DARBAS ATLIKTAS FARMACINIŲ TECHNOLOGIJŲ INSTITUTE PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Paprastųjų žemuogių (Fragaria vesca L.) žiedų, vaisių ir lapų fitocheminis tyrimas“.
1. Yra atliktas mano pačios.
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.
Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
2020 m. gegužės mėn. 5 d. Agnė Morkūnaitė
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuviu kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
2020 m. gegužės mėn. 5 d. Agnė Morkūnaitė
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO
Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS FARMACINIŲ TECHNOLOGIJŲ INSTITUTE
Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
2020 m. gegužės mėn. 11 d. prof. dr. Valdas Jakštas
(aprobacijos data ) (katedros (klinikos, instituto) vedėjo (-os) (vadovo (-ės)) (parašas)
vardas, pavardė)
Baigiamojo darbo recenzentas
Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
(vardas, pavardė) (parašas)
Baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
FARMACINIŲ TECHNOLOGIJŲ INSTITUTAS
AGNĖ MORKŪNAITĖ
PAPRASTŲJŲ ŽEMUOGIŲ (FRAGARIA VESCA L.) ŽIEDŲ, VAISIŲ IR LAPŲ FITOCHEMINIS TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas Prof. dr. Lina Raudonė
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
FARMACINIŲ TECHNOLOGIJŲ INSTITUTAS
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanė prof. dr. Ramunė Morkūnienė Data
PAPRASTŲJŲ ŽEMUOGIŲ (FRAGARIA VESCA L.) ŽIEDŲ, VAISIŲ IR LAPŲ FITOCHEMINIS TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Prof. dr. Lina Raudonė Data
Recenzentas Darbą atliko
Magistrantė Agnė Morkūnaitė
Data Data
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 7
SANTRUMPOS ... 9
ĮVADAS ... 10
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 11
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 12
1.1. Augalo morfologiniai požymiai ir paplitimas ... 12
1.2. Paprastųjų žemuogių (F. vesca L.) žaliavų fitocheminė sudėtis ... 12
1.3. Veiksniai turintys įtakos biologiškai aktyvių junginių kiekiui žemuogių vaisiuose ... 14
1.3.1. Genetiniai veiksniai (rūšis ir veislė) ... 14
1.3.2. Vaisių brandos stadija ... 15
1.3.3. Vaisių laikymo sąlygos ... 16
1.3.4. Vaisių perdirbimo metodas ... 17
1.4. Fenolinių junginių antioksidantinis poveikis ... 18
1.4.1. Fenolinių junginių struktūros ir antioksidantinio aktyvumo ryšys ... 19
1.5. Žemuogių (Fragaria) žaliavų panaudojimas ir farmakologiniai poveikiai ... 20
1.6. Žemuogių žaliavų priešuždegiminis poveikis ... 20
1.6.1. Antikoaguliantinis poveikis ... 21
1.6.2. Poveikis neurodegeneracinių ligų valdymui ... 22
1.7. Žemuogių žaliavų poveikis širdies ir kraujagyslių sistemai ... 23
1.8. Žemuogių žaliavų priešvėžinis poveikis ... 24
2. TYRIMO METODIKA ... 26
2.1. Tyrimo objektas ... 26
2.2. Naudotos medžiagos ir reagentai ... 28
2.3. Naudota aparatūra ... 28
2.4. Tyrimų metodai ... 28
2.4.1. Žemuogių (Fragaria vesca L.) žiedų, vaisių ir lapų ekstraktų paruošimas ... 28
2.4.2. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas Folin – Ciocalteu reagentu ... 29
2.4.3. Laisvųjų radikalų surišimo gebos nustatymas ABTS metodu ... 29
2.4.5. Fenolinių junginių kokybinis ir kiekybinis nustatymas ESC metodu ... 31
2.5. Statistinė duomenų analizė ... 31
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 32
3.1. Ekstrakcijos tirpiklio nustatymas ... 32
3.2. Bendro fenolinių junginių kiekio įvertinimas žemuogių žiedų ir vaisių ekstraktuose ... 34
3.3. Bendro fenolinių junginių kiekio įvertinimas žemuogių lapų ekstraktuose ... 35
3.4. Antiradikalinio aktyvumo įvertinimas žemuogių žiedų ir vaisių ekstraktuose ... 36
3.5. Antiradikalinio aktyvumo įvertinimas žemuogių lapų ekstraktuose ... 38
3.6. Redukcinio aktyvumo įvertinimas žemuogių žiedų ir vaisių ekstraktuose ... 39
3.7. Redukcinio aktyvumo įvertinimas žemuogių lapų ekstraktuose ... 40
3.8. Fenolinių junginių kokybinės ir kiekybinės sudėties įvertinimas žemuogių žiedų ir vaisių ekstraktuose ... 42
3.9. Fenolinių junginių kokybinės ir kiekybinės sudėties įvertinimas žemuogių lapų ekstraktuose .... 44
4. IŠVADOS ... 49
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 51
SANTRAUKA
A. Morkūnaitės magistro baigiamasis darbas/ mokslinė vadovė prof. dr. Lina Raudonė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmacijos fakulteto Farmacinių technologijų institutas. Kaunas, 2020.
Pavadinimas: Paprastųjų žemuogių (Fragaria vesca L.) žiedų, vaisių ir lapų fitocheminis tyrimas. Tyrimo tikslas: Nustatyti fenolinių junginių kiekį ir antioksidantinį aktyvumą, vegetacijos laikotarpiu, natūraliose augavietėse surinktų paprastųjų žemuogių (Fragaria vesca L.) žiedų, vaisių ir lapų mėginiuose.
Uždaviniai: 1. Nustatyti bendrą fenolinių junginių kiekį žemuogių žiedų, vaisių ir lapų mėginiuose, Folin – Ciocalteu reagentu. 2. Įvertinti žemuogių žiedų, vaisių ir lapų mėginių antiradikalinį aktyvumą ABTS metodu. 3. Įvertinti žemuogių žiedų, vaisių ir lapų mėginių redukcinį aktyvumą FRAP metodu. 4. Nustatyti fenolinių junginių kokybinę ir kiekybinę sudėtį, žemuogių žiedų, vaisių ir lapų mėginiuose, efektyviosios skysčių chromatografijos metodu.
Tyrimo objektas ir metodai: Tyrimo objektas - paprastųjų žemuogių (Fragaria vesca L.) žiedų, vaisių ir lapų ėminiai surinkti natūraliose augavietėse, Medinų kaime (Ukmergės raj.) ir Gražumyno kaime (Anykščių raj.), augalo vegetacijos laikotarpiu. Bendras fenolinių junginių kiekis, antiradikalinis ir redukcinis aktyvumas nustatytas spektrofotometriniu analizės metodu. Fenolinių junginių kokybinė ir kiekybinė sudėtis nustatyta efektyviosios skysčių chromatografijos metodu.
Tyrimo rezultatai ir išvados: Gražumyno kaime surinktų vaisių ėminių ekstraktuose bendras fenolinių junginių kiekis, nustatytas Folin – Ciocalteu reagentu, svyruoja nuo 29,86±1,67 mg/g iki 127,61±3,32 mg/g. Didžiausias kiekis (p<0,05) nustatytas vegetacijos pradžioje, žiedų ekstraktuose (134,51±0,54 mg/g) ir vaisių vystymosi pradžioje, žalsvos spalvos vaisių ekstraktuose, o mažiausias vaisių nokimo metu ir derėjimo pabaigoje. Stipriausias (p<0,05) antiradikalinis ir redukcinis aktyvumas nustatytas taip pat vegetacijos pradžioje, žiedų ekstraktuose. Lapų ėminių ekstraktuose bendras fenolinių junginių kiekis svyruoja nuo 67,97±1,02 mg/g iki 112,78±0,34 mg/g. Didžiausias kiekis (p<0,05) nustatytas rugpjūčio mėnesį, o mažiausias lapų senėjimo tarpsniais, rugsėjo ir spalio mėnesiais. Stipriausias (p<0,05) antiradikalinis ir redukcinis aktyvumas nustatytas augalo vystymosi ir brendimo tarpsniais: birželio, liepos ir rugpjūčio mėnesiais.
Medinų kaime surinktų vaisių ėminių ekstraktuose bendras fenolinių junginių kiekis, nustatytas Folin – Ciocalteu reagentu, svyruoja nuo 32,78±0,07 mg/g iki 145,39±1,41 mg/g. Didžiausias kiekis (p<0,05), nustatytas vaisių vystymosi pradžioje, žalsvos spalvos vaisių ekstraktuose, o mažiausias vaisių nokimo metu ir derėjimo pabaigoje. Stipriausias (p<0,05) antiradikalinis ir redukcinis aktyvumas nustatytas
taip pat vaisių vystymosi pradžioje, žalsvos spalvos vaisių ekstraktuose. Lapų ėminių ekstraktuose bendras fenolinių junginių kiekis svyruoja nuo 67,02±1,81 mg/g iki 139,51±1,53 mg/g. Didžiausias kiekis (p<0,05) nustatytas birželio ir rugpjūčio mėnesiais, o mažiausias rugsėjo ir spalio mėnesiais. Stipriausias (p<0,05) antiradikalinis aktyvumas nustatytas birželio ir rugpjūčio mėnesiais, o redukcinis liepos ir rugpjūčio mėnesiais.
Abiejose augavietėse surinktų žemuogių žiedų, vaisių ir lapų ėminių ekstraktuose, efektyviosios skysčių chromatografijos metodu, daugiausiai nustatyta (+)-katechino. Žiedų ekstraktuose (+)-katechino kiekis siekia 66060,50±1348,44 µg/g, vaisių ekstraktuose svyruoja nuo 2476,94±52,58 µg/g iki 54058,51± 1103,45 µg/g, o lapų ekstraktuose nuo 6728,53±87,13 µg/g iki 41938,46±856,08 µg/g. Kiti nustatytų profilių reikšmingi žymenys – izorhamnetino-3-O-rutinozidas, elago rūgštis ir (-)-epikatechinas.
SUMMARY
A. Morkūnaitė master’s thesis. Supervisor prof. dr. Lina Raudonė; Lithuanian University of Health Sciences, The Faculty of Pharmacy, The Institute of Pharmaceutical Technologies. Kaunas, 2020.
The Title: Phytochemical research of wild strawberry (Fragaria vesca L.) blossoms, fruits and leaves.
The aim of the research: To determine the content of phenolic compounds and antioxidant activity in the samples of blossoms, fruits and leaves of wild strawberries (Fragaria vesca L.) collected in natural habitats during the vegetation period.
The objectives of the research: To determine the total content of phenolic compounds in the samples of blossoms, fruits and leaves of wild strawberries using the Folin-Ciocalteu reagent. 2. To evaluate the antiradical activity of the samples of blossoms, fruits and leaves of wild strawberries by the ABTS method. 3. To evaluate the reducing activity of the samples of blossoms, fruits and leaves of wild strawberries by the FRAP method. 4. To determine the qualitative and quantitative composition of phenolic compounds in the samples of blossoms, fruits and leaves of wild strawberries by means of high-performance liquid chromatography.
The object and methods of the research: The research object is the samples of blossoms, fruits and leaves of wild strawberries (Fragaria vesca L.) collected in natural habitats during the vegetation period. The total content of phenolic compounds, antiradical and reducing activity were determined by means of spectrophotometric analysis. The qualitative and quantitative composition of phenolic compounds was determined by means of high-performance liquid chromatography.
The results and conclusions of the research: The total content of phenolic compounds in the samples of fruits collected in Gražumynas village, which was determined by the Folin-Ciocalteu reagent, ranges from 29.86±1.67 mg/g to 127.61±3.32 mg/g. The highest content (p<0.05) was determined at the beginning of vegetation in blossom extracts (134.51±0.54 mg/g) and at the beginning of fruit development in greenish fruit extracts, and the lowest content was determined during fruit ripening and at the end of ripening. The strongest (p<0.05) antiradical and reducing activity was also determined at the beginning of vegetation in blossom extracts. The total content of phenolic compounds in the samples of leaf extracts ranges from 67.97±1.02 mg/g to 112.78±0.34 mg/g. The highest content (p<0.05) was determined in August and the lowest content was determined in September and October during the stages of leaf ageing. The strongest (p<0.05) antiradical and reducing activity was determined during the stages of plant development and maturation in June, July and August.
The total content of phenolic compounds in the samples of fruits collected in Medinos village, which was determined by the Folin-Ciocalteu reagent, ranges from 32.78±0.07 mg/g to 145.39±1.41 mg/g. The highest content (p<0.05) was determined at the beginning of fruit development in greenish fruit extracts, and the lowest content was determined during fruit ripening and at the end of ripening. The strongest (p<0.05) antiradical and reducing activity was also determined at the beginning of fruit development in greenish fruit extracts. The total content of phenolic compounds in the samples of leaf extracts ranges from 67.02±1.81 mg/g to 139.51±1.53 mg/g. The highest content (p<0.05) was determined in June and August and the lowest content was determined in September and October. The strongest (p<0.05) antiradical activity was determined in June and August, while reducing activity in July and August.
Using the method of high-performance liquid chromatography, the content of (+)-catechin was determined to be the highest in the samples of blossoms, fruits and leaves of wild strawberries. The content of (+) - catechin in blossom extracts is 66060.50±1348.44 µg/g, in fruit extracts ranges from 2476.94±52.58 µg/g to 54058.51±1103.45 µg/g, while in leaf extracts ranges from 6728.53±87.13 µg/g to 41938.46±856.08 µg/g. Other significant markers of determined profiles were isorhamnetin-3-O-rutinoside, ellagic acid and (-)-epicatechin.
SANTRUMPOS
ESC – efektyvioji skysčių chromatografija
DMD – diodų matricos detektorius (angl. diode array detector)
ESI/MS – elektropurkštuvinė jonizacija/masių spektrometrija (angl. electrospray ionization/ mass spectrometry)
CRB – C reaktyvinis baltymas
ABTS – 2,2'-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgštis) (angl. 2,2'azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid)
FRAP – geležies (III) jonų redukcijos antioksidantinė galia (angl. ferric reducing antioxidant power) NKκB – branduolio faktorius kappa B (angl. nuclear factor kappa B)
ADP – adenozino difosfatas
NADP – nikotinamido adenino dinukleotido fosfatas
TNF-α – navikų nekrozės faktorius alfa (angl. tumor necrosis factor alpha) L-NAME – nitro-L-arginino metilo esteris
ROS – aktyvieji deguonies junginiai (angl. reactive oxygen species) RNS – aktyvieji azoto junginiai (angl. reactive nitrogen species)
ĮVADAS
Paprastoji žemuogė (Fragaria vesca L.) daugiametis žolinis augalas, priklausantis erškėtinių šeimai (Rosaceae Juss.), Fragaria genčiai. Žemuogės yra kilusios iš Europos ir vidutinio klimato Azijos regionų, auga Šiaurės pusrutulio subtropinėse zonose. Tradicinėje medicinoje naudojamos žemuogių vaistinės augalinės žaliavos yra žiedai, vaisiai, šaknys, vegetatyvinės augalo dalys: stiebai ir lapai [20]. Žemuogių vaistinėse augalinėse žaliavose gausu maistinių medžiagų: angliavandenių, riebalų rūgščių, organinių rūgščių, cukrų, skaidulinių medžiagų, vitaminų: askorbo rūgšties, tokoferolių, folio rūgšties (B9), mikro ir makroelementų: geležies, vario, cinko, kalcio, magnio, kalio taip pat fenolinių junginių: elago rūgšties darinių (elagitaninų), proantocianidinų, flavonoidų (flavonolių, antocianinų, flavanolių), fenolinių rūgščių, todėl žemuogių žaliavos vis dažniau naudojamos kosmetikos ir maisto papildų gamyboje [10]. Žemuogių žaliavose esančių biologiškai aktyvių junginių sudėčiai ir kiekiui turi įtakos augalo vegetacijos tarpsnis, ekstrakcijos sąlygos taip pat yra atlikta tyrimų, kad junginių kiekis ir sudėtis žemuogių vaisiuose priklauso nuo rūšies, veislės, perdirbimo metodo, aplinkos ir laikymo sąlygų. Žemuogių žaliavose esantys fenoliniai junginiai yra svarbūs organizmui, nes pasižymi antioksidantiniu poveikiu, apsaugo nuo laisvųjų radikalų poveikio, skatina ląstelių regeneraciją, stabdo neurodegeneracinių ligų: alzheimerio, parkinsono ir lėtinių ligų: cukrinio diabeto, širdies ir kraujagyslių, vėžio vystymąsi bei ląstelių senėjimo ir uždegimo procesus. Taip pat pasižymi detoksikuojančiu, antialerginiu, diuretiniu, antikoaguliantiniu, antibakteriniu, gleivinę sutraukiančiu bei virškinimą ir apetitą gerinančiu poveikiu [14].
Žemuogių vaisių ir lapų fitocheminės sudėties tyrimus, tam tikru augalo vegetacijos tarpsniu, atliko nemažai pasaulio mokslininkų, tačiau trūksta tyrimų, kuriuose būtų pateikiamas biologiškai aktyvių junginių kiekio ir antioksidantinio aktyvumo kitimas vegetacijos laikotarpiu. Lietuvoje apskritai nėra atlikta natūraliųjų žemuogių cenopopuliacijų fenolinių junginių tyrimų, todėl tam, kad būtų užtikrintas racionalus žaliavų rinkimas ir natūraliųjų augaviečių išsaugojimas, aktualu ištirti ontogenezės įtaką fenolinių junginių kiekiui ir antioksidantiniam aktyvumui. Taip pat svarbu ištirti Lietuvos resursus ir parinkti vegetacijos tarpsnį, kuriame būtų tikslinga rinkti augalines žaliavas. Tyrimų rezultatai pateiks naujų duomenų apie antioksidantinio aktyvumo ir fenolinių junginių kiekio pasiskirstymą paprastųjų žemuogių žieduose, vaisiuose ir lapuose, vegetacijos laikotarpiu, nuo gegužės iki spalio mėnesio, taip pat apie fenolinių junginių profilius, kurie yra svarbūs žaliavų kokybės charakterizavimui.
Mokslinio darbo tikslas – nustatyti fenolinių junginių kiekį ir antioksidantinį aktyvumą, vegetacijos laikotarpiu, natūraliose augavietėse surinktų paprastųjų žemuogių (Fragaria vesca L.) žiedų, vaisių ir lapų mėginiuose.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Tikslas: Nustatyti fenolinių junginių kiekį ir antioksidantinį aktyvumą, vegetacijos laikotarpiu, natūraliose augavietėse surinktų paprastųjų žemuogių (Fragaria vesca L.) žiedų, vaisių ir lapų mėginiuose.
Uždaviniai:
1. Nustatyti bendrą fenolinių junginių kiekį žemuogių žiedų, vaisių ir lapų mėginiuose Folin – Ciocalteu reagentu.
2. Įvertinti žemuogių žiedų, vaisių ir lapų mėginių antiradikalinį aktyvumą ABTS metodu. 3. Įvertinti žemuogių žiedų, vaisių ir lapų mėginių redukcinį aktyvumą FRAP metodu.
4. Nustatyti fenolinių junginių kokybinę ir kiekybinę sudėtį žemuogių žiedų, vaisių ir lapų mėginiuose efektyviosios skysčių chromatografijos metodu.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Augalo morfologiniai požymiai ir paplitimas
Paprastoji žemuogė (Fragaria vesca L.) yra erškėtinių (Rosaceae Juss.) šeimos daugiametis 5-20 cm aukščio žolinis, šakniastiebinis augalas. Stiebas (žiedynstiebis), status, nedaug aukštesnis už skrotelinius lapus, apaugęs prigludusiais arba kiek įžambiniais plaukeliais. Lapai ilgakočiai, sudėtiniai, kiaušiniški sudaryti iš trijų dalių, pjūkliškai dantytu kraštu, apatinė jų pusė apaugusi šilkiškais, o viršutinė laisvais, truputį prigludusiais plaukeliais. Šakniastiebis trumpas su pridėtinėmis šaknimis, rusvos spalvos. Žiedai balti su penkiais apskritais, 5-6 mm ilgio vainiklapiais, kurie išsivysto belapių, plaukuotų žiedkočių viršūnėse. Taurelė vertikali žiedkočio atžvilgiu ir dažniausiai, nokstant vaisiui, atlenkta atgal. Peržydėjus žiedui žiedsostis išauga į mėsingą, kvapnų, sultingą, raudoną netikrąjį vaisių. Uogos-netikrieji raudoni vaisiai, kurių paviršiuje yra tikrieji vaisiai smulkūs, rusvi riešutėliai (lukštavaisiai). Augalas žydi gegužės-birželio mėnesiais, vaisius subrandina gegužės-birželio-liepos mėnesiais. Dauginasi vegetatyviškai, šliaužiančiais, įsišaknijančiais ūgliais (ūsais, palaipomis) ir sėklomis. Žemuogės paplitusios beveik visoje Europoje, Rytų Azijoje, Šiaurės Amerikoje, auga kalnų zonose, lapuočių ir spygliuočių miškuose ypač kirtimuose, pamiškėse, šlaituose, krūmuose ir pievose. Žemuogės yra šviesamėgis, saulėtų vietų augalas. Mėgsta vidutinio drėgnumo, derlingesnius dirvožemius [22,8].
1.2. Paprastųjų žemuogių (F. vesca L.)
žaliavų fitocheminė sudėtis
M. I. Dias ir kt, (2016) atliko paprastųjų žemuogių (F. vesca) vaisių fitocheminės sudėties tyrimą ir nustatė, kad vaisiuose yra angliavandenių – 81,72 g/100g, tirpių maistinių skaidulų (pektinų) – 5,25 g/100g, įvairių tirpių cukrų (sacharozės, gliukozės, fruktozės, rafinozės) – 6,31 g/100g bei organinių rūgščių (citrinų, gintaro, oksalo, obuolių ir askorbo rūgšties) – 7,55 g/100g. Polinesočiosios riebalų rūgštys sudaro 94,49 %, iš kurių daugiausiai linoleno – 43 %, γ-linoleno rūgšties metilo esterio – 40 % ir linolo – 10,59 % [10]. Taip pat yra vitamino B9 – 29,33 µg/100g, tokoferolių (α, β, γ, δ, ) – 2,35 mg/100g bei mikroelementų: mangano – 1,27 mg/100g, geležies – 0,72 mg/100g, cinko – 0,19 mg/100g ir makroelementų: kalcio – 11,8 mg/100g, kalio – 18,7 mg/100g, magnio – 2,9 mg/100g [10]. H. Yildiz ir kt., (2014) nustatė, kad vitamino C kiekis F. vesca vaisiuose svyruoja nuo 38,55 mg/100g iki 57,37 mg/100g [45]. S. Yurdugül, (2008) nustatė, kad F. vesca vaisiuose yra 50,7 mg/100g vitamino C ir 7,28 mg/100g cukrų [46].
M. I. Dias ir kt., (2016) atliko tyrimą ir nustatė, kad F. vesca ekstraktuose (vandens ir metanolio mišiniuose) yra elago rūgšties darinių – 37,9 mg/g, dihidroflavonolių – 7 mg/g, flavan-3-olių – 4,4 mg/g, antocianinų – 9,02 µg/g [10]. H. Yildiz ir kt., (2014) tyrimo metu nustatė, kad F. vesca vaisių ekstraktuose (acetono, vandens ir acto rūgšties mišiniuose), antocianinų kiekis svyruoja nuo 25,11 mg/100g iki 53,51 mg/100g, o elago rūgšties darinių nuo 15,18 mg/100g iki 26,36 mg/100g [45]. M. I. Dias ir kt., (2016) ESC-DMD-MS/ESI metodu nustatė 32 fenolinius junginius iš kurių daugiausiai elago rūgšties darinių: elago rūgšties pentozido, dimetil elago rūgšties pentozido, kastalagino/veskalagino, sanguino H10 izomero, galoil-bis-HHDP gliukozės izomero. Taip pat fenolinių rūgščių: p-kumaro rūgšties ir ferulo rūgšties di-heksozido, flavan-3-olių: procianidino dimero B1 ir (+)-katechino, dihidroflavonolių: taksifolino-3-O-arabinozido, antocianinų: cianidino-3-O-gliukozido, pelargonidino-3-O-gliukozido, 3-gliukozido ir malonilo darinių: cianidino-malonil3-gliukozido, pelargonidino-malonil3-gliukozido, peonidino-malonilgliukozido [10]. J. Milivojevic´ ir kt., (2010) F. vesca vaisiuose nustatė flavonolių: kempferolio – 2,35 µg/g, miricetino – 0,50 µg/g bei kvercetino – 7,34 µg/g [28], o E. Bagdonaitė ir kt., (2013) nustatė hidroksicinamono rūgšties: chlorogeno (1,76 mg/g – 2,93 mg/g) bei flavonolių: rutino (1,07 mg/g – 1,72 mg/g) ir hiperozido (0,58 – 0,8 mg/g) [1].
M. I. Dias ir kt., (2015) atliko vegetatyvinių F. vesca dalių (lapų ir stiebų) fitocheminės sudėties tyrimą ir nustatė angliavandenių – 87,33 g/100g, tirpių cukrų (fruktozės, gliukozės, sacharozės, trehalozės, rafinozės) – 6,08 g/100g, organinių rūgščių (obuolių, citrinų, oksalo, chino) – 4,5 g/100g. Polinesočiosios riebalų rūgštys sudaro 41 %, iš kurių daugiausiai linoleno – 24,8 %, palmitino – 16 %, beheno – 9 % ir lignocerino. Lapuose ir stiebuose taip pat yra mikro ir makroelementų: geležies – 45,3 mg/100g, mangano – 18,3 mg/100g, cinko – 3,3 mg/100g, kalcio – 1272 mg/100g, kalio – 674 mg/100g, magnio – 235,9 mg/100g, folatų 115 µg/100g ir tokoferolių – 6,5 mg/100g [11]. M. I. Dias ir kt. (2017) atliko in vitro užaugintų F. vesca vegetatyvinių žemuogių dalių fitocheminės sudėties tyrimą ir nustatė, kad polinesočiosios riebalų rūgštys sudaro 53,56%, o pagrindinė organinė rūgštis yra oksalo taip pat papildomai nustatė chino ir fumaro rūgšties ir daugiau tokoferolių – 139,35 mg/100g [12]. M. I. Dias ir kt., (2015) tyrimo metu nustatė, kad vegetatyvinių žemuogių dalių (lapų ir stiebų) metanoliniuose ekstraktuose yra elago rūgšties darinių – 69,49 mg/g, flavonolių – 41,42 mg/g, flavan-3-olių – 27,46 mg/g. ESC metodu nustatė 30 fenolinių junginių, iš kurių daugiausiai elago rūgšties darinių: metilelago rūgšties deoksiheksozės, elago rūgšties, bis-HHDP-gliukozės, sanguino H10 izomero. Taip pat nemažai flavonolių: kvercetino O-gliukuronido, kvercetino deoksiheksozės gliukuronido, kempferolio deoksiheksozės gliukuronido, metilkvercetino deoksiheksozės gliukuronido, kvercetino-3-O-rutinozido, kvercetino
heksozės gliukuronido ir flavan-3-olių: (+)-katechino, procianidino dimero, B-tipo(epi)afzelechino-(epi)katechino, (epi)katechino heksozido [9]. L. Buřičová ir kt., (2011) atliko tyrimą ir nustatė, kad pagrindiniai fenoliniai junginiai F. vesca lapuose yra elago rūgštis, (+)-katechinas, epigalokatechinas ir procianidinas B1 [4].
1.3. Veiksniai turintys įtakos biologiškai aktyvių junginių kiekiui žemuogių
vaisiuose
1.3.1. Genetiniai veiksniai (rūšis ir veislė)
Y. Shiow ir kt., (2007) atliko tyrimą, siekiant palyginti F. chiloensis, F. virginiana ir F. × ananassa rūšių fitocheminę sudėtį. ESC tyrimo metu nustatytas panašus fenolinės rūgšties (p-kumaro-gliukozės) ir elago rūgščių kiekis, tačiau flavonolių (kvercetino-3-gliukozido, gliukozido, kempferolio-3-rutinozido) ir antocianinų (cianidino-3-gliukozido, pelargonidino-3-gliukozido) žymiai daugiau nustatyta
F. virginiana rūšies vaisiuose. Bendras fenolinių junginių kiekis F. virginiana vaisiuose (212,28 mg/100g)
didesnis negu F. chiloensis ir F. × ananassa, atitinkamai 160 mg/100g ir 144,86 mg/100g [41]. C. Munoz ir kt., (2011) taip pat atliko tyrimą, siekiant išsiaiškinti įvairių Fragaria genties (F. vesca, F. moschata, F.
chiloensis ir F. x ananassa, (cv. Camarosa, cv. Parker) vaisių fitocheminę sudėtį. ESC-MS metodu
nustatyta, kad tarp žemuogių genotipų yra metaboliniai skirtumai. Tyrimo metu nustatyta, kad visų rūšių vaisiuose yra antocianinų: gliukozido, cianidino-3-O-gliukozido ir pelargonidino-3-O-rutinozido. Daugiausiai cianidino-3-O-gliukozido kaupia F. vesca vaisiai, o mažiausiai F. x ananassa (cv. Camarosa, cv. Parker) ir F. chiloensis, o pelargonidino-3-O-gliukozidas dominuoja F. x ananassa (cv. Camarosa) ir F. vesca vaisiuose. Visų rūšių vaisiuose daugiausiai yra fenolinės rūgšties cinamoil-D-gliukozės esterio, šiek tiek p-kumaro rūgšties-4-O-D-gliukozido ir p-hidroksibenzoil-D-glukozės esterio. Didžiausias bendras fenolinių rūgščių kiekis nustatytas F. chiloensis, o mažiausiai F. x ananassa (cv. Parker.) vaisiuose. Visų rūšių vaisiuose taip pat nustatyta flavonolių: kvercetino-3-O-gliukuronido, kvercetino-3-O-gliukozido ir kempferolio-3-O-gliukozido. Daugiausiai kvercetino-3-O-gliukozido kaupia
F. vesca, o kempferolio-3-O-gliukozido ir kvercetino-3-O-gliukuronido F. x ananassa (cv. Parker.).
Didžiausias bendras flavonolių kiekis nustatytas F. x ananassa (cv. Parker.), o mažiausiai F. moschata rūšies vaisiuose. Didžiausias bendras flavan-3-olių: (epi)katechino, (epi)afzelechino kiekis nustatytas F. x
dominuoja F. chiloensis vaisiuose, antocianinai F. vesca ir F. x ananassa (cv. Camarosa) vaisiuose, o flavan-3-oliai ir flavonoliai F. x ananassa (cv. Parker.,) vaisiuose [30].
1.3.2. Vaisių brandos stadija
J. Song ir kt., (2015) teigia, kad žemuogių vaisių brandos stadija turi įtakos bendram fenolinių junginių ir antocianinų kiekiui. Brendimo metu vaisiai gamina nedidelį etileno kiekį, todėl didėja antocianinų biosintezė kai vaisių spalva keičiasi nuo žalios iki raudonos, atsiranda skonio ir kvapo savybės bei sumažėja vaisių tvirtumas ir rūgštingumas. Vaisių audinių pigmentacijai didžiausią įtaką daro monoglikozilintas pelargonidinas ir glikozilintas cianidinas. Tyrimų metu nustatyta, kad etileno gamybą skatina alkoholio acilo transferazės genas. Bendras antocianinų kiekis didėja, bręstant vaisiams, tačiau bendras fenolinių junginių kiekis didžiausias ankstyvaisiais vystymosi tarpsniais [42]. G. A Manganaris ir kt., (2014) teigia, kad fenoliniai junginiai pasiskirsto įvairiuose vaisių audiniuose, daugiausiai paviršiuje. Žemuogių lukštavaisiai sudaro tik 1 % bendros masės, tačiau jie kaupia apie 11 % fenolinių junginių ir sudaro 14 % bendro antioksidantinio aktyvumo [27].
S. Roy ir kt., (2018) atliko tyrimą, siekiant išsiaiškinti fenolinių junginių kiekio svyravumus F.
vesca vaisiuose vegetacijos periodu bei struktūrinius genus, atsakingus už flavonoidų biosintezę. F. vesca
vaisiai buvo surinkti G1 – vystymosi pradžioje, kuomet vaisiai žalsvi, be tarpų tarp sėklų, G2 – nokimo ir brendimo pradžioje, kuomet vaisiai žalsvi su tarpais tarp sėklų, T – derėjimo pradžioje, kuomet vaisiai rausvos spalvos ir R – kuomet vaisiai prinokę, raudonos spalvos. ESC-MS metodu nustatyta, kad bendras hidroksicinamono rūgščių (ferulo, p-kumaro) kiekis didėja nuo G1 iki G2 (4,6 mg/100g–14,9 mg/100g) tarpsnio, o sumažėja nuo G2 iki T (5,7 mg/100g), tačiau vėl padidėja R tarpsniu (11,2 mg/100g). Bendras flavonolių (kvercetino-3-gliukozido, kempferolio-3-acetil-gliukozido) kiekis didžiausias G1 ir G2 (22,1 mg/100g ir 17,7 mg/100g) tarpsniais, o mažiausias T (8,9 mg/100g) ir R (8,7 mg/100g) tarpsniais. Flavan-3-olių (proantocianidino, katechino, epikatechino) kiekis didėja nuo G1 iki G2 tarpsnio (260 mg/100g-604 mg/100g), o T ir R (558 mg/100g ir 417 mg/100g) tarpsniais sumažėja. Bendras elago rūgšties kiekis didžiausias ankstyvaisiais vaisių vystymosi G1 ir G2 (816 mg/100g ir 831 mg/100g) tarpsniais, o mažiausias T ir R (364 mg/100g ir 409 mg/100g) tarpsniais. Bendras elagitaninų kiekis taip pat didžiausias G1 ir G2 (757 mg/100g ir 686 mg/100g) tarpsniais, o mažiausias T ir R (212 mg/100g ir 140 mg/100g) tarpsniais. Pagrindiniai genai reguliuojantys flavonoidų biosintezę yra fenilalanino amonio liazė (PAL), antocianidino sintazė (ANS), chalkono izomerazė (CHI), chalkono sintazė (CHS) ir flavanono 3-hidroksilazė. Antocianidino gliukosiltransferazės geno ekspresija žymiai padidėja vaisių brendimo metu. Nepaisant to,
kad daugiausiai fenolinių junginių susikaupia ankstyvuose vaisių vystymosi etapuose, vaisiai turėtų būti renkami visiškai prinokę, nes nuo subrendimo priklauso vaisių kvapo ir skonio savybės [38].
1.3.3. Vaisių laikymo sąlygos
G. A. Manganaris ir kt., (2014) teigia, kad aukštoje temperatūroje vaisiai praranda antioksidantus, pavyzdžiui askorbo rūgštį, kuri yra ypač labili. Antocianinų kiekio svyravimai, laikant vaisius keletą dienų kambario temperatūroje, priklauso nuo biosintezės vaisių brendimo metu. Tačiau kiti kokybės požymiai (spalva, kvapas, skonis) žymiai pablogėja, kai vaisiai laikomi aukštesnėje negu 0℃ temperatūroje. Kontroliuojamoje ir/arba modifikuotoje atmosferoje, padidinus CO2 koncentraciją sumažėja pelargonidino
gliukozido ir askorbo rūgšties kiekis. Aukšta CO2 koncentracija (10-30%) stimuliuoja askorbo rūgšties
oksidaciją ir slopina mono arba dehidroaskorbo rūgšties redukciją į askorbo rūgštį. Bendras flavonoidų kiekis bei antioksidantinis aktyvumas didesnis vaisiuose, kurie laikomi deguonyje, o ne modifikuotoje CO2
aplinkoje. Kitos laikymo sąlygos, tokios kaip UV-C švitinimas gali padidinti antocianinų kiekį ir apsaugoti nuo antioksidantų praradimo [27].
M. Blanch ir kt. (2015) atliko tyrimą, siekiant išsiaiškinti žemos temperatūros ir aukštos CO2
koncentracijos įtaką F. vesca vaisių fermentacijai ir ląstelių pažeidimams. Tyrimo metu vaisiai buvo laikomi 3 ir 6 dienas 0 ℃ temperatūroje, esant 0, 20, 40 % CO2 ir 20 % O2 koncentracijai. Po to analizuojami
piruvato dekarboksilazės (PDC) ir alkoholio dehidrogenazės (ADH) genų ekspresijos pokyčiai bei fermentacijos metabolitų (alkoholio ir acetaldehido), malondialdehido (MDA) koncentracijos pokyčiai. Tyrimo rezultatai parodė, kad laikant vaisius 0 ℃ temperatūroje, be CO2, PDC ir ADH genų ekspresija po
3 ir 6 dienų žymiai padidėja (8,5 ir 23 kartus), o esant 20 ir 40 % CO2 koncentracijai, beveik nekinta.
Mažiausias alkoholio kiekis nustatytas vaisiuose, kurie buvo laikomi be CO2, o esant 20 ir 40 %
koncentracijai atitinkamai padidėja 4 ir 41 kartus. Acetaldehido taip pat daugiausiai nustatyta vaisiuose, kurie buvo laikomi 40 % CO2 koncentracijoje. Nustatyta, kad vaisiuose, kurie buvo laikomi 3 dienas 20 %
CO2 koncentracijoje MDA kiekis padidėja, tačiau mažiau negu vaisiuose, kurie buvo laikomi be CO2. Taigi
etanolio fermentacija vaisiuose, kuri vyksta, esant 20 % CO2 koncentracijai yra naudinga, nes palaiko vaisių
metabolizmą, sumažina lipidų peroksidaciją ir ląstelinį vandens stresą, be to fermentacijos metabolitai turi įtakos vaisių kokybei, nes yra natūralūs fungicidai ir insekticidai, tačiau jei CO2 koncentracija padidėja iki
40 %, susidaręs etanolio ir acetaldehido perteklius skatina MDA susidarymą, kuris vaisių audiniuose gali sukelti lipidų peroksidaciją ir oksidacinę pažaidą [2].
1.3.4. Vaisių perdirbimo metodas
G. A. Manganaris ir kt., (2014) teigia, kad vaisių perdirbimo metodai: džiovinimas, šaldymas, terminis apdorojimas turi įtakos fenolinių junginių kiekiui ir stabilumui. Džiovinimo (40-70 ℃ temperatūroje) metu antocianinai degraduoja greičiau nei kiti fenoliniai junginiai. Antocianinų praradimą galima sumažinti, blanširuojant vaisius (apdorojant karštu vandeniu, kuriame yra rūgščių ar druskų, garais arba mikrobangomis). Šio proceso metu inaktyvuojami, fenolinius junginius ardantys fermentai, todėl išvengiama nepageidaujamų fermentinių reakcijų, spalvos ir kvapo pokyčių. Liofilizacijos proceso metu išsaugomos beveik visos biologiškai aktyvios medžiagos, be to vaisiai nepraranda spalvos, formos, kvapo ir skonio savybių [27]. B. Rickman ir kt., (2007) teigia, kad vaisių šaldymas sukelia nežymius fenolinių junginių kiekio pokyčius. Atlikti tyrimai parodė, kad laikant vaisius 12 mėnesių šaldiklyje fenolinių junginių kiekis nepakinta arba sumažėja nuo 21 % iki 28 %, termiškai apdorojant bendras elago rūgšties ir flavanolių kiekis sumažėja apie 20 %, o askorbo rūgšties prarandama nuo 15 iki 55 %, tačiau verdant 10 min reikšmingų biologiškai aktyvių junginių kiekio pokyčių nepastebėta [37]. S. Sablani ir kt., (2010) nustatė, kad konservavimo procesų metu, bendras antocianinų kiekis sumažėja iki 44 %, tačiau fenolinių junginių kiekis ir antioksidantinis aktyvumas padidėja iki 50 % [39].
Y. Nuñez-Mancilla ir kt., (2013) teigia, kad osmosinė dehidratacija ir aukštas hidrostatinis slėgis taip pat turi įtakos F. vesca vaisių antioksidantiniam aktyvumui, fenolinių junginių, vitamino C kiekiui bei vaisių spalvai. Osmosinės dehidratacijos metu vaisių gabalėliai buvo ilgai mirkomi hipertoniniame tirpale, koncentruotame cukraus sirupe, kol vaisiai neteko vandens. Po to mėginiai (osmosiniai tirpalai) buvo 10min paveikti nuo 100 iki 500 MPa slėgiu. Tyrimo metu nustatyta, kad antioksidantinis aktyvumas svyruoja nuo 231,24 iki 181,73 µg/ml, bendras fenolinių junginių kiekis nuo 252 mg/100g iki 337 mg/100g, o vitamino C kiekis nuo 47,09 iki 56,37 mg/100g. Tyrimo rezultatai parodė, kad laisvųjų radikalų surišimo geba sumažėja 400 ir 500 MPa slėgiu paveiktuose mėginiuose, o 100 ir 200 MPa slėgis laisvųjų radikalų surišimo gebai įtakos neturi. Didžiausias fenolinių junginių kiekis nustatytas 400 MPa slėgiu paveiktuose mėginiuose, o vitamino C kiekis 200, 400, ir 500 MPa slėgiu paveiktuose mėginiuose. Taip pat nustatyta, kad vaisių spalvai 200 400 ir 500 Mpa slėgis įtakos neturi, todėl osmosinės dehidratacijos ir 400 Mpa slėgio panaudojimas yra tinkams būdas, siekiant išsaugoti žemuogių vaisių biologiškai aktyvius junginius ir kokybės parametrus [32].
1.4. Fenolinių junginių antioksidantinis poveikis
H. Zhang ir kt., (2016) teigia, kad nuolatinio imuninio atsako metu padidėjęs aktyviųjų deguonies junginių: hidroksilo (OH•), superoksido (O
2•-), peroksilo (ROO•), alkoksilo (RO•) laisvųjų radikalų ir
aktyviųjų azoto junginių: azoto oksido (NO•), azoto dioksido (NO
2•) radikalų bei neradikalinių junginių
kiekis gali sukelti imuninės sistemos pusiausvyros sutrikimus, negrįžtamus audinių pažeidimus ir oksidacinį stresą. Laisvieji radikalai yra ląstelių metabolizmo šalutiniai produktai, kurie valentiniame sluoksnyje turi vieną arba daugiau nesuporuotų elektronų. Šių junginių gamybą skatina ksenobiotikai, vaistai, teršalai, jonizuojančioji spinduliuotė, rūkymas ir sunkieji metalai. Pernelyg didelė reaktyvių deguonies ir azoto junginių (ROS ir RNS) gamyba gali sukelti įvairias lėtines ligas: aterosklerozę, cukrinį diabetą, vėžį, reumatoidinį artritą, kataraktą bei parkinsono ligą [47].
Fenoliniai junginiai yra stiprūs antioksidantai in vitro (Zhang, 2016; Pisoschi ir kt., 2015). Dėl aromatinių savybių ir konjuguotos sistemos su hidroksilo grupėmis šie junginiai yra elektronų arba vandenilio atomų donorai, todėl gali neutralizuoti laisvuosius radikalus, atiduodami elektronus reaktyviems deguonies, azoto, chloro junginiams O2•-, OH•, peroksilo radikalui RO2•, hipochloro rūgščiai HOCl ir
peroksinitro rūgščiai ONOOH. Be to, fenoliniai junginiai veikia kaip metalų jonų chelatoriai, hidroperoksidus ar metalų prooksidantus paverčia stabiliais junginais, fentono reakcijos metu slopina Fe3+
redukciją ir reaktyvaus OH• gamybą taip pat nutraukia lipidų autooksidacijos grandininę reakciją [47, 35]. F. Shahidi ir kt., (2015) teigia, kad polinesočiųjų riebalų autooksidacijos procesą sudaro laisvųjų radikalų grandininė reakcija, kurią inicijuoja šviesa, šiluma, jonizuojančioji spinduliuotė, metalų jonų katalizatoriai, taip pat fermentas lipooksigenazė. Autooksidacijos proceso stadijos yra iniciacija, kuomet susidaro lipidų laisvieji radikalai, sklidimas ir baigtis (neradikalinių produktų gamyba). Fenoliniai junginiai gali atiduoti vandenilio atomus lipidų radikalams ir gaminti lipidų darinius bei antioksidantinius radikalus, kurie yra stabilesni ir lėčiau veikia autooksidacijos procesą [40]. H. Zhang ir kt., (2016) teigia, kad fenoliniai junginiai yra stiprūs antioksidantai, tačiau didelės junginių koncentracijos gali prarasti aktyvumą ir tapti prooksidantais. Kuomet fenolio molekulė praranda elektroną arba veikia kaip reduktorius molekulė tampa stabiliu radikalu, todėl jų oksiduoti tarpiniai produktai gali tapti prooksidantais. Prooksidantų susidarymą taip pat gali skatinti sąveika tarp fenolinių junginių ir metalų jonų, tuomet oksiduoti tarpiniai produktai arba oksidacijos produktai tokie kaip semikvinonai ir kvinonai gali tapti prooksidantais, kurie sukelia žalingą poveikį žmogaus sveikatai [47].
1.4.1. Fenolinių junginių struktūros ir antioksidantinio aktyvumo ryšys
Antioksidantinis fenolinių junginių poveikis susiję su jų chemine struktūra (Zhang, 2016; Cai, 2006, Guardado ir kt., 2011). Fenolinių junginių antioksidantinis potencialas priklauso nuo hidroksi (–OH) ir metoksi (–OCH3) pakaitų padėties ir skaičiaus molekulėje. Elekronų donorai aromatinio žiedo meta padėtyje ir/arba hidrofobinės grupės orto, meta padėtyse bei grupės sudarančios vandenilinį ryšį ir/arba elekronų donorai orto padėtyje stiprina fenolinių rūgščių antioksidantinį aktyvumą. Aromatinio žiedo hidroksilinimas ir metoksilinimas stiprina hidroksicinamono rūgščių antioksidantinį aktyvumą, pavyzdžiui kavos rūgštis turi dvi hidroksi grupes, todėl pasižymi stipresniu aktyvumu negu m-, o-kumaro rūgštis, tačiau silpnesniu negu p-kumaro ir ferulo rūgštis dėl jų struktūroje esančios hidroksi grupės padėties ir metoksi pakaito. Hidroksibenzoinės rūgštys, išskyrus galo rūgštį, pasižymi silpnu antiradikaliniu aktyvumu, tačiau metoksi grupių pakaitai padidina vandenilio donorines savybes. Hidroksicinamono rūgščių struktūroje esanti –CH=CH–COOH grupė užtikrina stipresnes vandenilio donorines savybes negu hidroksibenzoinių rūgščių struktūroje esanti – CH2 – COOH grupė, todėl hidroksicinamono rūgštys turinčios metoksi ir hidroksi grupes pasižymi stipresniu aktyvumu negu hidroksibenzoinės rūgštys [47, 18, 5].
Flavonoidai (flavan-3-oliai, flavonoliai) pasižymi stipresniu antioksidantiniu aktyvumu negu fenolinės rūgštys, nes turi daugiau hidroksi grupių aromatiniame žiede. Be to flavonoidų struktūroje esančios orto-dihidroksi (katecholio) A arba B žiede, 3,5-hidroksi grupės bei 2,3-dviguba jungtis konjuguota su 4-okso grupe C žiede padidina metalus chelatuojantį ir laisvuosius radikalus surišantį poveikį. Pagal laisvųjų radikalų surišimo gebą flavonoidai skirstomi aktyvumo mažėjimo tvarka: flavanoliai (flavan-3-oliai), flavonoliai, chalkonai, flavonai, flavanonai ir izoflavonai. Flavan-3-oliai (katechino dariniai) pasižymi stipriausiu antioksidantiniu aktyvumu, nes jų struktūroje yra nuo 5 iki 8 hidroksi, orto-dihidroksi grupių B žiede ir 3-hidroksi ir/arba 3-galoil grupės C žiede. Pagal antioksidantinio aktyvumo gebą flavan-3-oliai skirstomi aktyvumo mažėjimo tvarka: epigalokatechino galatas, epikatechino galatas, (-)-epigalokatechinas, epikatechinas ir (+)-katechinas [47, 5].
G. A. Manganaris ir kt., (2014) teigia, kad antocianidinų glikozidų (antocianinų) aktyvumui turi įtakos C žiedo hidroksilinimas ir/arba metoksilinimas. Antocianidinai B žiede turintys o-difenilo struktūrą, tokie kaip cianidinas ir delfinidinas pasižymi stipresniu antioksidantiniu aktyvumu negu malvidinas, pelargonidinas, petunidinas ir peonidinas. Hidroksilinimas B žiede didina aktyvumą, o metoksilinimas C-3’ mažina, tačiau papildomų hidroksi arba metoksi grupių įterpimas C-5’ padėtyje antioksidantiniam aktyvumui įtakos neturi. Hidroksi grupės C-3 ir C-5 padėtyse, esančios A ir C žieduose yra svarbios laisvųjų radikalų surišimo gebai. Antocianidinų antioksidantiniam aktyvumui taip pat turi įtakos glikozilinimas.
Cianidino, delfinidino ir malvidino monoglikozidai pasižymi panašiu antioksidantiniu aktyvumu kaip ir laisvieji aglikonai. Tačiau glikozilinimas C-3 padėtyje sumažina peonidino ir pelargonidino aktyvumą. Cianidino ir malvidino 3,5-O-diglikozidai pasižymi silpnesniu aktyvumu nei monoglikozidai. Todėl galima teigti, kad antocianinai turi panašų arba šiek tiek silpnesnį antioksidantinį aktyvumą nei antocianidinai. Antioksidantinio poveikio potencialui svarbu, kad fenoliniai junginiai gali sąveikauti su kitomis cheminėmis medžiagomis, vykstant virškinimui, todėl gali sukelti antagonistinį, adityvinį ar sinergistinį poveikį [27].
1.5. Žemuogių (Fragaria) žaliavų panaudojimas ir farmakologiniai poveikiai
S. N. Jimenez-Garcia ir kt., (2013) teigia, kad fenoliniai junginiai yra augalų antriniai metabolitai, kurie apsaugo augalus nuo nepalankių veiksnių, keliančių grėsmę jų išlikimui, pavyzdžiui sausros, UV spindulių parazitų, patogenų ar fizinės pažaidos taip pat yra būtini augimui ir vystymuisi. Žmogaus organizmui svarbūs, nes sumažina širdies ir kraujagyslių ligų riziką, apsaugo nuo metabolinių sutrikimų ir degeneracinių ligų bei pasižymi antimikrobiniu, priešuždegiminiu, antioksidantiniu, antikoaguliantiniu, antialerginiu, priešvėžiniu poveikiu [23]. J. Liberal ir kt. (2014) teigia, kad žemuogių lapų užpilai ir nuovirai tinka išoriniam ir vidiniam vartojimui. Išoriškai naudojami žemuogių žaliavų preparatai (emolientai) veikia antiseptiškai, malšina odos paviršiaus ir gleivinės uždegimus. Žemuogių žaliavos yra naudojamos fitoterapijoje, kaip papildoma priemonė: hipertenzijos, cukrinio diabeto, mineralinių medžiagų apykaitos, virškinimo sutrikimų, avitaminozės, anemijos, kvėpavimo takų ligų (kosulio, gerklės skausmo, astmos) gydymui ir simptomų slopinimui. Žemuogių lapai taip pat skatina šlapimo išsiskyrimą, todėl vartojami, esant akmenims šlapimtakiuose ir tulžies pūslės latakuose bei podagros gydymui [25].
1.6. Žemuogių žaliavų priešuždegiminis poveikis
F. Giampieri ir kt., (2017) teigia, kad uždegimo metu ląstelės išskiria mediatorius citokinus, prostaglandinus ir aktyviuosius deguonies junginius, kurie skatina žaizdų gijimą, apsaugo nuo patogenų, ląstelių ir audinių pažeidimo. Tačiau nuolatinė uždegiminė būsena, kurią reguliuoja citokinai gali skatinti širdies ir kraujagyslių, 2 tipo diabeto, alzheimerio, astmos, alerginio rinito ar reumatoidinio artrito ligų vystymąsi, progresavimą bei komplikacijas [17]. M. Gasparrini ir kt., (2017) atliko in vivo ir in vitro tyrimus, siekiant įvertinti ananasinių žemuogių (F. x ananassa) antiuždegiminį poveikį. Tyrimo metu pelių makrofagų ir žmogaus odos fibroplastų ląstelių modeliai buvo paveikti azoto oksido sintezę skatinančiais bakterijų endotoksinais lipopolisacharidais, tyrimo rezultatai parodė kad F. x ananassa vaisiai reikšmingai
slopina mitogenų aktyvuojamų baltymų kinazės (MAPK) ir branduolio faktorius kappa B (NKκB) signalų perdavimą, todėl sumažėja citokinų išsiskyrimas ir azoto oksido (NO), indukuojamo azoto oksido (iNO) sintezė. Be to padaugėja antiuždegiminių citokinų, suaktyvėja mitochondrijų funkcijos bei antioksidantiniai fermentai [16]. J. Liberal, (2014) atliko tyrimą ir nustatė, kad 80 ir 160mg/l koncentracijų, F. vesca lapų etanoliniai ekstraktai taip pat slopina azoto oksido (NO) sintezę pelių makrofaguose atitinkamai 31 % ir 40 %. Be to tyrimo metu nustatyta, kad azoto oksido sumažėjimas ląstelėse yra susijęs su F. vesca lapų laisvųjų radikalų surišimo geba [25]. M. Fumagalli ir kt., (2016) atliko tyrimą ir nustatė, kad F. vesca vaisių ekstraktai, kuriuose gausu taninų: procianidinų B1, B2 bei katechinų slopina interleukinų sekreciją bei NKκB signalų perdavimą žmogaus skrandžio epitelio ląstelėse, kurios buvo paveiktos navikų nekrozės faktoriumi alfa (TNF-α) [15]. S. M. Poulose ir kt., (2014) atliko tyrimą, kurio metu pelės buvo maitinamos
F. x ananassa vaisiais ir paveiktos 1,5 Gy 56Fe dalelėmis. Tyrimo rezultatai parodė, kad prooksidantų
aktyvumas ir uždegiminis procesas smegenyse sumažėja, nes silpnėja ROS gamyba ir ciklooksigenazės 2 (COX-2) ir NKκB uždegimo signalų perdavimas [36].
1.6.1. Antikoaguliantinis poveikis
I. Pawlaczyk ir kt., (2013) teigia, kad F. vesca lapai kaupia polisacharidus hemiceliuliozę ir pektinus, kurių sudėtyje yra heksurono rūgštys: D-gliukurono, D-galakturono. Polisacharidų ir fenolinių junginių antikoaguliantinis ir trombolitinis aktyvumas patvirtintas in vitro tyrimais. Tyrimo metu iš F. vesca lapų skirtingomis ekstrakcijos sąlygomis buvo išskirti vandenyje tirpūs I-V glikokonjugatai, kurie sudaryti iš angliavandenių, fenolių ir baltymų. Glikokonjugatų angliavandeninė dalis buvo sudaryta iš heksurono rūgščių (35-60 %), ir cukrų – galaktozės, arabinozės ir ramnozės. Glikokonjugatų antikoaguliantinis aktyvumas nustatytas pagal dalinio aktyvuoto tromboplastino laiką (DATL) ir protrombino laiką (INR), panaudojant standartizuotą žmogaus kraujo plazmą ir tromboplastino-kalcio reagentą. Biologinio aktyvumo stiprumo įvertinimui buvo tiriami įvairių koncentracijų (nuo 7,81 µg/ml iki 4000 µg/ml) glikokonjugatai kraujo plazmoje. DATL tyrimo kontrole buvo nefrakcionuotas heparinas (144 IU/mg). DATL tyrimo rezultatai parodė, kad glikokonjugatai I ir III, kuriuose buvo didžiausi fenolinių junginių ir polisacharidų kiekiai, aktyviausiai slopina plazmos krešulių susidarymą, esant 500 µg/ml koncentracijai kraujo plazmoje, taip pat abu prailgina krešulių formavimosi laiką net ir esant 62,50 µg/ml koncentracijai. Kiti II, IV ir V glikokonjugatai slopina koaguliaciją, esant didesnei 1mg/ml koncentracijai. Tačiau palyginus su nefrakcionuotu heparinu (144 IU/mg) I ir III glikokonjugatų aktyvumas yra silpnesnis, atitinkamai 0,90 IU/mg ir 0,96 IU/mg. INR tyrimo rezultatai parodė, kad aktyviausiai koaguliaciją slopina taip pat I ir III
glikokonjugatai, esant 1 mg/ml koncentracijai. Taigi tyrimų metu nustatyta, kad visi glikokonjugatai didelėmis koncentracijomis slopina plazmos krešulių formavimąsi, tačiau aktyviausi konjugatai, kuriuose yra didžiausi fenolinių junginių ir polisacharidų kiekiai [34].
1.6.2. Poveikis neurodegeneracinių ligų valdymui
Neurodegeneracinės alzheimerio ir parkinsono ligos kelia vis didesnę problemą senėjančioje visuomenėje (Vauzour ir kt., 2010). Šių neurodegeneracinių sutrikimų pagrindinės atsiradimo priežastys yra neurouždegimas, glutaminerginis ekscitotoksiškumas, oksidacinio streso padidėjimas, geležies ir endogeninių antioksidantų trūkumas. Epidemiologiniai tyrimai parodė, kad reguliarus produktų, kuriuose gausu flavonoidų, vartojimas susijęs su 50% demencijos rizikos sumažėjimu, kognityvinių, pažinimo funkcijų išsaugojimu, lėtesniu alzheimerio ligos pasireiškimu bei sumažėjusia parkinsono ligos atsiradimo rizika [43]. A. Macready ir kt., (2009) atlikti gyvūnų elgesio tyrimai parodė, kad flavonoidai gerina erdvinę ir objektų atpažinimo atmintį taip pat turi įtakos psichomotoriniam aktyvumui [26]. Fenolinių junginių biologiniam poveikiui svarbus bioprieinamumo laipsnis smegenyse, flavanonai tokie kaip hesperetinas, naringeninas ir antocianinai bei jų in vivo metabolitai geba pereiti hematoencefalinį barjerą (HEB) skirtingais laipsniais, priklausomai nuo jų struktūros ir sukelti neuroprotekcinį, neuromoduliacinį poveikį in
vitro ir in situ modeliuose [13].
D. Vauzour ir kt., (2010) atliko tyrimą ir nustatė, kad antocianinai ir izoflavonai geba sumažinti neurodegeneraciją susijusią su galutiniais glikacijos produktais glikotoksinais (angl. AGE), o kavos rūgštis, tirozolis ir p-kumaro rūgštis gali apsaugoti nuo 5-S-cisteinil-dopamino neurotoksiškumo in vitro [44]. Be to pastebėta, kad fenoliniai junginiai geba apsaugoti neuronus nuo azoto oksido ir beta-amiloido sukelto nuorotoksiškumo bei oksidacinio streso [43]. K. P. Datla ir kt. (2001) atliko tyrimą ir nustatė, kad flavanonas – tangeretinas geba pereiti hamatoencefalinį barjerą ir apsaugoti nuo dopaminerginio neurotoksino, 6-hidroksidopamino, pažeidimo bei palaikyti nigrostriatinio tinklo vientisumą ir funkcijas: dopamino išskyrimą ir perdavimą [7]. Fenoliniai junginiai stiprina neuronų funkcijas, slopina oksidacinio streso poveikį pažeidžiamiems neuronams ir stimuliuoja neuronų regeneraciją. Taip pat slopina mitogenų aktyvuojamų baltymų kinazės (MAPK) ir NKκB signalų perdavimą, todėl sumažėja citokinų sintezė, kurie skatina neurouždegiminį atsaką centrinėje nervų sistemoje (CNS) [43].
1.7. Žemuogių žaliavų poveikis širdies ir kraujagyslių sistemai
F. Giampieri ir kt., (2017) teigia, kad flavonoliai, flavanoliai, antocianinai gali sumažinti aterosklerozės, miokardo infarkto ir hipertenzijos vystymosi riziką bei mirtingumą nuo širdies ir kraujagyslių ligų. Fenoliniai junginiai kaupiasi plazminėje membranoje, todėl geba apsaugoti lipidų dvisluoksnį nuo oksidacinio pažeidimo, gerina endotelio funkciją, slopina uždegiminį atsaką. Taip pat slopina trombocitų adheziją ir agregaciją, nes trombocitai tampa mažiau jautrūs aktyvavimo stimulams, kuriuos sukelia arachidono rūgštis ir adenosindifosfatas (ADP) [17]. D. Vauzour ir kt. (2010) teigia, kad fenoliniai junginiai taip pat turi įtakos cholesterolio pasiskirstymui, nes mažina mažo tankio lipoproteinų ir gliukozės kiekį kraujyje bei C reaktyvinio baltymo aktyvumą plazmoje [43]. M. Parelman ir kt., (2012) atlikti in vivo tyrimai parodė, kad ananasinių žemuogių (F. x ananassa) vaisių vartojimas slopina krakmolo virškinimo fermentus α-gliukozidazę ir α-amilazę, todėl mažėja gliukozės kiekis kraujyje. Be to vaisiuose esančios skaidulinės medžiagos – pektinai neleidžia organizmui greitai pasisavinti angliavandenių bei fruktozei patekti į kraują. Todėl vartojant žemuoges sumažėja uždegimo žymenų CRB ir interleukino (IL-6) aktyvumas, lipidų ir baltymų oksidacijos procesai bei padidėja jautrumas insulinui [33].
I. Mudnic ir kt., (2009) teigia, kad fenolinių junginių veikimo mechanizmas kraujagyslių sistemai susijęs su jų gebėjimu reguliuoti azoto oksido (NO) išsiskyrimą ir bioprieinamumą endoteliui. I. Mudnic ir kt., mokslininkai atliko tyrimą, siekiant įvertinti F. vesca lapų vandeninių ekstraktų poveikį jūrų kiaulytės širdies susitraukimų dažniui, vainikinių širdies kraujagyslių kraujotakai, deguonies suvartojimui ir vazodilataciniam poveikiui žiurkių aortos žiedui. F. vesca lapų ekstraktų poveikis kraujagyslėms buvo palygintas su grauželinių gudobelių (Crataegus oxyacantha) lapų ir žiedų ekstraktų poveikiu. Tyrime buvo naudojami įvairių koncentracijų (0,06; 0,6; 6 ir 60 mg/100ml) gudobelių ir žemuogių ekstraktai. Tyrimo rezultatai parodė, kad abiejų žaliavų ekstraktai sukelia panašią nuo dozės priklausomą vazodilataciją. Didžiausios koncentracijos žemuogių ekstraktai sukelia 72,2±4,4 %, o gudobelių 81,3±4,5 % aortos žiedo, su nepažeistu endoteliu, atsipalaidavimą. Ekstraktų vazodilatacinio veikimo mechanizmo patvirtinimui nepažeistas aortos žiedas ir endotelis buvo paveikti azoto oksido (NO) sintezės inhibitoriaus (L-NAME) arba ciklooksigenazės inhibitorius indometacino. Nustatyta, kad šių preparatų panaudojimas stipriai susilpnina ekstraktų vazodilatacinį poveikį. Širdies susitraukimų dažniui, kraujotakai ir deguonies suvartojimui įvertinti buvo naudojami įvairių koncentracijų (0,06; 0,18; 0,6 ir 1,8 mg/100ml) F. vesca ekstraktai. Tyrimo metu nustatyta, kad žemuogių ekstraktai neturi įtakos širdies ritmui ir susitraukimų dažniui, tačiau vainikinių širdies kraujagyslių kraujotaka 45 % pagreitėja, taip pat 34 % sumažėja deguonies poreikis [29].
1.8. Žemuogių žaliavų priešvėžinis poveikis
J. Liberal ir kt., (2015) teigia, kad nekontroliuojama ląstelių proliferacija ir ilgas gyvybingumas yra pagrindinės vėžinių ląstelių savybės. Teigiama, kad bet kuri molekulė gebanti slopinti vėžinių ląstelių proliferaciją gali būti naudinga kaip chemoterapinė priemonė [24]. D. Vauzour ir kt. (2010) teigia, kad fenoliniai junginiai pasižymi gebėjimu blokuoti kancerogeninio proceso iniciaciją, vėžinių ląstelių proliferaciją ir pirminių stadijų vystymąsi. Tačiau kai kurie atlikti tyrimai yra kontraversiški, nes vartojant produktus, kuriuose yra fenolinių junginių nepastebėta vėžinių ląstelių sumažėjimo. Nepaisant to išlieka galimybė, kad specifiniai fenoliniai junginiai gali turėti apsauginį poveikį, ypač virškinimo trakte ir storojoje žarnoje, kur jų koncentracija yra didžiausia [43].
D. Vauzour ir kt. (2010) teigia, kad fenoliniai junginiai gali sukelti priešvėžinį poveikį įvairiais veikimo mechanizmais: pašalindami kancerogenines medžiagas, moduliuodami vėžinių ląstelių signalų perdavimą, fermentinę veiklą, ląstelių ciklo progresavimą, skatindami apoptozę. Fenoliniai junginiai stiprina glutationo peroksidazės, katalazės, NADPH-kvinono oksidoreduktazės, glutationo S transferazės ir citochromo P450 fermentų aktyvumą, todėl skatinama kancerogeninių medžiagų detoksikacija [43]. F. Giampieri ir kt., (2017) nustatė, kad fenoliniai junginiai sumažina poliaminų spermidino ir spermino sintezę, todėl silpnėja vėžinių ląstelių proliferacija. Fenoliniai junginiai didina transglutaminazės aktyvumą, todėl stiprėja ląstelių diferenciacija taip pat aktyvuoja: kaspazę-3, kaspazę-9, ADP ribozės polimerazę ir aktyviuosius deguonies junginius (ROS), todėl skatinama ląstelių apoptozė, sutrikdomas gliukozės metabolizmas ir metastazių genų: kreatino kinazės B tipo, galektino-1 ir proteosomų aktyvatoriaus komplekso 3 (REG-γ) išsiskyrimas [17].
J. Liberal ir kt., (2015) atliko tyrimą, siekiant išsiaiškinti F. vesca lapų etanolinių ekstraktų ir elagitaninų frakcijos citotoksinį poveikį žmogaus kepenų karcinomos ląstelėms. Elagitaninų frakcijos ir žemuogių lapų ekstraktų poveikis vėžinių ląstelių gyvybingumui buvo nustatytas kolorimetriniu metodu. Tyrimo metu žemuogių lapų ekstraktų ir elagitaninų frakcijos koncentracija buvo didinama iki 10000 µg/ml. Nustatyta, kad po 24h elagitaninų frakcijos pusinė maksimali slopinanti koncentracija (IC50) buvo 113±1
µg/ml, šešiais kartais mažesnė negu žemuogių lapų ekstrakto (690±1 µg/ml). Be to, elagitaninų frakcija sutrikdė ląstelių ciklą G2/M fazėje bei ląstelių proliferaciją. Todėl tolesni tyrimai buvo atlikti tik su elagitaninų frakcija. Apoptozės ir nekrozės įvertinimui vėžinės ląstelės buvo paveiktos įvairių koncentracijų elagitaninų frakcija ir nudažytos aneksinu. Nustatyta, kad esant didžiausioms koncentracijoms (80 ir 113 µg/ml), daugiausiai yra nekrozės paveiktų vėžinių ląstelių. Siekiant įvertinti elagitaninų frakcijos poveikį proteolitiniams mechanizmams, vėžinės ląstelės buvo paveiktos skirtingomis elagitaninų frakcijos
koncentracijomis (nuo 9 µg/ml iki 113 µg/ml), o proteosomų inhibitorius MG132 buvo laikomas kontrole. Nustatyta, kad elagitaninų frakcija reikšmingai sumažina į chimotripsino panašų 26S proteosomų aktyvumą. Tyrimų rezultatai parodė, kad elagitaninų frakcija išskirta iš žemuogių lapų slopina abi autofaginę ir ubikvitino proteosomų sistemas, pagrindines intraląstelines baltymų skaidymo sistemas, kurios yra priešvėžinės terapijos taikiniai [24].
2. TYRIMO METODIKA
2.1. Tyrimo objektas
Tyrimo objektas - paprastųjų žemuogių (Fragaria vesca L.) žiedų, vaisių ir lapų ėminiai, surinkti natūraliose augavietėse, augalo vegetacijos laikotarpiu. Žemuogių žiedai buvo renkami 2019 m. gegužės 18d., vaisiai kas savaitę nuo birželio 1d. iki liepos 6d., o lapai kas dvi savaites nuo gegužės 18d. iki spalio 10d. F. vesca žaliavos surinktos iš dviejų vietovių: Anykščių raj. sav., Gražumyno kaimo pamiškės ir Ukmergės raj., Medinų kaimo pamiškės (duomenys pateikti 1 lentelėje). Vaisiai išdžiovinti šiluminėje džiovyklėje, 45-50 ℃ temperatūroje, o lapai ir žiedai kambario temperatūroje, paskleisti plonu sluoksniu ant popieriaus, gerai vėdinamoje patalpoje ir nuo tiesioginių saulės spindulių apsaugotoje vietoje. Išdžiovinta žaliava buvo laikoma popieriniuose maišeliuose, sausoje, tamsioje, gerai vėdinamoje patalpoje.
1 lentelė. Žemuogių žiedų, vaisių ir lapų radavietė, augavietė, data ir vegetacijos fazė
Žiedų ir vaisių radavietė ir augavietė
Žiedų ir vaisių
rinkimo data Vegetacijos fazė
Anykščių raj.,
Gražumyno k., pamiškė, miško takai ir šlaitai (koordinatės:
55.466753,25.040142)
2019-05-18 Žydėjimo pradžia
2019-06-01 Visiškas žydėjimas: atsiveria antriniai ir tretiniai žiedai, krenta pirmieji vainiklapiai, vystosi žalsvos spalvos vaisiai 2019-06-15 Vaisių formavimasis, brendimo ir nokimo pradžia:
dauguma vaisių rausvos spalvos 2019-06-22
Vaisių derėjimo periodas, vaisiai raudonos spalvos 2019-06-29
2019-07-06 Vaisių derėjimo pabaiga
Ukmergės raj., Medinų k., pamiškė, miško takai ir šlaitai, (koordinatės: 55.300336, 24.899803)
2019-06-01 Visiškas žydėjimas: atsiveria antriniai ir tretiniai žiedai, krenta pirmieji vainiklapiai, vystosi žalsvos spalvos vaisiai 2019-06-15 Vaisių formavimasis, brendimo ir nokimo pradžia:
dauguma vaisių rausvos spalvos 2019-06-22
Vaisių derėjimo periodas, vaisiai raudonos spalvos 2019-06-29
2019-07-06 Vaisių derėjimo pabaiga Lapų radavietė ir
augavietė
Lapų rinkimo
data Vegetacijos fazė
Anykščių raj.,
Gražumyno k., pamiškė 2019-05-18
Stolonų (šakninių ūglių) formavimosi pradžia: pasirodo pirmos ataugos su šaknimis
(koordinatės:
55.466753,25.040142)
2019-06-01 Vystosi ataugos, skleidžiasi tamsiai žalios spalvos lapai, ilgėja stiebai
2019-06-15 2019-06-29
Lapai visiškai išsivystę vykdo fotosintezę 2019-07-13
2019-07-27 2019-08-10 2019-08-24
2019-09-07 Lapų senėjimas: šviesiai žalsvos spalvos, po truputį gelsta 2019-10-05 Skleidžiasi nauji lapai su mažesniais lapalakščiais ir
trumpesniais stiebais, seni lapai sunyksta
Ukmergės raj., Medinų k., pamiškė (koordinatės: 55.300336, 24.899803)
2019-05-18 Stolonų (šakninių ūglių) formavimosi pradžia
2019-06-01 Vystosi ataugos, skleidžiasi tamsiai žalios spalvos lapai, ilgėja stiebai
2019-06-15 2019-06-29
Lapai visiškai išsivystę vykdo fotosintezę 2019-07-13
2019-07-27 2019-08-10 2019-08-24 2019-09-07
Lapų senėjimas: šviesiai žalsvos spalvos, po truputį gelsta 2019-09-21
2019-10-05 Skleidžiasi nauji lapai su mažesniais lapalakščiais ir trumpesniais stiebais, seni lapai sunyksta
2.2. Naudotos medžiagos ir reagentai
Etanolis 96 proc. (v/v) (gamintojas AB „Vilniaus Degtinė, Vilnius, Lietuva), išgrynintas vanduo, 99,8 proc. ledinė acto rūgštis, 2N Folin-Ciocalteu fenolinis reagentas, natrio karbonatas 99,5-100,5% (Na2CO3) (,,Sigma – Aldrich“, Prancūzija), 2,2'-azino-bis (3-etilbenzotiazolino-6-sulfoninė rūgštis 98%
(ABTS) (,,Sigma –Aldrich“, JAV), kalio persulfatas ≥99% (K2S2O8) (,,Sigma –Aldrich“,Vokietija), natrio
acetatas ≥99% (CH3COONa) (,,Sigma –Aldrich“,Vokietija), koncentruota druskos rūgštis ≥37% (konc.
HCl), (,,Sigma –Aldrich“,Vokietija), (2,4,6–tris–(2–piridil) S–triazinas) ≥99% (TPTZ) milteliai (,,Sigma – Aldrich“, Šveicarija), geležies (III) chlorido heksahidratas ≥99% (FeCl3 x H2O) (,,Sigma –
Aldrich“,Vokietija), 6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilchroman-2-karboksilo rūgšties standartas 97% (Trolox) (,,Sigma –Aldrich“, Šveicarija), galo rūgšties monohidratas ≥98% (,,Sigma –Aldrich“, Kinija).
2.3. Naudota aparatūra
Elektrinis malūnėlis „Retsch GM 200“ („Retsch GmbH“, Hanas, Vokietija), elektrinės analitinės svarstyklės „Sartorius CP64 – 0CE“ („Sartorius AG“, Getingenas, Vokietija), UV – regimosios šviesos spektrofotometras „Camspec – model M550“ („Spectronic CamSpec“, Garfortas, Jungtinė Karalystė), vakuuminis filtras „2511 Dry Vacuum Pump/Compressor“ („Welch“, Skokie, JAV), automatinės pipetės Eppendorf Research (Eppendorf, JAV), mechaninė purtyklė („Laboratory shaker 358S”, Lenkija).
2.4. Tyrimų metodai
2.4.1. Žemuogių (Fragaria vesca L.) žiedų, vaisių ir lapų ekstraktų paruošimas
Etanoliniai ekstraktai gaminami iš kiekvienos žaliavos (žiedų, vaisių, lapų) ėminių. Augalinė žaliava susmulkinama elektriniu malūnėliu. Analitinėmis svarstyklėmis atsveriama 0,25 g maltos žaliavos (tikslus svėrinys), suberiama į kolbutę ir užpilama 25 ml tirpiklio, santykiu 1:100. Ekstrakcija vykdoma kambario temperatūroje, kolbutės dedamos į mechaninę purtyklę 15 min. Po to ekstraktai filtruojami per vatą, panaudojant vakuuminį filtrą. Nufiltruoti ekstraktai supilami į tamsaus stiklo buteliukus, sandariai uždaromi, ženklinami ir laikomi šaldytuve.
2.4.2. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas Folin – Ciocalteu reagentu
Bendras fenolinių junginių kiekis žemuogių žiedų, vaisių ir lapų ekstraktuose nustatomas spektrofotometru, panaudojant Folin-Ciocalteau reagentą. Tyrimui naudojamas 7,5 % natrio karbonato tirpalas ir darbinis Folin-Ciocalteau reagentas, kuris paruošiamas motininį Folin-Ciocalteau, skiedžiant išgrynintu vandeniu 10 kartų (1 dalis FC ir 9 dalys išgryninto vandens). Tiriamasis tirpalas ruošiamas iš 1ml ekstrakto, 5 ml Folin-Ciocaltau reagento ir 4 ml natrio karbonato tirpalo, o palyginamasis tirpalas taip pat, tik vietoje ekstrakto naudojamas ekstrahentas 70 % etanolis. Gauti tirpalai išmaišomi ir laikomi tamsoje, kambario temperatūroje 1 val. Spektrofotometru išmatuojama mišinio absorbcija, esant 765 nm bangos ilgiui.
Kalibracinei kreivei paruošiami galo rūgšties etaloniniai tirpalai (0,1 mg/ml; 0,05 mg/ml; 0,025 mg/ml; 0,0125 mg/ml; 0,00625 mg/ml). Pradinė 0,1 mg/ml galo rūgšties koncentracija skiedžiama 2 kartus ir gaunama 0,05 mg/ml koncentracija, atitinkamai skiedžiant gaunami visų galo rūgšties koncentracijų tirpalai. Tiriamasis tirpalas ruošiamas iš 1 ml tam tikros koncentracijos galo rūgšties tirpalo (5 mėginiai), 5 ml Folin-Ciocalteau reagento ir 4 ml natrio karbonato, o palyginamasis tirpalas taip pat, tik vietoje galo rūgšties tirpalo naudojamas išgrynintas vanduo. Tirpalai laikomi tamsoje, kambario temperatūroje 1 val. Spektrofotometru išmatuojama mišinio absorbcija, esant 765 nm bangos ilgiui. Gautos kalibracinės kreivės regresijos lygtis 𝑦 = 11,281𝑥 − 0,0688, o determinacijos koeficientas 𝑅2 = 0,9957.
Bendras fenolinių junginių kiekis išreiškiamas galo rūgšties ekvivalentais (GAE) gramui žaliavos apskaičiuojamas pagal formulę:
𝐺𝐴𝐸 =𝑐𝑥𝑉
𝑚 ; 𝑚𝑔/𝑔
c – galo rūgšties koncentracija (mg/ml), nustatyta iš kalibracinės kreivės; V – ekstrakto tūris (ml); m – tikslus atsvertas žaliavos kiekis (g).
2.4.3. Laisvųjų radikalų surišimo gebos nustatymas ABTS metodu
Paruošiamas 2mM koncentracijos motininis ABTS tirpalas: atsveriama 0,0548 g ABTS miltelių ir ištirpinama 50 ml išgryninto vandens, tamsaus stiklo buteliuke, po to į gautą tirpalą pridedama 0,0095 g kalio persulfato. Mišinys sumaišomas ir paliekamas tamsoje 16 val. Darbinis ABTS tirpalas ruošiamas, praskiedžiant motininį ABTS tirpalą išgrynintu vandeniu iki 0,800 absorbcijos vienetų, esant 734 nm bangos ilgiui. Į 3 ml darbinio ABTS tirpalo pridedama 20 μl tiriamo ekstrakto. Mišinys laikomas tamsoje, kambario
temperatūroje 1 val. Spektrofotometru išmatuojamas mišinio absorbcijos pokytis, esant 734 nm bangos ilgiui. Palyginamasis tirpalas – išgrynintas vanduo.
Kalibracinei kreivei paruošiami trolokso etaloniniai tirpalai (50 µmol/l; 100 µmol/l; 200 µmol/l; 400 µmol/l; 600 µmol/l; 800 µmol/l). Tiriamasis tirpalas ruošiamas iš 3 ml ABTS darbinio tirpalo ir 20 µl trolokso etaloninio tirpalo, o palyginamasis tirpalas yra išgrynintas vanduo. Tirpalai laikomi tamsoje, kambario temperatūroje 1 val. Spektrofotometru išmatuojamas mišinio absorbcijos pokytis, esant 734 nm bangos ilgiui. Gautos kalibracinės kreivės regresijos lygtis 𝑦 = 0,0002𝑥 + 0,0146, o determinacijos koeficientas 𝑅2 = 0,9976.
Laisvųjų radikalų surišimo geba išreiškiama standartinio antioksidanto trolokso ekvivalentais (TE) gramui žaliavos. Apskaičiuojama pagal formulę:
𝑇𝐸𝐴𝐵𝑇𝑆 = (𝑐/1000) ∗ (𝑉/𝑚)
c – koncentracija (µmol/l) nustatyta iš kalibracinės kreivės; V- ekstrakto tūris (ml); m – tikslus atvertas žaliavos kiekis (g).
2.4.4. Redukcinio aktyvumo nustatymas FRAP metodu
Redukcinio aktyvumo tyrimui paruošiami šie reagentai:
1. 300 mM acetatinis buferis: atsveriama 3,1 g natrio acetato, suberiama į 1000 ml matavimo kolbą, įpilama 16 ml ledinės acto rūgšties ir skiedžiama išgrynintu vandeniu iki žymės (pH 3,6).
2. 10 mM TPTZ tirpalas: į 50 ml išgryninto vandens įpilama 0,1695 ml koncentruotos druskos rūgšties. Gautame 40 mM druskos rūgšties tirpale tirpinami 0,1562 g TPTZ miltelių.
3. 20mM geležies (III) chlorido heksahidrato tirpalas: atsveriama 0,2703 g geležies (III) chlorido heksahidrato ir ištirpinama 50 ml išgryninto vandens.
Darbinis FRAP reagentas ruošiamas, sumaišant reagentus santykiu 10:1:1 (10 dalių acetatinio buferio, 1 dalis TPTZ tirpalo ir 1 dalis geležies (III) chlorido heksahidrato tirpalo). Tyrimui imama 3 ml darbinio FRAP reagento ir pridedama 20 μl tiriamo ekstrakto. Palyginamasis tirpalas ruošiamas taip pat, tačiau vietoje ekstrakto dedama tirpiklio. Tirpalai laikomi tamsoje, kambario temperatūroje 1 val. Spektrofotometru išmatuojama mišinio absorbcija, esant 593 nm bangos ilgiui. Redukcinio aktyvumo galia išreiškiama standartinio antioksidanto trolokso ekvivalentais (TE) gramui žaliavos.
Kalibracininei kreivei paruošiami trolokso etaloniniai tirpalai (400 µmol/l; 800 µmol/l; 1600 µmol/l; 3200 µmol/l; 6400 µmol/l). Tiriamasis tirpalas ruošiamas iš 3ml darbinio FRAP ir 20 µl trolokso
