DARBAS ATLIKTAS FARMACINIŲ TECHNOLOGIJŲ INSTITUTE PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Lietuvoje auginamų melsvauogių sausmedžių (Lonicera caerulea L.) vaisių fenolinių junginių kokybinės ir kiekinės sudėties įvairavimo tyrimas“.
1. Yra atliktas mano pačios.
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą. Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
2020-05-06 Simona Šerpytytė
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas) PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS
TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE Patvirtinu lietuviu kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
2020-05-06 Simona Šerpytytė
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO
Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
2020-05-06 Dr. Mindaugas Liaudanskas
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE, INSTITUTE)
Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
2020-05-11 Prof. dr. Valdas Jakštas
(aprobacijos data ) (katedros (klinikos, instituto) vedėjo (-os) (vadovo (-ės)) (parašas) vardas, pavardė)
Baigiamojo darbo recenzentas
Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
(vardas, pavardė) (parašas)
Baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
MEDICINOS AKADEMIJA FARMACIJOS FAKULTETAS
FARMACINIŲ TECHNOLOGIJŲ INSTITUTAS
SIMONA ŠERPYTYTĖ
LIETUVOJE AUGINAMŲ MELSVAUOGIŲ SAUSMEDŽIŲ (LONICERA CAERULEA L.) VAISIŲ FENOLINIŲ JUNGINIŲ KOKYBINĖS IR KIEKINĖS
SUDĖTIES ĮVAIRAVIMO TYRIMAS Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas Dr. Mindaugas Liaudanskas
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
FARMACINIŲ TECHNOLOGIJŲ INSTITUTAS
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanė: prof. dr. Ramunė Morkūnienė
Data
LIETUVOJE AUGINAMŲ MELSVAUOGIŲ SAUSMEDŽIŲ (LONICERA CAERULEA L.) VAISIŲ FENOLINIŲ JUNGINIŲ KOKYBINĖS IR KIEKINĖS
SUDĖTIES ĮVAIRAVIMO TYRIMAS Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Dr. Mindaugas Liaudanskas
Data
Recenzentas Darbą atliko
Magistrantė Simona Šerpytytė
Data Data
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 6
SANTRUMPOS ... 7
ĮVADAS ... 8
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 9
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10
1.1. Melsvauogių sausmedžių (Lonicera caerulea L.) botaninė sistematika, morfologiniai požymiai ir paplitimas ... 10
1.2. Melsvauogių sausmedžių vaisių cheminė sudėtis ... 11
1.3. Augalinių žaliavų fenolinių junginių ekstrakcijos metodai ... 12
1.4. Antocianinų biologinis poveikis ... 13
1.5. Melsvauogių sausmedžių vaisių preparatų panaudojimas medicinos praktikoje ... 14
1.6. Melsvauogių sausmedžių vaisių panaudojimas maisto pramonėje ... 16
1.7. Literatūros apžvalgos apibendrinimas ... 16
2. TYRIMO METODIKA ... 18
2.1. Tyrimo objektas ... 18
2.2. Naudoti reagentai ... 18
2.3. Naudota aparatūra ... 18
2.4. Melsvauogių sausmedžių vaisių ėminių ištraukų paruošimas ... 19
2.5. Tyrimo metodai ... 20
2.5.1. Bendro antocianinų kiekio nustatymas pH–diferenciniu metodu ... 20
2.5.2. Bendro proantocianidinų kiekio nustatymas ... 21
2.5.3. Antioksidacinio aktyvumo in vitro nustatymas, taikant ABTS, CuPRAC ir FRAP metodikas ... 22
2.5.4. Antocianinų kokybinė ir kiekinė analizė ... 24
2.5.5. Fenolinių junginių kokybinė ir kiekinė analizė ... 24
2.6. Tyrimo duomenų analizė ... 24
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 26
3.1. Melsvauogių sausmedžių vaisių antocianinų ekstrakcijos sąlygų nustatymas ... 26
3.2. Melsvauogių sausmedžių vaisių ėminių bendro antocianinų kiekio įvairavimas ... 28
3.3. Melsvauogių sausmedžių vaisių ėminių antocianinų kokybinės ir kiekinės sudėties įvairavimas ... 29
3.4. Melsvauogių sausmedžių vaisių bendro proantocianidinų kiekio įvairavimas ... 34
3.5. Melsvauogių sausmedžių vaisių ėminių fenolinių junginių kokybinės ir kiekinės sudėties įvairavimas ... 35
3.6. Melsvauogių sausmedžių vaisių ėminių ištraukų antioksidacinio aktyvumo in vitro nustatymas ... 40
3.7. Melsvauogių sausmedžių vaisių ėminių fenolinių junginių kiekinės sudėties ir jų ištraukų antioksidacinio aktyvumo in vitro koreliacijų įvertinimas ... 42
3.8. Melsvauogių sausmedžių vaisių ėminių klasterinė ir faktorinė analizė ... 44
3.8.1. Antocianinų kiekio palyginimas naudojant klasterinę analizę ... 45
3.8.3. Melsvauogių sausmedžių vaisių ėminių fenolinių junginių pagrindinių komponenčių analizė ... 48 3.9. Rezultatų apibendrinimas ... 49 4. IŠVADOS ... 50 5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 52 6. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 53
SANTRAUKA
S. Šerpytytės magistro baigiamasis darbas/ mokslinis vadovas dr. Mindaugas Liaudanskas; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademijos Farmacijos fakulteto Farmacinių technologijų institutas. – Kaunas.
Pavadinimas: Lietuvoje auginamų melsvauogių sausmedžių (Lonicera caerulea L.) vaisių fenolinių junginių kokybinės ir kiekinės sudėties įvairavimo tyrimas.
Darbo tikslas – ištirti Lietuvoje auginamų melsvauogių sausmedžių vaisių, kaupiančių fenolinius junginius kokybinės ir kiekinės sudėties įvairavimą ir įvertinti šių ekstraktų antioksidacinį aktyvumą in vitro.
Darbo uždaviniai: Nustatyti melsvauogių sausmedžių vaisių ėminių antocianinų ekstrakcijos sąlygas. Pritaikius UV–regimosios šviesos spektrofotometrijos ir ESC metodus, nustatyti antocianinų kokybinės ir kiekinės sudėties įvairavimą skirtingų veislių vaisių ėminiuose. Pritaikius ESC metodą, nustatyti melsvauogių sausmedžių vaisių fenolinių junginių kokybines ir kiekinės sudėties įvairavimą. Atlikti melsvauogių sausmedžių vaisių ėminių ištraukų antioksidacinio aktyvumo in vitro tyrimus. Įvertinti koreliaciją tarp vaisių ėminių fenolinių junginių kiekio ir jų ištraukų antioksidacinio aktyvumo in vitro.
Tyrimo objektas ir metodai: tirti melsvauogių sausmedžių (Lonicera caerulea L.) 'Nimfa', 'Wojtek', 'Indigo Gem', 'Amphora', 'Leningradskij Velikan', 'Iga', 'Tundra' ir 'Tola' veislių vaisių ėminiai. Bendras proantocianidinų ir antocianinų kiekis, antioksidacinis aktyvumas in vitro įvertintas UV–regimosios šviesos spektrofotometrijos metodu. ESC metodu nustatytas individualių antocianinų ir fenolinių junginių kiekis.
Tyrimo rezultatai ir išvados: Didžiausias bendras antocianinų kiekis nustatytas melsvauogių sausmedžių vaisių ėminius ekstrahuojant 40 min. 80 proc. (v/v) etanoliu, naudojant 904 W ultragarso vonelės galią. ESC metodu nustatyti šie junginiai: cianidin-3-O-gliukozidas, cianidin-3,5-O-digliukozidas, cianidin-3-O-rutinozidas, peonidin-3-O-gliukozidas, cianidinas, cianidin-3-galaktozidas, peonidinas, procianidinas B1, rutinas, izokvercitrinas, kvercitrinas, chlorogeno rūgštis, kavos rūgštis, p-kumaro rūgštis ir ferulo rūgštis. Stipriausiu antioksidaciniu aktyvumu, nustatytu ABTS metodika, pasižymėjo 'Amphora', 'Nimfa', 'Tundra' ir 'Indigo Gem' veislių vaisių ėminių ištraukos, FRAP – 'Amphora' veislės vaisių ėminių ištraukos, CuPRAC – 'Tundra' veislės vaisių ėminių ištraukos. Stipriausiai su melsvauogių sausmedžių vaisių ėminių ištraukų antioksidaciniu aktyvumu koreliuoja antocianino cianidin-3-O-galaktozido kiekis.
SUMMARY
The title of the master thesis: Qualitative and quantitative composition variability of phenolic compounds in blue honeysuckle (Lonicera caerulea L.) fruits grown in Lithuania.
The aim of the research: to determine qualitative and quantitative composition of phenolic compounds in fruits of blue honeysuckle (Lonicera caerulea L.), which grow in Lithuania and to evaluate their extracts antioxidant activity in vitro.
The objectives of the research: to select the extraction conditions of anthocyanins from samples of the blue honeysuckle fruits. Using UV spectrophotometry and HPLC methods to determine the variation of qualitative and quantitative composition of anthocyanins in samples of different cultivars. To determine the qualitative and quantitative variability of phenolic compounds of blue honeysuckle fruits using the HPLC method. To investigate antioxidant activity in vitro of blue honeysuckle fruit extracts. To evaluate the correlation between the amount of identified phenolic compounds and antioxidant activity in vitro.
The object and methods of the research: the samples of fruits of blue honeysuckle (Lonicera caerulea L.) 'Nimfa', 'Wojtek', 'Indigo Gem', 'Amphora', 'Leningradskij Velikan', 'Iga', 'Tundra', 'Tola' cultivars. Total content of proanthocyanidins and anthocyanins as well as antioxidant activity was assessed by using UV spectrophotometric methods. The amounts of individual anthocyanins and phenolic compounds were determined by the HPLC method.
Results and conclusions of the study: by extracting the samples of bluehoneysuckle fruit for 40 minutes with 80% (v/v) ethanol using a 904 W ultrasound power, the highest amount of total anthocyanin content was determined. The following compounds and their amounts were determined using ESC method: cyanidin–3-O-glucoside, cyanidin-3,5-O-diglucoside, cyanidin-3-O-rutinoside, peonidine-3-O-glucoside, cyanidine, cyanidin-3-O-galactoside, peonidine, procyanidin B1, rutin, isoquercitrin, quercitrin, chlorogenic acid, coffee acid, p-coumaric acid and ferulic acid. The strongest antioxidant capacity was determined in extracts of cultivars 'Amphora’, 'Nimfa', 'Tundra' and 'Indigo Gem' using ABTS method, extracts of cultivars 'Amphora' using FRAP method and extracts of cultivars 'Tundra' using CuPRAC method. A correlation analysis showed that the strongest correlation was between the content of anthocyanin cyanidin-3-O-galactoside and antioxidant activity.
SANTRUMPOS
ABTS – 2,2-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgštis); ANOVA (angl. analysis of variance) – dispersinė analizė;
CGE – cianidin-3-O-gliukozido ekvivalentas (anglų k. cyanidin-3-O-glucoside equivalent); CuPRAC – vario (II) jonų redukcijos antioksidacinė galia (anglų k. Cupric ion reducing
antioxidant capacity);
EE – (-)-epikatechino ekvivalentas (anglų k. epicatechin equivalent); ESC – efektyvioji skysčių chromatografija;
FRAP – geležies (III) jonų redukcijos antioksidacinė galia (anglų k. Ferric reducing antioxidant
power);
IL – interleukinas;
ROS – reaktyviosios deguonies formos (anglų k. reactive oxygen species) TE – trolokso ekvivalentas (anglų k. trolox equivalent);
TNF-α – navikų nekrozės faktorius α (anglų k. tumor necrosis factor-α) TPTZ – 2,4,6-tripiridil-s-triazinas;
UESC – ultra–efektyvioji skysčių chromatografija; UV – ultravioletiniai spinduliai;
ĮVADAS
Vaisiai ir daržovės yra svarbūs sveikos mitybos komponentai. Remiantis Pasaulio sveikatos organizacijos duomenimis, 2017 metais nepakankamas vaisių ir daržovių vartojimas buvo susijęs su 3,9 milijonais žmonių mirčių visame pasaulyje. Vaisiai yra puikūs natūralių antioksidantų šaltiniai. Vartojant vaisius ir iš jų pagamintus produktus, sumažėja pagrindinių lėtinių ligų, tokių kaip antrojo tipo cukrinis diabetas, vėžys, nutukimas, širdies ir kraujagyslių sutrikimai, rizika [65]. Augalų vaisiai yra gausus fenolinių junginių, tokių kaip fenolinės rūgštys, proantocianidinai, antocianinai ir kiti flavonoidai, šaltinis. Nustatyta, kad šie biologiškai aktyvūs junginiai, pasižymi plačiu biologiniu poveikiu – kardioprotekciniu, priešvėžiniu, priešmikrobiniu, uždegimą slopinančiu ir kitais [1].
Melsvauogis sausmedis (Lonicera caerulea L.) – sausmedinių (Caprifoliaceae Juss.) šeimos augalas, paplitęs Europos, Šiaurės Azijos ir Šiaurės Amerikos miškuose, labiausiai kalnuotuose drėgnuose regionuose [1, 62]. Jis plačiai auginamas Europoje, ypač Lenkijoje, Slovėnijoje, Čekijoje ir Slovakijoje [37]. Vyraujantys fenoliniai junginiai melsvauogių sausmedžių vaisiuose yra antocianinai, o pagrindinis šios grupės junginys, kurio kaupiama daugiausiai yra cianidin-3-O-gliukozidas [8, 13, 17]. Įrodyta, kad vaisiuose nustatomas antocianinų kiekis priklauso nuo veislės, todėl skirtingų veislių melsvauogių sausmedžių vaisių cheminės sudėties įvairavimo tyrimai yra svarbūs ir aktualūs [8].
Lietuvoje melsvauogiai sausmedžiai nėra labai populiarūs, trūksta duomenų apie mūsų šalyje auginamų sausmedžių veislių vaisių cheminės sudėties įvairavimą. Tai paskatino atlikti Lietuvos klimato sąlygomis augančių melsvauogių sausmedžių (Lonicera caerulea L.) vaisių fenolinių junginių kokybinės ir kiekinės sudėties bei jų ištraukų antioksidacinio aktyvumo in vitro įvairavimo tyrimus. Tyrimo rezultatai gali būti aktualūs, įvertinant melsvauogių sausmedžių vaisių potencialią naudą žmogaus sveikatai, padės nustatyti perspektyviausias veisles, kurių vaisiuose sukaupiamas didžiausias fenolinių junginių kiekis, bei galės būti pritaikomi funkcinio maisto, maisto produktų ar papildų, pasižyminčių dideliu natūralių antioksidantų kiekiu, kūrimui ir gamybai.
Mokslinio darbo tikslas – ištirti Lietuvoje auginamų melsvauogių sausmedžių (Lonicera
caerulea L.) vaisių, kaupiančių fenolinius junginius kokybinės ir kiekinės sudėties įvairavimą ir
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas – ištirti Lietuvoje auginamų melsvauogių sausmedžių vaisių ėminių fenolinių junginių kokybinės ir kiekinės sudėties įvairavimą bei įvertinti jų ištraukų antioksidacinį aktyvumą in vitro.
Darbo uždaviniai:
1. Nustatyti Lietuvoje auginamų melsvauogių sausmedžių vaisių ėminių antocianinų ekstrakcijos sąlygas.
2. Pritaikius UV–regimosios šviesos spektrofotometrijos ir ESC metodus, nustatyti Lietuvoje auginamų skirtingų veislių melsvauogių sausmedžių vaisių ėminių antocianinų kokybinės ir kiekinės sudėties įvairavimą.
3. Taikant efektyviosios skysčių chromatografijos metodą, ištirti Lietuvoje auginamų melsvauogių sausmedžių vaisių ėminių fenolinių junginių kokybines ir kiekinės sudėties įvairavimą.
4. Pritaikius UV–regimosios šviesos spektrofotometrijos metodą, atlikti Lietuvos klimato sąlygomis auginamų melsvauogių sausmedžių vaisių ėminių ištraukų antiradikalinio ir redukcinio aktyvumo tyrimus modelinėse sistemose in vitro.
5. Įvertinti koreliacijas tarp melsvauogių sausmedžių vaisių ėminių fenolinių junginių kiekinės sudėties ir jų ištraukų antioksidacinio aktyvumo in vitro.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Melsvauogių sausmedžių (Lonicera caerulea L.) botaninė sistematika,
morfologiniai požymiai ir paplitimas
Karalystė: Augalai – Plantae;
Pokaralystė: Induočiai – Tracheobionta;
Super skyrius: Sėkliniai augalai – Spermatophyta;
Skyrius: Magnolijūnai (Gaubtasėkliai) – Mangnoliophyta;
Klasė: Magnolijainiai (Dviskilčiai) – Magnoliopsida (Dicotyledons); Poklasis: Astražiedžiai – Asteridae Takht.;
Eilė: Karšuliečiai – Dipsacales Juss;
Šeima: Sausmediniai – Caprifoliaceae Juss.; Gentis: Sausmedis – Lonicera L. [1]
Melsvauogis sausmedis (Lonicera caerulea L.) – sausmedinių (Caprifoliaceae Juss.) šeimos augalas. Pagal dabartinę klasifikaciją, melsvauogis sausmedis priklauso sausmedžio (Lonicera L.) genčiai, kurioje nustatyta 180 skirtingų rūšių krūmų bei vijoklių [1].
Melsvauogis sausmedis yra krūmas, užaugantis iki 2 metrų aukščio. Jauni augalo ūgliai rausvai rudi, dažniausiai pliki arba kartais apaugę retais, trumpais plaukeliais. Lapai ovalūs, kiaušiniški arba atvirkščiai kiaušiniški, 3–6 cm ilgio, 2–3,5 cm pločio, pliki arba tik išilgai centrinės gyslos plaukuoti. Žiedai – išsidėstę po du lapų pažastyse, gelsvai balti. Vainikėlis beveik taisyklingas, plaukuotas. Mezginės ir vaisiai ištisai tarpusavyje suaugę [2]. Vaisiai – mėlynos, tamsiai violetinės spalvos, pailgos, cilindrinės arba elipsės formos uogos, kurių maksimalus ilgis – 3 cm, o plotis – 1 cm. Augalo gyvavimo laikotarpis yra 25 – 30 metų [3]. Melsvauogis sausmedis žydi balandžio pabaigoje – gegužės mėnesį nuo 20 iki 25 dienų, o vaisiai prinoksta birželio mėnesio pabaigoje – liepos pradžioje [2].
Melsvauogis sausmedis paplitęs Europos, Šiaurės Azijos ir Šiaurės Amerikos miškuose, labiausiai kalnuotuose, drėgnuose regionuose [62]. Paskutiniu metu, šis augalas plačiai auginamas Europoje – Lenkijoje, Slovėnijoje, Čekijoje ir Slovakijoje [37]. Japonijoje ir Rusijoje paplitusios veislės skirtingai reaguoja į klimato sąlygas. Rusijoje augantys sausmedžiai yra labai šaltų regionų vietiniai augalai, kuriems augant šiltesnėms klimato sąlygomis (virš 6 zonos), gali pasireikšti
miltligė, augalas linkęs nudžiūti. Regionuose, kuriuose yra šiltesnis klimatas, geriau kultivuoti japoniškas veisles, kurios nėra tokios jautrios aukštesnei aplinkos temperatūrai [63].
Populiariausios ir lengviausiai auginamos melsvauogių sausmedžių veislės yra 'Tundra',
'Borealis', 'Indigo Gem', 'Blue lightning' ir 'Kamchatika'. Melsvauogių sausmedžių veislė 'Tundra'
yra atspari miltligei, dažnai naudojama komercinėje gamyboje bei pasižymi tvirtais sunokinamais vaisiais. 'Borealis' veislės vaisiai yra didesni, lyginant juos su kitomis veislėmis bei pasižymi geriausiomis vaisių skonio savybėmis. 'Indigo Gem' veislės augalai yra šiek tiek jautrūs miltligei, sunokinami vaisiai yra mažesni, lyginant su kitomis kultivuojamomis veislėmis, tačiau yra gana sunkūs. 'Blue lightning' yra Rusijoje paplitusi veislė, kuri sunokina sunkius, tamsiai mėlynos spalvos saldžius vaisius. 'Kamchatka' yra dar viena Rusijoje paplitusi veislė, kuri pasižymi dideliais, tamsiai mėlynos spalvos vaisiais [63].
1.2. Melsvauogių sausmedžių vaisių cheminė sudėtis
Fenoliniai junginiai yra biologiškai aktyvių junginių grupė, kuriai būdingos struktūros, turinčios bent vieną fenolinį pakaitą. Pagal cheminę struktūrą, fenolinius junginius galima suskirstyti į skirtingas grupes: fenolines rūgštis, flavonoidus, taninus, kumarinus, chinonus, lignanus, stilbenus, kurkuminoidus ir kitus [35]. Šie junginiai plačiai paplitę augalų audiniuose bei suteikia vaisiui spalvą, skonį ir sutraukiantį pojūtį [28]. Iš visų melsvauogių sausmedžių vaisiuose aptinkamų fenolinių junginių, daugiausiai yra antocianinų, kurie priklauso flavonoidų grupei (nuo 36 iki 51 proc.) [37].
Fenolinės rūgštys. Fenolines rūgštis, pagal jų struktūrą galima suskirstyti į hidroksibenzoinės rūgšties darinius, kurie turi C6-C1 strukūrą ir hidroksicinamono rūgšties
darinius, turinčius C6-C3 struktūrą. Ši klasifikacija sudaryta atsižvelgiant į anglies atomų kiekį
šoninėje grandinėlėje [32]. Hidroksicinamono rūgšties junginiai dažniausiai yra paprasti esteriai su hidroksikarboksirūgštimis arba gliukoze, o hidroksibenzoinės rūgšties junginiai dažniausiai yra gliukozidų pavidalu [49]. Viena iš dažniausiai aptinkamų fenolinių rūgščių augaluose yra chlorogeno rūgštis, kuri susidaro kavos ir chino rūgščių esterifikacijos proceso metu [6]. Nustatyta, kad 61,1 proc. sausmedžių vaisiuose aptinkamų fenolinių rūgščių, sudaro hidroksicinamono rūgštys (dažniausiai chlorogeno rūgštis) ir jų dariniai (p-kumaro ir m-kumaro rūgštis) [46]. Deineka ir kt. nustatė, kad chlorogeno (0,42 proc.), kavos (0,14 proc.) ir ferulo rūgštys (0,10 proc.) yra vyraujančios Lonicera kamtschatica melsvauogių sausmedžių vaisių ėminių fenolinių junginių
frakcijoje, o protokatecho, gentizo, rozmarino ir vanilino rūgščių kiekis sudaro tik 0,08 proc. viso nustatyto rūgščių kiekio [5]. Oszmianski ir kt., ištyrę 4 skirtingų veislių melsvauogių sausmedžių vaisių ėminius nustatė, kad bendras fenolinių rūgščių kiekis šiuose ėminiuose buvo 79,74 mg/100 g šviežios masės. Pagrindinės fenolinės rūgštys, kurios buvo identifikuotos tyrimo metu – chlorogeno ir neochlorogeno (atitinkamai 66,44 mg/100g ir 9,65 mg/100 g šviežios masės). Kitų tyrimo metu nustatytų fenolinių rūgščių kiekis buvo mažesnis nei 2 mg/100 g šviežios masės [9].
Antocianinai. Antocianinai yra pagrindinė fenolinių junginių grupė, kaupiama melsvauogių sausmedžių vaisiuose [13]. Antocianinų kiekis, kuris gali įvairuoti nuo 400–1500 mg/100g, reikšmingai priklauso nuo augalo veislės ir kultivavimo sąlygų. Chaovanakilit ir kt., ištyrę melsvauogių sausmedžių vaisių antocianinus, nustatė, kad tirtuose ėminiuose vyravo cianidin-3-O-gliukozidas (79–88 proc. suminio kiekiškai įvertintų antocianinų kiekio). Mažesniais kiekiais nustatyta cianidin-3-O-rutinozido (1–11 proc.), cianidin-3,5-digliukozido (2,2–6,4 proc.), peonidin-3-O-gliukozido (2,8–4,5 proc.), peonidin-3-O-rutinozido (0,3–3 proc.) ir pelargonidin-3-O-gliukozido (0,2–1,0 proc.). Meslvauogių sausmedžių vaisių ėminiuose identifikuoti ir kiti antocianinai: delfinidin-3-O-gliukozidas, delfinidin-3-O-rutinozidas, pelargonidin-3-O-gliukozidas, pelargonidin-3,5-O-dipelargonidin-3-O-gliukozidas, palargonidin-3-rutinozidas, peonidin-3-O-rutinozidas [13]. Vaisiuose nustatomas antocianinų kiekis priklauso nuo derliaus nuėmimo laiko ir veislės [8]. Įrodyta, kad esant žemesnei aplinkos temperatūrai, melsvauogių sausmedžių vaisiuose sukaupiamas didesnis antocianinų kiekis [37]. Svarbus veiksnys, lemiantis antocianinų kiekį, yra sausmedžių vaisių sunokimo laipsnis. Atlikus tyrimus pastebėta, kad pernokusiose uogose nustatytas didesnis antocianinų kiekis nei nesunokusiose [38].
1.3. Augalinių žaliavų fenolinių junginių ekstrakcijos metodai
Atliekant augalinės žaliavos ekstrakciją įprastais ekstakcijos metodais, tokiais kaip maceracija, perkoliacija ir ekstrakcija Soksleto aparatu, dažniausiai sunaudojami dideli organinių tirpiklių kiekiai bei ekstrakcijos procesas užtrunka ilgai. Šiuo metu, augalinės žaliavos ekstrakciją galima atlikti šiuolaikiškesniais ir ekologiškesniais metodais, tokiais kaip superkritinių skysčių ekstrakcija, suslėgtų skysčių ekstrakcija bei ekstrakcija panaudojant mikrobangas [15].
Maceracija. Vykdant ekstrakciją šiuo metodu, žaliava tam tikrą laiką laikoma pasirinktame tirpiklyje sandariame inde, nuolat maišant ekstrakcijos mišinį [14]. Dėl ilgo
ekstrahavimo laiko ir gana mažo ekstrakcijos efektyvumo, šis metodas nėra dažnai pasirenkamas, tačiau jis gali būti panaudojamas termolabiliems junginiams išgauti [15].
Ekstrakcija ultragarsu (sonifikacija). Tai ekstrakcijos metodas, kurio metu panaudojamas ultragarsas. Sonifikacijos proceso metu sukuriama kavitacija, kuri pagerina ląstelių sienelių pralaidumą, todėl pagreitėja difuzija pro ląstelės membraną, o tai padidina ekstrakcijos efektyvumą. Metodo metu yra sunaudojamas mažas tirpiklio kiekis bei sutrumpinama ekstrakcijos trukmė [25]. Svarbus šio ekstrakcijos metodo trūkumas – didesnis nei 20 kHz ultragarso dažnis, gali paveikti vaistinėje žaliavoje esančius aktyvius junginius ir padidinti laisvųjų radikalų susidarymo tikymybę [26, 14]. Antocianinai yra vakuoliniai pigmentai, kurie kaupiasi augalo ląstelių centrinėje vakuolėje, todėl ultragarso bangų sukeliama kavitacija ir pagerėjęs ląstelių sienelių pralaidumas, suaktyvina šių medžiagų difuziją iš ląstelių į ekstrakcijos tirpiklį, o tai padidina išgaunamų junginių antocianinų kiekio išeigą [26].
Mikrobangų ekstrakcija. Šio ekstrakcijos metodo metu, mikrobangos sukuria šilumą, sąveikaudamos su poliniais junginiais, tokiais kaip vanduo ir tam tikrais organiniai komponentais, esančiais augalinėje žaliavoje. Proceso metu sudaromas slėgis augalo ląstelėse ir taip pagreitinama medžiagų pernaša iš ląstelių į tirpiklį. Mikrobangų ekstakcijos metodas pasižymi greitu šildymu, nes įranga, kurią naudoja šiai ekstrakcijai atlikti nėra didelė, o tai sutrumpina ekstrakcijos trukmę bei reikalingo tirpiklio kiekį. Šis ekstrakcijos metodas laikomas ekologiška technologija, jį taikant sumažinamas organinių tirpiklių sunaudojimas [26, 15].
1.4. Antocianinų biologinis poveikis
Antocianinų biologinis poveikis yra susijęs su šių biologiškai aktyvių junginių oksidacinėmis – redukcinėmis savybėmis [54]. Tyrimais įrodyta, kad antocianinai pasižymi priešvėžiniu poveikiu, veiksmingai slopindami naviko augimą sustabdydami ląstelių augimą tarp S ir G2 ląstelių ciklo fazių [7, 20]. Antocianinai pasižymi širdį apsaugančiu poveikiu [21, 22]. Šie junginiai, dėl stipraus antioksidacinio aktyvumo ir kitų biocheminių mechanizmų, pasižymi teigiamomis savybėmis gydant retinopatiją ir amžinę geltonosios dėmės degeneraciją, sumažindami regėjimo praradimo riziką ir tinklainės degeneraciją [23, 56]. Nutukimas ir gausus riebaus bei aukštą glikeminį indeksą turinčio maisto vartojimas yra galimos santykinio insulino nepakankamumo priežastys vėlyvoje antrojo tipo cukrinio diabeto stadijoje. Antocianinai pasižymi nutukimo kontroliavimu, o tai mažina riziką susirgti antrojo tipo cukriniu diabetu [59]. Įrodyta,
kad antocianinai sumažina riebalų kaupimąsi organizme ir gliukozės koncentraciją kraujo prazmoje, kurią sukėlia vartojamas riebus maistas. Šis antocianinų poveikis siejamas su molekulių gebėjimu sąveikauti su vienu iš svarbiausių adipocitokinu adiponektinu, kuris žmogaus adipocituose didiną jautrumą insulinui bei slopina lipidų sintezę kepenyse ir baltajame riebaliniame audinyje [57]. Antocianinai teigiamai veikia mikrocirkuliaciją, sumažina kapiliarų pralaidumą ir trapumą [58]. Biologiškai aktyvūs junginiai antocianinai, pasižymi uždegimo slopinamuoju aktyvumu. Šiuos pastebėjimus patvirtino in vivo atliktas tyrimas su žiurkėmis, sergančiomis karagenino sukeltu plaučių uždegimu, kurios gydytos mėlynių vaisių antocianinais. Tyrimo metu, nustatytas reikšmingas visų įvertintų uždegimo rodiklių sumažėjimas, kuris buvo priklausomas nuo skirtos dozės [11].
1.5. Melsvauogių sausmedžių vaisių preparatų panaudojimas medicinos
praktikoje
Melsvauogių sausmedžių gydomosios savybės pastebėtos ir naudotos tradicinėje liaudies medicinoje Tolimuosiuose rytuose bei Sibire. Prinokųsių vaisių sultys naudotos vandenligės, opų, plokščiosios kerpligės gydymui [8, 9]. Vaisiai ir įvairūs jų preparatai, tradiciškai naudoti lėtinio uždegimo, skrandžio, kepenų ir tulžies pūslės sutrikimų gydymui [10, 36]. Tibeto medicinoje sausmedžių žievės nuoviras naudojamas kaip vaistas nuo galvos skausmo ir artrito [12]. Vaisių sultys naudotos skrandžio ir tonzilito gydymui, o lapų bei žiedų nuoviras, pasižymintis antiseptinėmis savybėmis, gerklės ir burnos bakterinių bei virusinių uždegimų, dantenų ligų, įvairių katarų, peršalimų, gripo gydymui [4, 17, 18]. Sausmedžių vaisiai naudoti gydant virškinimo trakto sutrikimus, akių ligas bei kitus su oksidaciniu stresu susijusius sindromus, o lapų ištraukos naudotos kaip diuretikai ir vaistai nuo dizenterijos [19].
Uždegimo slopinamasis poveikis. Melsvauogių sausmedžių vaisių ištraukos gali sumažinti uždegiminius tinklainės kraujagyslių pokyčius ir užkirsti kelią žalingiems regėjimo lauko pokyčiams, todėl yra vertingos virusinio retinito, toksinės ambliopijos ir pirminės atvirojo kampo glaukomos papildomam gydymui [29, 30, 31]. Wu ir kt., atlikę in vitro tyrimus, įrodė melsvauogių sausmedžių vaisių ištraukų uždegimo slopinamąjį ir antioksidacinį poveikį. Tyrimo metu, atsižvelgiant į tiriamųjų žiurkių svorį, jos buvo maitinamos 75–300 µg/g melsvauogių sausmedžių ištraukų dozėmis, kurios palengvino tiriamųjų žiurkių artrito simptomus, sumažinant edemas, atsiradusias ant kojų. Pastebėtas sumažėjęs TNF-α (naviko nekrozės faktorius alfa),
uždegimą slopinančių citokinų IL-1β ir IL-6 bei azodo oksido (NO) kiekis tiriamųjų žiurkių kraujo serume [53].
Priešvėžinis poveikis. In vitro tyrimais įrodyta, kad melsvauogių sausmedžių vaisiuose aptinkami biologiškai aktyvūs junginiai, slopina naviko ląstelių proliferaciją, blokuodami ląstelių ciklo etapus, įtakodami reguliuojančius baltymus ir blokuodami mitogenais aktyvuoto proteino kinazės signalo perdavimo kelią [33]. Ultravioletinė ar kitos rūšies spinduliuotė, sukelia ROS pokyčius, o tai paspartina ląstelių DNR pažeidimus ir vėžio atsiradimo riziką. Melsvauogių sausmedžių vaisių fenolinių junginių frakcija, reikšmingai slopino žalingų reaktyvių deguonies formų susidarymą ir lipidų peroksidaciją, pagerino UV spinduliuote paveiktų žmogaus keratinocitų HaCaT tarpląstelinio glutationo lygį [68].
Antimikrobinis aktyvumas. Atlikti tyrimai įrodė melsvauogių sausmedžių vaisių ištraukų antimikrobinį aktyvumą. Palíková ir kt. nustatė, kad melsvauogių sausmedžių liofilizuotų vaisių ištraukos, turtingos fenolinių junginių, sumažina žmogaus patogeninių mikrobų padermių
Candida parapsilosis, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecalis ir Streptococcus mutans, biologinį formavimąsi ir sukibimą su paviršiumi [27]. Sausmedžių vaisių ištraukų
poveikiui jautriausios padermės yra Corynebacrerium diphteriae, sukelianti difteriją, ir Moraxella
catarrhalis, sukelianti lėtines kvėpavimo ir centrinės nervų sistemos infekcijas [36]. Melsvauogių
sausmedžių vaisiai, pasižymi detoksikuojančiomis savybėmis, todėl jie gali būti naudojami po apsinuodijimo sunkiaisiais metalais ar vaistais bei bendrai žarnyno mikroflorai pagerinti [9].
Neuroprotekcinis poveikis. Atliktame dvigubai aklame klinikiniame tyrime nustatytas teigiamas melsvauogių sausmedžių vaisių ištraukų poveikis žmogaus fiziologinėms ir pažintinėms funkcijoms iš karto po jų suvartojimo. Šis poveikis susijęs ištirtomis antocianinų kraujagysles plečiančiomis ir gliukogeninį reguliavimą sukeliančiomis savybėmis [44, 45]. Šie fiziologiniai pokyčiai siejami su pagerėjusia kognityvine funkcija, dėl geresnės smegenų kraujotakos ir padidėjusio gliukozės pasisavinimo smegenyse. Tyrimo metu, tiriamiesiams vartojant 400 mg sausmedžių vaisių ištraukos dozę, pastebėta pagerėjusi epizodinė atmintis, tačiau 100 mg sausmedžių vaisių ištraukos dozės nepakako epizodinei atminčiai paveikti. Atliktame tyrime, nustatytas ribotas ištraukų poveikis darbinei atminčiai. Remiantis tyrimo rezultatais, sausmedžių vaisiai yra potencialiai vertinga priemonė, gerinanti su amžiumi susijusį atminties susilpnėjimą, medžiagų apykaitą ir kraujagyslių būklę [43].
1.6. Melsvauogių sausmedžių vaisių panaudojimas maisto pramonėje
Melsvauogių sausmedžių vaisiai dažniausiai yra vartojami švieži, tačiau juos galima panaudoti ir maisto pramonėje. Sausmedžių vaisiai naudojami uogienių, žele, sulčių, vynų, saldainių, ledų, jogurtų ir arbatų gamyboje. Iš melsvauogių sausmedžių vaisių spaudžiant sultis, ne tik išgaunama daugiau kaip 90 proc. sulčių, bet ir pagamintų sulčių spalva išlieka stabili ilgą laiką. Melsvauogių sausmedžių vaisiai yra naudojami kaip maisto priedai, kurie sustiprina kitų produktų spalvas [40]. Antocianinai yra natūralūs raudonos, mėlynos ir violetinės spalvos pigmentai, turintys patrauklų atspalvį. Šie pigmentai yra natūralūs dažikliai, pasižymintys mažu toksiškumu [60]. 2018 m. gruodį, melsvauogių sausmedžių vaisiai įregistruoti kaip tradicinis maistas iš trečiosios šalies pagal Europos Sąjungos reglamentus [41]. Sausmedžių vaisius įtraukti į kasdienį maisto racioną galima panaudojant kapsuliavimo metodus. Kapsulinė farmacinė forma, užtikrintų kontroliuojamą medžiagų išsiskyrimą ir ekstrakto stabilumą [30].
Senica ir kt. atliktame tyrime, palygintos melsvauogių sausmedžių vaisių skirtingų maisto produktų formos: užtepas, užpilas, kokteilis, trauktinė ir sultys. Iš vaisių pagamintas užtepas pasižymėjo didžiausiu askorbo rūgšties ir fenolinių junginių kiekiu (atitinkamai 302,02 mg/100 g ir 1753,54 mg/100 g sauso svorio). Trauktinės ir kokteilio produktų formose nustatyti vidutiniai šių junginių kiekiai, tačiau užpiluose (vaisių arbatoje) ir sultyse, askorbo rūgšties kiekis (atitinkamai 119,17 ir 118,17 mg /100 g) ir fenolinių junginių kiekis (atitinkamai 1138,75 ir 1108,25 mg /100 g) buvo mažiausias. Visi šie produktai turėjo mažai cukraus, todėl jie gali būti vartojami sergančiųjų cukriniu diabetu [42].
1.7. Literatūros apžvalgos apibendrinimas
Mokslinėse publikacijose aprašyta Lonicera caerulea L. cheminės sudėties tyrimų. Melsvauogių sausmedžių vaisių ištraukos pasižymi stipriu antioksidaciniu aktyvumu, yra turtingos fenolinių junginių, ypač antocianinų. Melsvauogių sausmedžių vaisiuose, tarp antocianinų grupės junginių, vyrauja cianidin-3-O-gliukozidas. Šių augalų vaisiuose gausu fenolinių rūgščių, tarp kurių dominuoja chlorogeno rūgštis. Išanalizavus įvairias mokslines publikacijas, nustatytas įvairiapusis melsvauogių sausmedžių vaisių antocianinų biologinis poveikis: uždegimo slopinamasis, priešvėžinis, priešmikrobinis, neuroprotekcinis. Lietuvos klimato sąlygomis auginamų skirtingų veislių melsvauogių sausmedžių vaisių cheminės sudėties tyrimų trūkumas
paskatino ištirti skirtingų veislių melsvauogių sausmedžių vaisių kokybinės ir kiekinės sudėties įvairavimą ir įvertinti jų ištraukų antioksidacinį aktyvumą in vitro.
2. TYRIMO METODIKA
2.1. Tyrimo objektas
Tyrimams naudoti melsvauogių sausmedžių skirtingų veislių vaisių ėminiai surinkti 2018 metų birželio mėnesį, vaisių derėjimo metu. Ištirti 8 skirtingų veislių ('Tundra', 'Wojtek', 'Tola', 'Amphora', 'Leningradskij Velikan', 'Nimfa', 'Indigo Gem', 'Iga') vaisių ėminiai. Melsvauogių sausmedžių vaisių ėminiai gauti iš Lietuvos agrarinių ir miškų mokslų centro filialo Lietuvos sodininkystės ir daržininkystės instituto eksperimentinio sodo.
2.2. Naudoti reagentai
Tyrimų metu naudoti analitinio švarumo reagentai, tirpikliai ir standartai. Tyrimo metu naudota: etanolis 96 proc. (v/v) ( AB „Vilniaus degtinė“, Vilnius, Lietuva), ABTS (2,2-azino-bis(3-etilbenzotiazolino-6-sulfono rūgštis), acto rūgštis, 4-dimetilaminocinamaldehidas, troloksas (6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilchroman-2-karboksilinė rūgštis) („Sigma-Aldrich“, Šteinheimas, Vokietija), vario (II) chloridas, kalio persulfatas, neokuproinas, natrio acetatas („Scharlau“, Sentmenatas, Ispanija), amonio acetatas, geležies (III) chlorido heksahidratas („Vaseline-Fabrik Rhenania“, Bona, Vokietija), TPTZ (2,3,5-trifenil-1,3,4-triaz-2-azoniaciklopenta-1,4-dieno chloridas) („Carl Roth“, Karlsrūjė, Vokietija), vandenilio chlorido rūgštis, cianidin-3-O-gliukozidas, ciandin-3-5-dicianidin-3-O-gliukozidas, ciandin-3-O-rutinozidas, peonidin-3-O-cianidin-3-O-gliukozidas, cianidino chloridas, cianidin-3-O-galaktozidas, peonidino chloridas, chlorogeno rūgštis, kavos rūgštis, p-kumaro rūgštis, ferulo rūgštis („Sigma-aldrich“, Šteinheimas, Vokietija), procianidinas B1, rutinas, kvercitrinas, izokvercitrinas („Sigma-aldrich“, Šteinheimas, Vokietija).
2.3. Naudota aparatūra
Melsvauogių sausmedžių vaisiai buvo liofilizuojami „Zirbus“ („Zirbus technology GmbH“, Bad Grundas, Vokietija) liofilizatoriuje. Vaisiai susmulkinti elektriniu malūnu „Retsch GM 200“ („Retsch GmbH“, Hanas, Vokietija). Svėrimai atlikti elektrinėmis analitinėmis svarstyklėmis „Sartorius CP64–0CE“ („Sartorius AG“, Getingenas, Vokietija). Žaliava džiovinta
džiovinimo spintoje („Swiss quality“, Planegas, Vokietija). Melsvauogių sausmedžių vaisių ėminių ekstrakcija vykdyta ultragarso vonelėje „Bandelin Sonorex Digital 10 P“ („Bandelin Electronic GmbH & Co. KG” Darmštatas, Vokietija). Vaisių ėminiu filtravimas atliktas naudojant vakuuminį siurblį. UV–regimosios šviesos spektrofotometru „M550“ („Spectronic CamSpec“, Garfortas, Jungtinė Karalystė) atlikti spektrofotometriniai tyrimai. Melsvauogių sausmedžių vaisių ėminių antocianinų kokybinė ir kiekinė analizė atlikta ultra–efektyviuoju skysčių chromotografu „ACQUITY UPLC® H-Class“ („Waters“, Milfordas, Masačusetsas, Jungtinės Amerikos Valstijos) su fotodiodų matricos detektoriumi, naudojant chromatografinę kolonėlę „ACE Excel 1.7 Super C18“ (100´2,1 mm) junginių skirstymui. Fenolinių junginių kokybinė ir kiekinė analizė atlikta „Waters 2695 Alliance“ chromatografine sistema („Waters“, JAV), panaudojant diodų matricos detektorių „Waters 2998“. Tyrimo metu, junginių skirstymui naudota chromatografinė kolonėlė „YMC-Pack ODS-A“ (250×4,6 mm, C18, dalelių dydis 5 µm) su prieškolone „YMC-Triart“
(10×3,0, C18, dalelių dydis 5 µm) („YMC Europe GmbH“, Vokietija). Išgrynintas dejonizuotas
vanduo, ruoštas vandens valymo sistema Milli–Q® („Millipore“, Bedfordas, JAV).
2.4. Melsvauogių sausmedžių vaisių ėminių ištraukų paruošimas
Žaliavos paruošimas. Tyrimams atrinkti sunokę melsvauogių sausmedžių vaisiai supjaustyti į mažesnes dalis ir užšaldyti (-35°C) šaldytuve su oro cirkuliacija, kuriame laikomi 24 valandas. Vaisiai perkeliami į sublimacinę džiovyklę, kurioje yra liofilizuojami. Po liofilizavimo, vaisiai sumalami elektriniu malūnu į iki smulkių miltelių ir perkeliami į sandarius indus.
Nuodžiūvio nustatymas. Melsvauogių sausmedžių vaisių nuodžiuvio nustatymas atliktas taikant Europos farmakopėjoje (Ph.Eur.01/2008:20232) nurodytą metodą [66]. Tikslus kiekis (1 g) susmulkintų melsvauogių sausmedžių vaisių, džiovinta džiovinimo spintoje 105°C temperatūroje, iki pastovios masės. Absoliučiai sausai liofilizuotai žaliavai perskaičiuoti tyrimų duomenys. Nuodžiūvio kiekis (proc.) skaičiuojamas naudojantis pateikta formule:
𝑋 =(𝑚 − 𝑚&)
𝑚 ×100
m – prieš džiovinimą atsverta tiksli žaliavos masė (g); m1 – po džiovinimo atsverta tiksli žaliavos masė (g);
Melsvauogių sausmedžių vaisių ištraukų paruošimas. Pasveriama 1 g (tikslus sverinys) liofilizuotų melsvauogių sausmedžių vaisių miltelių. Į tamsaus stiklo buteliuką, perpilami milteliai ir užpilami 10 ml 80 proc. (v/v) etanoliu, parūgštintu 2 proc. vandenilio chlorido rūgštimi. Buteliukai uždaromi ir 40 minučių esant 80 Hz dažniui ir 904 W galiai, ektrahuojami ultragarso vonelėje. Pasibaigus ekstrakcijai, etanolinės ištraukos filtruojamos, naudojant vakuuminį siurblį ir skiedžiamos iki žymės 10 ml matavimo kolbutėje. Nufiltruota etanolinė ištrauka supilama į tamsaus stiklo buteliukus ir laikoma 4 °C temperatūroje šaldytuve. Prieš atliekant chromatografinę analizę, ištraukos papildomai filtruojamos per 0,22 µm porų dydžio membraninius filtrus.
2.5. Tyrimo metodai
2.5.1. Bendro antocianinų kiekio nustatymas pH–diferenciniu metodu
Antocianinų kiekis melsvauogių sausmedžių vaisiuose buvo tiriamas taikant pH– diferencinį metodą, kuris pagrįstas antocianinų spalvų pokyčiais, esant skirtingam pH rodikliui (pH 1,0 ir pH 4,5) [14].
0,025 M kalio chlorido (pH 1,0) buferinis tirpalo paruošimas. Pasveriama 1, 86 g kalio chlorido ir ištirpinama 980 ml išgryninto vandens 1000 ml talpos matavimo kolboje. Matuojamas buferinio tirpalo pH rodiklis ir koreguojama koncentracija vandenilio chlorido rūgštimi iki pH 1,0. Pasiekus pH 1,0 reikšmę, tirpalas praskiedžiamas išgrynintu vandeniu iki žymės 1000 ml matavimo kolboje. Praskiedus, buferinio tirpalo pH rodiklis patikrinamas pakartotinai.
0,4 M natrio acetato (pH 4,5) buferinio tirpalo paruošimas. Atsveriama 54,43 g natrio acetato trihidrato ir ištirpinama 960 ml išgryninto vandens 1000 ml talpos matavimo kolboje. Matuojamas buferinio tirpalo pH rodiklis ir koreguojama koncentruota vandenilio chlorido rūgštimi iki pH 4,5. Pasiekus pH 4,5 reikšmę, tirpalas praskiedžiamas išgrynintu vandeniu iki žymės 1000 ml matavimo kolboje. Paskiedus, buferinio tirpalo pH rodiklis patikrinamas pakartotinai.
0,125 ml melsvauogių sausmedžių vaisių ištraukos perkeliama į 10 ml kolbutę ir buferiniu tirpalu praskiedžiama iki žymės. Praskiedimo faktorius 200. Kiekvienam bandiniui, atliekamas praskiedimas su 0,025 M kalio chlorido (pH 1,0) buferiniu tirpalu ir su 0,4 M natrio acetato (pH 4,5) buferiniu tirpalu. Tirpalai laikomi tamsoje 15 min. Spektrofotometru, esant 520 nm ir 700 nm
bangų ilgiui, matuojamas tirpalų šviesos absorbcijos dydis. Tyrimo metu kaip palyginamasis tirpalas naudojamas išgrynintas vanduo.
Tiriamųjų ištraukų absorbcijos dydis (A) apskaičiuojamas pagal formulę:
pH4,5 700 520 pH1,0 700 520
-
A
)
-
(A
-
A
)
(A
A
=
Bendras antocianinų kiekis ištraukoje išreiškiamas cianidin-3-O-gliukozido ekvivalentu: (mg/l) , 1 ε 1000 DF MW A X1 ´ ´ ´ ´ =
X1 – bendras antocianinų kiekis, mg/l;
MW – cianidin-3-O-gliukozido molekulinė masė (449,2 g/mol); A – šviesos absorbcijos dydis praskiesto bandinio;
DF – praskiedimo faktorius;
ε – cianidin-3-O-gliukozido molinis absorbcijos koeficientas (26900); 1 – kiuvetės storis, cm.
Procentinė bendro antocianinų kiekio išraiška: (proc.) , 1000 m 0,001 100 V X X2 1 ´ ´ ´ ´ =
X1 – bendras antocianinų kiekis ekstrakte, mg/l;
X2 – antocianinų bendras kiekis žaliavoje, proc.;
V – ekstrahento tūris paimtas ekstrakcijai; m – ekstrakcijai atsvertas tikslus žaliavos kiekis;
2.5.2. Bendro proantocianidinų kiekio nustatymas
Bendras proantocianidinų kiekis, nustatytas naudojant 4-dimetilaminocinamaldehido
reagentą (DMCA).
Bandinio paruošimas. 10 µl melsvauogių sausmedžių ekstrakto, sumaišoma su 3 ml 0,1proc. DMCA reagento, kuris buvo ištirpintas parūgštintame etanolyje (9 dalys 96 proc. etanolio ir 1 dalis koncentruotos vandenilio rūgšties). Praėjus 5 min. po bandinio paruošimo, spektrofotometru išmatuojamas, esant 640 nm šviesos bangos ilgiui, tiriamojo tirpalo absorbcijos dydis. Lyginamasis tirpalas – parūgštintas etanolis [55].
(-)-Epikatechino koncentracija apskaičiuojama pagal kalibravimo grafiką iš kalibracijos lygties (y = 1,879x + 0,017, R2 = 0,999).
Bendras proantocianidinų kiekis (mg/g), išreikštas epikatechino ekvivalentu (EE) 1g žaliavos. Šis kiekis apskaičiuojamas pagal formulę:
∁=c × V m C – bendras proantocianidinų kiekis, mg EE/g;
c – epikatechino koncentracija, kuri buvo nustatyta pagal kalibracinę kreivę, mg/ml; V – tiriamos etanolinės ištraukos tūris, ml;
m – tiriamos žaliavos masė (tikslus kiekis), g.
2.5.3. Antioksidacinio aktyvumo in vitro nustatymas, taikant ABTS,
CuPRAC ir FRAP metodikas
Antiradikalinio aktyvumo in vitro nustatymas, taikant ABTS metodiką.
Motininio 2 mmol/l ABTS•+ tirpalo paruošimas. Tiksliai pasveriama 0,0548 g (ABTS (2,2-azino-bis-(3-etilbenzotiazolin-6-sulfono rūgšties) miltelių, kurie ištirpinami 50 ml išgryninto vandens. Tuomet, į gautą tirpalą pridedama 0,0095 g kalio persulfato ir gerai sumaišoma. Pagamintas tirpalas laikomas tamsaus stiklo buteliuke 16 valandų tamsioje vietoje.
Darbinio ABTS•+ tirpalo paruošimas. Motininis tirpalas skiedžiamas išgrynintu
vandeniu, kol pasiekiamas tikslus absorbcijos dydis (0,800±0,03), esant 734 nm bangos ilgiui. Palyginamasis tirpalas – išgrynintas vanduo [16].
Bandinio paruošimas. 3 ml darbinio ABTS tirpalo sumaišoma su 20 µl tiriamos ištraukos. Praėjus 60 minučių, spektrofotometru išmatuojamas bandinių absorbcijos pokytis, esant 734 nm bangos ilgiui. Palyginamasis tirpalas – išgrynintas vanduo. Tirtų melsvauogių sausmedžių vaisių ėminių ištraukų antiradikalinis aktyvumas in vitro, įvertintas pritaikius ABTS metodiką, apskaičiuojamas pagal trolokso kalibravimo grafiką (y = 0,00005x+0,006, R2 = 0,964), kuris sudarytas naudojant 250–8000 µmol/l koncentracijos etaloninius trolokso tirpalus.
Redukcinio aktyvumo in vitro nustatymas, taikant CuPRAC metodiką.
Darbinio CuPRAC tirpalo paruošimas. 1 mmol/l CH3COONH4 buferinį tirpalą
sumaišyti su 10 mmol/l CuCl2 tirpalu ir 7,5 mmol/l neokuproino etanoliniu tirpalu santykiu 1:1:1.
Bandinio paruošimas. Į 10 µl melsvauogių sausmedžių tiriamosios ištraukos pridedama 3 ml darbinio CuPRAC tirpalo. Viskas sumaišoma ir laikoma tamsoje 30 minučių. Po to
spektrofotometru išmatuojamas tirpalo absorbcijos dydis, kai bangos ilgis 450 nm. Palyginamasis tirpalas – CuPRAC darbinis tirpalas be tiriamos etanolinės ištraukos [48]. Melsvauogių sausmedžių vaisių ėminių ištraukų redukcinis aktyvumas in vitro, įvertintas pritaikius CuPRAC metodiką, apskaičiuojamas pagal trolokso kalibravimo grafiką (y = 0,00004x + 0,021, R2 = 0,999), kuris sudarytas naudojant 250–16000 µmol/l koncentracijos etaloninius trolokso tirpalus.
Redukcinio aktyvumo in vitro nustatymas, taikant FRAP metodiką.
Darbinio FRAP tirpalo paruošimas. 300 mmol/l buferinį natrio acetato tirpalą sumaišyti su 10 mmol/l TPTZ tirpalu ir 20 mmol/l FeCl3× 6H2O vandeniniu tirpalu santykiu 10:1:1.
Bandinio paruošimas. Į 10 µl melsvauogių sausmedžių ištraukos pridedama 3 ml paruošto darbinio FRAP tirpalo. Viskas sumaišoma ir laikoma tamsoje 30 minučių. Po to spektrofotometru išmatuojamos tirpalo absorbcijos dydis, esant 593 nm bangos ilgiui.
Palyginamasis tirpalas – FRAP darbinis tirpalas be tiriamos etanolinės ištraukos [47]. Redukcinis aktyvumas in vitro, įvertintas pritaikius FRAP metodiką, apskaičiuojamas pagal
trolokso kalibravimo grafiką (y = 0,000042x + 0,00772, R2 = 0,997), kuris sudarytas naudojant 250–16000 µmol/l koncentracijos etaloninius trolokso tirpalus.
Antioksidacinio aktyvumo in vitro, nustatyto pritaikius ABTS, CuPRAC ir FRAP metodikas, apskaičiavimas.
Melsvauogių sausmedžių vaisių ėminių ištraukų antioksidacinis aktyvumas in vitro apskaičiuotas pagal formulę:
A – tiriamojo tirpalo šviesos absorbcijos dydis; a – nuolydis iš trolokso kalibracinio grafiko lygties; b – nuokrypis iš trolokso kalibracinio grafiko lygties;
Vband.
– melsvauogių sausmedžių ištraukos bandinio tūris (ml);
2.5.4. Antocianinų kokybinė ir kiekinė analizė
Ultra–efektyviosios skyčių chromatografijos (UESC) metodu atliktas kokybinis ir kiekinis antocianinų nustatymas [52]. Nustatymui naudotas ultra–efektyvusis skysčių chromatografas „Waters 2998“ su fotodiodų matricos detektoriumi, naudojant chromatografinę kolonėlę „ACE Excel 1.7 Super C18” (100×2,1 mm) junginių skirstymui.
Eliuavimo sistema buvo sudaryta iš 10 proc. (v/v) skruzdžių rūgšties vandeninio tirpalo (eliuentas A) ir 100 proc. (v/v) acetonitrilo tirpalo (eliuentas B). Judrios fazės tėkmės greitis – 0,5 ml/min, kolonėlės temperatūra 30°C, analizei paimto mėginio tūris – 1 µl.
2.5.5. Fenolinių junginių kokybinė ir kiekinė analizė
Atvirkščių fazių efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodu atliktas kokybinis ir kiekinis fenolinių junginių nustatymas [24]. Nustatymui buvo naudojama „Waters 2695 Alliance“ chromatografinė sistema („Waters“, JAV), panaudojant diodų matricos detektorių „Waters 2998“. Tyrimo metu, junginių skirstymui naudota chromatografinė kolonėlė „YMC-Pack ODS-A“ (250×4,6 mm, C18, dalelių dydis 5 µm) su prieškolone „YMC-Triart“ (10×3,0, C18, dalelių
dydis 5 µm) („YMC Europe GmbH“, Vokietija).
Eliuavimo sistema buvo sudaryta naudojant 2 proc. (v/v) acto rūgšties vandeninį tirpalą (eliuentas A) ir 100 proc. (v/v) acetonitrilo tirpalą (eliuentas B). Judrios fazės tėkmės greitis – 1 ml/min, kolonėlės temperatūra 25 °C, injekcijos tūris – 10 µl. Chromatografinės smailės identifikuotos lyginant etaloninių junginių ir analičių sulaikymų laikus bei UV absorbcijos spektrines charakteristikas. Flavan-3-olių grupei priklausantis procianidinas B1 nustatytas esant 280 nm bangos ilgiui, fenolinės rūgštys – esant 320 nm bangos ilgiui, o kvercetino glikozidai – esant 360 nm bangos ilgiui.
2.6. Tyrimo duomenų analizė
Statistinė analizė atlikta naudojant „Microsoft Office Excel 2017” ir „SPSS 20.0“ kompiuterines programas. Apskaičiuoti trijų pakartojimų aritmetiniai vidurkiai ir standartiniai nuokrypiai. Kai p<0,05, skirtumai laikomi reikšmingais. Statistiškai reikšmingi skirtumai tarp
skirtingų Lietuvoje auginamų melsvauogių sausmedžių vaisių ėminių nustatyti pritaikant vieno faktoriaus dispersinę analizę – ANOVA, naudojant Tjukio daugkartinio palyginimo kriterijų. Spirmeno koreliacijos koeficientas naudotas įvertinti duomenų koreliacijai. Melsvauogių sausmedžių vaisių kiekinės sudėties įvairavimui apskaičiuotas variacijos koeficientas (VK). Tirtų veislių melsvauogių sausmedžių ėminiai, pagal nustatytų fenolinių junginių sudėtį, tarpusavyje palyginti hierarchinės klasterinės analizės metodu, naudojant kvadratinius Euklido atstumus.
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1. Melsvauogių sausmedžių vaisių antocianinų ekstrakcijos sąlygų
nustatymas
Pirmame ekstrakcijos sąlygų nustatymo etape atliktas etanolio koncentracijos nustatymas. Mokslinėje literatūroje nurodoma, kad antocianinų grupės junginių ekstrakcijai iš augalinių žaliavų rekomenduojama naudoti parūgštintus organinius tirpiklius, dažniausiai metanolio ir etanolio mišinius su vandeniu [50]. Mūsų tyrimams ekstrahentu pasirinkome etanolį, nes jis daug mažiau toksiškas, etanolines ištraukas galima naudoti maisto pramonėje ir medicinos praktikoje [61]. Melsvauogių sausmedžių vaisių ėminiai ekstrahuoti skirtingų koncentracijų (20 –90 proc.) etanoliu ir nustatytas bendras išektrahuotas antocianinų kiekis. Pasirinkta ekstrakcijos trukmė – 20 min., ultragarso vonelės galia – 1130 W, dažnis – 80 kHz. Statistiškai reikšmingai didžiausias bendras antocianinų kiekis (1,29±0,0012 mg/g ir 1,23±0,0014 mg/g) nustatytas ekstrakcijai naudojant 80 proc. ir 90 proc. (v/v) etanolį, šie abu rezultatai tarpusavyje statistiškai reikšmingai nesiskyrė. Tolesniems tyrimams pasirinktas 80 proc. etanolis, nes nustatytas bendras antocianinų kiekis, ekstrahuojant melsvauogių sausmedžių vaisių ėminius šios koncentracijos etanoliu, skaitine verte buvo didesnis (1 pav.).
1 pav. Bendro antocianinų kiekio įvairavimas vaisių ėminiuose, naudojant skirtingų koncentracijų etanolį; skirtingos raidės žymi statistiškai reikšmingus bendro antocianinų
kiekio skirtumus, ekstrahuojant melsvauogių sausmedžių vaisių ėminius skirtingos koncentracijos etanoliu (p<0,05) A A, B C, D B, C D D E E 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 20 30 40 50 60 70 80 90 B en dr as an toc ian in ų ki ek is , m g CG E /g
Kitame ekstrakcijos sąlygų tyrimų etape nustatyta tinkamiausia ekstrakcijos trukmė. Ilga ekstrakcijos trukmė gali turėti įtakos antocianinų stabilumui ir paskatinti jų skilimo procesą, todėl gali sumažėti ekstrakcijos efektyvumas [51]. Tyrimams pasirinkta 5−60 min. ekstrakcijos trukmė, siekiant nustatyti tinkamiausią. Ekstrakcija atlikta naudojant 80 proc. (v/v) etanolį, esant ultragarso vonelės 1130 W galiai ir 80 kH dažniui. Statistiškai reikšmingai didžiausias bendras antocianinų kiekis (1,05±0,0001 mg/g ir 1,03±0,003 mg/g, p<0,05) nustatytas melsvauogių sausmedžių vaisių ėminius išekstrahavus atitinkamai 40 ir 50 minučių (2 pav.). Ekstrakcijos trukmę ilginant iki 60 min., nustatytas bendras antocianinų kiekis statistiškai reikšmingai mažėjo, todėl tolesniems tyrimams pasirinkta 40 min. ekstrakcijos trukmė.
2 pav. Bendro antocianinų kiekio įvairavimas vaisių ėminiuose, skirtingais laiko intervalais; skirtingos raidės žymi statistiškai reikšmingus bendro antocianinų kiekio skirtumus, ekstrahuojant melsvauogių sausmedžių vaisių ėminius skirtingais laiko intervalais (p<0,05)
Paskutiniajame ekstrakcijos sąlygų parinkimo etape nustatyta tinkamiausia ultragarso vonelės galia. Tyrimo metu atlikta melsvauogių sausmedžių vaisių ėminių ekstrakcija, esant skirtingai ultragarso vonelės galiai (339–1130 W). Ekstrakcija atlikta naudojant prieš tai nustatytus parametrus: 80 proc. etanolį ir 40 min. ekstrakcijos trukmę. Didžiausias bendras antocianinų kiekis nustatytas naudojant 904 W ir 1017 W ultragarso vonelės galią (atitinkamai 1,08±0,001 mg/g ir 1,07±0,001 mg/g) (3 pav.). Šie abu rezultatai tarpusavyje statistiškai reikšmingai nesiskyrė, todėl tolesniems tyrimams pasirinkta 904 W ultragarso vonelės galia, nes naudojant šią galią, nustatytas didesnis bendras antocianinų kiekis.
A B B C D D E E D 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 5 10 15 20 25 30 40 50 60 B en dr as an toc ian in ų ki ek is , m g C G E /g
3 pav. Bendro antocianinų kiekio įvairavimas vaisių ėminiuose, esant skirtingai ultragarso vonelės galiai; skirtingos raidės žymi statistiškai reikšmingus bendro antocianinų kiekio skirtumus, ekstrahuojant melsvauogių sausmedžių vaisius skirtingos galios ultragarsu
(p<0,05)
Atlikus melsvauogių sausmedžių vaisių ėminių ekstrakcijos sąlygų parinkimo tyrimus, didžiausias bendras antocianinų kiekis nustatytas melsvauogių sausmedžių vaisių ėminius ekstrahavus 80 proc. (v/v) etanoliu 40 min. ultragarso vonelėje, esant 904 W galiai. Šios ekstrakcijos sąlygos pasirinktos tolesniems melsvauogių sausmedžių vaisių ėminių tyrimams.
3.2. Melsvauogių sausmedžių vaisių ėminių bendro antocianinų kiekio
įvairavimas
Bendras antocianinų kiekis melsvauogių sausmedžių vaisių ėminiuose varijuoja nuo 4,48±0,03 mg CGE/g (p<0,05) 'Wojtek' vaisių ėminiuose iki 28,49±0,17 mg CGE/g (p<0,05) 'Amphora' vaisių ėminiuose (4 pav.). Siekiant įvertinti bendro antocianinų kiekio įvairavimą tarp skirtingų melsvauogių sausmedžių vaisių ėminių, apskaičiuotas variacijos koeficientas, atspindintis antocianinų kiekio variacijos amplitudę. Nustatytas variacijos koeficientas (57,88 proc.) parodo didelį bendro antocianinų kiekio įvairavimą tarp skirtingų veislių melsvauogių sausmedžių vaisių ėminių.
A A, B B, C D C, D B, C 0.98 1 1.02 1.04 1.06 1.08 1.1 339 565 791 904 1017 1130 B en dr as an toc ian in ų ki ek is , m g C G E /g
4 pav. Bendro antocianinų kiekio įvairavimas (mg CGE/g) melsvauogių sausmedžių vaisių ėminiuose; skirtingos raidės žymi statistiškai reikšmingus melsvauogių sausmedžių vaisių
ėminių bendro antocianinų kiekio skirtumus (p<0,05)
Tirtų veislių melsvauogių sausmedžių vaisių ėminių bendro antocianinių kiekio vidurkis – 15,03±0,09 mg CGE/g. Panašius duomenis pateikia ir kitų šalių mokslininkai, tyrę melsvauogių sausmedžių vaisius. Auzanneau ir kt., pritaikę pH–diferencinį metodą, nustatė bendrą antocianinų kiekį Šveicarijoje auginamų skirtingų veislių melsvauogių sausmedžių vaisių ėminiuose. Šių mokslininkų nurodomas bendras antocianinų kiekis varijavo nuo 8,4 iki 41,1 mg CGE/g (sausos masės) [34].
3.3. Melsvauogių sausmedžių vaisių ėminių antocianinų kokybinės ir kiekinės
sudėties įvairavimas
Atlikus melsvauogių sausmedžių vaisių antocianinų kokybinės ir kiekinės sudėties įvairavimo tyrimą ultra–efektyviosios skysčių chromatografijos metodu (UESC), nustatyti 7 antocianinai: cianidin-3-O-gliukozidas, cianidin-3,5-O-digliukozidas, cianidin-3-O-rutinozidas, peonidin-3-O-gliukozidas, cianidinas, cianidin-3-O-galaktozidas ir peonidinas (5 pav.). Senica ir kt., ištyrę Slovėnijoje užaugintus melsvauogių sausmedžių vaisių ėminius, nustatė, kad juose kaupiami antocianinai yra cianidin-3,5-O-digliukozidas, cianidin-3-O-gliukozidas, canidin-3-O-rutinozidas, pelargonidin-diheksozidas, pelargonidin-3-O-gliukozidas, peonidin-3-O-gliukozidas ir peonidin-3,5-diheksozidas [37]. D A E F E C D B 0 5 10 15 20 25 30 35 B en dr as an toc ian in ų ki ek is , m g C G E /g
5 pav. Melsvauogių sausmedžių vaisių ėminio ištraukos chromatograma (veislė 'Tola', λ=520 nm). Identifikuoti junginiai pažymėti skaičiais: 1 – cianidin-3,5-O-digliukozidas, 2 –
cianidin-3-O-galaktozidas, 3 – cianidin-3-O-gliukozidas, 4 – cianidin-3-O-rutinozidas, 5 – peonidin-3-O-gliukozidas, 6 – cianidinas, 7 – peonidinas.
Pagrindinis antocianinų grupės junginys, vyraujantis visuose tirtuose melsvauogių sausmedžių vaisių ėminiuose, yra cianidin-3-O-gliukozidas (1 lentelė). Šis antocianinas sudaro net 87,18 proc. melsvauogių sausmedžių vaisių ėminiuose nustatyto antocianinų kiekio. Atlikto tyrimo rezultatai patvirtina kitų mokslininkų tyrimų rezultatus, kad cianidin-3-O-gliukozidas yra dominuojantis antocianinas melsvauogių sausmedžių vaisiuose ir sudaro 80–90 proc. suminio melsvauogių sausmedžių vaisiuose nustatyto antocianinų kiekio [8, 13, 17]. Mažiausias cianidin-3-O-gliukozido kiekis nustatytas 'Tola' veislės vaisių ėminiuose (394,55±1,91 µg/g), tačiau šis kiekis statistiškai reikšmingai nesiskyrė nuo 'Wojtek' ir 'Iga' veislių vaisių ėminių (atitinkamai (1372,44±93,75 µg/g ir 4655,89±247,85 µg/g). Didžiausias cianidin-3-O-gliukozido kiekis nustatytas 'Amphora' veislės vaisių ėminiuose (41162,46±6694,48 µg/g, p<0,05). Vidutinis šio junginio kiekis melsvauogių sausmedžių vaisių ėminiuose yra 17336,0±14440,5 µg/g. Apskaičiavus variacijos koeficientą (83,3 proc.), pastebimas labai didelis cianidin-3-O-gliukozido įvairavimas tarp skirtingų veislių vaisių ėminių. Auzanneau ir kt. atliktame tyrime, nustatyti dar didesni cianidin-3-O-gliukozido kiekiai skirtingų melsvauogių sausmedžių veislių vaisių ėminiuose, kurie varijavo nuo 12500 µg/g iki 87500 µg/g [34].
Cianidin-3,5-O-digliukozido kiekis varijuoja nuo 19,00±1,56 µg/g (p<0,05) 'Tola' veislės iki 2182,68±421,91 µg/g (p<0,05) 'Amphora' veislės vaisių ėminiuose (1 lentelė). Šis antocianinas sudaro 4,13 proc. suminio melsvauogių sausmedžių vaisių ėminiuose nustatyto antocianinų kiekio. Mažiausi cianidin-3,5-O-digliukozido kiekiai nustatyti 'Tola' ir 'Wojtek' vaisių ėminiuose
(atitinkamai 19±1,56 µg/g ir 44,31±3,3 µg/g). Didžiausias šio junginio kiekis nustatytas 'Amphora' veislės vaisių ėminiuose (2182,68±421,91 µg/g), tačiau jis statistiškai reikšmingai nesiskyrė nuo 'Nimfa' veislės vaisių ėminiuose nustatyto cianidin-3,5-O-digliukozido kiekio (1460,77±191,75 µg/g). Vidutinis cianidin-3,5-O-digliukozido kiekis melsvauogių sausmedžių vaisių ėminiuose yra 821,83±774,81 µg/g. Apskaičiuotas variacijos koeficientas (94,28 proc.) parodo labai didelį cianidin-3,5-O-digliukozido kiekio įvairavimą tarp skirtingų veislių melsvauogių sausmedžių vaisių ėminių.
Cianidin-3-O-rutinozidas nustatytas visuose melsvauogių sausmedžių vaisių ėminiuose ir sudaro 2,86 proc. suminio vaisių ėminiuose nustatyto antocianinų kiekio. Cianidin-3-O-rutinozido kiekis varijuoja nuo 24,73±0,35 µg/g iki 1209,04±233,88 µg/g melsvauogių sausmedžių vaisių ėminiuose (1 lentelė). Mažiausi šio junginio kiekiai nustatyti 'Tola', 'Wojtek' ir 'Iga' vaisių ėminiuose (atitinkamai 24,73±0,35 µg/g, 132,74±8,84 µg/g ir 216,13±12,17 µg/g). Didžiausias cianidin-3-O-rutinozido kiekis (1209,04±233,88 µg/g) nustatytas 'Amphora' veislės melsvauogių sausmedžių vaisių ėminiuose, tačiau nuo jo statistiškai reikšmingai nesiskyrė 'Indigo Gem' bei 'Leningradskij Velikan' veislių vaisių ėminiuose nustatytas šio junginio kiekis (atitinkamai 894,39±222,36 µg/g ir 852,25±9,38 µg/g, (p<0,05). Apskaičiuotas variacijos koeficientas (73,79 proc.) parodo didelį šio junginio kiekio įvairavimą tarp skirtingų melsvauogių sausmedžių veislių vaisių ėminių.
Peonidin-3-O-gliukozidas nustatytas visuose skirtingų melsvauogių sausmedžių veislių vaisių ėminiuose. Šis antocianinas sudaro 3,98 proc. nustatyto suminio antocianinų kiekio. Didžiausias peonidin-3-O-gliukozido kiekis (1906,04±370 µg/g) nustatytas 'Amphora' veislės vaisių ėminiuose, tačiau nuo jo statistiškai reikšmingai nesiskyrė 'Tundra' vaisių ėminiuose nustatytas O-gliukozido kiekis (1326,58±4,19 µg/g) (1 lentelė). Mažiausi peonidin-3-O-gliukozido kiekiai nustatyti 'Tola' ir 'Wojtek' vaisių ėminiuose (atitinkamai 18,73±0,48 µg/g ir 36,86±1,98 µg/g). Statistiškai reikšmingai nuo šių kiekių nesiskyrė 'Iga' bei 'Leningradskij Velikan' vaisių ėminiuose nustatytas peonidin-3-O-gliukozido kiekis (atitinkamai 172,44±11,75 µg/g ir 716,85±11,12 µg/g). Nustatytas variacijos koeficientas (86,04 proc.) parodo labai didelį šio junginio kiekio įvairavimą tarp skirtingų melsvauogių sausmedžių veislių.
Antocianinas cianidinas identifikuotas visuose melsvauogių sausmedžių skirtingų veislių vaisių ėminiuose ir sudarė 1,52 proc. suminio antocianinų kiekio. Apskaičiuotas variacijos koeficientas (115,92 proc.) parodo ypatingai didelį šio junginio įvairavimą tarp skirtingų melsvauogių sausmedžių vaisių ėminių. Didžiausias cianidino kiekis (930,33±169,83 µg/g) nustatytas 'Amphora' veislės vaisių ėminyje. Nuo šios veislės vaisių ėminiuose nustatyto cianidino
kiekio reikšmingai nesiskyrė veislių 'Tundra' ir 'Indigo Gem' vaisių ėminiuose nustatytas antocianino cianidino kiekis (atitinkamai 603,93±2,18 µg/g ir 576,28±250,24 µg/g). Mažiausias šio junginio kiekis (3,77±0,04 µg/g) nustatytas 'Tola' veislės vaisių ėminiuose, tačiau jis statistiškai reikšmingai nesiskyrė nuo 'Wojtek', 'Iga', 'Leningradskij Velikan' ir 'Nimfa' vaisių ėminiuose nustatyto cianidino kiekio (atitinkamai 30,73±0,26 µg/g, 41,14±0,36 µg/g, 96,88±1,34 µg/g ir 137,32±12,33 µg/g) (1 lentelė).
Cianidin-3-O-galaktozidas nustatatytas visų tirtų veislių (išskyrus 'Tola') melsvauogių sausmedžių vaisių ėminiuose. Jis sudaro 0,21 proc. suminio melsvauogių sausmedžių vaisių ėminiuose nustatyto antocianinų kiekio. Vidutinis cianidin-3-O-galaktozido kiekis vaisių ėminiuose yra 46,47±37,81 µg/g. Didžiausias šio antocianino kiekis (121,38±27,95 µg/g, p<0,05) nustatytas 'Amphora' veislės vaisių ėminiuose, mažiausias kiekis (atitinkamai 6,86±0,13 µg/g ir 12,79±3,08 µg/g) – veislių 'Wojtek' ir 'Iga' vaisių ėminiuose (1 lentelė). Apskaičiuotas variacijos koeficientas (81 proc.), parodo labai didelį šio junginio kiekio įvairavimą tarp skirtingų melsvauogių sausmedžių veislių vaisių ėminių.
Peonidinas identifikuotas visų tirtų veislių melsvauogių sausmedžių vaisių ėminiuose (1 lentelė). Šis junginys sudaro tik 0,12 proc. suminio antocianinų kiekio. Vidutinis peonidino kiekis vaisių ėminiuose yra 23,96±19,18 µg/g. Didžiausias šio junginio kiekis (54,94±10,75 µg/g) nustatytas 'Amphora' veislės vaisių ėminiuose, tačiau nuo jo statistiškai reikšmingai nesiskyrė 'Tundra' ir 'Indigo Gem' vaisių ėminiuose nustatytas peonidino kiekis (atitinkamai 42,4±0,98 µg/g, 37,56 µg/g). Mažiausias šio junginio kiekis nustatytas 'Tola', 'Wojtek' ir 'Leningradskij Velikan' vaisių ėminiuose (atitinkamai 1,93±0,02 µg/g, 6,1±0,29 µg/g ir 8,31±0,69 µg/g). Variacijos koeficientas (80,04 proc.) parodo didelį šio junginio kiekio įvairavimą tarp skirtingų melsvauogių sausmedžių veislių vaisių ėminių.
1 lentelė. Identifikuotų antocianinų kiekinės sudėties įvairavimas skirtingų veislių melsvauogių sausmedžių vaisių ėminiuose, µg/g
Toje pačioje eilutėje esančios skirtingos raidės žymi statistiškai reikšmingus individualių antocianinų kiekių skirtumus tarp tirtų melsvauogių sausmedžių veislių vaisių ėminių (p<0,05).
Didžiausias suminis antocianinų kiekis, pritaikius ultra–efektyviosios skysčių chromatografijos metodą, nustatytas 'Amphora' veislės vaisių ėminiuose (47566,88±7928,81 µg/g, p<0,05), mažiausias (462,72±1,19 µg/g, p<0,05) – 'Tola' veislės vaisių ėminiuose (1 lentelė). Nuo 'Tola' veislės vaisių ėminių suminio antocianinų kiekio statistiškai reikšmingai nesiskiria 'Wojtek' bei 'Iga' veislių vaisių ėminių suminiai antocianinų kiekiai (atitinkamai 1630,04±108,34 µg/g ir 5385,55±204,53 µg/g. Vidutinis suminis antocianinų kiekis, nustatytas melsvauogių sausmedžių vaisių ėminiuose, yra 19886±45 µg/g. Apskaičiuotas variacijos koeficientas (83,54 proc.) parodo labai didelį suminio antocianinų kiekio įvairavimą tarp skirtingų melsvauogių sausmedžių veislių vaisių ėminių.
Apibendrinant gautus rezultatus, melsvauogių sausmedžių vaisių ėminiuose nustatytus antocianinų grupės junginius pagal kiekinę sudėtį galima išdėstyti šia mažėjimo tvarka: cianidin-
3-O-gliukozidas>cianidin-3,5-O-digliukozidas>peonidin-3-O-gliukozidas>cianidin-3-O-rutinozidas>cianidinas>cianidin-3-O-galaktozidas>peonidinas. Šiuos rezultatus patvirtina ir kitų mokslininkų atlikti tyrimai. Vyraujantis antocianinas melsvauogių sausmedžių vaisiuose yra cianidin-3-O-gliukozidas (79–88 proc.), o kitų identifikuotų antocianinų kiekiai sudaro 12–21 proc. visų vaisiuose nustatytų antocianinų [13, 64]. Apskaičiuoti variacijos koeficientai parodė, kad identifikuotų antocianinų kiekis ženkliai įvairuoja tarp skirtingų veislių melsvauogių sausmedžių vaisių ėminių (VK=73,79–115,92 proc.).
