RISULTATI Capitolo 3

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42 Capitolo 3

RISULTATI

3.1 Vitalità cellulare

Il saggio dell’LDH misura la quantità totale di lattato deidrogenasi (LDH), un enzima citoplasmatico, rilasciato dalle cellule quando la membrana cellulare è danneggiata.

Le cellule presenti sulla superficie apicale della membrana delle transwell e della membrana all’interno dell’holder hanno una vitalità compresa tra il 70 ed il 90 % sia durante i 21 giorni di coltura che dopo le 24 ore di esperimento.

Anche dopo essere state sottoposte, durante l’esperimento dinamico, ad un flusso di 100 µL/min con il mezzo di coltura per 24 ore sono state confermate le percentuali relative alla vitalità delle cellule (Figura 13).

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Figura 13 : Confronto vitalità cellulare Caco-2 in statico ed in dinamico durante la coltura cellulare e dopo il

tempo di svolgimento dell’esperimento.

3.2 Integrità e funzionalità della barriera epiteliale (Caco-2)

3.2.1 Misura della resistenza elettrica transepiteliale

L’incremento della TEER (Trans Epithelial Electrical Resistance), cioè il cambiamento di permeabilità, mostra la formazione, durante i primi giorni di coltura cellulare, della barriera epiteliale; l’integrità e la funzionalità del monostrato è stata mantenuta e la formazione delle tight junction è stata valutata nei giorni seguenti e dopo l’esperimento sia in statico che in dinamico (Figura 14).

Le cellule Caco-2 mantengono le loro proprietà di membrana durante la coltura cellulare e gli esperimenti mostrando un valore costante di TEER intorno a 1800 Ω [57].

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Figura 14 : Misurazione Teer di cellule Caco-2 in coltura in transwell ed in holder; i dati sono espressi come

valori di resistenza (Ohm).

3.2.2 Marcatura dei nuclei e delle giunzioni cellulari (ZO-1)

La vitalità delle cellule e l’integrità del monostrato è stata confermata dall’analisi morfologica delle Caco-2 utilizzando un microscopio a fluorescenza (Figura 15).

Il saggio immunocitochimico è stato effettuato sia dopo i 21 giorni di coltura cellulare all’interno del bioreattore, che dopo l’esecuzione dell’esperimento sulle membrane dell’holder dove era stata effettuata la coltura cellulare e dopo le 24 ore di flusso per la valutazione del passaggio di fluoresceina.

Sono state prese come riferimento immagini ottenute da coltura di 21 giorni di cellule Caco-2 su vetrino.

Le cellule crescono sulla membrana semipermeabile in policarbonato che è stata utilizzata per tutti gli esperimenti di permeabilità.

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A C

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E

Figura 15 : microscopia a fluorescenza di cellule Caco-2 dopo 21 giorni di coltura in statico (A) e (B) e

dopo 24 h in condizioni dinamiche con flusso a velocità di 100 µL/min (C) e (D); obiettivo 20X. Immagine tridimensionale eseguita con microscopio confocale (E); obiettivo 20X; in DAPI sono stati osservati i nuclei (blu), mentre le tight junction, in particolare ZO-1, è stata osservata in Tritc (rosso).

3.3 Confronto del passaggio di fluoresceina in statico con e senza cellule

Nelle transwell, in assenza di cellule, è stata mostrata un’evidente diminuzione della concentrazione di fluoresceina dalla zona apicale.

Nella zona basolaterale la concentrazione di fluoresceina invece è aumentata, indice del passaggio della sostanza attraverso la membrana semipermeabile.

Nel caso in cui sono state coltivate le cellule sulla superficie apicale della membrana all’interno delle transwell, il passaggio di fluoresceina dalla zona superiore a quella inferiore è stato molto ridotto (Figura 16).

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Figura 16 : Passaggio di fluoresceina dalla zona apicale a quella basolaterale delle transwell in assenza ed in

presenza di cellule; confronto tra l’esperimento in statico in assenza e in presenza della barriera epiteliale (Caco-2).

3.4 Confronto del passaggio di fluoresceina in dinamico con e senza cellule

In dinamico è stato osservato il passaggio di fluoresceina sia in assenza, che in presenza di cellule.

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Il flusso garantisce il passaggio della sostanza anche alla presenza della barriera epiteliale sulla superficie apicale della membrana inserita, tramite l’holder, nel bioreattore.

È stato osservato un decremento della concentrazione di fluoresceina nel tempo nella camera superiore ed un aumento in quella inferiore del bioreattore (Figura 17).

A

B

Figura 17 : Andamento in dinamico della concentrazione di fluorescceina nel tempo sia per il circuito

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3.5 Confronto del passaggio di fluoresceina in statico ed in dinamico

Un passaggio di fluoresceina significante attraverso la sola membrana con poro di diametro 0,4 µm è stato rilevato sia durante il tempo dell’esperimento in condizioni di statico, sia in dinamico.

In assenza di cellule, in statico il tempo di scomparsa della fluoresceina dalla camera superiore del bioreattore è minore come dimostra l’andamento del grafico; in dinamico l’andamento, che indica la diminuizione della sostanza nel tempo dalla camera superiore, è invece più graduale (Figura 18 A).

Questo risultato è stato confermato monitorando l’andamento nella camera inferiore del bioreattore; in statico l’aumento della concentrazione di fluoresceina è più rapido, mentre in dinamico questo avviene in modo più graduale. In statico un elevato passaggio di fluoresceina è stato valutato dopo 4 ore dall’inizio dell’esperimento, mentre in dinamico gli stessi valori sono stati raggiunti tra le 7 e 24 ore dall’inizio dell’esperimento (Figura 18 B).

In statico il passaggio dalla camera superiore a quella inferiore del bioreattore è quasi nullo se sulla superficie apicale della membrana vengono seminate e coltivate le cellule Caco-2 (Figura 18 C).

Al contrario la barriera epiteliale che è stata formata sulla superficie apicale della membrana non impedisce il passaggio della fluoresceina in dinamico; il flusso garantisce una maggiore permeabilità della sostanza esaminata attraverso il monostrato cellulare (Figura 18 D).

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A

B

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D

Figura 18 : diminuzione della concentrazione di fluoresceina dalla camera superiore del bioreattore in statico

ed in dinamico senza (A) e con cellule (B); aumento della concentrazione nella camera inferiore del bioreattore in statico ed in dinamico senza (C) e con cellule (D).

3.6 Crescita e vitalità su membrane in acrilato

Sulla superficie delle membrane in acrilato le cellule Caco-2 sono state seminate e mantenute in coltura per 21 giorni, monitorando la vitalità e lo sviluppo cellulare con il microscopio ottico; la membrana è trasparente e lo spessore è ridotto.

Le cellule hanno una buona aderenza e vitalità sul materiale testato durante i primi giorni di coltura sia in presenza di coating che a diretto contatto con la membrana (Figura 19 ).

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A B

C

Figura 19 : Caco-2 coltivate su membrana elettroattiva in acrilato dopo 0 giorni dalla semina con coating di

collagene (A), con coating di gelatina (B) e a diretto contatto con la membrana (C); obiettivo 20X.

Dopo 7 giorni, a partire dalla semina, l’epitelio cellulare si è formato sulla superficie della membrana. Le cellule continuano a crescere e svilupparsi ed è stata notata la formazione di “domes” (Figura 20 ).

Durante il differenziamento delle Caco-2 si instaura trasporto di ioni e di acqua per via transepiteliale, dal dominio apicale verso la superficie basolaterale e questo accumulo di fluido porta alla formazione dei “domes” su substrati impermeabili, come le membrane di acrilato che sono state utilizzate.

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Lo studio della formazione dei “domes” nei monostrati di cellule Caco-2 è correlato alla differenziazione degli enterociti ed alle proprietà di trasporto [58].

A B

Figura 20 : Caco-2 su membrana acrilato dopo 7 giorni di coltura cellulare su coating di collagene (A) ed a

diretto contatto con l’acrilato (B); obiettivo 10X.

Dopo 14 giorni le cellule continuano a crescere ed al termine dei 21 giorni della coltura cellulare continuano a rimanere adese sulla superficie della membrana (Figura 21 ).

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C D

Figura 21 : Caco-2 su membrana acrilato dopo 14 giorni di coltura con coating di collagene (A) e senza

coating (B); cellule dopo 21 giorni con coating di collagene (C) e senza (D); obiettivo 20X.

3.7 Integrità barriera epiteliale: marcatura citoscheletro con Rodamina- Falloidina

Alla fine del periodo di crescita e differenziamento è stato fatto un saggio immunocitochimico, marcando i nuclei delle cellule con il DAPI (blu) ed il citoscheletro con la Rodamina-Falloidina (rosso), come indicatore del differenziamento e dell’integrità del monostrato epiteliale.

Dopo 14 giorni i filamenti del citoscheletro sono presenti, ma non sono così netti e sviluppati come quelli che possiamo notare in una coltura di 21 giorni. Inoltre è stato notato che il citoscheletro nelle colture con il coating di collagene nell’arco dei 21 giorni appare più sviluppato e meglio delineato rispetto alla coltura cellulare senza coating (Figura 22 ).

L’actina rivelata con rodamina-falloidina può essere utilizzata come indicatore per studiare l’integrità delle tight-junction, dato che la distribuzione dell’actina spesso (ma non sempre) è correlata con il cambiamento delle proprietà delle tight-junction [26].

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