LIETUVOS SVEIKATOS MOKSL UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
AIST KAZAKAUSKIEN
BAKTERIOCINUS PRODUKUOJANČI PIENO R GŠTIES BAKTERIJ TAKA GR D SAUGOS RODIKLIAMS
THE INFLUENCE OF BACTERIOCINS PRODUCING LACTIC ACID BACTERIA ON CEREAL SAFETY PARAMETERS
Veterinarinės maisto saugos ištestinių studijų MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovė: prof. dr. E. Bartkienė
KAUNAS, 2016
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUM
Patvirtinu, kad teikiamas magistro baigiamasis darbas „Bakteriocinus produkuojančių pieno rūgšties bakterijų taka grūdų saugos rodikliamsį
1. Yra atliktas mano pačios:
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje:
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu vis panaudotos literatūros s raš . Aistė Kazakauskienė
(data) (autoriuas vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ
LIETUVI KALBOS TAISYKLINGUM ATLIKTAME DARBE Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingum atliktame darbe.
Aistė Kazakauskienė
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADOS D L DARBO GYNIMO
...
...
...
Prof. dr. Elena Bartkienė
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
APROBUOTAS MAISTO SAUGOS IR KOKYB S KATEDROJE
(aprobacijos data) (katedros vedėjo vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamasis darbas yra dėtas ETD IS
(gynimo komisijos sekretorės parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentas
(vardas, pavardė) (parašas)
TURINYS
SANTRAUKA ...6
VADAS ...8
1. LITERAT ROS APŽVALGA ...10
1.1. Mikotoksinai ...10
1.1.1. Deoksivalenolis ...11
1.1.2. Zearalenonas ...11
1.1.3. Mikotoksinų paplitimas ...12
1.1.4. Mikotoksinų kontrolė ir prevencijos priemonės ...13
1.1.5. Mikotoksikozės platinamos per maist ...15
1.2. Pieno rūgšties bakterijų panaudojimas mikotoksinų mažinimui ...15
2. DARBO METODIKA ...16
2.1. Pagrindinės tyrimų kryptys ir jų pagrindimas ...16
2.2. Tyrimų objektai ir metodai ...17
2.2.1. Tyrimui naudotos žaliavos ...17
2.2.2. Grūdų kokybės rodiklių tyrimų metodai ...17
2.2.3. Grūdų saugos rodiklių tyrimo metodai ...18
2.2.4. Pagausintų PRB rūgštingumo rodiklių tyrimas (pH ir BTR) ...19
2.2.5. Grūdų mėginių apdorojimas PRB ...20
2.2.6. Grūdų mikrobiologinių rodiklių tyrimas ...20
2.3. Statistinis duomenų vertinimas ...20
3. TYRIMO REZULTATAI ...21
3.1. Grūdų kokybės rodiklių tyrimų rezultatai ...21
3.2. Mikotoksinų kiekis grūduose prieš apdorojim ...24
3.3. Pagausintų PRB rūgštingumo rodikliai (pH ir BTR) ...25
3.4. Grūdų mėginių, apdorotų PRB daigumo rezultatai ...26
3.5. Grūdų mikrobiologiniai rodikliai prieš ir po apdorojimo PRB ...27
3.6. Mikotoksinų (DON, ZEA) kiekis grūduose po apdorojimo PRB ...33
4. REZULTAT APTARIMAS ...35
IŠVADOS ...37
LITERAT ROS S RAŠAS ...38
PRIEDAI ...41
SANTRUMPOS
PRB – pieno rūgšties bakterijos.
L. sakei – Lactobacillus sakei.
P. pentosaceus – Pediococcus pentosaceus.
P. acidilactici – Pediococcus acidilactici.
FAO – Jungtinių Tautų maisto ir žemės ūkio organizacija.
EFSA – Europos maisto saugos tarnyba.
DON – Deoksivalenolis.
ZEA – Zearalenonas.
IPCC – Tarpvyriausybinės klimato kaitos komisija.
SANTRAUKA
„Bakteriocinus produkuojančių pieno rūgšties bakterijų taka grūdų saugos rodikliamsį
Darbas parengtas Maisto saugos ir kokybės katedroje, Lietuvos sveikatos mokslų universitete, Veterinarjos akademijoje.
Darbo vadovas: prof. dr. Elena Bartkienė.
Darbo apimtis: 39 puslapiai, 1 lentelė, 30 paveikslų, 4 priedai, 28 literatūros šaltiniai.
Darbo tikslas: vertinti pasirinktų skirtingų rūšių varpinių javų grūdų mėginių kokybės ir saugos rodiklius bei nustatyti bakteriocinus produkuojančių mikroorganizmų tak tiriamų grudų saugos rodikliams.
Šiuo tikslu atliktas skirtingų rūšių varpinių javų grūdų mėginių kokybės ir saugos rodiklių vertinimas. Sekančiame eksperimento etape grūdai buvo apdoroti PRB ir nustatyta apdorojimo taka grūdų daigumui (parenkant optimalų apdorojimo laik ) bei bio- taršai ir mikotoksinų kiekiui.
PRB mažina varpinių javų grūdų biologinę tarš (bendras aerobinių mikroorganizmų kiekis, bendras mielinių ir pelėsinių grybų kiekis grūdų mėginiuose sumažėjo) ir mikotoksinų kiek (deoksivalenolio ir zearalenono kiek ). Apibendrinant galima teigti, kad pagausintos PRB gali būti naudojamos kaip alternatyvus beicas, mažinant bio- tarš ir mikotoksinų kiek varpinių javų grūduose.
Raktažodžiai: grūdai, Lactobacillus sakei, Pediococcus acidilactici, Pediococcus pentosaceus.
SUMMARY
The influence of bacteriocins producing lactic acid bacteria on cereal safety parameters
The work was prepared in the Department of Food Safety and Quality, Faculty of Veterinary, Lithuanian University of Health Sciences.
Academic Supervisor: Prof. Dr. Elena Bartkienė.
Scope of the work: 39 pages, 1 table, 30 pictures, 4 annexes, 28 sources of literature.
The aim of the work was to analyse quality parameters of different varieties of cereal, and to evaluate the influence of bacteriocin-producing microorganisms on cereals safety parameters.
For this purpose, the assessment of quality and safety parameters in samples of different varieties of cereal was carried out. At the next step of the experiment, cereals have been treated with lactic acid bacteria and the impact of treatment on cereal germination (in selecting the optimum time of treatment) as well as on bio-pollution and the levels of mycotoxins was evaluated.
Lactic acid bacteria reduced biological pollution of cereals (the total number of aerobic micro- organisms, total counts of fungi and moulds) and the concentration of mycotoxins (deoxinivalenol and zearalenone). We conclude, that treatment with lactic acid bacteria could be used as an alternative cereals dressing for bio- pollution and of mycotoxins reducing in cereals.
Key words: cereals, Lactobacillus sakei, Pediococcus acidilactici, Pediococcus pentosaceus.
VADAS
Javai – svarbiausias maistinis augalas, turintis daug žmogaus organizmui reikalingų baltymų, angliavandenių, vitaminų ir kt. medžiagų. Iš grūdų kepama duona, konditerijos gaminiai, jie yra pašaras gyvuliams. Javų ūkis – svarbi žemdirbystės šaka. Javų pasėliai užima daugiau nei 50 proc.
viso pasaulio ariamų žemės plotų. Yra daugybė javų rūšių, svarbiausios jų – kviečiai, rugiai, avižos, miežiai, soros, kukurūzai ir ryžiai. Populiariausi iš jų yra kviečiai, ryžiai ir kukurūzai. Šioms kultūroms tenka daugiau kaip 80 proc. visos pasaulio grūdų gamybos. Europoje, Š. Amerikoje daugiausiai auginami kviečiai, rugiai, avižos ir kukurūzai. Čia jų išauginama 90 proc. viso pasaulio derliaus. Azijoje užauginama 90 proc. viso pasaulio ryžių, Afrikoje – daugiausia sorų [1].
Kviečių grūdai yra antra pagal populiarum žaliava maisto pramonėje, o šių grūdų pasėlių plotai ketvirti, su jais vartotojai gauna apie 55 proc. angliavandenių ir 20 proc. visos paros raciono kalorijų [2].
Žemės ūkis dvidešimt pirmajame amžiuje susiduria su iššūkiu kaip patenkinti augančius vartotojų poreikius. Iššūkis tampa dar sudėtingesnis dėl klimato kaitos, turinčios takos pasėlių kenkėjų pasiskirstymui ir jų protrūkiams [3].
Šiuo metu ypač aktualia tampa klimato kaitos problema, kuri siejama ir su maistui skirtų grūdų sauga mikotoksinų aspektu [4].
Klimato kaita turi takos ir mikotoksinų koncenracijai grūduose. Mikotoksinus produkuojantiems grybams susidaro palankios s lygos. Mikotoksinų didesnis kiekis grūduose nustatomas regionuose, kuriuose šiuo metu klimatas yra šaltesnis, nei prastai [5].
Šiuo metu identifikuota ir žinoma daugiau nei 300 potencialių mikotoksinų, kurie gali užteršti maist ir pašarus ir sukelti neigiam poveik žmonėms ir gyvūnams [6].
Mikotoksinai yra stabilūs daugeliui perdirbimo procesų, todėl gali užteršti jau perdirbtus maisto produktus. Mikotoksinai, kurie dažniausiai aptinkami maistiniuose grūduose yra aflatoksinai, ochratoksinai A, fumonizinai, deoksinivalenolis ir zearalenonas [7].
Šiuo metu daugiau nei 100 šalių reglamentuoja labiausiai toksiškų ir labiausiai paplitusių mikotoksinų didžiausi leistin kiek maiste [8].
Siekiant mažinti mikotoksinų kiek grūduose, turi būti taikomos prevencinės priemonės ir pradedama nuo sėklinių grūdų kokybės užtikrinimo. Sėklinių grūdų saugai užtikrinti taikomos cheminės priemonės – beicai. Kaip alternatyva beicavimui, javų sėklai apdoroti naudojami ir biologiniai produktai, kurių veikimo mechanizmas paremtas antimikrobinėmis ar toksinius junginius degraduojančiomis mikroorganizmų savybėmis. Pieno rūgšties bakterijos (PRB) yra daugelyje maisto produktų ar žaliavų natūraliai paplitę mikroorganizmai, kurie gerai žinomi ir naudojami dėl savo bioapsauginių savybių, kurios pasireiškia PRB produkuojant antimikrobinius
junginius, pavyzdžiui, pieno rūgšt , peroksid , bakteriocinus ir kt. PRB antigrybinis poveikis yra mažiau ištirtas, tačiau manoma, kad jos gali slopinti kai kurių grybų augim [9].
Atsakingai vykdoma biologinė kontrolė turėtų padėti gerinti produktų saug ir kontroliuoti maisto tarš bei saug [10].
Darbo tikslas: vertinti pasirinktų skirtingų rūšių varpinių javų grūdų mėginių kokybės ir saugos rodiklius bei nustatyti bakteriocinus produkuojančių mikroorganizmų tak tiriamų grudų saugos rodikliams.
Darbo uždaviniai:
1. vertinti pasirinktų skirtingų rūšių varpinių javų grūdų mėginių kokybės rodiklius ir mikotoksinų kiek juose.
2. Panaudoti bakteriocinus produkuojančius mikroorganizmus kaip alternatyvų beic skirtingų grūdų biologinės taršos mažinimui, parenkant apdorojimui optimaliausi laiko interval ir palyginti grūdų daigumo kokybę.
3. vertinti alternatyvaus beico tak mikotoksinų kiekiui skirtinguose grūduose.
4. Gautų rezultatų palyginamasis vertinimas.
1. LITERAT ROS APŽVALGA 1.1. Mikotoksinai
Terminas mikotoksinas yra kilęs iš graikų kalbos žodžių mykes – grybas ir toxikon – nuodai.
Terminas „mikotoksinaiį apibrėžia antrinius grybelių metabolitus, kurie sukelia biocheminius, fiziologinius ir/arba patologinius pokyčius kitos rūšies organizmams, skaitant stuburinius, kitas gyvūnų grupes, augalus ir kitus mikrobus. Mikotoksinai yra mažos molekulinės masės junginiai (MW <700) ir net mažos jų koncentracijos yra toksiškos. Nors šimtai junginių buvo klasifikuojami kaip mikotoksinai ir buvo išskirti bei chemiškai apibūdinti, apytiksliai tik 50 buvo išnagrinėti išsamiai. Cheminiu požiūriu, mikotoksinai yra skirstomi polipeptidinius, terpenų, ir azoto metabolitus, priklausomai nuo jų biologinės kilmės ir struktūros. Mikotoksinus gamina trys pagrindinės mikroskopinių grybų gentys: Aspergillus, Penicillium ir Fusarium, taip pat mikotoksinai gali būti produkuojami genčių Claviceps, Alternaria ir Helminthosporium. Žmonės ir gyvūnai mikotoksinais gali būti veikiami per od , or ar oraliniu būdu. Mikotoksinai maisto grandinę dažniausiai patenka per užteršt maist ir pašarus, daugiausiai per užterštus grūdus, 1 paveiksle pateikta mikotoksinų maist patekimo grandinė bei jų sukeliami pavojai.
1 pav. Mikotoksinų į maistą patekimo grandinė
FAO (Jungtinių Tautų maisto ir žemės ūkio organizacija) vertino, kad apie 25 proc. grūdų užaugintų pasaulyje yra užteršti mikotoksinais, galbūt šis kiekis būtų apie 50 proc., jei būtų atsižvelgta naujus mikotoksinus, apie kuriuos iki šiol duomenų nėra daug ir jie plačiai nenagrinėjami. Pasak EFSA (Europos maisto saugos tarnybos) ir FAO, dažniausiai maiste apinkami
mikotoksinai, arba jų grupės yra aflatoksinai (B1, B2, G1, G2), ochratoksinai (A, B, C, D), patulinas, fumonizinai (B1, B2), zearalenonai (ZEN), T-2 ir HT-2 toksinai, deoksinivalenolis (DON) [11].
1.1.1. Deoksivalenolis
Deoksinivalenolis (DON) (2 pav.) yra vienas iš daugiausiai paplitusių trichotecenų, esančių grūduose (kviečiuose, miežiuose, rugiuose, avižose ir kt.).
2 pav. DON cheminė struktūrinė formulė
Dėl jo paplitimo ir keliamų ekonominių nuostolių DON daug griežčiau reguliuojamas nei T-2, nors žmonėms arba gyvūnams tikimybė mirtinai apsinuodyti DON yra daug mažesnė, nei T-2. Nėra iki galo ištirta kaip DON moduliuoja imunin atsak . DON toksiškumas aiškinamas gebėjimu kirsti biologines kliūtis ir paveikti l stelių funkcijas bei gyvybingum . DON slopina baltymų sintezę l stelėse. Vartojant produktus užterštus DON pastebimi žarnyno, imuninės, endokrininės ir nervų sistemos pakitimai, ūmiais atvejais, būdingas vėmimas, anoreksija, pilvo skausmas, viduriavimas, galvos skausmas ir galvos svaigimas. DON poveikis imuninei sistemai svyruoja nuo imunosupresijos iki imunostimuliacijos, atsižvelgiant jo koncentracij bei veikimo trukmę. Teisės aktai nustato didžiausi leistin 1,25 mg/kg DON grūduose, išskyrus kietuosius kviečius, avižas ir kukurūzus – 1,75 mg/kg [12].
1.1.2. Zearalenonas
Zearalenonas (ZEA) (3 pav.) yra Fusarium genties grybelių išskiriamas toksinas. ZEA sintezė gali vykti iki javų derliaus nuėmimo, taip pat, ZEA gali būti išskiriamas po derliaus nuėmimo, esant blogoms laikymo s lygas.
3 pav. ZEA cheminė struktūrinė formulė
Dažniausiai ZEA nustatomas kukurūzuose ir kviečiuose, tačiau jo gali būti ir kituose augaluose, pavyzdžiui, miežiuose, ryžiuose, sorgose ir rugiuose. Chemiškai ZEA yra rezorcilo rūgšties laktonų nesteroidinis, bet estrogeniniu poveikiu pasižymintis junginys. Jis greitai ojamas ir išplinta po audinius. Mikotoksinų ar jų metabolitų kaupimasis audiniuose yra labai
mažas, o likučiai pasišalina per kelias dienas su tulžimi, išmatomis ir šlapimu. Kaip ir dauguma mikotoksinų, ZEA yra stabilus cheminis junginys, todėl nepašalinamas maisto gamybos technologinių procesų metu. Jis neskyla terminio apdorojimo metu, todėl šių teršalų maisto produktuose ir pašaruose stebėsena yra susijusi su visuomenės sveikatos, žemės ūkio produkcijos klausimais, maisto perdirbimu ir prekyba [13].
1.1.3. Mikotoksinų paplitimas
Mikotoksinų paplitimas yra pasaulinio masto problema. Mikotoksinų kiekiui žaliavose ir produktuose takos turi du pagrindiniai veiksniai, tai drėgnis ir temperatūra. Esant klimato kaitai, daug diskusijų kelia temperatūros ir CO2koncentracijos didėjimas, besikeičianti kritulių tendencija ir dažnos audros. Tarpvyriausybinės klimato kaitos komisijos (IPCC) 2014 metų ataskaitoje prognozuojama, kad 2100 metais, temperatūra gali padidėti iki 4,8 °C. Viena vertus, kintanti temperatūra gali turėti takos fungicidų ir pesticidų iki derliaus nuėmimo veiksmingumui, kita vertus, klimato kaita gali pakeisti vabzdžių geografin pasiskirstym ir gyvavimo cikl , kurie skatina mikroskopinių grybelių infekcijas. Nustatyta, kaip kai kurios grybelių rūšys tampa daugiau virulentiškos ir agresyvios. Manoma, kad didžiausia mikotoksinų rizika bus stebima ne tik tropinio klimato šalyse, bet vidutinio klimato šalyse. Nuo 2004 m. BIOMIN vykdo žemės ūkio prekių visame pasaulyje mikotoksinų (aflatoksinų (Afla), zearlenono (ZEN), deoksinivalenolo (DON), fumonizinų (Fum) ir ochratoksino A (OTA)) monitoring . 4 paveiksle pateiktas mikotoksinų paplitimas [14].
4 pav. Mikotoksinų paplitimas 2013 metais skirtinguose geografiniuose regionuose, atsižvelgiant į teigiamų mėginių procentinę dalį (> kiekybinio nustatymo riba, LOQ)
Gamtoje aptinkami grybai daro žal pasėliams jų augimo metu ar po derliaus nuėmimo.
Mikroskopiniai grybai gali išskirti metabolitus jau po derliaus nuėmimo, dėl nepakankamo žaliavos išdžiovinimo, per šiltų ir drėgnų sandėliavimo s lygų [15].
1.1.4. Mikotoksinų kontrolė ir prevencijos priemonės
Mikotoksinų kontrolės bei prevencijos priemonės priklauso nuo mikroskopinio grybo atmainos ir produkto. Keletas priemonių gali būti naudojamų prieš arba po derliaus nuėmimo arba saugojimo metu. Pagrindinės priemonės, naudojamos mikotoksinų prevencijai iki derliaus nuėmimo, tai tinkama agronomijos praktika, atsparios veislės, pavyzdžiui, transgeniniai augalai pasižymintys atsparumu mikroskopiniams grybams. Transgeniniai augalai išskiria lizuojančius peptidus, kurie mažina neigiam mikroskopinių grybų poveik . Siekiant išvengti augalų streso, atliekami dirvožemio tyrimai, rekomenduojama kontroliuoti dirvožemio pH ir kitus parametrus, ypač mineralinių medžiagų kiek . Augalus rekomenduojama sodinti tokiais laikotarpiais, kad būtų galima išvengti aukštos temperatūros ir vandens stygiaus. Pavyzdžiui, dirvožem apdorojus A.
Flavus, jame užaugintoje medvilnėje žymiai sumažėjo aflatoksinų koncentracija.
Pagrindiniai metodai, taikomi mikotoksinų prevencijai, po derliaus nuėmimo, yra džiovinimas ir valymas. Išdžiovinus grūdus, drėgmės kiekis juose būna per mažas grybelių augimui, todėl dehidratacija yra vienas iš geriausių būdų kontroliuoti mikotoksinų koncentracij . Pasėliai nuo lauko turėtų būti transportuojami sausas, švarias ir vabzdžių neužkrėstas saugyklas, laikomi apsaugoti nuo lietaus ir gruntinio vandens patekimo. Taip pat rekomenduojama naudoti registruotus pesticidus ir kitas priešgrybelines priemones. Saugojimo laikotarpiu, temperatūra ir drėgmės kiekis turėtų būti stebimas reguliariai.
Jei grūdai visgi yra užteršti, gali būti taikomi detoksikacijos metodai. Detoksikacija apima mikotoksinų toksinio poveikio inhibavim arba sumažinim , ji klasifikuojama fizinę, cheminę, biologinę.
Fizinės priemonės apima ekstrakcij tirpikliu, adsorbcij , apdorojim ultragarsu, termin apdorojim , UV švitinim , ozono dujas, saulės spindulius, gama spindulius ir pan. Tačiau, kai kurie iš šių fizinių metodų yra brangūs ir taip pat gali sunaikinti svarbias maisto medžiagas produktuose.
Dauguma mikotoksinų yra atsparūs karščiui ir nėra visiškai sunaikinami prastose maisto perdirbimo temperatūrose (80-121 °C).
vairios cheminės medžiagos, skaitant oksiduojančius reagentus, reduktorius, rūgštis bei bazes buvo išbandytos mikotoksinų degradavimui. Tik kai kurios iš šių medžiagų buvo veiksmingos ir neardė maistinių medžiagų produktuose. Cheminiai būdai naudojami kartu su fiziniais padidina mikotoksinų detoksikacijos efektyvum . Aflatoksinų koncentracij daugiau nei 75 proc. galima sumažinti apdorojant dujiniu amoniaku arba amonio chloridu. Amoniako ir vandenilio chlorido
rūgštys yra veiksmingos detoksikacijos priemonės, bet apdorotų produktų maistinė vertė sumažėja, todėl jos naudojamos ribotai.
Biologinė mikotoksinų kontrolė vykdoma naudojant mikroorganizmus, kurių veikimo pasekoje, mikotoksinų kiekis sumažėja. Tokiu būdu galima pašalinti AFB1 iš vairių maisto produktų, tokių kaip kukurūzai, žemės riešutai, žemės riešutų sviestas, pienas, aliejus ir kt.
Fermentuojant galima detoksikuoti kelet mikotoksinų, skaitant OTA. Nustatyta, kad fermentuojant degraduoja apie 40 proc. OTA. Nustatyta, kad Torulaspora delbrueckii, Candida tropicalis, Zygosaccharomyces rouxii ir 7 Saccharomyces padermės sumažina ZEA biotransformuojant j alfa-zearalenol ir ß-zearalenol [16].
Nuolatinis monitoringas, gera žemės ūkio praktika, tinkamos saugojimo s lygos ir prevencinės priemonės yra būtinos s lygos, siekiant sumažinti užteršim mikotoksinais. 5 paveiksle pateikiami būdai, kuriais galima kontroliuoti ir mažinti mikotoksinų kiek grūduose [14].
Jei prevencijos priemonės nebūna veiksmingos būtina detoksikacija
DETOKSIKACIJA
Fiziniai metodai:
Terminis nukenksminimas;
Švitinimas UV spinduliais;
Švitinimas Gamma spinduliais;
Adsorbcija;
Ekstrahavimas.
Cheminiai metodai:
Amonizavimas;
Gydimas rūgštimi;
Ozonavimas;
Oksidatoriai;
Gydimas chloru.
Biologiniai metodai:
Bakterijų ir mielių degradacija;
Mikrobų fermentinis skaidymas;
Fermentacija.
PREVENCIJA
Priemonės iki derliaus nuėmimo:
1. Tinkama žemės ūkio praktika;
2. Atsparių veislių naudojimas;
3. Derliaus nuėmimas laiku;
4. Streso mažinimas augalams (apsauga nuo kenkėjų);
5. Biologinių - cheminių medžiagų naudojimas.
Priemonės iki derliaus nuėmimo:
1. Tinkama žemės ūkio praktika;
2. Atsparių veislių naudojimas;
3. Derliaus nuėmimas laiku;
4. Streso mažinimas augalams (apsauga nuo kenkėjų);
5. Biologinių - cheminių medžiagų naudojimas.
5 pav. Mikotoksinų kontrolės ir mažinimo būdai
1.1.5. Mikotoksikozės platinamos per maist
Grūdų užterštumas mikotoksinais yra rimta grėsmė žmonėms ir gyvūnams visame pasaulyje, ypač besivystančiose šalyse, ir gali sukelti daug sveikatos problemų. Pirm kart aflatoksinai identifikuoti, pasireiškus jų žalingam poveikiui kalakučiukams ir kitų paukščių jaunikliams 1960 metais Anglijoje, kai daugiau nei 100000 kalakučiukų krito dėl pašaruse esančio didelio kiekio mikotoksino. Šie mikotoksinai dislokavosi paukščių kepenyse, kurios buvo pakeitusios spalv ir padidėjusios. Šie kritimai buvo susieti su didele aflatoksino koncentracija importuotuose braziliškų riešutų miltuose, naudotų lesalams gaminti. Zearalenonas vienas iš Fusarium mikotoksinų, buvo nustatytas supelijusiuose kukurūzuose, kai pasireiškė jo estrogeninis poveikis gyvūnams, kuris išprovokavo patelėms vulvos ir/arba tiesiosios žarnos prolaps , nevaisingum , vulvovaginit . Didelis kiekis zearalenono pašaruose buvo nustatytas po ilgo pašarų formavimo, o pirmieji požymiai fusarium toksikozės sukeltų Fusarium graminearum ir Fusarium culmorum paprastai yra susijęs su citotoksiniais virškinimo trakto pokyčiais ir degeneraciniais pakitimais vidaus organuose [17].
1.2. Pieno rūgšties bakterijų panaudojimas mikotoksinų mažinimui
Žemės ūkio geros gamybos praktika ir subalansuotas chemikalų taikymas gali užkirsti keli mikotoksinų plitimui, tačiau net geriausios strategijos negali eliminuoti mikotoksinų iš žaliavų.
Dažniausiai naudojami metodai maisto pramonėje mikotoksinų kiekiui mažinti yra adsorbentų traukimas maisto produkt , kurie selektyviai pašalina toksinus ir mažina jų absorbcija virškinimo trakte [18].
Mikroorganizmų panaudojimas mikotoksinų prevencijai pastaraisiais metais išaugo dėl vartotojų poreikio natūraliems produktams be cheminių teršalų. Lactobacillus spp. sukėle didel susidomėjim , kai buvo atskleistos jų savybės mažinti mikotoksinų kiek . Šios bakterijos žinomos kaip probiotikai ir apsauginiai mikroorganizmai maisto ir pašarų pramonėje, tačiau žemės ūkio srityje, apie jų galim panaudojim iki šiol informacijos yra nedaug, nors šie mikroorganizmai gali būti randami augaluose ir gaminti biologiškai aktyvius junginius (organines rūgštis, bakteriocinus, ciklinius dipeptidus, riebalų rūgštis) pasižyminčius antimikrobinėmis savybėmis prieš platų spektr fitopatogeninių grybų [19].
Šiuo metu atliekama daug mokslinių tyrimų, stengiantis išskirti ir identifikuoti biologinius agentus pasižyminčius priešgrybeliniu poveikiu. Pieno rūgšties bakterijos (PRB) turi potencialo slopinant grybelių augim ir detoksikuojant mikotoksinus. Antimikrobinis PRB aktyvumas gali būti susijęs su konkurencija dėl maisto medžiagų, organinių rūgščių (acto ir pieno rūgšties) gamyba ir antagonistinių junginių (vandenilio peroksido, riebalų rūgščių) produkavimu [18].
2. DARBO METODIKA
2.1. Pagrindinės tyrimų kryptys ir jų pagrindimas
Eksperimentas atliktas dviem etapais. Pirmame eksperimento etape buvo atlikti grūdų saugos ir kokybės rodiklių tyrimai (6 paveikslas).
Grūdai: rugiai 1, rugiai 2, kviečiai 3, kviečiai 4, kvietrugiai, miežiai, avižos.
Grūdų kokybės rodiklių tyrimai:
Baltymų kiekio nustatymas, drėgmės kiekio nustatymas, glitimo kiekio nustatymas, piltinio tankio tyrimas,
kritimo skaičiaus tyrimas.
Grūdų saugos rodiklių tyrimas:
Mikotoksinų kiekybinė analizė (DON, ZEA)
6 pav. Principinė pirmo eksperimento etapo schema
Antrame eksperimento etape, atliktas grūdų mėginių apdorojimas pieno rūgšties bakterijomis Lactobacillus sakei, Pediococcus acidilactici, Pediococcus pentosaceus. vertintas optimaliausias gūdų apdorojimo laikas, bendras mikroorganizmų kiekis, atlikta grūdų daigumo analizė. Tyrimo schema pateikta 7 paveiksle.
Grūdų mėginių apdorojimas PRB
PRB (Lactobacillus sakei, Pediococcus acidilactici, Pediococcus pentosaceus)
Pagamintų PRB pH; BTR Grūdų po apdorojimo PRB rodiklių analizė
Grūdų daigumo analizė, bendras mikroorganizmų
kiekis, PRB kiekis, enterobakterijų kiekis, mikotoksinų kiekybinė analizė (DON, ZEA)
7 pav. Principinė antro eksperimento etapo schema
2.2. Tyrimų objektai ir metodai
2.2.1. Tyrimui naudotos žaliavos
Tyrimui naudoti grūdai užauginti Lietuvoje, gauti iš Kaišiadorių raj. ūkininkų (2014 metų derliaus). Eksperimente naudotų pieno rūgšties bakterijų aprašymas pateiktas 1 lentelėje. Pieno rūgšties bakterijos gautos iš Kauno technologijos universiteto Maisto mokslo ir technologijos katedros Grūdai ir grūdų produktai mokslininkų grupės kolekcijos.
Pieno rūgšties bakterijos buvo pagausintos MRS sultinyje, išlaikant termostate joms optimaliose temperatūrose, atitinkamai, L. sakei (30 ºC), P. acidilactici (32 ºC) ir P. pentosaceus (35 ºC), 24 valandas.
1 lentelė. Eksperimente naudotos pieno rūgšties bakterijos
Pavadinimas Aprašymas
Bakterijos Lactobacillus sakei
Gramteigiamos, anaerobinės, sporų nesudarančios, lazdelės formos. Priskiriamos pieno rūgšties bakterijoms, produkuojančioms bakteriocinus.
Pediococcus acidilactici Priskiriamos pieno rūgšties bakterijoms, produkuojančioms bakteriocinus. Rutulio formos.
Pediococcus pentosaceus Priskiriamos pieno rūgšties bakterijoms, produkuojančioms bakteriocinus. Rutulio formos.
2.2.2. Grūdų kokybės rodiklių tyrimų metodai
Baltymų kiekio, glitimo kiekio, sedimentacijos rodiklio, drėgnio tyrimas atliktas infraraudonosios spinduliuotės spektroskopijos metodu, grūdų analizatoriumi Infratec 1241.
Šlapiojo glitimo kiekis nustatomas pagal LST 1571 „Maltų kviečių ir kvietinių miltų (triticum aestivum) šlapiojo glitimo kiekio ir kokybės (glitimo indeksas pagal Perten ) nustatymasį. Iš kviečių išvalomos šiukšlinės priemaišos, kviečiai malami kritimo skaičiaus nustatymo analizei naudojamu laboratoriniu malūnu 3100, turinčiu 0,8 mm skersmens akučių siet . 0,01 g tikslumu pasveriama 10 g sumaltų kviečių, suberiama i Gliutomatic prietaiso plovimo ind , pilama 4,8 ml 2 proc. natrio chlorido tirpalo. Analizė pradedama, ir trunka 5 minutes. Pasibaigus analizei glitimas išimamas ir dedamas centrifuguoti. Po centrifugavimo nustatoma bendra glitimo masė. Rezultatai apskaičiuojami pagal formulę [20]:
drėgnumas bandinio
100
14 100 kiekis glitimo šlapiojo
as nekoreguot proc.
14 kiekis glitimo Šlapiojo
Piltinio tankio nustatymas atliktas pagal LST EN ISO 7971 – 3:2009 „Grūdai. Piltinio tankio, vadinamo hektolitro mase, nustatymas. 3 dalis. prastinis metodasį. Paruošiama ~1000 g reprezentatyvaus tiriamojo ėminio, pilama matavimo ind , pripylus reikiam kiek , šis fiksuojamas peiliu, grūdų perteklius pašalinamas, o matavimo indas pasveriamas [21].
Kritimo skaičius nustatomas pagal LST EN ISO 3093:2010 „Kviečiai, rugiai ir jų miltai, kietieji kviečiai ir kietųjų kviečių kruopmilčiai. Kritimo skaičiaus nustatymas pagal Hagberg ir Perten (ISO 3093:2009). 300 g reprezentatyvaus tiriamojo ėminio sumalama laboratoriniu malūnu.
Tiriamoji dalis pasveriama 0,05g tikslumu, suberiama viskozimetrin mėgintuvėl ir pilama 25 ml
± 0,2 ml vandens, kurio temperatūra 22 oC ± 2 oC. Viskozimetrinis mėgintuvėlis užkemšamas guminiu kamščiu ir iki 30 kartų purtomas aukšyn žemyn. Viskozimetriniu maišikliu nuvaloma visa prie mėgintuvėlio sienelių prilipusi medžiaga, po to maišiklis paliekamas mėgintuvėlyje.
Mėgintuvėlis statomas verdančio vandens voni . Tyrimas laikomas baigtu, kai viskozimetrinis maišiklis pasiekia kleisterizuotos suspensijos dugn . Užrašomas elektroninio chronometro rodomas laikas. Tai yra kritimo skaičius [22].
2.2.3. Grūdų saugos rodiklių tyrimo metodai
Grūdų mėginiuose buvo tirti mikotoksinų zearalenono ir deoksivalenolio kiekiai. Mikotoksinų aptikimui naudojamas renginys Rida quick scan. Deoksivalenolio nustatymo metodika pateikiama 8 paveiksle.
8 pav. Deoksivalenolio aptikimo metodas
Zearalenono nustatymo metodika pateikiama 9 paveiksle.
9 pav. Zearalenono aptikimo metodas
2.2.4. Pagausintų PRB rūgštingumo rodiklių tyrimas (pH ir BTR)
pH vertė buvo matuojama pH-metru (PP - 15, Sartorius Goettingen, Vokietija). Bendras titruojamas rūgštingumas (BTR) buvo nustatytas 10 g mėginio homogenizuoto su 90 ml distiliuoto vandens titruojant 0,1 M NaOH iki pH 8,2. Gautas kiekis ml išreikštas kaip titruojamasis
2.2.5. Grūdų mėginių apdorojimas PRB
Grūgai apdoroti pagausintomis PRB buvo laikyti 30 min ir 60 min. Po apdorojimo buvo tiriamas grūdų daigumas, sėjant juos Petri lėkšteles ir vertinant, kiek grūdų sudygo (procentais).
2.2.6. Grūdų mikrobiologinių rodiklių tyrimas
Mikrobiologiniai tyrimai buvo atlikti pagal LST ISO 11133-1:2009 Maisto ir pašarų mikrobiologija. Tiriami mėginiai suspenduoti fiziologiniame tirpale. Serijiniai skiedimai santykiu 1:9 atlikti iki 1x10-8. Mėgintuvėliai homogenizuoti homogenizatoriumi MSI (IKA, JAV). Tiriami skiedimai buvo sėjami ant mitybinių terpių paviršiaus Petri lėkštelėse. Bendras aerobinių ir fakultatyvinių anaerobinių bakterijų kiekis nustatytas naudojant Plate Count agar (PCA),
„Liofilchemį, Italija. Lėkštelės inkubuotos aerobinėmis s lygomis 30 °C temperatūroje 72 val.
(LST EN ISO 4833:2003). Mikroorganizmų kiekis – kolonijas sudarantys vienetai (KSV/g) nustatyti suskaičiavus po inkubacijos lėkštelėse išaugusias kolonijas.
Enterobakterijų nustatymui naudotas Violet Red Bile glucose agaras (VRBG), „Liofilchemį - Italija. Lėkštelės inkubuotos aerobinėmis s lygomis 37 °C temperatūroje 24 val. Enterobakterijų kiekis nustatytas suskaičiavus ant terpės paviršiaus išaugusias būdingas kolonijas. Identifikavimas atliktas atsižvelgiant išaugusių kolonijų morfologij , dažym si pagal Gram gliukozės fermentavim , oksidazės test (LST ISO 21528-2:2009).
Laktobacilų genties (Lactobacillus spp.) (pieno rūgšties bakterijų) kultivavimui ir kiekybiniam vertinimui naudotas MRS agaras „Biolifeį, Italija. Tiriami praskiedimai sėti ant selektyvinės terpės paviršiaus. Lėkštelės inkubuotos mikroaerofilinėmis s lygomis 5-10 proc. CO2
dujų aplinkoje, 30 °C temperatūroje 72 val. Po inkubacijos suskaičiuotos ant MRS agaro paviršiaus išaugusios būdingos kolonijos. Pirminis laktobacilų identifikavimas atliktas atsižvelgiant išaugusių kolonijų morfologij , dažym si pagal Gram , katalazės aktyvum (LST ISO 15214:2009).
Mielinių grybų kiekio nustatymui naudota DRCB agar terpė „Liofilchemį, Italija. Lėkštelės inkubuotos 25 °C temperatūroje 24-48 val. (LST ISO 21527-1-2008).
2.3. Statistinis duomenų vertinimas
Statistinis tiriamųjų duomenų vertinimas buvo atliktas statistiniu paketu SPSS skirtu Microsoft Windows ir Microsoft Excel programomis.
Rezultatams buvo paskaičiuota vidutinė vertė, standartinis nuokrypis, standartinė paklaida, skirtumo tarp rezultatų reikšmių patikimumas (t-testas) ir variacijos koeficientas. S ryšiams vertinti paskaičiuotas Pearsono koreliacijos koeficientas ir jo patikimumas.
3. TYRIMO REZULTATAI
3.1. Grūdų kokybės rodiklių tyrimų rezultatai
Eksperimente buvo tirti 7 grūdų mėginiai. Rugių mėginių Nr. 1 ir Nr. 2 kokybės rodikliai pateikti 10 paveiksle, kviečių mėginių Nr. 3 ir Nr. 4 kokybės rodikliai pateikti 11 paveiksle, kvietrugių Nr. 5 kokybės rodikliai pateikti 12 paveiksle, miežių mėginių Nr. 6 kokybės rodikliai pateikti 13 paveiksle, avižų mėginių Nr. 7 kokybės rodikliai pateikti 14 paveiksle (priedas 1).
9,2 13,3
75,8
213,0
8,2 15,1
72,7
254,5
Baltymai, % Drėg ė, % Piltinis tankis kg/hl Kriti o skaičius, s
Mėgi ys Nr. Rugiai Mėgi ys Nr. Rugiai
10 pav. Rugių kokybės rodikliai
Bazinis grūdų drėgnis yra 14,0 proc., mėginio Nr. 1 drėgmė nustatyta 13,3 proc. (atitinka reikalavimus saugiam laikymui), o mėginio Nr. 2 drėgmė nustatyta 15,1 proc., o tai viršija bazin rodikl 1,1 proc., todėl tokie grūdai nėra saugūs laikymo metu. Mėginio Nr. 1 piltinis tankis nustatytas 75,8 kg/hl, mėginio Nr. 2 - 72,7 kg/hl. Pagal „LST 1580:2003 Rugiai. Supirkimo ir tiekimo reikalavimaiį, tirtų rugių mėginių piltinio tankio rezultatai atitinka 1 klasės rugiams keliamus reikalavimus. Kritimo skaičius 42 sekundėmis didesnis nustatytas mėginio Nr. 2, tačiau pagal „LST 1580:2003 Rugiai. Supirkimo ir tiekimo reikalavimaiį, abiejų tirtų mėginių kritimo skaičiaus rezultatai atitinka 1 klasės rugiams keliamus reikalavimus.
13,6 15,2
74,1
228,0 25,4
24,0 47,5
12,6 13,1
78,6
374,5 24,3
23,7 44,0
Baltymai, % Drėg ė, % Piltinis tankis kg/hl Kriti o skaičius, s Glitimas infrat.
Glitimas gliut.
Sedmentacija
Mėgi ys Nr. Kviečiai Mėgi ys Nr. Kviečiai
11 pav. Kviečių kokybės rodikliai
Pagal „LST 1524:2003 Kviečiai. Supirkimo ir tiekimo reikalavimaiį, kviečių mėginio Nr. 3 ir kviečių mėginio Nr. 4 kokybės rodikliai atitinko 2 klasės kviečiams keliamus reikalavimus. Kviečių mėginio Nr. 3 drėgmė yra 15,2 proc., t.y., drėgnis viršija bazin . Mėginio Nr. 4 drėgmė nustatyta 13,1 proc. – grūdai gali būti krepiami laikymui. Kritimo skaičius mėginio Nr. 3 nustatytas 147 s mažesnis nei mėginio Nr. 4. Sedmentacijos rodiklis, glitimo ir baltymų kiekis tirtuose mėginiuose kito paklaidų ribose.
13,3 12,7
12,4 12,6 12,8 13,0 13,2 13,4
Baltymai, % Drėg ė, %
Mėgi ys Nr. Kvietrugiai
12 pav. Kvietrugių kokybės rodikliai
Kvietrugių drėgmė nustatyta 12,7 proc., t.y., mažesnė už bazin rodikl (drėgmė 14,0 proc.).
Baltymų kiekis mėginyje Nr. 5 nustatytas 13,3 proc. Kokybiniai kvietrugių rodikliai atitinka „LST 1948:2004 Kvietrugiai. Supirkimo ir tiekimo reikalavimaiį keliamus reikalavimus.
12,1 14,1
64,2
0 10 20 30 40 50 60 70
Baltymai, % Drėg ė, % Piltinis tankis kg/hl
Mėgi ys Nr. Miežiai
13 pav. Miežių kokybės rodikliai
Miežių drėgmė nustatyta 14,1 proc., šis rezultatas atitinka bazin rodikl (drėgmė 14,0 proc.).
Baltymų kiekis mėginiuose Nr. 6 nustatytas 12,1 proc., piltinis tankis – 64,2 kg/hl. Kokybiniai miežių rodikliai atitiko „LST 1797:2003 Miežiai. Supirkimo ir tiekimo reikalavimaiį keliamus reikalavimus.
13,2 16,1
30,4
0 5 10 15 20 25 30 35
Baltymai, % Drėg ė, % Piltinis tankis kg/hl
Mėgi ys Nr. Avižos
14 pav. Avižų kokybės rodikliai
Avižų drėgmė nustatyta 16,1 proc., šis rezultatas ženkliai viršijo bazin rodikl (drėgmė 14,0 proc.), vadinasi mėginio Nr. 7 grūdai nėra saugūs ir juos nepatartina nukreipti laikymui. Baltymų
kiekis nustatytas mėginiuose Nr. 7 buvo 13,2 proc., piltinis tankis 30,4 kg/hl. Kokybiniai rodikliai (išskyrus drėgn ) atitiko keliamus „LST 1610:2004 Avižos. Supirkimo ir tiekimo reikalavimaiį.
3.2. Mikotoksinų kiekis grūduose prieš apdorojim
Deoksivalenolio kiekis tirtuose grūdų mėginiuose pateiktas 15 paveiksle, zearalenono kiekis nustatytas tirtuose mėginiuose pateiktas 16 paveiksle.
0,5 0,5
1,7 1,6
3,0
0,5 0,5
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5
Mėgi ys Nr.
Rugiai
Mėgi ys Nr.
Rugiai
Mėgi ys Nr.
Kviečiai Mėgi ys Nr.
Kviečiai Mėgi ys Nr.
Kvietrugiai
Mėgi ys Nr.
Miežiai Mėgi ys Nr.
Avižos DON ppm
15 pav. Deoksivalenolio kiekis tirtuose mėginiuose, ppm (P=0,0174)
Pagal komisijos reglament (EB) Nr.1881/2006 deoksinivalenolio (DON) kiekis neperdirbtuose grūduose (išskyrus kietuosius kviečius, avižas ir kukurūzus) neturėtų viršyti 1,25 ppm. Analizuojant tirtų grūdų saug mikotoksinų aspektu galima teigti, kad trys mėginiai neatitiko reikalavimų, t.y. kviečių mėginys Nr. 3, kuriame DON kiekis – 1,65 ppm, kviečių mėginys Nr. 4, kuriame DON kiekis – 1,61 ppm bei kvietrugių mėginys Nr. 5, kuriame DON kiekis nustatytas didžiausias – 3,00 ppm.
75 75
500
75 75 75 75
0 100 200 300 400 500 600
Mėgi ys Nr.
Rugiai
Mėgi ys Nr.
Rugiai
Mėgi ys Nr.
Kviečiai Mėgi ys Nr.
Kviečiai Mėgi ys Nr.
Kvietrugiai
Mėgi ys Nr.
Miežiai Mėgi ys Nr.
Avižos ZEA ppb
16 pav. Deoksivalenolio kiekis tirtuose mėginiuose, ppb (P=0,0668)
Pagal komisijos reglament (EB) Nr.1881/2006 zearalenono (ZEA) kiekis neperdirbtuose grūduose (išskyrus kietuosius kviečius, avižas ir kukurūzus) neturėtų viršyti 100 ppb ribos.
Analizuojant tirtų grūdų mėginių rezultatus galima teigti, kad vienas mėginys neatitiko reikalavimų, t.y. kviečių mėginys Nr. 3, kuriame ZEA kiekis nustatytas 500 ppb. Analizuojant grūdų saugos rodiklius matyti, kad mėginyje, kuriame DON kiekis viršijo leistin rib , ZEA kiekis taip pat buvo didesnis.
3.3. Pagausintų PRB rūgštingumo rodikliai (pH ir BTR)
MRS sultinio pH prieš (PRB) gausinim ir po 24, 48 ir 72 val. pateiktas 17 paveiksle. MRS sultinio, BTR (°N) pateiktas 18 paveiksle (priedas 2).
0 1 2 3 4 5 6 7
Prieš gausi i ą
Po 24 val. Po 48 val. Po 72 val.
6,1
5,0 4,6
3,8 5,9
4,9
4,2 3,9
5,8 5,3
4,3 3,9
P.p P.a. L.s
17 pav. MRS sultinio pH prieš PRB gausinimą (P<0,0001) ir po 24 (P<0,0001), 48 (P<0,0001) ir 72val. (P<0,0001). (Paaiškinimas: PRB - pieno rūgšties bakterijos; P.p- Pediococcus pentosaceus;
P.a- Pediococcus acidilactici; L.s -Lactobacillus sakei)
Nustatyta, kad didžiausias MRS sultinio pH buvo prieš PRB gausinim , pH vertės P.p – 6,1, P.a – 5,9, L.s – 5,8. Po 24val. pH nežymiai sumažėjo: P.p – 5,0, P.a – 4,9, L.s – 5,3, lyginant su pradiniu rezultatu, t.y., prieš gausinim , P.p mažėjimas sudarė 18 proc., P.a mažėjimas sudarė 16,9 proc., L.s mažėjimas sudarė 8,6 proc. Palyginus gautus rezultatus po 48 val. su pradiniu rezultatu, t.y., prieš gausinim , ir toliau buvo stebimas pH mažėjimas: P.p mažėjimas sudarė 24,6 proc., P.a - 28,8proc., L.s - 25,9 proc. Mažiausias pH nustatytas po 72 val. Ph vertės: P.p – 3,8, P.a – 3,9, L.s – 3,9, lyginant su pradiniu rezultatu P.p mažėjimas sudarė 37,7 proc., P.a mažėjimas sudarė 33,9 proc., L.s mažėjimas sudarė 32,8 proc.
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
Prieš gausi i ą Po 24 val. Po 48 val. Po 72 val.
1,9
9,8
15,4
18,6
1,8
11,9
16,2
19,2
2,1
8,5
18,1
19,5
P.p P.a. L.s
18 pav. MRS sultinio BTR (bendras titruojamasis rūgštingumas) prieš PRB gausinimą (P<0,0001) ir po 24 (P<0,0001), 48 (P<0,0001) ir 72val. (P<0,0001). (Paaiškinimas: PRB - pieno rūgšties bakterijos; P.p- Pediococcus pentosaceus; P.a- Pediococcus acidilactici; L.s -Lactobacillus sakei)
MRS sultinio bendras titruojamasis rūgštingumas mažiausias prieš PRB gausinim . BTR po 24 val. kito nuo pradinių rezultatų, atitinkamai, mėginiuose P.p nuo 1,9 iki 9,8 °N, P.a nuo 1,8 iki 11,9 °N, L.s nuo 2,1 iki 8,5 °N. Praėjus 48 val. BTR nuo pradinių rezultatų padidėjo, atitinkamai, mėginiuose P.p nuo 1,9 iki 15,4 °N, P.a nuo 1,8 iki 16,2 °N, L.s nuo 2,1 iki 18,1 °N. Bendras titruojamas rūgštingumas labiausiai padidėjo po 72 val. P.p šis rodiklis padidėjo 10 kartų, lyginant su pradiniu rezultatu, nuo 1,9 iki 18,6 °N, P.a BTR padidėjo 11 kartų (nuo 1,8 iki 19,2 °N), L.s BTR padidėjo 9 kartus (nuo 2,1 iki 19,5 °N).
3.4. Grūdų mėginių, apdorotų PRB daigumo rezultatai
Grūdų daigumo rezultatai apdorojant juos skirtingomis PRB 30 min. ir 60 min. pateiktas 19 paveiksle.
Grūdų mėg. Nr. 3 apdoroti PRB Pp 30 min.
Grūdų mėg. Nr. 3 apdoroti PRB Pa 30 min.
Grūdų mėg. Nr. 3 apdoroti PRB Ls 30 min.
Grūdų mėg. Nr. 3 apdoroti PRB Pp 60 min.
Grūdų mėg. Nr. 3 apdoroti PRB Pa 60 min.
Grūdų mėg. Nr. 3 apdoroti PRB Ls 60 min.
19 pav. Grūdų daigumas tirtame 3 mėginyje
Grūdų daigumas buvo geresnis juos apdorojant 30 min. su PRB. Apdorojus grūdus 60 min.
grūdų daigumas sumažėjo. Tam takos galėjo turėti PRB išskiriamų metabolitų aktyvumas (fermentų, organinių rūgščių ir kt.).
3.5. Grūdų mikrobiologiniai rodikliai prieš ir po apdorojimo PRB
Bendras aerobinių mikroorganizmų kiekis grūdų mėginiuose prieš ir po apdorojimo Pediococcus pentosaceus, Pediococcus acidilactici, Lactobacillus sakei pateiktas, atitinkamai, 20, 21 ir 22 paveiksluose (priedas 4).
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
1 2 3 4 5 6 7
5,9 5,7
8,3
5,5 5,7
5,2 5,4
4,2
5,1 5,0 4,9 5,0
4,6 4,3
Prieš apdoroji ą su PRB Pp Po apdorojimo su PRB Pp
20 pav. Bendras aerobinių mikroorganizmų kiekis, log10 KSV/g prieš apdorojimą PRB (P<0,0001) ir po apdorojimo PRB (P<0,0001). (Paaiškinimas: KSV/g - kolonijas sudarantys vienetai grame
produkto; PRB- pieno rūgšties bakterijos; P.p - Pediococcus pentosaceus)
Bendras aerobinių mikroorgizmų kiekis prieš grūdų mėginių apdorojim PRB kito nuo 5,2 iki 5,9 KSV/g. Vienintelis mėginys Nr. 3 išsiskyrė didesniu bendru aerobinių mikroorganizmų kiekiu –
8,3 KSV/g. Po apdorojimo P.p (Pediococcus pentosaceus) visuose tirtuose mėginiuose bendras aerobinių mikroorganizmų kiekis sumažėjo. Pirmame mėginyje tai sudarė 29 proc., antrame mėginyje 10,5 proc., trečiame mėginyje - 39,8 proc., ketvirtame mėginyje - 10,9 proc., penktame mėginyje - 12,3 proc., šeštame mėginyje - 11,5 proc., septintame mėginyje - 20,4 proc. Vidutiniškai bendras aerobinių mikroorgizmų kiekis po apdorojimo P.p sumažėjo 19 proc.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
1 2 3 4 5 6 7
6,1 6,2
8,5
5,2
6,0
5,3 5,8
4,5 4,8 4,5 5,0
5,8
4,8 4,6
Prieš apdoroji ą su PRB Pa Po apdorojimo su PRB Pa
21 pav. Bendras aerobinių mikroorganizmų kiekis, log10 KSV/g prieš apdorojimą PRB (P<0,0001) ir po apdorojimo PRB (P<0,0001). (Paaiškinimas: KSV/g - kolonijas sudarantys vienetai grame
produkto; PRB- pieno rūgšties bakterijos; P.a - Pediococcus acidilactici)
Didžiausias bendras aerobinių mikroorganizmų kiekis buvo nustatytas mėginyje Nr. 3 – 8,5 KSV/g. Likusiuose mėginiuose bendras aerobinių mikroorgizmų kiekis prieš mėginių apdorojim PRB kito nuo 5,2 iki 6,2 KSV/g. Po apdorojimo PRB P.a (Pediococcus acidilactici) bendras aerobinių mikroorganizmų kiekis mėginiuose vidutiniškai sumažėjo 19 proc.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
1 2 3 4 5 6 7
6,0 5,9
8,1
5,9 5,9
5,5 5,1
4,9 5,0
4,3 4,8 5,2
4,6 4,9
Prieš apdoroji ą su PRB Ls Po apdorojimo su PRB Ls
22 pav. Bendras aerobinių mikroorganizmų kiekis, log10 KSV/g prieš apdorojimą PRB (P<0,0001) ir po apdorojimo PRB (P<0,0001). (Paaiškinimas: KSV/g - kolonijas sudarantys vienetai grame
produkto; PRB- pieno rūgšties bakterijos; L.s -Lactobacillus sakei)
Didžiausias bendras aerobinių mikroorganizmų kiekis nustatytas mėginyje Nr. 3 – 8,1 KSV/g.
Likusiuose mėginiuose bendras aerobinių mikroorgizmų kiekis prieš mėginių apdorojim PRB kito nuo 4,3 iki 5,9 KSV/g. Po apdorojimo PRB L.s (Lactobacillus sakei) bendras aerobinių mikroorganizmų kiekis mėginiuose sumažėjo: pirmame mėginyje – 18,3 proc., antrame mėginyje – 15,3 proc., trečiame mėginyje – 46,9 proc., ketvirtame mėginyje – 18,6 proc., penktame mėginyje – 11,9 proc., šeštame mėginyje – 16,4 proc., septintame mėginyje – 3,9 proc. Vidutiniškai bendras aerobinių mikroorgizmų kiekis po mėginių apdorojimo PRB L.s sumažėjo 18,8 proc.
Pieno rūgšties bakterijų kiekis neapdorotuose PRB grūdų mėginiuose pateiktas 23 paveiksle, apdorotuose Pediococcus pentosaceus, Pediococcus acidilactici, Lactobacillus sakei – 24 paveiksle.
3,6
3,9
3,2
3,6 3,5 3,5
2,7 3,1
4,2
3,3 3,2
3,7
3,3
2,8 3,9
3,7
3,3 3,5
3,1 3,2
2,4
1 2 3 4 5 6 7
Prieš apdoroji ą su PRB Pp Prieš apdoroji ą su PRB Pa Prieš apdoroji ą su PRB Ls
23 pav. Bendras pieno rūgšties bakterijų kiekis, log10KSV/g prieš apdorojimą PRB (P<0,0001).
(Paaiškinimas: KSV/g - kolonijas sudarantys vienetai grame produkto, PRB- pieno rūgšties bakterijos; P.p- Pediococcus pentosaceus; P.a- Pediococcus acidilactici; L.s -Lactobacillus sakei)
Mažiausias bendras PRB kiekis nustatytas 7 grūdų mėginyje, P.p – Pediococcus pentosaceus – 2,4 KSV/g; P.a – Pediococcus acidilactici – 2,8 KSV/g; L.s – Lactobacillus sakei – 2,7 KSV/g.
Likusiuose grūdų mėginiuose bendras PRB kiekis kito paklaidos ribose. Vidutiniškai PRB grūdų mėginiuose nustatyta: P.p – Pediococcus pentosaceus – 3,3 KSV/g, P.a – Pediococcus acidilactici – 3,4 KSV/g, Lactobacillus sakei – 3,4 KSV/g.
5,5 5,1 5 4,8 4,9
5,6 4,6 4,9
5,4 5,5
4,2
5,3
5,8
4,8
4,8 4,9
5,8
4,3
5,0 4,9 5,1
1 2 3 4 5 6 7
Po apdorojimo su PRB Pp Po apdorojimo su PRB Pa Po apdorojimo su PRB Ls
24 pav. Bendras PRB kiekis, log10 KSV/g po apdorojimo PRB (P<0,0001). (Paaiškinimas: KSV/ml- kolonijas sudarantys vienetai grame/mililitre produkto, PRB- pieno rūgšties bakterijos; P.p-
Pediococcus pentosaceus; P.a- Pediococcus acidilactici; L.s -Lactobacillus sakei)
Apdorojus PRB grūdų mėginius, šių mikroorganizmų kiekis juose padidėjo 1,5 karto.
Vidutiniškai PRB grūdų mėginiuose nustatyta: P.p- Pediococcus pentosaceus – 5,1 KSV/g, P.a – Pediococcus acidilactici – 5,1 KSV/g, Lactobacillus sakei – 5,0 KSV/g.
Enterobakterijų kiekis grūdų mėginiuose prieš ir po apdorojimo PRB pateiktas 25 paveiksle.
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0
1 2 3 4 5 6 7
1,3 1,4
2,1
1,2 1,1 1,2 1,1
1,5
1,3
2,7
1,1 1,0
1,3 1,4
1,2
1,4
2,5
1,4
1,2
1,0 1,0
0 0
1,2
0 0 0 0
0 0
1,3
0 0 0 0
0 0
1,0
0 0 0 0
Prieš apdoroji ą su PRB Pp Prieš apdoroji ą su PRB Pa Prieš apdoroji ą su PRB Ls Po apdorojimo su PRB Pp Po apdorojimo su PRB Pa Po apdorojimo su PRB Ls
25 pav. Bendras enterobakterijų kiekis, log10 KSV/g prieš apdorojimą PRB (P<0,0001).
(Paaiškinimas: KSV/g- kolonijas sudarantys vienetai grame produkto; PRB- pieno rūgšties bakterijos; P.p- Pediococcus pentosaceus; P.a- Pediococcus acidilactici; L.s -Lactobacillus sakei)
Visuose grūdų mėginiuose prieš apdorojim PRB vidutinis enterobakterijų kiekis nustatytas 1,4 KSV/g. Vidutinę reikšmę ženkliai viršijo grūdų mėginys Nr. 3, kuriame bendras enterobakterijų kiekis nustatytas 2,4 KSV/g. Po apdorojimo PRB visuose grūdų mėginiuose, išskyrūs grūdų mėgin Nr. 3, enterobakterijų nenustatyta. Grūdų mėginyje Nr.3 bendras enterobakterijų kiekis, net ir po apdorojimo PRB išliko vidutiniškai 1,2 KSV/g. Mažiausias enterobakerijų kiekis nustatytas po
apdorojimo L.s -Lactobacillus sakei – 1 KSV/g. Po apdorojimo P.p - Pediococcus pentosaceus – 1,2 KSV/g, didžiausias enterobakterijų kiekis nustatytas po apdorojimo P.a- Pediococcus acidilactici – 1,3 KSV/g.
Mielinių ir pelėsinių grybų kiekis grūduose prieš ir po apdorojimo Pediococcus pentosaceus, Pediococcus acidilactici, Lactobacillus sakei pateiktas 26, 27 ir 28 paveiksluose.
0 1 2 3 4 5 6 7 8
1 2 3 4 5 6 7
5,7 5,5
7,5
5,3 5,1 5,1
5,9
3,0
3,6
4,4 4,6
3,8
3,0 3,4
Prieš apdoroji ą su PRB Pp Po apdorojimo su PRB Pp
26 pav. Bendras mielinių ir pelėsinių grybų kiekis, log10 KSV/g prieš apdorojimą PRB (P<0,0001) ir po apdorojimo PRB (P<0,0001). (Paaiškinimas: KSV/g - kolonijas sudarantys vienetai grame
produkto; PRB- pieno rūgšties bakterijos; P.p- Pediococcus pentosaceus)
Didžiausias bendras mielinių ir pelėsinių grybų kiekis nustatytas grūdų mėginyje Nr. 3 – 7,5 KSV/g. Likusiuose grūdų mėginiuose šis rodiklis kito nuo 5,1 iki 5,9 KSV/g. Po grūdų mėginių apdorojimo PRB P.p- Pediococcus pentosaceus, bendras mielinių ir pelėsinių grybų kiekis sumažėjo. Pirmame mėginyje sumažėjo 47 proc., antrame – 35 proc., trečiame – 41 proc., ketvirtame – 13 proc., penktame – 25 proc., šeštame – 41 proc., septintame – 42 proc. Vidutiniškai bendras mielinių ir pelėsinių grybų kiekis po mėginių apdorojimo P.p- Pediococcus pentosaceus sumažėjo 35 proc.
0 1 2 3 4 5 6 7
1 2 3 4 5 6 7
5,5 5,3
6,9
5,4 5,0 5,1
5,7
3,8 3,8 4,1
4,8
3,7 3,8 4,2
Prieš apdoroji ą su PRB Pa Po apdorojimo su PRB Pa
27 pav. Bendras mielinių ir pelėsinių grybų kiekis, log10 KSV/g prieš apdorojimą PRB (P<0,0001) ir po apdorojimo PRB (P<0,0001). (Paaiškinimas: KSV/g - kolonijas sudarantys vienetai grame
produkto; PRB- pieno rūgšties bakterijos; P.a- Pediococcus acidilactici)
Didžiausias bendras mielinių ir pelėsinių grybų kiekis nustatytas grūdų mėginyje Nr. 3 – 6,9 KSV/g. Likusiuose grūdų mėginiuose mielinių ir pelėsinių grybų kiekis kito nuo 5,0 iki 5,7 KSV/g.
Po grūdų mėginių apdorojimo P.a- Pediococcus acidilactici, bendras mielinių ir pelėsinių grybų kiekis sumažėjo. Pirmame mėginyje sumažėjo 31 proc. (nuo 5,5 iki 3,8 KSV/g), antrame – 28 proc.
(nuo 5,3 iki 3,8 KSV/g), trečiame – 41 proc. (nuo 6,9 iki 4,1 KSV/g), ketvirtame – 11 proc. (nuo 5,4 iki 4,8 KSV/g), penktame – 26 proc. (nuo 5 iki 3,7 KSV/g), šeštame – 25 proc. (nuo 5,1 iki 3,8 KSV/g), septintame – 26 proc. (nuo 5,7 iki 4,2 KSV/g). Vidutiniškai bendras mielinių ir pelėsinių grybų kiekis po mėginių apdorojimo P.p- Pediococcus pentosaceus sumažėjo 27 proc.
0 1 2 3 4 5 6 7 8
1 2 3 4 5 6 7
5,9
5,2
7,2
5,1
5,7 5,3 5,2
3,2 3,6
4,6 4,6
3,6 3,2
3,8
Prieš apdoroji ą su PRB Ls Po apdorojimo su PRB Ls
28 pav. Bendras mielinių ir pelėsinių grybų kiekis, log10 KSV/g prieš apdorojimą PRB (P<0,0001) ir po apdorojimo PRB (P<0,0001). (Paaiškinimas: KSV/g - kolonijas sudarantys vienetai grame
produkto; PRB- pieno rūgšties bakterijos; L.s -Lactobacillus sakei)
Didžiausias bendras mielinių ir pelėsinių grybų kiekis nustatytas grūdų mėginyje Nr. 3 – 7,2 KSV/g. Likusiuose grūdų mėginiuose šis rodiklis kito nuo 5,1 iki 5,9 KSV/g. Po grūdų mėginių apdorojimo L.s -Lactobacillus sakei, bendras mielinių ir pelėsinių grybų kiekis sumažėjo. Pirmame mėginyje sumažėjo 46 proc., antrame – 31 proc., trečiame – 36 proc., ketvirtame – 10 proc., penktame – 37 proc., šeštame – 40 proc., septintame – 27 proc. Vidutiniškai bendras mielinių ir pelėsinių grybų kiekis po mėginių apdorojimo L.s -Lactobacillus sakei sumažėjo 32 proc.
3.6. Mikotoksinų (DON, ZEA) kiekis grūduose po apdorojimo PRB
Deoksivalenolio kiekis grūduose prieš ir po grūdų mėginių apdorojimo PRB pateiktas 29 paveiksle, zearalenono – 30 paveiksle (priedas 3).
0,5 0,5
1,8
1,6
3,0
0,5 0,5
0,5 0,5
1,6
1,4
2,2
0,5 0,5
0,5 0,5
1,4
1,2
2,0
0,5 0,5
0,5 0,5
1,3
1,5
2,2
0,5 0,5
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5
1 2 3 4 5 6 7
Ko trolė P. pentosaceus P. acidilactici L. sakei
29 pav. Deoksivalenolio kiekis (ppm) grūdų mėginiuose prieš ir po apdorojimo PRB (PRB - pieno rūgšties bakterijos; P.p- Pediococcus pentosaceus; P.a- Pediococcus acidilactici; L.s -
Lactobacillus sakei)
Pirmame, antrame, šeštame ir septintame grūdų mėginiuose deoksivalenolio kiekis nustatytas 0,5 ppm, po šių grūdų mėginių apdorojimo PRB, DON kiekis liko nepakitęs t.y. 0,5 ppm. Trečiame mėginyje DON kiekis prieš apdorojim nustatytas 1,81 ppm, po apdorojimo PRB P.p- Pediococcus pentosaceus DON kiekis sumažėjo iki 1,65 ppm, apdorojus P.a- Pediococcus acidilactici DON kiekis sumažėjo iki 1,44 ppm, apdorojus L.s - Lactobacillus sakei DON kiekis sumažėjo iki 1,28 ppm. Ketvirtame grūdų mėginyje DON kiekis prieš apdorojim nustatytas 1,61 ppm, po grūdų mėginio apdorojimo PRB P.p - Pediococcus pentosaceus, P.a - Pediococcus acidilactici, L.s - Lactobacillus sakei DON kiekis visuose mėginiuose sumažėjo sekančiai: 1,42 ppm, 1,22ppm, 1,53ppm. Kontroliniame mėginyje nr. 5 nustatytas DON kiekis 3 ppm. Po apdorojimo PRB DON kiekis sumažėjo: apdorojus P.p - Pediococcus pentosaceus DON kiekis sumažėjo iki 2,23 ppm,
apdorojus PRB P.a - Pediococcus acidilactici DON kiekis sumažėjo iki 1,99 ppm, apdorojus PRB L.s - Lactobacillus sakei DON kiekis sumažėjo iki 2,15 ppm.
75 75
500
75 75 75 75
75 75
261
75 75 75 75
75 75
174
75 75 75 75
75 75
258
75 75 75 75
0 100 200 300 400 500 600
1 2 3 4 5 6 7
Ko trolė P. pentosaceus P. acidilactici L. sakei
30 pav. Zearalenono kiekis (ppb) grūdų mėginiuose prieš ir po apdorojimo PRB (PRB - pieno rūgšties bakterijos; P.p- Pediococcus pentosaceus; P.a- Pediococcus acidilactici; L.s -
Lactobacillus sakei)
Iš tirtų septynių grūdų mėginių: pirmame, antrame, ketvirtame, šeštame penktame, bei septintame mėginiuose jokių reikšmingų pokyčių, lyginant kontrolinius grūdų mėginius su grūdų mėginiais juos apdorojus PRB, nenustatyta. Tiek prieš grūdų mėginių apdorojim PRB, tiek po apdorojimo, ZEA kiekis buvo tas pats t.y., 75 ppb. Trečiame grūdų mėginyje prieš apdorojim PRB, ZEA kiekis nustatytas 500 ppb, apdorojus grūdus P.p- Pediococcus pentosaceus ZEA kiekis sumažėjo iki 261 ppb, apdorojus grūdus P.a- Pediococcus acidilactici ZEA kiekis sumažėjo iki 258 ppb, t.y., apdorojus PRB ZEA kiekis sumažėjo net 2,8 karto.
