AUGALINIŲ EKSTRAKTŲ ĮTAKA EMULSINIŲ SISTEMŲ KOKYBEI IR DRĖGMĖS, LIPIDŲ KIEKIUI BEI ODOS PIGMENTACIJAI

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA

Ugnė Čižauskaitė

AUGALINIŲ EKSTRAKTŲ ĮTAKA

EMULSINIŲ SISTEMŲ KOKYBEI

IR DRĖGMĖS, LIPIDŲ KIEKIUI

BEI ODOS PIGMENTACIJAI

Daktaro disertacija Biomedicinos mokslai,

farmacija (08B)

Disertacija rengta 2013–2017 metais Lietuvos sveikatos mokslų univer-sitete, Medicinos akademijos Vaistų technologijos ir socialinės farmacijos katedroje.

Mokslinė vadovė

prof. dr. Jurga Bernatonienė (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Medicinos akademija, biomedicinos mokslai, farmacija – 08B)

Disertacija ginama Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmacijos mokslo krypties taryboje:

Pirmininkas

prof. dr. Vitalis Briedis (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Me-dicinos akademija, biomeMe-dicinos mokslai, farmacija – 08B)

Nariai:

doc. dr. Sandrita Šimonytė (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Medicinos akademija, biomedicinos mokslai, biologija – 01B)

dr. Raimondas Raudonis (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Me-dicinos akademija, biomeMe-dicinos mokslai, farmacija – 08B)

prof. dr. Daiva Leskauskaitė (Kauno technologijos universitetas, tech-nologijos mokslai, chemijos inžinerija – 05T)

doc. dr. Tariq Mahmood (Centrinis Punjab universitetas (Pakistanas), biomedicinos mokslai, farmacija – 08B)

Disertacija ginama viešame Farmacijos mokslo krypties tarybos posėdyje 2018 m. kovo 30 d., 10 val. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Lietuvos medicinos ir farmacijos istorijos muziejaus konferencijų salėje.

Disertacijos gynimo vietos adresas: Rotušės a. 28, LT-44279 Kaunas, Lietuva.

LITHUANIAN UNIVERSITY OF HEALTH SCIENCES MEDICAL ACADEMY

Ugnė Čižauskaitė

THE INFLUENCE OF HERBAL

EXTRACTS ON THE EMULSION

QUALITY AND THE HUMAN SKIN

MOISTURE, SEBUM CONTENT

AND PIGMENTATION

Doctoral dissertation Biomedical Sciences,

Pharmacy (08B)

Dissertation has been prepared at the Department of Drug Technology and Social Pharmacy of Medical Academy of Lithuanian University of Health Sciences during the period of 2013–2017.

Scientific Supervisor

Prof. Dr. Jurga Bernatonienė (Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Biomedical Sciences, Pharmacy – 08B)

Dissertation is defended at the Pharmacy Research Council of Lithua-nian University of Health Sciences.

Chairperson

Prof. Dr. Vitalis Briedis (Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Biomedical Sciences, Pharmacy – 08B)

Members:

Assoc. Prof. Dr. Sandrita Šimonytė (Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Biomedical Sciences, Biology – 01B) Dr. Raimondas Raudonis (Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Biomedical Sciences, Pharmacy – 08B)

Prof. Dr. Daiva Leskauskaitė (Kaunas University of Technology, Tech-nological Sciences, Chemical engineering – 05T)

Assist. Prof. Dr. Tariq Mahmood (University of Central Punjab (Pakis-tan), Biomedical Sciences, Pharmacy – 08B)

Dissertation will be defended at the open session of the Pharmacy Research Council on the 30th of March, 2018 at 10 a.m. in the Conference Hall of the Museum of History of Lithuanian Medicine and Pharmacy of Lithuanian University of Health Sciences.

TURINYS

SANTRUMPOS ... 7

ĮVADAS... 8

1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 14

1.1. Ekstrakcijos metodų ir sąlygų įtaka veikliųjų medžiagų ekstrakcijai iš augalinių žaliavų ... 14

1.1.1. Ekstrakcijos sąlygų įtaka rozmarinų, ursolo ir oleanolo rūgščių išeigai ... 14

1.1.2. Ekstrakcijos metodų įtaka rozmarinų, ursolo ir oleanolo rūgščių išeigai ... 16

1.2. Emulsiklio įtaka emulsinių sistemų agregatiniam ir sedimentaciniam stabilumui ... 17

1.3. Daugianarės emulsijos formavimo ypatumai ... 19

1.4. Augalinių ekstraktų įtaka emulsinių sistemų formavimuisi ir stabilumui ... 21

1.4. Emulsinių sistemų kokybės vertinimas in vivo ir in vitro ... 23

2. TYRIMO OBJEKTAS IR METODAI ... 26

2.1. Tyrimų objektai ... 26

2.2. Reagentai ir medžiagos bei aparatūra ir įrengimai ... 26

2.3. Augalų ekstraktų gamyba ... 27

2.3.1. Kvapiųjų rozmarinų lapų ekstrakcijos metodai ... 27

2.3.2. Sėjamųjų avižų sėklų ekstrakcija ... 27

2.3.3. Sėjamųjų linų sėklų ekstrakcija ... 28

2.4. Veikliųjų medžiagų nustatymas tiriamuosiuose mėginiuose ... 28

2.4.1. Rozmarinų rūgšties nustatymas kvapiųjų rozmarinų lapų ekstrakte ... 28

2.4.2. Oleanolo (OR) ir ursolo (UR) rūgščių nustatymas kvapiųjų rozmarinų lapų ekstrakte ... 28

2.4.3. β-gliukanų nustatymas avižų sėklose ir avižų sėklų ekstrakte ... 29

2.4.4. Monosacharidų nustatymas linų sėklų ekstrakte ... 29

2.5. Dvinarių ir daugianarių emulsijų gamyba ... 30

2.6. Emulsinių sistemų ir jų gamybai naudotų žaliavų fizikinių savybių tyrimas ... 31

2.7. Dvinarių ir daugianarių emulsinių sistemų stabilumo tyrimas ... 33

2.8. Emulsijos mikrobiologinės kokybės vertinimas ... 33

2.9. Konservavimo efektyvumo vertinimas emulsinėje sistemoje ... 34

2.10. Emulsijos odą dirginančio, fototoksinio ir uždegimą

sukeliančio poveikio vertinimas in vitro ... 34

2.11. Daugianarės emulsijos odos lopo tyrimas ... 35

2.12. Daugianarės emulsinės sistemos įtakos žmogaus odos parametrams in vivo vertinimas ... 36

2.13 Statistinis duomenų vertinimas... 37

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 38

3.1. Kvapiųjų rozmarinų lapų veikliųjų junginių (rozmarino, ursolo ir oleanolo rūgščių) ekstrakcija ... 38

3.1.1. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos validacija ... 38

3.1.2. Gamybos metodų ir sąlygų įtaka kvapiųjų rozmarinų lapų veikliųjų junginių (rozmarino, ursolo ir oleanolo rūgščių) ekstrakcijai ... 39

3.2. Emulsinės sistemos matricos formavimas ... 43

3.2.1. Kvapiųjų rozmarinų lapų ekstrakto ir jame esančių veikliųjų junginių įtaka emulsinės sistemos kokybei ... 46

3.2.2. Linų ir avižų sėklų ekstraktų įtaka daugianarės emulsijos su rozmarinų ekstraktu kokybei ... 49

3.2.3. Daugianarės emulsijos su augaliniais ekstraktais receptūros optimizavimas ... 54

3.3. Daugianarės emulsinės sistemos su augaliniais ekstraktais technologijos optimizavimas ... 55

3.4. Daugianarės emulsijos su augaliniais ekstraktais stabilumas ... 58

3.5. Daugianarės emulsijos su augaliniais ekstraktais mikrobiologinės kokybės įvertinimas ... 60

3.5.1. Daugianarės emulsijos mikrobiologinės kokybės kontrolė ... 60

3.5.2. Daugianarės emulsijos konservavimo efektyvumo įvertinimas... 61

3.6. Daugianarės emulsijos toksikologiniai tyrimai in vitro ... 62

3.7. Daugianarės emulsijos odos lopo tyrimas ... 65

3.8. Daugianarės emulsinės sistemos įtaka žmogaus odos parametrams in vivo ... 66

IŠVADOS ... 72

LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 74

DISERTACIJOS TEMA PASKELBTŲ PUBLIKACIJŲ SĄRAŠAS ... 92

SUMMARY ... 133

PRIEDAI ... 149

CURICULUM VITAE ... 151

PADĖKA ... 152 6

SANTRUMPOS

AMPS/VIFA – amonio poli(akrildimetiltauramido-ko-vinilformamidas) A/V – aliejus vandenyje tipo emulsija

A/V/A – aliejus/vanduo/aliejus tipo emulsija DPPH – 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilas

ES – Europos Sąjunga

ESC – efektyvioji skysčių chromatografija HLB – hidrofilinis lipofilinis balansas II – išsisluoksniavimo indeksas Konc. – koncentracija

MTT – 3-(4,5-Dimetiltiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazolio bromidas PAM – paviršiui aktyvi medžiaga

PEG – polietilenglikolis

pH – vandenilio jonų (H+_{) koncentracijos tirpale matas}

RR – rozmarino rūgštis OR – oleanolo rūgštis UR – ursolo rūgštis

UV – ultravioletinė spinduliuotė V/A – vanduo aliejuje tipo emulsija

V/A/V – vanduo/aliejus/vanduo tipo emulsija 3D – tridimencinė erdvė

ĮVADAS

Pastaraisiais metais didėja susidomėjimas puskiečių farmacinių formų pagamintų iš natūralių produktų kūrimu. Didėjantis kontaktine alergija ir atopiniu dermatitu sergančių žmonių skaičius skatina rinkai siūlyti produk-tus, sukurtus augalinių ingredientų pagrindu, nenaudojant jų gamybai kon-servantų [67]. Šiandien jau yra sukurta daug odos priežiūros priemonių su įvairiais biologiniu aktyvumu pasižyminčiais komponentais [62, 68]. Yra įrodytas šių produktų antioksidacinis, antimikrobinis veikimas, įvertintas biologinis prieinamumas, stabilumas [29, 53, 161, 210]. Nei Lietuvoje, nei pasaulyje augalinių ekstraktų įtaka puskiečių farmacinių formų technolo-ginėms savybėms nėra plačiai tirta. Paskelbti tik keli tyrimai, kuriuose yra įvertinta kvapiųjų rozmarinų lapų, vaistinių medetkų žiedų ir greipfrutų minkštimo ir sėklų ekstraktų įtaka dvinarės aliejus vandenyje (A/V) tipo emulsinės sistemos kokybei [161, 195]. Duomenų apie augalinių ekstraktų ir jų sudėtyje esančių veikliųjų junginių įtaką daugianarių emulsijų formavi-muisi ir technologiniams parametrams rasti nepavyko. Atsižvelgiant į tai, mes iškėlėme hipotezę, kad augaliniai ekstraktai ir jų sudėtyje esančios veikliosios medžiagos gali pakeisti paviršiui aktyvias medžiagas ir/arba klampos ir tekstūros modifikatorius naudojamus puskiečių farmacinių formų kūrimui ir stabilizavimui.

Eksperimentiniams tyrimams viena iš pasirinktų vaistinių augalinių žalia-vų buvo kvapiųjų rozmarinų lapai, kurie kaupia eterinius aliejus, fenolines ir triterpenines rūgštis, flavanoidus ir kt. [35]. Šis augalas gali būti naudojamas kaip funkcionali žaliava ne tik dėl jo sudėtyje esančios rozmarinų rūgšties antioksidacinio poveikio, bet ir dėl kaupiamų triterpeninių ursolo ir oleanolo rūgščių, kurios pasižymi plačiu biologiniu aktyvumu: priešuždegiminiu, hepatoprotekciniu, gastroprotekciniu, priešopiniu, priešvėžiniu ir kt. [86, 197]. Dėl skirtingų rozmarino, ursolo ir oleanolo rūgščių tirpumo savybių, gana sudėtinga, tačiau aktualu pagaminti ekstraktą, kuris pasižymėtų stipriu antioksidaciniu poveikiu ir didele ursolo ir oleanolo rūgščių išeiga ir įver-tinti jo įtaką A/V ir vanduo/aliejus/vanduo (V/A/V) tipo emulsinių sistemų technologinėms charakteristikoms. Nepaisant įvairių augalinių vaistinių ža-liavų biologinių poveikių ir mažesnio dirginančio ir toksinio poveikio žmo-gaus organizmui lyginant su sintetinėmis žaliavomis, jų įvairi fitocheminė sudėtis sunkina emulsinių sistemų technologiją siekiant pagaminti stabilų produktą [138].

Pastaruoju metu inovatyvios aktyviųjų medžiagų pernašos sistemos tokios kaip nano, mikro ir daugianarės emulsijos yra intensyviai tyrinė-jamos. Daugianarė emulsija yra sudėtinga daugiafazė sistema, kurioje vienu

metu yra ir A/V, ir vanduo aliejuje (V/A) tipo emulsijos [179]. Daugianarių V/A/V emulsijų kūrimas yra aktualus dėl jų didesnio bioprieinamumo ly-ginant su dvinarėmis sistemomis ir mikronešiklių funkcijos: vandenyje tir-pūs junginiai gali būti įkapsuliuojami į vidinę hidrofilinę fazę ir taip apsau-goti nuo išorinio streso, pvz.: junginių oksidacijos [3]. Kiti daugianarės emulsijos privalumai yra pailginto veikliųjų medžiagų atpalaidavimo savy-bės bei mažesnis toksinis poveikis [183]. Nepaisant gausysavy-bės daugianarių emulsijų pranašumų lyginant su A/V ar V/A tipo sistemomis, jų gamybos procesas reikalauja didesnių laiko sąnaudų dėl papildomų technologinių stadijų ir daugiau lėšų dėl emulsinei sistemai suformuoti naudojamų emul-siklių gausos. Atsižvelgiant į tai, aktualu supaprastinti daugianarių emulsijų gamybos eigą ir sumažinti šiai sistemai suformuoti naudojamų sintetinių emulsiklių kiekį ar juos pakeisti augalinės kilmės produktais.

Inovatyvių ir natūralių daugianarių ir dvinarių emulsinių sistemų stabi-lizatorių paieška yra svarbi siekiant supaprastinti emulsinių sistemų gamy-bos procesą ir sukurti stabilų produktą. Nedidelės klampos polisacharidų geliai (ksantano, sklerogliukano ir kt.) šiuo metu yra aktyviai tiriami dėl pastebėto jų emulsines sistemas stabilizuojančio poveikio, išvengiant emul-sijų išsisluoksniavimo ir dispersinių dalelių koalescencijos [15]. Iki šiol duomenys apie sėjamųjų linų sėklų ir sėjamųjų avižų sėklų ekstraktų įtaką daugianarių emulsinių sistemų reologijai ir agregatiniam bei sedimenta-ciniam stabilumui nebuvo skelbti. Avižų bei linų sėklos ir jų ekstraktai išo-riškai naudojami jau daugiau nei tūkstantį metų siekiant apsaugoti ir rege-neruoti odą [163]. Literatūros duomenimis avižų sėklų ekstraktas pasižymi odą drėkinančiomis bei tonizuojančiomis savybėmis, o avižų miltai lengvina tokias odos būkles kaip niežulį, odos nudegimą [54]. Dėl silpnai rūgštinės pH reikšmės avižų produktai naudojami odos valymui ir probleminės odos priežiūrai [121]. Linų sėklų aliejus ir gleivės gerina odos elastingumą, ba-lansuoja odos pH reikšmę, suteikia švelnumo pojūtį [65]. Aktualu įvertinti linų sėklų ir avižų sėklų ekstraktų emulsinę galią ir įtaką daugianarės emul-sijos formavimuisi bei kokybei ir išnaudoti šių augalinės kilmės nedidelės klampos gelių technologines funkcijas.

Pastaruoju metu didelis dėmesys skiriamas puskiečių farmacinių formų ypač odos priežiūrai skirtų gaminių saugumui. Nuo 2013 m. ES šalyse na-rėse įsigaliojo sugriežtinta direktyva (1223/2009) dėl kosmetikos gaminių bandymų su gyvūnais, todėl aktyviai tobulinami ir taikomi alternatyvūs gaminio toksiškumą ir efektyvumą vertinantys metodai [25, 84, 104]. Inovatyvūs 3D rekonstruoto žmogaus epidermio modeliai histologiškai ati-tinkantys žmogaus epidermį in vivo, yra vienas naujausių metodų, kurio pagalba galima vertinti medžiagos, puskiečio vaistinio preparato ar kosme-tikos gaminio dirginantį, koroziją ar uždegimą sukeliantį bei fototoksinį

poveikį žmogaus odai in vitro. Dėl plačios fitocheminės augalinių ekstraktų naudojamų emulsinės sistemos gamyboje sudėties aktualu įvertinti ar sukurta daugianarė V/A/V tipo emulsija nėra toksiška. Šie tyrimai leidžia prognozuoti tiriamo puskiečio preparato efektą naudojant ant odos in vivo.

Siekiant įrodyti preparato naudą žmogaus odai naudojant išoriškai, aktualu atlikti eksperimentą in vivo. Nors etanolis ES yra leidžiamas naudoti ir kosmetikos, ir farmacijos pramonėje, literatūros duomenimis alkoholio turinčios kosmetinės, dezinfekcinės ir higienos priemonės sąlygoja drėgmės netekimą ir odos išsausėjimą [186]. Todėl tęstiniai preparato, sudėtyje turinčio etanolio tyrimai odos charakteristikoms in vivo, yra būtini siekiant įvertinti daugianarės emulsinės sistemos saugumą ir galimas nepageidauja-mus poveikius žmogaus odai. Aktualu atlikti augalinių produktų pagrindu sukurtos V/A/V tipo emulsinės sistemos biomedicininį tyrimą, vertinantį augalinių ekstraktų, įeinančių į puskiečių farmacinių formų sudėtį, poveikį žmogaus odos drėgmei, lipidų kiekiui ir pigmentacijai. Šie tyrimai leistų pagrįsti kuriamų produktų efektą ir saugų naudojimą ir galimą komercija-lizaciją farmacijos ir/ar kosmetikos pramonėje.

Darbo tikslas – pagaminti stabilią daugianarę emulsinę sistemą su auga-liniais ekstraktais, įvertinti jų įtaką emulsinės sistemos formavimuisi ir kokybei bei nustatyti gautos farmacinės formos poveikį žmogaus odos drėgmei, lipidų kiekiui ir pigmentacijai.

Uždaviniai:

1. Įvertinti ekstrakcijos metodo įtaką kvapiųjų rozmarinų lapų veikliųjų medžiagų (ursolo, oleanolo ir rozmarino rūgščių) išeigai;

2. Įvertinti emulsiklio įtaką emulsinių sistemų matricų agregatiniam ir sedimentaciniam stabilumui;

3. Ištirti rozmarinų lapų, avižų ir linų sėklų ekstraktų įtaką emulsinių sistemų formavimuisi ir kokybei;

4. Įvertinti pagamintos sistemos dirginantį ir fototoksinį poveikį odai panaudojant 3D rekonstruoto žmogaus epidermio modelius;

5. Ištirti emulsijų su augaliniais ekstraktais įtaką tiriamųjų žmonių odos drėgmei, lipidų kiekiui ir pigmentacijai.

Mokslinio darbo naujumas

Sukurtas naujas tiesioginis daugianarės emulsijos gamybos metodas, įvertinus etanolinio rozmarinų lapų ekstrakto, esančio emulsijų su polime-rinio ir paviršiui aktyvios medžiagos emulsiklio kompleksu sudėtyje, gebą formuoti daugianares V/A/V tipo emulsijas, be jokių papildomų techno-loginių veiksmų. Šis efektas dar niekada nebuvo pastebėtas ar nagrinėtas

paskelbtoje mokslinėje literatūroje. Vertinant rozmarinų lapų ekstrakto veikliųjų medžiagų įtaką daugianarės emulsijos formavimuisi atlikti pavir-šiaus ir tarpfazinės įtempties tyrimai parodė, kad etanolinis rozmarinų lapų ekstraktas neveikia kaip paviršiui aktyvi medžiaga, nors sudėtyje esančios ursolo ir oleanolo rūgštys yra triterpeniniai saponinai.

Nustatyta kompleksinio emulsiklio sudaryto iš polisorbato 20 ir poli-akrilo rūgšties natrio druskos polimero ir aliejaus kilmės įtaka dvinarių A/V tipo emulsinių sistemų klampai bei agregatiniam ir sedimentaciniam stabi-lumui. Įvairių paviršiui aktyvių medžiagų, polimerų ir jų kompleksų įtaka emulsijos formavimuisi plačiai išnagrinėta literatūros šaltiniuose, tačiau tokios sudėties emulsiklis vertintas nebuvo. Nustatyta, kad daugianarės emulsijos su augaliniu aliejumi emulsinių rutulėlių dydis yra reikšmingai mažesnis lyginant su mineraliniu aliejumi. Gauti duomenys prieštarauja iki šiol literatūroje vyravusiam teiginiui, kad daugianarės emulsijos su minera-liniais aliejais pasižymi mažesniu emulsinių rutulėlių dydžiu ir yra stabiles-nės [92, 187].

Ištirta ekstrakcijos metodo, tirpiklio ir technologinių parametrų įtaka veikliųjų medžiagų (rozmarino (RR), ursolo (UR) ir oleanolo (OR) rūgščių) išeigai kvapiųjų rozmarinų lapų ekstrakte.

Tiriamojo etanolinio rozmarinų lapų ekstrakto pagalba suformuota daugianarė V/A/V emulsija pasižymėjo tik trumpalaikiu stabilumu, todėl augalinės kilmės stabilizatorių paieška buvo būtina. Nedidelės klampos polisacharidų gelių taikymas emulsinių sistemų stabilizavimui jau buvo nagrinėtas literatūroje, tačiau linų ir avižų sėklų ekstraktų įtaka daugianarių emulsijų stabilumui paskelbta nebuvo. Įvertinus šių ekstraktų emulsinę galią nustatyta jų įtaka ne tik V/A/V tipo sistemos technologinėms charakte-ristikoms, bet ir daugianarės emulsijos formavimuisi. Vadovaujantis mate-matine statistine eksperimentų matrica buvo sukurta optimalios sudėties sta-bili daugianarė emulsinė sistema suformuota augalinių ekstraktu pagrindu.

Atsižvelgiant į tai, kad daugianarės emulsijos formuluotė yra inovatyvi, buvo būtina įvertinti ir technologinių parametrų tokių kaip maišymo greitis ar trukmė įtaką emulsijos rutulėlių dydžiui, klampai ir agregatiniam bei sedimentaciniam stabilumui.

In vitro rekonstruoto žmogaus epidermio modelių ir in vivo odos lopo

tyrimo pagalba ištirtas sukurtos puskietės farmacinės formos toksiškumas ir dirginantis poveikis odos ląstelėms, taip įrodant V/A/V sistemos saugumą vartojant ant odos. Daugianarės emulsinės sistemos literatūros duomenimis dar niekada nebuvo vertintos pasitelkiant inovatyvius 3D rekonstruoto žmo-gaus epidermio modelius, o jų kompozicijų sudėtyje turinčių augalinių ekstraktų dirginantis poveikis odai in vivo taip pat nebuvo tyrinėtos.

Vertinant sukurtos daugianarės emulsinės sistemos poveikį žmogaus odos drėgmei in vivo nustatyta, kad 28 dienas naudojant V/A/V emulsiją drėgmės kiekis odoje reikšmingai padidėja, o dvinarė emulsija, sudėtyje turinti etanolio pasižymi odą sausinančiu poveikiu. Remiantis gautais duo-menimis įrodyta, kad daugianarė emulsija suformuota etanolinio rozmarinų lapų ekstrakto pagalba yra saugi naudoti ant odos, nesausina odos kaip kitos etanolio sudėtyje turinčios skystos ar puskietės vaisto formos.

Praktinė ir teorinė reikšmė

Įvertinta kompleksinio emulsiklio, sudaryto iš paviršiui aktyvios medžia-gos ir polimero, įtaka puskiečių farmacinių formų - kremų technologiniams parametrams. Nustatyti optimalūs ekstrakcijos metodai, tirpiklių ir ekstrak-cijos sąlygų įtaką RR, OR ir UR bei fenolinių junginių išeigai kvapiųjų rozmarinų lapų ekstrakte, pritaikyta ESC metodika UR ir OR atskyrimui bei identifikavimui augalinėje žaliavoje. Nustatyta rozmarinų lapų ekstrakto ir jo sudėtyje esančių veikliųjų medžiagų (UR, OR ir RR) įtaka emulsinės sis-temos technologinėms charakteristikoms ir daugianarės emulsijos formavi-muisi. Įrodytos rozmarinų lapų ekstrakto, kaip tiesiogiai V/A/V tipo emul-sines sistemas formuojančio ingrediento, taikymo galimybės kosmetikos ir farmacijos pramonėje. Nustatyta, kaip rozmarinų lapų, linų bei avižų sėklų ekstraktai gali įtakoti puskiečių preparatų klampą bei agregatinį ir sedi-mentacinį stabilumą. Nustatytos avižų ir linų sėklų ekstraktų kaip augalinių reologijos modifikatorių, stabilizuojančių emulsinę sistemą, komercijaliza-vimo galimybės farmacijos bei kosmetikos pramonėje. Gautos žinios apie technologinius veiksnius, lemiančius tiesiogiai formuojamos V/A/V tipo emulsinės sistemos kokybę.

Etanolinis rozmarinų lapų ekstraktas, pasižymintis antimikrobinėmis savybėmis, panaudotas puskietės farmacinės formos konservavimui, kas rodo, kad jis gali pakeisti sintetinius konservantus. Nustatytas etanolinio kvapiųjų rozmarinų lapų ir avižų bei linų sėklų ekstraktų esančių emulsijos sudėtyje toksiškumas in vitro bei dirginantis poveikis odai in vivo. Įrodytas sukurtos daugianarės emulsijos su augaliniais ekstraktais teigiamas poveikis žmogaus odai in vivo. Sukurta V/A/V tipo daugianarė emulsija gali būti naudojama kaip bazė puskiečių farmacinių formų gamyboje, įterpiant į sudėtį lipofilines ir hidrofilines veikliąsias medžiagas.

Darbo rezultatų aprobavimas

Disertacijos tyrimų rezultatai pristatyti 1 nacionalinėje ir 4 tarptautinėse mokslinėse konferencijose: Jaunųjų mokslininkų ir tyrėjų konferencija 2014 (Kaunas, Lietuva, 2014 m.); The 5th International Conference On Phar-maceutical Sciences and Pharmacy Practice dedicated to 145th Anniversary

of prof. Petras Raudonikis (Kaunas, Lietuva, 2014 m. lapkričio 22 d.); 9th International Scientific Conference “The Vital Nature Sign” (Kaunas, Lietuva, 2015 m. gegužės 14–16 d.); The 8th International Conference and Exhibition on Pharmaceutics & Novel Drug Delivery Systems: Pharma-ceutica 2016 (Madridas, Ispanija, 2016 m. kovo 7–9 d.); International Conference on Chemical, Agricultural, Biological and Health Sciences (CABHS-2017) (Kuta, Indonezija, 2017 m. vasario 2–3 d.). Tyrimų tema-tika paskelbtos 4 publikacijos, atspausdintuose tarptautiniuose mokslo leidiniuose, turinčiuose cituojamumo rodiklį Clarivate Analytics Web of

Science (CA WoS) duomenų bazėje.

Darbo apimtis ir struktūra

Disertaciją sudaro įvadas, literatūros apžvalga, tyrimo objektas ir me-todai, rezultatai ir jų aptarimas, išvados, literatūros sąrašas (204 šaltiniai), disertacijos tema paskelbtų publikacijų sąrašas, priedai, disertantės gyve-nimo aprašymas, mokslinių publikacijų disertacijos tema kopijos, santrauka ir padėka. Darbe yra 16 lentelių ir 19 paveikslų. Disertacijos apimtis 152 puslapiai.

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. Ekstrakcijos metodų ir sąlygų įtaka veikliųjų medžiagų ekstrakcijai iš augalinių žaliavų

Augalinės kilmės biologiškai aktyvių junginių ekstrakcija ir gryninimas yra aktualus, kuriant įvairias farmacines formas [196]. Dažniausiai akty-viųjų junginių išskyrimas iš augalinės žaliavos vyksta ekstrakcijos tirpiklio, kuriame tirpsta veikliosios medžiagos, pagalba. Biologiškai aktyvių junginių išeiga priklauso ne tik nuo ekstrakcijos metodo, bet ir tinkamų ekstrakcijos sąlygų parinkimo [139].

Atliktuose eksperimentiniuose tyrimuose buvo naudoti kvapiųjų roz-marinų (Rosmarinus officinalis L.) lapai. Kvapusis rozmarinas yra lūpa-žiedžių šeimos augalas kaupiantis eterinius aliejus, flavanoidus, fenolines ir triterpenines rūgštis ir kt. [35]. Rozmarinų lapų ekstrakte randama roz-marinų rūgšties, kuri pasižymi antialerginiu, antioksidaciniu bei prieš-uždegiminiu poveikiu, bei triterpeninių ursolo ir oleanolo rūgščių, kurios šiuo metu yra plačiai tyrinėjamos dėl potencialaus priešuždegiminio po-veikio bei priešvėžinio aktyvumo žmogaus melanomos ląstelėms [66, 115, 147]. Dėl skirtingų minėtų rūgščių tirpumo įvairiuose ekstrakcijos proceso metu naudojamuose tirpikliuose sudėtinga pagaminti ekstraktą, kuris pa-sižymėtų stipriu antioksidaciniu poveikiu dėl sudėtyje esančios rozmarinų rūgšties (RR) ir didele triterpeninių rūgščių koncentracija.

1.1.1. Ekstrakcijos sąlygų įtaka rozmarinų, ursolo ir oleanolo rūgščių išeigai

Rozmarinų rūgštis yra kavos rūgšties ir 3,4-dihidroksifenillakto rūgšties esteris gerai tirpus organiniuose tirpikliuose ir mažai tirpus vandenyje [159]. Literatūros duomenimis optimaliai RR išeigai augalinės žaliavos ekstrakte išgauti naudojamas ekstrahentas su dialektrine konstanta 48–59 [144]. Dent su bendraautoriais nustatė, kad binarinė tirpiklių sistema yra efektyvesnė RR ekstrakcijai dėl jų santykinio poliškumo [38]. Moksliniai tyrimai teigia, kad etanoliu išgaunama reikšmingai daugiau RR iš vaistinės augalinės ža-liavos lyginant su heksanu, 2-propanoliu ar acetonu [2, 38, 144]. Angelov su bendraautoriais nustatė, kad 50–60 proc. etanolis ekstrahuoja didžiausią kiekį RR iš vaistinės melisos lapų lyginant su kitomis etanolio koncentra-cijomis [7]. Kitų autorių duomenimis 80 proc. ir didesnė etanolio koncent-racija tirpiklių sistemoje sąlygoja reikšmingą RR išeigos sumažėjimą vaistinių šalavijų ekstrakte [46]. Triterpeninės rūgštys yra gerai tirpios

organiniuose tirpikliuose ir praktiškai netirpios vandenyje (metanolis > etanolis > acetonitrilas > acetonas > etilacetatas > chloroformas > vanduo) [11, 197, 207, 208]. Literatūros duomenimis didelė UR ir OR išeiga ekstra-huojant metanoliu išgaunama dėl didelio poliškumo ir mažesnės klampos bei paviršiaus įtempties lyginant su kitais organiniais tirpikliais [11, 208]. Xia ir kiti įvertino etanolio koncentracijos įtaką UR ir OR išeigai: nustatyta, kad didžiausia veikliųjų medžiagų išeiga gaunama kai tirpiklio koncentra-cija yra 90 – 95 proc. [208].

Vienas iš ekstrakcijos proceso optimizavimo būdų yra tinkamas žaliavos ir tirpiklio santykio parinkimas. Literatūroje skelbtais duomenimis RR išei-ga iš vaistinių melisų žolės padidėja 5 kartus, kai žaliavos ir tirpiklio santy-kis pakinta nuo 1:10 iki 1:30, o jo pokytis nuo 1:6 iki 1:18 sąlygoja 30 proc. didesnę RR išeigą vaistinių šalavijų ekstrakte (p < 0,05) [46, 144]. Xia ir bendraautoriai panašų efektą nustatė ir triterpeninių saponinų ekstrakcijos metu [208]. UR išeiga tiesiogiai proporcinga žaliavos ir tirpiklio santykiui – jam kintant nuo 1:5 iki 1:20 triterpeninės rūgšties kiekis ekstrakte padidėja apie 30 proc., o Vetal ir kiti nustatė, kad keičiant žaliavos ir tirpiklio santykį nuo 1:30 iki 1:150 UR išeiga padidėjo net tris kartus [196, 208]. Ultra-garsinės ekstrakcijos iš blizgančiųjų ligustrų vaisių metu žaliavos ir ekstra-hento santykiui kintant nuo 1:30 iki 1:40 OR išeiga sumažėja 12 proc. [208].

Temperatūra ekstrakcijos metu taip pat reikšmingai įtakoja veikliųjų medžiagų išeigą: dažniausiai esant aukštesnei temperatūrai ekstrahavimas vyksta greičiau, pagerėja medžiagų tirpumas, intensyvesnė molekulinė difu-zija [77, 193]. Literatūros duomenimis didžiausias RR kiekis iš vaistinės augalinės žaliavos išgaunamas kai ekstrakcijos temperatūra svyruoja tarp 40–60 °C [7, 46, 72]. Nustatyta, kad triterpeninių rūgščių išeiga tiesiogiai proporcinga ekstrakcijos temperatūrai: UR ir OR išeiga ultragarsinės eks-trakcijos metu padidinus temperatūrą nuo 20 iki 50 °C padidėja 33 proc., tačiau reikšmingo skirtumo 50–70 °C temperatūros ribose nepastebėta [196, 197, 208].

Aktualu optimizuoti ekstrakcijos laiką siekiant sumažinti ekstrakto ga-mybos kaštus. Įrodyta, kad RR išeiga didėja ilgėjant ekstrakcijos laikui [89, 185]. Kim ir kiti nustatė, kad vaistinių melisų dinaminės maceracijos truk-mės kaita nuo 30 iki 90 min. sąlygojo RR išeigos padidėjimą 30 proc., tačiau Durling ir kiti pastebėjo, kad ilgesnis nei 3 valandų ekstrakcijos procesas reikšmingos įtakos RR koncentracijai ekstrakte neturi [46, 89]. Pasak Fang ir kitų triterpeninių rūgščių išeiga didėja mikrobangų ekstrak-cijos laikui ilgėjant nuo 6 iki 11 min. [51]. Kitų autorių duomenimis eks-trahuojant vaistinę augalinę žaliavą ultragarsu UR ir OR kiekis didėja tik nuo 0 iki 30 min., o ekstrakcijos trukmės pokytis nuo 30 iki 60 min.,

reikšmingos įtakos UR išeigai neturi, o OR koncentracija ekstrakte su-mažėja [196, 197, 208].

1.1.2. Ekstrakcijos metodų įtaka rozmarinų, ursolo ir oleanolo rūgščių išeigai

Efektyvaus ekstrakcijos metodo parinkimas veikliųjų medžiagų ekstrak-cijai iš vaistinės augalinės žaliavos yra svarbus norint sumažinti produkto gamybos kaštus ir pagaminti ekstraktą su didele biologiškai aktyvių junginių koncentracija. Literatūroje yra duomenų, kad maceracija ir perkoliacija yra efektyvūs metodai RR iš vaistinės augalinės žaliavos išekstrahuoti [20, 175]. Adham lygindamas maceracijos ir ekstrakcijos ultragarsu efektyvumą lūpažiedžių šeimos augalų veikliųjų medžiagų išeigai nustatė, kad 6 dienas trukusio maceracijos proceso metu išgaunama nuo 2 iki 5 kartų daugiau ekstraktyvų priklausomai nuo augalo rūšies [2]. Koncentruotam ar sausam augalinės žaliavos ekstraktui su RR pagaminti gali būti taikoma ekstrakcija Soksleto aparate. Jos metu ekstrakcijai yra naudojamas didelis kiekis vaistinės augalinės žaliavos ir mažas tirpiklio kiekis, tačiau lakaus organinio tirpiklio likutį reikia nugarinti, todėl išauga ekstrakcijos proceso sąnaudos [48, 106, 190]. Erkan ir Ayranci nustatė, kad sausajame kvapiųjų rozmarinų lapų ekstrakte, veikliąsias medžiagas ekstrahuojant Soksleto aparate meta-noliu 6 valandas, rozmarinų rūgšties kiekis yra apie 6 proc. [48].

Nors modifikuoti maceracijos ir perkoliacijos metodai taikomi ekstraktų ir tinktūrų gamybai, tačiau naujausi tyrimai rodo, kad dinaminė, ultragarsu ar mikrobangomis vykdoma ekstrakcija yra efektyvus ir greičiau vykstantis procesas [11, 17, 36]. Ši hipotezė pasitvirtino vertinant ekstrakcijos grįžta-muoju šaldytuvu ir ultragarsu įtaką UR bei OR išeigai iš Hedyotis diffusa žolės: ekstrakcijos metodas reikšmingos įtakos UR ir OR išeigai neturėjo [201]. Vis dėlto dauguma autorių teigia, kad triterpeninių saponinų ekstra-kcija naudojant slėgį, mikrobangas ar ultragarsą sąlygoja reikšmingai dides-nes veikliųjų medžiagų išeigas lyginant su maceracija, ekstrakcija Soksleto aparate ar ekstrakcija naudojant grįžtamąjį šaldytuvą [17, 51, 205]. Hossain su bendraautoriais nustatė, kad RR kiekis (24,86 ± 0,45 mg/g) kvapiųjų mairūnų lapuose išgautas ultragarsinės ekstrakcijos būdu yra reikšmingai didesnis lyginant su maceracija, o Paniwnyk ir kiti įrodė, kad proceso di-namika reikšmingai neįtakoja veikliųjų junginių išeigos ultragarsinės eks-trakcijos metu [72, 153].

Vienas iš metodų taikomų biologiškai aktyviems komponentams iš auga-linės žaliavos išgauti yra superkritinė ekstrakcija suskystintomis CO2 – taip

padidinamas žaliavos pralaidumas ir išvengiama kenksmingų ekstrakcijai 16

naudojamų organinių tirpiklių [27, 182]. Vertinant hidrodistiliacijos, super-kritinės ekstrakcijos bei ekstakcijos naudojant grįžtamąjį šaldytuvą įtaka RR išeigai kvapiųjų rozmarinų lapų ekstrakte, nustatyta, kad etanolinė ekstrak-cija naudojant grįžtamąjį šaldytuvą yra net 3 kartus efektyvesnė nei super-kritinė ekstrakcija, o hidrodistilacijos metu RR išeiga buvo net 200 kartų mažesnė [27]. Panaši tendencija pastebima taikant superkritinę ekstrakciją triterpenėms rūgštims iš augalinės žaliavos išgauti: UR ir OR išeiga iš pla-čialapių gysločių lapų 2 kartus mažesnė nei eksterahuojant žaliavą Soksleto aparate [188].

Vienas naujausių ekstrakcijos būdų siekiant pagerinti sunkiai hidrofili-nėje fazėje tirpių medžiagų tirpumą ir išvengti kenksmingų organinių tir-piklių naudojimo yra dvifazė ekstrakcija. Jos metu ekstrahentas yra vande-ninis paviršiui aktyvios medžiagos tirpalas, o ekstrakcijos temperatūra pa-renkama pagal naudojamos PAM susidrumstimo tašką (angl. cloud point) [70]. Schneider su bendraautoriais pritaikė polioksietilen-(10)-cetilo eterio, oligoetilenglycolio monoalkileterio bei polisorbato 65 tirpalus triterpeni-nėms rūgštims iš šalavijo lapų ir stiebų išgauti: UR ir OR išeiga buvo reikšmingai didesnė nei ekstrahuojant 70 proc. etanolio tirpalu [178].

RR, OR ir UR iš kvapiųjų rozmarinų lapų išgauti gali būti taikomi ir statiniai ar dinaminiai tradiciniai, tinktūrų ir skystų ekstraktų gamyboje naudojami, ekstrakcijos metodai ir inovatyvūs, saugesni vartotojui ir mažiau laiko bei energijos sąnaudų reikalaujantys ekstrakcijos procesai. Aktualu parinkti ekstrahentą, kuris išekstrahuotų visas tiriamąsias kvapiųjų rozma-rinų lapų veikliąsias medžiagas, atsižvelgiant į skirtingas šių rūgščių tirpu-mo savybes. Taip pat svarbu optimizuoti ekstrakcijos proceso parametrus – žaliavos ir tirpiklio santykį, ekstrakcijos trukmę ir temperatūrą, kad biologiškai aktyvūs junginiai išliktų stabilūs ir iš augalinės žaliavos būtų išekstrahuotas didelis RR, UR ir OR kiekis.

1.2. Emulsiklio įtaka emulsinių sistemų agregatiniam ir sedimentaciniam stabilumui

Emulsijos yra termodinaminiu požiūriu nestabilios sistemos, kurios gali būti stabilizuojamos medžiagomis pvz.: emulsikliais arba klampos modifi-katoriais, kurie pasižymi skirtingu veikimo mechanizmu. Emulsiklis daž-niausiai yra paviršiui aktyvi medžiaga (PAM), kuri adsorbuojasi ant emul-sinio rutulėlio paviršiaus ir sukuria apsauginį apvalkalą, kuris neleidžia rutulėliams agreguotis [125]. PAM taip pat sumažina įtemptį tarp disper-sinės fazės ir terpės, todėl homogenizacijos metu susiformuoja mažesnio skersmens emulsiniai rutulėliai [204]. Tekstūros ir klampos modifikatorius

yra medžiaga, kuri suteikia pusiau kietai vaisto formai būdingas tekstūros savybes ir padidina dispersinės terpės klampą taip sulėtinamas dispersinės fazės rutulėlių judrumą dėl sunkio jėgos ar šiluminio judėjimo [42, 125].

Polioksietilen(20)sorbitano monolauratas (polisorbatas 20) yra nejono-geninė paviršiui aktyvi medžiaga, kuri plačiai naudojama kosmetikos, far-macijos ir maisto pramonėje. Ši PAM gali atlikti emulsiklio, tirpiklio, stabilizatoriaus funkcijas bei sulėtinti kristalizacijos procesą [10, 116, 124]. Renkantis nejonogeninę PAM svarbi yra hidrofilinio – lipofilinio balanso (HLB) reikšmė, nes jų savybės priklauso nuo hidrofilinių bei lipofilinių dalių santykio medžiagos molekulėje [136]. Lopes ir kiti ieškodami opti-malaus emulsiklio kvapiosios cimbžiedos eterinių aliejų emulsijos gamybai nustatė, kad 2 proc. polisorbato 20 koncentracija reikšmingai geriau tirpina eterinius aliejus ir stabilizuoja emulsinę sistemą lyginant su kitomis nejo-nogeninėmis PAM. Remiantis literatūros duomenimis, ilgėjanti anglies ato-mų grandinė ir didėjanti emulsiklio molekulinė masė sąlygoja stabilesnės emulsinės sistemos sukūrimą dėl lėtesnės PAM difuzijos link tikslinių ląs-telių paviršiaus, to pasekoje veikliųjų medžiagų atpalaidavimas iš emulsijos prailginamas [110, 120].

Polisorbatas 20 emulsinėse sistemose dažniausiai yra naudojamas komp-lekse kartu su kitomis PAM norint pasiekti tam tikrą HLB reikšmę rei-kalingą emulsinei sistemai suformuoti arba kartu su produkto klampą di-dinančiais reologijos modifikatoriais. Ping ir kiti įrodė, kad skirtingos HLB reikšmės polisorbato 20 ir kitų nejonogeninių PAM kombinacija gali būti taikoma mikroemulsijų gamyboje siekiant užtikrinti agregatinį bei sedimen-tacinį sistemos stabilumą bei pagerinti veikliųjų medžiagų įkapsuliavimą [103]. Daugianarių emulsinių sistemų gamyboje dažniausiai yra naudojamos dvi ar daugiau PAM kartu su produkto tekstūrą modifikuojančiu ingre-dientu, siekiant išvengti dalelių koalescencijos ir sistemos suirimo. Musa-shino ir kiti teigė, kad V/A/V sistemos suformuotos tik su PAM polisorbato 20 ir sorbitano monooleato 80 kompleksu nėra stabilios, o šių emulsiklių kompleksas turėtų būti taikomas A/V ar V/A tipo emulsijų gamyboje, tačiau į daugianarės emulsinės sistemos sudėtį pridėjus dekstrano, pululano ar mal-todekstrino polimerų padidėja produkto klampa, užtikrinamas agregatinis ir sedimentacinis stabilumas [135]. Matathia ir Taldock nustatė, kad 1 proc. polisorbato 20 ar kitos PAM, kurios HLB reikšmė 16–20, yra tinkamas kiekis daugianarei emulsijai suformuoti, kai sistemos klampa modifikuo-jama ir ji stabilizuomodifikuo-jama AMPS/VIFA kopolimeru [119]. Skirtingų rinkoje esančių polimerinių medžiagų ir PAM emulsiklių kompleksų įtakos emul-sinių sistemų agregatiniam ir sedimentaciniam stabilumui vertinimas pa-rodė, kad akrilo rūgšties ir akrilamido bei poliakrilo rūgšties kompleksas su

polisorbatu 20 reikšmingai padidina emulsinės sistemos klampą bei agrega-tinį stabilumą lyginant su kitais polimero ir PAM kompleksais [80].

Poliakrilo rūgšties natrio druska, superabsorbentas (polimeras, kuris absorbuoja ir sulaiko kelis šimtus kartų didesnį skysčio kiekį nei jo pačio masė), buvo sukurta dar 1970 m. [108]. Kryžminės jungtys polimero gran-dinėje riboja medžiagos tirpumą vandenyje, tačiau gerai brinksta, todėl ilgą laiką ji buvo plačiai taikoma vienkartinių medicininių ir higienos prekių tokių kaip rankšluosčiai, paklotai, įklotai, sauskelnės ir kt. gamyboje [108, 189, 209]. Poliakrilo rūgšties natrio druskos gelio matrica buvo pradėta taikyti kosmetikos ir farmacijos pramonėje – emulgelių ir emulsinių sistemų gamybai ir stabilizavimui, gerokai vėliau, tačiau procesas buvo sudėtingas ir brangus dėl ilgo gelifikacijos proceso ir aukštos temperatūros reikalingos gelio matricai paruošti [93, 126].

Poliakrilo rūgšties natrio druskos ir įvairių PAM taikymas emulsiklių bei reologijos modifikatorių gamybai inversinės emulsinės polimerizacijos būdu plačiai tiriama mokslinėje literatūroje, tačiau gauto poliakrilo rūgšties natrio druskos ir polisorbato 20 komplekso įtaka emulsinių sistemų formavimuisi ir kokybei iki šiol tirta mažai [6, 102]. Weisman ir Torres ištyrė minėto emulsiklių komplekso taikymą odos priežiūros produktų kūrime išsaugant veikliųjų medžiagų antioksidacines savybes. Šie mokslininkai taip pat nusta-tė, kad 5,49 proc. poliakrilo rūgšties natrio druskos ir polisorbato 20 kon-centracija buvo nepakankamas kiekis emulsijai stabilizuoti todėl papildomai stabilios sistemos suformavimui pridėta PEG-8 hidroksipropil kokoato ir PEG-12 dimetikono [202, 203]. Šio polimerinio emulsiklio ir PAM medžia-gos komplekso įtaka daugianarių emulsinių sistemų formavimuisi ir stabi-lumui nei Lietuvos, nei pasaulio moksliniuose leidiniuose skelbta nebuvo.

Emulsinę sistemą formuojančio emulsiklio parinkimas įtakoja ne tik emulsijos technologinius procesus, bet ir kokybinius parametrus. Skirtingų veikimo mechanizmo emulsiklių taikymas emulsijos gamyboje leidžia kontroliuoti produkto technologines charakteristikas tokias kaip klampa, pH reikšmė ir tepumas bei išsaugoti stabilumą.

1.3. Daugianarės emulsijos formavimo ypatumai

Emulsijos yra dispersinės sistemos susidedančios bent iš dviejų nesi-maišančių skysčių [152, 194]. Daugianarė emulsija yra inovatyvi vaisto pernašos sistema, kurioje viena emulsija yra kitoje emulsijoje t. y. ir A/V, ir V/A emulsijos egzistuoja kartu [74, 95, 100]. Daugianarės emulsijos turi daug privalumų prieš tradicines A/V arba V/A tipo emulsines sistemas: įkapsuliavus kvapiąsias ar karčiąsias veikliąsias medžiagas vidinėje trinarės

emulsijos fazėje paslepiamas kvapas ir skonis, veikliosios medžiagos apsau-gomos nuo oksidacijos ir hidrolizės procesų. Nustatyta, kad daugianarės emulsinės sistemos bioprieinamumas yra didesnis nei dvinarių emulsijų, o lipofilinės ir hidrofilinės biologiškai aktyvios medžiagos gali būti įterpiamos į daugianarės emulsijos dispersinės fazės rutulėlius [18, 78, 87, 100, 194]. Kuriant įvairias farmacines formas V/A/V ar A/V/A tipo emulsijos gali būti naudojamos ir kaip pernašos sistema siekiant prailginto veikliųjų medžiagų atpalaidavimo ir kaip tarpinis produktas mikrosferų, neorganinių dalelių, lipidinių nanodalelių bei polimerosomų gamyboje, todėl šios sistemos tech-nologija yra aktuali [18, 100].

Dažniausiai daugianarės emulsijos gaminamos dviejų žingsnių emulga-vimo procesu (1.3.1 pav.). Gaminant V/A/V tipo emulsiją pirmas galutinio preparato stabilumą lemiantis etapas yra stabilios pirminės V/A emulsinės sistemos suformavimas. Vanduo, aliejus ir lipofilinė PAM homogenizuo-jama dideliu greičiu (> 4000 aps./min.). Siekiant pagaminti emulsiją su ma-žu emulsinių rutulėlių dydžiu gali būti taikoma homogenizacija naudojant slėgį ar ultragarsą [18, 58, 183, 194]. Antrajame etape į paruoštą pirminę V/A emulsiją pridedama išorinė dispersinė terpė – vandeninis hidrofilinės PAM tirpalas. Šio etapo kritinis žingsnis yra optimalaus homogenizacijos greičio parinkimas: per didelis maišymo greitis sąlygoja vidinės hidrofilinės fazės rutulėlių koalescenciją ar vidinės dispersinės fazės ir išorinės disper-sinės terpės koalescenciją t. y. sistemos suirimą ir pavirtimą dvinare emul-sija bei mažą įkapsuliavimo efektyvumą. Lėtas maišymo procesas įtakoja didelį lipofilinės fazės dalelių dispersiškumą [18, 87, 194]. Dėl temperatūros ir slėgio sąlygų kaitos antrosios emulgavimo fazės metu kinta emulsinių rutulėlių dydis [87]. Dviejų žingsnių daugianarės emulsijos gamybos pro-cesas yra brangus, ilgai trunka, sistemai suformuoti reikia bent dviejų skir-tingų emulsiklių.

1.3.1 pav. Dviejų žingsnių daugianarės V/A/V emulsijos gamybos procesas

Naujausi daugianarių emulsijų gamybai naudojami dviejų žingsnių me-todai yra membraninis emulgavimas ir emulsijos gamyba mikrokanalų pa-galba [18, 194]. Šių procesų metu pirminė koncentruota V/A emulsija slėgio pagalba yra stumiama per porėtą stiklo membraną arba mikrokanalus į dispersinę hidrofilinę terpę – formuojama daugianarė V/A/V tipo emulsija [18, 87, 88, 194]. Literatūros duomenimis šių metodų taikymas leidžia paga-minti homogeniškas daugianares emulsines sistemas, įkapsuliuojant dau-giau nei 90 proc. pirminės emulsijos. Šis gamybos procesas yra sudėtingas, reikalinga specializuota aparatūra [87].

Vieno žingsnio daugianarės emulsijos gamybos metodas vadinamas fazių inversija. Siekiant sukurti A/V/A tipo daugianarę emulsiją fazių inversijos būdu pirmiausia yra pagaminama V/A tipo dvinarė emulsija, turinti nedidelį kiekį hidrofilinio ir perteklių hidrofobinio emulsiklio su reikiamu HLB.

Emulsija šildoma ir prie tam tikros temperatūros įvyksta fazių inversija – gaunama V/A/V tipo emulsija [63]. Paprastesnis pastaruoju metu naudo-jamas vieno žingsnio V/A/V tipo emulsijos formavimo metodas yra hidro-filinės fazės su vandenyje tirpia PAM įvedimas į lipofilinę fazę turinčią PAM komplekso suformuotą plokštelinę struktūrą, kas lemia fazių inversiją be terminio proceso ir daugianarės emulsijos susiformavimą [74, 87]. Nors ši technologija paprasta, ji retai naudojama dėl mažo hidrofilinės fazės įkap-suliavimo efektyvumo, riboto proceso atsikartojamumo bei trumpalaikio emulsinės sistemos stabilumo [74, 137].

Daugianarės emulsijos yra gaminamos dviejų žingsnių arba vieno žings-nio (fazių inversija) gamybos metodais. Dviejų etapų gamybos metodu kontroliuojamas daugianarės emulsijos susiformavimo procesas, ko pase-koje galimas didelis veikliųjų medžiagų vidinėje dispersinėje fazėje įkapsu-liavimo efektyvumas, tačiau šių metodų taikymas apribotas dėl didelių laiko, energijos ir žaliavų sąnaudų. Vieno žingsnio metodas yra techno-logiškai paprastas, tačiau neefektyvus, siekiant pagaminti stabilią mono-dispersišką sistemą. Aktualu sukurti tiesioginį papildomų technologinių stadijų nereikalaujantį daugianarės emulsijos gamybos metodą, kurį būtų galima sėkmingai taikyti stabilių daugianarių sistemų kūrimui.

1.4. Augalinių ekstraktų įtaka emulsinių sistemų formavimuisi ir stabilumui

Augalinių ekstraktai ir jų veikliosios medžiagos įeina į puskiečių far-macinių formų sudėtį dėl antioksidacinių, priešuždegiminių, antibakterinių, žaizdų gijimą skatinančių savybių ir kitų žinomų biologinių poveikių. Lite-ratūroje yra paskelbti tyrimai vertinantys emulsijų su augaliniais ekstraktais

bei jų komponentais bioprieinamumą, antioksidacinį poveikį ir kt., tačiau jų poveikis puskietės sistemos technologiniams parametrams nagrinėtas mažai [29, 62, 68, 112, 138, 173, 191].

Augalinių ekstraktų emulsinę galią ir jų potencialą stabilizuoti emulsines sistemas imta tyrinėti tik XXI – ajame amžiuje. Noudeh ir bendraautoriai nustatė Cuminum cyminum L., Heracclum persicum Desf. ir Artemisia

dra-cunculus L. ekstraktų, kuriuose gausu saponinų, putų formavimo galimybes

bei emulgavimo indeksą: 50 mg/ml koncentracijos augalinių ekstraktų emulgavimo indeksas buvo 12, 15 ir 23 proc. (H. persicum < C. cyminum <

A. dracunculus) [142]. Reikšmingai didesnį putų sluoksnį lyginant su

kitomis tirtomis augalinėmis žaliavomis suformavo vaistinio kiečio ekstrak-tas [142]. Varka su bendraautoriais įvertino kvapiųjų rozmarinų ekstrakto emulsines savybes ir nustatė, kad 6 proc. rozmarinų ekstrakto emulsinėje sistemoje sumažina išsisluoksniavimo indeksą (II) nuo 20 iki 45 proc. (po 60 dienų, 25 ± 2 °C), o vidutinis emulsinių rutulėlių dydis sumažėja nuo 40 µm iki 30 µm lyginant su kontroline A/V tipo emulsija (p < 0,05) [195]. Literatūroje yra duomenų, kad 1 proc. etanolinio rozmarinų ekstrakto įterpto į dispersinę terpę sąlygoja emulsinės sistemos reologijos pokyčius: sistemos klampa reikšmingai sumažėja [161]. Vaistinių medetkų ekstraktas taip pat pasižymi emulsines sistemas stabilizuojančiu poveikiu: 4 proc. augalinio ekstrakto įterpto į dispersinę terpę sumažina emulsijos, laikytos 30 dienų kambario temperatūroje, II apie 35 proc., tačiau po 60 dienų emulsija išsisluoksniuoja [195]. Nustatyta, kad vandeniniai rozmarinų ir medetkų ekstraktai, esantys hidrofilinės (vandeninės) fazės sudėtyje, keičia tarpfazinę paviršiaus įtemptį tarp vandens ir alyvuogių aliejaus (17 mN/m): rozmarinų ekstrakto – alyvuogių aliejaus įtemptis 6 mN/m, o medetkų ekstrakto – alyvuogių aliejaus 5 mN/m [195].

Proteinų, polisacharidų bei jų kompleksų galimybę pakeisti sintetines paviršiui aktyvias medžiagas ir stabilizuoti emulsines sistemas literatūroje nagrinėtas mažai [14, 21, 123]. Nustatyta, kad polisacharidai gali ne tik padidinti emulsinės sistemos klampą ir pagerinti stabilumą dėl sumažėjusio emulsinių rutulėlių judrumo ir koalescencijos, bet ir paspartinti emulsinės sistemos išsisluoksniavimą dėl skatinamos flokuliacijos [97, 123]. D. J. McClements įrodė, kad pagrindiniai veiksniai, lemiantys minėtus procesus, yra polisacharido struktūra ir jo koncentracija produkte [123]. Diaz ir kiti įvertino sausojo linų sėklų ekstrakto, kuriame identifikuoti ir kiekybiškai įvertinti polisacharidai bei proteinai, kaip bioemulsiklio taikymą puskiečių farmacinių formų gamyboje. 4 proc. ekstrakto įterpto į emulsijos hidrofilinę fazę sąlygoja stabilios A/V tipo sistemos susiformavimą [24]. Kitų tyrėjų duomenimis linų sėklų ekstrakto emulsinė galia svyruoja nuo 300 iki 1000 m2_{/g, o emulsinės sistemos su linų sėklų ekstraktu stabilumas tarp}

80–100 proc. priklausomai augalo veislės [82]. Žinoma, kad avižų sėklų ekstraktas, kuriame yra β-gliukanų, taip pat pasižymi reologiją modifikuo-jančiomis savybėmis ir gali būti taikomas maisto produktų stabilizavimui [39, 40, 206]. Santipanichwong and Suphantharika nustatė, kad iš avižų išskirti β-gliukanai įterpti į emulsijos hidrofilinę fazę ne tik reikšmingai padidina sistemos klampą, bet ir 25 proc. sumažina emulsijos II po 2 mė-nesių laikymo kambario temperatūroje [176].

Literatūroje nurodoma, kad augaliniai ekstraktai gali pakeisti sintetinius konservantus puskiečių farmacinių formų ir odos priežiūros priemonių ga-myboje [131, 161]. 1 proc etanolinio rozmarinų ekstrakto ar greipfrutų minkštimo ir sėklų ekstrakto emulsinės sistemos sudėtyje ne tik praturtina ją antioksidantais, bet ir apsaugo nuo mikroorganizmų augimo ir vystymosi 3 mėnesius [161].

Augaliniai ekstraktai ir jų komponentai ne tik pasižymi biologiniu aktyvumu, bet ir gali būti naudojami kaip technologinę funkciją atliekantys ingredientai (klampos modifikatoriai, konservantai, paviršiui aktyvios me-džiagos) siekiant pakeisti ar sumažinti sintetinių ingredientų kiekį puskie-tėse farmacinėse formose.

1.4. Emulsinių sistemų kokybės vertinimas in vivo ir in vitro Svarbus puskiečių farmacinių formų kokybės vertinimo kriterijus yra efektyvus įkapsuliuotos veikliosios medžiagos atpalaidavimas [52]. Žino-ma, kad aktyviųjų junginių nešiklio kilmė, fiziko – cheminės savybės ir sudėtis turi reikšmingos įtakos vaistinės medžiagos atpalaidavimo greičiui, kinetikai bei bendram atpalaiduotos medžiagos kiekiui [149]. Veikliųjų medžiagų atpalaidavimo iš puskiečių formų testas literatūros duomenimis dažniausiai atliekamas skvarbos pro sintetinę pusiau pralaidžią membraną (in vitro) arba nepažeistą žmogaus ar gyvūno odą (ex vivo) metodu [52, 128, 210]. Remiantis šio tyrimo duomenimis, galima prognozuoti veikliosios medžiagos biologinį pasisavinimą in vivo [28, 211]. Mokslinėje literatūroje skelbta, kad puskiečių farmacinių formų ir jose įkapsuliuotų veikliųjų medžiagų tyrimas dializės pro pusiau pralaidžią sintetinę membraną metodu

in vitro gali būti klaidingai teigiamas dėl barjerinės viršutiniojo raginio odos

sluoksnio (stratum corneum) funkcijos nebuvimo [1].

Siekiant užtikrinti puskietės farmacinės formos naudojamos vietiškai, ant odos saugumą būtina įvertinti sukurto produkto dirginantį poveikį odai. Nuo 2013 m. ES šalyse narėse įsigaliojo sugriežtinta direktyva dėl kosmetikos gaminių bandymų su gyvūnais, todėl imta taikyti alternatyvius produktų toksiškumą ir efektyvumą in vitro vertinančius metodus [25].

3D rekonstruoto žmogaus epidermio modelių taikymas vertinant medžia-gų ar produktų toksiškumą yra inovatyvus ir patvirtintas metodas odos korozijos, sudirginimo ir fototoksinio poveikio nustatymui [1, 99]. Lite-ratūros duomenimis modifikuoti modeliai gali būti taikomi ir puskietės vaisto formos bioprieinamumo, žaizdų gijimą skatinančio poveikio, odos drėkinimo ir senėjimo vertinimui [99, 167]. Faller su bendraautoriais ištyrė, kad rekonstruoto žmogaus epidermio modeliai yra tikslesni vertinant odos priežiūrai skirtų gaminių dirginantį poveikį, nes odos sudirginimas kitaip nei in vivo metodais gali būti kiekybiškai įvertintas [49]. Martin ir kiti naudodami 3D modelius nustatė, kad rozmarinų ekstraktas inhibuoja ultra-violetinės spinduliuotės indukuotą metaloproteinazę-1 ir pasižymi fotopro-tekciniu poveikiu [118]. Apie augalinių ekstraktų ir jų veikliųjų junginių sudirginantį, uždegimą sukeliantį ir fototoksinį poveikį odos ląstelėms lite-ratūroje skelbta mažai, o duomenų apie puskiečių farmacinių formų, kurių sudėtyje yra augaliniai ekstraktai, įtaką rekonstruoto žmogaus epidermio ląstelėms rasti nepavyko.

Pagamintos puskietės farmacinės formos ar kosmetikos gaminio poveikio vertinimas žmogaus odai in vivo yra būtinas siekiant užtikrinti produkto saugumą ir efektyvumą. Remiantis literatūros duomenimis, ant odos nau-dojamų produktų poveikis drėgmei, transepiderminio vandens netekimui, lipidų kiekiui, pigmentacijai ir porų dydžiui dažniausiai vertinamas nein-vaziniais metodais [76, 111]. Armendariz-Barragan su bendraautoriais tei-gia, kad prailginto atpalaidavimo augalinių žaliavų ekstraktus įkapsuliuo-jančios nešiklių sistemos tokios kaip daugianarės emulsijos ar nano dalelės tinkamesnės augalinių žaliavų ekstraktų poveikiui in vivo išsaugoti ir jų bioprieinamumui pagerinti nei dvinarės A/V ar V/A tipo emulsijos [9]. Rasul ir Ahtar nustatė, kad antioksidaciniu poveikiu pasižymintys lūpa-žiedžių šeimos augalų ekstraktai esantys emulsinės sistemos hidrofilinės fazės sudėtyje reikšmingai sumažina transepiderminio vandens netektį po 2 savaičių preparato naudojimo [166]. Žinoma, kad oligo- ir polisacharidai indukuoja fibroblastų proliferaciją ir apsaugo jas nuo askorbo druskų sukelto citotoksinio poveikio taip slopindami odos senėjimo procesą, tačiau linų sėklų ekstrakto teigiamas poveikis odos drėgmei, lipidų kiekiui ar pigmentacijai in vivo nėra įrodytas [160]. Remiantis mokslinėje literatūroje skelbtų tyrimų duomenimis žmogaus odoje drėgmės gali būti nuo 15 iki 54 proc. [105, 200]. Ilnytska ir kiti nustatė, kad avižų sėklų ekstraktas reikšmingai įtakoja odos drėgmę ir barjerinę funkciją: po 21 dienos odos drėgmė padidėjo 3 kartus [127].

Emulsinės sistemos tipas ir sudėtis reikšmingai įtakoja veikliųjų medžia-gų skvarbą bei kinetiką in vivo ir in vitro. Siekiant prognozuoti aktyviųjų medžiagų bioprieinamumą į žmogaus odą in vivo ir gauti patikimus junginių

atpalaidavimo iš emulsinio puskiečio pagrindo ir jų toksiškumo rezultatus, verta rinktis modernias tyrimo metodikas – veikliųjų junginių biopriei-namumą į žmogaus odą ex vivo ir/arba rekonstruoto žmogaus epidermio modelius. Įvairūs augalų ekstraktai ir puskiečių farmacinių formų, į kuriuos jie įterpti, fiziko – cheminės savybės sąlygoja skirtingą poveikį žmogaus odos charakteristikoms, todėl aktualu ištirti inovatyvios emulsinės sistemos, suformuotos natūralių ingredientų pagrindu, įtaką žmogaus odos drėgmei, lipidų kiekiui ir pigmentacijai in vivo.

2. TYRIMO OBJEKTAS IR METODAI

Dvinarės ir daugianarės emulsijos.

2.2. Reagentai ir medžiagos bei aparatūra ir įrengimai

Išgrynintas vanduo, paruoštas naudojant Millipore (JAV) vandens dis-tiliavimo sistemą, bevandenis natrio karbonatas ir Folin – Ciocalteu rea-gentas (Fluka Chemie GmbH, Vokietija), rozmarinų rūgštis (> 98 proc.) (ChromaDex, JAV), oleanolo rūgštis (> 97 proc.) ir ursolo rūgštis (> 98 proc.) (Sigma – Aldrich Chemie GmbH, Vokietija), 96, 3 proc. etanolis (Stumbras, Lietuva), 6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilchroman-2-karboksi rūgš-tis (troloksas) (Sigma – Aldrich Chemie GmbH, Vokietija), 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilas (Sigma – Aldrich Chemie GmbH, Vokietija), rozmarinų rūgštis (> 97 proc.) ir ursolo rūgštis (> 90 proc.) (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Vokietija), acto rūgštis (Sigma – Aldrich Chemie GmbH, Vokietija), metanolis (Carl Roth GmbH, Vokietija), džiovinti kvapiųjų rozmarinų lapai (UAB „Širdažolė“, Lietuva), polisorbatas 20 (Sigma – Aldrich Chemie GmbH, Vokietija), alyvuogių aliejus (la Bella, Italija), skystasis parafinas (BrenntagLT, Lietuva), reologijos modifikatorius ViscOptima SE (Croda Nordica, Švedija), maišyklė RZR2020 (Heidolph, Vokietija), linų sėklos (UAB „Herba Humana“, Lietuva), avižų sėklos (UAB „Skanėja“, Lietuva), svarstyklės KERN 440 – 47 (KERN & Sohn GmbH, Vokietija), analitinės svarstyklės KERN 870 – 13 (KERN & Sohn GmbH, Vokietija), ultragarso vonelė Sonorex Digitec DT 156 (Bandelin, Vokietija), rotacinis garintuvas Heidolf Laborata 400 efficient (Heidolph Instruments GmbH, Vokietija), vandens vonelė WNB7 (Memmert GmbH, Vokietija), efektyviosios skysčių chromatografijos sistema Waters 2695 (Waters, JAV), diodų matricos de-tektorius Waters 996 (Waters, JAV), kolonėlė ACE 5 C18 250 × 4,6 mm (Advanced chromatography technologies, Škotija), pH reikšmės matuoklis InoLab pH/ION 7320 (WTW GmbH, Vokietija), klampomatis P –Selectra ST – 2010 (JP Selectra, Ispanija), optinis mikroskopas BMS 739960 (Breukhoven, Olandija), konduktometras MC226 (Mettler Toledo, JAV), tekstūros analizatorius TA.Xtplus (Stable Micro Systems, Austrija), ten-siometras Attention Sigma 702 (Biolin Scientific, Švedija), elektroninės svarstyklės HF – 200GD (A&D Engineering, JAV), UV-vis spektrofoto-metras Spectronic Genesys 2 (Thermo Scientific, JAV),

2.3. Augalų ekstraktų gamyba 2.3.1. Kvapiųjų rozmarinų lapų ekstrakcijos metodai

1. Maceracija. Džiovinti smulkinti (≤ 1 mm) kvapiųjų rozmarinų lapai (5,0 g) buvo maceruojami 25 ml etanoliu (90 proc.) 48 val. kambario temperatūroje (25 ± 2 °C). Ekstraktai filtruojami 0,2 µm membraninį filtrą ESC analizei.

2. Perkoliacija. 90 proc. etanolis naudojamas ekstrakcijai atlikti. Perko-liacija atliekama 48 val. kambario temperatūroje (25 ± 2 °C). Džiovinta augalinė žaliava buvo sudrėkinta ekstrakcijos tirpikliu (žaliavos ir tir-piklio santykis 1:1) ir brinkinama 4 val. Augalinė žaliava perkeliama į perkoliatorių, užpilama tirpikliu ir maceruojama 48 val. Surenkama 85 proc. pirminio koncentruoto ekstrakto. Ekstrakcija tęsiama iki vi-siško veikliųjų junginių išgavimo. Antroji pagamintos ištraukos dalis sukoncentruojama iki reikiamo tūrio naudojant rotacinį garintuvą Heidolph Laborata 4000 efficient (Heidolph Instruments GmbH & Co. KG, Vokietija). Abu pagaminti ekstraktai sumaišomi ir filtruojami nau-dojant 0,2 µm membraninį filtrą ESC analizei.

3. Ultragarsinė ekstrakcija. Ekstrakcija atliekama ultragarsinėje vonelėje Bandelin electronic GmbH & Co.KG, Berlin, Vokietija) su skaitme-niniu temperatūros valdikliu/indikatoriumi, kurios tūris apie 6 L, o ultragarso galia 200 W. 1,0 g džiovintos smulkintos augalinės žaliavos užpilama 5–20 ml ekstrahento ir patalpinama į ultragarsinę vonelę nustačius ekstrakcijos temperatūrą ir ekstrahavimo trukmę. Ekstraktas filtruojamas naudojant 0,2 µm membraninį filtrą ESC analizei.

4. Dvifazė ekstrakcija. Ekstrakcija atlikta vandens vonelėje Memmert WNB7 (Memmert GmbH & Co. KG, Vokietija). 1,0 g smulkintos (≤ 1 mm) džiovintos augalinės žaliavos užpilama 15 ml išgryninto van-dens ar vanvan-dens/paviršiui aktyvios medžiagos mišiniu. Vanvan-dens/PAM mišiniui pagaminti naudotos PAM koncentracija buvo 7 proc. Ekstrak-cija vykdoma 90, 180 ir 300 min. Ekstraktas filtruojamas naudojant 0,2 µm membraninį filtrą ESC analizei.

2.3.2. Sėjamųjų avižų sėklų ekstrakcija

Gaminant didelės klampos avižų ekstraktą buvo naudota magnetinė maišyklė (MSH-20A, witeg Labotechnik GmbH, Vokietija). Avižų sėklos buvo ekstrahuojamos 250 ml kolboje 1 val. 98 ± 2 °C temperatūroje. Žalia-vos ir tirpiklio santykis buvo 1:20, ekstrakcijos tirpiklis buvo išgrynintas

vanduo. Karštas ekstraktas filtruojamas per 4 sluoksnių marlę ir vėsinamas kambario temperatūroje.

2.3.3. Sėjamųjų linų sėklų ekstrakcija

Linų sėklų ekstrakcija atlikta 98 ± 2 °C temperatūroje. 5,0 g linų sėklų ekstrahuojama su 100 ml išgryninto vandens 250 ml kolboje. Augalinė žaliava ekstrahuojama mechaninėje maišyklėje (MSH-20A, witeg Labotech-nik GmbH, Vokietija). Karštas ekstraktas nufiltruojamos per ketursluoksnę marlę ir atvėsinamos kambario temperatūroje [55].

2.4. Veikliųjų medžiagų nustatymas tiriamuosiuose mėginiuose 2.4.1. Rozmarinų rūgšties nustatymas kvapiųjų rozmarinų lapų ekstrakte

ESC analizė atlikta Waters 2695 chromatografijos sistema (Waters, Mil-ford, JAV), su Waters 996 diodų matricos detektoriumi. Duomenų analizė atlikta Empower2 sistema (Waters Corporation, Milford, JAV).

Rozmarinų rūgšties kokybiniam ir kiekybiniam nustatymui naudota ACE 5 C18 250 × 4,6 mm (Advanced Chromatography Technologies, Aberdeen, Škotija) kolonėlė. Tirpiklių sistemą sudarė metanolis (tirpiklis A) ir 0,5 proc. vandeninis acto rūgšties tirpalas (tirpiklis B). Taikyta linijinė eliucija: 95 proc. A / 5 proc. B 0 min., 40 proc. A / 60 proc. B 40 min., 10 proc. A / 90 proc. B 41–55 min., 95 proc. A / 5 proc. B 56 min. Mobilios fazės tėkmės greitis – 1 ml/min., o injekcijos tūris 10 µl. Absorbcija matuojama kai λ = 329 nm. Kiekybinė analizė atlikta pagal išorinio standarto metodą naudojant kalibracinę kreivę (R2 _{= 0,999918), RR kiekis apskaičiuotas}

pagal smailių plotus [17].

2.4.2. Oleanolo (OR) ir ursolo (UR) rūgščių nustatymas kvapiųjų rozmarinų lapų ekstrakte

Triterpeninių rūgščių atskyrimui naudota ACE 5 C18 250 × 4,6 mm (Advanced Chromatography Technologies, Aberdeen, Škotija) kolonėlė. Mobilioji fazė sudaryta iš metanolio ir vandens santykiu 90:10. Mobilios fazės tėkmės greitis 0,6 ml/min., injekcijos tūris 10 µl. Absorbcija matuo-jama kai λ = 203 nm. Kiekybinė analizė atlikta pagal išorinio standarto me-todą naudojant kalibracinę kreivę (OR R2 = 0,999383, UR R2 = 0,998872), rūgščių kiekis apskaičiuotas pagal smailių plotus [17].

2.4.3. β-gliukanų nustatymas avižų sėklose ir avižų sėklų ekstrakte β-d-gliukanų kiekis nustatytas spektrofotometriškai naudojant mišrių jungčių β-gliukanų analizės rinkiniu (Megazyme, Airija) vadovaujantis McCleary and Codd metodika [122]. Pavyzdžiai buvo sudrėkinami ir su-spenduojami natrio fosfato buferyje (pH 6,5), inkubuojami su linchenazės fermentu ir nufiltruotas tirpalas reagavo su β-gliukozidazės fermentu. Gliu-kozės produktai buvo nustatyti naudojant oksidazės/peroksidazės reagentą. Absorbcija matuojama kai λ = 510 nm.

2.4.4. Monosacharidų nustatymas linų sėklų ekstrakte

Mėginių paruošimas ir hidrolizė buvo atlikta vadovaujantis modifikuota Th. H. Emaga ir kitų metodika [47]. 50 mg linų sėklų ekstrakto ir avižų sėklų ekstrakto buvo hidrolizuojama 2M H2SO4 (2,5 ml) esant 80 °C

tem-peratūrai 2 val. Po hidrolizės tirpalai buvo neutralizuojami su BaCO3 iki

pH 7 [47]. BaSO4 druskos nuosėdos buvo pašalinamos dekantuojant po

centrifugavimo 3000 aps./min. 10 min. Gautas tirpalas filtruojamas ir džio-vinamas 50 °C temperatūroje esant 200 mbar slėgiui vakuuminėje džiovyk-loje VO200 (Memmert, GmbH & Co. KG, Vokietija). Gauti sirupai ištir-pinami išgrynintame vandenyje.

Kiekybinė ir kokybinė monosacharidų analizė buvo atlikta naudojant plonasluoksnės chromatografijos sistemą CAMAG (Muttenz, Šveicarija). Eksperimentas atliktas su silikagelio 60 F25 plokštelėmis, 10 × 10 cm (Merk Millipore, JAV). L-ramnozė, l-(+)-arabinozė, galaktozė, d-(+)-ksilozė and d-(+)-galaktūroninė rūgštis buvo ištirpintos išgrynintame van-denyje. Ant plokštelės užnešta 10 µg standartinių tirpalų ir 5 µg tiriamųjų mėginių tirpalų. Tirpiklių sistemą sudarė n-propanolio, išgryninto vandens, trimetilamino ir 25 proc. amoniako tirpalo santykiu 80:20:0,2:4. Polisacha-ridai aptikti chromatografines plokšteles apipurškus 6,5 mM N-1-(-1-naftil) etilenediamino dihidrochlorido tirpalu metanolyje ir plokštelę kaitinant 10–15 min. 100 °C temperatūroje [41]. Skaičiavimai atlikti su TLC Visuali-zer (CAMAG, Muttenz, Šveicarija) pagal kalibracines kreives ir smailių plotus.

2.5. Dvinarių ir daugianarių emulsijų gamyba

1. Pirminės A/V emulsijos gamyba. 13-kos mėginių eksperimentinis pla-nas buvo sugeneruotas naudojant 2 kintamųjų mišinio dizainą pagal Design-Expert 9.0 (Stat-Ease Inc., JAV) matematinės statistikos prog-ramą. Kintamieji buvo emulsiklio Viscoptima SE (0,5–2,0 proc.) ir išgryninto vandens (78–79,5 proc.) koncentracija, lipofilinės fazės (aly-vuogių aliejus/skystasis parafinas) koncentracija buvo konstanta ir nekito viso eksperimento metu (20 proc.) [32]. Emulsiklis buvo įter-piamas į lipofilinę fazę, tada lipofilinė ir hidrofilinė fazės buvo maišo-mos 800 aps./min. greičiu 10 min. naudojant mechaninę maišyklę Hei-dolph RZR 2020 (HeiHei-dolph Instruments GmbH, Vokietija).

2. Emulsijos su rozmarinų lapų ekstraktu ir rozmarinų, ursolo ir oleanolo

rūgščių tirpalais gamyba. Rozmarinų, ursolo ir oleanolo rūgščių tirpalai

buvo pagaminti grynas rūgštis tirpinant etanolyje (90 proc.) Paruošti tirpalai buvo tokios pačios koncentracijos kaip ESC identifikuoti veik-lieji junginiai etanoliniame kvapiųjų rozmarinų lapų ekstrakte.

Emulsijos su rozmarinų lapų ekstraktu ir jo veikliųjų junginių tirpalais buvo pagamintos tomis pačiomis sąlygomis kaip pirminės A/V tipo emulsijos. Tiriamieji tirpalai ir rozmarinų lapų ekstraktas buvo sumai-šomi su išgrynintu vandeniu. Emulsijos sudėtis buvo: Viscoptima SE 0,5 proc., dispersinė fazė 20,0 proc., rozmarinų lapų ekstrakto ar jo sudėtyje esančių UR, OR, RR tirpalų 10,0 proc. ir išgrynintas vanduo iki 100 proc. [32].

3. Emulsijos su rozmarinų lapų ekstraktu, avižų ir linų sėklų ekstraktais

gamyba. Eksperimentinis planas (41 mėginys) buvo sugeneruotas

nau-dojant sudėties paiešką Design-Expert 9.0 (Stat-Ease Inc., JAV) ma-tematinės statistikos programa. Pasirinkti 4 kintamieji: išgrynintas vanduo, etanolinis rozmarinų lapų ekstraktas, linų sėklų ekstraktas ir avižų sėklų ekstraktas, kurių koncentracija galutiniame produkte turi būti 79,5 proc. Alyvuogių aliejaus (20 proc.) ir emulsiklio Viscoptima SE (0,5 proc.) koncentracija nekito viso eksperimento metu [34]. Kinta-mųjų reikšmingumas įvertintas, atlikta skaitinė optimizacija. Emulsijos buvo gaminamos maišant lipofilinę fazę (alyvuogių aliejus, emulsiklis) ir hidrofilinę fazę (išgrynintas vanduo ir/ar avižų sėklų ekstraktas ir/ar rozmarinų lapų ekstraktas ir/ar linų sėklų ekstraktas) mechanine mai-šykle IKA Eurostar 200 digital (IKA-Werke, GmbH & Co, Vokietija) 800 aps/min greičiu 10 min.

4. Technologinių parametrų įtakos eksperimentinės sudėties daugianarei

emulsinei sistemai vertinimas. 25 eksperimentai buvo atlikti pagal

pa-viršiaus atsako dizainą suplanuotą Design-Expert 9.0 (Stat-Ease Inc., 30

JAV) matematinės statistikos programos. Pasirinkti 3 kintamieji: mai-šymo trukmė, maimai-šymo trukmė (2) ir maimai-šymo greitis. Kintamųjų intervalai pasirinkti vadovaujantis pilotine studija. Įvertintas kintamųjų reikšmingumas, jų sąveika, atlikta skaitinė optimizacija.

Daugianarės emulsinės sistemos lipofilinė ir hidrofilinė fazė sumaišo-mos (2.5.1 lentelė). Maišymas atliekamas mechanine maišykle IKA Eurostar 200 digital (IKA-Werke, GmbH & Co, Vokietija). Du maišy-mo etapai taikyti daugianarės emulsijos gamybai siekiant išsiaiškinti ar maišymo greičio pokytis reikšmingai įtakoja emulsinės sistemos koky-bę [33]. Pirmame etape emulsija maišoma skirtingu greičiu (600–1000 aps./min.) ir trukme (5–15 min.). Antrajame maišymo etape maišymo greitis buvo nekintantis (1000 aps./min.), kito tik maišymo trukmė (5– 10 min.).

2.5.1 lentelė. Eksperimentinės daugianarės emulsijos sudėtis

Lipofilinė fazė Hidrofilinė fazė

Ingredientas Konc. (proc.) Ingredientas Konc. (proc.)

Alyvuogių aliejus 20,0 Išgrynintas vanduo 3,79 Emulsiklis

(Viscoptima SE) 0,5 Etanolinis rozmarinų lapų ekstraktas _{Linų sėklų ekstraktas 24,18} 7,5 Avižų sėklų ekstraktas 44,03

2.6. Emulsinių sistemų ir jų gamybai naudotų žaliavų fizikinių savybių tyrimas

1. Emulsinių sistemų pH reikšmės nustatymas. Pagamintas 5,0 proc. van-deninis emulsinės sistemos tirpalas buvo filtruojamas per 20–25 µm porų dydžio popieriaus filtrą (DP 411, Albet – Hahnemuhle, Ispanija). Tiriamųjų mėginių pH reikšmė nustatyta InoLab pH/ION 7320 (WTW GmbH, Vokietija) matuokliu. Atlikti 5 matavimai, skaičiuojamas vi-durkis ir standartinis nuokrypis.

2. Emulsinių sistemų dinaminės klampos nustatymas. Tiriamųjų mėginių klampa nustatoma rotaciniais viskozimetrais Selectra 2010 (JP Selectra, Ispanija) 50 aps./min., 100 aps./min. ir 200 aps./min. greičiu naudojant R7 suklį ir Alpha series (Fungilab, Ispanija) 100 aps./min. greičiu nau-dojant L4 suklį. Rodmuo buvo užfiksuotas po 10 sekundžių.

3. Emulsinių sistemų tekstūros analizė. Tekstūros analizė atliekama nau-dojant tekstūros analizatorių TA.Xtplus (Stable Micro Systems, Aus-trija), tepumo testą. Tiriamieji pavyzdžiai patalpinami į tepumo testui naudojamus vienodo tūrio stiklinius indus, kurie pritvirtinami prie