LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
FARMACIJOS FAKULTETAS
KLINIKINĖS FARMACIJOS KATEDRA
GABRIELĖ BARTULYTĖ
EMULSINIŲ SISTEMŲ SU MEDETKŲ ALIEJINIU EKSTRAKTU
MODELIAVIMAS IR KOKYBĖS VERTINIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Doc. dr. Asta Marija Inkėnienė
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
FARMACIJOS FAKULTETAS
KLINIKINĖS FARMACIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas Ramunė Morkūnienė Data
EMULSINIŲ SISTEMŲ SU MEDETKŲ ALIEJINIU EKSTRAKTU
MODELIAVIMAS IR KOKYBĖS VERTINIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Doc. dr. Asta Marija Inkėnienė Data
Recenzentas Darbą atliko
Magistrantė Gabrielė Bartulytė
Data Data
TURINYS
SANTRUMPOS ... 7
ĮVADAS ... 8
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 9
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10
1.1. Emulsijos ... 10
1.2 Emulsikliai ... 12
1.3. Emulsijų stabilumas ... 13
1.4. Linų sėmenų aliejus ... 14
1.5. Vaistinė medetka – Calendula officinalis ... 16
1.6. Bioaktyvių junginių ekstrakcija ir jos tipai ... 19
1.6.1. Maceracija ... 19
1.6.2. Perkoliacija ... 19
1.6.3. Ekstrakcija naudojant ultragarsą ... 20
1.6.4. Ekstrakcija mikrobangomis ... 20
1.7. Aliejaus ekstraktai ... 20
2. TYRIMO METODIKA IR METODAI ... 22
2.1. Naudojamos medžiagos ir įranga ... 22
2.1.1. Naudojamos medžiagos ... 22
2.1.2. Naudojama įranga ... 22
2.2. Aliejinio ekstrakto paruošimas ... 23
2.2.1. Maceracija ... 23
2.2.2. Ekstrakcija ultragarsu ... 23
2.2.3. Ekstrakcija mikrobangomis ... 24
2.3. Karotinoidų nustatymas medetkų žaliavoje ... 24
2.4. Flavonoidų nustatymas aliejiniame ekstrakte ... 24
2.5. Fenolinių junginių nustatymas aliejiniame ekstrakte ... 25
2.6. Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas aliejiniuose ekstraktuose pagal DPPH (2,2–difenil–1– pikrilhidrazil–hidrato) radikalų surišimo metodą ... 25
2.7. Aliejinių ekstraktų organoleptinis vertinimas ... 26
2.8. Emulsijų gamyba ... 26
2.9. Emulsijų pH reikšmės vertinimas ... 27
2.10. Dinaminės klampos nustatymas emulsinėse sistemose ... 28
2.12 Fenolinių junginių atpalaidavimo iš emulsinių sistemų tyrimas in vitro ... 28
2.13. Flavonoidų atpalaidavimo iš emulsinių sistemų tyrimas in vitro ... 29
2.14. Emulsijų mikrostruktūros nustatymas ... 29
2.15. Statistinė analizė ... 29
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 30
3.1. Ekstrakcijos metodo parinkimas ir skirtingų žaliavų palyginimas ... 30
3.1.1. Medetkų žaliavos palyginimas ... 30
3.1.2. Karotinoidų nustatymas medetkų žaliavoje ... 31
3.1.3. Aliejinių ekstraktų organoleptinių savybių palyginimas ... 32
3.1.4. Bendro flavonoidų kiekio nustatymas aliejiniuose ekstraktuose ... 33
3.1.5. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas ekstraktuose ... 35
3.2. Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas, pagamintuose ekstraktuose, pagal DPPH (2,2–difenil–1– pikrilhidrazil–hidrato) radikalų surišimo metodą. ... 37
3.3. Sumodeliuotų emulsijų su pagamintu aliejiniu ekstraktu kokybės vertinimas ... 39
3.3.1. Emulsijų gamyba ir stabilumas ... 39
3.3.2. Sumodeliuotų emulsijų mikrostruktūros vertinimas ... 41
3.3.3. Emulsijų pH reikšmės vertinimas ... 43
3.3.4. Dinaminės klampos vertinimas ... 44
3.4. Bendras flavonoidų ir fenolinių junginių atpalaidavimo tyrimas in vitro iš emulsinių sistemų ir aliejinio ekstrakto per pusiau pralaidžią membraną ... 45
3.4.1. Flavonoidų atpalaidavimo iš emulsinių sistemų ir aliejinio ekstrakto tyrimas in vitro ... 45
3.4.2. Fenolinių junginių atpalaidavimo iš emulsinių sistemų ir aliejinio ekstrakto tyrimas in vitro ... 46
IŠVADOS ... 51
SANTRAUKA
G. Bartulytės magistro baigiamasis darbas „Emulsinių sistemų su medetkų aliejiniu ekstraktu modeliavimas ir kokybės vertinimas“. Mokslinė vadovė doc. dr. A. M. Inkėnienė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Klinikinės farmacijos katedra. Kaunas, 2019.
Tyrimo tikslas – sumodeliuoti emulsines sistemas, panaudojus linų (lot. Linum usitatissimum) sėmenų aliejaus ir augalinės žaliavos – medetkų (lot. Calendula officinalis) žiedų aliejinį ekstraktą.
Uždaviniai – remiantis moksline literatūra ir eksperimentu parinkti tinkamą ekstrakcijos metodą ir palyginti skirtingų kokybių medetkų žaliavas bei įvertinti ir palyginti medetkų aliejinio ir etanolinių ekstraktų antioksidacinį aktyvumą pagamintuose ekstraktuose. Iš pagaminto aliejinio ekstrakto sumodeliuoti emulsiją a/v ar v/a ir atlikti kokybės vertinimą; įvertinti sumodeliuotų emulsinių sistemų stabilumą pagal pasirinktus kriterijus (klampa, flavonoidų kiekis, pH reikšmė) taip pat įvertinti flavonoidų ir fenolinių junginių atpalaidavimą iš sumodeliuotų a/v ir v/a emulsinių sistemų ir aliejinio ekstrakto per pusiau pralaidžią membraną biofarmaciniu tyrimu in vitro ir nustatyti skirtingų tipų emulsijų ir aliejaus įtaką fenolinių junginių ir flavonoidų atpalaidavimo greičiui.
Darbo objektas – emulsinės sistemos su pagamintu linų sėmenų aliejaus ir medetkų žaliavos aliejiniu ekstraktu.
Metodai – bendras fenolinių junginių ir flavonoidų kiekis aliejiniuose ekstraktuose vertinamas spektrofotometriškai. Pagaminto aliejinio ekstrakto ir pagamintų emulsinių sistemų antioksidacinis aktyvumas vertinamas spektrofotometriniu DPPH metodu. Emulsijų stabilumas ir kokybė vertinama nustatant dinaminę klampą, pH reikšmę, atpalaiduotą bendrą fenolinių junginių ir flavonoidų kiekį atliekant biofarmacinį tyrimą in vitro.
Iš gautų tyrimo rezultatų ir išvadų nustatyta, kad didžiausias bendras flavonoidų kiekis nustatomas, kai ekstraktai gaminami maceracijos metodu, o didžiausias bendras fenolinių junginių kiekis nustatomas, kai aliejiniai ekstraktai gaminami ultragarsinės ekstrakcijos metodu. Tyrimų rezultatai parodė, kad didžiausiu antioksidaciniu aktyvumu pasižymi, kai aliejiniai ekstraktai gaminti ekstrakcija mikrobangomis. Emulsinės sistemos a/v ar v/a su pagamintu aliejiniu ekstraktu, yra stabiliausios, kai pasirinkti emulsikliai: Span 80 ir Tween 80. Tyrimų metu nustatyta, kad atliekant bendrą fenolinių junginių atpalaidavimo tyrimą in vitro, daugiau fenolinių junginių atpalaiduojama, kai akceptorinė terpė parenkama 70proc. etanolis. Didžiausias bendras fenolinių junginių atpalaiduotas kiekis po 3 val. buvo iš a/v emulsijų, bendras flavonoidų kiekis po 3 val. buvo iš emulsijos Nr. 1. Eksperimentinio tyrimo metu nustatyta, kad mažesne pH reikšme pasižymi a/v tipo emulsinės sistemos, o didesne klampa pasižymi taip pat a/v tipo emulsijos.
SUMMARY
Master’s final thesis project by G.Bartulyte on ‘’Modelling and Quality Assessment of Emulsion Systems with Calendula Oil Extract’’. Associate Professor Doc. Dr. A. M. Inkeniene; The Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, Department of Clinical Pharmacy. Kaunas. 2019.
The aim of the study was to model emulsion systems, using linseed oil (lot. Linum usitatissimum) and raw plant material – calendula (lot. Calendula officinalis) petal oil extract
Research goals were to firstly select the appropriate extraction method based on scientific literature and performed experiments. Secondly, to compare raw calendula materials of different qualities by evaluating and comparing antioxidant activity of calendula oil and ethanol extracts in produced extracts. Thirdly, to perform a quality assessment for modelled oil extract emulsion o/w (oil/water) or w/o (water/oil); then to evaluate the stability of modeled emulsion systems according to selected criteria as well as to evaluate the release of flavonoids and phenolic compounds from modeled emulsion systems and oil extracts using biopharmaceutical in vitro analysis. Lastly, to determine the impact of different emulsion and oil types for the release rate of phenolic compounds and flavonoids.
The object of the study – emulsijon systems of calendula petal material and linseed oil extraction.
Methods of use – phenolic compounds and flavonoids in oil extracts is evaluated spectrophotometrically. Furthermore, the antioxidant activity of linseed oil and produced emulsion systems is assessed by the use of spectrophotometric DPPH method. Lastly, the stability and quality of the emulsions is assessed by determining the dynamic viscosity, pH value, the total amount of released phenolic and flavonoid compounds, by carrying out invitro analysis through cellulose membrane.
The results and conclusions of the study have found that the maximum amount of flavonoids is determined when maceration method is used to produce the extracts and the maximum amount of phenol compounds is determined when the oil extracts were produced by the ultrasonic extraction method. Research has shown that the highest antioxidant activity is reached when oil extracts are produced by extraction via micro – waves. The emulsion systems of o/w or w/o produced with the oil extract are the most stable when the Span 80 and Tween 80 emulsifiers are selected. Studies have also shown that during release analysis of combined phenolic compounds in vitro more phenolic compounds are being released when the acceptor medium is selected to be 70proc. ethanol. The maximum amount of total released phenolic compounds after 3 hours was reached from o/w emulsions, and the maximum total amount of flavonoids was reached from emulsion No.1. The experimental study has found that the lower pH is characterized by the o/w type emulsion system and the higher viscosity is found in the o/w type emulsion.
SANTRUMPOS
a/v – aliejus vandenyjeALA – α–linoleno rūgštis
DPPH – 2,2–difenil–1–pikrilhidrazilas
FRAP – geležies redukcijos antioksidacinė galia GRE – galo rūgšties ekvivalentas
HLB – hidrofilinis – lipofilinis balansas RE – rutino ekvivalentas
Span 20 – sorbitano monolauratas Span 80 – sorbitano monooleatas
Tween 80 – polioksietilen(20) – sorbitano monooleatas v/a – vanduo aliejuje
ĮVADAS
Šiuo metu, kai žmonių susidomėjimas ekologija ir natūraliomis priemonėmis vis didėja, stengiamasi į rinką įvesti vis daugiau dermatologinių preparatų, kurie būtų pagaminti iš kuo natūralesnių, ekologiškesnių produktų. Šiame tyrime panaudoti du pagrindiniai objektai: linų sėmenų aliejus ir medetkų žiedai yra natūralūs ir gana dažnai sutinkami Lietuvoje, todėl produktą daro priimtinesnį mūsų visuomenei.
Linų sėmenų aliejus yra gan patrauklus dėl savo sudėties, todėl jis gali būti vartojamas ne tik į vidų, bet ir ant odos. Linų sėmenų aliejus dėl savo praturtintos sudėties gali būti naudojamas esant odos uždegiminėms reakcijoms, nes pasižymi priešuždegiminiu poveikiu. Linų sėmenų aliejus savo sudėtyje turi didelį kiekį riebalų rūgščių, tai reikalinga norint užtikrinti ląstelių struktūrą odos pralaidumą, skatinami odos regeneraciniai procesai. [42]
Medetkų žiedų žaliava pasižymi priešuždegiminės, žaizdų gijimą skatinančiomis savybėmis [41]. Dėl šio poveikio, medetkų žiedų žaliava buvo pasirinkta kaip veikliosios medžiagos idėja.
Tiek linų sėmenų aliejus, tiek medetkų žaliava pasižymi panašiu ir vienas kitą papildančiu poveikiu, todėl tiriamojo darbo metu norima sukurti kokybišką, stabilų, dermatologinį preparatą iš natūralių komponentų, nes ekstrahuojant medetkas linų sėmenų aliejumi, aliejų galima dar labiau praturtinti biologiškai aktyviomis medžiagomis.
Aliejiniai ekstraktai iš linų sėmenų aliejaus ir medetkų žiedų žaliavos gaminami trimis būdais: maceracija, ekstrakcija ultragarsu, ekstrakcija mikrobangomis. Atlikus pagamintų aliejinių ekstraktų vertinimą, galiausiai emulsijos gaminamos su ultragarsinės ekstrakcijos metodu pagamintais ekstraktais, nes tai gana naujas, inovatyvus metodas, nereikalaujantis daug laiko ir galima naudoti ekologiškus tirpiklius, šiuo atveju – linų sėmenų aliejų.
Tyrimo objektas – emulsinės sistemos su pagamintu linų sėmenų aliejaus ir medetkų žaliavos aliejiniu ekstraktu.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Tikslas: Sumodeliuoti emulsines sistemas su linų (lot. Linum usitatissimum) sėmenų aliejumi juo
išekstrahavus vaistinę augalinę žaliavą – medetkų (lot. Calendula officinalis) žiedus ir įvertinti kokybę.
Uždaviniai:
1. Remiantis moksline literatūra ir atliktų mokslinių tyrimų rezultatais, parinkti tinkamą ekstrakcijos metodą bei jį pritaikyti skirtingų kokybių medetkų žaliavoms ekstrahuoti.
2. Įvertinti ir palyginti medetkų aliejinio ir etanolinio ekstraktų antioksidacinį aktyvumą pagamintuose ekstraktuose.
3. Sumodeliuoti a/v arba v/a tipo emulsiją su pagamintu aliejiniu ekstraktu ir atlikti kokybės vertinimą. Sumodeliuotų emulsinių sistemų pagal pasirinktus kriterijus (klampa, flavonoidų kiekis, pH reikšmė) stabilumo įvertinimas.
4. Įvertinti flavonoidų ir fenolinių junginių atpalaidavimą iš sumodeliuotų a/v ir v/a emulsinių sistemų in vitro ir nustatyti emulsijos tipo ir aliejaus įtaką fenolinių junginių ir flavonoidų atpalaidavimo kinetikai.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Emulsijos
Emulsiją galima apibrėžti kaip laisvo dispersiškumo sistemą, sudarytą iš 2 nesimaišančių skysčių, 2 fazių, iš kurių viena fazė yra disperguota ir išsisklaidžiusi lašelių pavidalu (dispersinė fazė) kitoje fazėje (dispersinėje terpėje). Emulsija gali būti sudaryta iš dviejų visiškai nesimaišančių skysčių arba iš dviejų ribotai susimaišančių skysčių [2,9].
Skiriami 2 pagrindiniai emulsijų tipai:
1. pirmoji – a/v (aliejus–vandenyje) (1 pav.), tai tiesioginė I tipo emulsija, kai riebalų lašeliai yra išsisklaidę vandenyje. Šio tipo emulsijos yra neriebios ir lengvai pašalinamos nuo odos. Išoriškai, ant odos, naudojamos norint suteikti „šaldantį“ efektą, o naudojant į vidų – lengviau užmaskuoti nemalonų aliejaus skonį;
2. antroji – v/a (vanduo–aliejuje) (1pav), tai atvirkštinė, II tipo emulsija, kuomet dispersinė terpė (aliejus) yra išsklaidomas dispersinėje fazėje (vandenyje). Šio tipo emulsijos dermatologiškai naudojamos norint išvengti drėgmės garavimo nuo odos paviršiaus [2,9,10,13].
1 pav. a/v ir v/a tipų emulsijos [9]
2 pav. A – daugiafazė emulsija – vanduo aliejuje vandenyje B – daugiafazė emulsija – aliejus vandenyje aliejuje
Pirmoji, pažymėta a raide – tai daugiafazė emulsija – vanduo aliejuje vandenyje (v/a/v). Šiuo atveju, vandens lašeliai yra išsklaidyti aliejaus lašeliuose ir visa tai yra dispersinėje terpėje – vandenyje. Antroji, pažymėta b raide, daugiafazė emulsija – aliejus vandenyje aliejuje. Šiuo atveju, aliejaus lašeliai išsklaidyti vandens lašeliuose ir visa tai yra dispersinėje terpėje – aliejuje. Tai sudėtingesnės emulsinės sistemos [11,12].
Įprastos emulsijos (makroemulsijos), priešingai nei mikroemulsijos, yra termodinamiškai nepalankios sistemos, nestabilios, nes jos turi savybę skilti esant įvairiems fizikocheminiams mechanizmams (1 lentelė). Makroemulsijos plika akimi žiūrint yra drumstos, nepermatomos, neskaidrios, tai lemia, kad lašelių matmenys yra tokio paties dydžio kaip ir šviesos bangos ilgis (d ≈ λ), šviesos išsklaidymas yra gana stiprus. Taigi, kuo mažesnis lašelių dydis, tuo stabilesnė emulsija, tačiau jei lašelių dydis yra šiek tiek didesnis, egzistuoja medžiagos, kurios padeda pagaminti emulsiją stabilią ilgesniam laiko tarpui, tai – stabilizatoriai, pavyzdžiui, emulsikliai [7,12,25].
1 lentelė. Emulsijų, pagamintų iš vandens ir aliejaus, savybės [25]
Emulsijos tipas Lašelių skersmuo Termodinaminis stabilumas
Paviršiaus ir masės
santykis (m2/g) Išvaizda
Makroemulsija 0,1–100 μm Nestabili 0,07–70 Nepermatoma
Nanoemulsija 20–100 nm Nestabili 70–330 Skaidri
1.2 Emulsikliai
Emulsikliai – tai medžiagos, naudojamos stabilizuoti emulsiją bei norint išsklaidyti du nesimaišančius skysčius. Tai trečiasis reikalingas komponentas norint sudaryti stabilią emulsiją. Emulsikliai – tai paviršiaus aktyvios medžiagos, kurios absorbuoja lašelių paviršių homogenizacijos metu. Teigiama, kad efektyviausi emulsikliai – nejoninės paviršiaus aktyvumo medžiagos. Joninės paviršiaus aktyvumo medžiagos, pavyzdžiui, natrio dodecilsulfatas, taip pat gali būti naudojamos kaip emulsikliai aliejus vandenyje tipo emulsijai, tačiau, susidariusi sistema yra labai jautri elektrolitų buvimui. Emulsifikavimui ir emulsijos stabilumo padidinimui gali būti pasitelkiamas paviršiui aktyvių medžiagų maišymas, pavyzdžiui, joninių ir nejoninių arba dviejų nejoninių (3 pav.) [25,26].
3 pav. Aliejus vandenyje emulsijos gamyba naudojant emulsiklį [25]
Šiuo atveju, emulsija aliejus vandenyje yra gaminama homogenizuojant aliejaus ir vandens fazes, pridėjus vandenyje tirpaus emulsiklio.
Tiesa, nereiktų pamiršti, kad nėra absoliutaus klasifikavimo, nes kai kurios medžiagos gali turėti skirtingas funkcijas. Pavyzdžiui, trietanolaminas gali būti naudojamas ir kaip emulsiklis, ir kaip tirštiklis. Yra įvairių tipų emulsinių medžiagų, pradedant nuo paviršinio aktyvumo medžiagų, polimerų, baltymų (želatina). Visiems šiems emulsikliams yra būdinga tai, kad jie neleidžia įvykti koalescencijai [12]. Nuo emulsiklio tipo priklauso kokio tipo emulsija susidarys – a/v ar v/a.
Emulsikliai yra charakterizuojami pagal hidrofilinio – lipofilinio balanso (HLB) reikšmę. HLB reikšmė yra nuo 1 iki 20. Kuo didesnė hidrofilinio – lipofilinio balanso reikšmė, tuo aktyvios medžiagos paviršius yra labiau hidrofilinis. Pagal Bankrofto taisyklę, fazė, kurioje emulsiklis geriau ištirpsta, yra vadinama – dispersine terpe [12].
1.3. Emulsijų stabilumas
Svarbus emulsinių sistemų kokybės vertinimo veiksnys – jų stabilumas [13]. Kuo didesnis tankių skirtumas tarp dispersinės fazės ir dispersinės terpės, tuo greičiau emulsija gali tapti nestabili, gali įvykti sedimentacija [3].
Pagal Nesterenko A. et al (2014) atliktame tyrime, emulsijos stabilumas gali būti matuojamas vadinamuoju „kolbos bandymo metodu“. 10 ml ką tik pagamintos vanduo aliejuje emulsijos yra perkeliama į matavimo kolbą, uždengiama plastikiniu dangteliu ir laikoma 21 dieną kambario temperatūroje (20 ± 3 °C). Reguliariais laiko intervalais vizualiai stebima ar aliejinė fazė neatsiskiria nuo emulsijos. Apskaičiuojama abiejų fazių procentinė dalis palyginus su bendru tūriu. Analizė atliekama 3 kartus [27].
Išskiriami keli pagrindiniai emulsijų nestabilumo tipai (4pav.): koalescencija, flokuliacija, išsisluoksniavimas ir visiškas fazių išsiskyrimas.
Flokuliacija ir koalescencija yra pagrindiniai destabilizacijos mechanizmai.
Esant laisvosios energijos pertekliui, gali įvykti koalescencija – kai dispersinės fazės lašeliai susilieja į stambesnius lašelius.
Esant flokuliacijai, lašeliai susijungia į didesnę visumą, bet nesusilieja [11,13]. Norint suformuoti stabilią emulsiją reikia įvykdyti 3 pagrindines sąlygas: • 2 skysčiai turi nesimaišyti tarpusavyje, taip pat netirpti vienas kito sąveikoje; • turi būti taikomas maišymas norint išsklaidyti vieną skystį kitame;
• panaudoti emulsiklį ar emulsiklių derinį [10].
Emulsijos stabilumui įtakos turi: homogenizavimo intensyvumas (pasirinktas apsisukimų kiekis per minutę), maišymo laikas, temperatūra, pH reikšmė, paviršinio aktyvumo medžiagos [10].
Išsisluoksniavimas – tai vienas iš emulsijos stabilumo nustatymo tipų. Visų pirma, prieš išsisluoksniavimą emulsija yra stebima vizualiai ar nematoma fazių išsiskyrimo laikant kambario temperatūroje [1]. Emulsijos stabilumas yra apskaičiuojamas pagal išsisluoksniavimo indeksą ir jei išsisluoksniavimo indeksas yra 100 proc, tai reiškia, kad emulsijoje nėra fazių išsiskyrimo ir emulsija yra stabili [3].
Emulsijos lašelių stabilumas. Prieš flokuliaciją/koalescenciją (4 pav.) yra įvertinamas emulsijos lašelių stabilumas. Laikant emulsiją ilgą laiką kambario temperatūroje yra stebima kaip keičiasi lašelių dydis ilgėjant laikymo laikui [1].
Taip pat emulsijos gali būti įvertintos atsižvelgiant į jų stabilumą šildymui. Tyrime (Koupantsis T, Kiosseoglou V. 2009), kuriame buvo tiriama išrūgų baltymų – karboksimetilceliuliozės
sąveika aliejus vandenyje emulsijoje, buvo imama 2 ml emulsijos ir patalpinta stikliniame butelyje ir šildoma 10 min 90 °C temperatūroje vandens vonioje. Vėliau buvo nustatinėjamas emulsijos stabilumas esant – 15 °C. Abiem atvejais vidutinis dalelių dydis buvo nustatytas pagal sklaidą vandenyje [1].
1.4. Linų sėmenų aliejus
Linų sėmenų aliejus yra žinomas ir labai plačiai vartojamas dėl savo unikalios sudėties. Linų sėmenų aliejus yra gaunamas iš sėjamojo lino (Lot. Linum usitatissimum). Šis aliejus yra praturtintas dideliu kiekiu omega–3 riebalų rūgštimi, kuri sudaro apie 57 proc visų sudėtyje esančių riebalų rūgščių, taip pat tai yra α–linoleno (ALA) rūgšties šaltinis [3,5,8]. Jo sudėtyje gausu ir kitų riebalų rūgščių (2 lentelė). Linoleno rūgštis yra labai svarbi, nes palaiko žmogaus ląstelių, nervų ir kraujagyslių funkciją. Suaugusiems linoleno rūgšties rekomenduojama gauti 1,6 g per dieną norint išvengti trūkumo, dėl kurio gali atsirasti įvairios ligos, pavyzdžiui, žvynelinė [3].
2 lentelė. Riebalų rūgščių kiekis proc. linų sėmenų aliejuje [16]
Linų sėmenyse yra kaupiami fenoliniai junginiai – lignanai, kurie mažina tam tikro vėžio riziką [4]. Lignanai ne vieninteliai fenoliniai junginiai, kaupiami linų sėmenyse, juose taip pat kaupiama: fenolinė rūgštis, flavonoidai, glikozidas fenilpropanoidas. Flavonoidamas yra priskiriami: antocianai, flavonoliai, flavonai, flavononai. Priklausomai nuo auginimo ir kultivavimo sąlygų, linų sėmenyse yra 0,3–0,71 g flavonoidų 1 kg žaliavos. Linų sėmenyse flavonoidai yra gliukozidų formos, pavyzdžiui, herbacetinas–3. Be jau minėtų fenolių, aptinkama ir taninų [14].
Be to, teigiama, jog linų sėmenų aliejus gali būti naudojamas prevencijai ir gydymui esant širdies ligoms, diabetui, vėžiui ir kaulų retėjimui – osteoporozei [6].
Antioksidacinis aktyvumas. Įrodyta, jog linų sėmenys – tai natūralių antioksidantų šaltinis. Antioksidantai padeda atkurti ir atnaujinti odą, kuri buvo pažeista per didelės saulės spinduliuotės, oro taršos ar kitų aplinkos pavojų [22]. Teigiama (Kasote DM, 2013), kad fenoliniai junginiai yra pagrindiniai, kurie atsakingi už antioksidacinį aktyvumą [14]. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas
vyksta spektrofotometriškai nustatant spalvos pokyčio intensyvumą, kuris priklauso nuo esančio 2,2–di–fenil–1–pikrilhidrazilo (DPPH) kiekio. Tai DPPH radikalo surišimo metodas, kai DPPH
radikalo tirpalas prisijungdamas protoną, keičia spalvą. Siger A. ir kt 2008 metais atliko antioksidacinio aktyvumo tyrimą šalto spaudimo augaliniuose aliejuose (3 lentelė). Būtent linų sėmenų antioksidacinis aktyvumas proc. pagal DPPH testą yra 19,3±2,1 proc. Teigiama, jog šalto spaudimo aliejai gali išlaikyti didesnį kiekį natūralių oksidantų, kurie galėtų būti pašalinti rafinavimo metu [15]. Šalto spaudimo aliejus yra pažymimas kaip „Pirmo spaudimo aliejus“, nes jam nereikia patirti rafinavimo procesų [28].
Riebalų rūgštys Kiekis linų sėmenų aliejuje proc.
α– linoleno 51.8–60.4
Linolo 15.2–17.4
Oleino 13.4–22.2
Palmitino 5.5–6.5
3 lentelė. Antioksidacinis aktyvumas proc. pagal DPPH testą [15]
Aliejus DPPH inaktyvinimas proc.
Saulėgražų 23,8±2,1
Rapsų 51,2±4,1
Kukurūzų 11,1±1,3
Linų sėmenų 19,3±2,1
Moliūgų 65,3±3,1
Antioksidacinis aktyvumas proc. pagal DPPH testą yra apskaičiuojamas pagal šią formulę [15]: 𝐷𝑃𝑃𝐻𝑝𝑟𝑜𝑐. 𝐼𝑛𝑎𝑘𝑡𝑦𝑣𝑖𝑛𝑖𝑚𝑎𝑠 =AB− AA
AB Kai: AB – Standartinio (tuščiojo) tirpalo absorbcija
AA – Bandinio su aliejumi absorbcija
Kita vertus, viena iš pagrindinių problemų, susijusių su aliejais, turinčiais daug polinesočiųjų riebalų rūgščių yra ta, jog jie esant netinkamoms sąlygoms greitai oksiduojasi, to pasekoje, atsiranda nemalonus skonis ir kvapas, dėl to mažėja produkcijos laikymo trukmė, nes tai skatina laisvųjų radikalų susidarymą, o tai gali turėti neigiamą fiziologinį poveikį žmogaus organizmui, todėl labai svarbu juos apsaugoti gamybos, perdirbimo bei laikymo etapuose. Būtent dėl šios priežasties linų sėmenų aliejus gali būti naudojamas tik šviežias, jo nepatartina naudoti kepimui ar kitaip termiškai jį apdoroti [5,7,28,29].
1.5. Vaistinė medetka – Calendula officinalis
Vaistinių medetkų (Lot.– Calendula officinalis) žiedai ilgą laiką buvo naudojami liaudies medicinoje, rasta daugiau nei 35 jų panaudojimo būdai. Tai astrinių (graižažiedžių) – Asteraceae (Compositae) šeimos atstovė [23]. Medetkų ekstraktas gali būti naudojamas į vidų, norint sušvelninti skausmą, atsiradusį dėl skrandžio opos ar uždegimo. Dermatologiškai naudojama nudegimų (įskaitant ir saulės nudegimus), įdrėskimų, mėlynių, žaizdų gydymui. Medetkų ekstraktas išoriškai gali būti naudojamas siekiant gydyti išopėjimus, egzemą ar konjunktyvitą [35]. Tai, kad vaistinių medetkų žaliava naudojama dermatologiškai, lemia jos gausi cheminė sudėtis.
Vaistinės medetkos žaliava kaupia [17,18,19,20,35]: • Steroidus;
• Karotinoidus (liuteinas, rubiksantinas, β–karotenas, likopenas), jie kaupiami laisvoje ir esterifikuotoje formoje;
• Eterinius aliejus. Įvairūs monoterpenai ir seksviterpenai randami eteriniuose aliejuose, kurie žaliavai suteikia specifinį kvapą ir skonį. Pavyzdžiui: α–tujenas, α–pinenas, 1,8–cineolis, geraniolis, karvakrolis, sabinenas, germakrenas D;
• Kumarinus (skopoletinas, umbeliferonas, eskuletinas); • Terpenoidus;
• Fenoliniai junginiai – flavonoidai (kvercetinas, rutinas, narcisinas, izoramnetinas, kaemferolis, izokvercetinas) (4 lentelė) ;
• Amino rūgštis (alaninas, argininas, asparto rūgštis, valinas, histidinas, leucinas, lizinas, serinas, tirozinas).
4 lentelė. Fenoliniai junginiai aptikti Calendula officinalis lapuose a ir žieduose b kartu su
HPLC sulaikymo laiku, UV maksimumu [24]
N0 Fenolinis junginys Augalo dalis Sulaikymo
laikas (min) UV (λmax)
Molekulinė masė
1 Galo rūgštis a,b 9,21 216, 272 170
2 Skopoletino–7–O– gliukozidas a 11,42 228, 345 354 3 Kvercetino–3–O–gliukozidas a,b 17,60 256, 350 464 4 Rutinas b 18,00 218, 255, 355 610 5 Nežinomas a 18,20 258, 360 350 6 Izoramnetin–3–O– gliukozidas b 18,60 255, 355 478 7 Nežinomas b 25,10 242, 360 386
Raal A. ir kt. 2011 metais Estijoje atliktame tyrime buvo nustatė, kad bendras flavonoidų kiekis medetkų augalinėje žaliavoje yra nuo 0,21 proc. iki 0,68 proc.. Norint atskirai išsiaiškinti kiekvieną flavonoidą, reikia tęsti tyrimus naudojant aukšto efektyvumo skysčių chromatografiją (HPLC) [33]. Król B. 2012 metais atliktame tyrime nustatė, kad bendras flavonoidų kiekis išlieka panašus: 0,2 proc.–0,7 proc.. Tai nustatoma imant hiperozidą kaip ekvivalentą [34].
Kvercetinas ir izoramnetinas – būtent šie du flavonoidai yra atsakingi už antioksidacinį aktyvumą [20]. Antioksidacinį aktyvumą galima nustatyti jau anksčiau aprašytu DPPH radikalo surišimo metodu, taip pat FRAP metodu (5 lentelė). Išvertus iš anglų kalbos FRAP (ferric reducing antioxidant power) – tai geležies redukcijos antioksidacinė galia. Naudojantis FRAP metodu, redukcijos antioksidacinė galia yra išreiškiama standartinio antioksidanto trolokso ekvivalentais, vienam gramui žaliavos. Rigane G. ir kt. 2013 metais atliko tyrimą, kurio metu buvo tiriamas vaistinių medetkų antioksidacinis aktyvumas FRAP metodu. Reagentai buvo pasirinkti tokie: 300 mM
acetatinio buferio (pH 3,6), 10 Mm TPTZ, 20mM FeCL3•6H20 esantis 1 M hidrochlorido rūgštyje. FRAP reagentas buvo paruošiamas sumaišius 10 ml acetatinio buferio, 1 ml TPTZ tirpalo ir 1 ml geležies chlorido heksahidrato tirpalo. 100 μl mėginio buvo įdėta į 3ml FRAP tirpalą taip pat pridėta 900 μl 96proc. etanolio ir 300μl vandens. Visa tai buvo laikoma apie 6 min. Išmatuoti absorbcijos rodmenys buvo pastovūs – 593 nm. Ekstraktų antioksidacinis aktyvumas buvo apskaičiuotas pagal Trolokso dozės koncentracijos ir atsako (poveikio) kreivę [24].
5 lentelė. Calendula officinalis ekstrakto antioksidacinis aktyvumas [24]
DPPH (IC50 mg.mL–1) FRAP (mM Trolokso)
Žiedai 0,35±0,02 28,37±0,12
Lapai 0,57±0,03 17,68±0,02
BHT 8,11±0,01 1,22±0,03
Be antioksidacinio aktyvumo vaistinių medetkų žaliava taip pat pasižymi priešuždegiminiu, antibakteriniu, spazmolitiniu, antivėžiniu poveikiu [17,18,19,20].
Vaistinių medetkų žiedų ekstrakcijos paruošimas. Efstratiou E. ir kt. 2012 metais aprašytame tyrime vaistinių medetkų žiedlapiai iš pradžių buvo džiovinami kambario temperatūroje, vėliau perkelti į kolbą su metanoliu ir etanoliu, kurie naudojami kaip tirpikliai. Medžiagos buvo maišomos pasirinkus 35 °C temperatūrą, 350 apsisukimų per minutę, 24 val. naudojant orbitalinę purtyklę, vėliau mėginys buvo filtruojamas, tirpiklis išgarinamas vakuume naudojant rotacinį garintuvą. Išdžiovintas ekstraktas buvo laikomas 4 °C temperatūroje tolesniems tyrimams [20]. Kitame tyrime Rigane G ir kt. 2013 metais, ekstrakciją atliko šiek tiek kitaip. Iš pradžių žiedai ir lapai buvo atskirti rankomis ir džiovinami kambario temperatūroje, vėliau mechaniškai susmulkinama. Kiekviena augalo dalis buvo tiksliai pasverta svarstyklėmis ir nuosekliai ekstrahuojama metanolis/vanduo (70:30). Paliekama stovėti kambario temperatūroje 24 h. Filtruoti tirpikliai, naudojant rotacinį garintuvą, buvo garinami vakuume iki tol kol lieka visiškai sausa medžiaga [24].
Varka E.M. ir kt. 2012 metais atliko vaistinių augalinių žaliavų (Rosmarinus officinalis ir Calendula officinalis) ekstrakciją naudojant alyvuogių aliejų. Augalinės žaliavos buvo dedamos kartu su alyvuogių aliejumi, pašildomos ir vėliau sausoje vietoje laikomos apie 40 dienų, kad įvyktų visiška ekstrakcija [22].
Galimi ir kiti ekstrakcijos tipai, pavyzdžiui, ekstrakcija n–hexanu, dichlormetanu, acetonu, etilacetatu, metanoliu, vandeniu [21].
1.6. Bioaktyvių junginių ekstrakcija ir jos tipai
Ekstrakcija yra pirmasis lemtingas žingsnis prieš nustatant cheminius komponentus esančius tam tikrame augale. Iš pradžių seka augalinės žaliavos apdorojimas (tai gali būti žaliavos plovimas, džiovinimas). Reikia imtis tinkamų veiksmų, kad aktyvūs komponentai nebūtų prarasti dar ekstrakto paruošimo stadijoje. Tinkamas tirpiklio ar tirpiklio mišinio parinkimas turi įtakos bioaktyvių junginių ekstrakcijai. Norint išekstrahuoti hidrofilinius junginius, naudojami tinkami tirpikliai: etanolis, metanolis, etilo acetatas. Norint išekstrahuoti lipofilinius junginius galimi naudoti tokie tirpikliai: dichlormetanas arba dichlormetanas mišinyje su etanoliu, santykiu 1:1. Kai kuriais atvejais norint iš ekstrakto pašalinti chlorofilą, naudojamas heksanas [39].
Bioaktyvių junginių analizei gali būti naudojami spektrofotometrijos ar chromatografijos metodai, tačiau analizės tikslumas priklauso nuo ekstrakcijos metodo, pasirinktų parametrų ir ekstrahuojamos augalo dalies (šaknys, stiebai, lapai, žiedai, vaisiai ir t.t.). Ekstrakcijos efektyvumui
turi įtakos tokie veiksniai: pasirinkta ekstrahuoti augalo dalis, tirpiklis, temperatūra, slėgis ir trukmė [37].
1.6.1. Maceracija
Susmulkinta sausa arba džiovinta augalinė žaliava užpilama tirpikliu ir paliekama kambario temperatūroje mažiausiai 3 dienas, dažnai maišant, kol tirpūs junginiai ištirps. Tirpiklis nupilamas, o augalinė žaliava yra nuspaudžiama, kad kuo daugiau tirpiklio pasišalintų. Išspaustas aliejus pilamas į nupiltą ištrauką ir po šio proceso seka filtravimas [31, 32].
1.6.2. Perkoliacija
Perkoliacija naudojama norint išgauti veikliąsias medžiagas. Dažniausiai naudojamas perkoliatorius.
Žaliava yra sudrėkinama atitinkamu kiekiu pasirinktos medžiagos ir paliekama stovėti 4 val. gerai uždarytoje talpykloje. Vėliau žaliava kraunama į perkoliatorių ir užpilama tirpikliu taip, kad susidarytų nedidelis sluoksnis virš žaliavos. Žaliava paliekama perkoliatoriuje 24 val. Praėjus šiam laikui, perkoliatoriaus išėjimo anga atidaroma ir leidžiama lėtai lašėti. Jei trūksta, papildomai įpilama tirpiklio. Perkoliuojama iki reikiamo tūrio. Abi ištraukos yra sujungiamos ir tada filtruojama [32].
1.6.3. Ekstrakcija naudojant ultragarsą
Ekstrakcija naudojant ultragarsą yra populiarus metodas bioaktyvių junginių ekstrakcijoje. Organinių ir neorganinių junginių išgavimą iš kietų formų, panaudojus tinkamą tirpiklį, gali palengvinti ultragarsinė spinduliuotė, kurios dažnis yra didesnis nei 20 kHz. Ultragarso bangų pagalba sukuriami kavitacijos burbuliukai šalia mėginio audinio ląstelių, taip suardomos audinio ląstelės ir medžiagos pereina į tirpiklį. Parenkamas tinkamas tirpiklis, jis sumaišomas su tiriamąja medžiaga (pavyzdžiui augalo žaliava), dedama į ultragarso vonelę ir veikiama ultragarsu pasirinktoje temperatūroje pasirinktą laiką. Ekstrahavimo intensyvumas priklauso ne tik nuo laiko, temperatūros, bet ir nuo bangos dažnio, jos pasiskirstymo bei parinkto tinkamo tirpiklio.
Palyginus su įprastais metodais, ekstrakcija ultragarsu yra vienas paprasčiausių metodų, palyginti nebrangus, greitas metodas [36].
Ultragarsinės ekstrakcijos pliusai: tai inovatyvus metodas, galima naudoti ekologiškus tirpiklius (saulėgrąžų, alyvuogių aliejus), greitas, pigus metodas [40].
1.6.4. Ekstrakcija mikrobangomis
Mikrobangos sukelia molekulių judėjimą žaliavoje arba tirpiklyje su dipoliu, taip gaunamas mėginio kaitinimas. Šildant augalų ląstelės praranda drėgmę ją išgarindamos. Garai priverčia ląstelę išsipūsti ir ji pratrūksta, taip išleisdama aktyvius junginius. Mikrobangos – tai ne jonizuojanti spinduliuotė, kurios dažnis yra tarp 300 MHz ir 300 GHz.
Ekstrakcijos mikrobangomis pranašumas yra toks, kad tai pakankamai greitas metodas (dažniausiai iki 30 min.), sunaudojamas mažesnis kiekis tirpiklio ir ganėtinai didelė ekstrahavimo išeiga. Dažniausiai naudojami tirpikliai yra vanduo, etanolis, metanolis, acetonitrilas, acetonas [36].
1.7. Aliejaus ekstraktai
Aliejiniai ekstraktai – tai gaminimas ekstrahuojant augalinę žaliavą riebalų aliejais. Ekstrahavimas galimas šaltuoju būdu bei šildant. Ekstrakcijai gali būti naudojami saulėgrąžų, linų sėmenų, alyvuogių, rapsų, kukurūzų aliejai. Gaminant aliejaus ekstraktus šildymo būdu, augaliniai aliejai gali būti šildomi įvairiomis temperatūromis nustatant didžiausią aliejaus pelningumą, pavyzdžiui:
✓ rapsų aliejus iki 60°C
✓ kukurūzų aliejus iki 80°C [30]
Šildymo trūkumas toks, jog gali suskilti dalis veikliųjų medžiagų. Vėliau iš gautosios ištraukos turi būti pašalintas vanduo. Tą galima padaryti į vandenį įdėjus vandenį sugeriančių medžiagų arba tiesiog palikti gautą ištrauką nusistovėti. Po šio etapo seka gautos ištraukos filtravimas.
Aliejaus ekstraktų standartizavimas. Gauti aliejiniai ekstraktai standartizuojami atsižvelgiant į esamą vaistinių medžiagų kiekį, tankį, rūgštingumą taip pat įvertinamos juslinės savybės, tokios kaip: skonis, kvapas, konsistencija, spalva. Aliejiniai ekstraktai laikomi sandariose talpyklėse, tamsioje vėsioje vietoje, tokios ypatingos laikymo sąlygos reikalingos todėl, kad jie dėl šviesos ir oro poveikio gali apkarsti [31].
Ekstrakcija galima maceracijos ir perkoliacijos metodais. Maceracija yra ilgesnį laiką užimantis metodas, bet jis priešingai nei perkoliacija, nereikalauja ypatingos aparatūros, perkoliatoriaus. Tiesa, pasirinkus perkoliacijos metodą, ekstraktą galima gauti per trumpesnį laiką.
2. TYRIMO METODIKA IR METODAI
2.1. Naudojamos medžiagos ir įranga
2.1.1. Naudojamos medžiagos
o Medetkų žiedai (Pirktiniai, Lietuva)
o Medetkų žiedai (Užauginti ir rinkti Kupiškio raj.)
o Follin–Ciocalteau reagentas (Sigma–Aldrich, Šveicarija) o Natrio karbonatas (Na2CO3) (Aldrich, Vokietija)
o Linų sėmenų aliejus, šalto spaudimo (Carl roth, Vokietija) o Aliuminio chloridas (AlCl3) (Sigma–Aldrich, Vokietija) o Acto rūgštis (Sigma–Aldrich, Vokietija)
o DPPH reagentas (2,2–difenil–1–pikrilhidrazil–hidratas) (Aldrich, Vokietija) o Etanolis 96proc. („AB Vilniaus degtinė“)
o Emulsiklis Span 20 (Sigma–Aldrich, JAV) o Emulsiklis TWEEN (Sigma–Aldrich, Prancūzija) o Imersinis aliejus (Carl roth, Vokietija)
o Celiuliozinės membranos (Sigma–Aldrich, JAV)
2.1.2. Naudojama įranga
o Spektrofotometras (Agilent 8453 UV–Vis) o Magnetinė maišyklė (Wise Stir MSH–20D)
o Ultragarso vonelė (VWR ultrasonic cleaner USC–THD) o Mikrobangų krosnelė
o Analitinės svarstyklės SBC–31 (Scaltec Instruments GmbH, Vokietija) o Automatinės pipetės (Eppendorf, Research plus, Vokietija)
o Homogenizatorius Ultra Turrax (Janke&Kunhel, Vokietija) o pH–metras (pH–Meter 766 Calimatic)
o Viskozimetras (SV–10 Vibro viscometer, A&D company, Japonija) o Mikroskopas (Motic B3 Professionl series)
2.2. Aliejinio ekstrakto paruošimas
Aliejinis ekstraktas gaminamas iš medetkų žiedų žaliavos ir linų sėmenų aliejaus santykiu 1:10. Ekstraktai gaminami trimis būdais: maceracija, ekstrakcija ultragarsu ir ekstrakcija mikrobangomis [35]. Naudojant tris skirtingas metodikas svarbu atkreipti dėmesį į ekstrakcijos trukmę bei temperatūrą. Tai matoma 6 lentelėje.
6 lentelė. Parametrai taikomi ekstrakcijoms
Maceracija Ekstrakcija ultragarsu Ekstrakcija mikrobangomis
Temperatūra Kambario temperatūra 300 –
Trukmė 1 savaitė 30min. 10min.
Papildomi parametrai – Ultragarso vonelės
dažnis: 9W
Mikrobangės pasirinkta galia: 380W
2.2.1. Maceracija
Atliekant ekstrakciją maceracijos metodu, tiksliai pasverta žaliava užpilama linų sėmenų aliejumi, sumaišoma, kad aliejus apsemtų žaliavą ir šiek tiek paspaudus laikoma kambario temperatūroje vieną savaitę vėsioje, nuo saulės spindulių apsaugotoje vietoje. Po savaitės žaliava nufiltruojama naudojant dvigubos marlės filtrą, kad į ekstraktą patektų kuo mažiau priemaišų ir laikoma tamsioje, nuo tiesioginių saulės spindulių apsaugotoje vietoje [31,32].
2.2.2. Ekstrakcija ultragarsu
Gaminant antruoju būdu, pasirenkant ekstrakciją ultragarsu, taip pat pasirenkamas santykis 1:10, nes norima palyginti su rezultatais gautais gaminant maceracijos būdu.
Tiksliai atsverta žaliava dedama į stiklinį indą su kaitinimo žyme ir užpilama linų sėmenų aliejumi. Naudojama ultragarso vonelė VWR ultrasonic cleaner USC–THD, ekstrakcija atliekama 30 min, 300C temperatūroje, pasirinktas ultragarso vonelės dažnis – 9W. Toliau, kaip ir gaminant maceracijos būdu, ekstraktas nufiltruojamas naudojant dvigubos marlės filtrą ir nufiltruotas ekstraktas laikomas kambario temperatūroje, apsaugotoje nuo tiesioginių saulės spindulių vietoje.
2.2.3. Ekstrakcija mikrobangomis
Gaminant trečiuoju būdu, pasirenkant ekstrakciją mikrobangomis, kaip ir pirmaisiais dviem būdais, tiksliai pasverta medetkų žiedų žaliava yra užpilama linų sėmenų aliejumi, standartiniu santykiu 1:10, sumaišoma ir dedama į mikrobangų krosnelę. Vykdoma ekstrakcija mikrobangomis, kurios trukmė 10 min. Pasirinkta mikrobangų krosnelės galia 380 W [36]. Po to seka filtravimas, pagamintas aliejinis ekstraktas laikomas kambario temperatūroje, apsaugotoje nuo tiesioginių saulės spindulių vietoje.
2.3. Karotinoidų nustatymas medetkų žaliavoje
Pasveriama 0,001 g susmulkintos medetkų žaliavos, suberiama į grūstuvę, susmulkinama, užpilama 10 ml 96 proc. etanoliu ir dar kartą sutrinama. Gauta masė nufiltruojama per dvigubos marlės filtrą, atmatuojama 1,0 ml, supilama į mėgintuvėlį ir užpilama 4 ml 96 proc. etanoliu, išmaišoma. Spektrofotometru išmatuojama bangos sugertis esant bangos ilgiams: chlorofilas a 664 nm, chlorofilas b 649 nm, karotinoidams 470 nm. Palyginamasis tirpalas 96 proc. etanolis. Apskaičiuojama chlorofilo a (Ca), chlorofilo b (Cb) ir bendra karotinoidų (Ckarotinoidai) koncentracija, μg/ml:
Ca=13.36*A664–5.19*A649 Cb=27.43*A649–8.12*A664
Ckarotinoidai=1000∗A470−2.13∗Ca−97.63∗Cb 209
2.4. Flavonoidų nustatymas aliejiniame ekstrakte
Iš aliejinio ekstrakto yra gaminamas etanolinis ekstraktas norint atlikti flavonoidų nustatymą. Aliejinis ekstraktas yra sumaišomas su 96 proc. etanoliu, pasirinkus santykį 1:2. Maišoma ant magnetinės maišyklės (Wise Stir MSH–20D) 30 min pasirinkus 1500 RPM. Išjungus maišyklę, gautas ekstraktas laikomas parą laiko kambario temperatūroje, kol nusistovi dvi fazės. Vėliau panaudojus dalijamąjį piltuvą atskiriamos dvi fazės ir tolimesni matavimai atliekami jau iš etanolinės fazės.
Bendrasis flavonoidų kiekis nustatomas atliekant reakciją su aliuminio chloridu (AlCl3) matuojant absorbciją 415 nm bangos ilgyje su Aligent 8453 UV–Vis spektrofotometru. 1,0 ml ekstrakto, sumaišoma su reagentu, kuris gaminamas iš 4 ml 96 proc. etanolio, 0,2 ml 10 proc. ledinės acto rūgšties, 0,6 ml 10 proc. aliuminio chlorido (AlCl3). 10 proc. aliuminio chlorido (AlCl3) tirpalas gaminamas 2 g aliuminio chlorido miltelių tirpinant 20 ml distiliuoto vandens. Viską gerai sumaišius, gautas mišinys paliekamas stovėti 30 min. tamsioje, vėsioje, apsaugotoje nuo tiesioginių saulės
spindulių vietoje. Praėjus 30 min atliekami matavimai prie 415 nm bangos ilgio, naudojant Aligent 8453 UV–Vis spektrofotometrą. Visi mėginiai tiriami 3 kartus.
Bendrasis flavonoidų kiekis nustatomas pagal rutino kalibracinį grafiką ir išreiškiamas RE (rutino ekvivalentu) mg/ml.
2.5. Fenolinių junginių nustatymas aliejiniame ekstrakte
Kaip ir tiriant bendrą flavonoidų kiekį, taip ir fenolinių junginių kiekį, pirmiausiai iš aliejinio ekstrakto yra gaminamas etanolinis ekstraktas norint atlikti fenolinių junginių nustatymą. Pagamintas aliejinis ekstraktas yra sumaišomas su 96 proc. etanoliu, pasirinkus santykį 1:2, maišoma ant magnetinės maišyklės 30 min pasirinkus 1500 RPM. Gautas ekstraktas laikomas parą laiko kambario temperatūroje, kol nusistovi dvi fazės. Panaudojus dalijamąjį piltuvą atskiriamos dvi fazės ir tolimesni matavimai atliekami jau iš etanolinės fazės.
Bendras fenolinių junginių kiekis nustatomas standartiniu Follin–Ciocalteau metodu. Į 25 ml kolbutę sumaišoma 1 ml jau pagaminto ekstrakto su 1 ml Follin–Ciocalteau reagentu, 9 ml distiliuoto vandens ir paliekama kambario temperatūroje 5 min pastovėti. Po to įpilama 10 ml 7 proc. natrio karbonato (Na2CO3) tirpalo ir praskiedžiama distiliuotu vandeniu iki 25 ml žymės. Gautas tirpalas gerai sumaišomas ir paliekamas 90 min pastovėti kambario temperatūroje, tamsioje, apsaugotoje nuo tiesioginių saulės spindulių vietoje. Po inkubacinio laikotarpio absorbcija matuojama spektrofotometru prie 750 nm bangos ilgio. Matavimai kartojami tris kartus.
Bendrasis fenolinių junginių kiekis nustatomas pagal galo rūgšties kalibracinį grafiką ir išreiškiamas GRE (galo rūgšties ekvivalentu) mg/ml.
2.6. Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas aliejiniuose ekstraktuose pagal DPPH
(2,2–difenil–1–pikrilhidrazil–hidrato) radikalų surišimo metodą
DPPH tirpalas gaminamas tamsioje, nuo tiesioginių ir netiesioginių saulės spindulių apsaugotoje vietoje. Prieš gaminant šį tirpalą reikia pasiruošti kolbą ir iš anksto ją apvynioti aliuminio folija, kad vėliau tirpalas būtų apsaugotas nuo šviesos.
DPPH tirpalas gaminamas taip: tiksliai atsveriamas 0,01 g DPPH ir 250 ml 96 proc. etanolio. Iš pradžių į kolbą, apvyniota aliuminio folija, įpilama šiek tiek etanolio, tada suberiamas atsvertas DPPH, išmaišoma ir tada supilamas likęs etanolis, kolba užkemšama kamščiu, ant viršaus
apvyniojama aliuminio folija ir per naktį paliekama šaldytuve, nes DPPH yra sunkiai tirpus etanolyje. Pagamintą tirpalą galima naudoti septynias dienas nuo pagaminimo datos.
Antioksidacinis aktyvumas yra nustatomas spektrofotometru, prie 515 nm bangos ilgio. 0,1 ml etanolinio tirpalo yra sumaišoma su 3 ml DPPH tirpalo ir tada matuojama spektrofotometru.
Prieš matuojant absorbciją spektrofotometras yra nukalibruojamas 96 proc. etanoliu. DPPH inaktyvacijos procesai yra apskaičiuojami pagal šią formulę:
𝐷𝑃𝑃𝐻 𝑖𝑛𝑎𝑘𝑡𝑦𝑣. 𝑝𝑟𝑜𝑐𝑒𝑠. =𝐴𝑜 − 𝐴𝜏
𝐴𝑜 × 100 𝑝𝑟𝑜𝑐.
𝐴𝑜 = 𝑡𝑢šč𝑖𝑜𝑗𝑜 𝑏𝑎𝑛𝑑𝑖𝑛𝑖𝑜 𝑜𝑝𝑡𝑖𝑛𝑖𝑠 𝑡𝑎𝑛𝑘𝑖𝑠, 𝑘𝑎𝑖 𝜏 = 𝑜 𝑚𝑖𝑛, 𝑔𝑟𝑦𝑛𝑜 𝐷𝑃𝑃𝐻 𝑜𝑝𝑡𝑖𝑛𝑖𝑠 𝑡𝑎𝑛𝑘𝑖𝑠 𝐴𝜏 = 𝑏𝑎𝑛𝑑𝑖𝑛𝑖𝑜 𝑠𝑢 𝑡𝑖𝑟𝑖𝑎𝑚𝑢𝑜𝑗𝑢 𝑡𝑖𝑟𝑝𝑎𝑙𝑢 𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑐𝑖𝑗𝑎 𝑝𝑢𝑠𝑖𝑎𝑢𝑠𝑣𝑦𝑟𝑜𝑗𝑒, 𝑘𝑎𝑖 𝜏 = 30 𝑚𝑖𝑛.
Pirmiausiai pamatuojama pačio DPPH absorbcija, iš jos atimama bandinio su tiriamuoju tirpalu absorbcija, padalijama iš DPPH tirpalo absorbcijos ir tada padauginama iš 100. Visi matavimai vyksta tris kartus.
2.7. Aliejinių ekstraktų organoleptinis vertinimas
Gautų aliejinių ekstraktų organoleptinis vertinimas vyksta vertinant juslines savybes: skonis, spalva, kvapas, konsistencija. Aliejiniai ekstraktai laikomi sandariose talpyklose, tamsioje, vėsioje vietoje, nes jie dėl šviesos ir oro poveikio gali apkarsti [31].
2.8. Emulsijų gamyba
Emulsijos ruošiamos kambario temperatūroje homogenizuojant aliejų vandeninėje fazėje ar vandenį aliejinėje fazėje, priklausomai nuo pasirinkto emulsiklio. Taikomas homogenizavimo metodas skirtas tirpalų sumaišymui naudojant Ultra Turrax homogenizatorių, pasirenkant trukmę bei apsisukimų skaičių per minutę. Kuhn KR et al (2012) aprašytame tyrime buvo pasirinkta 4 min ir 14000 apsisukimų per minutę [7]. Labai svarbu tinkamai pasirinkti paviršinio aktyvumo medžiagas, kurios pasirinktoje temperatūroje tinkamai emulsuos ingredientus [10].
Gaminama emulsija naudojant 50 proc. aliejaus ir 50 proc. vandens. Emulsiklio kiekis imamas 20 proc. nuo aliejinės fazės (Emulsijų sudėtys yra pateiktos 7 lentelėje). Šiuo atveju žaliava Nr. 1 yra pirktinė žaliava (Lietuva), o žaliava Nr. 2 – užauginta ir rinkta Kupiškio raj. Emulsija yra gaminama naudojant Homogenizatorių Ultra Turrax (Janke&Kunhel, Vokietija).
Emulsija a/v yra gaminama su polioksietilen (20) – sorbitano monooleatu (Tween 80), nes jis tirpsta vandenyje, tai hidrofilinis emulsiklis. Iš pradžių Tween atsveriamas ir sumaišomas su vandeniu, įpilamas į 150 ml kolbutę, į kurią dedamas homogenizatorius, palaipsniui pilamas aliejus.
Jei gaminama v/a emulsija, ji gaminama su sorbitano monooleatu (Span 80) ar sorbitano monolauratu (Span 20), nes jis tirpus aliejuje, tai oleofilinis emulsiklis, tuomet atsvertas Span sumaišomas su aliejumi ir pasirinkta 150 ml kolbutė dedama į homogenizatorių ir palaipsniui pilamas vanduo. Tiek Tween, tiek Span yra paviršinio aktyvumo medžiagos.
Homogenizuojama 5 min, 500 aps/min greičiu. Pagamintos emulsijos paliekamos 1 parą pastovėti kambario temperatūroje, nuo tiesioginių ir netiesioginių saulės spindulių apsaugotoje vietoje, ir tik tada atliekami kiti tyrimai.
7 lentelė. Emulsijų sudėtys
Emulsijos Nr. Emulsijos tipas Pasirinktas emulsiklis Emulsiklio HLB Aliejaus kiekis (g) Ekstraktui naudota žaliava Vandens kiekis (g) Emulsiklio kiekis (g)
1. a/v Tween80 15,0 25 Žaliava
nr.1
25 5
2. a/v Tween80 15,0 25 Žaliava
nr.2
25 5
3. v/a Span 80 4,3 25 Žaliava
nr.1
25 5
4. v/a Span 80 4,3 25 Žaliava
nr.2
25 5
5. v/a Span 20 8,6 25 Žaliava
nr.1
25 5
2.9. Emulsijų pH reikšmės vertinimas
Odos pH reikšmė paprastai yra rūgštinė, svyruoja nuo 4 iki 6 [38]. Matavimų metu stebima ar pagamintų emulsijų pH reikšmė atitinka odos pH. Pagamintų emulsijų pH reikšmė yra matuojama po paros, kai emulsijos yra pagamintos. pH reikšmė matuojama naudojant pH–metrą (pH–Meter 766 Calimatic). pH reikšmė matuojama 220C temperatūroje. Po kiekvienos emulsijos matavimo, elektrodai nuplaunami su išgrynintuoju vandeniu. Matavimai kartojami tris kartus, rezultatuose pateikiamas išvestas aritmetinis vidurkis.
2.10. Dinaminės klampos vertinimas emulsinėse sistemose
Emulsinių sistemų stabilumui turi įtakos klampa. Kuo klampa didesnė, tuo didesnė tikimybė, kad ilgiau nepasireikš tokie procesai kaip išsisluoksniavimas ar flokuliacija, vadinasi, emulsinė sistema ilgiau išliks stabili. Pagamintų emulsijų dinaminė klampa yra matuojama po paros, kai emulsijos yra pagamintos.
Dinaminės klampos nustatymas atliekamas naudojant viskozimetrą (SV–10 Vibro viscometer, A&D company, Japonija). Į plastikinę celę yra supilama 45 ml emulsijos, į celę yra nuleidžiamos viskozimetro sensoriaus plokštelės ir tuomet matuojama klampa. Matavimo trukmė – 10 s. Matavimas vyksta kambario temperatūroje. Nustatyta klampa išreiškiama mPa.s. Matavimai kartojami tris kartus, rezultatuose pateikiamas išvestas aritmetinis vidurkis.
2.11. Emulsinės sistemos tipo nustatymas
Nustatyti ar pagaminta emulsija yra tiesioginio ar atvirkštinio tipo galima skiedimo metodu. Ant stiklinės plokštelės reikia užlašinti vieną lašą vandens ir ant viršaus vieną lašą pagamintos emulsijos. Jei emulsijos lašas susimaišo su vandeniu, tuomet bus a/v tipo emulsija, jei abu lašai nesusimaišo, tuomet bus v/a tipo emulsija.
2.12 Fenolinių junginių atpalaidavimo iš emulsinių sistemų tyrimas in vitro
Norint atlikti suminio fenolinių junginių atpalaidavimo tyrimą in vitro, yra naudojamos celiuliozinės membranos, kurios yra užmerkiamos vandenyje bent jau parą laiko prieš bandymą. Naudojamos dvi skirtingos akceptorinės terpės: 15 ml išgrynintojo vandens ir 15 ml 70 proc. etanolio. Vandens vonelėje temperatūra viso bandymo metu yra palaikoma 32±0,5C0 norint imituoti žmogaus odos temperatūrą. Į difuzinę celę yra talpinama 1,0±0,05 g emulsijos ir vienas bandinys linų sėmenų aliejaus (donorinė terpė), tada sandariai pritvirtinama celiuliozinė membrana ir merkiama į akceptorinę terpę. Donorinę terpę ir akceptorinę terpę skiria celiuliozinė membrana, per ją vyks difuzija. Difuzijos plotas – 1,77 cm2. Į indą, kuriame yra akceptorinė terpė dedamas magnetas, tuomet tai dedama ant magnetinės maišyklės su kaitinamuoju paviršiumi, akceptorinė terpė yra nuolat maišoma. Mėginiai imami po 0,5, 1, 1,5, 2, 3 val. Mėginio tūris – 1 ml, tokiu pat tūriu akceptorinė terpė yra papildoma šviežiu išgrynintu vandeniu ar 70 proc. etanoliu.
Fenolinių junginių kiekis yra matuojamas spektrofotometru pagal anksčiau aprašytą (2.5) metodiką. Suminis fenolinių junginių kiekis yra apskaičiuojamas pagal galo rūgšties kalibracinį grafiką.
2.13. Flavonoidų atpalaidavimo iš emulsinių sistemų tyrimas in vitro
Bendras flavonoidų kaip ir fenolinių junginių atpalaidavimo tyrimas yra atliekamas naudojant celiuliozines membranas. Šiuo atveju akceptorinė terpė yra 15 ml 70 proc. etanolis. Donorinė terpė – 1,0±0,05 g tiriamos emulsijos ir vienas bandinys su linų sėmenų aliejumi. Donorinė terpė dedama ant celiuliozinės membranos ir dedama į stiklinę, kurioje yra akceptorinė terpė su magnetu. Visa tai dedama ant magnetinės maišyklės su kaitinamuoju paviršiumi, palaikant 32±0,5 C0 temperatūrą. Mėginiai imami po 0,5, 1, 1,5, 2, 3 val po 1 ml. Paėmus 1 ml mėginio atgal įpilamas toks pat tūris šviežios akceptorinės fazės.
Toliau bendras flavonoidų kiekis matuojamas spektrofotometru pagal jau anksčiau aprašytą metodiką (2.4). Suminis flavonoidų kiekis apskaičiuojamas pagal rutino kalibracinį grafiką.
2.14. Emulsijų mikrostruktūros nustatymas
Mikrostruktūra tirta Motic mikroskopu (Motic B3 Professionl series). Tiriamoji emulsija labai plonu sluoksniu užtepama ant stiklelio, uždengiama mikroskopavimo stikleliu ir paliekama kelias minutes pastovėti. Tada ant mikroskopavimo stiklelio užlašinamas lašas imersinio aliejaus. Stiklelis įtvirtinamas ant objektinio stalelio ir nuleidžiamas mikroskopo objektyvas, pasirinktas didinimas x100. Duomenys fotografuojami moticam 1000 1,3 M Pixel USB 2,0 kamera ir apdorojami kompiuterine programa Motic Images Plus 2.0ML. Mikroskopavimo lauke išmatuojami mažiausi ir didžiausi lašeliai.
2.15. Statistinė analizė
Gauti duomenys apdoroti naudojant Microsoft Office Excel 2010 (Microsoft, JAV) ir „SPSS Statistics 25.0“ (IBM, JAV) kompiuterines programas. Tyrimai kartoti tris kartus, rezultatuose pateikiamas vidurkis su standartiniu nuokrypiu. „SPSS Statistics 25.0“ programa vertinamas statistinis reikšmingumas, skirtumas laikomas statistiškai reikšmingas, kai p<0,05.
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1. Ekstrakcijos metodo parinkimas ir skirtingų žaliavų palyginimas
3.1.1. Medetkų žaliavos palyginimas
Medetkų žiedai pasižymi priešuždegiminėmis, žaizdų gijimą skatinančiomis savybėmis [41]. Dėl paminėto poveikio, medetkų žiedų žaliava buvo pasirinkta kaip veikliosios medžiagos idėja.
Atliktame tyrime buvo pasirinktos 2 skirtingų kokybių žaliavos. Toliau jos bus vadinamos žaliava Nr. 1 ir žaliava Nr. 2. Žaliava Nr. 1 – tai pirktinė žaliava (Lietuva), o žaliava Nr. 2 – užauginta ir rinkta žydėjimo metu Kupiškio raj. (8 lentelė)
8 lentelė. Žaliavos Nr.1 ir žaliavos Nr.2 palyginimas
Žaliava Nr. 1 Žaliava Nr. 2
Kilmė Lietuva Kupiškio raj., Lietuva
Rinkimo metai Gamintojas nepateikia 2017 Džiovinimo
sąlygos
Gamintojas nepateikia Žaliava džiovinta kambario temperatūroje, apsaugotoje nuo tiesioginių saulės
spindulių ir drėgmės apsaugotoje, gerai vėdinamoje vietoje
Spalva Intensyvi geltona spalva Spalva vos intensyvesnė nei žaliavos Nr.1 Kvapas Specifinis medetkų žaliavos
kvapas, vos intensyvesnis nei žaliavos Nr. 2
Specifinis medetkų žaliavos kvapas
Laikymo sąlygos po džiovinimo
Gamintojo sąlygos: „laikyti gamintojo pakuotėje, sausoje vietoje, ne aukštesnėje kaip 25 °C temperatūroje“
Supakuota į popierinius maišelius ir laikoma tamsioje, sausoje vietoje
Siekiama palyginti dvi skirtingos kokybės žaliavas, taip pat skirtingus ekstrakcijos būdus gaminant aliejinius ekstraktus. Norima palyginti kuriuo ekstrakcijos būdu gaminant išsiekstrahuos daugiau veikliųjų junginių (fenoliniai junginiai, flavonoidai). Ekstrakcijos naudingumas vertinamas pagal išekstrahuojamų biologiškai aktyvių medžiagų kiekį – bendrą fenolinių junginių kiekį, flavonoidų kiekį ir antioksidacinį aktyvumą.
3.1.2. Karotinoidų nustatymas medetkų žaliavoje
Bendras karotinoidų kiekis buvo matuojamas dviejų tipų medetkų žaliavoje, norint palyginti kuri žaliava pasižymi didesniu bendru karotinoidų kiekiu. Atliekant karotinoidų nustatymą gaunamas ir bendras chlorofilo a ir b kiekis. Nustatinėjama naudojant spektrofotometrą matuojant šviesos sugertį. Naudojami skirtingi bangos ilgiai kiekvienam parametrui (chlorofilui a, chlorofilui b ir bendram karotinoidų kiekiui) nustatyti.
5 pav. Medetkų žaliavos palyginimas. Ca – chlorofilo a kiekis, Cb – Chlorofilo b kiekis, Ckarotinoidai –
bendras karotinoidų kiekis medetkų žaliavoje.
Iš rezultatų pateiktų 5 pav. matoma, kad žaliava Nr. 2 pasižymi net 2,5 karto didesniu chlorofilo b kiekiu ir 3,0 karto didesniu chlorofilo a kiekiu. Apskaičiavus bendrą vidutinį karotinoidų kiekį galima pastebėti, kad žaliava Nr.2 (13,268 0,19 μg/ml) kaupia 2,6 karto daugiau karotinoidų nei žaliava Nr.1 (5,0350,13 μg/ml).
Panaudojant SPSS programą ir t–test analizę nustatyta, kad medetkų žaliavoje Nr. 1 ir Nr. 2 bendras karotinoidų kiekis reikšmingai skyrėsi (p<0,05). Tai galėjo lemti skirtingos augimo ir džiovinimo sąlygos, žaliavos rinkimo laikas.
2.997 7.37 1.433 4.315 5.035 13.268 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Žaliava nr.1 Žaliava nr.2 C ki ek is išr eik štas μ g/m l Ca Cb Ckarotinoidai
3.1.3. Aliejinių ekstraktų organoleptinių savybių palyginimas
Aliejiniai ekstraktai gaminami iš dviejų, jau anksčiau aprašytų ir palygintų, skirtingų kokybių žaliavų: žaliava Nr. 1 ir žaliava Nr. 2. Aliejiniai ekstraktai gaminami trimis skirtingais ekstrakcijos būdais – tai maceracija, ekstrakcija ultragarsu ir ekstrakcija mikrobangomis, gaminama standartiniu santykiu 1:10 norint vėliau palyginti kuriuo ekstrakcijos būdu gaminant bus išgaunama daugiau veikliųjų junginių, todėl visais trimis ekstrakcijos būdais gaminama tuo pačiu santykiu.
Pagaminti ekstraktai filtruojami naudojant dvigubos marlės filtrą ir laikomi nuo tiesioginių saulės spindulių apsaugotoje vietoje. 9 lentelėje pateikiama pagamintų aliejinių ekstraktų organoleptinių savybių palyginimas, pagal tai, kokiu ekstrakcijos būdu buvo gaminama, pasitelkiant šiuos kriterijus: konsistencija, kvapas, spalva ir išvaizda.
9 lentelė. Pagamintų aliejinių ekstraktų organoleptinių savybių palyginimas
Ekstrakcijos būdas Organoleptinės savybės Maceracija Konsistencija: aliejinė.
Kvapas: jaučiamas intensyvesnis linų sėmenų aliejaus kvapas nei gaminant ultragarsinės ekstrakcijos būdu.
Spalva: geltonai ruda. Išvaizda:
Ekstrakcija ultragarsu
Konsistencija: aliejinė.
Kvapas: silpnokas specifinis linų sėmenų aliejaus kvapas. Spalva: skaidri, šviesiai geltona.
Išvaizda:
Ekstrakcija mikrobangomis
Konsistencija: aliejinė.
Kvapas: jaučiamas intensyvus tiek medetkų tiek linų sėmenų aliejaus kvapas. Spalva: tamsiai rudai geltona, tamsiausia iš visų 3 skirtingai gamintų ekstraktų. Išvaizda:
Apibendrinant galima teigti, kad visi aliejiniai ekstraktai pasižymi aliejine konsistencija, jaučiamas specifinis linų sėmenų aliejaus kvapas, pagamintų aliejinių ekstraktų spalvos vyrauja nuo gelsvos iki rudai gelsvos.
3.1.4. Bendro flavonoidų kiekio nustatymas aliejiniuose ekstraktuose
Teigiama, kad flavonoidai pasižymi antioksidacinėmis ir antimikrobinėmis savybėmis [14]. Gaminant dermatologinį preparatą, šiuo atveju, emulsinę sistemą, svarbu ištirti koks veikliųjų junginių kiekis randamas emulsinėse sistemose. Palyginus jau pagamintų aliejinių ekstraktų organoleptines savybes tiriamas bendras flavonoidų kiekis visuose aliejiniuose ekstraktuose.
Bendras flavonoidų kiekis nustatomas spektrofotometru, absorbcija matuojama prie 415 nm bangos ilgio. Bendras flavonoidų kiekis išreiškiamas rutino ekvivalentu (RE) mg/ml. Bendras flavonoidų kiekis matuojamas trimis skirtingais būdais pagamintuose ekstraktuose: gaminant maceracijos metodu, veikiant ultragarsu ir mikrobangomis. Palyginimui buvo pagamintas etanolis ekstraktas su augaline žaliava Nr. 1, standartiniu santykiu 1:10, panaudotas 96 proc. etanolis.
Pagal rutino ekvivalentą išreikšti rezultatai pateikiami 6 pav. Apibūdinant visus ekstraktų gamybos metodus, didžiausias bendras flavonoidų kiekis randamas ekstraktuose, kurie ekstrahuoti tiesiogiai su etanoliu, tai 0,3030,016 RE mg/ml (kai gaminama pasitelkiant ultragarso vonelę) ir 0,4990,022 RE mg/ml (gaminant maceracijos metodu), kai rezultatai išreikšti rutino ekvivalentu.
6 pav. Skirtingų ekstrakcijos metodų su skirtingais ekstrahentais palyginimas naudojant žaliavą Nr. 1, kai matuojamas bendras flavonoidų kiekis ekstraktuose. n=3
0.146 0.499 0.133 0.303 0.000 0.100 0.200 0.300 0.400 0.500 0.600
Aliejinis ekstraktas su žaliava nr.2 Etanolinis ekstraktas su žaliava nr.1
F
la
vo
no
idų
ki
ek
is
R
E
m
g
/m
l
Maceracija Ekstrakcija ultragarsuLyginant tos pačios kokybės žaliavą ir tą patį ekstrakcijos būdą, tik skirtingus ekstrahentus, aliejinį ir etanolinį, šiuo atveju naudojant žaliavą Nr. 1, maceracijos būdu gamintas etanolinis ekstraktas turi 3,4 karto daugiau flavonoidų, nei aliejinis ekstraktas taip pat gamintas su žaliava Nr. 1, o pasitelkiant ekstrakciją ultragarsu gamintas etanolinis ekstraktas turi 2,3 karto daugiau flavonoidų nei aliejinis ekstraktas.
Atlikus t–test analizę, gaunama, jog tarp maceracijos metodu gamintų ekstraktų su skirtingais ekstrahentais gaunamas statistiškai reikšmingas skirtumas (p<0,05). Taip pat statistiškai reikšmingas skirtumas gaunamas tarp ekstrakcijos ultragarsu gamintų ekstraktų naudojant skirtingus ekstrahentus.
Matavimai su etanoliniais ekstraktais buvo atliekami norint palyginti ar iš etanolinių ekstraktų atsipalaiduos daugiau flavonoidų nei gaminant aliejinius ekstraktus. Atlikus matavimus, matoma, kad etanolį naudojant kaip ekstrahentą, išgaunama daugiau flavonoidų. Toliau gaminant emulsines sistemas dalyvaus tik aliejiniai ekstraktai.
Lyginant tik aliejinius ekstraktus, daugiausiai flavonoidų gauta gaminant ekstraktą maceracijos metodu, aliejinis ekstraktas su žaliava Nr. 2 – 0,1520,016 RE mg/ml. Pagal rutino ekvivalentą išreikšti rezultatai pateikiami 7 pav. Mažiausias flavonoidų kiekis gaunamas gaminant ekstraktą mikrobangomis, tai aliejinis ekstraktas su žaliava Nr. 2 – 0,1310,012 RE mg/ml.
7 pav. Skirtingų ekstrakcijos būdų palyginimas iš aliejinių ekstraktų, kai nustatomas bendras flavonoidų kiekis. n=3
Iš grafiko matyti, kad tiriant aliejinį ekstraktą su žaliava Nr. 1, gamintą maceracijos būdu gaunama 1,1 karto daugiau flavonoidų nei ultragarsinės ekstrakcijos būdu, ir 1,1 karto daugiau nei gaminant aliejinį ekstraktą pasitelkiant mikrobangas. Tiriant aliejinį ekstraktą su žaliava Nr. 2,
0.146 0.152 0.133 0.149 0.134 0.131 0.000 0.020 0.040 0.060 0.080 0.100 0.120 0.140 0.160 0.180
Aliejinis ekstraktas su žaliava nr.1 Aliejinis ekstraktas su žaliava nr.2
F
la
vo
no
idų
ki
ek
is
R
E
m
g
/m
l
Klasikinė maceracija Ekstrakcija ultragarsu Ekstrakcija mikrobangomisgaminant maceracijos metodu flavonoidų gaunama 1,02 karto daugiau nei gaminant ultragarsinės ekstrakcijos metodu ir 1,2 karto daugiau nei ekstrahuojant mikrobangomis.
Kaip matome, gaminant ekstraktus maceracijos metodu gaunama daugiausiai flavonoidų, gaminant aliejinį ekstraktą su žaliava Nr. 1 – 0,1460,010 RE mg/ml ir su žaliava Nr. 2 – 0,1520,016 RE mg/ml
Atlikus t–test analizę nustatyta, kad lyginant aliejinius ekstraktus nėra statistiškai reikšmingo skirtumo tarp pasirinktos žaliavos. Taip pat nėra statistiškai reikšmingo skirtumo tarp pasirinkto ekstrakcijos būdo.
3.1.5. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas ekstraktuose
Žinoma, jog fenoliniai junginiai pasižymi antioksidacinėmis, priešuždegiminėmis savybėmis, todėl svarbu išsiaiškinti kokiu ekstrakcijos metodu gaminant ekstraktus galima išgauti daugiausiai fenolinių junginių.
Palyginus pagamintų aliejinių ekstraktų organoleptines savybes vertinama ne tik bendras flavonoidų kiekis, bet ir bendras fenolinių junginių kiekis. Tiriami trimis būdais (maceracija, ekstrakcija ultragarsu ir ekstrakcija mikrobangomis) pagaminti ekstraktai.
Fenolinių junginių matavimas atliekamas naudojant spektrofotometrą prie 750 nm bangos ilgio. Buvo naudojami vaistinių medetkų (Calendula officinalis) žiedų ir linų sėmenų aliejinis ekstraktas. Medetkų žaliava buvo pasirinkta tiek pirktinė, žaliava Nr. 1 (Lietuva) tiek užauginta namuose, žaliava Nr. 2 (Kupiškio raj., Lietuva). Palyginimui buvo pagamintas etanolis ekstraktas su augaline žaliava Nr. 1, standartiniu santykiu 1:10 panaudotas 96 proc. etanolis.
Bendras fenolinių junginių kiekis išreikštas mg/ml galo rūgšties ekvivalentais (GRE) naudojant galo rūgšties kalibracinę kreivę. Šis metodas yra populiarus, nes pakankamai greitas ir nereikalaujantis brangios įrangos metodas.
Apibendrinant gautus rezultatus, kurie išreikšti galo rūgšties ekvivalentu, nustatyta, kad didžiausias bendras fenolinių junginių kiekis, kaip ir flavonoidų, rastas etanoliniuose ekstraktuose, tai 0,8720,098GRE mg/ml (etanolinis ekstraktas su žaliava Nr. 1, pasitelkiant ultragarso vonelę) ir 0,9600,024 GRE mg/ml (etanolinis ekstraktas su žaliava Nr. 1, gaminamas maceracijos metodu). Pagal galo rūgšties ekvivalentą gauti rezultatai pateikiami 8 pav.
8 pav. Skirtingų ekstrakcijos būdų ir skirtingų ekstrahentų palyginimas naudojant žaliavą Nr. 1, kai nustatomas bendras fenolinių junginių kiekis
Lyginant tos pačios kokybės žaliavą, šiuo atveju žaliavą Nr. 1 ir tą patį ekstrakcijos būdą, tik parenkant skirtingą ekstrahentą, linų sėmenų aliejų ir etanolį, tiriama kiek fenolinių junginių nustatoma etanoliniame ir aliejiniame ekstraktuose.
Maceracijos būdu gamintas etanolinis ekstraktas turi 5,7 karto daugiau fenolinių junginių, nei aliejinis ekstraktas taip pat su žaliava Nr. 1, o ultragarsinės ekstrakcijos būdu gamintas etanolinis ekstraktas turi 4,6 karto daugiau fenolinių junginių nei aliejinis ekstraktas.
Atlikus t–test analizę nustatytas statistiškai reikšmingas skirtumas (p<0,05) ekstrakcijai parenkant skirtingus ekstrahentus gaminant tuo pačiu ekstrakcijos metodu. Gaminant ekstraktą su tuo pačiu ekstrahentu, tik skirtingais ekstrakcijos metodais statistiškai reikšmingo skirtumo nenustatyta.
Matavimai su etanoliniais ekstraktais buvo daromi tik norint palyginti ar iš etanolinių ekstraktų atsipalaiduos daugiau fenolinių junginių nei iš aliejinių ekstraktų. Toliau tyrimuose dalyvaus tik aliejiniai ekstraktai.
Didžiausias fenolinių junginių kiekis, ne etanoliniuose, o aliejiniuose ekstraktuose, kai matavimai išreiškiami galo rūgšties ekvivalentu, rastas: 0,2010,021 GRE mg/ml (aliejinis ekstraktas su žaliava Nr. 2, gaminant ultragarso vonelėje), o mažiausias fenolinių junginių kiekis: 0,1420,022 GRE mg/ml (aliejinis ekstraktas su žaliava Nr. 2 gamintas maceracijos metodu). Pagal galo rūgšties ekvivalentą išreikšti rezultatai pateikiami 9 pav.
0.167 0.96 0.19 0.872 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
Aliejinis ekstraktas su žaliava nr.1 Etanolinis ekstraktas su žaliava nr.1
