DARBAS ATLIKTAS

(1)

PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „ Organinių rūgščių nustatymas bičių produktuose dujų chromatografijos masių spektrometrijos metodu“.

1. Yra atliktas mano paties (pačios).

2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.

3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.

Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE

Patvirtinu lietuviu kalbos taisyklingumą atliktame darbe.

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO

(2)

(aprobacijos data ) (katedros (klinikos, instituto) vedėjo (-os) (vadovo (-ės)) (parašas) vardas, pavardė)

Baigiamojo darbo recenzentas

(vardas, pavardė) (parašas)

Baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:

(3)

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS

ANALIZINĖS IR TOKSILOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA

KAMILĖ STUPURAITĖ

ORGANINIŲ RŪGŠČIŲ NUSTATYMAS BIČIŲ PRODUKTUOSE DUJŲ

CHROMATOGRAFIJOS MASIŲ SPEKTROMETRIJOS METODU

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas: Prof. Liudas Ivanasukas

(4)

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

FARMACIJOS FAKULTETAS

ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanė Ramunė Morkūnienė

ORGANINIŲ RŪGŠČIŲ NUSTATYMAS BIČIŲ PRODUKTUOSE DUJŲ

CHROMATOGRAFIJOS MASIŲ SPEKTROMETRIJOS METODU

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas: Prof. Liudas Ivanauskas

Recenzentas Data 2020-0 Darbą atliko Magistrantė Kamilė Stupuraitė Data 2020-0 KAUNAS, 2020

(5)

TURINYS

SANTRAUKA ... 5

SUMMARY ... 6

SANTRUMPOS ... 8

ĮVADAS ... 9

TIRIAMOJO DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 10

1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 11

1.1. Organinės rūgštys bičių produktuose ... 11

1.1.1. Gliukono ir pieno rūgštys randamos bičių produktuose ... 11

1.1.2. Citrinos ir oksalo rūgštys randamos bičių produktuose... 12

1.1.3. Obuolių ir fumaro rūgštys randamos bičių produktuose ... 13

1.2. Organinių rūgščių analizės metodai ... 13

1.2.1. Fermentinis tyrimo metodas nustatant organines rūgštis bičių produktuose ... 13

1.2.2. Organinių rūgščių nustatymas bičių produktuose kapiliarinės elektroforezės metodu ... 14

1.2.3. Organinių rūgščių nustatymas bičių produktuose chromatografiniais metodais ... 14

1.3. Bičių duonelės cheminė sudėtis ir biologinis aktyvumas ... 15

1.4. Žiedadulkių cheminė sudėtis ir biologinis aktyvumas ... 17

1.5. Medus cheminė sudėtis ... 19

1.5.1. Medaus biologinis aktyvumas ... 20

1.6. Bičių pienelio cheminė sudėtis ir biologinis aktyvumas ... 21

1.7. Bičių produktai kaip bioindikatoriai ... 22

2. TYRIMO METODIKA ... 23

2.1. Tyrimo objektas ... 23

2.2. Tyrimo metu naudoti reagentai ir aparatūra ... 23

2.4. Dujų chromatografijos metodika organinių rūgščių nustatymui bičių produktuose ... 24

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 25

3.1. Skirtingų bičių produktų organinių rūgščių identifikavimas DC–MS metodu ... 25

3.1.1. Žiedadulkių tabletėse (Medicata Filia) esančių organinių rūgščių nustatymas ... 25

3.1.2. Žiedadulkių (Šerkšno medus) organinių rūgščių nustatymas ... 26

3.1.3. Žiedadulkių (Brolių medus) organinių rūgščių nustatymas ... 27

3.1.4. Organinių rūgščių nustatymas bičių duonelės pastilės (Medicata Filia) ... 29

3.1.5. Organinių rūgščių nustatymas bičių duonelėje (Šerkšno medus) ... 30

(6)

3.1.7. Organinių rūgščių nustatymas Apilakas 70 (Medicata Filia) ... 33

3.1.8. Organinių rūgščių nustatymas bičių pienelelyje (Brolių medus) ... 34

3.1.9. Organinių rūgščių nustatymas bičių pienelyje (Vaido bitynas) ... 35

3.1.10. Organinių rūgščių nustatymas meduje (Brolių medus) ... 37

3.1.11. Organinių rūgščių nustatymas meduje (Medicata Filia)... 38

3.1.12. Organinių rūgščių nustatymas meduje ... 39

3.2. Tyrimo rezultatų apibendrinimas ... 40

4. IŠVADOS ... 42

5. REKOMENDACIJOS ... 43

(7)

SANTRAUKA

Kamilės Stupuraitės magistro baigiamasis darbas „Organinių rūgščių nustatymas bičių produktuose dujų chromatografijos masių spektrometrijos metodu“ mokslinis vadovas Prof. Liudas Ivanauskas. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Analizės ir toksikologinės chemijos katedra, Kaunas.

Darbo tikslas: nustatyti organinių rūgščių sudėtį bičių pienelyje, duonelėje, žiedadulkėse ir meduje dujų chromatografijos masių spektrometrijos metodu naudojant junginių derivatizacijos metodą.

Darbo uždaviniai:

1. Pritaikytu ekstrakcijos metodu išskirti iš bičių produktų organines rūgštis.

2. Remiantis literatūros šaltinais, atrinkti tinkamiausią metodą mėginių derivatizacijai ir analizei dujų chromatografijos masių spektrometrijos metodu.

3. Palyginti organinių rūgščių kiekius skirtinguose bičių produktuose. Tyrimo metodai:

Organinių rūgščių ekstrakcijai iš bičių produktų buvo taikyta ekstrakcija naudojant tirpiklį metanolį ir veikiant ultragarsu. Organines rūgštys kiekybiškai nustatytos naudojantis dujų chromatografijos masių spektrometrijos metodika.

Rezultatai ir išvados:

Bičių produktai buvo tirti dujų chromatografijos masių spektrofotometrijos metodu, prieš tai atliekant mėginių derivatizacija MTBSTFA reagentu. Organinių rūgščių išgavimui iš bičių produktų buvo naudojamas kaip ekstrahentas metanolis ir veikiamas ultragarso vonelėje. Tyrimo metu nustatyta, kad didžiausias bendras organinių rūgščių kiekis nustatytas bičių duonelėje (Šerkšno medus) (2.28 proc.), mažiausias organinių rūgščių kiekis nustatytas bičių duonelės pastilėse (Medicata Filia) (0,28 proc.).

(8)

SUMMARY

The master thesis „Determination of organic acids in bee products by gas chromatography – mass spectrometry“ written by Kamile Stupuraite, leading professor Liudas Ivanauskas. Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, Department of Analytical and Toxicological Chemistry, Kaunas.

The aim: determination of the organic acids in royal jelly, bee bread, bee pollen and honey by gas chromatography mass spectrometry after using a compound derivatization method.

Objectives:

1. With suitable extraction method, distinguish organic acids from bee products.

2. According to scientific data, choose the most suitable method for the derivatization and analysis of samples by gas chromatography mass spectrometry.

3. Compare organic acids amounts in different bee products.

Methods:Extraction of organic acid from bee products using methanol as a solvent and ultrasound. Organic acids were quantified by gas chromatography mass spectrometry method.

Results and conclusions:

Bee products were analysed by gas chromatography – mass spectrophotometry, preceded by derivatization of samples with MTBSTFA reagent. Methanol was used as an extractant to extract organic acids from bee products with ultrasonic bath. The study found that the highest total organic acid content was found in bee bread (Šerkšno honey) (2.28%), the lowest organic acid content was found in bee bread lozenges (Medicata Filia) (0.28%).

(9)

PADĖKA

Norėčiau padėkoti analizinės ir toksikologijos katedrai už suteiktas puikias sąlygas atliekant savo magistrinį darbą laboratorijoje. Taip pat norėčiau padėkoti prof. Liudui Ivanauskui ir lektoriui Mindaugui Marksai už pagalbą, konsultaciją ir patarimus rašant magistrinį darbą. Didžiausia padėka UAB „Medicata Filai“ už materialinė pagalbą, suteiktą galimybę tirti bičių produktus ir jų maisto papildus.

(10)

SANTRUMPOS

10–HDA – 10–hidroksi–2–deceno rūgštis DC – dujų chromatografija

DC–MS – dujų chromatografija – masių spektrometrija ESC – Efektyvioji skysčių chromatografija

(11)

ĮVADAS

Daugelį amžių bičių produktai naudojami kaip medicinos priemonės nuo įvairiausių ligų [1]. Neretai pacientai renkasi gydymą natūraliais bičių produktais kaip: medus, bičių duonelė, žiedadulkės, propolis, ir bičių nuodai [2]. Šie produktai gali tapti puikia alternatyva jau esamiems vaistinėje maisto papildams norint stiprinti imuninę sistemą, kadangi savo sudėtyje turi angliavandenių, baltymų, organinių rūgščių, vitaminų, mineralų ir kitų sudedamųjų dalių, reikalingų mūsų organizmui [3].

Organinės rūgštys bičių produktuose randamos nedidėliais kiekiais apie 0,5%, tačiau yra svarbios, kadangi nusako produkto skonį, aromatą, pH [4]. Dažniausia randamos organinės rūgštys yra gliukono, oksalo, obuolių, pieno, acto ir citrinos [5]. Žmogaus organizme organinės rūgštys pasižymi antioksidacinėmis ir antimikrobinėmis savybėmis, taip pat dalyvauja kaip tarpiniai produktai Krebso cikle [4]. Kai kurios rūgštys naudojamas bitininkystėje naikinti Varoatozės erkes, kurios mažina bičių populiaciją [6].

Atlikus literatūros apžvalgą organinių rūgščių nustatymui bičių produktuose buvo pasirinktas dujų chromatografijos – masių spektrofotometrijos metodas. Kadangi tai selektyvus, jautrus metodas, tinkamas identifikuoti mažos molekulinės masės junginius ir turintis geriausią chromatografinį skirstymą [7]. Derivatizacijos reagentu buvo pasirinktas MTBSTFA (N–tret–butildimetilsiliil–N– trifluoroacetamidas), kadangi pagerina junginių atrankamą detektoriui (masių spekrofotometras) [8]. Kaip žaliavos organinių rūgščių nustatymui buvo pasirinktos žiedadulkės, bičių duonelė, bičių pienelis ir medus.

(12)

TIRIAMOJO DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas: nustatyti organinių rūgščių sudėtį bičių pienelyje, duonelėje, žiedadulkėse ir meduje dujų chromatografijos masių spektrometrijos metodu naudojant junginių derivatizacijos metodą. Darbo uždaviniai:

1. Pritaikytu ekstrakcijos metodu išskirti iš bičių produktų organines rūgštis.

2. Remiantis literatūros šaltiniais, atrinkti tinkamiausią metodą mėginių derivatizacijai ir analizei dujų chromatografijos masių spektrometrijos metodu.

(13)

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. Organinės rūgštys bičių produktuose

Organinės rūgštys jau nuo seno yra naudojamas maisto, gėrimų ir farmacijos pramonėje kaip konservantai, kadangi stabdo bakterijų dauginimąsi. Labiausiai paplitusios yra karboksirūgštys. Tai junginiai turintys R–COOH funkcinę grupę, prie kurios galima pridėti organinę grupę arba vandenilio atomą. Rūgštys yra skirstomos pagal anglies grandinės ilgį. Turinčios 1–6 anglies atomus vadinamos trumpųjų grandinių rūgštimis, o turinčios 7–6 anglies atomus vadinamos vidutinės grandinės rūgštimis. Grandinės sudarytos iš 11 ir daugiau anglies atomų vadinamos ilgos grandinės rūgštimis. Tai silpnos rūgštys, kurių stiprumas priklauso nuo pKa (disociacijos konstantos) [9]. Bičių produktuose dažniausiai randamos organinės rūgštys (1 pav.).

1.1.1. Gliukono ir pieno rūgštys randamos bičių produktuose

Gliukono rūgštis yra silpna (pKa 3,5–3,8), tirpi vandenyje, gaunama aerobinėmis sąlygomis oksiduojant gliukozę, dalyvaujant katalizatoriui gliukozės oksidazei. Dažnai randama meduje,

Gliukono rūgštis Oksalo rūgštis Obuolių rūgštis Pieno rūgštis

Acto rūgštis

Citrinos rūgštis Fumaro rūgštis Skruzdžių rūgštis

Gintaro rūgštis Propiono rūgštis

1 pav. Organinės rūgštys randamos bičių produktuose.

(14)

vynuogėse, obuoliuose, mėsoje, vyne. Dėl savo mažo toksiškumo gliukono rūgštis plačiai naudojama farmacijos, tekstilės bei maisto pramonėje (pieno, mėsos, konditerijos) kaip rūgštingumą reguliuojanti medžiaga (E574), kuri suteikia maistui švelniai rūgštų skonį [10,11]. Farmacijos pramonėje dažniausiai naudojamas gliukono rūgšties anijonas – gliukonatas. Jis naudojamas kaip mineralų papildas esant hipokalcemijai, hipomagnezijai ir anemijai. Taip pat gliukono rūgštis turi prebiotinių savybių ir turi nedidelį poveikį kai kurioms bakterijų padermėms, esančioms storajame žarnyne [12].

Pieno rūgštį natūraliai išskiria Lactobacillus bakterijos, kurios yra randamos tiek žmonių, tiek gyvūnų virškinamajame trakte. Tai vienintelė rūgštis, kurią gali metabolizuoti žmogaus organizmas, todėl yra plačiai naudojama įvairiose pramonės šakose. Maisto pramonėje yra naudojama kaip kvapioji medžiaga, pH reguliatorius, konservantas. Kosmetikoje naudojama kaip konservantas, pH reguliatorius, odos drėkiklis. Medicinoje pieno rūgštis naudojama kaip priešvėžinis ir antimikrobinis vaistas. Plačiau medicinoje naudojamos laktato druskos, kurias puikiai pasisavina žmogaus organizmas. Pavyzdžiui natrio laktatas yra naudojamas gaminant parenterinius ir intraveninius tirpalus kaip elektrolitas. Taip pat ši medžiaga naudojama dializėje, kadangi sukelia labai mažus šalutinius poveikius. Geležies laktatas vartojamas anemijai gydyti, kalcio laktatas vartojamas osteoparozei ir dantų ėduoniui gydyti, magnio laktatas – hipertenzijai ir raumenų silpnumui mažinti [11,13].

1.1.2. Citrinos ir oksalo rūgštys randamos bičių produktuose

Citrinos rūgštis yra viena iš seniausiai atrastų rūgščių, buvo išgauta iš citrinos [11]. Tai silpna rūgštis, mažo toksiškumo ir tirpi vandenyje, labai plačiai naudojama maisto pramonėje dėl konservavimo savybių, malonaus skonio ir savybės sustiprinti maisto skonį net 70%. Farmacijos pramonėje ši rūgštis yra naudojama gaminant šnypšiančias tabletes su bikarbonatais, kadangi padeda greičiau ištirpti veikliajai medžiagai, taip pagreitinant vaistinės medžiagos pasisavinimą. Citrinos rūgštis – būtina mūsų organizmui, kadangi yra tarpinis Krebso ciklo produktas, gaunamas iš oksaloacto rūgšties ir acetylCoA. Citrinos rūgštis kartu su citrinos rūgšties natrio druska – natrio citratu, medicinos srityje naudojami pacientams, turintiems inkstų problemų, siekiant išvengti tolesnių problemų – podagros, inkstų akmenligės ar metabolinės acidozės [10,11].

Oksalo rūgštis dar kitaip vadinama etano dirūgštimi mažais kiekiais yra randama lapinėse daržovėse, riešutuose, avietėse bei meduje [14]. Didelis oksalo rūgšties kiekis yra toksiškas žmogui ir gali sukelti pykinimą, metabolinę acidozę, inkstų nepakankamumą ir mirtį. Dažniausiai ši rūgštis yra naudojama buitiniuose valikliuose [15]. Taip pat ši organinė rūgštis naudojama bitininkystėje, siekiant bičių avilyje išnaikinti Varoatozės erkes, kurios silpnina ir naikina bites. Tyrimo metu buvo nustatyta, kad bitininkų vartota oksalo rūgštis, neturi įtakos meduje esančiam oksalo rūgšties kiekiui [14].

(15)

1.1.3. Obuolių ir fumaro rūgštys randamos bičių produktuose

Obuolių rūgštis, tai balta, kristalinė medžiaga tirpi vandenyje. Naudojama mažai kalorijų turinčių gaiviųjų gėrimų pramonėje, kad sustiprintų vaisių skonį ir spalvą [16]. Kosmetikoje mažais kiekiais naudojamas kaip alfa hidroksi rūgštis (AHA), kuri reguliuoja aknės sukeltas problemas. Šią rūgštį galima rasti natūraliuose produktuose kaip vaisiai. Taip pat šį rūgštis yra gaminama žmogaus organizme, kad suteiktų energijos mūsų ląstelėms. Gydomosiomis savybėmis taip pat pasižymi organinė rūgštis. Tyrimo metu su pelėmis buvo nustatyta, kad obuolių, gintaro ir citrinos rūgšties kompleksas pasižymi antitrombozinėmis savybėmis. Kitame tyrime, kuriame dalyvavo pacientai, turintys sausos burnos simptomus dėl antidepresantų vartojimo buvo gydomi obuolių rūgštimi. Atlikto tyrimo metu, pacientams buvo taikoma intervencija, kurios metu, siekiant gydant šiuos simptomus, buvo purškiama 1% obuolių rūgštis. Tyrimo metu buvo įrodyta, kad rūgštis skatino seilių išsiskyrimą ir mažino sausos burnos pojūtį [17–19].

Fumaro rūgštis yra netoksiška irdažnai randama vaisiuose. Ši organinė rūgštis pasižymi antibakterinėmis savybėmis, tiek prieš gramteigiamas bakterijas – auksinis stafilokokas (Staphylococcus aureus), streptokokas (Streptococcus), tiek prieš gramneigiamas bakterijas – (Escherichia coli), salmonelės (Salmonella). Todėl dažnai fumaro rūgštis yra naudojama maisto pramonėje, siekiant prailginti maisto galiojimo laiką [20]. Medicinoje šios rūgšties esteris naudojamas sistemiškai gydyti vidutinio sunkumo ir sunkią psoriazę [21].

1.2. Organinių rūgščių analizės metodai

1.2.1. Fermentinis tyrimo metodas nustatant organines rūgštis bičių produktuose

Fermentinis metodas bičių produktuose yra naudojamas kiekybiniam organinių rūgščių įvertinimui. Metodas yra specifiškas, todėl gali nustatyti gliukono rūgšties, obuolių rūgšties, pieno rūgšties ir kitų organinių rūgščių L ir D izomerus. Taip pat metodas yra jautrus ir paprastas, kadangi nereikalauja sudėtingos įrangos. Tyrimas atliekamas naudojant spektrofotometrą esant 340nm bangai. Organinės rūgštys reaguoja su specifiniais fermentais ir yra stebimas kofermentų redukuoto nikotinamido adenino dinukleotido (NADH) ir redukuoto nikotinamido adenino dinukleotido fosfato (NADPH) absorbcijos padidėjimas arba sumažėjimas. Tačiau šis metodas turi trūkumų. Naudojami mėginiai nėra stabilūs, todėl tyrimą privaloma atlikti per kelias dienas. Vieno bandymo metu

(16)

nustatoma tik viena rūgštis ir norint ištirti daugiau nei kelis komponentus preparate ne visada gali užtekti kelių dienų [4,22].

1.2.2. Organinių rūgščių nustatymas bičių produktuose kapiliarinės elektroforezės

metodu

Organinėms rūgštims nustatyti bičių produktuose puikai tinka ir kapiliarinė elektroforezė, kadangi šis metodas yra greitas, pigus, nereikalauja sudėtingos aparatūros ir gali vienu kartu nustatyti kelias organines rūgštis, ko negalima padaryti atliekant fermentinius tyrimus. Brugnerotto kartu su kitais mokslininkai tyrė organines rūgštis naudojant kapiliarinė elektroforezė su ultravioletinių spindulių aptikimu. Tyrimo metu mažiau nei per 10 minučių buvo aptikta 14 organinių rūgščių (2 pav). Tačiau šis metodas turi trūkumų, kadangi nėra pakankamai tikslus ir jautrus palyginus su kitais metodais [23,24].

1.2.3. Organinių rūgščių nustatymas bičių produktuose chromatografiniais

metodais

Efektyvioji skysčių chromatografija (ESC), tai metodas skirtas kiekybiškai ir kokybiškai įvertinti tiriamus mėginius. Veikimo principas: ištirpintas tiriamasis junginys (judrioji fazė) teka viena kryptimi per nejudančia fazę, taip atskirdamas mažos ir didelės molekulės masės junginius. Norint, kad ESC metodas būtų jautresnis ir būtų galima identifikuoti specifinius junginius yra naudojamos detektorių sistemos: UV–Vis spektrofotometrija, masių spektrometrija, branduolinio magnetinio rezonanso spektroskopija [25]. ESC tinka tirti bičių produktus, kadangi yra jautrus, atrankus metodas. Tačiau bičių produktuose esantys angliavandeniai trukdo identifikuoti esantį mažą kiekį organinių rūgščių mėginyje, todėl prieš tyrimą reikia cukrų pašalinti, o tai užima daug laiko ir sąnaudų [4,24].

2 pav. Elektroferograma. (1) maleino rūgštis, (2) malonine rūgštis, (3) fumaro rūgštis, (4) vyno rūgštis, (I.S) glioksilo rūgštis, (5) skruzdžių rūgštis, (6) citrinos rūgštis, (7) obuolių rūgštis, (8) glikolio rūgštis, (9) pieno rūgštis, (10) gliukono rūgštis, (11) gintaro rūgštis, (12) glutaro rūgštis,

(17)

Dujų chromatografiją (DC), tai labai jautrus, selektyvus, paprastas, nereikalaujantis didelio kiekio reagentų metodas, norint nustatyti lakius mažos molekulinės masės junginius. Tiriamasis tirpalas yra įleidžiamas į dujų chromatografą ir kaitinamas iki dujų fazės. Dujų pavidalu tiriamasis tirpalas kitų dujų (judanti fazė) pagalba yra nunešamas iki kolonėlės (nejudanti fazė), kur aptikti junginiai yra atskiriami pagal sulaikymo laiką. Norint patvirtinti medžiagos identifikaciją yra naudojamas detektorius – masių spektrofotometras. Jis išmatuoja ir apskaičiuoja aptiktų jonų masės ir įkrovos santykį (m/z) [7,26]. Mokslininkų komanda iš Ispanijos tyrė organines rūgštis DC–MS metodu maisto produktuose, tarp jų buvo ir medus. Jiems pavyko identifikuoti 29 organines rūgštis iš kurių buvo ir medaus sudėtyje esančios rūgštys: acto, pieno, obuolių, gintaro, fumaro ir citrinos [27]. Organinės rūgštis yra nelakios, tad norint ištirti jas DC–MS reikia taikyti junginių derivatizaciją. Derivatizacijos procese vyksta alkilinimo, acilinimo arba sililinimo reakcijos, kurių metu pašalinamos polinės funkcinės grupės (pvz. OH grupė). Tokiu būdu padidinamas junginio lakumas ir atsiranda galimybė identifikuoti junginius mišiniuose. Nustatyta, kad efektyviausias organinių rūgščių reagentas yra MTBSTFA, kadangi naudojant jį ir vykdant DC–MS lengviau atskiriami junginiai [8,28].

1.3. Bičių duonelės cheminė sudėtis ir biologinis aktyvumas

Bitės – labai socialūs vabzdžiai gyvenantys kolonijomis [29]. Šie vabzdžiai smarkiai pasitarnauja žmonijai, kadangi atlieka apdulkinimą, kuris labai svarbus mūsų agrokultūrai [30]. Kiekviena kolonijoje esanti bitė atlieka tam tikrą rolę. Kiekvienas avilys turi: motinėlę, kuri yra lytiškai subrendusi ir deda kiaušinėlius; patinus, kitaip vadinamus tranais, kurių vienintelis vaidmuo kolonijoje yra poruotis, ir bites darbininkes, kurios yra lytiškai nesubrendusios ir atlieka visus kitus darbus avilyje [31]. Bitės darbininkės yra skirstomos pagal amžių ir atliekamas pareigas. Jauniausios bitės (apie 10 dienų) prižiūri bičių jauniklius, vidutinio amžiaus (10 20 dienų amžiaus) bitės atlieka maisto saugojimo darbus ir saugo avilį nuo įsibrovėlių, o vyriausios bitės yra visos kolonijos maitintojos [32].

Bičių duonelė gyvūninės kilmės produktas. Jo gamyba yra gana sudėtingas procesas, kurio metu bitės darbininkės atsinešusios į avilį žiedadulkes, sudeda jas į korio akeles, sumaišo su savo seilėmis, tvirtai suspaudžia savo galvele ir užlieja medumi. Tada vyksta biocheminis procesas, kurio metu korio akelėse esanti Lactobacillus bakterija ir seilėse esantys fermentas β – glikosidaze pradeda fermentuoti žiedadulkėse esančią pieno rūgštį, 30 laipsnių temperatūroje [33]. Fermentacijos būdu gaunama bičių duonelė, kuri yra svarbus bičių lervų ir darbininkių baltymų šaltinis, nulemiantis jų puikią savijautą ir gerą vystymasis [2].

(18)

1 lentelė. Bičių duonelės cheminė sudėtis [39,62]

Bičių duonelės (BD) maistinė vertė yra geresnė, nei žiedadulkių, kadangi cheminė sudėtis yra praturtinta baltymais, vitaminais, mineralais, amino rūgštimis ir angliavandeniais [2]. Bičių duonelė yra ir fermentuota, geriau pasisavinama mūsų organizmo, todėl didesnė tikimybė, kad į organizmą pateks reikiami mikroelementai [3]. Komponentai, kurie įeina į bičių duonelės sudėtį pavaizduoti 1 lentelėje. Sudėtis Kiekis, % Vanduo 8–10 Baltymai 15–18 Angliavandeniai 24–34 Maistinės skaidulos 37–60 Riebalai 3 Mineralinės medžiagos 3

Bičių duonelėje yra vandens, kuris suteikia galimybę augti mikroorganizmams, todėl labai svarbu šviežią duonelę išdžiovinti 40⁰C temperatūroje iki 14–15% drėgmės likučio [34]. Taip bus išvengta mikrobinio užterštumo ir produktas išliks šviežias ilgesnį laiką. Bičių duonelė savo sudėtyje turi nemažai amino rūgščių, daugiausia randama glutamo, asparto ir prolino rūgščių. Angliavandenių sudėtyje daugiausia yra fruktozės, gliukozės ir maltozės. Duonelė yra puikus polinesočiųjų riebalų rūgščių šaltinis, kurios mums labai reikalingos, nes mūsų organizmas jų nesintetina ir būtina gauti šių medžiagų su maistu [35]. Kalbant apie organines rūgštis duomenų yra nedaug ir kiekybiškai ištirta tik oksalo rūgštis, kurios rasta 0,383g/100g [36]. Mineralų sudėtis tokia, kaip ir žiedadulkių, tik BD randama daugiau: kalio (12,16%), fosforo (6.15%), kalcio (49.23%). Tačiau, lyginant su žiedadulkėmis, bičių duonelėje dėl fermentacijos proceso sumažėja magnio (236,7%) ir cinko (14.42%) kiekiai [37]. Bičių duonelė savo sudėtyje turi būtinus mums vitaminus: (askorbo rūgštį (C), tiaminą (B1), riboflaviną (B2), E, K, biotiną (H), nikotino ir folio rūgštį) [38].

Bičių duonelės stabilumas laikant tinkamomis sąlygomis išlieka gana ilgą laiką, palyginus su žiedadulkėmis. Šį papildą tinka vartoti žiemos periodu, kadangi duonelėje esantys vitaminai ir mikroelementai padeda stiprinti imuninę sistemą, palaiko normalią virškinimo sistemą dėl sudėtyje esančių fermentų (sacharazės, amilazės, fosfatazės) [38]. Vitaminas K esantis duonelėje sustiprina kraujagyslių sieneles ir pagerina kraujotaką, mažina cholesterolio kiekį kraujyje [3]. Tokie junginiai kaip fenoliai ir polinesočiosios riebalų rūgštys, suteikia bičių duonelei antioksidantinį poveikį [39]. Taip pat svarbu paminėti, kad tai puikus maisto papildas, kuris pasižymi antimikrobinėmis savybėmis

(19)

ir slopina tiek gramteigiamų, tiek gramneigiamų bakterijų augimą [36]. Duonelė yra vartojama po 20– 40 g. per dieną, dažniausiai šaltuoju laikotarpiu. Svarbu paminėti, kad nėra galimybės jos perdozuoti, tik reikia stebėti ar neatsiranda alergijos pažymių [3].

1.4. Žiedadulkių cheminė sudėtis ir biologinis aktyvumas

Žiedadulkės yra vyriškos lytinės augalų ląstelės (gametofitai), kurios prilimpa prie bičių galinių kojelių ir yra atnešamos į avilį. Tai labai maistingos, mikro ir makro elementais prisotintos medžiagos, kurių reikia mūsų organizmui ypač rudenį ir pavasarį [2]. Pati žiedadulkių sudėtis priklauso nuo augalo rūšies, klimato juostos, laikymo sąlygų. Augalo rūšis nulemia kokios spalvos ir formos bus žiedadulkės. Pigmentą suteikia sudėtyje esantys karatinoidai, flavanoidai ir antioksidaintai [40]. Viena bitė į avilį gali parnešti apie 7,5 mg žiedadulkių. Bičių šeima per metus gali surinkti nuo 15 iki 40 kilogramų žiedadulkių [41]. Žiedadulkės į avilį atnešamos keliasi būdais: skrendant nuo vieno žiedo link kito, kuomet visas bitės kūnelis aplimpa žiedadulkėmis arba nešant žiedadulkes galinių kojų gurbelyje [40]. Dažniausiai atneštos į avilį žiedadulkės yra sumaišomos su nektaru ir seilėmis ir paliekamos fermentuotis [41].

Sudėtis Kiekis, % Baltymai 22,7 Angliavandeniai 30,8 Lipidai 5,1 Fenoliniai junginiai 1,6 Vitaminai 0,7 Mikroelementai 1,6

Baltimų kiekis labai svarbus, kadangi nuo jo priklauso žiedadulkių skonis. Daugiausia yra laisvųjų amino rūgščių prolino, jis sudaro daugiau nei pusę baltymų kiekio. Sudėtyje randama albumino (35.4%), globulino (18.9%), prolamino (31,8%) ir kitų amino rūgščių. Angliavandenių kiekis priklauso nuo augalų, iš kurių buvo surinktos žiedadulkės. Daugiausia randama monosacharidų (fruktozė ir gliukozė) apie 94 proc. Taip pat sudėtyje galima rasti disacharidų: maltosės, turanosės ir sukrosės. Žiedadulkių sudėtyje randama įvairių lipidų. Visų pirma vyrauja nepakeičiamos riebalų rūgštys: linolo, arichidono bei randama sočiųjų (stearino, miristo ir palmitino) ir nesočiųjų (oleino, linolo ir α – linoleno) riebalų rūgščių. Šios rūgštys mažina cholesterolio kiekį kraujyje. Žiedadulkėse

(20)

esantys fenoliniai junginiai yra atsakingi už grūdelių spalvą. Vyrauja kaempferolis, kvercetinas ir izorhamnetinas. Šie komponentai taip pat veikia kaip antioksidantai ir gerina kraujagyslių pralaidumą sustiprindami kraujagyslių sieneles. Organinių rūgščių sudėtis priklauso nuo klimato juostos, augalų rūšies bei žiedadulkių surinkimo laikotarpio. Taip pat šios rūgštys turi įtakos žiedadulkių skoniui. Korėjoje buvo tirtos iš ąžuolų (Quercus spp) surinktos žiedadulkės, kuriose daugiausia buvo rasta obuolių rūgšties (3,04g/kg). Mažesniais kiekiais buvo rasta citrinų rūgšties (2.04g/kg), kuri apsaugo inkstus nuo akmenų susidarymo ir fumaro rūgšties (0,07g/kg) [42]. Kitas tyrimas buvo atliekamas Turkijoje, Antalijos regione. Ištirtų žiedadulkių organinių rūgščių sudėtis buvo įvairesnė. Daugiausia nustatyta gliukono rūgšties (20g/kg), mažesniais kiekiais rasta pieno rūgšties (1g/kg), kuri dalyvauja fermentacijos procese, oksalo rūgšties (0,9g/kg), gintaro rūgšties (0,28g/kg), vyno rūgšties (0,25g.kg), citrinų rūgšties (0,25g/kg) ir obuolių rūgšties (0,2g/kg) [43]. Žiedadulkėse randami riebaluose tirpūs vitaminai: D, E, K, A ir vandenyje tirpūs vitaminai: askorbo rūgštis (C), niacinas (B3), piridoksinas (B6), tiaminas (B1), riboflavinas (B2), pantoteno rūgštis, folio rūgštis, biotinas (H). Tai svarbūs elementai mūsų organizmui, dalyvaujantys įvairiose cheminėse reakcijose. Mineralinių medžiagų spektras žiedadulkėse taip pat nemažas. Daugiausia yra kalio (K), taip pat randama fosforo (P), kalcio (Ca), magnio (Mg), cinko (Zn), mangano (Mg), geležies (Fe), vario (Cu), seleno (Se). Tai mikro ir makro elementai dalyvaujantys medžiagų apytakos keliuose [3,44].

Žiedadulkės tarsi „super“ maistas, kadangi gali būti naudojamas sergant depresija, esant vidurių užkietėjimui ar viduriavimui, taip pat sergant anoreksija, kad būtų atstatyta tinkama mityba. Svarbu paminėti, kad žiedadulkės puikiai tinka vegetarams, nes turi daug baltymų, amino rūgščių, kurių reikia mūsų organizmui [38,41]. Tyrimo metu yra įrodyta, kad žiedadulkėse esantys komponentai gali mažinti uždegimo procesus ir sumažinti riziką susirgti prostatos vėžiu. Taip pat mokslininkai įrodė, kad galima sumažinti alergijų riziką dėl slopinamos putliųjų ląstelių veiklos. Kadangi žiedadulkių sudėtyje yra antioksidantų, kurie apsaugo mūsų organizmą nuo laisvųjų radikalų pažaidos, žiedadulkės puikiai veikia kovojant su senėjimo požymiais bei apsaugo nuo kraujagyslių ligų [33,45].

Suaugusiems patartina vartoti po 20–40g. žiedadulkių per dieną. Vaikams iki 15g. per dieną. Dozę galima dalinti ir vartoti tris kartus dienoje, prieš valgį. Svarbu prieš nuryjant gerai sukramtyti žiedadulkes, kadangi biologinis prieinamumas yra 5 kartus geresnis, nei nesukramtytų žiedadulkių. Rekomenduojama šį preparatą vartoti 1–3 mėnesius [45].

(21)

1.5. Medus cheminė sudėtis

Tai geltonos spalvos, saldus skystis, daugelį amžių naudojamas kaip natūralus produktas, išgaunamas iš žieduose esančio nektaro. Bičių atneštas nektaras yra patalpinamas į korį ir sumaišomos su bičių seilėmis, kuriose yra fermentų skaidančių disacharidą sacharozė į monosacharidus fruktozę ir gliukozę. Po fermentacijos – gaunamas medus [46].

Sudėtis Kiekis, % Vanduo 12–23 Angliavandeniai 60–85 Baltymai 0,2–1,6 Organinės rūgštys <0,5 Vitaminai ir Mineralai 0,02–3

Vandens kiekis meduje skiriasi nuo klimato juostos, gėlių rūšies, oro temperatūros, laikymo sąlygų. Optimaliausia, kai vandens kiekis yra 17%. Esant mažesniam vandens kiekiui medų sunku apdoroti, o esant didesniai nei 18% drėgmei medus fermentuojasi, nes sumažėjus osmosiniam slėgiui pradeda daugintis mielės. Taip pat nuo vandens kiekio priklauso medaus spalva, skonis ir klampa. Meduje esantys angliavandeniai sudaro net 95% sausųjų medžiagų esančių meduje [5]. Pagrindiniai yra monosacharidai – fruktozė ir gliukozė, kurių nereikia virškinti ir patekę į organizmą gali iškart būti absorbuojami į mūsų kraujotakos sistemą. Todėl medus gali būti naudojamas kaip greitas energijos šaltinis [46]. Angliavandeniai suriša dalį vandens, taip neleisdami augti mikroorganizmams meduje. Produkte randamos 26 amino rūgštys, kurios pasižymi antioksidacinėmis savybėmis. Tačiau pagrindinė yra prolino rūgštis, kuri gaunama iš bičių seilių. Ji dalyvauja nektaro fermentacijos procese į medų. Organinės rūgštys yra gaunamos iš nektaro ir bičių seilių, medaus brandinimo metu. Dažniausiai randamos šios rūgštys: gliukono (14,27–49,51g/L), skruzdžių (0,08–1,52g/L), obuolių (0,29–2,86g/L), pieno (0,76–4,95g/L), acto (0,65–2,67g/L), citrinos (1,87–2,91g/L), gintaro (0,66– 3,98g/L), fumaro (0,51–8,02g/L) ir propiono (0,22–4.95g/L) [47,48]. Preparate dominuojanti yra gliukono rūgštis, sudaro net 70–90% visų organinių rūgščių kiekio esančio meduje. Ji gaunama vykstant gliukozės oksidacijos reakcijai. Kitos svarbios rūgštys yra citrinos ir acto. Jos suteikia medui skonį ir yra naudojamos maisto pramonėje kaip skonio stiprikliai. Meduje esanti skruzdžių rūgštis dalyvauja reakcijoje, kurios metu susijungusia su vandeniu ir taip padidina medaus rūgštingumą. Medaus pH svyruoja nuo 3.2 iki 4.5. Svarbu paminėti, kad pH nėra tiesiogiai susijęs su organinėmis

(22)

rūgštimis, kadangi produkte yra mineralinių medžiagų ir druskų, kurios veikia kaip buferiai. Mineralų kiekis ir įvairovė priklauso nuo kokiame dirvožemyje augo augalai iš kurių buvo surinktas nektaras. Dažniausia randami šie elementai: kalis (K), natris (Na), kalcis (Ca), magnis (Mg), geležis (Fe), varis (Cu), manganas (Mg), chloras (Cl), boras (Br), siera (S), silicis (Si) ir nikelis (Ni). Šie elementai randami labai mažais kiekiais, todėl medus neturėtų būti naudojamas, kaip šių medžiagų šaltinis. Vitaminų kiekis, taip pat randamas mažas. Meduje vyrauja vandenyje tirpūs vitaminai: D, E, K, A. Taip pat randama vitamino C, kuris veikia kaip antioksidantas [5,49].

1.5.1. Medaus biologinis aktyvumas

Medus pasižymi antibakterinėmis savybėmis, kadangi gali iš bakterijų ląstelių osmoso būdu ištraukti vandenį, taip sukeldamas bakterijų dehidrataciją. Taip pat vykstant gliukozės skaidymui susidaro vandenilio peroksidas, kuris suteikia aseptines sąlygas patogenų dauginimuisi. Neretai medus yra naudojamas tarp odontologų, gydant burnos pažeidimus. Pavyzdžiui gydant burnos opas, periodontitą, stomatitą buvo pastebėtas uždegimą ir skausmą mažinantis efektas, kuris padėjo greičiau pasveikti pacientui sergant šiomis ligomis [46]. Kito tyrimo metu buvo lyginta medaus ir sidabro sulfadiazino poveikis žaizdos gijimui. Nustatyta, kad medus geriau veikia bakteriocidiškai, sumažina žaizdos plotą bei sumažina randų susidarymo tikimybę, nei naudotas sidabro sulfadiazinas. Taip pat medus sumažina uždegiminių skysčių sankaupas audiniuose, taip pagreitindamas žaizdų gijimą esant nudegimams. Jei medus naudojamas gydymo tikslais, svarbu atsižvelgti į žaizdos dydį ir jame esančių eksudatų kiekį ir atitinkamais kiekiais naudoti medų. Iš pradžių tvarsliava su medumi turi būti keičiama kasdien, vėliau galima palikti iki 4–7 dienų [50]. Svarbu paminėti, kad medus yra natūralus produktas, tad jame dažnai randama mielių, grybelių, bakterijų sporų, kurios patekusios į organizmą gali sukelti negalavimus. Tad labai svarbu, kad naudojamas medus būtų pilnai ištirtas ir būtų galimą jį naudoti tiek į vidų, tiek į išorę [46]. Surinktas nektaras iš alkaloidų turinčių augalų, pavyzdžiui

Rhododendron ponticum, gali būti toksiškas žmonėms ir sukelti tokius simptomus kaip prakaitavimą,

(23)

4 lentelė. Bičių pienelio cheminė sudėtis [52]

1.6. Bičių pienelio cheminė sudėtis ir biologinis aktyvumas

Tai išskirtas sekretas iš hipofaringinės liaukos esančios priekinėje bičių darbininkių galvos dalyje, kuris yra pagrindinis maisto šaltinis lervoms (3 pav.) ir bitėms motinėlėms. Tai gelsvai baltos spalvos, aitraus skonio tyrelė, kuri su laiku įgauna vis intensyvesnę geltoną spalvą. Šios organoleptinės savybės leidžia nustatyti pienelio kokybę. Siekiant, kad kokybė būtų užtikrinta, bičių pienelį laikyti šaldiklyje užšaldytą, kad nepakistų spalva, klampumas ir skonis [51].

Sudėtis Kiekis, % Vanduo 50–60 Baltymai 18 Angliavandeniai 15 Lipidai 3–6 Mineralinės druskos 1,5

Vitaminai ir bioaktyvūs junginiai <1

Daugiausia bičių pienelyje randama vandens. Mažesniais kiekiais galima rasti baltymų, angliavandenių, lipidų bei kitų medžiagų. Baltymai esantys bičių pienelyje turi antibakterinį poveikį, todėl pasižymi žaizdas gydančiu poveikiu. Taip pat pienelis pasižymi antioksidantinėmis savybėmis. Mineralines druskas sudaro: kalis (K), kalcis (Ca), magnis (Mg), cinkas (Zn), geležis (Fe) ir varis (Cu) [52]. Pienelyje randama ir bioaktyvių medžiagų. Lipidus daugiausia sudaro organinės rūgštys, net 80– 85 proc. Iš jų pagrindiniai biokatyvūs komponentai yra 10–hidroksi–2–deceno rūgštis (10–HDA) (4 pav.), gliukono rūgštis ir 10–hidroksi dekano rūgštis (HDAA).

(24)

Tai 8–10 atomų turinčios organinės rūgštys, kurių pagrindinė 10–HDA rūgštis, dar kitaip vadinama bičių pienelio rūgštis, pasižymi antibakterinėmis savybėmis ir yra randama tik bičių pienelyje [53]. Todėl pagal tarptautinius standartus norint įvertinti bičių pienelio kokybę ir tapatybę užtenka nustatyti 10–HDA rūgšties buvimą preparate [54]. Tyrimais įrodyta, kad bičių pienelis turi daug bioaktyvių medžiagų, todėl tinka gydant vėžį ir uždegiminius procesus. Taip pat turi antioksidantinį, antimikrobinį bei senėjimą lėtinantį poveikį [51,53,55].

1.7. Bičių produktai kaip bioindikatoriai

Bičių produktai puikiai pasitarnauja kaip bioindikatoriai, kurie gali parodyti aplinkos užterštumą pesticidais, metalais, radioaktyviais elementais [56]. Užterštumą šiomis toksinėmis medžiagomis galima pastebėti dviem būdais: smarkiai padidėjęs bičių mirtingumas arba randami toksinai bičių kūnuose arba produktuose [57]. Šių medžiagų patekimas į bičių produktus dažniausiai įvyksta apdulkinimo metu, kuomet bitės darbininkės turėdamos kontaktą su žiede esančiais ksenobiotikais, juos parneša į avilius kartu su nektaru ir žiedadulkėmis, sukeldamos pavojų visai bičių kolonijai. Tokiu būdu šios medžiagos gali patekti į žmogaus organizmą ir sukelti rimtus organizmo sutrikimus. Todėl labai svarbu kontroliuoti ksenobiotikų kiekį gamtoje [56]. Žiedadulkės augančios šalia greitkelio, dažniausiai kaupia šiuos sunkiuosius metalus: arseną (Ar), barį (Ba), kadmį (Cd), litį (Li), nikelį (Ni), šviną (Pb) ir vanadį (V) [58,59]. Meduje taip pat randami tokie toksiniai elementai kaip: aliuminis, kadmis švinas, nikelis ir titanas. Nustatyta, kad pačios bitės yra kaip biofiltrai, kadangi ant bičių kūnų rasti žymiai didesni kiekiai sunkiųjų metalų, nei meduje. Atsižvelgiant į tai, kad šiuos prepartus vartos vaikai ir senyvo amžiaus žmonės, būtina kontroliuoti šiuos elementus [60].

(25)

2. TYRIMO METODIKA

2.1. Tyrimo objektas

Tyrimo metu ištirtos žiedadulkės, bičių duonelė, bičių pienelis ir medus ( 5 lentelė).

Pavadinimas Farmacinė forma Medžiagos kiekis

Žiedadulkių tabletės (Medicata Filia) Tabletės 100% Žiedadulkės (Šerkšno medus) Gryna medžiaga 100% Žiedadulkės (Brolių medus) Gryna medžiaga 100% Bičių duonelės pastilės (Medicata

Filia) Kramtomos pastilės

485 mg grynos bičių duonelės vienoje pastilėje

Bičių duonelė (Šerkšno medus) Gryna medžiaga 100% Bičių duonelė (Brolių medus) Gryna medžiaga 100%

Apilakas 70 (Medicata Filia) Tabletės 70 mg liofilizuoto bičių pienelio _tabletėje Bičių pienelis (Brolių medus) Gryna medžiaga 100%

Bičių pienelis (Vido bitynas) Gryna medžiaga 100% Medus (Medicata Filia) Gryna medžiaga 100% Medus (Brolių medus) Gryna medžiaga 100%

Medus Gryna medžiaga 100%

2.2. Tyrimo metu naudoti reagentai ir aparatūra

Tyrimo metu naudoti reagentai:

1) Metanolis (≥ 99,8% Sigma – Aldrich, Izraelis); 2) Acetonitrilas (≥ 99,9%, Sigma – Aldrich, Izraelis);

3) MTBSTFA – N–tert–Butyldimethylsilyl–N–methyltrifluoroacetamid (≥ 99% Sigma – Aldrich, Missouri, JAV).

Tyrimo metu naudota aparatūra:

1) Analitinės svarstyklės Shimadzu Auw 120 D (Duisburgas, Vokietija); 2) Ultragarso vonelė „WiseClean“;

(26)

3) Automatinės pipetės „Eppendorf“ (Hamburgas, Vokietija); 4) Centrifuga „Centurion Scientific“ C2 Series;

5) Glicerolio vonelė „Heidolph” (Vokietija);

6) Dujų chromatografinė sistema Shimazdu GC – 2010 plius (Shimandzu Corporation, Japonija), su masių spektrometrijos detektoriumi.

2.4. Dujų chromatografijos metodika organinių rūgščių nustatymui bičių

produktuose

Tiriamojo tirpalo ruošimas

1g. (tikslus svoris) bičių produkto yra atsveriama analitinėmis svarstyklėmis, užpilama metanoliu iki 10 ml. ribos. Mėginys 10 min. įdedamas į ultragarso vonelę. Gautas tirpalas nucentrifuguojamas, atskiriama skysta fazė ir iš jos paimama 100 µl. mėginio. Mėginys visiškai išgarinamas po azoto dujų srove iki sauso likučio. Gautos nuosėdos užpilamos 100 µl. acetonitrilo ir 100µl MTBSTFA derivatizatoriumi. Šis tirpalas kaitinamas 100 ̊C temperatūroje 2,5 valandos, glicerolio vonioje. Po to 1µl. tiriamojo mėginio injekuojama į dujų chromatografą.

Etaloninio tirpalo ruošimas:

Paimama 100 µL. organinių rūgščių standartų mišinio ir išdžiovinama po azoto srove iki sauso likučio. Tuomet sausos nuosėdos užpilamos 100 µL. acetonitrilo ir 100 µL. MTBSTFA derivatizatoriumi. Gautas tirpalas kaitinamas 2,5 valandos kaitinamas glicerolio vonioje, 100 ̊C temperatūroje.

Tyrimo metodika organinių rūgščių nustatymui bičių produktuose

Kolonėlė Rxi® – 5ms (Restek Corporation), 30 m. ilgio ir 0,25 µm. skersmens, su 0,25 µm. nejudančios fazės sluoksnio storiu. Pradinė kolonėlės temperatūra 75 O_{C. Dujų nešėjo (helio) tekėjimo}

greitis: 1,5 ml/min., slėgis 100,0 kPa., bendras tekėjimo greitis: 34,4 ml/min. Tyrimas atliekamas per 41min. Temperatūrinis rėžimas kolonėlėje buvo programuojamas: pradinė kolonėlės temperatūra nustatyta 75O_{C, išlaikoma pastovi temperatūra 5 min., po to didinama 10}O_{C/min. ir keliama iki 290}O_C,

laikoma pastovi 5 min., toliau temperatūra keliama kas 20O_{C/min. iki 320}O_{C ir laikoma pastovi 5min.}

(27)

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1. Skirtingų bičių produktų organinių rūgščių identifikavimas DC

–

MS metodu

Tyrime organinės rūgštys buvo nustatomos dujų chromatografijos masių spektrometrijos metodu. Junginiai identifikuoti pagal sulaikymo laiką, lyginami su masių spektrų duomenų bazėmis (WVR10 ir NIST14), kurie yra duomenų bibliotekoje. Dėl gero junginių atrankumo kaip derivatizatorius buvo parinktas MTBSTFA.

3.1.1. Žiedadulkių tabletėse (Medicata Filia) esančių organinių rūgščių nustatymas

5 paveikslėlyje pavaizduota žiedadulkių tablečių (Medicata Filia) chromatogramą. Smailės aiškiai atsiskiria, todėl galima teigti, kad metodika pritaikyta tinkamai ir galima lengvai identifikuoti organines rūgštis: skruzdžių rūgšties sulaikymo laikas – 8,531 min., propiono rūgšties sulaikymo laikas – 10,668 min., glikolio rūgšties sulaikymo laikas – 1,793 min., malono rūgšties sulaikymo laikas – 10,841 min., gintaro rūgšties sulaikymo laikas – 12,633 min., glikaro rūgšties sulaikymo laikas – 13,934 min.

(28)

Atlikus tablečių ekstrakto chromatografinę analizę ir sulyginus su duomenų bazės masių spektro duomenimis buvo identifikuoti 6 organinės rūgštys, kurios pavaizduotos 6 lentelėje.

Tyrimo metu daugiausia nustatyta gintaro rūgšties 1,56 proc. Mažesnis kiekis nustatytas glikolio rūgšties 0,14 proc. Skruzdžių ir propiono rūgščių kiekiai buvo aptikti vienodi po 0,03 proc. Malono rūgšties nustatyta 0,01 proc.

3.1.2. Žiedadulkių (Šerkšno medus) organinių rūgščių nustatymas

Pagal gautus duomenų masių spektrus ir jų standartų sulaikymo laikus galime identifikuoti 5 organines rūgštis. Skruzdžių rūgšties sulaikymo laikas – 8.538 min., obuolių rūgšties sulaikymo laikas – 10,478 min., glikolio rūgšties sulaikymo laikas – 10,803 min., malono rūgšties sulaikymo laikas – 10,850 min., gintaro rūgšties sulaikymo laikas – 12,644 min.

Nr. Junginio pavadinimas Sulaikymo

trukmė, min. Piko plotas, %

1. Skruzdžių rūgštis (Formic acid) 8,531 0,03

3. Propiono rūgštis (Propanoic acid) 10,668 0,03

4. Glikolio rūgštis (2–Hydroxyethanoic acid) 10,793 0,14

5. Malono rūgštis (Malonic acid) 10,841 0,01

8. Gintaro rūgštis (Butanedioic acid) 12,633 1,56

6 lentelė. Organinių rūgščių sudėtis žiedadulkių tabletėse

(29)

Identifikuotos 5 organinės rūgštys matomos 7 lentelėje. Skirtingai nei ištyrus žiedadulkes (Medicata Filia) dominuojanti rūgštis yra glikolio 0,41 proc., daugiau nei per pus mažesnis kiekis aptiktas skruzdžių rūgšties 0,18 proc. Mažiau nei 0,1 proc. nustatyta obuolių rūgšties 0,09 proc., tik pėdsakai identifikuoti. gintaro rūgšties 0,01 proc. ir malono rūgšties 0,01 proc.

Nr. Junginio pavadinimas Sulaikymo trukmė,

min. Piko plotas, %

2. Obuolių rūgštis (2–Hydroxybutanedioic acid) 10,478 0,09 3. Glikolio rūgštis (2–Hydroxyethanoic acid) 10,803 0,41

3.1.3. Žiedadulkių (Brolių medus) organinių rūgščių nustatymas

Ištyrus žiedadulkes (Brolių medus) aptiktos 4 organinės rūgštys, kurios buvo identifikuotos remiantis sulaikymo laikais pagal standartus ir jų duomenų bazėmis. Nustatyti jų sulaikymo laikai: obuolių rūgštis – 13,345 min., propiono rūgštis – 14,076 min., glikolio rūgštis – 14,307 min. ir gintaro rūgštis – 17,421 min.

7 lentelė. Organinių rūgščių sudėtis žiedadulkėse (Šerkšno medus)

(30)

Žiedadulkėse didžiausia koncentracija nustatyta glikolio rūgšties 0,24 proc., mažesnis kiekis nustatytas propiono rūgšties 0,16 proc.. Po 0,06 proc. aptikta obuolių ir gintaro rūgšties.

Visos tirtos žiedadulkės buvo surinktos Lietuvos teritorijoje. Didžiausias organinių rūgščių spektras nustatytas žiedadulkių tabletėse (Medicata Filai) ir žiedadulkėse (Šerkšno medus). Sudėtis svyruoja nuo 4 iki 6 identifikuojamų organinių rūgščių. Pirmame mėginyje buvo nustatyta propiono rūgštis, o antrame mėginyje obuolių rūgštis. Žiedadulkėse (Brolių medus) skruzdžių rūgštis nebuvo identifikuota, kuri buvo įvertinta pirmame ir antrame mėginyje. Didžiausias bendras organinių rūgščių kiekis aptiktas žiedadulkių tabletėse (Medicata Filia) (8 pav.), dėl didelės gintaro rūgšties koncentracijos. Lyginant dviejų rūšių žiedadulkes („Šerkšno medus“ ir „Brolių medus“) skirtumas nėra statistiškai reikšmingas (p<0,05), tačiau lyginat žiedadulkių tabletes (Medicata Filia ) su žiedadulkėmis („Šerkšno medus“ ir „Brolių medus“) skirtumas yra statistiškai reikšmingas (p>0,05).

min. Piko plotas, % 2. Obuolių rūgštis (2–Hydroxybutanedioic acid) 13,345 0,06

1,77 0,7 0,52 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 Be nd ra s org an in ių rų gšč ių k iek is %

Žiedadulkių tabletės (Medicata Filia) Žiedadulkės (Šerkšno medus) Žiedadulkės (Brolių medus)

8 pav. Bendras organinių rūgščių įvairavimas ištirtuose žiedadulkėse 8 lentelė. Organinių rūgščių sudėtis žiedadulkėse (Brolių medus)

(31)

Atlikus literatūros apžvalgą žiedadulkėse taip pat identifikuojama gliukolio rūgštis (5,9– 32g/kg). Pieno, acto, citrinos, oksalo, gintaro, obuolių ir vyno rūgštys randamos mažesniais kiekiais (1g/kg.) [43]. Tyrimo metu nėra gautos identiškos medžiagos, kadangi organinių rūgščių sudėtis priklauso nuo gėlių rūšies ir regiono kuriame buvo surinktos žiedadulkės.

3.1.4. Organinių rūgščių nustatymas bičių duonelės pastilės (Medicata Filia)

Bičių duonelės pastilėse (Medicata Filai) pagal standartų masių spektro duomenis buvo identifikuotos 6 organines rūgštis, kurių sulaikymo laikai: obuolių rūgšties – 9,982 min., acto rūgšties – 10,602 min., propiono rūgšties – 10,660 min., glikolio rūgšties – 10,785 min., malono rūgšties – 10,833 min.

Atlikus bičių duonelės pastilių chromatografinę analizę didžiausias procentinis kiekis gautas obuolių rūgšties 0,16 proc., per puse mažesnis kiekis identifikuotas glikolio rūgšties 0,06 proc.. Propiono rūgšties nustatyta 0,03 proc., mažiausiai duomenų bazės aptiktiko acto rūgšties 0,02 proc. ir malono rūgšties 0,01 proc.

(32)

9 lentelė. Organinių rūgščių sudėtis bičių duonelės pastilėse (Medicata Filai)

3. Acto rūgštis (Acetic acid) 10,602 0,02

3.1.5. Organinių rūgščių nustatymas bičių duonelėje (Šerkšno medus)

Remiantis sulaikymo laikais pagal standartų masių spektro duomenis, bičių duonelėje (Šerkšno medus) buvo identifikuoti ne visi pikai ir rastos tik 3 organinės rūgštys. Propiono rūgšties sulaikymo laikas – 10,672 min., glikolio rūgšties sulaikymo laikas – 10,809 min., citrinos rūgšties sulaikymo laikas – 17,459 min.

Nustatyta, kad bičių duonelėje (Šerkšno medus) dominuojanti rūgštis yra glikolio. Nustatytas net 1,41 proc. Citrinų rūgšties aptikta 0,83 proc. Ir nedidelis procentinis kiekis identifikuotas propiono rūgšties – 0,04 proc.

(33)

10 lentelė. Organinių rūgščių sudėtis bičių duonelėje (Šerkšno medus)

Nr. Junginio pavadinimas _{trukmė, min.}Sulaikymo Piko plotas, %

3. Glikolio rūgštis (2–Hydroxyethanoic acid) 10,809 1,41 8. Citrinos rūgštis (2–Hydroxypropane–1,2,3–

tricarboxylic acid)

17,459 0,83

3.1.6. Organinių rūgščių nustatymas bičių duonelėje (Brolių medus)

Atlikus chromatografinę analizę (11 pav.) ir palyginus duomenis su standarto sulaikymo laikais duomenų bazėje atpažinti 5 pikai. Obuolių rūgšties sulaikymo laikas – 13,346 min., propiono rūgšties sulaikymo laikas – 14,076 min., glikolio rūgšties sulaikymo laikas – 14,308 min., oksalo rūgšties sulaikymo laikas – 14,352 min., propiono rūgšties sulaikymo laikas – 15,252 min.

(34)

12 pav. Bendras organinių rūgščių įvairavimas ištirtuose bičių duonelėse 11 lentelė. Organinių rūgščių sudėtis bičių duonelėje (Brolių medus)

Tirtoje bičių duonelėje (Brolių medus) didžiausias kiekis nustatytas glikolio rūgšties – 0,25 proc.. Panašus kiekis identifikuotas propiono rūgšties (2–[tert–butyl(dimethyl)silyl]oxypropanoate) – 0,10 proc. ir obuolių rūgšties – 0,09 proc. Nedideli kiekiai aptikti oksalo rūgšties – 0,03 proc. ir propiono rūgšties (3–[tert–butyl(dimethyl)silyl]propanoate ) – 0,02 proc.

Tyrimo metu buvo ištirtos bičių duonelės surinktos Lietuvos teritorijoje. Visų trijų mėginių organinių rūgščių sudėtis buvo skirtinga. Daugiausia rūgščių buvo aptikta duonelės pastilėse (Medicata Filia) ir bičių duonelėje (Brolių medus). Pirmas mėginys išsiskyrė tuo, kad buvo identifikuota acto rūgštis (0,02 proc.) ir malono rūgštis (0,01 proc.). Bičių duonelėje (Šerkšno medus) buvo įvertinta 0,83 proc. citrinos rūgšties. Bičių duonelėje (Brolių medus) duomenų bazė nustatė oksalo rūgšties (0,03 proc.) buvimą mėginyje. Lyginant suminį organinių rūgščių kiekį, didžiausias aptiktas bičių duonelėje (Šerkšno medus) (12 pav.), nors ten buvo rastos vos 3 organinės rūgštys. Lyginant bičių duonelę (Šerkšno medus) su bičių duonelę (Brolių medus) ir bičių duoneles pastilėmis (Medicata Filia) skirtumas yra statistiškai reikšmingas (p>0,05).

0,28 2,28 0,49 0 0,5 1 1,5 2 2,5 Be nd ra s org an in ių rū gšč ių k iek is %

Bičių duonelės pastilės (Medicata Filia) Bičių duonėlė (Šerkšno medus) Bičių duonelė (Brolių medus)

3. Propiono rūgštis (2–[tert–

butyl(dimethyl)silyl]oxypropanoate)

14,076 0,10

5. Oksalo rūgštis (Ethanedioic acid) 14,352 0,03

butyl(dimethyl)silyl]propanoate)

(35)

Gauti organinių rūgščių duomenys buvo lyginami su kitų mokslininkų tyrimu. Isidorov, VA., Isidorova, AG., Sczczepaniak, L., ir Czyżewska, U. atliko bičių duonelės rinktos Lenkijoje, Latvijoje ir Rusijoje cheminę analizę. Mėginiuose buvo identifikuota: glikolio rūgštis 0,2–0.4 proc., pieno rūgštis 0,1–0,7 proc., obuolių rūgštis 0,02 proc., gintaro rūgštis 0,5–1,6 proc. ir dodekano rūgštis 0,03–0,05 proc. [61]. Lenkijos mokslininkų bičių duonelės organinių rūgščių sudėtis skiriasi. Tai gali būti susiję suskirtingomis klimato sąlygomis, rinkimo sezonu ir augalų rūšimi.

3.1.7. Organinių rūgščių nustatymas Apilakas 70 (Medicata Filia)

Masių spektro duomenų bazė identifikavo 10 organinių rūgščių (13 pav.). Pikai atskirti vienas nuo kito, todėl metodika ir derivatizatorius pritaikytas tinkamai. Skruzdžių rūgšties sulaikymo laikas – 8,540 min., obuolių rūgšties sulaikymo laikas – 8,983 min., acto rūgšties sulaikymo laikas – 10,603 min., propiono rūgšties sulaikymo laikas – 10,662 min.

12 lentelėje nurodytos organinės rūgštys ir jų piko plotai procentais. Didžiausias nustatytas procentinis kiekis yra obuolių rūgšties 0,21 proc.. Glikolio rūgšties aptikta 0,08 proc., per pus mažiau identifikuota gintaro rūgšties 0,04 proc. ir propiono rūgšties 0,03 proc. Taip pat buvo aptikta 0,01 proc. acto, malono ir skruzdžių rūgšties.

(36)

3.1.8. Organinių rūgščių nustatymas bičių pienelelyje (Brolių medus)

Atlikus bičių pienelio (Brolių medus) ekstrakto chromatografinę analizę (14 pav.) ir sulyginus duomenų bazės masių spektro duomenis, buvo identifikuotos 6 organinės rūgštys. Obuolių rūgšties sulaikymo laikas – 13,348 min., propiono rūgšties (2–[tert–butyl(dimethyl)silyl]oxypropanoate) sulaikymo laikas – 14,079 min., glikolio rūgšties sulaikymo laikas– 14,310 min., oksalacto rūgšties sulaikymo laikas – 14,676 min., propiono rūgštis (3–[tert–butyl(dimethyl)silyl]propanoate) sulaikymo laikas – 15,257 min.

Ištyrus bičių pienelį (Brolių medus) nustatyta 0,25 proc. gliukolio rūgšties. Propijono rūgšties (2–[tert–butyl(dimethyl)silyl]oxypropanoate) mėginyje aptikta 0,10 proc., obuolių rūgšties – 0,03 proc.,

min. Piko plotas, %

2. Obuolių rūgštis (2–Hydroxybutanedioic acid) 9,983 0,21

3. Acto rūgštis (Acetic acid) 10,603 0,01

6. Malono rūgštis (Propanedioic acid) 10,833 0,01

14 pav. Bičių pienelio (Brolių medus) chromatograma 12 lentelė. Organinių rūgščių sudėtis Apilakas 70 (Medicata Filia)

(37)

oksalacto rūgšties – 0,02 proc. ir propiono rūgšties (3–[tert–butyl(dimethyl)silyl]propanoate) – 0,02 proc.

3.1.9. Organinių rūgščių nustatymas bičių pienelyje (Vaido bitynas)

Pagal gautus duomenų masių spektrus ir jų standartų sulaikymo laikus identifikuotos 4 organinės rūgštys: obuolių rūgšties sulaikymo laikas – 13,351 min., propiono rūgšties sulaikymo laikas – 14,080 min., glikolio rūgšties sulaikymo laikas – 14,313 min., 10–hidroksi–2–deceno rūgšties sulaikymo laikas – 23,521 min.

Tirtame bičių pienelyje (Vaido bitynas) didžiausias procentinis kiekis buvo įvertintas glikolio rūgšties, kuris siekė 0,26 proc. 10–hidroksi–2–deceno rūgšties buvo nustatys mažesnis kiekis 0,22 proc. Taip pat pienelyje aptikta 0,10 proc. propiono rūgšties ir 0,03proc. obuolių rūgšties.

trukmė, min. Piko plotas, % 2. Obuolių rūgštis (2–Hydroxybutanedioic acid) 13,348 0,03

14,079 0,10

4. Glikolio rūgštis (2–Hydroxyethanoic acid) 14,310 0,25 5. Oksaloacto rūgštis (2–Oxobutanedioic acid) 14,676 0,02 7. Propiono rūgštis (3–[tert–butyl(dimethyl)silyl]propanoate) 15,257 0,02

13 lentelė. Organinių rūgščių sudėtis bičių pienelyje (Brolių medus)

(38)

Apilakas 70 (Medicata Filai) tabletės buvo įsigytos vaistinėje, o bičių pienelis (Brolių medus) ir bičių pienelis (Vaido bitynas) buvo įsigyti iš Lietuvos ūkininkų. Didžiausias kiekis organinių rūgščių identifikuotas Apilakas 70 (Medicata Filai). Aptikti 7 organiniai junginiai iš kurių skruzdžių, acto, malono ir gintaro rūgštys įvertinti tik pirmajame mėginyje. Iš ūkininkų įsigyto bičių pienelio sudėtis mažesnė ir svyruoja nuo 4 iki 5 identifikuojamų organinių rūgščių. Svarbiausia 10–hidroksi–2–deceno rūgštis nustatyta tik 3 mėginyje (0,22%). Todėl galima teigti, kad tai mažiausiai apdorotas, natūralus produktas, tinkamas vartoti norint išvengti organizmo sutrikimų. Didžiausias bendras organinių rūgščių kiekis įvertintas taip pat bičių pienelyje (Vaido bitynas) (17 pav.). Lyginant visus tris bičių pienelio mėginius statistiškai reikšmingas pokytis nebuvo nustatytas (p<0,05).

Remiantis literatūros šaltiniais Lenkijos mokslininkai tirdami bičių pienelį dujų chromatografijos masių spektrometrijos metodu identifikavo: pieno rūgštį (0,01–1 proc.), gintaro rūgštį (0,01–1 proc.), obuolių rūgštį (0,03 proc.), glikolio rūgštį (0,03 proc.) 10–hidroksi–2–deceno

trukmė, min.

Piko plotas, % 2. Obuolių rūgštis (2–Hydroxybutanedioic acid) 13,351 0,03 3. Propiono rūgštis (2–[tert–butyl(dimethyl)silyl]oxypropanoate) 14,080 0,10 4. Glikolio rūgštis (2–Hydroxyethanoic acid) 14,313 0,26

7. 10–hidroksi– 2–deceno rūgštis (10–HDA) 23,521 0,22

16 pav. Bendras organinių rūgščių įvairavimas ištirtuose bičių pieneliuose

0,39 0,42 0,61 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 1 kategorija Ben d ras o rg an in ių rū gš či ų ki eki s %

Apilakas 70 (Medicata Filia) Bičių pienelis (Brolių medus) Bičių pienelis (Vaido bitynas) 14 lentelė. Organinių rūgščių sudėtis bičių pienelyje (Vaido bitynas)

(39)

rūgštį (0,02 proc.) ir 10–hidroksi dekano rūgštį (0,1–0,6 proc.) [61]. Lyginant su Lenkijos mokslininkų ištirtais organiniais junginiais nustatytos 3 identiškos organinės rūgštys ir jų kiekai.

3.1.10. Organinių rūgščių nustatymas meduje (Brolių medus)

Ištyrus medų (Brolių medus), organinės rūgštys buvo identifikuotos remiantis sulaikymo laikais pagal standartus ir duomenų bazėmis. Propiono rūgšties (2–[tert– butyl(dimethyl)silyl]oxypropanoate) sulaikymo laikas – 14,082 min., glikolio rūgšties sulaikymo laikas – 14,315 min., propiono rūgšties (3–[tert–butyl(dimethyl)silyl]propanoate) sulaikymo laikas – 15,258 min.

Didžiausias procentinis kiekis nustatytas glikolio rūgšties 0,28 proc., propiono rūgšties (2– [tert–butyl(dimethyl)silyl]oxypropanoate) 0,09 proc. ir tik pėdsakai įvertinti propiono rūgšties (3– [tert–butyl(dimethyl)silyl]propanoate) 0,03 proc.

(40)

15 lentelė. Organinių rūgščių sudėtis meduje (Brolių medus)

3.1.11. Organinių rūgščių nustatymas meduje (Medicata Filia)

Atlikus medaus (Medicata Filia) chromatografinę analizę (19 pav.)ir palyginus rezultatus su duomenų bazėje esančiais sulaikymo laikais, atpažintos šios rūgštys: obuolių rūgštis ir jos sulaikymo laikas – 13,351 min., propiono rūgštis ir jos sulaikymo laikas – 14,082 min., glikolio rūgštis ir jos sulaikymo laikas – 14,314 min. ir itakono rūgštis ir jos sulaikymo laikas– 19,913 min.

Atlikus chromatogramos analizę ir identifikavus junginių sulaikymo laikus duomenų bazė aptiko 3 organines rūgštis, kurios pavaizduotos 15 lentelėje. Kaip ir pirmame medaus mėginyje aptiktas didžiausias kiekis glikolio rūgšties 0,26 proc.. Taip pat nustatyta 0,09 proc. propiono rūgšties, 0,03 proc. obuolių rūgštie ir 0,02 proc. itakono rūgšties.

Nr. Junginio pavadinimas Sulaikymo trukmė, min. Piko plotas, % 2. Propiono rūgštis (2–[tert–butyl(dimethyl)silyl]oxypropanoate) 14,082 0,09

4. Propiono rūgštis (3–[tert–butyl(dimethyl)silyl]propanoate) 15,258 0,03

(41)

16 lentelė. Organinių rūgščių sudėtis meduje (Medicata Filia)

trukmė, min. Piko plotas, % 2. Obuolių rūgštis (2–Hydroxybutanedioic acid) 13,351 0,03

14,082 0,09

4. Glikolio rūgštis (2–Hydroxyethanoic acid) 14,314 0,26 8. Itakono rūgštis (2–Methylidenebutanedioic acid) 19,913 0,02

3.1.12. Organinių rūgščių nustatymas meduje

Pagal gautus duomenų masių spektro ir jų standartų sulaikymo laikus identifikuotos tik 3 organinės rūgštys. Propiono rūgštis (2–[tert–butyl(dimethyl)silyl]oxypropanoate) – 14,085min., glikolio rūgštis – 14,318min., propiono rūgštis (3–[tert–butyl(dimethyl)silyl]propanoate) – 15,265min

Meduje nustatytas didžiausias kiekis glikolio rūgšties, kuris siekia 0,08 proc. Identifikuoti 0,03 proc. propiono rūgšties (2–[tert–butyl(dimethyl)silyl]oxypropanoate) ir propiono rūgšties (3–[tert– butyl(dimethyl)silyl]propanoate) pėdsakai 0.01proc.

(42)

Ištirtuose trijuose medaus mėginiuose nustatytos 2 identiško rūgštys (Propiono ir gliukolio). Antrasis mėginys medus (Medicata Filia) pirktas vaistinėje, išsiskyrė tuo, kad nustatytas platesnis organinių junginių spektras. Identifikuota obuolių (0,03 proc.) ir itakono (0,02 proc.) rūgštys, kurių nebuvo aptikta pirmame ir trečiame mėginyje. Didžiausias bendras organinių rūgščių kiekis po 0,4 proc. įvertintas meduje (Brolių medus) ir meduje (Medicata Filia) (20 pav.) ir paklaidos neviršijo leistinos p<0,05 ribos.

3.2. Tyrimo rezultatų apibendrinimas

Organinės rūgštys bičių produktuose buvo įvertintos DC–MS metodu, taikant derivatizacijos metodą. Metodas pritaikytas tinkamai, kadangi iš viso buvo nustatyta 12 organinių rūgščių: glikolio, propiono, obuolių, citrinos, oksalo, oksalacto, acto, skruzdžių, gintaro, 10–HDA, malono ir itakono.

Lyginant tyrimo rezultatus bičių produktuose sudėtis svyruoja nuo 3 iki 5 identifikuojamų organinių rūgščių. Išimtis bičių pienelio tabletės (Apilakas 70). Šiame mėginyje duomenų bazės

trukmė, min. Piko plotas, % 2. Propiono rūgštis (2–[tert–

14,085 0,03

3. Glikolio rūgštis (2–Hydroxyethanoic acid) 14,318 0,08 5. Propiono rūgštis (3–[tert–

butyl(dimethyl)silyl]propanoate)

15,265 0,01

20 pav. Bendras organinių rūgščių įvairavimas ištirtame meduje

0,4 0,4 0,12 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 0,45 Be nd ra s org an in ių rū gšč ių k iek is %

(43)

nustatytos 7 organinės rūgštys. Didžiausias bendras organinių rūgščių kiekis identifikuotas bičių duonelėje (Šerkšno medus) (2,28 proc.). Mažiausias rūgšių kiekis įvertintas bičių duonelės pastilėse (Medicata Filia) (0,28 proc.). Visuose 12 mėginiuose dominavo ir buvo aptikta glikolio rūgštis. Propiono rūgštis įvertinta 11 – oje mėginių, nebuvo aptikta žiedadulkių (Šerkšno medus) sudėtyje. Svarbiausias bičių pienelio kiekybinio ir kokybinio įvertinimo 10–HDA rūgštis buvo nustatytas bičių pienelyje (Vaido bitynas) (0,22 proc.).

(44)

4. IŠVADOS

1. Tyrimo metu visuose bičių produktuose buvo nustatytos organinės rūgštys ir įvertinti jų kiekiai., todėl galima teigti, kad ekstrakcijos sąlygos buvo parinktos tinkamai. Ekstrakcijai iš bičių produktų buvo naudojamas metanolis kaip tirpiklis ir ultragarso vonelę.

2. Atlikus literatūros analizę, pastebėta, kad naudojant derivatizacijos reagentą MTBSTFA, organinės rūgštys pasižymėjo didesniu lakumu ir tapo tinkamos chromatografinei analizei. 3. Tyrimo metu nustatyta, kad didžiausias bendras organinių rūgščių kiekis nustatytas bičių

duonelėje (Šerkšno medus) (2.28 proc.), mažiausias organinių rūgščių kiekis nustatytas bičių duonelės pastilėse (Medicata Filia) (0,28 proc.). Ištyrus žiedadulkes, didžiausias organinių rūgščių procentinis kiekis aptiktas žiedadulkių tabletėse (Medicata Filia) (1,77 proc.). Ištyrus bičių pienelį, didžiausiu identifikuotu organinių rūgščių kiekiu pasižymėjo bičių pienelis (Vaido bitynas) (0,61 proc.). Tiriant medų, dvejuose mėginiuose (Brolių medus ir Medicata Filia) buvo nustatytas didžiausias organinių rūgščių kiekis (0,4 proc.).

(45)

5. REKOMENDACIJOS

Pritaikyta dujų chromatografijos masių spektrofotometrijos metodika tinkama identifikuoti organines rūgštis bičių produktuose. Todėl reikėtų tolimesnių, kadangi organinių rūgščių sudėtis labai priklauso nuo bičių produktų geografinės ir botaninės kilmės. Remiantis atliktais tyrimais norit gauti didžiausią kiekį organinių rūgščių reikia vartoti bičių duonelę (Šerkšno medus).