JUODUOGIŲ ŠEIVAMEDŽIŲ (SAMBUCUS NIGRA L.) ŽIEDŲ FLAVONOIDŲ SUDĖTIES, ANTIRADIKALINIO IR ANTIMIKROBINIO POVEIKIO TYRIMAS

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

LILIJA SPILNIK

JUODUOGIŲ ŠEIVAMEDŽIŲ (SAMBUCUS NIGRA L.) ŽIEDŲ

FLAVONOIDŲ SUDĖTIES, ANTIRADIKALINIO IR

ANTIMIKROBINIO POVEIKIO TYRIMAS

Darbo vadovas Lekt. dr. Deividas Burdulis Konsultantas Prof. dr. Alvydas Pavilonis

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanas prof. dr. Vitalis Briedis Data

JUODUOGIŲ ŠEIVAMEDŽIŲ (SAMBUCUS NIGRA L.) ŽIEDŲ

FLAVONOIDŲ SUDĖTIES, ANTIRADIKALINIO IR

ANTIMIKROBINIO POVEIKIO TYRIMAS

Konsultantas

Prof. dr. Alvydas Pavilonis

Data

Darbo vadovas

Lekt. dr. Deividas Burdulis

Data Recenzentas Data Darbą atliko Magistrantė Lilija Spilnik Data KAUNAS, 2015

TURINYS

SANTRAUKA ... 5

SUMMARY ... 6

SANTRUMPOS ... 8

ĮVADAS ... 9

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 10

1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 11

1.1. Sambucus L. genties apibūdinimas ... 11

1.2. Juoduogių šeivamedžių apibūdinimas ir morfolginiai požymiai ... 11

1.3. Augalo paplitimas ir dauginimasis ... 12

1.4. Vaistinė augalinė žaliava, jos ruošimas ir laikymas ... 12

1.5. Juoduogių šeivamedžių cheminė sudėtis ... 13

1.6. Juoduogių šeivamedžių medicininis pritaikymas ... 13

1.6.1. Vaistinio augalo panaudojimas liaudies medicinoje ... 13

1.6.2. Kvėpavimo sistemos ligos ... 14

1.6.3. Antivirusinis poveikis prieš Herpes simplex ir žmogaus imunodeficito virusus 14 1.6.4. Cukrinis diabetas ... 15

1.6.5. Širdies ir kraujagyslių ligos ... 15

1.6.6. Antimikrobinis poveikis ... 16

1.6.7. Kitas medicininis pritaikymas ... 16

1.7. Augalinio vaisto formos ir dozavimas ... 17

1.8. Nepageidaujamos reakcijos, kontraindikacijos, toksiškumas ir sąveika su vaistais . 18 1.9. Flavonoidai ... 18

1.9.1. Bendra flavonoidų apžvalga ... 18

1.9.2. Flavonoidų cheminė struktūra ir klasifikacija ... 19

1.9.3. Flavonoidų reikšmė augalams ... 21

1.9.5. Laisvieji radikalai, antioksidantai ir atiradikalinis aktyvumas ... 23

1.9.6. Antimikrobinio aktyvumo tyrimui in vitro naudotos bakterijų ir grybelių kultūros ... 23

2. TYRIMŲ METODIKA ... 25

2.1. Tyrimo objektas ... 25

2.2. Naudotos medžiagos, reagentai ir mikroorganizmai ... 26

2.3. Naudota aparatūra ... 26

2.4. Tyrimų metodai ... 27

2.4.1. Ekstraktų paruošimas ... 27

2.4.2. Nuodžiūvio nustatymas vaistinėje augalinėje žaliavoje ... 27

2.4.3. Spektrofotometrinis bendro flavonoidų kiekio nustatymas ... 27

2.4.4. Spektrofotometrinis laisvojo DPPH radikalo surišimo metodas ... 28

2.4.5. Antimikrobinio poveikio nustatymas ... 29

2.4.6. Duomenų statistinis įvertinimas ... 30

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 31

3.1. Vaistinės augalinės žaliavos nuodžiūvis ... 31

3.2. Ekstrakcijos sąlygų optimizavimas ... 31

3.3. Flavonoidų kiekybinės sudėties kitimo dinamika Sambucus nigra L. augalo žydėjimo fazėmis ... 35

3.4. Bendro Sambucus nigra L. flavonoidų kiekio įvairavimas skirtingose Lietuvos regionuose ... 37

3.5. Sambucus nigra L. žiedų ekstraktų laisvųjų radikalų surišimo gebos įvertinimas ... 39

3.6. Antiradikalinio aktyvumo priklausomybės nuo flavonoidų kiekybinės sudėties įvertinimas ... 42

3.7. Juoduogių šeivamedžių žiedų ekstraktų antimikrobinis aktyvumas ... 43

4. IŠVADOS ... 46

5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 47

6. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 48

SANTRAUKA

Lilijos Spilnik magistro baigiamasis darbas/ mokslinis vadovas lekt. dr. Deividas Burdulis; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Farmakognozijos katedra. – Kaunas.

Darbo pavadinimas: Juoduogių šeivamedžių (Sambucus nigra L.) žiedų flavonoidų sudėties, antiradikalinio ir antimikrobinio poveikio tyrimas.

Raktiniai žodžiai: Sambucus nigra L., flavonoidai, antiradikalinis aktyvumas, antimikrobinis aktyvumas.

Darbo tikslas - ištirti Lietuvoje augančių juoduogių šeivamedžių (Sambucus nigra L.) žiedų flavonoidų kiekybinę sudėtį, antiradikalinį ir antimikrobinį aktyvumą.

Darbo uždaviniai:

1. Optimizuoti flavonoidų ekstrakcijos metodiką juoduogių šeivamedžių žiedų žaliavoms. 2. Nustatyti flavonoidų kiekinius sudėties kitimo dėsninigumus augalo žydėjimo fazėmis. 3. Nustatyti bendrą flavonoidų kiekį juoduogių šeivamedžių žiedų bandiniuose, rinktuose skirtingose Lietuvos augavietėse.

4. Įvertinti juoduogių šeivamedžių žiedų ėminių antiradikalinį aktyvumą spektrofotometriniu DPPH metodu.

5. Ištirti juoduogių šeivamedžių žiedų ekstraktų antimikrobinį aktyvumą.

Tyrimo metodai. Bendras flavonoidų kiekis šeivamedžių žiedų etanoliniuose ekstraktuose nustatytas spektrofotometriniu metodu, rezultatai išreikšti procentais. Antiradikalinis aktyvumas nustatytas spektrofotometriškai, taikant DPPH radikalų surišimo metodą. Antimikrobinis aktyvumas įvertintas liejant skirtingas tirštųjų ekstraktų koncentracijas į Miulerio – Hintono agarą ir stebint mikroorganizmų augimą.

Tyrimo rezultatai ir išvados. Didžiausias bendras flavonoidų kiekis nustatytas juoduogių šeivamedžių žiedų mėginiuose rinktuose masinio žydėjimo metu (2,91 proc.), pietinėje augalo pusėje (3,48 proc.), todėl rekomenduojama rinkti Sambucus nigra L. žiedus masinio žydėjimo metu, pietinėje augalo pusėje. Nustatyta, kad didžiausiu bendru flavonoidų kiekiu (3,53 proc.) ir antiradikaliniu aktyvumu (68,21 proc.) pasižymi Sambucus nigra L. bandiniai, rinkti Mosėdžio kaime, Skuodo rajone. Antiradikalinis aktyvumas yra statistiškai priklausomas nuo bendro flavonoidų kiekio, nustatyta stipri koreliacija (koreliacijos koeficientas 0,991). Sambucus nigra L. žiedų tirštieji ekstraktai pasižymi stipresniu antimikrobiniu poveikiu prieš gramteigiamas, silpnesniu prieš gramneigiamas mikrobines kultūras. Labiausiai slopinamos Klebsiella pneumoniae ir Staphyloccocus epidermidis mikroorganizmų kultūros.

SUMMARY

Master thesis of Lilija Spilnik/ supervisor Deividas Burdulis Dr.; Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, Department of Pharmacognosy. – Kaunas.

Title: Total flavonoid content, and antiradical and antimicrobial activities of flowers of Sambucus nigra L.

Keywords: Sambucus nigra L., flavonoids, antioxidant activity, antimicrobial activity.

Aim of experiment – To evaluate total flavonoid content, antiradical and antimicrobial activity of Sambucus nigra L. flower samples, collected in Lithuania.

Experiment tasks:

1. To determine the most suitable extraction method and the optimum extraction conditions of Sambucus nigra L. flower samples.

2. To evaluate total flavonoid content quantitive variation during the flowering season.

3. To determine quantity of total flavonoid content of Sambucus nigra L. flower samples, collected in different regions of Lithuania.

4. To evaluate antiradical activity of Sambucus nigra L. flower samples.

5. To evaluate antimicrobial activity of Sambucus nigra L. thick ethanolic extracts.

Methods. Total amount of flavonoid content of elder flower ethanolic extracts determined by spectrophotometric method and the results are expressed in percent. The antiradical activity was determined spectrophotometrically by DPPH radical scavenging method. Antimicrobial activity was assessed by infusing different concentrations of the thick extracts by Mueller - Hinton'o II agar and monitoring the growth of microorganisms.

Results and conclusions. The highest total flavonoid content was determined in the elder flowers samples during massive flowering period (2.91%) and on the south side of the plant (3.48%). It is recommended to collect Sambucus nigra L. flower samples during massive flowering period on the south side of the plant. The highest total flavonoid content (3.53%) and the DPPH radical-scavenging activity (68.21%) was determined in Sambucus nigra L. samples, collected in Mosėdis, Skuodas district. DPPH radical-scavenging activity is statistically dependent on the total amount of the total flavonoid content (correlation coefficient is 0,991). It was found that the thick ethanolic extracts of the Sambucus nigra L. flower samples has the strongest antimicrobial activity against Gram-positive, than Gram-negative microorganisms. Stronegst antimicrobial activity was found against Klebsiella pneumoniae and Staphyloccocus epidermidis cultures of microorganisms.

PADĖKA

Nuoširdžiai dėkoju darbo vadovui lekt.dr. Deividui Burduliui už vertingus patarimus ir konsultacijas. Taip pat noriu padėkoti mikrobiologijos katedros profesoriui dr. Alvydui Paviloniui už pagalbą atliekant antimikrobinio poveikio tyrimą.

SANTRUMPOS

didelio tankio lipoproteinai glikuotas hemoglobinas

pirmo tipo herpes virusas (angl. Herpes simplex virus 1)

(angl. inhibitory concentration fifty) koncentracija, reikalinga sukelti pusę maksimalaus slopinančio poveikio

imunoglobulinas E interleukinas laisvieji radikalai

minimali slopinanti koncentracija (angl. minimum inhibitory concentration) meticilinui rezistentiškas auksinis stafilokokas

mažo tankio lipoproteinai imtis

reaktyvios deguonies formos (angl. reactive oxygen species) santykinis standartinis nuokrypis

ultravioletinė spinduliuotė žmogaus imunodeficito virusas

ĮVADAS

Šio darbo tiriamasis objektas – juoduogių šeivamedžių (Sambucus nigra L.) žiedai. Tai ūksmininių (Adoxaceae) šeimos augalas, kaupiantis flavonoidus, triterpenus, sterolius, eterinius aliejus ir kitus junginius. Sambucus nigra L. yra naudojamas sergant įvairiomis kvėpavimo takų ligomis ir pasižymi plačiu veikimo spektru: antivirusiniu, antibakteriniu, priešuždegiminiu, hipoglikeminiu, diuretiniu, antioksidaciniu, imunomoduliuojančiu [1, 2].

Remiantis pasaulinės sveikatos organizacijos statistikos duomenimis, rudens ir žiemos metu 5 - 15 proc. žmonių populiacijos serga viršutinėmis kvėpavimo takų ligomis [3]. Lietuvoje Sambucus nigra L. preparatai vartojami esant peršalimui, karščiavimui. Remiantis valstybinės vaistų kontrolės duomenimis, Lietuvoje yra registruoti 4 augaliniai vaistiniai preparatai, sudėtyje turintys Sambucus nigra L. ekstrakto. Europos vaistų agentūros duomenimis, vaistinis augalas Europoje vartojamas jau 30 metų, tačiau Lietuvoje nėra atliktų išsamių flavonoidų sudėties tyrimų [4].

Sambucus nigra L. - populiarus ir plačiai naudojamas augalas Lietuvoje, tačiau nėra pakankamai literatūros duomenų apie flavonoidų kiekio įvairavimą žieduose, todėl aktualu ištirti Lietuvoje augančius juoduogių šeivamedžių žiedus ir nustatyti optimalų vaistinės augalinės žaliavos paruošos laiką Lietuvos klimatinėmis sąlygomis.

Flavonoidai yra vieni svarbiausių biologiškai aktyvių junginių, kaupiamų Sambucus nigra L. žieduose, todėl racionalu juos išanalizuoti lengvai atliekamu spektrofotometriniu metodu. Juoduogių šeivamedžių žiedų flavonoidų kiekybinis tyrimas atliktas, siekiant išsiaiškinti kiekybinius kitimo dėsningumus augalo žydėjimo fazėse ir palyginti flavonoidų pasiskirstymą skirtingose Lietuvos augavietėse. Antiradikalinio aktyvumo tyrimas yra reikšmingas, norint įvertinti galimą Sambucus nigra L. žiedų panaudojimą, užkertant kelią oksidacinio streso sukeliamų ligų atsiradimui. 90 proc. visų viršutinių kvėpavimo takų ligų sukelia virusai ir bakterijos, todėl antimikrobinio aktyvumo tyrimas yra aktualus vertinant vaistinės augalinės žaliavos panaudojimą sergant bronchitu ir kitomis peršalimo ligoms [5].

Šio tyrimo naujumas yra flavonoidų kiekybinės sudėties kitimo dinamikos ir antiradikalinio aktyvumo nustatymas augalo žydėjimo metu ir skirtingose Lietuvos augavietėse rinktuose mėginiuose. Siekiant išsamiau įvertinti flavonoidų kiekybinių rodiklių įvairavimą nustatytas bendras flavonoidų kiekis skritingose augalo pusėse ir atliktas antimikrobinio aktyvumo tyrimas.

Darbo tikslas - ištirti Lietuvoje augančių juoduogių šeivamedžių (Sambucus nigra L.) žiedų flavonoidų kiekybinę sudėtį, antiradikalinį ir antimikrobinį aktyvumą.

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Ištirti Lietuvoje augančių juoduogių šeivamedžių (Sambucus nigra L.) žiedų flavonoidų kiekybinę sudėtį, antiradikalinį ir antimikrobinį aktyvumą.

Darbo uždaviniai:

1. Optimizuoti flavonoidų ekstrakcijos metodiką juoduogių šeivamedžių žiedų žaliavoms. 2. Nustatyti flavonoidų kiekinius sudėties kitimo dėsninigumus augalo žydėjimo fazėmis. 3. Nustatyti bendrą flavonoidų kiekį juoduogių šeivamedžių žiedų bandiniuose, rinktuose skirtingose Lietuvos augavietėse.

4. Įvertinti juoduogių šeivamedžių žiedų ėminių antiradikalinį aktyvumą spektrofotometriniu DPPH metodu.

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. Sambucus L. genties apibūdinimas

Iš viso žinoma Sambucus L. genties 30 augalų rūšių. Lietuvoje natūraliai auga 3 rūšių šeivamedžiai: žolinis šeivamedis (Sambucus ebulus L.), juoduogis šeivamedis (Sambucus nigra L.) ir raudonuogis šeivamedis (Sambucus racemosa L.) [6].

1.2. Juoduogių šeivamedžių apibūdinimas ir morfolginiai požymiai

Pavadinimas - juoduogis šeivamedis (Sambucus nigra L.), šeima - ūksmininių (Adoxaceae). Sinonimas yra Sambucus laciniata L. Mill. [5]. Sinonimai: juodasis bezdas, kiaurmedis, sambė, štrukas [6]. Tai daugiametis 3-10 m aukščio krūmas arba nedidelis medis (1 pav.). Žievė balkšva ar rudai pilkšva, giliai suaižėjusi. Stiebai turi tvirtus, stačius ūglius, šakos dažnai horizontalios. Lapai kotuoti, neporomis plunksniški, lapelių kraštai dantyti, sutrynus nemaloniai kvepia [7, 8]. Lapai sudaryti iš 5-7 blizgių lapelių, aštriai pjūkliški, ovalūs ar kiaušiniški, viršūnės smailios, šiek tiek dantytos [9]. Jų viršutinė pusė tamsiai žalia, pagrindinės gyslos šiek tiek plaukuotos, o apatinė – šviesesnė, pilka [6]. Žiedynas skėtiškas, plokščias 10-20 cm skersmens. Žiedai maži, simetriški, 5-6 mm skersmens, balti ar kreminiai balti, išsidėstę šakučių viršūnėse. Žiedai žydėjimo metu yra statūs, vėliau nusvyra, aromatingo, malonaus kvapo. Taurėlapiai 5, žali. Vainiklapiai 5, ovalūs, šviesiai geltoni, suaugusiais pamatais. Kuokeliai 5, geltoni [1, 5]. Vaisiai – blizgios, juodai violetinės, mėsingos 6-8 mm ilgio, uogos pavidalo kaulavaisiai. Uogos turi 3-5 sėklas [9].

Pagal klasifikaciją juoduogiai šeivamedžiai priklauso šeivamedžių (Sambucus) genčiai. Įprastai priskiriami sausmedinių - Caprifoliaceae šeimai, tačiau remiantis naujais duomenimis šeivamedžiai priklauso ūksmininių - Adoxaceae šeimai [10, 11].

1.3. Augalo paplitimas ir dauginimasis

Medis yra paplitęs Europoje, Azijoje, Šiaurės Afrikoje, įvestas Šiaurės Amerikoje, kur natūraliai auga amerikiniai šeivamedžiai (Sambucus canadensis L.). Sambucus nigra L. yra paplitęs Vakarų ir Vidurio Europoje, Didžiojoje Britanijoje, Skandinavijoje, Kryme. Neauga aukštuose kalnuotose vietovėse [12, 13].

Lietuvoje apyretis augalas ir dažniausiai auga miško pakraščiuose, pušynuose, parkuose, pakelėse, šalia geležinkelių ir pastatų. Paplitęs laukuose, pakrantėse, miestuose, aplink gyvatvores ir paunksnėje, pasitaiko sulaukėjusių. Rečiau auga miškuose, nes augalas mėgsta saulės šviesą ir derlingus dirvožemius, kuriuose yra maistinių medžiagų.

Dauginasi sėklomis, šaknų atžalomis ir vegetatyviškai. Dauginama sėjant sėklas rudenį arba šaknų atraižomis vasaros pradžioje, naudojant nežydinčius ūglius. Dekoratyvinės veislės turėtų būti dauginamos vegetatyviškai. Vegetatyvinis dauginimas yra priimtiniausias būdas siekiant išvengti kryžminio apdulkinimo su kitomis šeivamedžių rūšimis [10, 14].

1.4. Vaistinė augalinė žaliava, jos ruošimas ir laikymas

Pagal Europos farmakopėją (Ph. Eur. 01/2005:1217) kaip augalinė žaliava naudojama juoduogių šeivamedžių žiedai (Sambuci nigrae flos). Kita žaliava – juoduogių šeivamedžių vaisiai (Sambuci nigrae fructus). Žiedų kvapas stiprus, aromatinis, charakteringas. Skonis: saldus, silpnai kartus, gleivingas.

Šeivamedžių žiedynai skinami gegužės pabaigoje – birželio pradžioje (žydėjimo metu), tuo tarpu vaisiai rugpjūčio-rugsėjo mėnesiais. Žiedynai renkami visiškai išsiskleidę, be žiedkočių. Vaistinė augalinė žaliava (VAŽ) džiovinama gerai vėdinamoje patalpoje, apsaugotoje nuo saulės spindulių. Iš 10 kg šviežių žiedų gaunama 2,3-2,5 kg orasausės žaliavos. VAŽ yra gelsvai baltos spalvos, silpno specifinio kvapo. Pakuojama į popierinius maišus, laikoma ant lentynų gerai vėdinamoje patalpoje. VAŽ tinkama vartoti iki 3 metų. Europos farmakopėjoje nurodyta, kad kokybiškai išdžiovintoje žaliavoje turi būti ne mažiau kaip 0,80 proc. flavonoidų, perskaičiuotu izokvercitrinu [4, 6, 15, 16].

1.5. Juoduogių šeivamedžių cheminė sudėtis

Apžvelgus ir susiteminus literatūros duomenis, įvertinta Sambucus nigra L. cheminė sudėtis. Žieduose gausiai aptinkami flavonoidai, jų žiedynuose yra virš 3,0 proc. Daugiausiai hiperozido, izokvercitrino, rutino, kemferolio, nikotiflorino, kvercetino, astragalino. Aptinkami šie fenoliniai junginiai: chlorgeninė rūgštis (iki 3,0 proc.), kavos ir ferulo rūgštys (daugiau kaip 3 proc.), organinės rūgštys: acto, valerijonų, obuolių. Žiedynuose kaupiama 0,03-0,30 proc. eterinio aliejaus. Vidutiniškai nustatyta apie 0,15 proc. eterinių aliejų. Šiek tiek mažiau aptinkama sterolių apie 0,11 proc. Pagrindiniai steroliai yra β-sitosterolis, stigmatosterolis, kampesterolis ir cholesterolis. Žieduose randama apie 1,0 proc. triterpenų: α ir β amirinų, oleonolinių ir ursolinių rūgščių ir β-hidroksiursolinės rūgšties. Žieduose yra 66 proc. nesočiųjų riebalų rūgščių: linolo, linoleno, palmitino rūgštys (38 proc.) ir 7 proc. alkanų (C19, C21, C23, C25). Identifikuota daugelis kitų junginių, tokių kaip: eteriai, esteriai,

oksidai, ketonai, aldehidai ir alkoholiai. Žieduose yra 8-9 proc. mineralinių medžiagų, didelis kiekis kalio. Kiti junginiai: vitaminas C (80 mg proc.), taninai, gleivės, baltymai, pektinai, cukrai [1, 4, 6]. Kislichenko & Vel'ma (2006) aptiko 16 aminorūgščių iš kurių gausiausiai buvo alanino, glutamo ir asparaginės rūgščių, suminis jų kiekis 8,965 proc. [17].

1.6. Juoduogių šeivamedžių medicininis pritaikymas

1.6.1. Vaistinio augalo panaudojimas liaudies medicinoje

Pirmą kartą šeivamedžių vartojimas medicininiams tikslams buvo paminėtas 1550 m. pr. Kr. Hipokratas aprašė augalo skausmą mažinantį, opas gydantį ir diurezę skatinantį poveikį. Medis laikomas šventu, jam priskiriamos magiškos galios, jis simbolizuoja pagarbą [18, 19]. Nuo senovės laikų indėnų gentys naudojo juoduogių šeivamedžių žiedų arbatą kaip prakaitavimą skatinančią priemonę. Žiedų, uogų, žievių mišinys kaip vėmimą skatinančią, vidurius liuosuojančią priemonę. Išdžiovintų žiedų užpilą vartojo siekiant sumažinti gerklės skausmą, karščiavimą, sergant ūmiu bronchitu [20]. Liaudies medicinoje naudojami juoduogių šeivamedžių žiedai, vaisiai, lapai. Žiedynai vartojami gydyti viršutines kvėpavimo takų ligas ir burnos uždegimus, konjuktyvitą, apendicitą, šlapimo takų infekcijas, reumatą, galvos skausmą ir cukrinį diabetą [14, 15]. Sambucus nigra L. žiedų, lapų, žievės ir šakelių mišinys sumaišytas lygiomis dalimis su vaistinių ramunių (Matricaria recutita L.) žiedais išoriškai naudojamas kaip karštas kompresas, mažinantis skausmą, uždegimą, sąnarių sąstingį. Vandeninė žiedų ištrauka išoriškai naudojama kaip priemonė minkštinanti odą, šviesinanti strazdanas ir pigmentines dėmes [14]. Juoduogių šeivamedžių ir liepų žiedų mišinys naudojamas susirgus gripu ar esant peršalimui [6]. Juoduogių šeivamedžių žiedų ekstraktai įeina į tepalų, kremų ir

losjonų, šampūnų sudėtį [21]. Sambucus nigra L. žiedai ir vaisiai plačiai naudojami ir maisto pramonėje kaip natūralūs dažikliai vynams, sultims, uogienėms gaminti [12].

1.6.2. Kvėpavimo sistemos ligos

Juoduogių šeivamedžių žiedų užpilai, vaistažolių arbatos ir mikstūros naudojamos gydyti viršutines kvėpavimo takų ligas [13]. Įrodyta, kad flavonoidai pasižymi antivirusiniu poveikiu prieš kvėpavimo sincitinį, gripo ir paragripo virusus [22, 23]. C. Chen ir kt. (2014) nustatė, kad Sambucus nigra L. ekstraktai slopina bronchito virusų sukėlėjus ankstyvuoju replikacijos metu. Tyrimo metu buvo tiriamos rausvųjų radiolių (Rhodiola rosea L.), sėjamųjų juodrūgių (Nigella sativa L.) ir Sambucus nigra L. ekstraktų antivirusinio ir antimikrobinio aktyvumo poveikiai, tačiau tik šeivamedžių ekstraktas slopino bronchito infekcijos patogenų sukelėjus [24].

In vivo ir in vitro tyrimo duomenimis, Sambucus nigra L. preparatai efektyviai slopina gripo viruso A ir B tipo padermes [25]. Šis poveikis grindžiamas flavonoidų gebėjimu stimuliuoti imunitetą bei citokinų gamybą. Z. Zakay-Rones ir kt. (2004) įvertino Sambucol sirupo efektyvumą prieš gripo virusą. Išsiaiškinta, kad vartojant juoduogių šievamedžių sirupą tiriamajai grupei simptomai pagerėjo per 3-4 dienas, o placebo grupei tik po 7-8 dienų [23]. N.P. Friel ir kt. (2005) atliko klinikinį tyrimą ir nustatė, kad vartojant po 15 ml - 3 dienas Sambucol sirupo gripo simptomų pagerėjimas pastebimas po 2 dienų - 93,3 proc. pacientų ir visiškas pasveikimas - 90,0 proc. dalyvių nustatytas po 3 dienų [8].

Sambucus nigra L. žiedai, esantys sudėtiniame preparate Sinupret, naudojami gydyti ūmiam ar lėtiniui sinusitui, siekiant efektyvesnio gydymo poveikio šį preparatą rekomenduojama vartoti kartu su antibiotikais. Nustatytas sekretolitinis, galvos skausmą, nosies užgulimą ir paburkimą mažinantis poveikis. 22 tyrimų metaanalizės rezultatai parodė, kad po dviejų savaičių gydymo Sinupret preparatu 61,1 proc. pacientų ligos simptomai išnyksta [26].

1.6.3. Antivirusinis poveikis prieš Herpes simplex ir žmogaus imunodeficito

virusus

Sambucus nigra L. žiedai pasižymi antivirusiniu poveikiu prieš herpes simplex-1 virusą (HSV-1). Šį poveikį sukelia flavonoidų, fenolinių rūgščių, taninų ir polisacharidų mišinys. Juoduogių šeivamedžių ekstraktai plačiai vartojami herpes viruso gydymui, dėl imunomoduliuojančių ir antioksidacinių savybių [27]. Tiriant Sambucol preparatą buvo išskirtos iš HSV-1 keturios padermės: etaloninė, dvi aciklovirui atsparios padermės ir viena izoliuota iš paciento. Nustatyta, kad visos keturios padermės buvo slopinamos replikacijos stadijoje. Antivirusinis poveikis aiškinamas

hemagliutinino slopinimu, todėl virusai negali patekti į ląstelės vidų [7]. Išsiaiškinta, kad Sambucus nigra L., paprastųjų jonažolių (Hypericum perforatum L.) ir vaistinių putoklių (Saponaria officinalis L.) augalų mišinys slopina HSV-1 replikaciją in vitro [4].

Išsiaiškinta, kad Sambucol preparatas slopina žmogaus imunodeficito viruso (ŽIV) izoliatus, CD4+ ląstelių linijas, limfocitus ir laboratorinių padermių virulentiškumą. Rezultatai parodė, kad pastebėtas reikšmingas užkrečiamumo sumažėjimas visose padermėse. Remiantis 6 tyrimų duomenimis, šeivamedžių ir čiobrelių ekstraktai sumažina viruso koncentraciją kraujyje sergantiems ŽIV. In vitro tyrimai parodė, kad vaistinio augalo ekstraktai stipriai slopina kačių imunodeficito virusą [7, 22].

1.6.4. Cukrinis diabetas

In vitro tyrimai parodė, kad Sambucus nigra L. žiedai pasižymi hipoglikeminiu poveikiu. Nustatyta, kad vandeniniai žiedų ekstraktai reikšmingai pagerina gliukozės apykaitą ir pasisavinimą raumenyse. Ištyrus žiurkių kasos ląsteles pastebėtas nuo dozės priklausomas atsakas, skatinantis insulino sekreciją. Tačiau nenustatyta cheminių junginių prigimtis, todėl turėtų būti atliekami tolimesni tyrimai norint išsiaiškinti hipoglikeminį mechanizmą [7]. M. Ciocoiu ir kt. (2009) atliko tyrimą, kuriame buvo tiriamos žiurkės, kurioms dirbtinai sukeltas cukrinis diabetas (CD) (suleidžiama 1 proc. streptozotocino injekcija į pilvaplėvės ertmę), ir skiriami juoduogių šeivamedžių ekstraktai. Rezultatai parodė, sumažėjusį mažo tankio lipoproteinų (MTL) ir padidėjųsį didelio tankio lipoproteinų (DTL) kiekius, sumažėjusią trombocitų adheziją, padidėjusias šlapimo rūgšties koncentraciją [28]. L. Bădescu ir kt. (2008) nustatė, kad juoduogių šeivamedžių vandeniniai ekstraktai geba padidinti kaulų mineralinį tankį esant CD. Šių studijų rezultatai parodė reikšmingą antioksidacinio aktyvumo padidėjimą, dėl padidėjusios glutationo koncentracijos ir glikuoto hemoglobino (HbA1c). Pasak autorių, ateityje augalo ekstraktai galėtų būti sėkmingai panaudojami ne tik CD, bet ir osteoporozei gydyti [27].

1.6.5. Širdies ir kraujagyslių ligos

Dėl stiprių antioksidacinių savybių vaistinis augalas slopina MTL oksidaciją ir laisvuosiuos radikalus bei gerina endotelio funkciją ir miokardo perfuziją ankstyvoje arterinės hipertenzijos (AH) stadijoje todėl yra tinkamas gydyti būkles, sukeltas oksidacinio streso. In vivo tyrime buvo lyginamas juodvaisės aronijos (Aronia melanocarpa L.) ir Sambucus nigra L. apsaugantis poveikis esant AH, naudojant žiurkių modelį. Rezultatai parodė, kad abu augalai vienodai veiksmingai apsaugo nuo AH taip pat ir inkstų audinius [27, 29, 30].

1.6.6. Antimikrobinis poveikis

Sambucus nigra L. žiedai pasižymi antimikrobiniu poveikiu prieš gramteigiamas ir gramneigiamas bakterijas, šį poveikį sukelia taninai (galo rūgšties dariniai, hidroksicinamono rūgštis, kavos rūgštis, chino rūgštis) ir triterpenai (β-amirino, eritrodiolio, oleanolinių, masri rūgščių) [31]. A.V. Arjoon ir kt. (2012) nustatė, kad Sambucus nigra L. žiedų 380 mg/ml koncentracijos vandeniniai ekstraktai veikia bakteriostatiškai prieš M. mycoides capri, E. coli, B. subtilis. Nustatytos šių bakterijų minimalios slopinančios koncentracijos (MSK) reikšmės: 0,0038 mg/ml ekstraktų koncentracija slopino E. Coli augimą, 0,38 mg/ml ekstraktų koncentracija slopino M. mycoides capri augimą, 3,8 mg/ml ekstraktų koncentracija slopino B. subtilis augimą [32]. A. Salehzadeh ir kt. (2014) įvertinto antimikrobinį poveikį difuziniu į agarą metodu prieš 16 meticilinui rezistentiško auksinio stafilokoko (MRSA) bakterijų su metanoliniu Sambucus ebulus lapų ekstraktu. Nustatyta, kad MSK - 15 mg ekstrakto koncentracija slopino augimą S. aureus padermės. S. ebulus metanoliniai ekstraktai veikė visas tirtas MRSA mikroorganizmų padermes [33]. C. Hearst ir kt. (2010) atlikto juoduogių šeivamedžių žiedų, uogų ir lapų antimikrobinio poveikio tyrimą prieš hospitalinių infekcijų sukelėjus. Nustatyta, kad Sambucus nigra L. žiedų etanoliniai ekstraktai pasižymėjo stipresniu antimikrobiniu poveikiu palyginus su uogomis ir lapais. Sambucus nigra L. inhibavo visų 13 tirtų hospitalinių infekcijų sukelėjų augimą. Žiedų ekstraktai stipriausiai slopino MRSA augimą (17 mm), kurio poveikis buvo panašus kaip tyrime naudoto standarto ciprofloksacino 5 µg (22 mm). Juoduogių šeivamedžių žiedų ir uogų liofilizuoti koncentratai slopino daugumą bakterijų, tiek gramteigiamas (stafilokokų rūšies, B. cereus) tiek ir gramneigiamas (Salmonella Poona, P. aeruginosa) hospitalinių infekcijų sukėlėjus. Manoma, kad juoduogių šeivamedžių žiedų ar uogų liofilizuoti milteliai naudojami gelių, emulsijų ar kremų pavidalu yra perspektyvūs antimikrobiniai agentai, gydant odos infekcijas [31]. C. Avancini ir kt. (2008) atliko in vitro antimikrobinį tyrimą skiedimo metodu ir nustatė, kad Sambucus nigra L. vandeninis lapų ekstraktas santykiu 1:10 yra efektyvus vartojant per os ar lokaliai gydant galvijų mastitą. Vandeninis ekstraktas pasižymėjo antimikrobiniu aktyvumu prieš Staphylococcus aureus ir Salmonella choleraesuis [34].

1.6.7. Kitas medicininis pritaikymas

Sambucus nigra L. žiedai naudojami, esant obstipacijoms. P.D. Picon ir kt. (2010) ištyrė Brazilijoje registruotos vaistažolių arbatos saugumą ir veiksmingumą, kurios sudėtyje yra anyžinių ožiažolių (Pimpinella anisum L.), paprastųjų pankolių (Foeniculum vulgare) vaisių ir juoduogių

šeivamedžių (Sambucus nigra L.), aštrialapių kasijų (Cassia augustifolia L.) žiedų mišinio. Nustatyta, kad vaistažolių arbata yra saugi ir veiksminga vidurių užkietėjimui gydyti, kadangi skatina žarnyno peristaltiką ir didina išmatų tūrį [35].

Sambucus nigra L. žiedai pasižymi diuretiniu poveikiu. J. Barnes ir kt. (2007) atliko tyrimą, kuriame palygino teofilino ir šeivamedžių žiedų poveikį šlapimo išsiskyrimui. Žiurkėms buvo leidžiama VAŽ infuzija (20 ml/kg kūno svorio) ir skiriama teofilino per os (5 mg/kg kūno svorio). Rezultatai parodė, kad stipresnį diuretinį poveikį sukėlė vaistinis augalas [1]. Manoma, kad diurezę skatina diterpenai ir triterpenai, glikozidai, fenoliniai junginiai [28].

Plačiai tiriamas juoduogių šeivamedžių priešvėžinis poveikis. F.P. Karakas ir kt. (2012) atliktas tyrimas parodė, kad Sambucus nigra L. uogų ir lapų metanoliniai ir vandeniniai ekstraktai (80 proc.) vidutiniškai slopino naviko augimą, etanolinis ekstraktas veikė silpniau (63 proc.) [36]. Priešvėžinis veikimas grindžiamas imuninės sistemos stimuliavimu, dėl to padidėja leukocitų, citokinų ir priešuždegiminių junginių skaičius [2].

Vandeninis VAŽ ekstraktas pasižymi priešuždeginiu poveikiu ir slopina periodonto ligų sukėlėjus Porphyromonas ginigivalis ir Actinobacilus actinomycetemcomitans. Uždegimo metu slopinama makrofagų ir neutrofilų aktyvacija, kurią galimai sukelia kvercetinas.

In vivo tyrimo metu nustatytas Sambucus nigra L. flavonoido rutino sukeliamas priešuždegiminis poveikis, tiriant artritą modelyje su žiurkėmis. Pelėms leidžiant 0,5 ml žiedų frakcijos į papilvės ertmę padidėja fagocitozė. Įrodyta, kad 80 proc. etanolinis VAŽ ekstraktas vidutiniškai slopina edemą. [4].

In vitro tyrimai (atlikti su žiurkių klubine žarna, triušių/jūrų kiaulyčių žarnomis) įrodė, kad lektinai išskirti iš Sambucus nigra L. pasižymi antispazminiu poveikiu [1].

Sambucus nigra L. žiedai naudojami kosmetikoje. Jų žiedų mišinių ekstraktų emulsijos su vienpiestėmis gudobelėmis (Crataegus monogyna L.), smiltyniniais šlamučiais (Helichrysium arenarium L.) apsaugo odą nuo ultravioletinių spindulių (UV) [37].

1.7. Augalinio vaisto formos ir dozavimas

Remiantis Čekijos farmakopėja reglamentuojama Sambucus nigra L. žiedų vienkartinė dozė yra 2-3 g, paros dozė 10-15 g. Nerekomenduojama vartoti ilgiau nei 1 savaitę.

 Džiovinti žiedai: 2 - 4 g × 3 kartus per dieną.  Vaistažolių arbata: 2 – 5 g × 3 kartus per dieną.

 Skystas ekstraktas 1:1 (25 proc. etanolio V/V) po 3 - 5 ml × 3 kartus per dieną.  Tinktūra 1:5 (25 proc. etanolio V/V) po 10 – 15 ml × 3 kartus per dieną.

 Užpilas: 3 g VAŽ užpilama 150 ml karšto vandens.

Europos komisijos direktyva nurodo šias vaisto formas skirtas vartoti per os: vaistažolių arbata, skysti žoliniai preparatai [1, 4, 12].

1.8. Nepageidaujamos reakcijos, kontraindikacijos, toksiškumas ir sąveika su

vaistais

Juoduogių šeivamedžių žiedų terapinės dozės nesukelia jokio nepageidaujamo poveikio, tačiau vartojant dideles dozes gali atsirasti pykinimas, viduriavimas ir poliurija. Remiantis neklinikiniais duomenimis nėra nustatyta žiedų sukeliamo žalingo poveikio. Nėra duomenų apie mutageniškumą, genotoksiškumą, kancerogeniškumą. Tačiau vaistinis augalas kaupia nuodingus alkaloidus ir cianogeninius glikozidus, kurie gali sukelti vėmimą ar viduriavimą. Nėra nustatytų kontraindikacijų, bet įspėjama, kad padidėjęs jautrumas veikliosioms medžiagoms gali būti laikomas kontraindikacija. Nėra patvirtintų duomenų apie galimas vaistų sąveikas. Yra duomenų apie žieduose esančius flavonoidus rutiną ir kvercetiną, kurie slopina ksantino oksidazę ir teoriškai gali turėti poveikį kofeino ir teofilino koncentracijai kraujyje. Dėl duomenų trūkumo apie toksiškumą, sukeliamus apsigimimus, kontraindikacijas nėštumo ar laktacijos metu, Sambucus nigra L. žiedai neturėtų būti rekomenduojami nėščioms ir žindyvėms [1, 4].

1.9. Flavonoidai

1.9.1. Bendra flavonoidų apžvalga

Medicinoje ir farmacijoje didėja susidomėjimas natūralios kilmės antioksidantais -flavonoidais. Flavonoidai tai viena didžiausių augalinių fenolinių junginių grupių. Iki šiol yra identifikuota daugiau kaip 8000 skirtingos cheminės struktūros flavonoidų. Flavonoidai yra antriniai augalų metabolitai ir natūralūs augaliniai pigmentai. Jų gausu ne tik augaluose, bet ir vaisiuose, daržovėse, sėklose, grūduose, riešutuose, meduje ir gėrimuose, pvz: vyne, arbatoje, kavoje. Sambucus nigra L. žieduose kaupiami flavonoidai yra pagrindinė fenolinių junginių grupė, todėl ši grupė bus aptariama darbe [38, 39, 40]. Sambucus nigra L. ir kitų vaistinių augalų flavonoidų nustatymui taikomi šie metodai: spektrofotometrija, efektyvioji skysčių chromatografija, kapiliarinė elektroforezė, elektrokinetinė kapiliarinė chromatografija [41].

1.9.2. Flavonoidų cheminė struktūra ir klasifikacija

Bendra flavonoidų struktūra sudaryta iš 15 anglies atomų, kuri yra sujungta į C6-C3-C6 sistemą (1 pav.). Flavonoidų pagrindą sudaro 2 aromatiniai A ir B benzolo žiedai, kurie sujungti per C heterociklinį pirano žiedą. Flavonoidai aptinkami aglikonų pavidalu ir glikozilinti. Prie aglikono dažniausiai prijungta gliukozė, bet gali būti ir ramnozė, gliukoramnozė, arabinozė, galaktozė. Flavonoidų klasifikacijų yra įvairių. Pagal C žiedo oksidacijos laipsnį ir pagal cheminę struktūrą, flavonoidai skirstomi į šias klases: flavonai, flavonoliai, flavanonai, flavan-3-oliai (katechinai), antocianidinai, izoflavonai, auronai, chalkonai, biflavonoidai, neoflavonoidai [38, 42, 43, 44].

2 pav. Flavonoidų aglikono struktūrinis pagrindas

Flavonai (apigeninas, luteolinas) ir flavonoliai (mirecetinas, kvercetinas, kemferolis) tai vieni iš svarbiausių flavonoidų pogrupių (2 pav.). Kemferolis, kvercetinas yra kaupiami Sambucus nigra L. žaliavoje. Flavonai kaupiami ir lapuose, vaisiuose, dauguma O-glikozidų pavidalu. Glikozilinimas vyksta C7 padėtyje prijungiama gliukozė, ramnozė, galaktozė ar disacharidai. Tarp C2 ir C3 yra dviguba jungtis, 4 padėtyje yra keto grupė, o flavonoliai 3 padėtyje turi ir hidroksi grupę. Pakaitai jungiasi C3, tačiau gali jungtis ir 5,7, 4',5',3' padėtyse.

3 pav. Flavonų ir flavonolių struktūrinės formulės

Flavanonai (hesperidinas, naringinas) skirtingai nei flavonai neturi dvigubos jungties tarp C2 ir C3. Flavan-3-oliai ((+)-katechinas, (-)-epikatechinas) skiriasi nuo flavanonų tuo, kad C4 padėtyje

nėra keto grupės, o C3 yra hidroksi grupė. Priklausomai nuo to kaip yra išsidėstę du H atomai C2 ir C3 padėtyse galimos cis ir trans konigūracijos. Flavan-3-oliai išsiskiria iš kitų flavonoidų, nes augaluose randami aglikonu pavidalu, retai glikozilinti (3 pav.).

4 pav. Flavanonų ir flavan-3-olių struktūrinės formulės

Antocianidinai (antocianas, cianidinas, malvidinas, delfinidinas) C3 padėtyje turi hidroksi grupė, dvi dvigubas jungtis tarp C1 ir C2, ir C3 ir C4 (4 pav.). Augaluose randami glikozilintu pavidalu vadinami antocianinais. Dažniausiai jungiasi per C3 atomą, bet gali ir 3,5,7, 3' ir 5' padėtyse.

5 pav. Antocianidino struktūrinė formulė

Izoflavonai (genisteinas, genistinas, daidzeinas) tai 3-fenilchromano dariniai. Žinoma daugiau kaip 350 izoflavono junginių. Struktūra panaši į flavonus, tarp C2 ir C3 turi dvigubą jungtį ir keto grupę 4 padėtyje. Skirtingai nuo kitų flavonoidų B žiedas yra prijungtas per C3 (5 pav.).

Auronai tai benzofurano junginiai (6 pav.). Auronai kitaip nei kiti flavonoidai turi furano žiedą. Dažniausiai aptinkami glikozilinti, rečiau aglikonų pavidalu. Labiausiai paplitęs junginys yra aureosidinas. Chalkonai (izolikvirtinas, chalkonas) turi atvirą pirono žiedą. Galimos izomerų cis ir trans konfigūracijos. [45, 46, 47, 48, 49, 50].

7 pav. Auronų struktūrinė formulė

1.9.3. Flavonoidų reikšmė augalams

Flavonoidai turi teigiamą poveikį augalams: apsaugo nuo UV spindulių, privilioja vabzdžius, kad apdulkintų augalus, veikia antimikrobiškai. Flavonai, flavanonai ir izoflavonai lemia augalo priešgrybelinį poveikį. Flavonoidai ir taninai apsaugo augalus nuo vabzdžių ir žolėdžių žinduolių. Biologiškai aktyvios medžiagos suteikia žiedams spalvą. Antocianinai nulemia įvairius vaisių ir žiedų atspalvius: raudonus, purpurinius, mėlynus. Antocianinas delfinidinas nudažo žiedus mėlyna spalva, o flavonai - balta ir geltona spalvomis. Antocianinai atlieka lapų ląstelių fotoprotekcinę funkciją. Svarbus yra antocianinų gebėjimas veikti kaip UV filtras. Jie sugeria UV spindulius 280-315 nm intervale [47, 51, 52].

1.9.4. Flavonoidų medicininė reikšmė

Pastaruoju metu farmacijoje ir medicinoje plačiai tyrinėjami flavonoidai, nes jie veikia kaip stiprūs antioksidantai ir sunkiuosius metalus surišančios medžiagos. Flavonoidai pasižymi šiais poveikiais: priešuždegiminiu, antimikrobiniu, antialerginiu, hepatoprotekciniu, antidiabetiniu, kardioprotekciniu, priešvėžiniu [11, 49].

Antioksidacinis poveikis. Flavonoidai neutralizuoja laisvuosiuos radikalus, apsaugo nuo išeminių audinių pažeidimų ir nuo kitų oksidacinio streso sukeliamų ligų, mažina įvairias reaktyvias deguonies formas (ROS), įskaitant hidroksilo ir superoksido radikalus [53, 54]. Antioksidaciniam aktyvumui svarbi molekulės cheminė struktūra: dviguba jungtis tarp C2 ir C3, keto grupė prie C4,

hidroksilo grupės prie C3 ir C5. Žinoma, kad flavonoidų aglikonų formos pasižymi stipresnėmis antioksidacinėmis savybėmis nei glikozilintos formos [43, 55].

Priešuždegiminis poveikis. Flavononai ir flavonoliai slopina ūmų ir lėtinį uždegimą modeliuose su gyvūnais. Fenoliniai junginiai - kemferolis, kvercetinas, miricetinas ir fisetinas slopina ciklooksigenazę, lipooksigenazę ir fosfodiesterazę. Nustatyta, kad apigeninas, hesperidinas, luteolinas slopina uždegimą ir veikia analgetiškai. Flavonoidas rutinas veiksmingas esant lėtiniam uždegimui, kuris sukeltas adjuvantinio artrito [40, 43, 56].

Antimikrobinis ir antivirusinis poveikis. Nustatyta, kad polifenoliniai junginiai slopina 11 tipų virusų. Antivirusinį poveikį lemia junginio neglikozilinta forma ir hidroksi grupė C3 padėtyje. Išsiaiškinta, kad katechinai stipriau slopina ŽIV infekciją negu flavonai ir flavononai, o flavonoliai aktyviau slopina HSV-1 nei flavonai. Katechinai inhibuoja DNR polimerazes ir ŽIV-1 atvirkšines transkriptazes, o kai kurie flavonoidai ir ŽIV-1 proteinazes. Flavonoidai kartu su antivirusiniais ar antibakteriniais preparatais veikia sinergistiškai. In vitro tyrimai įrodė katechinų stiprų antibakterinį poveikį prieš Vibrio cholerae, Streptoccocus mutans, Shigella mikrobines kultūras. Manoma, kad flavonoidų struktūroje esantis B žiedas yra svarbus antibakteriniam poveikiui. Jis sudaro vandenilinius ryšius su nukleino bazėmis ir taip inhibuoja DNR ir RNR sintezę bakterijose [43, 57].

Antialerginis poveikis. Šis poveikis pagrįstas interleukinų IL-4 ir IL-13 ir bazofilų aktyvuotų ligandų CD40 inhibavimu. Flavonoidai slopina histamino išsiskyrimą ir leukotrienų sintezę. Apigeninas, luteolinas, fisetinas svarbiausi IL-4 ir IgE inhibitoriai [58, 59].

Poveikis virškinamajam traktui. Tyrimai parodė, kad flavonoidai skatina skrandžio opų gijimą. Jie mažina skrandžio gleivinės sekreciją, histamino kiekį, slopina H+

/K+ protonų siurblio veiklą. Žinomas flavonoido silimarino veiksmingumas gydant kepenų ligas, tačiau ir kiti fenoliniai junginiai yra potencialūs hepatoprotekciniai agentai. Pvz: rutinas apsaugo kepenis ir skatina jų ląstelių regeneraciją, eksperimentiškai sukeltoje cirozėje [40, 60].

Antidiabetinis poveikis. Flavonoidai skatina kasos ląstelių regeneraciją ir insulino išsiskyrimą taip padidinamas Ca2+

kiekį, kuris yra būtinas insulino gamybai [40].

Kardioprotekcinis poveikis. Širdies ir kraujagyslių apsaugantis poveikis siejamas su flavonoidų antioksidacinėmis, priešuždegiminėmis ir trombocitų agregaciją, lipidų peroksidaciją mažinančiomis savybėmis. In vitro atlikti tyrimai parodė, kad flavonoidai pagerina adheziją aortos endotelio ląstelėse, sutrikdo aterosklerozinių plokštelių susidarymą. Daugelis in vivo ir in vitro tyrimų patvirtino antitrombozinį poveikį dėl ciklooksigenazės ir lipooksigenazės slopinimo [56].

Priešvėžinis poveikis. Flavonoidai reguliuoja procesus, vykstančius organizme esant navikui: apoptozę, vaskuliarizaciją, ląstelių diferenciaciją ir proliferaciją. In vitro flavonoidai keičia fermentinių sistemų aktyvumą. In vivo tyrimų duomenys parodė, kad kai kurie flavonoidai slopina vėžinių ląstelių dalijimąsį ir navikų progresavimą [61, 62].

1.9.5. Laisvieji radikalai, antioksidantai ir atiradikalinis aktyvumas

Laisvieji radikalai (LR) tai nestabilios ir labai reaktyvios molekulės, turinčios neporinį elektroną. LR pažeidžia biologiškai svarbias molekules tokias kaip DNR, angliavandenius, baltymus ir lipidus. LR ląstelėse susidaro nuolat dėl fermentinių ir nefermentinių reakcijų. ROS tai įprasti žmogaus metabolizmo produktai, kurie mažais kiekiais yra nekenksmingi žmogaus organizmui, o dideliais kiekiais sukelia oksidacinį stresą. Dėl šios priežasties gali išsivystyti vėžys, aterosklerozė, kardiomiopatija, lėtinis širdies nepakankamumas, Alzhaimerio ir Parkinsono ligos, išsėtinė sklerozė, astma, lėtinė obstrukcinė plaučių liga, reumatoidinis artritas, inkstų ligos, katarakta, sutrikdomas vaisiaus vystymasis [54, 63, 64, 65].

Antioksidantai tai mažos molekulinės masės molekulės, kurios neutralizuoja ir stabilizuoja laisvuosius radikalus, nutraukdamos grandininę reakciją ir taip apsaugo ląsteles nuo pažeidimų. Jie klasifikuojami į fermentinius ir nefermentinius. Fermentiniai antioksidantai yra superoksido dismutazė, katalazė, glutationo peroksidazė, glutationo reduktazė. Nefermentiniai antioksidantai gali būti gaunami su maistu: vitaminu C, vitaminu E, karotinoidais, flavonoidais, omega-3 ir omega-6 riebalų rūgštimis. Nefermentiniems antioksidantams priskiriami ir metaboliniai, kurie susidaro medžiagų apykaitos metu – kofermentas Q10, L-argininas, bilirubinas, melatoninas. Antioksidantų veikimas grindžiamas dviem mechanizmais. Pirmasis mechanizmas susijęs su grandinės nutraukimo reakcija, kurios metu antioksidantas atiduoda elektroną laisvam radikalui. Antrasis remiasi reaktyvių deguonies ir azoto formų pašalinimu, slopinant grandininės reakcijos susidarymo katalizatorių [63, 64, 65]. Nauji duomenys rodo, kad kvercetinas, rutinas ir izokvercitrinas, kuriuos kaupia Sambucus nigra L. žaliava yra vieni stipriausių antioksidantų, efektyviai slopinantys lipidų peroksidaciją ir fermentus, ir pasižymi antihemoraginiu poveikiu [41, 66].

1.9.6. Antimikrobinio aktyvumo tyrimui in vitro naudotos bakterijų ir grybelių

kultūros

Micrococcaceae šeima. Šiai gramteigiamų mikroorganizmų šeimai priklauso Staphyloccocus gentis, kuriai priskiriamos 39 stafilokokų rūšys, tame tarpe Staphyloccocus aureus ir Staphyloccocus epidermidis, kurios yra normali žmogaus flora. S. aureus sukelia lokalizuotas odos infekcijas tokias kaip folikulitą, šunvotę, piktvotę, impetigą ir kitas infekcines ligas: endokarditą, osteomelitą, pielonefritą. S. epidermidis yra mažiau pavojinga bakterija, kuri sukelia hospitalines infekcijas [67].

Streptococcaceae šeima. Šiai gramteigiamų bakterijų šeimai priklauso Enteroccocus faecalis – tai natūrali žarnyno anaerobinė bakterija, ji yra atspari daugeliui antibiotikų. Ši bakterija sukelia įvairiais infekcijas, tokias kaip endokarditas, bakteriemija, tačiau dažniausiai sukeliamos yra šlapimo takų infekcijos [68].

Enterobacteriaceae šeima. Tai gramneigiamų bakterijų šeima, kuriai priklauso daugiau kaip 25 gentys ir 110 rūšių, o kliniškai reikšmingomis laikomos 20-25 enterobakterijų rūšys. Enterobakterijų šeimai priklauso Esherichia coli, Klebsiella pneumoniae (sudaro kapsulę), Proteus mirabilis (šliaužiančioji bakterija). E. coli yra normali žarnyno floros dalis. Ji yra dažniausia šlapimo takų infekcijos priežastis jaunoms moterims ir gali sukelti viduriavimą, sepsį, meningitą. K. pneumoniae yra kvėpavimo takuose ir žmogaus išmatose. K. pneumoniae ir P. mirabilis sukelia pneumoniją, bakteremiją ir šlapimo takų infekcijas [69].

Pseudomonaceae šeima. Šiai gramneigiamų bakterijų šeimai priklauso Pseudomonas aeruginosa. P. aeruginosa sukelia hospitalines infekcijas tiems pacientams, kuriems diagnozuota ŽIV, piktybiniai navikai, cukrinis diabetas, cistinė fibrozė. Ši gentis sukelia apatines kvėpavimo takų ligas, endokarditą, skrandžio ir žarnyno ir šlapimo takų infekcines ligas [70].

Bacillaceae šeima. Tai gramteigiamos, sporas sudarančios bakterijos, kuriai priklauso Bacillus subtilis ir Bacillus cereus. Šios bakterijos sukelia maisto intoksikacijas, lokalizuotas akių infekcijas susijusias su traumomis, giliasias minkšųjų audinių ir sistemines infekcijas, tokias kaip meningitas, osteomelitas, endokarditas ar bakteriemija [71].

Grybeliai. 8-15 proc. hospitalinių kraujo infekcijų sukelia Candida grybelis. Candida dažniausiai pasireiškia žmonėms, kurių imuninė sistema yra nusilpusi. Candida albicans dažniausiai aptinkamas grybelis, sukeliantis sistemines infekcines ligas tokias kaip kandidozė, odos ir gleivinės infekcijas, pvz: žarnyno, makšties, burnos kandidozes. Šis grybelis yra normali žmogaus žarnyno simbiotinė flora [72].

2. TYRIMŲ METODIKA

2.1. Tyrimo objektas

Tyrimų objektas – natūraliai augančių juoduogių šeivamedžių (Sambucus nigra L.) žiedų mėginiai rinkti 2013 m. birželio mėnesį skirtingose Lietuvos augavietėse ir pateikti 1 lentelėje.

1 lentelė. Sambucus nigra L. žiedų ėminių rinkimo datos ir vietos Eilės numeris Rinkimo data Žaliavos rinkimo vieta

1. 2013 06 12 Dembavos k., Panevėžio raj. sav.

2. 2013 06 05 Žvėrynas, Vilniaus m. sav.

3. 2013 06 09 Vijolių k., Šiaulių raj. sav.

4. 2013 06 15 Barzdūnų k., Šilutės raj. sav.

5. 2013 06 04 VDU botanikos sodas, Kauno m. sav.

6. 2013 06 16 Taurų k., Tauragės raj. sav.

7. 2013 06 20 Salantų m., Kretingos raj. sav.

8. 2013 06 05 Radivoniškių k., Vilniaus raj sav.

9. 2013 06 16 Ašmintų k., Prienų raj. sav.

10. 2013 06 25 Radiškių k., Šilalės raj. sav.

11. 2013 06 24 Girėnų k., Šakių raj. sav.

12. 2013 06 22 Rainių k., Telšių raj. sav.

13. 2013 06 15 Mosėdžio k., Skuodo raj. sav.

14. 2013 06 10 Trakiškių k., Marijampolės raj. sav.

15. 2013 06 15 Varnikių k., Trakų raj. sav.

Mėginiai rinkti 2013 – 2014 metų birželio mėnesį iš gamtinių cenopopuliacijų Juodkrantėje (Neringos savivaldybė, Klaipėdos apskritis) buvo naudojami cheminės sudėties dinamikos kitimų tyrimams.

Augalinė žaliava buvo džiovinta gerai vėdinamoje patalpoje, apsaugotoje nuo tiesioginių saulės spindulių. Išdžiovinta augalinė žaliava buvo laikoma popieriniuose maišeliuose, sausoje gerai vėdinamoje vietoje.

2.2. Naudotos medžiagos, reagentai ir mikroorganizmai

Retifikuotas etilo alkoholis 96,3 proc. V/V („Stumbras”, Lietuva); Aliuminio chloridas („Mezobenzon”, Danija);

Heksametilentetraminas („Sigma-Aldrich”, Anglija); Ledinė acto rūgštis („ЗАО Купавнареактив”, Rusija);

Praskiesta vandenilio chlorido rūgštis („Sigma-Aldrich”, Kanada); Rutino standartas („Carl Roth GmbH”, 76185, Vokietija);

DPPH reagentas („Sigma-Aldrich”, Vokietija); Miulerio – Hintono agaras („BBL”, JAV);

Antimikrobiniam tyrimui naudotos mikrobiologinės kultūros:  Stapyloccocus aureus ATCC 25923;

 Staphyloccous epidermidis ATCC 12228;  Enteroccocus faecalis ATCC 29212;  Escherichia coli ATCC 25922;

 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853;  Klebsiella pneumoniae ATCC 13883;  Bacillus cereus ATCC 11778;

 Bacillus subtilis ATCC 6633;  Proteus mirabilis ATCC 12453;  Candida albicans ATCC 10231.

2.3. Naudota aparatūra

Augalinė žaliava sumalta elektriniu malūnėliu („First”, Austrija). Žaliavos mėginiai sveriami elektroninėmis svarstyklėmis („Sartorius CP6M-0CE”, Vokietija). Nuodžiūvis nustatomas nuodžiūvio nustatymo aparatu („Swiss quality“, Šveicarija). Žaliavos ekstrakcija ir optimalių sąlygų nustatymas atliktas mechaninėje purtyklėje („Laboratory shaker 358S”, Lenkija) ir ultragarso vonelėje („Elmasonic P“, Vilnius). Bendras flavonoidų kiekis ir antiradikalinis aktyvumas nustatyti spektrofotometru („Beckman DU-70”, JAV). Antimikrobinio aktyvumo tyrimui buvo naudojamas šilumos cirkuliacinis termostatas („Binder”, Vokietija), drumstumo nustatymo aparatas ir mėgintuvėlių purtyklė („Eppendeorf Reasearch AG”, Vokietija).

2.4. Tyrimų metodai

2.4.1. Ekstraktų paruošimas

Išdžiovinti juoduogių šeivamedžių žiedai susmulkinami elektriniu malūnėliu į miltelius. Atsveriama po 1 g (±0,01) orasausės žaliavos, dedama į 25 ml talpos kolbutę ir užpilama 20 ml (±0,01) 30 proc. V/V etanoliu. Ekstrahuojama ultragarso vonelėje 10 min 50°C temperatūroje, užkimštuose tamsaus stiklo buteliukuose. Gauti ekstraktai filtruojami per popierinį filtrą ir išpilstomi į tamsaus stiklo buteliukus. Siekiant gauti tikslesnius rezultatus, tomis pačiomis sąlygomis, iš kiekvieno žaliavos mėginio yra pagaminami trys etanoliniai ekstraktai, atliekami pakartojimai ir apskaičiuojamas gautų rezultatų vidurkis.

2.4.2. Nuodžiūvio nustatymas vaistinėje augalinėje žaliavoje

Nuodžiūvis vertinamas remiantis Europos farmakopėjos straipsniu (Ph. Eur. 01/2005:1419). Atsveriamas 1 g (0,001 g tikslumu) žaliavos ir džiovinama 2 val 100-105°C temperatūroje iki pastovios masės.

Nuodžiūvis (proc.) apskaičiuojamas remiantis formule:

čia: - žaliavos masė gramais prieš džiovinimą; - žaliavos masė gramais po džiovinimo.

2.4.3. Spektrofotometrinis bendro flavonoidų kiekio nustatymas

Bendras flavonoidų kiekis nustatomas ekstraktą veikiant aliuminio chlorido tirpalu rūgščioje aplinkoje. Tirpalas parūgštinamas acto rūgšties tirpalu. Bendras flavonoidų kiekis vertinamas lyginant tiriamojo tirpalo absorbcijos koeficientą su rutino etanolinio tirpalo absorbcijos koeficientu.

Tiriamasis tirpalas ruošiamas į 25 ml matavimo kolbutę įpilama 2 ml paruošto juoduogių šeivamedžių etanolinio ekstrakto, 10 ml 96 proc. V/V etanolio, 0,5 ml 30 proc. vandenilo chlorido rūgšties tirpalo, 1,5 ml 10 proc. aliuminio chlorido tirpalo. Praėjus 30 min įpilama 2 ml 5 proc.

heksametilentetramino tirpalo ir kolbutės turinys skiedžiamas išgrynintu vandeniu iki žymės, sumaišoma. Gauto tirpalo absorbcijos dydis matuojamas prie 407 nm bangos ilgio.

Palyginamasis tirpalas ruošiamas: į 25 ml matavimo kolbutę įpilama 2 ml juoduogių šeivamedžių etanolinio ekstrakto, 10 ml 96 proc. V/V etanolio, 0,5 ml 30 proc. vandenilio chlorido rūgšties tirpalo ir kolbutės turinys praskiedžiamas išgrynintu vandeniu iki žymės.

Tokiomis pačiomis sąlygomis ruošiami etanolinio rutino tirpalo tiriamasis ir palyginamasis tirpalai, tačiau vietoje 2 ml juoduogių šeivamedžių etanolinio ektrakto, pilama 2 ml etanolinio rutino tirpalo. Etanolinis rutino tirpalas ruošiamas taip: 0,025 g rutino (tikslus svėrinys) tirpinama 30 proc. V/V etanolyje 25 ml talpos matavimo kolbutėje.

Flavonoidų kiekis žaliavoje, perskaičiuotas rutinu ir išreikštas procentais (X), apskaičiuotas pagal formulę:

– rutino masė gramais, sunaudota etanoliniam rutino tirpalui

VVAŽ –paruošto ekstrakto tūris mililitrais

DVAŽ – tiriamojo tirpalo absorbcijos dydis

mVAŽ – ekstrakto žaliavos svėrinio masė gramais

DR –rutino tiriamojo tirpalo absorbcijos dydis.

2.4.4. Spektrofotometrinis laisvojo DPPH radikalo surišimo metodas

Antiradikalinis aktyvumas įvertinamas ekstraktą veikiant DPPH tirpalu. Etaloninis DPPH tirpalas ruošiamas atsveriant 0,0024 g (0,0001g tikslumu) DPPH radikalo ir tirpinama 96,3 proc. V/V etanolyje 100 ml matavimo kolbutėje. Palaukiama kol nusistovi pastovi absorbcijos reikšmė ir matuojama esant 515 nm bangos ilgiui, kaip palyginamasis tirpalas naudojamas atitinkamos koncentracijos etanolis. Tiriamasis tirpalas ruošiamas į 50 µl ekstrakto įpilama 3 ml etaloninio DPPH tirpalo. Palyginamajam tirpalui imama 50 µl 30 proc. etanolio ir 3 ml DPPH tirpalo. Mišiniai laikomi tamsoje 30 min ir matuojamas mėginio šviesos absorbcijos sumažėjimas (bangos ilgis 518 nm).

Suminis antiradikalinis aktyvumas (proc.) apskaičiuojamas pagal formulę:

– tiriamojo tirpalo absorbcijos reikšmė – palyginamojo tirpalo absorbcijos reikšmė

2.4.5. Antimikrobinio poveikio nustatymas

Antimikrobiniam tyrimui pagaminamas etanolinis juoduogių šeivamedžių vaistinės augalinės žaliavos tirštasis ekstraktas santykiu 1:10. 20 g (±0,01) susmulkintos žaliavos užpilama 200 ml 30 proc. etanolio V/V ir ekstrahuojama ultragarsinėje vandens vonelėje 10 min. Gautas ekstraktas filtruojamas pro popierinį filtrą. Nufiltruotas ekstraktas supilamas į porceliano lėkštelę ir garinamas virš vandens vonelės, esant 50°C temperatūrai, kol gaunamas tamsiai rudos spalvos tirštasis ekstraktas. Paruošiamos 9 etaloninių mikroorganizmų suspensijos. Į mėgintuvėlius įpilama ~7 ml fiziologinio tirpalo. Steriliu tamponu dedama mikroorganizmų, kurie buvo 24 val. kultivuoti triptozės sojos agare, esant 35 - 37°C temperatūrai. Kultūrų suspensijos, pagal drumstumo standartą turi būti ~0,5 McFarlandʻo.

Miulerio – Hintono (angl. Mueller – Hinton) agaras kaitinamas 30 min sandariai uždarytoje stiklinėje kolboje, pamerktoje vandens vonelėje, iki ištirps. Skystas agaras talpinamas į 50ºC vandens vonelę, kad nesustingtų. Daromi ekstraktų skiedimai agare, įpiltame į Petri lėkšteles, gaunant 1-oje Petri lėkštelėje ekstrakto koncentracija 50 mg/ml, 2-oje Petri lėkšelėje ekstrakto koncentracija - 40 mg/ml, 3-oje Petri lėkšelėje ekstrakto koncentracija - 30 mg/ml, 4-oje Petri lėkšelėje ekstrakto koncentracija - 20 mg/ml, 5-oje Petri lėkšelėje ekstrakto koncentracija - 10 mg/ml ir 6-oje Petri lėkšelėje ekstrakto koncentracija - 5 mg/ml. Teigiama kontrolė atlikta sėjant etalonines kultūras į Miulerio – Hintono agarą Petri lėkštelėje. Petri lėkštelės palaikomos kambario temperatūroje, kol agaro sluoksnis sustingsta ir vėliau perkeliamos į termokamerą ir laikomos, kol apdžiūsta agaro paviršius. Paruoštos mikroorganizmų kultūrų suspensijos sėjamos sterilia kilpele į visas Petri lėkšteles. Pasėliai inkubuojami termokameroje 20 val. esant 35 - 37°C temperatūrai. Mikroorganizmų augimas vertinamas vizualiai, lyginant tiriamasias Petri lėkšteles su kontroline lėkštele, inkubuota tokiomis pačiomis sąlygomis.

Etanolinių tirštųjų ekstraktų poveikis vertinamas +/- sistema:

 „-” – mikroorganizmų kultūrų kolonijų augimas toks pats kaip kontrolinėje Petri lėkštelėje (antimikrobinio poveikio nėra);

 „-+“ – mikroorganizmų kultūrų kolonijų augimas dvigubai silpnesnis nei kontrolinėje Petri lėkštelėje (vidutinis antimikrobinis poveikis);

 „+” – mikroorganizmų kultūrų kolonijos neauga (maksimalus antimikrobinis poveikis).

2.4.6. Duomenų statistinis įvertinimas

Duomenų statistinis įvertinimas atliktas programomis „MS Excel 2007“ (Microsoft,

JAV) kompiuterine programa ir „SPSS 20.0“ (IBM, JAV) statistiniu paketu. Apskaičiuotas tyrimų duomenų matematinis vidurkis, standartinis nuokrypis ir statistinis duomenų reikšmingumas. Koreliacinių ryšių stiprumas nustatytas taikant Pirsono koreliacijos koeficientą.

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1. Vaistinės augalinės žaliavos nuodžiūvis

Sambucus nigra L. žiedų žaliavos žydėjimo fazės, surinkimo data ir nuodžiūvis pavaizduotas 2 lentelėje.

2 lentelė. Sambucus nigra L. žiedų nuodžiūvio įvairavimas tirtuose mėginiuose (n=3)

Žydėjimo fazė Rinkimo data Nuodžiūvis (proc.) ir SSN

Ūglių augimo pabaiga 2013 06 12 6,97 ± 0,1

Žydėjimo pradžia 2013 06 18 6,50 ± 0,3

Masinis žydėjimas 2013 06 24 6,77 ± 0,1

Žydėjimo pabaiga 2013 06 30 6,66 ± 0,2

Ūglių augimo pabaiga 2014 06 12 6,32 ± 0,1

Žydėjimo pradžia 2014 06 18 5,60 ± 0,2

Masinis žydėjimas 2014 06 24 6,47 ± 0,2

Žydėjimo pabaiga 2014 06 30 6,39 ± 0,1

Remiantis Europos farmakopėjos (Ph. Eur. 2.2.32) nuodžiūvio testu vaistinės augalinės žaliavos nuodžiūvis negali būti didesnis negu 10,0 proc. Gauti rezultatai rodo, kad nuodžiūvis žaliavoje svyruoja nuo 5,60 iki 6,97 proc. Atlikus analizę nustatyta, kad nuodžiūvis yra mažesnis negu 10 proc. Taigi tyrimui surinkti Sambucus nigra L. žiedų mėginiai atitinka nuodžiūviui taikomus Europos farmakopėjos reikalavimus.

3.2. Ekstrakcijos sąlygų optimizavimas

Ekstrakcijos sąlygų optimizavimas yra svarbus žingsnis norint užtikrinti ekstrakcijos efektyvumą. Ekstrakcijos sąlygos optimizuotos pagal šiuos parametrus: tinkamiausio poliškumo tirpiklio parinkimas, optimalaus ekstrakcijos laiko nustatymas, atliekant maceraciją purtyklėje ir ekstrakciją ultragarsinėje vonelėje, optimalios ektrakcijos temperatūros nustatymas.

Ekstrakcijos tirpiklio ir jo koncentracijos nustatymas. Norint gauti didžiausią veikliųjų junginių išeigą svarbu parinkti tinkamo poliškumo tirpiklį. Flavonoidų ekstrakcijai iš Sambucus nigra L. žiedų naudojami etanolio mišiniai su vandeniu ir metanolis. Tačiau dėl didelio metanolio

toksiškumo buvo pasirinkti šie tirpikliai: skirtingų koncentracijų etanolio ir vandens mišiniai V/V: 30 proc., 50 proc., 70 proc., 96 proc. ir atliekama maceracija 1 val. Optimalaus tirpiklio pasirinkimas nustatomas spektrofotometriškai ir vertinamas pagal bendrą flavonoidų kiekį. Rezultatai pateikti 8 paveiksle.

8 pav. Bendro Sambucus nigra L. flavonoidų kiekio įvairavimas naudojant skirtingą ekstrakcijos tirpiklio koncentraciją (n=3)

Tyrimo rezultatai parodė, kad didžiausia flavonoidų išeiga gauta naudojant 30 proc. etanolio tirpalą (2,41±0,10 proc.). Nustatyta, kad mažiausia flavonoidų išeiga gaunama naudojant 96 proc. etanolį (0,77±0,05 proc.). Remiantis gautais tyrimų duomenimis, tinkamiausias ekstrahentas yra 30 proc. etanolis (V/V) ir jis yra naudojamas tolimesniems tyrimamas. Europos komisijos direktyvos nurodymu 2001/83, tinkamiausias ekstrahentas yra 25 proc. etanolis (V/V) [14].

Optimalaus ekstrakcijos metodo ir laiko trukmės nustatymas.

Pagrindiniai ekstrakcijos metodai yra šie: maceracija purtyklėje, ekstrakcija ultragarsinėje vonelėje, ekstrakcija soksleto aparatu, ekstrakcija mikrobangomis, fermentinė ekstrakcija, superkritinių skysčių ekstrakcija ir suslėgta karšto vandens ekstrakcija [73]. Maceracija purtyklėje ir ekstrakcija ultragarsinėje vonelėje yra paprasti, lengvai atliekami ir plačiai taikomi ekstrakcijos metodai. Atliekant maceraciją purtyklėje kiekvienas ekstraktas maceruojamas skirtingais laiko intervalais: 5 min, 10 min, 15 min, 30 min, 1 val, 2 val, 24 val. Paskutinysis ekstraktas 2 val. maceruojamas ir paliekamas stovėti 24 val. tamsioje, vėsioje vietoje, apsaugotoje nuo saulės spindulių. Ekstrahentu naudotas 30 proc. (V/V) etanolis. Rezultatai pateikiami 9 paveiksle.

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 Distiliuotas vanduo

Etanolis 30% Etanolis 50% Etanolis 70% Etanolis 96%

B end ra s fl a v o n o id ų k iek is p ro c. Ekstrahentas V/V proc.

9 pav. Bendro Sambucus nigra L. flavonoidų kiekio įvairavimas maceruojant skirtingomis laiko trukmėmis (n=3)

Didžiausias bendras flavonoidų kiekis nustatytas atliekant maceraciją purtyklėje 1 val. (1,63±0,03 proc.). Maceruojant ilgiau nei 1 val. flavonoidų kiekis pradeda mažėti. Maceracija purtyklėje yra ilgai trunkantis procesas ir nėra toks efektyvus kaip ekstrakcija ultragarsu.

Ekstrakcija ultragarsinėje vonelėje atliekama kambario temperatūroje skirtingomis laiko trukmėmis: 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 25 min, 30 min. Ekstrahentu naudotas 30 proc. (V/V) etanolis. Rezultatai pavaizduoti 10 paveiksle.

10 pav. Bendro Sambucus nigra L. flavonoidų kiekio įvairavimas ekstrahuojant ultragarsinėje vonelėje skirtingomis laiko trukmėmis (n=3)

Efektyviausias ekstrakcijos laikas ultragarsinėje vonelėje yra 10 min, kadangi gaunama didžiausia flavonoidų išeiga

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8

5 min 10 min 15 min 30 min 1 val 2 val 24 val

B endra s fl a v o no idų k iek is pro c.

Maceracijos purtyklėje trukmė, min.

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0

5 min 10 min 15 min 20 min 25 min 30 min

B endra s fl a v o no idų k iek is pro c.

(2,46±0,07 proc.). Ekstrahuojant ilgiau negu 10 min ekstrakcijos efektyvumas mažėja ir gaunamas mažesnis bendras flavonoidų kiekis. Atliekant ekstrakciją ilgesnį laiką, gali atsirasti flavonoidų kokybiniai ir kiekybiniai struktūros pokyčiai [73].

Palyginus maceracijos purtyklėje ir ultragarsinėje vonelėje rezultatus, buvo pasirinktas metodas 10 min. ekstrakcija ultragarsu. Šis metodas yra efektyvesnis, nes gaunamas didesnis bendras flavonoidų kiekis ir ekstrakcijos laikas yra trumpesnis. Atliekant ekstrakciją ultragarsinėje vonelėje nustatytas didžiausias (2,46±0,03 proc.) bendras flavonoidų kiekis, o dinaminės maceracijos purtyklėje būdu tik (1,63±0,03 proc.).

Temperatūros įtaka flavonoidų ekstrakcijai. Norint išekstrahuoti didžiausią flavonoidų kiekį ir optimizuoti ekstrakcijos ultragarsinėje vonelėje metodą, svarbu įvertinti temperatūros įtaka flavonoidų išeigai. Ekstrakcija ultragarsinėje vonelėje atliekama, esant skirtingai temperatūrai: 20°C, 30°C, 40°C, 50°C, 60°C, 70°C, 80°C. Ekstrahentas naudotas 30 proc. (V/V) etanolis. Rezultatai pateikti 11 paveiksle.

11 pav. Bendro Sambucus nigra L. flavonoidų kiekio įvairavimas ekstrahuojant ultragarsinėje vonelėje esant skirtingai temperatūrai (n=3)

Nustatytas didžiausias bendras flavonoidų kiekis yra (2,47±0,06 proc.), esant 50°C temperatūrai. Didinant temperatūrą, flavonoidų kiekis pradeda mažėti, nes didinant temperatūrą gali skilti flavonoidai ir gaunama mažesnė jų išeiga [74]. Todėl tolimesniems tyrimams pasirinkta 50°C temperatūra.

Gauti rezultatai skiriasi nei anksčiau atliktų mokslininkų darbuose. Dawidowicz & Wianowska (2009) palygino Sambucus nigra L. žiedų mėginių optimalų ekstrakcijos metodą, atliekant pagreitintą ekstrakciją tirpikliais ir maceraciją purtyklėje. Tyrimo rezultatai parodė, kad pagreitintos ekstrakcijos tirpikliais metodas yra efektyvesnis, nes buvo gauta didesnė flavonoidų išeiga: rutino

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 20°C 30°C 40°C 50°C 60°C 70°C 80°C B endra s fl a v o no idų k iek is pro c.

2,875 proc., izokvercitrino – 0,114 proc., palyginus su maceracijos purtyklėje metodu: rutino 2,051 proc, izokvercitrino – 0,114 proc. Pagreitintos ekstrakcijos tirpikliais metodu buvo pasirinktas kitas ekstrahentas - 80 proc. (V/V) metanolis ir temperatūra - 100°C, tačiau nustatyta tokia pati optimali ekstrakcijos trukmė kaip ir mūsų atliktame tyrime – 10 min. [74]. Diankov & Parlapanska (2013) spektrofotometrijos metodu nustatė, kad optimali ekstrakcijos trukmė yra 120 min. Tyrimo metu buvo naudotas tirpiklis 50 proc. etanolis ir tiriami 10 min, 20 min, 30 min, 40 min, 60 min, 90 min, 120 min. laiko intervalai. Nustatyta, kad po 120 min. gauta didžiausia polifenolinių junginių išeiga – 2,312 gGA/L [75]. M. Kurzawa (2010) efektyviosios skysčių chromatografijos metodu ištyrė Sambucus nigra

L. žiedų metanolinių ekstraktų (1:9) rūgščioje vandenilio chlorido terpėje optimalų ekstrakcijos laiką. Nustatyta, kad optimalus ekstrakcijos laikas yra 6 val, nes buvo gauta didžiausia rutino koncentracija 48,23 mg/g (4,82 proc.) [76]. Aptartų autorių ir šio tyrimo metu gautų rezultatų skirtumus galėjo sąlygoti skirtingos tyrimo metodikos, tiriami laiko intervalai, tirpikliai, žaliavos kiekiai.

Taigi galima daryti išvadą, kad optimaliausios ekstrakcijos sąlygos juoduogių šeivamedžių žiedų ėminiuose yra 10 minučių trukmės ekstrakcija ultragarsinėje vonelėje, palaikant 50°C temperatūrą ir kaip ekstrahentą naudojant 30 proc. V/V etanolį.

3.3. Flavonoidų kiekybinės sudėties kitimo dinamika Sambucus nigra L. augalo

žydėjimo fazėmis

Flavonoidų kiekybinės sudėties pokyčiai žieduose augalo žydėjimo fazėmis nustatyti spektrofotometriškai. Tyrimams naudojami mėginiai surinkti iš gamtinių cenopopuliacijų Juodkrantėje (Neringos savivaldybė, Klaipėdos apskritis) 2013 – 2014 metų birželio mėnesiais. Nustatyta, kad 2014 metais šeivamedžių žiedų etanoliniuose ekstraktuose yra didesnis bendras flavonoidų kiekis negu 2013 metais. Bendro flavonoidų kiekio kitimo dinamika pavaizduota 12 paveiksle.