DARBAS ATLIKTAS ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDROJE (KLINIKOJE, INSTITUTE)
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Laisvųjų amino rūgščių įvertinimas
vilkdalgių gumbuose (Iris L.) dujų chromatografijos – masių spektrometrijos metodu“.
1. Yra atliktas mano paties (pačios).
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą. Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
2020 – 05 – 20 Martynas Gataveckas
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuviu kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
2020 – 05 – 20 Martynas Gataveckas
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO
Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
2020 – 05 – 20 Martynas Gataveckas
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE, INSTITUTE)
Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
(aprobacijos data ) (katedros (klinikos, instituto) vedėjo (-os) (vadovo (-ės)) (parašas)
vardas, pavardė) Baigiamojo darbo recenzentas
Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
(vardas, pavardė) (parašas)
Baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERISTETAS MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
Laisvųjų amino rūgščių įvertinimas vilkdalgių gumbuose (Iris L.) dujų
chromatografijos masių spektrometrijos metodu
Magistro baigiamasis darbas
Darbą parengė: Martynas Gataveckas 7 gr. Darbo vadovas: Doc., dr. Konradas Vitkevičius
Kaunas 2020
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERISTETAS MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanė Ramunė Morkūniekė
Laisvųjų amino rūgščių įvertinimas vilkdalgių gumbuose (Iris L.) dujų
chromatografijos masių spektrometrijos metodu
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas:
Doc., dr. Konradas Vitkevičius
Data: Parašas
Recenzentas: Darbą atliko:
Data: Magistrantas Martynas Gataveckas
Parašas: Data:
Kaunas 2020
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 6
SANTRUPOS ... 8
ĮVADAS ... 9
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 10
1. LITERATŪROS ANALIZĖ ... 11
1.1. Amino rūgštys ... 11
1.2. Amino rūgščių klasifikacija ... 11
1.3. Amino rūgščių optinis aktyvumas ... 15
1.4. Amino rūgščių funkcijos ... 15
1.5. Amino rūgščių nustatymas ... 16
1.6. Dujų chromatografija ir junginių derivatizacija ... 17
1.7. Vilkdalgio (Iris L.) morfologija ... 19
2. Tyrimo objektas ir metodika... 21
2.1. Tyrimo organizavimas... 21
2.2. Tyrimo objektas... 21
2.3. Įranga ... 22
2.4. Dujų chromatografijos metodikos pritaikymas amino rūgštims tirti ... 22
2.5. Dujų chromatografijos sąlygos... 23
3. Rezultatai ir jų aptarimas ... 25
3.1. Laisvųjų amino rūgščių kokybinis nustatymas ... 25
3.2. Laisvųjų amino rūgščių kiekybinis nustatymas ... 26
3.2.1. Alaninio kiekio nustatymas tiriamose žaliavose ... 27
3.2.2. Valino kiekio nustatymas tiriamose žaliavose ... 28
3.2.3. Leucino kiekio nustatymas tiriamose žaliavose ... 28
3.2.4. Izoleucino kiekio nustatymas tiriamose žaliavose ... 29
3.2.5. Asparto rūgšties kiekio nustatymas tiriamose žaliavose ... 30
3.2.6. Tirozino kiekio nustatymas tiriamose žaliavose ... 31
3.2.7. Prolino kiekio nustatymas tiriamose žaliavose ... 31
3.2.8. Glicino kiekio nustatymas tiriamose žaliavose ... 32
3.2.9. Glutamo rūgšties kiekio nustatymas tiriamose žaliavose ... 33
3.2.10. Serino kiekio nustatymas tiriamose žaliavose ... 34
4. IŠVADOS ... 36 5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 37 6. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 38
SANTRAUKA
Laisvųjų amino rūgščių įvertinimas vilkdalgių gumbuose (Iris L.) dujų chromatografijos masių spektrometrijos metodu
Martyno Gatavecko magistro baigiamojo darbo „Laisvųjų amino rūgščių įvertinimas vilkdalgių gumbuose (Iris L.) dujų chromatografijos masių spektrometrijos metodu“, vadovas Doc., dr. Konradas Vitkevičius, Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra, Kaunas.
Darbo tikslas: nustatyti ir įvertinti laisvų amino rūgščių kokybinę bei kiekybinę
sudėtį vilkdalgių (Iris L.) gumbų ekstraktuose dujų chromatografijos - masių spektrometrijos metodu.
Darbo uždaviniai: parinkti vilkdalgių gumbų žaliavos ekstrakcijos sąlygas; pritaikyti
dujų chromatografijos – masių spektrometrijos metodą su junginių derivatizacija Lietuvoje
augančių vilkdalgių gumbų laisvųjų amino rūgščių tyrimui; nustatyti kokybinę Lietuvoje augančių vilkdalgių gumbų laisvųjų amino rūgščių ekstraktų sudėtį; nustatyti ir palyginti kiekybinę vilkdalgių gumbų sudėtį tarp skirtingų Lietuvos regionų.
Tyrimo objektas: skirtinguose Lietuvos regionuose augantys vilkdalgių gumbai. Tyrimo metodai: tirtiems skirtingų Lietuvos regionų vilkdalgių (Iris L.) gumbams
buvo atlikta junginių derivatizacija ir dujų chromatografijos metodika su masių spektrometrijos detektoriumi.
Rezultatai ir išvados: Ruošiantis atlikti ekstrakcijai nustatyta, kad vilkdalgių
gumbuose nėra aptinkamos laisvosios amino rūgštys, todėl prieš tyrimą vykdoma baltymų hidrolizė. Derivatizacijai laisvųjų amino rūgščių analizėje pasirinktas MTBSTFA (N-metil-N-(tert
butildimetilsilyil) trifluoroacetamidas). Pritaikius dujų chromatografijos – masių spektrometrijos metodą su junginių derivatizacija ir remiantis masių spektrų duomenų baze vilkdalgių gumbuose, buvo identifikuotos laisvosios amino rūgštys: alaninas, glicinas, valinas, leucinas, izoleucinas, prolinas, serinas, fenilalaninas, apsarto rūgštis, glutamo rūgštis ir tirozinas.Tyrimų metu nustatyta, kad suminis LAR kiekis skirtinguose Lietuvos regionuose surinktose vilkdalgių gumbų žaliavose skyrėsi. Didžiausias bendras laisvųjų amino rūgščių kiekis nustatytas išdžiovintuose vilkdalgių gumbuose, rinktuose Kauno (1) rajone (248,38 μg/g). Mažiausias bendras laisvųjų amino rūgščių kiekis nustatytas Jurbarko rajone rinktoje šviežioje žaliavoje (48,32 μg/g). Nors LAR kiekiai skyrėsi tarp regionų, tačiau visuose dominavo alaninas ir leucinas.
SUMMARY
Evaluation of free amino acids in iris (Iris L.) tubers using Gas Chromatography Mass Spectrometry
Martynas Gataveckas final thesis for master‘s degree „Evaluation of free amino acids in iris (Iris L.) tubers using gas chromatography mass spectrometry“ supervisor Konradas
Vitkevičius, Lithuanian University Of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, department of Analytical and Toxicological Chemistry. – Kaunas.
The aim of investigation: Identify and evaluate free amino acids qualitative and
quantitative composition in samples of iris (Iris L.) using gas chromatography mass spectrometry.
Objectives: select conditions for extraction of iris tubers; apply gas chromatography –
mass spectrometry method for free amino acids study from iris tubers grown in Lithuania; determine free amino acids qualitative composition from extracts of iris tubers; determine and compare quantative free amino acids compositions of iris tubers grown in Lithuania.
Object: Iris tubers grown in different regions of Lithuania.
Methods: Iris tubers of different regions of Lithuania were derivatized and evaluated
using gas chromatograph with mass spectometer.
Conclusions: it is established that no free amino acids can be found found in iris
tubers and as a result protein hydrolysis has to be performed. MTBSTFA (N-methyl-N- (tert-butyldimethylsilyl) trifluoroacetamide) was selected for derivatization in free amino acid analysis. Applying gas chromatography – mass spectrometry with compound derivatization and based on mass spectral database free amino acids were identified in iris tubers: alanine, glycine, valine, leucine, isoleucine, proline, serine, phenylalanine, aspartic acid, glutamic acid, and tyrosine.Studies have shown, that total amount of free amino acids in iris tubers, which were collected in different regions of Lithuania, differed.The highest total amount of free amino acids was found in dried iris tubers, which was collected in Kaunas (1) district (248,38 μg/g). Thelowest total amount of free amino acids was found in fresh material, which was collected in Jurbarkas district (48,32 μg/g). Although the amounts of free amino acids varied between regions, dominant compounds found in iris tubers were alanine and leucine.
PADĖKA
Už suteiktą galimybę atlikti mokslinį tiriamąjį darbą „Laisvųjų amino rūgščių
įvertinimas vilkdalgių gumbuose (Iris L.) dujų chromatografijos masių spektrometrijos metodu“ bei kantrybę ir visus patarimus, rašant magistro baigiamąjį darbą, nuoširdžiai norėčiau padėkoti
SANTRUPOS
AR – amino rūgštys
LAR – laisvosios amino rūgštys
DC - MS – dujų chromatografija – masių spektrometrija
BSTFA – (N,O-bis(trimetil-silil)-trifluoroacetamidas) derivatizatorius
ĮVADAS
Amino rūgštys – viena svarbiausių raumenų audinių statybinė medžiaga [2]. Tai organiniai junginiai, turintys ketvirtinį α-anglies atomą, prijungę keturias skirtingas, asimetriškai išsidėsčiusias funkcines grupes - rūgštinę karboksilo grupę (-COOH), bazinę amino grupę (-NH2), šoninį radikalą (R) ir vandenilio atomą (H) [1]. Nuo AR priklauso ne tik žmogaus jėgų tonusas ar raumenų masė, jos žmogaus organizme atlieka ir daugybę kitų funkcijų: veikia kaip antioksidantas, reguliuoja išskiriamo insulino kiekį, galimą poveikį nerviniai sistemai [11, 13, 14]. Didėjant amino rūgščių paklausai, atliekama daugybė tyrimų amino rūgštims aptikti žaliavoje.
Vilkdalgių (Iris L.) genties atstovai yra daugiamečiai augalai, priklausantys vilkdalginių (Iridaceae) šeimai [34]. Tai žoliniai augalai storais mėsingais arba sumedėjusiais šakniastiebiais. Stiebai matomi po vieną arba suaugę į kelis, vientisi arba šakoti. Šiuo metu manoma, jog
vilkdalginių genčiai priskiriami daugiau nei per 300 rūšių augalų [33]. Vilkdalgių preparatai yra naudojami daugybėje sferų: liaudies medicinoje, kosmetikos, konditerijos, tekstilės pramonėje.
Viena iš kaupiamųjų cheminių medžiagų vilkdalgiuose – laisvosios amino rūgštys. Šių organinių junginių dėka augale pagreitinamas medžiagų patekimas, jų transportavimas bei sunaudojimas. Augalai, šiuo atveju ir vilkdalgiai, lengvai įsisavina tik laisvas amino rūgštis. Su laisvosiomis amino rūgštimis buvo atlikta nemažai cheminių analizių, kurias taip pat privaloma tirti ir dujų chromatografijos metodu.
DC - MS tyrimui reikalingos specifinės preparato savybės. Dėl to tyrimui atlikti reikalinga junginių derivatizacija [27]. Analizuojant laisvąsias amino rūgštis dujų chromatografijos – masių spektrometrijos būdu, atliekama jungininų derivatizacija, kuri pagerina junginių stabilumą ir jų nustatymą dujų chromatografijoje. Taikant derivatizaciją labai poliniai junginiai paverčiami lakiais ir taip galima atlikti procesą, esant normaliai temperatūrai, be terminio skilimo arba molekulinio pertvarkymo [28].
Šiame darbe bus išvystoma dujų chromatografijos – masių spektrometrijos metodiką, kuri bus praktiškai pritaikyta laisvų amino rūgščių vertinime vilkdalgių gumbų ekstraktuose.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas - nustatyti ir įvertinti laisvų amino rūgščių kokybinę bei kiekybinę
sudėtį vilkdalgių gumbų (Iris L.) ekstraktuose dujų chromatografijos - masių spektrometrijos metodu.
Darbo uždaviniai:
1. Parinkti vilkdalgių gumbų žaliavos ekstrakcijos sąlygas.
2. Pritaikyti dujų chromatografijos – masių spektrometrijos metodą Lietuvoje augančių vilkdalgių gumbų laisvųjų amino rūgščių tyrimui.
3. Nustatyti kokybinę Lietuvoje augančių vilkdalgių gumbų ekstraktų sudėtį.
1.
LITERATŪROS ANALIZĖ
1.1.
Amino rūgštys
Amino rūgštys (AR) – tai polipeptidines baltymų grandines sudarantys organiniai monomerai. Tai organiniai junginiai, turintys ketvirtinį α-anglies atomą, prijungę keturias
skirtingas, asimetriškai išsidėsčiusias funkcines grupes - rūgštinę karboksilo grupę (-COOH), bazinę amino grupę (-NH2), šoninį radikalą (R) ir vandenilio atomą (H). Taip pat randamos β, γ bei kitos amino rūgštys, kurios turi skirtingą padėtį struktūroje ir jungiasi su jos atitinkamu anglies atomu. Tarp gamtoje natūraliai randamų AR yra pagrindinės 20 α – amino rūgščių (bendroji α-amino rūgščių struktūrinė formulė 1 paveikslėlyje). Seka, kuria išsidėsto amino rūgštys, sujungtos tarpusavyje, sukuria struktūros ir funkcijos pokyčius baltymuose. Daugybė skirtingų baltymų su skirtingomis savybėmis gali būti susintezuota keičiant AR seką, santykį, polipeptido grandinės ilgį [1, 2].
1 pav. Bendroji amino rūgščių struktūrinė formulė [3].
1.2.
Amino rūgščių klasifikacija
Amino rūgštys gali būti klasifikuojamos pagal sintezės procesus organizme: • Pakeičiamos amino rūgštys: šios rūgštys sintetinamos iš kitų organinių junginių.
Teigiamasis azoto balansas organizme suteikia galimybę pakeičiamosioms amino rūgštims būti sintetinamoms žmogaus organizme. Tai glicinas, cistinas, alaninas , serinas,
glutaminas, glutamatas, aspartamo rūgštis, tirozinas, prolinas ir asparaginas.
• Dalinai pakeičiamos amino rūgštys: jas organizmas sintezuoja tada, kada organizme yra nepakeičiamų rūgščių perteklius. Tai histidinas ir argininas.
• Nepakeičiamos amino rūgštys: sintezuojamos tik augaluose ir bakterijose, žmogus šių AR gali gauti tik su maistu. Tai valinas, metioninas, leucinas, izoleucinas, fenilalaninas, treoninas, lizinas ir triptofanas.
Visos 20 amino rūgščių yra privalomos normaliai organizmo funkcijai palaikyti. Sutrikdžius amino rūgščių metabolizmą organizme gali sutrikti organizmo funkcijos pvz.: augimas, homeostazė arba net ištikti mirtis [4, 5].
AR gali būti skirstomos pagal šoninių radikalų savybes. 1. Pagal šoninio radikalo poliškumą, AR klasifikuojamos į:
• hidrofobines (alaninas, glicinas, valinas, fenilalaninas, leucinas, izoleucinas, triptofanas, prolinas, tirozinas ir metioninas),
• hidrofilinės (treoninas, asparaginas, argininas, glutaminas, cisteinas, asparto rūgštis, glutamo rūgštis, histidinas, serinas ir lizinas) [6].
2. Pagal šoninio radikalo (R) prisijungimą:
a. Rūgštinės AR: asparto rūgštis, glutamo rūgštis;
Asparto rūgštis Glutamo rūgštis 2 pav. Rūgštinės amino rūgštys [7].
b. Bazinės AR: histidinas, lizinas, argininas;
Lizinas Argininas Histidinas 3 pav. Bazinės amino rūgštys [7].
Glicinas Alaninas Valinas
Leucinas Izoleucinas Prolinas
4 pav. Alifatinės amino rūgštys [7].
d. SH radikalą turinčios AR: cisteinas, metioninas;
Cisteinas Metioninas 5 pav. Amino rūgštys, turinčios SH radikalą [7].
Serinas Treoninas 6 pav. Hidroksi amino rūgštys [7].
f. Aromatinės AR: fenilalaninas, tirozinas, triptofanas;
Fenilalaninas Tirozinas Triptofanas 7 pav. Aromatinės amino rūgštys [7].
g. Amidinės amino rūgštys: asparaginas ir glutaminas.
Asparginas Glutanimas 8 pav. Amidinės amino rūgštys [7].
1.3.
Amino rūgščių optinis aktyvumas
Amino rūgštyse prie α - anglies atomo yra prisijungusios funkcinės grupės, kurios erdvėje gali išsidėstyti asimetriškai. α - anglies atomas yra chiralinis molekulės centras ir gali turėti optinius izomerus, kurie žymimi didžiosiomis D ar L raidėmis. Amino grupei esant kairėje pusėje, amino rūgštis - L konfigūracijos, jei dešinėje pusėje – D konfigūracijos. [8]
Vienintelis glicinas neturi asimetrinio anglies atomo ir neturi D ar L izomerinių formų. Pagal tai, kurioje molekulinės erdvės pusėje išsidėsto amino grupė karboksi rūgščiai esant viršuje, galima spręsti apie amino rūgšties optinę izomeriją. Optiniai izomerai geli sukti šviesos plokštumą į skirtingas puses [9, 10].
1.4.
Amino rūgščių funkcijos
Amino rūgštys reaguliuoja insulino išskyrimą
Amino rūgštys (valinas, leucinas ir izoleucinas) stimuliuoja keliant cirkuliuojančio insulino kiekį. Leucinas aktyvuodamas glutamato dehidrogenazę kasos langerhanso salelių β ląstelėse skatina insulino sekreciją ir mažina gliukozės koncentraciją kraujyje. Glikemijos kontrolė, II tipo cukrinio diabeto prevencija ir gydymas taip pat paveikiamas ilgai vartojus leuciną. Yra svarstoma, jog vartojant insulino sekreciją skatinančiu poveikiu pasižymintį derinį (leuciną su fenilalaninu) kartu su karbohidratais (gliukoze), gaunamas efektyvesnis vidutinės insulino koncentracijos padidėjimas, nei vartojant atskirai [11, 12].
Amino rūgščių įtaka imuninei sistemai
Nustatyta, kad amino rūgštys dalyvauja organizmo imuninės sistemos reguliacijos procesuose. Yra daroma prielaida, jog cirkuliuojančių antigenų koncentracijos didinimui aktyvuoti vartoti tinkamas cisteinas ir metioninas. AR argininas ir glutaminas įtakoja fagocitinį ir
baktericidinį ląstelės poveikį. Argininas reaguliuoja T ir B limfocitų vystymąsi bei jų gamybą, didina cirkuliuojančių imunoglubulinų (IgG ir IgM) koncentraciją. Glutaminas stimuliuoja limfocitų ląstelių paviršiuje esančių ląstelių ekspresiją, reguliuoja citotoksinų išskyrimą, stabdo limfocitų apoptozę, skatina T limfocitų proliferaciją. [13].
Amino rūgščių antioksidacinės savybės
Amino rūgštys gali pasižymėti ir antioksidacinėmis savybėmis. Jos apsaugo ląsteles nuo laisvųjų radikalų sukeliamo oksidacinio streso. Laisvieji radikalai sukelia DNR pažeidimus,
dalyvauja Alzheimerio, Parkinsono, Hantingtono ligos, lėtinių uždegiminių ligų (astmos, reumatoidinio artrito, cukrinio diabeto), išemijos patogenezėje [14].
Stipriausiu antioksidantiniu poveikiu iš amino rūgščių pasižymi cisteinas ir metioninas [15]. Cisteinas yra endogeninis antioksidantas, gausiausiai randamas ląstelėse – glutationo
sudėtyje. Glutationas, sudarytas iš glicino, cisteino ir glutamato, apsaugo ląsteles nuo ksenobiotikų metabolitų sukeliamo oksidacijos proceso ir laisvųjų radikalų. Teigiama, kad glutationas taip pat dalyvauja imuniteto stiprinime [16].
Amino rūgščių poveikis nerviniams impulsams
Nervinių impulsų perdavimui taip pat turi įtakos amino rūgštys. AR veikia kaip mažos molekulinės masės mediatoriai arba prekursoriai neurotransmiterių biosintezėje. Glicinas inhibuoja neuromediatorius nugaros smegenyse, sustiprina kitų neurotransmiterių stimuliuojantį poveikį šiam receptoriui [17]. Glutamatas centrinėje ir periferinėje nervų sistemoje yra kaip mažos molekulinės masės stimuliuojantis neurotransmiteris, kuris atsakingas už 75 proc. visų nervinių impulsų
perdavimų. Šis inhibuojančio neurotransmiterio γ - amino sviesto rūgšties biosintezės prekursorius sintetinamas iš glutamino. Tirozinas – jis sintezuojamų katecholaminų (dopamino, norepinefrino ir epinefrino) pagrindinis prekursorius. Hidroksilinant tirozinas virsta į DOPA, kuris dekarboksilinimo metu virsta į dopaminą, iš dopamino sintetinamas norepinefrinas, o vėliau epinefrinas. Taip pat biogeninių sintezės prekursoriai kaip triptofanas – serotonino ir melatonino sintezės prekursorius, histamino prekursorius – histidinas [18, 19].
1.5.
Amino rūgščių nustatymas
Įvairūs chromatografiniai metodai gali būti naudojami įvertinti amino rūgštis: plonasluoksnė chromatografija, žemo slėgio jonų mainų chromatografija, jonų mainų efektyvioji skysčių chromatografija, atvirkščių fazių efektyvioji skysčių chromatografija, kapiliarinė
elektroforezė bei dujų chromatografija.
Lyginant su kitais metodais dujų chromatografijos metodas yra greitas ir patogus [20]. Tačiau prieš pradedant atlikti dujų chromatografiją, mėginys turi atitikti savybes: pirma, mėginys turi būti termiškai stabilus, bei lakus ir būti išgarinamas iki 250 ̊C, antra, mėginys neturi turėti neorganinių medžiagų, tokių, kaip neorganinės druskos ar rūgštys, kurios gali būti kenksmingos dujų chromatografijos kolonėlei ar įtakoti analizės rezultatus [21]. Todėl dažnai prieš analizę yra atliekama amino rūgščių derivatizacija [22].
1.6.
Dujų chromatografija ir junginių derivatizacija
Tai yra išskirstymo metodas, kuriame judri fazė yra dujos, kurios turi nereaguoti su tiriamo mėginio junginiais. Dujų chromatografijos metodas dažnai naudojamas lakiems ir
termostabiliems, aukštoje temperatūroje neskylantiems junginiams [23].
Metodo veikimo pagrindas yra medžiagų atskyrimas, remiantis molekuline mase ir afinitetu nejudriai fazei. Naudojamos dujos gali būti: vandenilis, argonas, helis, anglies dioksidas ir azotas [24]. Judri fazė dėl inertiškumo pasirenkama vandenilio dujos. Tyrimui tirti reikalingos ir kapiliarinės kolonėlės, pagamintos iš suspausto silikagelio, parenkant vidutinį kolonėlės ilgį bei plotą [25].
Dujų chromatografijos privalumai: • analizei reikia tik nedidelio medžiagos kiekio; • tyrimas atliekamas greitai;
• didelis medžiagų atskyrimas; • pigus analizės metodas; • didelis jautrumas [26]. Trūkumai:
• netinkami naudoti nestabilioms medžiagoms;
• be papildomo paruosimo galima tirti tik lakius junginius [26].
Dujų chromatografijos tyrimui reikalingos specifinės preparato savybės, būtent lakumas ir atsparumas aukštai temperatūrai. Dėl to tyrimui atlikti reikalinga junginių derivatizacija. Derivatizacija – metodas, kurio metu prijungiama funkcinė grupė ir junginiui suteikiamos
papildomos savybės [27]. Šios savybės gali būti: • virimo bei lydymosi temperatūra; • lakumas;
• preparato aktyvumas; • agregatinė būsena; • tirpumas. [28].
Chromatografinio medžiagų atskyrimo efektyvumui pakeisti naudojama
su AR yra atliekama prieškolonėlinė derivatizacija. Atsižvelgiant į tai, kokie preparatai tiriami derivatizuoti, taikomi šie metodai:
• alkilinimas; • sililinimas;
• chiralinė derivatizacija; • acilinimas. [29]
Amino rūgščių derivatizacijai dažniausiai pasirenkamas sililinimas. Reagentai derivatizuoja amino rūgščių aktyvius vandenilio atomus ir pakeičia amino rūgščių molekulėje grupes į trimetilsilil (gali būti naudojami ir kitos grupės pvz.:dimetilsililo gr.). Taip sudaromi atsparūs aukštai temperatūrai ir hidrolizei, patvarūs amino rūgščių derivatai [30]. Verta pabrėžti, kad mėginiai ir tirpikliai turi būti miltelių pavidalu, nes silil grupė yra jautri drėgmei ir lengvai skyla [31]. Derivatizacijoje plačiai naudojami reagentai (struktūrinės formulės 9 ir 10
paveiksluose):
• N,O-bis(trimetil-silil)-trifluoroacetamidas (BSTFA);
• N-metil-N-(tert-butildimetilsilyil)trifluoroacetamidas (MTBSTFA).
10 pav. N-metil-N-(tert-butildimetilsilyil)trifluoroacetamido struktūrinė formulė [31]. BSTFA pagalba dažniau tiriami pirminiai aminai. Antrinių aminų analizei jis
naudojamas rečiau. Kaip katalizatorius reakcijos palengvinimui dedamas trimetil-chlor-silanas [32]. N-metil-N-(tert-butildimetilsilyil)trifluoroacetamidas (MTBSTFA) yra taip pat dažnai vartojamas sililinantis reagentas. Lyginant su BSTFA, MTBSTFA privalumas tas, kad silil grupė yra
apsaugoma didelėmis tret-butil grupėmis ir dėl to derivatai yra atsparesni hidrolizei. Taip pat AR derivatizacijai naudojamas acilinimas, kuriame naudojami alkil-chloroformato reagentai. Pagrindinis acilinimo privalumas – acilinimo derivatai yra atsparesni hidrolizei lyginant su silil derivatais. Tai patvirtina atliktas tyrimas, kuriame buvo pritaikyta
acilinimo metodika. Tiriamoji medžiaga buvo sumaišyta su derivatizatoriumi – metilchloroformatu ir minutę maišoma maišyklėje. Analizuojamų mėginių rezultatai parodė derivatų didelį atsparumą hidrolizei [33].
1.7.
Vilkdalgio (Iris L.) morfologija
Šis augalas priklauso vilkdalginių šeimai (lot. Iridaceae). Šiuo metu manoma, jog vilkdalginių genčiai priskiriami daugiau nei per 300 rūšių augalų [33]. Vilkdalgiai – žoliniai
augalai, turintys storus mėsingus arba sumedėjusius šakniastiebius. Stiebai gali būti pastebimi vieni arba suaugę, vientisi ar šakoti. Lapai gali būti ir siauri, linijiški, plokšti, kalavijiški arba dvieiliai. Vilkdalgių lapų spalva gali būti įvairi: šviesiai žalios, žalios, melsvai žalios ar pilkšvai žalios matinės ar blizgančios. Lapų ilgis gali būti nuo 60 cm ir siekti 90 cm ar net daugiau, o plotis – 1 - 6 cm. Žiedai pavieniai arba po kelis, žiedynuose susitelkę, gana stambūs, taisyklingi su pažiedėmis. Vilkdalgių žiedai yra sudaryti iš 3 viršutinių ir 3 apatinių žiedlapių su apatine mezgine ir neilgu liemenėliu, nuo kurio atsišakojusios 3 purkos ir 3 kuokeliai [34, 35].
Barzdotieji vilkdalgiai apatinėje žiedlapių dalyje turi šepetėlio pavidalo darinį – barzdelę. Ji aptinkama ilga, siaura ar plati, ryški ar neryški. Barzdelės spalva, priklausomai nuo veislės, gali būti balta, geltona, oranžinė, žalsvai geltona, žydra, balta su geltonais galiukais, geltona su violetiniais galiukais arba gali turėti rudus bei violetinius dryžius per barzdelės vidurį. Naujai išrastų veislių žiedai vietoje barzdelės gali turėti įvairias išaugas ragelio, šaukštelio ar raukinio formos. [35]
2. Tyrimo objektas ir metodika
2.1.
Tyrimo organizavimas
Pradžioje buvo surinkta literatūra duomenų bazėse, kuri reikalinga magistrinio baigiamojo darbo temos plėtojimui. Sukaupus pakankamai žinių apie tyrimo objektą buvo nustatytas darbo tikslas, suformuoti uždaviniai, numatytas tyrimo eigos procesas.
Tyrimui pasirinkta vilkdalgių gumbų žaliava, kurioje buvo analizuojamos laisvosios amino rūgštys, naudojant dujų chromatografija – masių spektrometrijos metodą. Tyrimai buvo atliekami Lietuvos sveikatos mokslų universitete, Medicinos akademijoje, Farmacijos fakultete, Analizės ir toksikologinės chemijos katedroje.
2.2.
Tyrimo objektas
Barzdotųjų vilkdalgių (Iris germanica) gumbai. Šiai žaliavai nebuvo naudotos trąšos ar kiti augalą modifikuojantys preparatai. Preparatai buvo laikomi vėsioje, vengiant tiesioginių saulės spindulių vietoje. Vilkdalgių mėginiai buvo renkami įvairiuose Lietuvos regionuose (1 lentelė).
Veislė Metai Vietovė
Iris germanica 2020 Kauno raj., Kaunas (1)
Iris germanica 2020 Kauno raj., Kaunas (2)
Iris germanica 2020 Raseinių raj., Raseiniai
Iris germanica 2020 Mažeikių raj., Mažeikiai
Iris germanica 2020 Jurbarko raj., Jurbarkas
Iris germanica 2020 Šakių raj., Šakiai
1 lentelė. Barzdotojo vilkdalgio žaliavos surinkimo vietovės Lietuvos regionuose. Tyrimams buvo naudotos šios medžiagos:
• destiliuotas vanduo (paruoštas naudojant „Millipore“ (Darmstadt, Vokietija) valymo sistemą);
• acetonitrilas (99,99 %) (Sigma – Aldrich, Vokietija); • aetanolis (99,9%), Sigma-Aldrih);;
• N-metil-N-(tert-butildimetilsilyil)trifluoroacetamidas (MTBSTFA).
• amino rūgščių standartų mišinys (2,5 μmol/ml kiekvienos amino rūgšties) (Sigma-Aldrich, Vokietija).
2.3.
Įranga
Tyrimui atlikti naudojama įranga:
• Analizė atlikta su Shimadzu (SHIMADZU GC-2010 PLUS) dujų chromatografu su masių spektrometrijos detektoriumi(Shimandzu Corporation, Japonija), Rxi – 5MS spausto silikagelio kolonėlė, kurios ilgis 30m, vidinis diametras 0,25mm, o nejudančios fazės storis 0,25μm ir nešančios dujos – helis.
• Tirpalų lašinimui naudotos automatinės pipetės (Eppendorf Research, JAV). • Shimadzu AUW120D (Duisburgas, Vokietija) analitinės svarstyklės.
• IKA A11 Basic (Vokietija) smulkinimo aparatas. • Ultragarso bangų vonelė „WiseClean“.
2.4.
Dujų chromatografijos metodikos pritaikymas amino rūgštims tirti
Žaliavos paruošimas tiriamiesiems tirpalams gaminti
Tyrimas atliekamas sausai ir šviežiai susmulkintai medžiagai, todėl žaliava
padalinama į dvi grupes. Dalis iš jų buvo laikoma sausoje, vėsioje patalpoje, o kita žaliavos dalis buvo iškart džiovinama.
Analizei naudojama medžiaga pradžioje susmulkinama, taip džiovinimo procesui padidindamas paviršiaus plotas. Žaliava džiovinama gerai vėdinamoje, ne aukštesnėje nei 25 °C temperatūroje, sausoje aplinkoje kelias dienas arba džiovinama specialu džiovinimo aparatu iki susmulkinta žaliava tampa trapi. Augalo susmulkinti, išdžiovinti gumbai sudedami į IKA A11 Basic smulkinimo aparatą (Vokietija). Smulkinimas vyksta kelias minutes iki tol, kol žaliava virsta
smulkiais milteliais. Po smulkinimo buvo gauta smulki, miltelių pavidalo žaliava, kurioje nebebuvo matoma dalelių. Susmulkinta žaliava paruošiama ir sudedama į skirtingas talpyklas bei
paženklinama. Kita žaliavos dalis iškart smulkinama ir atliekamas tiriamojo tirpalo ruošimas. Tiriamųjų tirpalų paruošimas
1 g susmulkintų vilkdalgių gumbų atsveriamas analitinėmis svarstyklėmis ir supilamas į 10 ml tūrio kolbutes. Kolbutės užpildomos metanoliu iki 10 ml žymės, gerai supurtomos ir 10 minučių laikomos ultragarso vonelėje. Gauti mėginiai perkeliami į mėgintuvėlius, naudojamus centrifugoje. Medžiaga centrifuguojama porą minučių, greitį nustačius 7500 apsisukimų per minutę. Baigus centrifuguoti ir atskyrus skystą fazę, iš mėginio paimama 100 μl tirpalo, kuris supilamas į tamsaus stiklo, sandarius buteliukus.
Amino rūgščių derivatizacija
Tiriamoms laisvosioms amino rūgštims privaloma derivatizaciją, dėl to buteliukuose esantis mėginys visiškai išgarinamas po azoto dujų srove iki sauso likučio. Į talpykles su likučiu pilamas 100 μl acetonitrilas ir 100 μl derivatizatoriaus MTBSTFA. Uždari buteliukai su gautais tirpalais kaitinami 100 °C temperatūroje glicerolio vonelėje 2,5 valandos. Galiausiai 1 μl tiriamojo mėginio injekuojama į dujų chromatografą.
Etaloninio tirpalo ruošimas
Iš standartų mišinio paimama 100μL amino rūgščių tirpalo ir iki sauso likučio išgarinama po azoto srove. Gautos sausos nuosėdos užpilamos 100 μL acetonitrilo ir 100μL naudojamo derivatizatoriaus MTBSTFA. Gautas tirpalas kaitinamas 100 °C temperatūroje glicerolio vonioje 2,5 valandos.
2.5.
Dujų chromatografijos sąlygos
Laisvųjų amino rūgščių kokybiniam bei kiekybiniam nustatymui žaliavoje buvo pasirinkta dujų chromatografijos metodika. Dujų chromatografo ir analizės sąlygos pateikiama 2 lentelėje.
Parametras Sąlygos
Kolonėlė Rxi®-5ms
Kolonėlis ilgis 30m ilgio
Kolonėlės skersmuo 0,25μm
Nejudrios fazės storis 0,25μm
Injekcijos temperatūra 260 °C
Kolonėlės temperatūra 75 °C
Bendras tėkmės greitis 34,4 ml/min Tėkmės kolonėle greitis 1,5ml/min
Nešančios dujos Helis
Injekcijos tūris 1 μl
Helio slėgis 100,0 kPa
2 lentelė. Dujų chromatografijos analizės sąlygos
Analizės metu vyko kolonėlės temperatūros pokytis, nes buvo naudojamas gradientinis temperatūros rėžimas (3 lentelė).
Keliamos temperatūros greitis (°C/min)
Temperatūra (°C) Užlaikymo laikas (min)
- 75 5
10 290 5
20 320 5
3 lentelė. Gradientinis temperatūros kilimas
Tyrimai buvo atliekami skirtingų regionų žaliavoms. Laisvųjų amino rūgščių koncentracija apskaičiuota naudojant kalibracinę kreivę, kuriai sudaryti buvo naudojami žinomos koncentracijos etaloniniai tirpalai.
Validacija
Analitinė metodika yra validuota ir tinkama amino rūgščių analizei. Validacija atlikta Mato Gaivenio magistro baigiamajame darbe „Laisvų amino rūgščių augalinėje žaliavoje nustatymo metodika naudojant dujų chromatografiją“.
3. Rezultatai ir jų aptarimas
3.1.
Laisvųjų amino rūgščių kokybinis nustatymas
Poliškumas ir nelakumas yra pagrindinės savybės, dėl kurių laisvosios amino rūgštys negali būti tiesiogiai tiriamos dujų chromatografijos metodu. Prieš analizę atliekama junginių dervatizacija, kuri paverčia AR mažiau reaktyviomis medžiagomis, taip pat pagerina jų chromatografinį atskyrimą ir padaro lakiais junginiais. Derivatizacijos analizei buvo naudotas (MTBSTFA) N-metil-N-(tret-butildimetilsilil)trifluoroacetamidas) derivatizatorius.
Dujų chromatografijos metodu visuose mėginiuose sėkmingai nustatyti laisvųjų amino rūgščių derivatizacijos produktai.Amino rūgštys identifikuotos remiantis duomenų baze ir pagal sulaikymo laiką. Įvertintų junginių sulaikymo laikai sulyginti su standartinių tirpalų sulaikymo laikais.
12 paveikslas. Amino rūgščių mėginio K(1) chromatograma. 1 – alaninas, 2 – glicinas, 3 – valinas, 4 – leucinas, 5 – izoleucinas, 6 – prolinas, 7 – serinas, 8 – fenilalaninas, 9 – apsarto rūgštis, 10 – glutamo rūgštis, 11 – tirozinas.
Iš pateiktų chromatogramų matome, kad junginiai vienas nuo kito atsiskyrę. Alanino sulaikymo trukmė - 14.704 min, glicino - 15.001 min, valino - 16.216 min, leucino - 16.714 min,
izoleucino - 17.090 min, prolino - 17.409 min, serino - 19.940 min, fenilalanino - 20.943 min, aspartamo rūgšties - 21.559 min, glutamo rūgšties - 22.641 min, tirozino - 25.753 min.
3.2.
Laisvųjų amino rūgščių kiekybinis nustatymas
Nustačius laisvąsias amino rūgštis kokybiškai, privaloma atlikti ir kiekybinė AR analizė. Dėl šios priežąsties yra sudaroma kalibracinės kreivės, panaudojus žinomų koncentracijų etaloninius tirpalus.
Kalibraciniuose grafikuose absicisių ašyje norodomos medžiagų koncentracijos, ordinačių – dujų chromatografo smailės plotas. Funkcijos ir kiti svarbūs parametrai nurodomi 4 lentelėje.
Amino rūgštis Funkcijos lygtis Determinacijos koficientas Alaninas f(x)=281766.732385*x -151475.614966 r2 = 0.930087 Glicinas f(x)=307888.469976*x -386511.363171 r2 = 0.924776 Valinas f(x)=249141.957926*x +363365.493606 r2 = 0.886084 Leucinas f(x)=287041.492244*x -201473.326389 r2 = 0.927946 Izoleucinas f(x)=233454.537256*x +544450.385570 r2 = 0.896224 Prolinas f(x)=288232.903171*x +1720910.693438 r2 = 0.865114 Serinas f(x)=324303.113917*x +1971749.329881 r2 = 0.886962 Fenilalaninas f(x)=211654.925651*x + 421367.953259 r2 = 0.888505 Asparto rūgštis f(x)=273314.973170*x +2701137.416486 r2 = 0.881785 Glutamo rūgštis f(x)=218542.759110*x - 352240.735532 r2 = 0.933645
Tirozinas f(x)=218746.004720*x +4267862.926887
r2 = 0.813934
4 lentelė. Kalibracinių kreivių parametrai.
Determinacijos koeficientas (r2 ) nėra toli nuo vieneto, todėl pagal kalibracines kreives galima nustatyti nežinomų mėginių kiekius. Pagal šias kalibracinių kreivių lygtis galima
paskaičiuoti, kokia koncentracija bus analizuojamoje žaliavoje - μg/ml.
3.2.1. Alaninio kiekio nustatymas tiriamose žaliavose
Atlikus kiekybinį alanino tyrimą buvo sėkmingai paskaičiuotas jo kiekis preparatuose. Skirtinguose rajonuose rinktoms žaliavoms buvo atlikti tyrimai, kuriuose buvo lyginami alanino kiekiai. Iš viso buvo paruošti 6 sausi ir 6 šviežiai nurinktos žaliavos mėginiai. 13 paveiksle rodomas skirtinguose miestuose augintų vilkdalgių gumbų amino rūgščių rastas kiekis.
13 paveikslas. Alanino kiekis vilkdalgių gumbuose.
Kaip matoma iš diagramos, visuose skirtingų rajonų vilkdalgių gumbuose buvo rastas alaninas. Labiausiai savo profiliu išsiskyrė Kauno, Raseinių ir Mažeikių rajonuose rinktos žaliavos preparatai – 30,56 μg/g, 30,24 μg/g ir 30,27 μg/g (išdžiovintose) žaliavose. Apart Jurbarko ir Šakių rajone rinktų žaliavų, visuose preparatuose buvo aptinkamas panašus alanino kiekis.
30,56 28,75 27,58 25,86 30,24 28,95 30,27 27,46 23,45 21,45 23,25 21,34 0 5 10 15 20 25 30 35 K ( 1 ) K 1 K ( 2 ) K 2 R R 1 M M 1 J J 1 Š Š 1
ALANINO KIEKIS MKG/G
3.2.2. Valino kiekio nustatymas tiriamose žaliavose
Kita laisvoji amino rūgštis nagrinėjama tyrime buvo valinas. Pritaikius dujų chromatografijos metodiką visuose mėginiuose buvo sėkmingai nustatytas valinas. Remiantis gautais tyrimo rezultatais, valino kiekiai yra pateikiami diagramoje.
14 paveikslas. Valino kiekis žaliavose, rinktose skirtinguose Lietuvos regionuose. Remiantis gautais rezultatais galima teigti, jog didžiausias valino kiekis nustatytas Kauno, Raseinių bei Mažeikių rajonų sausose (9,94, 10,06, 10,24 μg/g) bei šviežiai (9,62, 9,65, 9,51 μg/g) paruoštoje žaliavoje. Išdžiovintoje žaliavoje galima pastebėti, kad valino kiekis yra šiek tiek didesnis. Žaliavoje, rinktoje Jurbarko bei Šakių rajone, yra matomas daug mažesnis valino kiekis, kuris svyruoja apie 6,5 μg/g.
3.2.3. Leucino kiekio nustatymas tiriamose žaliavose
Vilkdalgių gumbuose taip pat buvo tiriamas ir leucino kiekis. Tiriamuose tirpaluose nustatyta, kad kiekviename iš mėginių buvo aptiktas leucinas. Visi gauti rezultatai yra pavaizduoti 19 paveiksle. 0 2 4 6 8 10 12 K(1) K1 K(2) K2 R R1 M M1 J J1 Š Š1
Valino kiekis mkg/g
15 paveikslas. Mėginiuose aptiktas leucino kiekis.
Visuose tirtuose mėginiuose pastebima, kad išdžiovintų žaliavų paruoštuose mėginiuose leucino kiekis yra didesnis. Didžiausias kiekis buvo pastebimas Kauno (35,48 μg/g), Raseinių (28,87 μg/g), bei Mažeikių (27,26 μg/g) rajonuose rinktų preparatų žaliavoje. Mažiausi kiekiai aptinkami šviežiai paruoštuose preparatuose. Jie buvo renkami Jurbarko (18,48 μg/g) rajone.
3.2.4. Izoleucino kiekio nustatymas tiriamose žaliavose
Atlikus kiekybinę analizę taip pat mėginiuose buvo ieškomas izoleucinas.
16 paveikslas. Izoleucino kiekis μg/g tiriamuose mėginiuose.
35,48 33,91 27,45 24,62 28,87 26,41 27,26 26,23 20,3 18,48 26,34 23,56 0 5 10 15 20 25 30 35 40 K(1) K1 K(2) K2 R R1 M M1 J J1 Š Š1
Leucino kiekis mkg/g
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 K(1) K1 K(2) K2 R R1 M M1 J J1 Š Š1Izoleucino kiekis mkg/g
Mėginiuose buvo aptiktas mažas kiekis izoleucino (16 paveikslas). Sausai paruoštose žaliavose vėlgi buvo matomas didžiausias kiekis laisvųjų amino rūgščių. Šie preparatai buvo rinkti Raseinių rajone, kurių izoleucino kiekis buvo 1,71 μg/g. Žaliava rinkta Kauno (2) rajone taip pat turėjo panašų kiekį izoleucino – 1,64 μg/g. Mažeikiuose rinkta žaliava mėginyje izoleucino turėjo mažiausiai apie 0,9 μg/g.
3.2.5. Asparto rūgšties kiekio nustatymas tiriamose žaliavose
Dar viena medžiaga bandoma nustatyti – asparto rūgštis. Atlikus kiekybinį tyrimą LAR, tik dalyje buvo aptinkama ieškoma medžiaga. Visose medžiagose aptiktas asparto rūgšties kiekis pavaizduojamas 21 diagramoje.
17 paveikslas. Žaliavose esantis asparto rūgšties kiekis mėginiuose.
Kaip rodo gauti duomenys, galime daryti išvadą, kad tik išdžiovintose medžiagose yra pastebima asparto rūgštis. Didžiausias kiekis tiriamosios medžiagos buvo matomas Mažeikių ir Kauno (1) rajonų žaliavose (43,24 μg/g ir 42,88 μg/g). Atlikus DC – MS, Jurbarko (36,4 μg/g) ir Raseinių rajonas (37,14 μg/g) išsiskyrė mažiausiu kiekiu tiriamos medžiagos profiliu. Atliktus bandymus ir šviežioms žaliavoms, dujų chromatogramoje nebuvo aptikta asparto rūgšties.
32 34 36 38 40 42 44 K(1) K1 K(2) K2 R R1 M M1 J J1 Š Š1
3.2.6. Tirozino kiekio nustatymas tiriamose žaliavose
Tirozinas buvo taip pat bandomas nustatyti vilkdalgių gumbuose. Atlikus dujų chromatografiją, tiriamos medžiagos kiekis, esantis žaliavoje, buvo perskaičiuotas. Vėliau aptikti kiekiai preparatuose buvo lyginami (22 paveikslas).
18 paveikslas. Tirozino kiekis μg/g augalinėje žaliavoje.
Atlikus tyrimą, tirozinas buvo matomas tik preparatuose, kurių žaliava iš pradžių buvo džiovinama. Juos palyginus matomas panašus kiekis tiriamos medžiagos, bet didesniu kiekiu
labiausiai išsiskyrė Šakių ir Kauno (1) rajonai (27,84 μg/g, 26,17 μg/g), o mažiausiu Kauno (2) rajonas (20,33 μg/g).
3.2.7. Prolino kiekio nustatymas tiriamose žaliavose
Tarp visų laisvųjų amino rūgščių buvo tiriamas prolinas. Tyrime buvo atliekamas nustatymas šviežioms ir sausai paruoštoms žaliavoms. Ištyrus preparatus dujų chromatografu, vėliau buvo apskaičiuotas prolino kiekis žaliavose. Palyginus gautus rezultatus, duomenys toliau perkeliami į diagramą. 26,17 20,33 24,32 25,73 23,84 27,84 0 5 10 15 20 25 30 K(1) K1 K(2) K2 R R1 M M1 J J1 Š Š1
Tirozino kiekis mkg/g
19 paveikslas. Aptiktas prolino kiekis žaliavose.
Šviežiai paruoštoje žaliavoje prolinas nebuvo aptiktas. Džiovintuose preparatuose labiausiai savo profiliu išsiskyrė Kauno (1) rajone rinkta žaliava (35,95 μg/g). Visų rajonų
preparatuose buvo rastas panašus kiekis prolino ~ 25 μg/g. Šakių rajone rinktoje žaliavoje prolinas nerastas.
3.2.8. Glicino kiekio nustatymas tiriamose žaliavose
Kiekybinis tyrimas buvo atliekamas glicinui aptikti. Atlikus tyrimą, ne visuose mėginiuose buvo rasta LAR. Mėginių duomenys, kuriuose aptiktas glicinas, buvo perskaičiuojami μg/g. Vėliau kiekiai palyginti tarpusavyje ir įstatyti į diagramą.
35,95 27,46 23,86 26,64 25,65 0 5 10 15 20 25 30 35 40 K(1) K1 K(2) K2 R R1 M M1 J J1 Š Š1
Prolino kiekis mkg/g
20 paveikslas. Glicinas aptiktas vilkdalgių gumbuose.
Gautais duomenimis matoma, kad šviežiai smulkintuose gumbuose glicinas neaptinkamas. Ieškoma medžiaga aptikta daugumoje išdžiovintų žaliavų (svyruoja ~ 20 μg/g). Šviežioje ir sausai paruoštoje žaliavoje, kuri buvo rinkta Jurbarko rajone, glicinas nebuvo rastas.
3.2.9. Glutamo rūgšties kiekio nustatymas tiriamose žaliavose
Pasitelkus dujų chromatografijos metodiką, mėginiuose buvo tiriama glutamo rūgštis. Apskaičiuoti duomenys pateikti 21 paveiksle.
0 5 10 15 20 25 K(1) K1 K(2) K2 R R1 M M1 J J1 Š Š1
Glicino kiekis mkg/g
12,53 12,34 13,38 13,53 11,6 11,8 12 12,2 12,4 12,6 12,8 13 13,2 13,4 13,6 13,8 K(1) K1 K(2) K2 R R1 M M1 J J1 Š Š121 paveikslas. Glutamo rūgštis tiriamose žaliavose.
Atlikta kiekybinė analizė parodė, kad glutamo rūgštis neaptinkama šviežiai paruoštuose vilkdalgių gumbų mėginiuose. Visuose rajonuose augintose žaliavose, išskyrus Mažeikių ir Šakių rajonus, buvo aptinkama glutamo rūgštis (~13 μg/g).
3.2.10. Serino kiekio nustatymas tiriamose žaliavose
Atlikus kiekybinę analizę vilkdalgių gumbams, buvo aptiktas serinas. Skirtinguose rajonuose rinktoms žaliavoms perskaičiavus duomenis μg/ml, jie buvo palyginti. 21 paveiksle pateikti gauti žaliavų serino kiekiai.
22 paveikslas. Serino kiekis aptiktas vilkdalgių gumbuose.
Kaip matoma diagramoje, šviežiose žaliavose nėra pastebimas serinas. Atlikus dujų chromatografiją, išdžiovintuose vilkdalgių gumbuose serinas buvo aptiktas tik Mažeikių, Šakių, Kauno (1) ir (2) rajonuose rinktose žaliavose. Didžiausias kiekis užfiksuotas Kauno (1) rajono žaliavoje (16,67 μg/g), o kituose ~ 12 μg/g.
3.2.11. Fenilalanino kiekio nustatymas tiriamose žaliavose
Vilkdalgių gumbuose buvo nustatomas fenilalanino kiekis. Atlikus dujų
chromatografiją, tiriamoji medžiaga buvo aptikta ne visose žaliavose. Kai kuriuose mėginiuose buvo aptinkami fenilalanino kiekiai, o jie paskaičiuoti μg/ml, o vėliau gauti rezultatai lyginami tarpusavyje. 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 K(1) K1 K(2) K2 R R1 M M1 J J1 Š Š1
Serino kiekis mkg/g
23 paveikslas. Vilkdalgių gumbuose aptiktas fenilalanino kiekis.
Gautais rezultatais galima teigti, jog didžiausias fenilalanino kiekis nustatytas Kauno (1) ir Mažeikių rajonų išdžiovintoje (16,67, 15,23 μg/g) žaliavoje. Žaliavoje rinktoje Jurbarko bei Šakių rajone yra matomas šiek tiek mažesnis fenilalanino kiekis (12,01, 13,42 μg/ml). Šviežiai žaliavai atliktus dujų chromatografiją, ji nepasižymėjo turinti fenilalanino.
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 K(1) K1 K(2) K2 R R1 M M1 J J1 Š Š1
Fenilalanino kiekis mkg/g
4.
IŠVADOS
1. Parenkant ekstrakcijos sąlygas nustatyta, kad vilkdalgių gumbuose nėra randama laisvųjų amino rūgščių, dėl to prieš atliekant tyrimą vykdoma baltymų hidrolizė. Junginių
derivatizacijai kaip derivatizatorius laisvųjų amino rūgščių analizėje parinktas MTBSTFA (N-metil-N-(tert-butildimetilsilyil)trifluoroacetamidas).
2. Pritaikius dujų chromatografijos – masių spektrometrijos metodą su junginių derivatizacija ir remiantis masių spektrų (WR10 ir NIS14) duomenų baze vilkdalgių (Iris L.) gumbuose, buvo identifikuotos laisvosios amino rūgštys: alaninas, glicinas, valinas, leucinas,
izoleucinas, prolinas, serinas, fenilalaninas, apsarto rūgštis, glutamo rūgštis ir tirozinas. 3. Tyrimų metu nustatyta, kad suminis laisvųjų amino rūgščių kiekis, skirtinguose Lietuvos
regionuose surinktose vilkdalgių gumbų žaliavose skyrėsi. Didžiausias bendras laisvųjų amino rūgščių kiekis nustatytas išdžiovintuose vilkdalgių gumbuose rinktuose Kauno (1) rajone (248,38 μg/g). Mažiausias bendras laisvųjų amino rūgščių kiekis nustatytas Jurbarko rajone rinktoje šviežioje žaliavoje (48,32 μg/g). Nors LAR kiekiai skyrėsi tarp regionų, tačiau visuose dominavo alaninas ir leucinas.
5.
PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS
Atlikus laisvųjų amino rūgščių kokybinę ir kiekybinę analizę Iris germanica
gumbuose, augintuose skirtinguose Lietuvos regionuose, rekomenduojama ištirti ir kitus vilkdalgių rūšies augalus. Tokiu atveju būtų įgyjama daugiau žinių apie laisvąsias amino rūgštis, esančias šios šeimos augaluose.
6.
LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Bhagavan NV, Ha CE. Amino Acids. Essentials of Medical Biochemistry. 2nd ed. 2015; 21–29. 2. Wu, G. (2013). Functional amino acids in nutrition and health. Amino Acids, 45(3), pp.407-411. 3. Damodaran S, Parkin K, Fennema O. Fennema's Food Chemistry, Fourth Edition. Hoboken: CRC Press; 2007.
4. Bocian, Szymon, Magdalena Skoczylas, and Bogusław Buszewski. "Amino acids, peptides, and proteins as chemically bonded stationary phases–A review." Journal of separation science 39.1 (2016): 83-92.
5. King M. Chemical Nature of the Amino Acids. 2018. Prieiga internetu:
https://themedicalbiochemistrypage.org/amino-acids.php
6. Rodwell VW, Bender DA, Botham KM, Kennelly PJ, Weil PA. Chapter 3: Amino Acids & Peptides. Harper's Illustrated Biochemistry, 31ed. 2018.
7. Sigma Aldrich. Amino Acids Reference Chart. [žiūrėta 2018 11 15]. Prieiga internetu: https://www.sigmaaldrich.com/life-science/metabolomics/learning-center/amino-acid-referencechart.html
8. Smith CM, Marks AD, Lieberman MA. Amino Acids in Proteins, chapter 7.Marks’ Essential Medical Biochemistry, 2nd ed. Lippincott Williams &Wilkins, US. 2007; ISBN: 0-7817-2145-8. 9. Guoyao Wu. „Amino acids: metabolism, functions, and nutrition“. 2009, Volume 37, Issue 1, pp 1–17.
10. Srinivasan D, Parkin KL, Fennema OR, editors. Fennema's Food Chemistry, 4th ed.Taylor & Francis. 2007. ISBN 978-0-8247-2345-3.
11. Yang J, Chi Y, Burkhardt BR, Guan Y, Wolf BA. Leucine metabolism in regulation of insulin secretion from pancreatic beta cells. Nutrition Reviews. 2010; 68 (5): 270 – 9.
12. Iverson J, Gannon M, Nuttall F. Ingestion of Leucine + Phenylalanine with Glucose Produces an Additive Effecton Serum Insulin but Less than Additive Effect on Plasma Glucose. J Amino Acids. 2013;
13. Heys D, Garcia-Caballero M, Wahle K. Essential Immunology for Surgeons. Nutrition and Immunity. 2011;
14. Thanan R, Oikawa S, Hiraku Y, Ohnishi S, Ma N, Pinlaor S, et al. Oxidative stress and its significant roles in neurodegenerative disease and cancer. Int J Mo Sci. 2014;16(1):193-217. 15. Bourdon E, Loreu N, Lagrost L, Blache D. Differential effects of cysteine and methionine residues in the antioxidant activity of human serum albumin. Free Radical Research. 2005; 39(1): 15–20.
16. Atmaca G. Antioxidant Effect on Sulphur-Containing Amino Acids. Yonsey Medical Journal. 2004; 45(5): 776-88.
17. Vanderah T, Gould D. Nolte's The Human Brain,7ed. Synaptic Transmission Between Neurons. 2016; 182-206
18. Barrett K, Barman S, Brooks H, Yuan J. Ganong's Review of Medical Physiology, 26ed. Chapter 7: Neurotransmitters & Neuromodulators. 2019; ISBN 978-1-260-12240-4.
19. King M.W. Integrative Medical Biochemistry Examination and Board Review. Chapter 31: Nitrogen: Amino Acid–Derived Biomolecules. NewYork; 2014.
20. Önal, A. (2007). A review: Current analytical methods for the determination of biogenic amines in foods. Food Chemistry, 103(4), pp.1475-1486.
21. WU Chen, WANG Li-Qin, YANG Lu et al. „Application of Gas Chromatography-Mass Spectrometry for the Identification of Organic Compounds in Cultural Relics“. Chin J Anal Chem, 2013, 41(11), p.1773–1779
22. Hannelore Kaspar, Katja Dettmer, Wolfram Gronwald et al. „Advances in amino acid analysis“. Anal Bioanal Chem (2009) 393: 445
23. McNair, Harold M., James M. Miller, and Nicholas H. Snow. Basic gas chromatography. John Wiley & Sons, 2019.
24. Saleh, A., Yamini, Y., Faraji, M., Rezaee, M. and Ghambarian, M. (2009). Ultrasound-assisted emulsification microextraction method based on applying low density organic solvents followed by gas chromatography analysis for the determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in water samples. Journal of Chromatography A, 1216(39), pp.6673-6679.
25. Glew R, Vanderjagt D, Lockett C, Grivetti L, Smith G, Pastuszyn A et al. Amino Acid, Fatty Acid, and Mineral Composition of 24 Indigenous Plants of Burkina Faso. Journal of Food Composition and Analysis. 1997;10(3):205-217.
26. McNair H, Miller J, Settle F, Mcnair. Basic Gas Chromatography. Somerset: Wiley; 2011. 27. Hušek P. Rapid derivatization and gas chromatographic determination of amino acids. Journal of Chromatography A. 1991;552:289-299.
28. Bidlingmeyer B, Cohen S, Tarvin T. Rapid analysis of amino acids using pre-column derivatization. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 1984;336(1):93-104.
29. Orata F. Derivatization Reactions and Reagents for Gas Chromatography Analysis. Mohd MA, editor. Advanced Gas Chromatography – Progressin Agricultural, Biomedical and Industrial Applications; 2012. ISBN: 978-953-51-0298-4.
30. Villas-Bôas SG, Smart KF, Sivakumaran S, Lane GA. Alkylation or Silylation for Analysis of Amino and Non-Amino Organic Acids by GC-MS? Metabolites. 2011; 1(1): 3–20.
31. Villas-Bôas S, Smart K, Sivakumaran S, Lane G. Alkylation or Silylation for Analysis of Amino and Non-Amino Organic Acids by GC-MS?. Metabolites. 2011;1(1):3-20.
32. Kaspar H, Dettmer K, Gronwald W, Oefner PJ. Advances in amino acid analysis. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2009; 393(2): 445-52.
33.Ugland H, Krogh M, Rasmussen K. Aqueous alkylchloroformate derivatisation and solid-phase microextraction: determination of amphetamines in urine by capillary gas chromatography. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 1997;701(1):29-38.
34. Kondratas, Edmundas. "Vilkdalgio (Iris L.) genties augalų taksonomija." Vytauto Didžiojo universiteto Botanikos sodo raštai, 2012, t. 16, p. 30-40 (2012).
35. Dapkūnienė, Stasė. "Barzdotųjų vilkdalgių veislių (Iris ‘XXX’morfologinių ir dekoratyvių
savybių apibūdinimo aprašas." (2013).
36. Mermygkas, Dionysios, Kit Tan, and Artemios Yannitsaros. "A new species of Iris (Iridaceae) from the northern Peloponnese (Greece)." Phytologia Balcanica 16.2 (2010): 263-266.
