PUSKIEČIŲ SISTEMŲ SU BIČIŲ PRODUKTAIS GAMYBA IR BIOFARMACINIS VERTINIMAS

MEDICINOS AKADEMIJA FARMACIJOS FAKULTETAS KLINIKINĖS FARMACIJOS KATEDRA

INETA STANKEVIČIŪTĖ

PUSKIEČIŲ SISTEMŲ SU BIČIŲ PRODUKTAIS GAMYBA IR

BIOFARMACINIS VERTINIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovė Prof. dr. Kristina Ramanauskienė

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS KLINIKINĖS FARMACIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis Data

PUSKIEČIŲ SISTEMŲ SU BIČIŲ PRODUKTAIS GAMYBA IR

BIOFARMACINIS VERTINIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovė Darbą atliko

Prof. dr. Kristina Ramanauskienė Magistrantė

Data Ineta Stankevičiūtė

Data Recenzentas

Prof. S. Trumbeckaitė Data

TURINYS

SANTRAUKA ... 6 SUMMARY ... 7 PADĖKA ... 8 1. SANTRUMPOS ... 9 2. ĮVADAS ... 10

3. DARBO TIKSAS IR UŽDAVINIAI ... 11

4. LITERATŪROS APŽVALGA ... 12

4.1. Propolis, jo cheminė sudėtis, gydomosios savybės, medicininio pobūdžio moksliniai tyrimai su propoliu ... 12

4.2. Medus, jo cheminė sudėtis, gydomosios savybės, medicininio pobūdžio moksliniai tyrimai su medumi ... 13

4.3. Bičių vaškas, jo cheminė sudėtis, gydomosios savybės, medicininio pobūdžio moksliniai tyrimai su bičių vašku ... 15

4.4. Saulėgrąžų aliejus, jo cheminė sudėtis, būdingosios savybės ... 16

4.5. Puskiečių sistemų charakteristika ir jų klasifikacija ... 16

5. EKSPERIMENTINĖ DALIS ... 19

5.1. Tyrimo medžiagos ... 19

5.1.1. Reagentai ... 19

5.1.2. Įranga ... 19

5.2. Technologijos metodikos ... 20

5.2.1. Propolio ištraukų gamyba ... 20

5.2.2. Bičių produktų (geltonojo bičių vaško ir propolio) puskiečių sistemų modeliavimas ... 21

5.2.3. Bičių produktų (medaus ir propolio) puskiečių sistemų modeliavimas ... 22

5.2.4. Bičių produktų (medaus, propolio, geltonojo bičių vaško) puskiečių sistemų gamyba ... 23

5.3. Analizės metodikos... 23

5.3.1. Fenolinių junginių kiekio nustatymas propolio ištraukose ... 23

5.3.3. Propolio ištraukų antiradikalinio aktyvumo nustatymas ... 24

5.3.4. Fenolinių junginių atpalaidavimo iš puskiečių bičių produktų sistemų tyrimai in vitro ... 25

5.3.5. Fenolinių junginių kiekio nustatymas puskietėse sistemose su bičių produktais ... 25

5.3.6. Puskiečių sistemų su propoliu analizė efektyviąja skysčių chromatografija ... 26

5.3.7. Puskiečių sistemų su bičių produktais (medumi, propoliu ir bičių vašku) antiradikalinio aktyvumo nustatymas ... 26

5.3.8. Puskiečių sistemų su bičių produktais (I, II ir III grupių) pH nustatymas ... 26

5.3.9. Bičių produktų puskiečių sistemų (I ir II grupių) mikrostruktūros vertinimas ... 26

5.3.10. Statistinė analizė ... 27

6. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 28

6.1. Propolio ištraukų kokybės vertinimas ... 28

6.1.1. Propolio ištraukų bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas ... 28

6.1.2. Propolio tirštojo ekstrakto antiradikalinio aktyvumo vertinimo rezultatai ... 29

6.1.3. Tirštojo propolio ekstrakto veikliųjų junginių kiekio nustatymas efektyviosios skysčių chromatografijos analizės metodu ... 29

6.2. Puskiečių sistemų su bičių produktais mikrostruktūros vertinimas ... 30

6.2.1. Puskiečių sistemų su bičių produktais (I grupė) mikrostruktūros tyrimo rezultatai ... 31

6.2.2. Puskiečių sistemų su bičių produktais (II grupė) mikrostruktūros tyrimo rezultatai ... 32

6.3. Puskiečių sistemų su bičių produktais pH vertinimas ... 32

6.4. Biofarmacinis puskiečių sistemų su bičių produktais vertinimas in vitro ... 33

6.4.1. I grupės puskiečių sistemų biofarmacinis vertinimas ... 33

6.4.2. II grupės puskiečių sistemų biofarmacinis vertinimas ... 35

6.4.3. III grupės puskiečių sistemų biofarmacinis vertinimas ... 36

6.5. II ir III grupių puskiečių sistemų antiradikalinio vertinimo rezultatai ... 37

6.6. I ir II grupių puskiečių sistemų veikliųjų junginių kiekio nustatymas efektyviosios skysčių chromatografijos analizės metodu ... 38

6.6.1. I ir II grupių puskiečių sistemų atskirų veikliųjų junginių kiekio nustatymas ESC analizės metodu ... 38

6.6.2. I ir II grupių puskiečių sistemų suminio fenolinių junginių kiekio nustatymas ESC analizės

metodu ... 45

7. IŠVADOS ... 47

8. REKOMENDACIJOS ... 49

9. LITERATŪROS SĄRAŠAS... 50

SANTRAUKA

PUSKIEČIŲ SISTEMŲ SU BIČIŲ PRODUKTAIS GAMYBA IR

BIOFARMACINIS VERTINIMAS

Inetos Stankevičiūtės magistro baigiamasis darbas. Darbo vadovė prof. dr. K. Ramanauskienė. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto,Farmacijos fakulteto,Klinikinės farmacijos katedra.Kaunas.

Tyrimo tikslas: sumodeliuoti puskietes sistemas su bičių produktais ir įvertinti jų kokybę biofarmaciniais tyrimais.

Uždaviniai: 1. Atrinkti tinkamą propolio, kaip veikliosios medžiagos, formą įvedimui į modeliuojamas puskietes sistemas; 2. Pagaminti stabilias puskietes formas su bičių produktais (bičių vašku, propoliu, medumi) ir įvertinti jų kokybę, tiriant šiuos parametrus: vienalytiškumas, pH reikšmė, antioksidacinis aktyvumas; 3. Atlikti puskiečių sistemų su bičių produktais biofarmacinį vertinimą ir identifikuoti veiksnius, darančius įtaką bendro fenolinių junginių kiekio atpalaidavimui; 4. Įvertinti puskiečių formų su bičių produktais kokybę, remiantis atliktais veikliųjų junginių (fenolinių rūgščių, vanilino) atpalaidavimo in vitro tyrimo rezultatais.

Bičių produktų puskiečių sistemų analizei pasirinktas fenolinių junginių nustatymas spektrofotometriniu ir ESC metodais bei spektrofotometrinis metodas laisvųjų DPPH· radikalų surišimo aktyvumui pagal troloksą nustatyti. Vaisto formų kokybė vertinta nustatant pH reikšmę ir atliekant veikliųjų junginių atpalaidavimo tyrimą in vitro. Į puskietes sistemas veiklioji medžiaga (propolis) įterpiama tirštojo arba skystojo (gelyje) ekstrakto forma. Stabilios I grupės sistemos pagaminamos tada, kai bičių vaško ir saulėgrąžų aliejaus santykis ne didesnis kaip 1:5. Bičių vaškas ir medus daro įtaką atpalaiduojamam veikliųjų junginių kiekiui – didėjant vaško kiekiui, veikliųjų junginių iš sistemų atsipalaiduoja mažesnis kiekis, o iš medaus atpalaiduoti fenoliniai junginiai padidina atpalaiduotų veikliųjų junginių kiekį iš puskietės sistemos. Daugiausia veikliųjų junginių atsipalaiduoja iš puskiečių sistemų su medumi ir propoliu po 6 val. nuo tyrimo pradžios (13,46±0,26 proc.). Sistemoms būdinga pH reikšmė nuo 4,07±0,034 iki 5,383±0,162. Puskietės sistemos su didžiausiu veikliosios medžiagos (propolio) kiekiu pasižymi geriausiu antioksidaciniu aktyvumu, o medus puskietėse sistemose antioksidacinį aktyvumą sustiprina. ESC metodu nustatyta, jog puskietėse sistemose dominuoja p-kumaro, ferulo rūgštys bei vanilinas. Sistemose su medumi nustatomas didesnis šių junginių kiekis, todėl įrodyta, jog medus puskietėse sistemose gali būti naudojamas ne tik kaip pagalbinė medžiaga, bet ir veiklioji medžiaga.

SUMMARY

SEMISOLID SYSTEMS WITH BEES PRODUCTS MANUFACTURING AND

BIOPHARMACEUTICAL EVALUATION

Ineta Stankevičiūtė master thesis. Term paper advisor: prof. dr. K. Ramanauskienė; Lithuanian University of Health Sciences,Faculty of pharmacy,Department of Clinical Pharmacy.Kaunas

The aim of work: Formulate and analyze semisolid preparations with bees products and evaluate their quality by biopharmaceutical researches.

Main tasks: 1. Select the proper form of propolis as an active material in formulated semisolid systems; 2. Formulate stable semisolid systems with bees products (beeswax, propolis, honey) and evaluate their quality by investigation of these parameters: homogenity, pH value, antioxidant activity; 3. Perform biopharmaceutical evaluation of semisolid systems with bees products and identify the factors that influence release the total amount of phenolic compounds; 4. Evaluate quality of semisolid systems with bees products based on active compounds (phenolic acids, vanillin) in vitro release test results.

Semisolid systems with bees products are analyzed by using spectrophotometric and capillary HPLC methods for analysis of total phenolic compounds measuring, DPPH· free radical scavenging activity measuring according to trolox. Quality of the systems was evaluated by measuring pH values and by testing release of active compounds in vitro. The active substance propolis is inserted into semisolid systems by thick or liquid (in gels) extract form. Stable system of the Group I semisolid systems is formulated when beeswax and sunflower oil ratio is less than 1:5. Beeswax and honey in systems affect the release of active compounds - increasing the wax content, the active compounds release of the systems is reduced, adequate quantity of honey increases the release of active compounds from semisolid systems. The largest amount of the active compounds is released from semisolid systems with honey and propolis after 6 h from the beginning of the study (13.46 ± 0.26 per cent.). Semisolid systems pH value is from 4,07±0,034 till 5,383±0,162. Semisolid systems with the largest amount of the active compound (propolis) has the best antioxidant activity. Honey compound in semisolid systems strengthens the antioxidant activity. HPLC method showed that in semisolid systems dominate p-coumaric, ferulic acid and vanillin. In semisolid systems with honey are found higher levels of these active compounds, so studies demonstrated that honey can be used as an active compounds in semisolid systems.

PADĖKA

Už suteiktas kokybiškas darbo sąlygas, teorinę ir praktinę pagalbą bei materialinę bazę atlikti mokslinį tiriamąjį darbą „Puskiečių sistemų su bičių produktais gamyba ir biofarmacinis vertinimas“ dėkoju savo darbo vadovei prof. dr. K. Ramanauskienei ir visam Klinikinės farmacijos katedros kolektyvui.

1. SANTRUMPOS

proc. – procentai pH – vandenilio potencialas min. – minutės val. – valandos pav. – paveikslas

ESC – efektyvioji skysčių chromatografija r. – rūgštis

o

2. ĮVADAS

Oda yra didžiausias žmogaus organas, sudarytas iš raginio sluoksnio, gyvojo epidermio, tikrosios odos arba dermos, poodžio arba hipodermos. Neigiamos aplinkos sąlygos skatina odos raginio sluoksnio pažeidimą, tuomet sutrinka odos barjerinės funkcijos, sumažėja riebalinių liaukų sekrecija. Norint atkurti odos raginio sluoksnio lipidinį barjerą, naudojami tokie riebalai, kurie panašūs į šio sluoksnio lipidinę struktūrą, ypač linoleno rūgštis. Tokių lipidinių medžiagų gausu aliejuose, todėl tyrimui pasirinktos puskietės sistemos su saulėgrąžų aliejumi, kuriame yra net 66 proc. linoleno rūgšties. Taip pat puskiečių sistemų modeliavimui pasirinkta natūrali medžiaga bičių vaškas, kuri skatina odos pažeidimų gijimą.

Viena dažniausių odos ligų yra atopinis dermatitas (PSO, 2005). Dermatologiniai preparatai iš natūralių neapdirbtų žaliavų tampa vis populiaresni, todėl tyrėjai ir gamintojai siekia sukurti stabilų produktą iš natūralių medžiagų, kuris atitiktų šiuolaikinius reikalavimus [43]. Taip pat yra aktualu sumodeliuoti tokią sistemą, kuri būtų sudaryta ne tik iš natūralios veikliosios medžiagos, bet ir iš natūralaus pagrindo [44]. Ankstesniuose tyrimuose išnagrinėta, jog medaus tirpalai su bičių vašku ir aliejumi gali būti taikomi atopinio dermatito, psoriasis vulgaris ir dermatito, atsiradusio dėl vystyklų, gydymui [45, 46]. Visi šie komponentai naudoti mūsų gamintoje puskietėje sistemoje. Medus dėl savo antiuždegiminių savybių plačiai taikomas nudegimams bei egzemai gydyti [47].

Kitos sudėtinės medžiagos, medus ir propolis, pasižymi antibakteriniu ir priešgrybeliniu veikimu bei suteikia puskietei sistemai konservuojančių savybių, todėl tyrime nenaudotos kitos puskietės sistemos galiojimo laiką ilginančios medžiagos.

Šiuo metu Lietuvoje tampa populiaru gydytis natūraliomis priemonėmis, todėl yra aktualu sumodeliuoti puskietę sistemą iš natūralių medžiagų, šiuo atveju iš bičių produktų, kuri pasižymėtų apsauginiu bei odos pažeidimus gydančiu poveikiu ir būtų tinkama vartoti pakankamai ilgą laiką.

3. DARBO TIKSAS IR UŽDAVINIAI

Tyrimo problema: ar bičių produktai (bičių vaškas, medus, propolis) yra tinkamos medžiagos natūralios kilmės puskiečių preparatų įvedimui.

Tyrimo objektas: pusiau kietos sistemos su bičių produktais.

Darbo tikslas: sumodeliuoti puskietes sistemas su bičių produktais ir įvertinti jų kokybę biofarmaciniais tyrimais.

Darbo uždaviniai:

1. Atrinkti tinkamą propolio, kaip veikliosios medžiagos, formą įvedimui į modeliuojamas puskietes sistemas.

2. Pagaminti stabilias puskietes formas su bičių produktais (bičių vašku, propoliu, medumi) ir įvertinti jų kokybę, tiriant šiuos parametrus: vienalytiškumas, pH reikšmė, antioksidacinis aktyvumas.

3. Atlikti puskiečių sistemų su bičių produktais biofarmacinį vertinimą ir identifikuoti veiksnius, darančius įtaką bendro fenolinių junginių kiekio atpalaidavimui.

4. Įvertinti puskiečių formų su bičių produktais kokybę, remiantis atliktais veikliųjų junginių (fenolinių rūgščių, vanilino) atpalaidavimo in vitro tyrimo rezultatais.

4. LITERATŪROS APŽVALGA

4.1. Propolis, jo cheminė sudėtis, gydomosios savybės, medicininio pobūdžio

moksliniai tyrimai su propoliu

Propolis (bičių pikis) yra rusvos arba tamsiai pilkos spalvos, stipraus, tačiau malonaus aromato masė. Propoliui senstant, jo spalva tamsėja. Veiksmingosios savybės propolyje išlieka iki 10 metų [1]. Propolis kambario temperatūroje (15o

C) būna kietas ir elastingas, tačiau 30o

C temperatūroje – minkštas ir klijingas. Propolis gerai tirpsta eteryje ir spirite, tačiau prastai – karštame vandenyje [2].

Propolio cheminė sudėtis ir farmakologinis aktyvumas priklauso nuo jo geografinės kilmės ir metų laiko poveikio [8 - 11].

Propolio cheminė sudėtis yra labai įvairi: 55 proc. jo sudėties sudaro įvairios aromatinės medžiagos, 30 proc. - vaškas, 10 proc. - eterinis aliejus, 5 proc. – žiedadulkės. Iš visų cheminių medžiagų propolyje nustatytas didžiausias flavanoidų kiekis (net 25 proc.). Juos sudaro organinės rūgštys (vanilinė, benzoinė bei kitos), eteriai, terpenai, tokie kaip bisabololas, fenolino trigliceroidai, pferostilbenas, taip pat betulenolas, betulenas, vanilino bei izovanilino aldehidai. Propolyje gausu mineralinių medžiagų, kurių kiekiai gali būti vos aptinkami ir siekti 11,6 µg/100g. Šios medžiagos yra cinkas, nikelis, manganas, varis, kalis, kalcis, kobaltas, natris, magnis, siera, fosforas, geležis. Taip pat aptinkami nedideli vitaminų kiekiai – C, E, A, B1, B2, B6, pantoteno bei nikotino rūgštys. Bičių pikyje randama 8 – 17 aminorūgščių: alanino, serino, triptofano, gliukolio, lizino, metionino, leicino, histidino bei valino. Žinoma, svarbios propolio sudėtinės dalys yra ir įvairūs angliavandeniliai, sudėtingos riebalinės rūgštys, inhibitoriai, antimikrobinės ir kitos biologiškai aktyvios medžiagos [2]. Propolio sudėtyje esantys flavonoidai ir (hidroksilo) cinamono rūgšties dariniai plačiai naudojami kaip biologiškai aktyvūs mišiniai [12 – 14]. Įrodyta, jog jo etanolinės ištraukos ir heksano frakcijos (H-Fr) pasižymi puikiu antimikrobiniu aktyvumu prieš patogenus, įskaitant mutantinius streptokokus [15 – 17].

Dėl propolio sudėtyje esančių įvairių aktyvių medžiagų, nustatytas jo poveikis: 1) galangino, pinacembrino, ferulinė rūgštis pasižymi antibakteriniu veikimu;

2) p-kumaro rūštis, pterostilbinas, 3-acetil-pinobanksino benzilo esteriai – priešgrybelinis veikimas;

3) kvercetinas bei liutseolinas pasižymi priešvirusiniu veikimu;

4) kofeininės rūgšties fenetilo esteriai, metilfuruleatas – priešvėžinis veikimas; 5) pinocembrinas, kofeininiai eteriai, pinostrobinas – nuskausminantis poveikis;

6) kofeininė rūgštis bei akacetinas veikia priešuždegimiškai;

7) pektolinarigeninas pasižymi spazmus atpalaiduojančiu poveikiu [3].

Propolio veikimo spektras labai platus, todėl šis bičių produktas pasižymi dar ir kapiliarų trapumą mažinančiu bei priešopiniu veikimu [3].

Kitų autorių teigimu, propolio antimikrobinis aktyvumas priklauso nuo jo cheminės sudėties [16 – 17].

Tiriant lietuviškąjį propolį, sudėtyje taip pat aptikta aromatinių rūgščių ir karboninių rūgščių su benzeno žiedu alifatinėje grandinėje, dėl ko pikis pasižymi stipriu antimikrobiniu aktyvumu ir veikia prieš Bacillus subtilis ir Pseudomonas aeruginosa [18]. Šie komponentai taip pat pasižymi raumenis atpalaiduojančiu veikimu [19]. Esteriai ir fenolinės rūgštys, tokios kaip ferulatai ir kofeatai pasižymi antivirusiniu, antibakteriniu ir antiuždegiminiu aktyvumu [20] bei slopina laisvųjų radikalų susidarymą 86 proc. [21]. Analizuojant fenolinių rūgščių kiekį lietuviškame propolyje, taikytas efektyviosios skysčių chromatografijos metodas. Tyrimų duomenimis, kokybinė ir kiekybinė fenolinių rūgščių sudėtis propolyje priklauso nuo to, kokie augalai dominuoja vietovėse, kuriose bitės renka medžiagas propolio žaliavai. Be to, surinktame propolyje didesnis veikliųjų medžiagų kiekis nustatytas iš tų vietovių, kuriose dominuoja lapuočiai medžiai. Nustatyta, kad pagrindinės fenolinės rūgštys yra ferulinė rūgštis ir p-kumaro rūgštis. Gaminant propolio preparatus, jos galėtų būti kokybės rodikliu žaliavos standartizavimui [22].

4.2. Medus, jo cheminė sudėtis, gydomosios savybės, medicininio pobūdžio

moksliniai tyrimai su medumi

Medus yra gaminamas iš augalų nektaro ar sekretą išskiriančių gyvųjų augalo dalių, kuriuos bitės surenka, perdirba, papildydamos specifinėmis savo medžiagomis, dehidratuoja, sandėliuoja, patalpina į korį, brandina [28].

Medus sudarytas iš 19 proc. vandens ir 81 proc. sausųjų medžiagų. Meduje daugiausia yra angliavandenių, kurių didžiausią dalį sudaro gliukozė (apie 34 proc.) bei fruktozė (apie 40 proc.), taip pat svarbios sudėtinės dalys yra sacharozė (1,5 – 5 proc.), melitozė (5 – 10 proc.) bei apytiksliai 20 proc. kitokių sudėtingų cukrų. Gliukozė ir fruktozė yra meduje invertuoti cukrai, jų kiekis priklauso nuo augalų, iš kurių medus yra surinktas [2].

Pavyzdžiui, invertuoto cukraus yra 71,4 proc. grikių, 73,8 proc. viržių, 74,7 proc. liepų meduje. Žiedų gyvavimo laikotarpis, dirvožemis bei klimato sąlygos yra kiti svarūs veiksniai, darantys

įtaką cukraus kiekiui meduje. Pavyzdžiui, žydėjimo pabaigoje medaus kiekis žiede sumažėja. Žmogaus organizmas fruktozę bei gliukozę pasisavina kur kas geriau negu sacharozę ar kitus angliavandenius. Virškinamajame trakte fruktozė verčiama į gliukozę, o gliukozė iš virškinamojo kanalo absorbuojama į kraują, pernešama į žmogaus organizmo audinius ir panaudojama kaip energijos šaltinis [2].

Medaus sudėtyje taip pat gausu mineralinių medžiagų, tokių kaip kalis, kalcis, geležis, natris, magnis, bei vitaminų – pantoteno rūgštis, PP, C, B1, B2, B6. Nustatyti nedideli kiekiai azotinių medžiagų (0,3 proc.), aminorūgščių (fenilalanino, prolino), taip pat aptikti fitoncidai, kai kurie hormonai, fermentai bei aromatinės ir baktericidinės medžiagos [2].

Medaus klampumas priklauso nuo kelių veiksnių: temperatūros, drėgmės, kristalinės struktūros. Šiuos veiksnius svarbu įvertinti prieš naudojant medų kaip pagrindinę veikliąją ar pagalbinę medžiagą [23].

Tirtuose lietuviškojo medaus bandiniuose vandens kiekis buvo tarp 18 ir 20,2 proc. Didžiausias bendrasis rūgštingumas buvo būdingas miško ir grikių medui, o mažiausias – akacijų medui. Mažiausia pH vertė (3,76) nustatyta miško ir rapsų meduje, o didžiausia - eukaliptų meduje [23].

Tiriant lenkiškąjį medų, buvo naudojama fenolinių junginių ekstrakcija ir atliekami spektrofotometriniai ir efektyviosios skysčių chromatografijos metodai. Natūralaus medaus spalva priklausomai nuo jo augalinio šaltinio gali varijuoti nuo vandens baltumo (dobilų, šalavijų medus) iki tamsios (lipčiaus, viržių, kaštonų medus) [24]. Spalva priklauso ir nuo mineralų kiekio [25].

Fenoliniai junginiai kiekybiškai buvo vertinami Folin-Ciocalteu metodu bei kokybiškai – efektyviosios skysčių chromatografijos metodu. Bendras fenolinių junginių kiekis bandiniuose buvo 71,7-202,6 µg/g. Fenolinių junginių kiekis didžiausias buvo tamsesniuose (grikių ir viržių) bandiniuose. Medaus spalvos intensyvumas priklauso nuo fenolinių junginių kiekio. Nustatytas flavonoidų kiekis yra penkis kartus mažesnis už bendrąjį fenolinių junginių kiekį (13,5-44,5 µg/g). Mėginiuose dominavo fenolinės rūgštys. Kofeino, ferulo, benzoinė rūgštys, rutinas, kemferolis ir pinocembrinas buvo nustatyti daugelyje bandinių, tačiau skyrėsi atskirų junginių kiekis [26].

Naudojantis efektyviosios skysčių chromatografijos metodu, galima nustatyti ir kiekybiškai įvertinti laisvąsias fenolines rūgštis ir vaniliną meduje. Vanilinas aptiktas visuose mėginiuose, tačiau daugiausia jo rasta grikių meduje. Laisvosios fenolinės rūgštys ir vanilinas aptikti visuose medaus mėginiuose, jų kiekis ir suma priklauso nuo medaus botaninės kilmės [27].

Medus dėl jame esančių lakiųjų medžiagų fitoncidų pasižymi bakterijas ir grybelius naikinančiu veikimu. Taip pat šios medžiagos bei kai kurie fermentai suteikia medui konservuojančių savybių [2].

Gydomaisiais tikslais medus vartojamas stenokardijai, viršutinių kvėpavimo takų uždegimams, hipertonijai bei aterosklerozės sukeltai hipertonijai, širdies ar klimakterinei neurozei, ūminiam ar lėtiniam kepenų uždegimui, odos nudegimams bei pūliuojančioms žaizdoms, rečiau ginekologijoje, ragenos žaizdoms, ankstyvosioms kataraktos formoms, konjunktyvitams ir vaikų ligoms.

4.3. Bičių vaškas, jo cheminė sudėtis, gydomosios savybės, medicininio

pobūdžio moksliniai tyrimai su bičių vašku

Korių gamybai naudojamas bičių vaškas būna gelsvas dėl jame esančių propolio ir žiedadulkių priemaišų, tačiau šviežias vaškas būna baltos spalvos. Nors natūralus bičių vaškas pasižymi maloniu medaus kvapu, paragavus yra beskonis. Vaškas yra kietos konsistencijos masė, tačiau pašildžius iki 60 – 68 o

C temperatūros, lydosi. Esant kietai konsistencijai netirpsta nei vandenyje ar glicerine, nei šaltame spirite, tačiau esant lydymosi temperatūrai, tirpsta chloroforme, acetone, terpentine ir benzine [2].

Bičių vaško sudėtyje yra 70 – 75 proc. sudėtingų esterių, 13 – 15 proc. laisvųjų riebiųjų rūgščių bei 12 – 15 proc. angliavandenių. Esteriai sudaryti iš tiesios grandinės monoalkoholių, kurių anglies atomų skaičius nuo C24 iki C36, ir tiesios grandinės rūgščių, kurių anglies atomų skaičius yra

virš C36 [5]. Kitos sudėtinės dalys yra vanduo (0,1 – 2,5 proc.), karotinoidai (provitaminas A),

aromatinės ir dažomosios medžiagos, mineralinės medžiagos. Vaško sudėtyje randama pikio, žiedadulkių bei mirusių bičių liekanų ar lervučių priemaišų, nuo kurių kiekio priklauso vaško kokybė [2].

Bičių vaškas puskietėse sistemose atlieka emulsijų stabilizatoriaus funkciją, nes turi emulsuojančių savybių, beje, dažnai atlieka nešiklio, kietiklio, tirštiklio funkciją [4].

Bičių vaškas yra naudojamas kaip pagalbinė medžiaga įvairiuose kosmetikos, maisto bei konditerijos gaminiuose. Kremų, losjonų, tepalų bei lūpų balzamų sudėtyje jo koncentracija būna 5 – 20 proc. Šiuose produktuose vaškas atlieka tirštiklio funkciją, kitur dar gali pasižymėti plastiškumą suteikiančiomis savybėmis [5].

Emulsuoti nedidelį vandens kiekį vaškai gali dėl sudėtyje esančių laisvųjų alkoholių. Puskiečių sistemų gamybai pramonėje naudojami geltonasis (Cera flava) ir mažiau stabilus baltasis (Cera alba) bičių vaškai [6].

4.4. Saulėgrąžų aliejus, jo cheminė sudėtis, būdingosios savybės

Saulėgrąžų aliejus (Helianthus annuus) yra laikomas oleino – linoleno rūgščių aliejumi, kurio sudėtyje yra 66 proc. linoleno, 21,3 proc. oleino, 6,4 proc. palmitino, 4,0 proc. arachidono, 1,3 proc. stearino ir 0,8 proc. beheno rūgščių. Aliejus gaunamas iš saulėgrąžų sėklų naudojant mechaninę jėgą arba ekstrakcijos būdu. Naudojamas kaip skiediklis, minkštiklis, emulsiklis, tirpiklis, tablečių rišamoji medžiaga. Terapiškai saulėgrąžų aliejus vartojamas parenteraliai kaip energetinė medžiaga ir pagrindinių riebiųjų rūgščių šaltinis, jis gali būti injekuojamas į raumenis nesukeldamas audinių pažeidimo. Jis apibūdinamas kaip skaidrus, šviesiai geltonos spalvos skystis, turintis švelnų, priimtiną skonį. Saulėgrąžų aliejus verda 40 – 60 o

C temperatūroje, lydosi esant -18 o

C temperatūrai, maišosi su benzenu, chloroformu, anglies tetrachloridu, dietilo eteriu, petroleteriu, praktiškai netirpsta 95 proc. etanolyje ir vandenyje [29].

Saulėgrąžų aliejus turi būti laikomas sandariose, gerai užpildytose talpyklėse, apsaugančiose nuo šviesos. Stabilumą gali pagerinti pridėtas antioksidantas. Oksidacinis aliejaus stabilumas sumažėjęs dėl sudėtyje esančių geležies oksidų ir zinko oksido, po sąlyčio su oru, suformuoja plėvelę, kuri būna stabili 2 – 3 savaites. Saulėgrąžų aliejus plačiai naudojamas maisto pramonėje kaip valgomasis aliejus, kosmetikoje, farmacinėse formose, yra netoksiškas ir nedirginantis [29].

4.5. Puskiečių sistemų charakteristika ir jų klasifikacija

Vaistiniai preparatai, vartojami ant odos, yra dviejų rūšių – veikiantys vietiškai ir sistemiškai [30, 31]. Pusiau kieti preparatai, vartojami ant odos, sudaryti iš paprasto ar sudėtinio pagrindo, kuriame yra ištirpinta arba disperguota 1 ar kelios aktyviosios medžiagos. Atsižvelgiant į preparato sudėtį, pagrindas gali daryti įtaką preparato stiprumui. Pagrindas gali būti sudarytas iš natūralių ar sintetinių medžiagų ir būti vienafazis arba daugiafazis. Atsižvelgiant į pagrindą, preparatas gali turėti hidrofilinių ar hidrofobinių savybių, sudėtyje gali turėti antimikrobinių konservantų, antioksidantų, stabilizatorių, emulsiklių, tirštiklių, skvarbą gerinančių medžiagų. Preparatai, skirti vartoti ant pažeistos odos, yra sterilūs. Puskiečiai preparatai gali būti skirstomi į keletą kategorijų: tepalus, kremus, gelius, pastas, šuteklius, medicininius pleistrus, transderminius pleistrus. Atsižvelgiant į jų struktūrą, tepalai, kremai ir geliai pasižymi viskoelastinėmis, tačiau nepasižymi niutoninėmis savybėmis [30].

Vietiškai veikiančių preparatų veikimo vieta yra odos paviršius, raginis sluoksnis ir epidermis/derma. Šiai kategorijai priklauso kremai, geliai, tepalai, pastos, suspensijos, losjonai, putos,

purškalai, tirpalai ir aerozoliai. Tepalai, kremai ir geliai vadinami puskietėmis sistemomis. Sisteminiu poveikiu pasižymi prilimpančios transderminės sistemos arba transderminiai pleistrai [31].

Tepalus sudaro vienafazis pagrindas, kuriame disperguota kieta arba skysta veiklioji medžiaga. Hidrofobiniai tepalai gali absorbuoti nedidelius kiekius vandens. Paprastai naudojami pagrindai yra kieto, skysto pavidalo parafinas, daržovių aliejai, gyvuliniai riebalai, sintetiniai gliceridai, vaškai ir skysti polialkilsiloksanai. Vandenį emulguojantys tepalai gali absorbuoti didesnius vandens kiekius, priklausomai nuo emulsiklio po homogenizacijos susidaro vanduo/aliejuje arba aliejus/vandenyje tipo emulsija. Hidrofilinių tepalų pagrindai maišosi su vandeniu, pagrindas dažniausiai sudarytas iš skystų ir kietų makrogolių mišinio (polietileno glikolių). [ph.eur] Tepalai yra pusiau kieti preparatai, skirti vartoti išoriškai ant odos ar gleivinės. Gydymo tikslais tepalai vartojami kaip odą minkštinantys ir apsaugantys preparatai, tačiau dažniausiai vartojami kaip transportinės priemonės, padedančios veikliajai medžiagai patekti į reikiamą veikimo vietą [32].

Kremai yra daugiafaziai preparatai, sudaryti iš lipofilinės ir vandeninės fazės. Lipofiliniai kremai sudaryti iš nepertraukiamos lipofilinės fazės, sudėtyje turi vanduo/aliejuje tipo emulsiklių, o hidrofilinių nepertraukiama fazė vandeninė, sudėtyje yra aliejus/vandenyje tipo emulsiklių.[ph.eur.] Kremų sudėtyje būna viena ar daugiau vaistinių medžiagų, kurios ištirpinamos arba disperguojamos atitinkamame pagrinde. Įprastai tai yra aliejus/vandenyje tipo emulsija arba vandeninė mikrokristalinė dispersinė sistema iš ilgosios grandinės riebiųjų rūgščių arba alkoholių, kurie yra nuplaunami vandeniu arba kosmetiniu ir estetiniu požiūriu priimtini vartoti [32].

Geliai sudaryti iš mažų neorganinių dalelių arba didelių organinių molekulių, į kurias įsiskverbia skystis. Geliai gali turėti vandeninį pagrindą (vandeniniai geliai) arba organinio tirpiklio pagrindą (organogeliai) [33].

Pastose gali būti viena arba kelios vaistinės medžiagos, įvestos į pagrindą dideliais kiekiais ir smulkiai disperguotos [32].

Šutekliai sudaryti iš hidrofilinio šilumą sulaikančio pagrindo, kuriame disperguota kieto ar skysto pavidalo veiklioji medžiaga. Jie būna paskleisti gana storu sluoksniu ant atitinkamo tvarsčio ir prieš vartojimą pašildomi [30].

Medicininiai pleistrai yra lankstūs preparatai, sudėtyje turintys vieną ar daugiau veikliųjų medžiagų. Jie dedami ant odos, išlaikomas ilgai trunkantis kontaktas su oda, nes veikliosios medžiagos absorbuojamos lėtai, pleistras taip pat gali veikti kaip apsauginė ar keratolitinė priemonė [30].

Odos pleistrai taip pat yra lankstūs preparatai, sudėtyje turintys vieną ar kelias veikliąsias medžiagas, skirtas vartoti ant odos. Išlaikomas glaudus kontaktas su oda, tačiau veikimas yra tik vietinis [30].

Pusiau kieti preparatai lokaliai vartojami ant odos, ragenos, tiesiosios žarnos audinių, nosies gleivinės, makšties, burnos audinių, šlaplės membranos, išorinės ausies gleivinės. Dėl ypatingų reologinių savybių šie preparatai vartojimo vietoje prilimpa ir išsilaiko pakankamai ilgą laiką, iki kol yra nuplaunami, taip prailginamas vaistinės medžiagos tiekimo laikas. Puskiečių sistemų privalumai: nesudėtingas vartojimo būdas, greitas reikiamo kiekio formavimas, gebėjimas lokaliai tiekti didelį vaistinės medžiagos molekulių kiekį [32].

Vaistų absorbcija per odą. Puskietės sistemos, skirtos odos ligoms gydyti, veikia vietiškai epidermio audinį. Vaisto gebėjimas įsiskverbti į odos epidermio, dermos ar poodinius riebalų sluoksnius priklauso nuo vaistinės medžiagos ir nešiklio savybių. Pagrindiniai vaistų patekimo per odą keliai yra plaukų folikulai, prakaito liaukos arba nepažeistas raginis sluoksnis, esantis tarp šių dviejų odos priedų [34, 35]. Daugiausia vaistų patekimo kelias priklauso nuo vaistinės medžiagos fizikinių ir cheminių savybių bei odos būklės [32].

Sisteminis vaisto pristatymas. Didelis odos paviršiaus plotas 1,73 m2 palengvina šių vaistų formų vartojimą [36]. Vartojant tokioje formoje, vaistinė medžiaga lengvai patenka per odą, išvengiama pirminio prasiskverbimo pro žarnų sieneles virškinamajame trakte bei metabolizmo kepenyse, ilgiau išsilaiko pastovi vaisto koncentracija kraujyje, pasireiškia mažiau šalutinių poveikių, geresnis biologinis prieinamumas, reikalinga mažesnė vaisto doze, pacientai labiau laikosi vaisto vartojimo nurodymų, nutraukiant vaistinį preparatą pastebima mažiau neigiamų reakcijų negu vartojant kitas vaisto formas [37]. Įprastai kremo vidutinio lašelio dydis svyruoja tarp 10 – 100 µm. Tokio dydžio lašeliai prastai skverbiasi į gilesnius odos sluoksnius. Mikrodalelės, kurių skersmuo yra tarp 3 ir 10 µm, selektyviai prasiskverbia pro folikulų latakus, o dalelės, kurių skersmuo >10 µm, lieka ant odos paviršiaus, kurių skersmuo <3 µm – greitai prasiskverbia į plauko folikulus ir raginį sluoksnį [38, 39].

5.

_{EKSPERIMENTINĖ DALIS}

5.

1. Tyrimo medžiagos

5.1.1. Reagentai

Bevandenis natrio karbonatas Na2CO3,Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Vokietija

Folin-Ciocalteu‘s reagentas Sigma – Aldrich® Chemie GmbH, Steinheim, Vokietija

Acetonitrilas ≥ 99,9 proc. grynumo, Sigma – Aldrich® Chemie GmbH, Steinheim, Vokietija Acto rūgštis ≥ 99,8 proc., Sigma – Aldrich® Chemie GmbH, Steinheim, Vokietija

Etanolis 96,3 proc., AB „Stumbras“, Kaunas, Lietuva

2,2-difenil-1-pikrilhidrazilas DPPH, Sigma – Aldrich® Chemie GmbH, Steinheim, Vokietija Carbopol® 981 NF Polymer, Homopolymer Type A, Lubrizol®, Ohajo valstija, JAV

Natrio hidroksidas NaOH, Lachema, Brno, Čekijos Respublika

Saulėgrąžų aliejus (Helianthus annuus), Sigma – Aldrich® Chemie GmbH, Steinheim, Vokietija

Medus, bitininkas J. Aguonis, Lazdijų raj., Lietuva Propolis, bitininkas J. Aguonis, Lazdijų raj., Lietuva Bičių vaškas, UAB „Bičių korys“, Vilnius, Lietuva

Vanilo rūgštis ≥ 98 proc., Sigma – Aldrich® Chemie GmbH, Steinheim, Vokietija Kavos rūgštis ≥ 98 proc., Sigma – Aldrich® Chemie GmbH, Steinheim, Vokietija Vanilinas ≥ 99 proc., Sigma – Aldrich® Chemie GmbH, Steinheim, Vokietija Kumaro rūgštis ≥ 98 proc., Sigma – Aldrich® Chemie GmbH, Steinheim, Vokietija Ferulo rūgštis ≥ 99 proc., Sigma – Aldrich® Chemie GmbH, Steinheim, Vokietija

5.1.2. Įranga

Spektrofotometras su diodų matricos detektoriumi: Agilent 8453 UV – Vis/DAD, Agilent technologies®, JAV

Magnetinė maišyklė su kaitinimo įranga: IKA® C – MAG H57, IKA®-Werke GmbH & Co. KG, Vokietija

Kapiliarinis skysčių chromatografas: Agilent Infinity 1260 Capillary LC – DAD, Agilent technologies®, JAV

pHmetras: HD 2105.1, Delta OHM, Italija

Svarstyklės: Scaltec SBC 31, Scaltec Instruments GmbH, Vokietija

5.2. Technologijos metodikos

5.2.1. Propolio ištraukų gamyba

5.2.1.1. Propolio etanolinių ištraukų gamyba

Propolio etanolinės ištraukos gaminamos santykiu 1:1, 1:5 ir 1:10. Skystųjų propolio ištraukų gaminama po 50 ml. Ištraukų sudėtys pateiktos 1 lentelėje.

1 lentelė. Etanolinių propolio ištraukų sudėtys. Etanolinės propolio ištraukos

santykis

Propolio masė, g 70 proc. etanolio tūris, ml

1:1 15,0 100

1:5 10,0 50

1:10 2,5 50

Etanolinės propolio ištraukos gaminamos naudojant 70 proc. Koncentracijos etanolį. Etanolio reikiama koncentracija paskaičiuojama:

96% 70 t.d.

70%

0% 26 t.d.

Išdžiovinta susmulkinta propolio žaliava užpilama atitinkamu ekstrahento, 70 proc. etanolio, kiekiu, sandariai uždaroma bei paliekama stovėti 7 paras, esant kambario temperatūrai (15 – 25o

C). Gauta ištrauka filtruojama naudojant popierinį filtrą į tamsaus stiklo buteliuką [40].

5.2.1.2. Tirštojo propolio ekstrakto gamyba

Gaminama 100 g ekstrakto, žaliavos-ekstrahento santykis 1:1. Ekstrahentu naudojamas 70 proc. koncentracijos etanolis. Ekstrakcija iš propolio vykdyta vieną valandą maišant ant magnetinės maišyklės IKAMAG®

C-MAG HS7 (IKA-Werke GmbH & Co.KG, Staufen, Vokietija) kambario temperatūroje. Patalpinama į sandariai uždaromą indą, ekstrakcija vykdoma 7 paras paliekant stovėti [40]. Po to filtruojama per popierinį filtrą, skystasis ekstraktas garinamas ant vandens vonelės iki tirštos masės. Patalpinama į plačiakaklį tamsaus stiklo buteliuką.

5.2.1.3. Aliejinės propolio ištraukos gamyba

Gaminta 25 g ištraukos, ekstrahentu naudojant saulėgrąžų aliejų (Helianthus annuus). Žaliavos-ekstrahento santykis pasirinktas 1:10. Paliekama stovėti 7 paras, po to aliejinė ištrauka košiama per 3 sluoksnių marlę. Vizualiniu metodu patikrinus, jog yra matomų priemaišų, košiama per 8 sluoksnių marlę. Ištrauka laikoma plačiakakliame tamsaus stiklo buteliuke.

5.2.2. Bičių produktų (geltonojo bičių vaško ir propolio) puskiečių sistemų modeliavimas

Puskiečių sistemų modeliavimui pasirinktas geltonasis vaškas (Cera flava) ir saulėgrąžų aliejus (Helianthus annuus). Veiklioji medžiaga propolis į puskiečių sistemų pagrindus įterpta tirštojo ekstrakto forma. Atitinkamas bičių vaško kiekis lydomas porcelianinėje lėkštelėje ant vandens vonelės, pilamas reikiamas saulėgrąžų aliejaus kiekis, šildant maišoma iki vienalytės masės, gauta masė

maišant atvėsinama, įterpiama veiklioji medžiaga tirštojo ekstrakto formoje, maišoma iki vienalytės masės. Gautų tepalų sudėtys pateikiamos 2 lentelėje.

2 lentelė. Puskiečių sistemų su geltonuoju bičių vašku ir propoliu sudėtys.

I

g

r

u

p

ė

Tepalo Nr. aliejaus Vaško-santykis Bičių vaškas (g) Saulėgrąžų

aliejus (g) Tirštasis propolio ekstraktas (g) 1 1:1 10 9,8 0,2 2 1:2 6,67 13,13 0,2 3 1:3 5 14,8 0,2 4 1:5 4 15,8 0,2 5 1:8 2,5 17,3 0,2 6 1:10 2 17,8 0,2

5.2.3. Bičių produktų (medaus ir propolio) puskiečių sistemų modeliavimas

Siekiant suformuoti puskietes sistemas, eksperimentiniams tyrimams pasirinktas medus, propolis ir bičių vaškas. Pagamintos skirtingos puskietės formos, t.y. tepalai ir gelis. Į tepalo pagrindo sudėtį veiklioji medžiaga propolis įvedama tirštojo ekstrakto forma, į gelio sudėtį – skystojo ekstrakto forma. Bičių produktų puskiečių sistemų sudėtys pateikiamos 3 lentelėje.

3 lentelė. Bičių produktų puskiečių sistemų kompozicija.

II

g

r

u

p

ė

Tepalo/ gelio Nr. Saulė-grąžų aliejus (g) Tirštasis propolio ekstraktas (g) Medus (g) medaus 1proc. tirpalas (ml) Etanolinis propolio ekstraktas (ml) Karbo-meras (g) NaOH 10proc. tirpalas (lašai) 7 15 0,5 34,5 - - - - 8 - - - 48 1 0,31 Atitin-kamas kiekis 9 7,5 0,75 16,75 - - - - 10 7,5 - 17,5 - - - -

5.2.3.1. Tepalo su bičių produktais gamyba

Puskietė sistema su bičių produktais (medumi ir propoliu) gaminama ant vandens vonelės porcelianinėje lėkštelėje lydant atitinkamą medaus ir saulėgrąžų aliejaus kiekį ir piestele maišant iki vienalytės masės. Atvėsinama maišant, įterpiamas reikiamas tirštojo propolio ekstrakto kiekis, maišoma iki vienalytės masės.

5.2.3.2. Gelio su bičių produktais gamyba

Gelis gaminamas brinkinant karbomerą vandeniniame 1 proc. koncentracijos medaus tirpale, veiklioji medžiaga įvedama skystojo ekstrakto forma (ekstrahentu naudojamas 70 proc. koncentracijos etanolis, žaliavos-ekstrahento santykis 1:1). Lašais lašinamas atitinkamas 10 proc. koncentracijos NaOH tirpalo kiekis, susiformuoja gelis.

5.2.4. Bičių produktų (medaus, propolio, geltonojo bičių vaško) puskiečių sistemų gamyba

Bičių produktų (medaus, propolio, geltonojo bičių vaško) puskiečių sistemų sudėtys pateikiamos 4 lentelėje.

4 lentelė. Bičių produktų puskiečių sistemų sudėtys.

II

I

g

r

u

p

ė

Tepalo

Nr. Medus (g) Saulėgrąžų aliejus (g) vaškas Bičių (g) Tirštasis propolio ekstraktas (g) 11 12,5 7,25 5,25 - 12 11,75 7,25 5,25 0,75

Pagrindai su bičių vašku ir medumi gaminami vašką lydant porcelianinėje lėkštelėje ant vandens vonelės, pilamas atitinkamas saulėgrąžų aliejaus kiekis, maišoma, dedamas reikiamas medaus kiekis, lydoma bei sumaišoma iki vienalytės masės, maišant atvėsinama. Į atvėsintus, tačiau dar šiltus puskiečių sistemų pagrindus veiklioji medžiaga propolis įterpiama tirštojo ekstrakto forma, maišoma iki vienalytės masės.

5.3. Analizės metodikos

5.3.1. Fenolinių junginių kiekio nustatymas propolio ištraukose

Nustatant bendrą fenolinių junginių kiekį propolio ištraukose, naudotas Agilent 8453 UV-Vis spektrofotometras (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, JAV), reakcija atliekama su Folin-Ciocalteu‘s phenol reagentu. Reakcijai atlikti naudotos 25 ml talpos kolbutės, į kurias pilama po 3 ml išgrynintojo vandens, 1 ml Folin-Ciocalteu‘s phenol reagento bei atitinkami propolio ištraukų kiekiai. Etanolinės propolio ištraukos 1:10 imama 0,02 ml, kitų etanolinių ištraukų 1:5 ir 1:3 bei tirštojo propolio ekstrakto – po 0,05 ml, aliejinio ekstrakto – 1 ml. Tuomet pilama 1,5 ml paruošto 20 proc. vandeninio Na2CO3 tirpalo, mišinys skiedžiamas išgrynintu vandeniu iki 25 ml žymos. Kolbutė

užkemšama, laikoma kambario temperatūroje 30 min. Atliekami matavimai spektrofotometru, esant 765 nm bangos ilgiui. Kalibracinis grafikas sudarytas pagal p-kumaro rūgštį.

5.3.2. Tirštojo propolio ekstrakto analizė efektyviąja skysčių chromatografija

Mėginio paruošimas: 1 g tirštojo propolio ekstrakto patalpinama į kolbutę ir tirpinama 25 ml 70 proc. koncentracijos etanolio. Tirpalas filtruojamas per popierinį filtrą į 50 ml matavimo kolbutę (Tirpalas 1). Filtratas praskiedžiamas 70 proc. koncentracijos etanoliu iki žymos (Tirpalas 2). Imama 1 ml Tirpalo 2, skiedžiama 96,3 proc. koncentracijos etanoliu 10 ml matavimo kolbutėje iki žymos (Tirpalas 3). Kiekybiniam ir kokybiniam fenolinių junginių nustatymui naudotas Agilent 1260 Infinity kapiliarinis skysčių chromatografas (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, JAV) su diodų matricos detektoriumi. Fenoliniai junginiai atskirti, naudojant ACE C18 kolonėlę (150 × 0,5 mm, 5 µm dydžio dalelėmis) su prieškolone ACE C18 5 µm. Mobili fazė yra sudaryta iš 0,5 proc. acto rūgšties (eliuentas A) ir acetonitrilo (eliuentas B). Linijinis gradientas kito nuo 1 iki 21 proc. B, o A atitinkamai nuo 99 iki 79 proc. 25 min. Injekuojamas mėginio tūris - 0,2 µl, tėkmės greitis – 20 µl/min., o kolonėlės temperatūra 25°C. Fenolinių junginių detekcija mėginiuose atliekama esant 290 nm bangos ilgiui. Mėginio filtracija atliekama per nailoninį membraninį švirkšto filtrą, kurio porų dydis 0,20 µm (Sartorius Stedim Biotech GmbH, Goettingen, Vokietija). Gauti analičių spektrai lyginami, taip nustatant fenolinių junginių tapatybę. Analičių spektrai gauti 210 – 600 nm bangos ilgio intervale, naudojant diodų matricos detektorių.

5.3.3. Propolio ištraukų antiradikalinio aktyvumo nustatymas

Propolis į puskietes sistemas įterpiamas tirštojo propolio ekstrakto forma, todėl siekiama išsiaiškinti, ar jam būdingas literatūroje minimas propolio radikalus surišantis efektas [41]. Tyrimo metu analizuojama ekstrakto geba surišti stabilius laisvuosius DPPH• radikalus. Lyginama pagal troloks ekvivalentą (sintetinį tokoferolio analogą). Kaip tirpiklis tyrimui naudotas išgrynintasis vanduo.

Į 10 ml išgrynintojo vandens dedama 1 g tirštojo propolio ekstrakto, šildoma iki 37o

C ir palaikoma pastovi temperatūra, maišoma stikline lazdele. Filtruojama naudojant nailoninį membraninį švirkšto filtrą, kurio porų dydis 0,20 µm (Sartorius Stedim Biotech GmbH, Goettingen, Vokietija). Į kiuvetę pilama 2,9 ml DPPH, tuomet 0,1 ml tiriamojo tirpalo. Laikoma tamsoje 30 min. Praėjus 15 min., supurtoma, kad susimaišytų. Absorbcija matuojama spektrofotometru, esant 515 nm bangos ilgiui. DPPH koncentracija 40 µg/ml, t.y. 0,1 mM. Lyginamasis tirpalas – išgrynintasis vanduo. Tiesioginiam apskaičiavimui naudojama formulė:

Y = 2,9265 · ((a – 1,0531)/-0,0316) + 2,5796, kur Y – sujungto DPPH kiekis procentais, a – absorbcija.

5.3.4. Fenolinių junginių atpalaidavimo iš puskiečių bičių produktų sistemų tyrimai in vitro

Atpalaidavimo tyrimai in vitro atlikti naudojant Franz tipo modifikuotas difuzines celes, sudarytas iš dviejų natūralios celiuliozės dializės membrana Cuprophan®

(Medicell International Ltd., Londonas, Didžioji Britanija) atskiriamų dalių – donorinės ir akceptorinės. Iki eksperimento likus ne mažiau negu 12 val., celiuliozės membranos pamerkiamos į akceptorinę terpę (išgrynintąjį vandenį), laikoma ~ 30o

C temperatūros aplinkoje. Kintamo tūrio cilindre patalpinama ~ 1 g donorinės puskietės sistemos, kurios atviroji dalis uždengiama celiuliozės membrana ir pritvirtinama gumele. Šioje celės dalyje vyks difuzija, kurios plotas 1,77 m2

. Paruošta donorinė dalis merkiama į išgrynintojo vandens akceptorinę terpę. Maišymui naudota magnetinė maišyklė IKAMAG®

C-MAG HS7 su kaitinamuoju paviršiumi (IKA-Werke GmbH & Co.KG, Staufenas, Vokietija). Palaikoma pastovi 37 ± 0,2o

C temperatūra. Iš akceptorinės terpės po 1, 2, 4 ir 6 val. imami mėginiai po 1 ml, kaskart vis papildant akceptorinę terpę tokiu pat išgrynintojo vandens kiekiu. Mėginiai analizuojami spektrofotometriniu bei efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodais pagal skyriuje 5.3.5 ir 5.3.6 pateiktas metodikas.

5.3.5. Fenolinių junginių kiekio nustatymas puskietėse sistemose su bičių produktais

Fenoliniai junginiai nustatomi 1 ml mėginiuose, imtuose iš akceptorinės terpės po 1, 2, 4 ir 6 val. Naudotas Agilent 8453 UV-Vis spektrofotometras (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, JAV), reakcija atliekama su Folin-Ciocalteu‘s phenol reagentu. Reakcijai atlikti naudotos 5 ir 10 ml kolbutės (I ir III grupės puskietėms sistemoms su bičių produktais tirti – 10 ml kolbutės, II grupės – 5 ml kolbutės). Į 10 ml kolbutes pilama 3 ml išgrynintojo vandens, į 5 ml – 1 ml vandens, 1 ml Folin-Ciocalteu‘s phenol reagento bei po 1 ml tiriamojo mėginio. Tuomet pilama 1,5 ml paruošto 20 proc. vandeninio Na2CO3 tirpalo, mišinys skiedžiamas išgrynintu vandeniu iki 10 ml arba 5 ml žymos.

Kolbutė užkemšama, laikoma kambario temperatūroje 30 min. Atliekami matavimai spektrofotometru, esant 765 nm bangos ilgiui. Kalibracinis grafikas sudarytas pagal p-kumaro rūgštį.

5.3.6. Puskiečių sistemų su propoliu analizė efektyviąja skysčių chromatografija

Tyrimui naudojami mėginiai po 1 ml iš I (Tepalai Nr. 2, 3, 4, 5, 6) ir II (Puskietės sistemos Nr. 7, 8) grupių puskiečių sistemų su bičių produktais akceptorinės terpės. Tolimesnė analizė atliekama pagal 5.3.2 skyrelyje pateiktą metodiką.

5.3.7. Puskiečių sistemų su bičių produktais (medumi, propoliu ir bičių vašku) antiradikalinio aktyvumo nustatymas

Tepalų Nr.7, Nr.9, Nr.10, Nr.11 ir Nr.12 kiekvieno dedama į 10 ml akceptorinės terpės. Tepalo Nr.7 sudėtis pateikiama 3 lentelėje. Kai tirpiklis - išgrynintasis vanduo, šildoma iki 37o

C ir palaikoma pastovi temperatūra, maišoma stikline lazdele, pagreitinamas tepalų lydymosi ir tirpimo procesas. Filtruojama per popierinį filtrą, jei tirpalas neskaidrus, filtruojama per nailoninį membraninį švirkšto filtrą, kurio porų dydis 0,20 µm. Tolimesnė metodika pateikiama skyrelyje 5.3.3.

5.3.8. Puskiečių sistemų su bičių produktais (I, II ir III grupių) pH nustatymas

Imama 5g puskietės sistemos, tirpinama vandenyje, šiek tiek pašildoma, filtruojama per popierinį filtrą, skiedžiama išgrynintuoju vandeniu iki 100 ml. Matuojamas tirpalų pH, naudojant HD 2105.1 pH-metrą (Delta OHM, Italija).

5.3.9. Bičių produktų puskiečių sistemų (I ir II grupių) mikrostruktūros vertinimas

Bičių produktų puskiečių sistemų mikrostruktūra vertinta Motic®

B3–serijos mikroskopu (Meyer Instruments, Teksasas, JAV) su integruota skaitmenine kamera Moticam 1000. Daromos nuotraukos, vizualiai stebima puskietės sistemos mikrostruktūra. Atitinkama puskietė sistema patalpinama ant objektinio stikliuko kiek įmanoma plonesniu sluoksniu, uždengiama mažesniu plonu dengiamuoju stikliuku. Ant jo užlašinamas vienas imersinio aliejaus lašas. Po mikroskopo objektyvu dedamas paruoštas objektinis stikliukas su mėginiu.

5.3.10. Statistinė analizė

Visi tyrimai atlikti po 3 kartus. Rezultatų vidurkiai bei standartiniai nuokrypiai buvo apskaičiuojami naudojant programą IBM SPSS statistics 20, rezultatų skirtumų reikšmingumas nustatytas pagal Paired-samples T-test. Skirtumai yra reikšmingi tuomet, kai p < 0,05.

6. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

6.1. Propolio ištraukų kokybės vertinimas

6.1.1. Propolio ištraukų bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas

Nustatytas bendras fenolinių junginių kiekis etanolinėse propolio ištraukose (Nr.1 – 3), tirštajame propolio ekstrakte (Nr.4) bei aliejinėje propolio ištraukoje (Nr.5), kuriuos planuojama pritaikyti puskiečių preparatų gamyboje, naudojant kaip veikliąją medžiagą dėl specifinių tiriamųjų medžiagų antibakterinių, priešgrybelinių, priešvėžinių, nuskausminančių, priešuždegiminių bei kitų savybių.Fenolinių junginių kiekiai tirtose ištraukose pateikti 1 paveiksle.

8,3792 8,6504 12,474 27,538 0 5 10 15 20 25 30 35 Nr.1 Nr.2 Nr.3 Nr.4 B en d ra s fen o li n ių j u n g in ių k iek is , m g /m l

1 pav. Bendro fenolinių junginių kiekio propolio ištraukose tyrimų rezultatai.

Tyrimų rezultatai parodė, jog mažiausias kiekis fenolinių junginių nustatytas aliejinėje propolio ištraukoje, todėl tolimesniuose tyrimuose nuspręsta nevartoti veikliosios medžiagos šioje formoje.

Tiriant etanolines propolio ištraukas, nustatyta, jog svarbus žaliavos ir ekstrahento santykis. Didėjant žaliavos kiekiui, išekstrahuojama daugiau veikliųjų junginių. Nenustatyta statistiškai reikšmingo atpalaiduoto suminio fenolinių junginių kiekio skirtumo tarp tiriamųjų produktų Nr.1 ir Nr.2, kuriuose atitinkamai žaliavos ir ekstrahento santykis 1:10 ir 1:5, tačiau nustatytas statistiškai reikšmingas skirtumas, kai žaliavos ir ekstrahento santykis 1:1 (Produktas Nr.3).

Didžiausias veikliųjų junginių kiekis nustatytas tirštajame propolio ekstrakte, todėl šią formą nutarta naudoti įterpimui į puskietes sistemas.

6.1.2. Propolio tirštojo ekstrakto antiradikalinio aktyvumo vertinimo rezultatai

Antiradikaliniam tirštojo propolio ekstrakto aktyvumui nustatyti naudotas tirpiklis – išgrynintasis vanduo. Tyrimai atlikti 3 kartus, rezultatai pateikti 2 paveiksle.

2 pav. Tirštojo propolio ekstrakto antiradikalinio aktyvumo nustatymo rezultatai.

Nustatyta, jog vandeninio tirštojo propolio ekstrakto tirpalo geba sujungti DPPH• yra geresnė (71,9 ± 1,9 proc.) nei etanolinio (40,8 ± 1,3 proc.), todėl remiantis tyrimų rezultatais, tirpikliu pasirinktas vanduo.

6.1.3. Tirštojo propolio ekstrakto veikliųjų junginių kiekio nustatymas efektyviosios skysčių chromatografijos analizės metodu

Atlikti tirštojo propolio ekstrakto veikliųjų junginių - vanilo rūgšties, kavos rūgšties, vanilino, p-kumaro rūgšties ir ferulo rūgšties, tyrimai ESC analitiniu metodu. Nustatyti veikliųjų medžiagų kiekiai pateikti 3 pav.

3 pav. Nustatyti veikliųjų junginių kiekiai ESC metodu.

Tirštajame propolio ekstrakte nustatytas mažiausias kavos (kofeininės) rūgšties kiekis, o didžiausias kiekis – p-kumaro rūgšties. Tyrimų rezultatai pagrindė literatūros duomenis [22], kad lietuviškąjame propolyje dominuoja p-kumaro r., ferulo r. ir vanilinas. Dėl šios priežasties matuojant fenolinių junginių kiekį propolyje kalibracinis grafikas sudaromas pagal p-kumaro rūgštį.

6.2. Puskiečių sistemų su bičių produktais mikrostruktūros vertinimas

Vertinimui pasirinktos I ir II grupių puskietės sistemos (Nr. 2 – 8). Jų mikrostruktūra vertinta mikroskopu, analizuojant vaško kiekio įtaką kristalų susidarymui, medaus tepalų bei gelio struktūrą.

6.2.1. Puskiečių sistemų su bičių produktais (I grupė) mikrostruktūros tyrimo rezultatai

4 pav. Tepalas Nr.2 (1:2). 5 pav. Tepalas Nr.3 (1:3).

6 pav. Tepalas Nr.4 (1:5). 7 pav. Tepalas Nr.5 (1:8).

6.2.2. Puskiečių sistemų su bičių produktais (II grupė) mikrostruktūros tyrimo rezultatai

9 pav. Tepalas Nr.7 (medaus puskietė sistema). 10 pav. Tepalas Nr.8 (gelis).

Puskietė konsistencija buvo būdinga puskietėms sistemoms Nr.2 ir Nr.3 (I grupė), tuo tarpu sistemos Nr.4 – Nr.8 (I, II grupė) pasižymėjo skysta konsistencija.

Tirtose I grupės puskietėse sistemose (Nr. 2 – 6) matomi vaško kristalai. Tyrimais nustatyta, kad didėjant bičių vaško kiekiui tepaluose, didėja kristalinė struktūra.

Medaus tepale (Nr.7) matoma emulsinė struktūra, aliejaus lašeliai (hidrofobinė fazė) meduje (hidrofilinėje terpėje). Gelis (Nr.8) skaidrus, masė vienalytė, nėra kristalų ar emulsinės struktūros.

6.3. Puskiečių sistemų su bičių produktais pH vertinimas

Gaminant puskietes sistemas su bičių produktais, vienas svarbiausių kokybės parametrų yra pH nustatymas. Tyrimo rezultatai pateikiami 5 lentelėje.

5 lentelė. Puskiečių sistemų su bičių produktais pH tyrimų rezultatai.

Grupė Puskietė _sistema pH

I

Nr.1 5,05 ± 0,291 Nr.2 4,597 ± 0,074 Nr.3 5,383 ± 0,162 Nr.4 5,34 ± 0,095 Nr.5 5,173 ± 0,162 Nr.6 5,347 ± 0,035

II

Nr.7 4,272 ± 0,01 Nr.9 4,163 ± 0,003 Nr.10 4,463 ± 0,018

III

Nr.11 4,335 ± 0,012 Nr.12 4,07 ± 0,034

Siekiant, kad tepalas gerai prasiskverbtų pro odos audinius, puskietės sistemos pH reikšmė turėtų atitikti ar būti panaši į odos pH 5,4 – 5,9 [42]. Puskiečių sistemų su propoliu pH reikšmės yra panašios į odos, todėl sistemos yra tinkamos vartoti, prognozuojamas kokybiškas veikliosios medžiagos atsipalaidavimas ir skvarba. Terpė silpnai rūgštinė.

Tyrimų rezultatai parodė, kad mažiausia pH reikšmė būdinga puskietei sistemai Nr.12, o didžiausia – puskietei sistemai Nr.3.

6.4. Biofarmacinis puskiečių sistemų su bičių produktais vertinimas in vitro

6.4.1. I grupės puskiečių sistemų biofarmacinis vertinimas

Siekiant įvertinti veikliųjų junginių atsipalaidavimą iš puskiečių sistemų, atlikti biofarmaciniai tyrimai, kurių metu vertinta fenolinių junginių atsipalaidavimo kinetika.

Pirmajame etape siekiant įvertinti tirštojo propolio ekstrakto kaip veikliosios medžiagos tinkamumą puskietėse sistemose su bičių vašku ir saulėgrąžų aliejumi (I grupė), atliktas fenolinių junginių atpalaidavimas 4 valandų laikotarpyje, mėginius imant po 1, 2 ir 4 valandų. Tyrimo rezultatai pateikiami 6 lentelėje.

6 lentelė. Atpalaiduoto bendro fenolinių junginių kiekio iš I grupės sistemų tyrimų rezultatai.

Tepalas Mėginio

laikas

Fenolinių junginių kiekis, mg/ml Nr.1 1 val. 0,001 ± 0,001 2 val. 0,005 ± 0,003 4 val. 0,006 ± 0,002 Nr.2 1 val. 0,001 ± 0,001 2 val. 0,006 ± 0,003 4 val. 0,009 ± 0,003 Nr.3 1 val. 0,010 ± 0,004 2 val. 0,015 ± 0,005 4 val. 0,014 ± 0,004 Nr.4 1 val. 0,001 ± 0,001 2 val. 0,009 ± 0,002 4 val. 0,013 ± 0,004 Nr.5 1 val. 0,001 ± 0,001 2 val. 0,005 ± 0,002 4 val. 0,009 ± 0,003 Nr.6 1 val. 0,020 ± 0,005 2 val. 0,015 ± 0,004 4 val. 0,009 ± 0,003

Tyrimo metu nustatyta, kad iš tirtų preparatų atsipalaiduoja nedidelis kiekis fenolinių junginių nuo 0,001 ± 0,001 mg/ml iki 0,020 ± 0,005 mg/ml. Mažiausias kiekis veikliųjų junginių atsipalaiduoja po 1 valandos, o didžiausias – po 4 valandų. Didžiausias junginių kiekis atsipalaiduoja po pirmos valandos iš puskietės sistemos Nr.6, kurioje vaško kiekis yra mažiausias, bei po 4 valandų iš sistemos Nr.3, kurioje vaškas sudaro 30 proc. puskietės sistemos sudėties.

Tyrimo rezultatai parodė, kad formuojant puskietes sistemas, naudinga atsižvelgti į vaško kiekį, kuris naudojamas puskietės sistemos formavimui, didėjant vaško kiekiui, veikliųjų junginių atpalaidavimas lėtėja.

6.4.2. II grupės puskiečių sistemų biofarmacinis vertinimas

Antrajame etape siekiama įvertinti tirštojo propolio ekstrakto kaip veikliosios medžiagos tinkamumą puskietėse sistemose su medumi ir saulėgrąžų aliejumi bei etanolinio propolio ekstrakto kaip veikliosios medžiagos tinkamumą gelyje (II grupė). Fenolinių junginių atpalaidavimas atliktas 6 valandų laikotarpyje, mėginius imant po 1, 2, 4 ir 6 valandų. Atlikto tyrimo rezultatai pateikiami 11pav.

11 pav. Atpalaiduoto bendro fenolinių junginių kiekio iš II grupės sistemų tyrimų rezultatai.

Tyrimo metu nustatyta, kad mažiausias bendras fenolinių junginių kiekis atsipalaidavo iš puskietės sitemos Nr.8 (gelio). Tam įtakos turėjo pasirinkta veikliosios medžiagos forma skystasis ekstraktas, kuris veikliųjų junginių turėjo mažiau, lyginant su tirštuoju propolio ekstraktu, tačiau gelis vis tiek yra tinkama sistema veikliosios medžiagos (spiritinio propolio ekstrakto) įvedimui į pagrindą. Didžiausias bendras fenolinių junginių kiekis nustatytas puskietėje sistemoje Nr.9, kurioje yra 3 proc. veikliosios medžiagos tirštojo propolio ekstrakto ir medaus, iš kurio taip pat gali išsiskirti atitinkamas fenolinių junginių kiekis. Medus dėl sudėtyje turimų fenolinių junginių didina atpalaiduojamą fenolinių junginių kiekį iš puskietės sistemos Nr.9, todėl medus yra tinkamas vartoti puskiečių sistemų modeliavimui ne tik kaip pagalbinė medžiaga, bet ir kaip veiklioji medžiaga [25]. Iš puskietės sistemos Nr.7, kurioje yra 1 proc. veikliosios medžiagos tirštojo propolio ekstrakto, atsipalaidavo taip pat didelis veikliųjų junginių kiekis (11 pav.).

Tyrimo rezultatai parodė, kad formuojant puskietes sistemas, naudinga pagrindą gaminti kartu su medumi (sistemos Nr.7, Nr.9, Nr.10), iš kurio taip pat atsipalaiduoja atitinkamas fenolinių junginių kiekis.

6.4.3. III grupės puskiečių sistemų biofarmacinis vertinimas

Trečiajame etape siekiama įvertinti tirštojo propolio ekstrakto kaip veikliosios medžiagos tinkamumą puskietėse sistemose su medumi, saulėgrąžų aliejumi ir geltonuoju bičių vašku (III grupė). Atliktas fenolinių junginių atpalaidavimas 6 valandų laikotarpyje, mėginius imant po 1, 2, 4 ir 6 valandų. Tyrimo rezultatai pateikiami 12 pav.

12 pav. Atpalaiduoto bendro fenolinių junginių kiekio iš III grupės sistemų tyrimų rezultatai. Tyrimo metu nustatyta, kad mažesnis fenolinių junginių kiekis atsipalaidavo iš sistemos Nr.11, kuri naudota kaip puskietės sistemos pagrindas su medumi veikliosios medžiagos tirštojo propolio ekstrakto įterpimui. Iš šios sistemos didžiausias fenolinių junginių kiekis atsipalaidavo po 2 valandų. Puskietėje sistemoje Nr.12 nustatytas didesnis fenolinių junginių kiekis, nes joje įterpta 3 proc. veikliosios medžiagos tirštojo propolio ekstrakto. Iš šios sistemos daugiausia veikliųjų junginių atsipalaidavo po 6 valandų, praėjus ilgiausiam laiko tarpui nuo tyrimo pradžios.

Tyrimo rezultatai parodė, kad iš tepalo atsipalaiduoja didesnis veikliųjų junginių kiekis dėl įterptos veikliosios medžiagos, negu iš tepalo pagrindo.

Lyginant II ir III grupės puskietes sistemas, nustatyta, jog į puskietę sistemą pridėtas atitinkamas bičių vaško kiekis mažina veikliųjų junginių atsipalaidavimą iš puskietės sistemos.

6.5. II ir III grupių puskiečių sistemų antiradikalinio vertinimo rezultatai

Tyrimo rezultatai parodė, jog didžiausias kiekis veikliųjų junginių nustatoma II ir III puskiečių sistemų grupėse, todėl nuspręsta vertinti jų biologinį poveikį nustatant antioksidacinį poveikį in vitro.

Antiradikaliniam II ir III grupių puskiečių sistemų vertinimui tirpikliu naudotas išgrynintasis vanduo. Tyrimo rezultatai pateikiami 13 paveiksle.

13 pav. II ir III grupių puskiečių sistemų antiradikalinio aktyvumo nustatymo rezultatai.

Daugiausia radikalo suriša sistemos su įterpta veikliąja medžiaga (Nr.9 ir Nr.12), vadinasi, įterptas veikliosios medžiagos kiekis daro įtaką. Nr.7 puskietėje sistemoje įterptas mažesnis veikliosios medžiagos kiekis (1 proc.), lyginant su sistemomis Nr.9 ir Nr.12, kuriose tirštojo propolio ekstrakto kiekis – 3 proc. Iš 13 paveiksle pateiktų duomenų matyti, kad ir pats pagrindas pasižymi antioksidaciniu aktyvumu.

6.6. I ir II grupių puskiečių sistemų veikliųjų junginių kiekio nustatymas

efektyviosios skysčių chromatografijos analizės metodu

6.6.1. I ir II grupių puskiečių sistemų atskirų veikliųjų junginių kiekio nustatymas ESC analizės metodu

Siekiant įvertinti I ir II grupių puskiečių sistemų kokybę, atliktas veikliųjų junginių kiekio nustatymas ESC analizės metodu. Tyrimų metu vertinta, kurių fenolinių junginių iš puskiečių sistemų atsipalaiduoja daugiausiai.

6.6.1.1. I grupės puskiečių sistemų atskirų veikliųjų junginių kiekio nustatymas ESC metodu

Tiriant I grupės puskietes sistemas, mėginiai imami po 1, 2, 4 ir 6 val. Tyrimo rezultatai pateikiami 7 - 11 lentelėse.

7 lentelė. I grupės puskietės sistemos Nr.2 atskirų fenolinių junginių kiekio nustatymo ESC analizės metodu rezultatai.

Puskietė sistema

Fenoliniai

junginiai

Fenolinių junginių kiekis, µg/ml

Po 1 val. Po 2 val. Po 4 val. Po 6 val. Nr.2 Vanilo r. + 0,25 0,41 0,40 Kavos r. + + + Vanilinas 0,22 0,49 0,68 0,74 p-kumaro r. 0,35 0,89 1,34 1,31 Ferulo r. 0,17 0,52 0,82 0,78 Iš viso: 0,74 2,15 3,25 3,23

Tyrimų rezultatai parodė, jog I grupės puskietėje sistemoje Nr.2, kai bičių vaško ir saulėgrąžų aliejaus santykis 1:2, iš puskietės sistemos daugiausiai atsipalaiduoja atitinkamai p-kumaro r., ferulo r.

ir vanilino. Veikliųjų junginių p-kumaro r. ir ferulo r. didžiausias kiekis iš puskietės sistemos atsipalaidavo praėjus 4 val. nuo tyrimo pradžios, o vanilino geriausias išsiskyrimas iš puskietės sistemos vyko po 6 val. Nustatytas nedidelis kiekis vanilo r., kurio daugiausiai iš puskietės sistemos atsipalaidavo po 6 val. nuo tyrimo pradžios. Didžiausias suminis fenolinių junginių kiekis, atpalaiduotas iš puskietės sistemos Nr.2, nustatytas po 4 val. nuo tyrimo pradžios.

8 lentelė. I grupės puskietės sistemos Nr.3 atskirų fenolinių junginių kiekio nustatymo ESC analizės metodu rezultatai.

Puskietė sistema

Fenoliniai

junginiai

Fenolinių junginių kiekis, µg/ml

Po 1 val. Po 2 val. Po 4 val. Po 6 val.

Nr.3 Vanilo r. + + 0,28 0,33 Kavos r. + + + Vanilinas 0,30 0,38 0,53 0,63 p-kumaro r. 0,38 0,49 0,67 0,88 Ferulo r. 0,18 0,23 0,36 0,48 Iš viso: 0,86 1,1 1,84 2,32

Nustatyta, jog iš I grupės puskietės sistemos Nr.3, kai bičių vaško ir saulėgrąžų aliejaus santykis 1:3, tyrimo metu atpalaiduota daugiausiai atitinkamai p-kumaro r., vanilino ir ferulo r. Visų šių veikliųjų junginių geriausias atsipalaidavimas iš puskietės sistemos vyko po 6 val. nuo tyrimo pradžios. Nustatytas nedidelis kiekis vanilo r., kurios daugiausiai iš puskietės sistemos atsipalaidavo po 6 val. nuo tyrimo pradžios. Aptikta kavos r., tačiau tikslus jos kiekis nenustatytas. Didžiausias suminis fenolinių junginių kiekis, atpalaiduotas iš puskietės sistemos Nr.3, nustatytas po 6 val. nuo tyrimo pradžios.

9 lentelė. I grupės puskietės sistemos Nr.4 atskirų fenolinių junginių kiekio nustatymo ESC analizės metodu rezultatai.

Puskietė sistema

Fenoliniai

junginiai

Fenolinių junginių kiekis, µg/ml

Po 1 val. Po 2 val. Po 4 val. Po 6 val.

Nr.4 Vanilo r. 0,27 0,36 0,41 0,43 Kavos r. + + + + Vanilinas 0,52 0,62 0,77 0,79 p-kumaro r. 0,86 1,00 1,29 1,31 Ferulo r. 0,48 0,53 0,77 0,78 Iš viso: 2,13 2,51 3,24 3,31

Remiantis tyrimų duomenimis, iš I grupės puskietės sistemos Nr.4, kai bičių vaško ir aliejaus santykis 1:5, tyrimo metu atpalaiduota daugiausiai atitinkamai p-kumaro r., vanilino ir ferulo r. Iš šios puskietės sistemos geriausias šių veikliųjų junginių atpalaidavimas vyko praėjus 6 val. nuo tyrimo pradžios. Nustatytas reikšmingas vanilo r. kiekis, daugiausiai šio junginio, atpalaiduoto iš puskietės sistemos, nustatyta po 6 val nuo tyrimo pradžios. Aptikta kavos r., tačiau jos tikslus kiekis nenustatytas. Didžiausias suminis fenolinių junginių kiekis, atpalaiduotas iš puskietės sistemos Nr.4, nustatytas po 4 val. nuo tyrimo pradžios.

10 lentelė. I grupės puskietės sistemos Nr.5 atskirų fenolinių junginių kiekio nustatymo ESC analizės metodu rezultatai.

Puskietė sistema

Fenoliniai

junginiai

Fenolinių junginių kiekis, µg/ml

Po 1 val. Po 2 val. Po 4 val. Po 6 val.

Nr.5 Vanilo r. + 0,28 0,29 0,29 Kavos r. + + + + Vanilinas 0,39 0,46 0,58 0,68 p-kumaro r. 0,50 0,71 0,82 1,00 Ferulo r. 0,24 0,34 0,46 0,53 Iš viso: 1,13 1,79 2,15 2,5

Nustatyta, jog iš I grupės puskietės sistemos Nr.5, kai bičių vaško ir saulėgrąžų aliejaus santykis 1:8, tyrimo metu daugiausiai atpalaiduota atitinkamai p-kumaro r., vanilino ir ferulo r. Iš puskietės sistemos šių veikliųjų junginių atpalaidavimas geriausiai vyko po 6 val. nuo tyrimo pradžios. Vanilo r., atpalaiduotos iš puskietės sistemos visais tyrimo laiko matavimo intervalais (po 2, 4 ir 6 val.) nustatytas panašus kiekis. Aptikta kavos r., tačiau kiekis nenustatytas. Didžiausias suminis fenolinių junginių kiekis, atpalaiduotas iš puskietės sistemos Nr.5, nustatytas po 6 val. nuo tyrimo pradžios.

11 lentelė. I grupės puskietės sistemos Nr.6 atskirų fenolinių junginių kiekio nustatymo ESC analizės metodu rezultatai.

Puskietė sistema

Fenoliniai

junginiai

Fenolinių junginių kiekis, µg/ml

Po 1 val. Po 2 val. Po 4 val. Po 6 val.

Nr.6 Vanilo r. 0,28 0,36 0,42 0,49 Kavos r. + + + Vanilinas 0,53 0,67 0,82 0,97 p-kumaro r. 0,66 0,78 0,92 1,07 Ferulo r. 0,28 0,34 0,42 0,52 Iš viso: 1,75 2,15 2,58 3,05

Nustatyta, jog iš I grupės puskietės sistemos Nr.6, kai bičių vaško ir saulėgrąžų aliejaus santykis 1:10, atpalaiduota daugiausiai atitinkamai p-kumaro r., vanilino ir ferulo r. Daugiausiai šių veikliųjų junginių atpalaiduota iš puskietės sistemos po 6 val. nuo tyrimo pradžios. Nustatytas reikšmingas vanilo r. kiekis, kurios daugiausiai iš puskietės sistemos atsipalaidavo po 6 val. nuo tyrimo pradžios. Aptikta kavos r., tačiau jos kiekis nenustatytas. Didžiausias suminis fenolinių junginių kiekis, atpalaiduotas iš sistemos Nr.6, nustatytas po 6 val. nuo tyrimo pradžios.

Lyginant visas I grupės puskietes sistemas, nustatomas didžiausias kiekis veikliojo junginio p-kumaro r. po 6 val. nuo tyrimo pradžios. Didžiausias suminis fenolinių junginių kiekis taip pat nustatomas po 6 val. nuo tyrimo pradžios.

6.6.1.2. II grupės puskiečių sistemų atskirų veikliųjų junginių kiekio nustatymas ESC metodu

Tiriant II grupės puskietes sistemas, mėginiai imami po 1, 2, 4 ir 6 val. Tyrimo rezultatai pateikiami 12, 13 lentelėse.

12 lentelė. II grupės puskietės sistemos Nr.7 atskirų fenolinių junginių kiekio nustatymo ESC analizės metodu rezultatai.

Puskietė sistema

Fenoliniai

junginiai

Fenolinių junginių kiekis, µg/ml

Po 1 val. Po 2 val. Po 4 val. Po 6 val.

Nr.7 Vanilo r. 2,24 2,91 2,80 2,80 Kavos r. 0,43 0,73 0,61 0,68 Vanilinas 2,79 3,57 3,59 3,75 p-kumaro r. 5,45 9,35 9,36 9,38 Ferulo r. 2,94 4,52 4,89 5,18 Iš viso: 13,85 21,08 21,25 21,79

Nustatyta, jog iš II grupės puskietės sistemos Nr.7 (medaus tepalo) atsipalaidavo daugiausiai atitinkamai p-kumaro r., ferulo r. ir vanilino. Didžiausias šių veikliųjų junginių kiekis, atpalaiduotas iš puskietės sistemos, nustatytas po 6 val. nuo tyrimo pradžios. Taip pat nustatyti atitinkami vanilo r. ir kavos r. kiekiai, kurių didžiausias kiekis iš puskiečių sistemų atsipalaidavo praėjus 2 val. nuo tyrimo pradžios. Didžiausias suminis fenolinių junginių kiekis, atpalaiduotas iš puskietės sistemos Nr.7, nustatytas po 6 val. nuo tyrimo pradžios.