LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS
FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
SIMONA ZUOZAITĖ
PAPRASTŲJŲ AVIEČIŲ (RUBUS IDAEUS L.) LAPŲ FENOLINIŲ
JUNGINIŲ IR ANTIOKSIDANTINIO AKTYVUMO TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas: Prof.dr. Valdas Jakštas
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS
FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis Data
PAPRASTŲJŲ AVIEČIŲ (RUBUS IDAEUS L.) LAPŲ FENOLINIŲ
JUNGINIŲ IR ANTIOKSIDANTINIO AKTYVUMO TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Recenzentas:
Darbo vadovas:
Prof.dr. Valdas Jakštas Data Darbą atliko Magistrantė: Simona Zuozaitė Data Kaunas, 2015
TURINYS
SANTRUMPOS ... 4
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 6
ĮVADAS ... 7
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 8
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 9
1.1. Rubus idaeus morfologija ir paplitimas. ... 9
1.2. R. idaeus fitocheminė sudėtis ... 10
1.3. Paprastųjų aviečių panaudojimas medicinoje ir farmacijoje ... 11
1.4. Fenolinių junginių charakteristika ir nustatymas ... 12
1.5. Antioksidantinis aktyvumas ir jo įvertinimo metodai ... 16
2. TYRIMO METODIKA ... 21
2.1. Tyrimų objektas ... 21
2.2. Reagentai ir aparatūra ... 21
2.3. Tyrimų metodai ... 22
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 28
3.1. Ekstrakcijos sąlygų parinkimas ... 28
3.2. Suminių flavonoidų ir fenolinių junginių kiekių įvertinimas R. idaeus lapuose ... 29
3.2.1. Flavonoidų ir fenolinių junginių kiekių įvertinimas įvairiose Lietuvos augavietėse surinktuose R. idaeus lapuose ... 29
3.2.2. Flavonoidų ir fenolinių junginių kiekių įvertinimas skirtingais vegetacijos tarpsniais surinktuose R. idaeus lapuose ... 34
3.2.3. Flavonoidų ir fenolinių junginių kiekių įvertinimas R. idaeus lapų arbatose ... 36
3.3. Antioksidantinio aktyvumo įvertinimas ... 38
3.3.1. Antioksidantinio aktyvumo įvertinimas įvairiuose Lietuvos regionuose rinktuose R. idaeus lapuose ... 39
3.3.2. Antioksidantinio aktyvumo įvertinimas skirtingais vegetacijos tarpsniais rinktuose R. idaeus lapuose ... 41
3.3.3. Antioksidantinio aktyvumo įvertinimas R. idaeus lapų arbatose ... 44
3.4. Chromatografinis R. idaeus lapų tyrimas ... 47
3.5. Rezultatų apibendrinimas ... 50
IŠVADOS ... 52
LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 54
PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 58
SANTRUMPOS
ABTS - 2,2'-azino-bis 3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgštisANOVA - vieno faktoriaus dispersinė analizė (angl. – analysis Of variance) CUPRAC – vario jonų redukcijos antioksidantinė galia
DPPH – 1,1-difenil-2-pikrilhidrazilas DNR – deoksiribonukleo rūgštis
ESC – efektyvioji skysčių chromatografija
FRAP – geležies jonų redukcijos antioksidantinė galia N - imties tūris
ORAC – deguonies radikalų absorbcinė geba p - reikšmingumo lygmuo
PDA – fotodiodų matricos detektorius RNS - aktyvios azoto formos radikalai ROS - reaktyvaus deguonies forma rs - Spirmeno koreliacijos koeficientas
R2 - regresijos koeficientas
RNR – Ribonukleino rūgštis
TPTZ - 2,4,6-tri(2-pyridyl)-s-triazinas UV – ultravioletiniai spinduliai
SANTRAUKA
Simonos Zuozaitės magistro baigiamasis darbas „Paprastųjų aviečių (L. Rubus idaeus) lapų fenolinių junginių ir antioksidantinio aktyvumo tyrimas“/ mokslinis vadovas prof. dr. Valdas Jakštas; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Medicinos akademijos, Farmacijos fakulteto, Farmakognozijos katedra. – Kaunas.
Tyrimo tikslas: ištirti natūraliai augančių paprastųjų aviečių lapų flavonoidų ir fenolinių junginių kiekinės sudėties ir antioksidantinio aktyvumo įvairavimą bei palyginti rezultatus su vaistinių asortimente esančių arbatų fitocheminės sudėties rodikliais.
Tyrimo uždaviniai: ištirti natūraliai augančių paprastųjų aviečių lapų ir vaistinių asortimente esančių aviečių lapų arbatų flavonoidų ir fenolinių junginių kiekinės sudėties įvairavimą; įvertinti paprastųjų aviečių lapų etanolinių ekstraktų antiradikalinį ir redukcinį aktyvumą; ESC metodu ištirti kvercetino ir chlorogeno rūgšties kiekio įvairavimą; palyginti natūraliai augančių lapų ėminių fitocheminės sudėties rodiklius su vaistinėje įsigytomis aviečių lapų arbatų rodikliais.
Tyrimo metodai: bendras flavonoidų kiekis nustatytas spektrofotometriškai po reakcijos su
aliuminio chloridu. Bendras fenolinių junginių kiekis nustatytas spektrofotometriniu Folin – Ciocalteau
metodu. Antioksidantinis aktyvumas nustatytas spektrofotometriniu metodu naudojant DPPH, ABTS, CUPRAC, FRAP testus. Kvercetino ir chlorogeno rūgšties kiekis nustatytas ESC metodu.
Tyrimo objektas: paprastųjų aviečių lapų mėginiai, surinkti natūraliose augavietėse (n=13), skirtingais vegetacijos tarpsniais toje pačioje augavietėje (n=12) bei įsigyti vaistinėse (n=15).
Tyrimo rezultatai: flavonoidų kiekis lapų žaliavose įvairavo nuo 0,78 iki 3,85 proc. Suminis fenolinių junginių kiekis lapų mėginiuose nuo 22,2 iki 116,1 mg/g. Lapų žaliavose kvercetino kiekis sudarė 4,83 – 43,60 µg/g, chlorogeno rūgšties 232,45 – 1362,17 µg/g. Antioksidantinis aktyvumas įvairavo: DPPH metodu nuo 173 iki 823,36 µmol/g, ABTS 240 - 844,1 µmol/g, CUPRAC 362,8 - 1448,3 µmol/g, FRAP 207,09 - 1045,1 µmol/g.
Tyrimo išvados: bendras flavonoidų ir fenolinių junginių kiekis (tarp mažiausios ir didžiausios mėginiuose nustatytos reikšmės) skirtingose augavietėse rinktuose mėginiuose skyrėsi atitinkamai 4,9 ir 5,2 karto, skirtingais vegetacijos tarpsniais rinktuose aviečių lapų mėginiuose – atitinkamai 2,8 ir 1,9 karto, arbatų mėginiuose – 3 ir 2,2 karto. Skirtingais antioksidantinio aktyvumo įvertinimo metodais gauti rezultatai skyrėsi. Nustatyta stipri koreliacinė priklausomybė tarp veikliųjų junginių (fenolinių junginių ir flavonoidų) kiekių ir žaliavos mėginio antioksidantinio aktyvumo. ESC būdu identifikuoti ir kiekybiškai įvertinti antriniai metabolitai – kvercetinas ir chlorogeno r.
SUMMARY
The topic of the master thesis by Simona Zuozaitė is ‚ The Analysis of Antioxidant Activity and Phenolic Compounds of Raspberry Leaves (Rubus idaeus L.) ‘. The supervisor is prof. Dr. Valdas Jakštas, Lithuanian University of Health Sciencies, Academy of Medicine, Faculty of Pharmacy, Department of Pharmacognosis. –Kaunas.
The aim of the research: to evaluate the quantitative composition of naturally growing R. idaeus phenolic compounds and antioxidant activity variance and compare the results with leaf teas.
The objectives of the research: to evaluate the total content of phenolic compounds and flavonoids, and their variability in the leaf samples of R.idaeus collected in natural habitats and in raspberry leaves tea; to measure the antioxidant activity of ethanolic extracts of raspberry leaves; to evaluate the quantitative distribution of of chlorogenic acid and kvercetin in leaves by HPLC method; to compare results of leaf tea analysis with samples collected in different habitats.
The methods of the research: the total flavonoid content has been measured using the spectrophotometric method after the reaction with aluminum choride. The total content of phenolic compounds has been evaluated by Folin–Ciocalteu method. The antioxidant activity has been measured using the spectrophotometric method with DPPH, ABTS, CUPRAC, FRAP assays. The content of quercertin and chlorogenic acid has been evaluated by HPLC.
The object the research: The samples of the R. idaeus leaves collected in natural habitats in different parts of Lithuania (n=13), at different stages of vegetation in the same habitat (n=12), and purchased in pharmacies (n=15).
The results of the research: The flavonoid content in raw leaves varied 0,78 - 3,85%. The total content of phenolic compounds in the leaf samples was 22,2 - 116,1 mg/g. The quercertin content in raw leaves was 4,83 to 43,60 µg/g, while chlorogenic acid was 232,45 to 1362,17 µg/g. The antioxidant activity varied: DPPH 173 – 823,36 µmol/g, ABTS 240 - 844,1 µmol/g, CUPRAC 362,8 - 1448,3 µmol/g, FRAP 207,09 - 1045,1 µmol/g.
The conclusions of the research: The total content of flavonoids and phenolic compounds (between the minimum and maximum measured values) in the samples collected at different habitats varied 4,9 and 5,2 times respectively, in the samples of raspberry leaves collected in different stages of vegetation – 2,8 and 1,9 times respectively, in tea samples – 3 and 2,2 times. Strong correlative dependence has been established between the content of the active compounds and the antioxidant activity of the raw sample. HPLC has been utilized to identify and quantify the secondary metabolites, quercetin and chlorogenic acid.
ĮVADAS
Paprastoji avietė (Rubus idaeus L.) yra daugiametis, erškėtinių (Rosaceae) šeimos augalas, plačiai paplitęs visame pasaulyje. Paprastųjų aviečių lapai tradicinėje medicinoje naudojami karščiavimui, menstruaciniams skausmams, pykinimui nėštumo metu mažinti, gimdymo skatinimui, taip pat uždegiminių virškinamojo trakto ligų atvejais, bei burnos ir gerklės skalavimui, rečiau lėtinių odos ligų gydymui.
Vieni svarbiausių junginių, lemiančių paprastųjų aviečių poveikį, yra fenoliniai junginiai, kurie taip pat pasižymi ir antioksidantiniu poveikiu. Fenoliniai antioksidantai gali surišti laisvuosius radikalus, susijungti su prooksidantinių savybių turinčiais junginiais, sąveikauti su laisvųjų radikalų atsiradimą sukeliančiomis sistemomis ar sustiprinti vidinių antioksidantų poveikį, taip sukeldami teigiamą fiziologinį poveikį žmogaus organizmui. Biologiškai aktyvių junginių kokybiniai ir kiekybiniai sudėties pokyčiai gali sukelti fiziologinio - farmakologinio poveikio pakitimus, todėl fitocheminės sudėties pokyčiai turi didžiausią reikšmę augalinės žaliavos kokybės įvertinimui. Skirtingose augavietėse surinktų aviečių lapų cheminė sudėtis ir biologiškai aktyvių junginių kiekis jose gali kisti. Kiekybiniai ir kokybiniai rodikliai taip pat gali pakisti augalo vegetacijos metu, vykstant įvairiems biocheminiams procesams ir veikiant išoriniams aplinkos veiksniams.
Paprastųjų aviečių augalai sudaro apie 10,9 proc. Lietuvoje augančių uoginių augalų sąžalynų ploto. Aviečių nacionaliniai resursai yra dideli, todėl aviečių lapuose sukaupiamų junginių įvairavimo tyrimai gali duoti pridėtinės vertės siekiant racionaliai išnaudoti šiuos išteklius. Racionalus vaistinės augalinės žaliavos paruošų vykdymas gali padėti užtikrinti tausojantį augalų nacionalinių išteklių naudojimą, apsaugoti juos nuo niokojimo bei išsaugoti biologinę įvairovę [1]. Fitocheminių žinių praplėtimas apie kiekybinių rodiklių kitimą aviečių lapų žaliavose taip pat gali paskatinti naujų fitopreparatų kūrimą. Šio tyrimo metu siekiama įvertinti vaistinės žaliavos fitocheminę sudėtį, antioksidantinį aktyvumą ir jų kintamumą skirtingose augavietėse surinktuose mėginiuose bei skirtingais vegetacijos tarpsniais rinktuose aviečių lapų ėminiuose. Siekiant įvertinti Lietuvoje augančių aviečių lapų tinkamumą vaistinės augalinės žaliavos paruošų vykdymui, skirtingose augavietėse nustatyti rezultatai lyginami su vaistinėse įsigytomis aviečių lapų arbatomis.
Darbo naujumas – nustatytas suminių fenolinių junginių ir flavonoidų kiekių pasiskirstymas ir antioksidantinio aktyvumo įvairavimas paprastųjų aviečių lapų žaliavose surinktose skirtingose augavietėse. Pirmą kartą plačiau ištyrinėtas fenolinių junginių ir flavonoidų bei antioksidantinio aktyvumo kitimas vegetacijos tarpsniais surinktuose mėginiuose bei skirtingų gamintojų paprastųjų aviečių lapų arbatose. Pirmą kartą nustatytas aviečių lapų ekstraktų redukcinis aktyvumas.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas – ištirti natūraliai augančių paprastųjų aviečių lapų flavonoidų ir fenolinių junginių kiekinės sudėties ir antioksidantinio aktyvumo įvairavimą bei palyginti rezultatus su vaistinių asortimente esančių arbatų fitocheminės sudėties rodikliais.
Darbo uždaviniai:
1. Ištirti natūraliai augančių paprastųjų aviečių lapų flavonoidų ir fenolinių junginių kiekinės sudėties įvairavimą.
2. Nustatyti paprastųjų aviečių lapų flavonoidų ir fenolinių junginių kiekinės sudėties dėsningumus augalo vegetacijos periodo metu.
3. Ištirti paprastųjų aviečių lapų arbatų flavonoidų ir fenolinių junginių kiekius ir jų įvairavimą skirtingų gamintojų ėminiuose.
4. Įvertinti paprastųjų aviečių lapų etanolinių ekstraktų antiradikalinį ir redukcinį aktyvumą in vitro.
5. ESC metodu ištirti kvercetino ir chlorogeno rūgšties kiekio įvairavimą paprastųjų aviečių lapuose.
6. Palyginti natūraliai augančių lapų ėminių tyrimo metu nustatytus fitocheminės sudėties rodiklius su vaistinėje įsigytomis aviečių lapų arbatų rodikliais.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Rubus idaeus morfologija ir paplitimas.
Paprastoji avietė (Rubus idaeus) yra daugiametis 1-2 m aukščio puskrūmis, priskiriamias erškėtinių (Rosaceae) šeimai.
Aviečių augalų stiebai yra dvimečiai. Pirmaisiais metais išauga ~ 2 metrų aukščio nešakoti stiebai, turintys plunksninius lapus. Pirmaisiais metais augalas dažniausiai nežydi. Antraisiais metais, stiebai šakojasi, atsiranda smulkesnių lapelių. Stiebai būna statūs bei apvalūs, laipiojantys arba gulsti, nusvirusiomis viršūnėmis, dygliuoti. Šaknys daugiametės, labai išsišakojusios bei gulsčios. Ūgliai žalsvi, kartais su melsvomis apnašomis, apaugę trumpais plaukeliais bei šereliais, dygliuoti. Lapai sudėtiniai, neporiškai plunksniški, sudaryti iš 3-7 lapelių dantytais kraštais. Lapeliai smailiomis viršūnėmis, kiaušiniški, apvaliu pamatu. Lapų viršutinė pusė žalia, apatinė balkšva nuo gausių plaukelių.
Avietės žydi gegužės – birželio mėnesiais. Taurėlapiai baltai žalsvi. Žiedai sudaryti iš 5 nedidelių, nukarusių baltos spalvos vainiklapių. Žiedai yra dvilyčiai, apdulkinami vabzdžių. Vaisiai subręsta liepą – rugpjūtį. Vaisius sudėtinis, sudarytas iš daugelio sultingų kaulavaisių. Prinokęs vaisius raudonas, saldaus skonio. Skinant vaisių, jis atsiskiria nuo šerdies, todėl vaisius lieka tuščiaviduris [2–4].
1 pav. Paprastoji aviete (Rubus idaeus L.) http://www.pfaf.org, http://tryonfarm.org
Paprastoji avietė paplitusi Europoje, centrinėje ir pietų Azijoje, Šiaurės Amerikoje. Avietės auga spygliuočių, lapuočių ir mišriuose miškuose. Dažniausiai avietės auga lengvame, bet azotu praturtintame bei drėgname dirvožemyje. Didžiausi sąžalynai susidaro gerai apšviestose miškų kirtavietėse, pamiškėse,
miškų aikštelėse, gana retuose miškuose. Paprastųjų aviečių augalai sudaro apie 10,9 proc. Lietuvoje augančių uoginių augalų sąžalynų ploto [1,3,4].
1.2. Rubus idaeus fitocheminė sudėtis
Aviečių uogose nustatytos fenolinės rūgštys (elago rūgštis ir jos dariniai, p – kumaro, ferulinė, kavos, p - hidroksibenzoinė rugštis), flavonoidai (kvercetinas ir jo gliukozidai), taninai, sangvininas, lambertianinas, proantocianidinai, askorbo rūgštis [5–9].
Lapuose nustatyti polifenoliniai antriniai metabolitai, daugiausia hidrolizuojami taninai (galotaninai, dimeriniai ir tetrameriniai elagotaninai). Lapuose yra flavonoidų (kemferolis ir jo glikozidai (kempferol-3-O-β-D-galaktopiranozidas, kempferol-3-O-β-larabinopiranozidas, kempferol-3-O-β-D gliukozidas), kvercetinas ir jo glikozidai (kvercetin-3-O-β-D glukopiranozidas, kvercetin 3-O-β-D galaktopiranozidas), izokvercetinas, hiperozidas, rutinas (kvercetin -3- rutinozidas)) ir labai nedidelis kiekis eterinių aliejų (priklausomai nuo augalo vegetacinio laikotarpio). Taip pat identifikuoti terpenoidai (monoterpenoidai, seskviterpenoidai, triterpenoidai), vitaminai C ir E, fenolinės rūgštys (kavos, kumaro, ferulinė, cholinerginė, protokatecheininė, gentisinė, p-hidroksibenzoinė, vanilinė), mineralinės medžiagos (kalcis, magnis, cinkas), alkoholiai (oktanolis, n – butanolis, 3- heksenas), aldehidai (benzaldehidas, heksanalis ir kt.) [9–13].
Paprastosios avietės fitocheminė sudėtis bei kaupiamų junginių kiekiai gali varijuoti dėl genetinių skirtumų - avietei būdingas genetinis polimorfizmas. Laukinės avietės genetinę įvairovę didina ir lengvas kryžminimasis su kitais Rosaceae šeimos augalais. Yra nurodoma, jog aviečių fitocheminei sudėčiai turi įtakos ir augalo amžius, augavietė, aplinkos sąlygos, stresiniai veiksniai, pavyzdžiui, saulės radiacija, aplinkos temperatūra, virusai [6,14].
Lietuvoje buvo vykdomi epizodiniai aviečių lapų tyrimai. A. Dagilytė (2001 m.) Lietuvoje atlikto tyrimo metu, Kauno regione rinktuose paprastųjų aviečių lapuose bendras flavonoidų kiekis kito nuo 0,32 iki 0,5 proc, o analizuojant pramoninius aviečių lapų pavyzdžius nustatyta vidutiniškai 15,1 mg% rutino, 25,3 mg% hiperozido, 9,6 mg% kvercetino ir 5mg% kemferolio. Tiriant skirtingais vegetacijos tarpsniais rinktus mėginius (n=5) nustatytas didžiausias rutino kiekis siekė 16,49 mg% (rugsėjo mėn. surinktame mėginyje), hiperozido – 43,9 mg% (gegužės pradžioje rinktame mėginyje), kvercetino 15 mg% (birželį – liepą rinktuose mėginiuose) [12]. 2006 m., Lietuvoje atliktas P.R. Venskutonis ir kt. tyrimas su 41 aviečių lapų mėginiais surinktais iš natūralių augimviečių [15]. Mėginiai surinkti ir pasodinti priesmėlio
dirvožemyje, botanikos instituto teritorijoje bei kultivuoti vienodomis sąlygomis. Spektrofotometrinės analizės metu nustatytas suminis fenolinių junginių kiekis sudarė nuo 4,8 iki 12,03 mg/g, o ESC/UV/MS analizės metu identifikuoti flavonoidai: kvercetino gliukoronidas, kvercetin – O – gliukozidas ir rutinas. 2014 m. J. Bajer Lietuvoje atlikto tyrimo metu, vidutinis flavonoidų kiekis skirtingose augavietėse rinktuose aviečių lapuose (n=7) sudarė 1,62 proc., fenolinių junginių kiekis - 3,25 proc., chlorogeno r. kiekis - 2702 µg/g. Analizuoti aviečių lapų mėginiai surinkti Kauno regione [16].
Aviečių lapų ėminiai tirti ir kitų šalių autorių atliekamų tyrimų metu. V.S. Nikitina ir kt.(2000, Rusija) vykdyto tyrimo metu tirti 4 aviečių veislių lapų bandiniai iš centrinio Volgos regiono Rusijoje (mėginiai surinkti gegužės ir spalio mėn.)[10]. Tyrimo metu bendras flavonoidų kiekis kito nuo 2,8 iki 5,6 proc. Lyginant skirtingais mėnesiais surinktus mėginius nustatyta, jog flavonoidų kiekis rugsėjo mėn. tirtose veislėse nukrito vidutiniškai 22 proc. J.Gudej ir kt. 2004 m. Lenkijoje atliko spektrofotometrinį tyrimą, kurio metu nustatytas bendras flavonoidų kiekis ir atlikta ESC analizė su 2 laukinių aviečių mėginiais ir 13 kultivuotų paprastųjų aviečių veislių mėginių [11]. Bendras flavonoidų kiekis kito nuo 0,5 iki 0,92 proc, kemferolio kiekis 0,17 - 0,31, kvercetino 0,10 - 0,32 proc., hiperozido 0,5 – 0,8 proc.
Publikuotų tyrimų metu daugiausia analizuoti skirtingų veislių aviečių lapų mėginiai. Ištyrus mėginius iš daugelio augaviečių (41 ėminys), nebuvo įvertintas aplinkos sąlygų poveikis bei augavietės ar regiono įtaka veikliųjų junginių kiekiui mėginyje. Ankstesnių tyrimų metu taip pat nenustatyti
fitocheminės sudėties kitimo dėsningumai vegetacijos tarpsniais.
1.3. Paprastųjų aviečių panaudojimas medicinoje ir farmacijoje
Paprastoji avietė (Rubus idaeus L.) yra tradicinis augalas vartojamas visoje Europoje, Šiaurės Amerikoje, vidurinėje Azijoje. Duomenis apie paprastosios avietės vartojimą gydymo tikslais siekia VI a. ir ankščiau. Tradicinis vartojamas aprašytas įvairiose knygose, moksliniuose straipsniuose [13].
Tradicinėje kinų medicinoje paprastoji avietė naudojama kaip diuretinė priemonė. Diuretinis poveikis įrodytas tyrimais su žiurkėmis - vaisių ekstraktai didino išskiriamo šlapimo kiekį bei, lyginant su diuretiku hidrochlortiazidu, pasižymėjo kalį tausojančiu poveikiu [17]. Nustatytas ir antimikrobinis vaisių ekstraktų poveikis. Nustatyta, jog aviečių vaisių ekstraktai slopino gram neigiamų bakterijų augimą, o didesni ekstrakto kiekiai slopino Lactobacillus, silpnai slopino Bifidobacterium lactis bei visiškai slopino Salmonella typhimurium bakterijų augimą [18]. Manoma, jog vaisių ekstraktai taip pat turi antivėžinį ir antiuždegiminį poveikį [19].
Paprastųjų aviečių lapai tradicinėje medicinoje naudojami menstruaciniam skausmams, karščiavimui, pykinimui nėštumo mažinti, gimdymo skatinimui, taip pat uždegiminių virškinamojo trakto ligų atvejais, bei burnos ir gerklės skalavimui, rečiau lėtinių odos ligų gydymui. Atlikus in vivo ir in vitro tyrimus su aviečių lapų preparatais, nustatytas lygiuosius raumenis atpalaiduojantis (daugiausia tyrinėjamas gimdos raumenis atpalaiduojantis poveikis) bei antioksidantinis poveikiai. Sutraukiantį, viduriavimą mažinantį poveikį bei vietinį priešuždegiminį poveikį burnos ir ryklės gleivinei įrodančių mokslinių tyrimų nėra atlikta [13].
Literatūros šaltiniuose skelbiami 2 klinikiniai tyrimai atlikti su žmonėmis. Pirmajame tyrime (Parsons ir kt., 1999) dalyvavo 108 besilaukiančios moterys: 57 vartojo aviečių lapų preparatus, 51 sudarė kontrolinę grupę. Moterys vartojo įvairias aviečių lapų preparatų dozes (nuo 1 iki 8 aviečių lapų tablečių arba tiek pat puodelių aviečių lapų arbatos) nuo 1 iki 32 nėštumo savaitės. Antrojo tyrimo (Simpsons ir kt., 2001) metu, nėščios moterys vartojo aviečių lapų tabletes (2,4 g/d) nuo 32 nėštumo savaitės iki pat gimdymo. Antrasis tyrimas buvo dvigubai aklas, randomizuotas, kontroliuojamas placebu. Iš viso tyrime dalyvavo 192 moterys (96 moterys vartojo aviečių lapų produktus ir 96 buvo placebo grupėje). Pirmojo tyrimo metu, aviečių lapų preparatai sutrumpino trečiąją gimdymo stadiją [20], o antrojo tyrimo metu - reikšmingai sutrumpino antrą gimdymo stadiją bei sumažino skubaus cezario pjūvio poreikio dažnumą (duomenys statistiškai reikšmingi) [21]. Abiejų tyrimų metu nenustatyta jokių šalutinių poveikių gimdyvei ar naujagimiui, tačiau šių tyrimų nepakanka įvertinti aviečių lapų naudojimo saugumo nėštumo ir gimdymo metu, todėl aviečių lapų preparatų kol kas nerekomenduojama vartoti nėščioms ir maitinančioms moterims [13,22].
Nors eksperimentinių duomenų apie visas paprastųjų aviečių lapų vartojimo indikacijas trūksta, tačiau iki šiol gauti farmakologinio poveikio tyrimų rezultatai neprieštarauja ilgalaikio tradicinio vartojimo metu susiformavusioms indikacijoms [13].
1.4. Fenolinių junginių charakteristika ir nustatymas
Fenolinių junginių charakteristika. Fenoliniai junginiai - tai biologiškai aktyvios molekulės, randamos augaluose bei augalinės kilmės maisto produktuose (vaisiuose, daržovėse, uogose, meduje). Šie junginiai yra antriniai augalų metabolitai, susidarantys tiek normaliomis, tiek stresinėmis sąlygomis [23]. Kol kas yra identifikuota apie 8 tūkst. įvairios struktūros fenolinių junginių [24].
Polifenoliniai junginiai sudaryti iš vieno ar kelių benzeno žiedų, prisijungusių mažiausiai vieną hidroksilo grupę [5,23]. Šiai junginių grupei priskiriamos tiek paprastos molekulės, tiek sudėtingos polimerinės medžiagos, todėl fenoliniai junginiai gali būti klasifikuojami įvairiai, pavyzdžiui, pagal tirpumą, paplitimą, cheminę sandarą, poveikį žmogaus organizmui [24,25]. Pagrindinėmis fenolinių junginių grupėmis laikomos fenolinės rūgštys, flavonoidai ir taninai (rauginės medžiagos) [26].
Fenolinės rūgštys pagal cheminę sandarą, gali būti skirstomos į benzoinės (galo rūgštis, vanilinė, p - hidroksibenzoinė, protokatechininė ir kt.) ir cinamono (kumaro, kavos, ferulinė ir kt.) rūgščių poklasius [24,25,27,28]. Fenolinės rūgštys įeina į hidrolizuojamųjų taninų, ligninų kompleksines struktūras arba yra susijungusios su organinėmis rūgštimis, cukrais, rečiau aptinkamos laisvos formos [5,25]. Fenolinės rūgštys dažniausiai identifikuojamos esterinėse struktūrose - susijungusios su ciklinėmis alkoholinėmis rūgštimis, pavyzdžiui, su kvinine rūgštimi suformuojama izochlorogeninė ir neochlorogeninė rūgštis, kripto chlorogeninė ir chlorogeninė rūgštys [25].
Žinoma, jog fenolinės rūgštys ir jų esteriai turi stiprių antioksidantinių savybių. Šiuo poveikių ypač pasižymi hidroksibenzoinė rūgštis, hidroksicinamoninė rūgštis, kavos ir chlorogeno rūgštys [25]. Taip pat yra duomenų apie fenolinių rūgščių antimutageninį, antivirusinį, antibakterinį, keratolitinį, estrogeninį aktyvumą [29].
Taninai yra didelės molekulinės masės junginiai, kurie skirstomi į hidrolizuojamuosius (galotaninai ir elagotaninai) bei kondensuotosius taninus (proantocianidinus) [25][26]. Hidrolizuojami taninai sudaryti iš cukrinės dalies šerdies (gliukozės ar kito angliavandenio, turinčio daug hidroksi grupių), kuri esterifikuota galo rūgštimi (galotaninai) ar heksahidroksidifeine rūgštimi (elagotaninai) [24]. Veikiant fermentams ar pH pokyčiams šie taninai gali skilti į fenolines rūgštis ir cukrines dalis [8]. Taninai gali oksiduotis ir sudaryti didesnės molekulinės masės junginius (oligomerus) [24]. Kondensuotiems taninams priskiriami oligomerai ir polimerai. Ši junginių grupė dažnai vadinama proantociadininais (dėl jų skilimo į antociadininus rūgštinės hidrolizės metu) [24].
Taninai dažniausiai aptinkami susijungę su alkaloidais, polisacharidais, baltymais [8]. Šie junginiai nėra absorbuojami virškinamojo trakto gleivinėje, todėl laikomi netirpiais antioksidantais. Manoma, jog dėl šios savybės taninai gali turėti stiprų antioksidantinį poveikį virškinamajame trakte ir apsaugoti lipidus, karbohidratus, baltymus nuo oksidacinio streso virškinimo metu [25].
Flavonoidai yra plačiausia ir labiausiai tyrinėjama polifenolinių junginių grupė. Kolkas yra išskirta ir identifikuota apie 4000 flavonoidų, tačiau tobulėjant analizės metodams ir daugėjant tyrimų, šis skaičius tik didėja [30].
Flavonoidai susidaro augalinės kilmės ląstelėse ir atlieka tam tikras funkcijas – žiedams suteikia spalvą, dalyvauja augalo jutiminiuose, energijos perdavimo, hormonų ir augimo faktorių veikimo, kvėpavimo, fotosintezės, morfogenezės procesuose [31].
Flavonoidai turi flavano branduolį, sudarytą iš 15 anglies atomų, išsidėsčiusių trimis žiedais (A,B,C)[24]. A ir B benzeno žiedai yra sujungti per C heterociklinį pirano žiedą (benzilbenzopirano funkcinė grupė) [32](2 pav.).
Flavonoidai gali būti skirstomi į poklasius pagal C žiedo oksidacijos laipsnį: flavonus (apigeninas, liuteolinas), flavononus (hesperitinas, naringeninas), flavonolius (kvercetinas, mircetinas, kemferolis, rutinas), flavanolius (katechinus), izoflavonus (genistinas), antocianidinus (pelargonidinas, petunidinas) (2 pav.)[5,24,26]. Įvairios flavonoidų struktūrinio pagrindo modifikacijos, pavyzdžiui, metilo grupių prijungimas, hidroksilinimas, glikozilinimas lipoflinių grupių prijungimas, suteikia didelę flavonoidų įvairovę [24].
2 pav. Flavonoidų poklasiai [30]
Augaluose flavonoidai aptinkami laisvi (aglikonai) ir susijungę su cukrais (glikozidai). Dažniausiai flavonoidai randami β – glikozidų pavidalu (išskyrus katechinus) [30]. Glikozidai pagal cukrinės dalies prisijungimo vietą gali būti skirstomi į O – glikozidus ir C - glikozidus. Daugiausia susidaro O - glikozidų, kuriuose cukrus prisijungęs prie aglikono hidroksilo grupės (įprastai C3 ar C7 padėtyje). C - glikoziduose cukrinė dalis prisijungusi prie aglikono anglies atomo C6 ar C8 padėtyse. Dažniausiai cukrinė dalis yra gliukozė, galaktozė, arabinozė, ramnozė, tačiau gali būti ir kitų cukrų. Cukrai daugiausiai prisijungę kaip mono ir disacharidai, rečiau tricacharidai [33–35].
In vitro ir in vivo tyrimais nustatyta, jog flavonoidai pasižymi antigrybeliniu, antivirusiniu, antibakteriniu, priešuždegiminiu, antiateroskleroziniu hepatoprotekciniu, antialerginiu, antitromboziniu aktyvumu. Manoma, jog daugumos flavonoidų sukeliamas fiziologinis poveikis pasireiškia dėl antioksidantinio veikimo (tiesioginio ir netiesioginio) ir poveikio įvairioms fermentinėms funkcijoms (kinazėms, fofolipazei A2 ir fofolipazei C, lipoksigenazėms, oksigenazėms ir kt.) [31,36–38].
Fenolinių junginių nustatymas. Siekiant įvertinti fenolinių junginių kokybinę ir kiekybinę sudėtį, vykdomas veikliųjų junginių išskyrimas iš augalinės žaliavos. Mėginiai pirmiausia homogenizuojami (skystų mėginių atveju – filtruojami ir centrifuguojami), valomi, tada vykdoma analičių ekstrakcija ir analizė [35].
Ekstrakcija. Fenolinių junginių ekstrakcijai įtakos turi pasirinktas ekstrakcijos metodas, mėginio laikymo ir paruošimo sąlygos, balastinės medžiagos mėginyje, fenolinių junginių cheminės savybės (poliariškumas, struktūra, hidroksi grupių skaičius ir kt.) bei mėginio prigimtis. Fenoliniai junginiai iš žaliavų dažniausiai išskiriami įvairiais organiniais ir neorganiniais tirpikliais bei jų mišiniais: metanoliu, etanoliu, acetonu, vandeniu, etilacetatu, rečiau propanoliu, dimetilformadidu [23,39]. Ekstraktuose gausu įvairių balastinių medžiagų (vaškų, riebalų, terpenų ir kt.) bei kitų fenolinės struktūros junginių, todėl ekstraktus reikia papildomai valyti [23]. Ekstrakcijos sąlygos (laikas, temperatūra, tirpiklis ar jų sistema ir kt.) pasirenkamos atsižvelgiant į tiriamosios augalinės žaliavos, bei siekiamų išekstrahuoti junginių savybes, todėl kiekvienai fenolinių junginių grupei gali būti skirtingos [39]. Siekiant išskirti individualius junginius, ekstraktai paprastai veikiami rūgštimis, šarminėmis medžiagomis ar fermentais, sukeliant glikozidų hidrolizę į aglikoną ir cukrinę dalį [33].
Fenoliniai junginiai iš mėginių ekstrahuojami soksleto aparatu ar vykdant maceraciją, tačiau vis daugiau dėmesio sulaukia pažangesni ekstrakcijos metodai - ekstrakcija ultragarso bangomis, mikrobangomis ar ultragarso – mikrobangomis, superkritinių skysčių ekstrakcija, aukšto hidrostatinio slėgio ekstrakcija ir kt. Naudojant pažangesnius ekstrakcijos metodus sutrumpėja ekstrakcijos laikas, sumažėja balastinių medžiagų ekstrakcija, tirpiklio sąnaudos [39].
Fenoliniai junginiai, cheminiu požiūriu, yra labai plati junginių grupė, todėl vieningo metodo šių junginių nustatymui nėra [6]. Analizės metu siekiama įvertinti bendrą fenolinių junginių kiekį bei kokybiškai ir kiekybiškai įvertinti atskiras fenolinių junginių grupes ar individualius junginius [24]. Dažniausiai naudojami spektrofotometriniai analizės metodai bei pažangesni analizės metodai – dujų chromatografija, efektyvioji skysčių chromatogafija ar jų deriniai su kitais metodais [23].
Spektrofotometriniai metodai naudojami suminio fenolinių junginių kiekio nustatymui augalinėje žaliavoje. Dažniausiai naudojami metodai yra Folin-Denis ir Folin-Ciocalteu. Šie metodai pagrįsti
redukcijos reakcija (naudojami ją sukeliantys reagentai). Tirpalai įgauna mėlyną spalvą ir užrašomi jų absobcijos spektrai esant 760 nm bangos ilgiui. Reagentai nėra specifiniai, todėl reakciją gali sukelti ir kitos medžiagos (cukrai, aromatiniai aminai) [39].
Spektrofotometriniai metodai naudojami ir flavonoidų kiekio įvertinimui augalinėje žaliavoje. Visi flavonoidų aglikonai turi bent vieną aromatinį žiedą, todėl absorbuoja elektromagnetinę spinduliuotę. Flavonoidų spektrams būdingi du maksimumai. Pirmasis A žiedo maksimumas užfiksuojamas esant 240 – 285 nm bangos ilgiams, antrasis 300-550 nm bangos ilgių srityje ir yra priskiriamas pakaitams bei C žiedo konjungacijai. Paprasti pakaitai (metil, metoksi ir nedisocijuotos hidroksi grupės) tik minimaliai veikia absorbcijos maksimumą [34,35].
Efektyvioji skysčių chromatografija (ESC) yra tikslus ir perspektyvus metodas fenolinių junginių kiekybiniam ir kokybiniam įvertinimui augalinėje žaliavoje. Šis metodas tinkamas visoms flavonoidų grupėms nustatyti. Dažniausiai atliekama atvirkštinių fazių chromatografija, naudojant C8 ir C18 kolonėles [35,40]. Kolonėlės ilgis varijuoja nuo 100 iki 250 mm, o diametras nuo 3,9 – 4,6 mm [35]. Šio metodo pagalba labiau poliniai komponentai eliumuojami greičiau nei mažiau poliniai. Naudojamas tiek izokratinis, tiek grandientinis eliumavimas [35]. Gradientiniam eliumavimui atlikti dažniausiai naudojamos dviejų tirpiklių sistemos, pavyzdžiui, vanduo ir metanolis ar acetonitrilas [28,34].
Efektyvioji skysčių chromatografija dažnai derinama su spektrofotometriniais metodais. Naudojami UV detektoriai, matuojantys iš kolonėlės išplautų analičių regimosios ar ultravioletinės šviesos absorbciją. ESC apjungiant su UV, masių ar branduolių magnetinio rezonanso detektoriais, padidėja efektyviosios skysčių chromatografijos metodo galimybės – to paties bandymo metu junginius galima atskirti, identifikuoti ir įvertinti kiekybiškai [35].
1.5. Antioksidantinis aktyvumas ir jo įvertinimo metodai
Laisvieji radikalai ir antioksidantinis aktyvumas. Oksidacijos proceso metu susidaro laisvieji radikalai. Tai reaktyvios dalelės (atomai ar molekulės), turinčios nesuporuotų elektronų. Radikalai, greitomis mainų reakcijomis, gali destabilizuoti kitas molekules ir taip sukurti dar daugiau laisvųjų radikalų.
Reaktyvieji deguonies ir azoto radikalai (ROS ir RNS) gali reaguoti su baltymais, DNR, RNR, lipidais ar kitomis makromolekulėmis ir neigiamai paveikti jų biologines funkcijas (sukeliamas oksidacinis stresas) [5]. Viena geriausiai žinomų oksidacinio streso priežasčių yra lipidų peroksidacija. Vykstant šiam procesui, pažeidžiama ląstelės membrana, pasikeičia osmosinis slėgis, ląstelės tūris padidėja, galiausiai
ląstelė žūva. Laisvieji radikalai taip pat gali pritraukti įvairius uždegimo mediatorius, taip sukeldami uždegimą ir audinių pažeidimą [36]. Aktyviųjų deguonies radikalų sukeltas oksidacinis stresas siejamas su tam tikrų degeneracinių ligų (aterosklerozės, cukrinio diabeto, reumatoidinio artrito, autoimuninių ligų, neurodegeneracinių ligų, tam tikrų vėžio tipų) vystymuisi [5,41].
Gyvieji organizmai, siekdami apsisaugoti nuo radikalų poveikio, išvystė fermentinius (superoksido dismutazė, katalazė, glitationo peroksidazė) ir nefermentinius (glutationas, askorbo rūgštis, α- tokoferolis) apsaugos kelius [36]. Susidarius daugiau radikalinių junginių, sumažėja vidinių antioksidantų, todėl atsiranda papildomų antioksidantiniu veikimu pasižyminčių junginių poreikis [42].
Vieni geriausiai žinomų antioksidantų - fenoliniai junginiai. Fenoliniai antioksidantai gali surišti laisvuosius deguonies, azoto ir chloro radikalus, metalų jonus, taip pat susijungti su prooksidantinių savybių turinčiais junginiais, sąveikauti su laisvųjų radikalų atsiradimą sukeliančiomis sistemomis ar sustiprinti vidinių antioksidantų poveikį, taip sukeldami teigiamą fiziologinį poveikį žmogaus organizmui [5,36].
Antioksidantinio aktyvumo įvertinimas. Antioksidantinės galios tyrimo rezultatai priklauso nuo veikliųjų junginių komplekso tiriamuosiuose ekstraktuose bei pasirinkto tyrimo metodo [43]. Vienas iš būdų, skirtų nustatyti mėginio antioksidantinį aktyvumą – antioksidanto ir stabilaus oksidanto reakcijos įvertinimas. Šie tyrimai in vitro yra pagrįsti elektronų arba vandenilio atomo pernaša [41,44]. Elektronų perdavimu paremtuose tyrimuose vyksta viena redokso reakcija su oksidantu (antioksidantas atiduoda elektroną ir oksiduojasi), kuri naudojama kaip indikatorius reakcijos pabaigai nustatyti (pasikeičia tirpalo spalva). Tirpalo spalvos pasikeitimo intensyvumas siejamas su mėginyje esančia antioksidanto ar antioksidantų komplekso koncentracija [44]. Dažniausiai naudojami elektronų perdavimo reakcijomis pagrįsti antioksidantinio aktyvumo nustatymo metodai yra DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil) radikalų surišimo metodas, ABTS (2,2'-azino-bis (3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgštis) radikalų - katijonų surišimo metodas, geležies redukcijos antioksidantinė galios (FRAP) ir vario redukcijos antioksidantinė galios (CUPRAC) nustatymo metodai. Metodai tarpusavyje skiriasi reakcijos mechanizmu, taikiniu, reakcijos sąlygomis [44]. DPPH ir ABTS metodu gali būti perduotas ir vandenilio atomas [45].
Vandenilio atomo perdavimu pagrįstuose metoduose naudojama konkurencinių reakcijų kinetika (oksidantas ir antioksidantas konkuruoja dėl radikalų), o rezultatas įvertinimas iš kinetinių kreivių. Dažniausiai naudojami metodai yra šie: mažo tankio lipoproteinų oksidacijos inhibavimas, deguonies radikalų absorbcijos galios nustatymas (ORAC) [44–46].
Abiejų tipų metodai analizuoja mėginio redukcines ar oksidacines galimybes neutralizuoti laisvuosius radikalus, bet neįvertina mėginio savybių radikalų atsiradimo prevencijai (aktualu biologinėse sistemose). Tai vienas iš pagrindinių antioksidantinių metodų trūkumų. Vieno metodo mėginio įvertinimui
nepakanka, nes augalinės kilmės mėginiuose yra įvairiais poveikiais pasižyminčių antioksidantų, todėl naudojant kelis antioksidantinės galios įvertinimo metodus gaunami labiau informatyvūs rezultatai [44].
ABTS radikalų-katijonų surišimo metodas. Tyrimo metu naudojamas ABTS reagentas (3-etil-benzotiazolin-6-sulfoninė rūgštis). ABTS yra peroksidazės substratas, oksidatoriaus aplinkoje pereinantis į intensyviai mėlynos spalvos metastabilų katijoną (ABTS.+)[46]. Šis metodas parodo antioksidantinės
medžiagos pajėgumą neutralizuoti ABTS katijonus, palyginant su standartu – troloksu (vitamino E analogu)(3 pav.). Antioksidantinė galia išreiškiama trolokso ekvivalentais (TE µmol/l) [46].
ABTS tirpus tiek vandenyje, tiek etanolyje, todėl su šiuo metodu galima nustatyti lipofilinius ir hidrofilinius junginius [47]. ABTS radikalai gali būti gaunami reagentą veikiant fermentinėmis (pavyzdžiui, peroksidazėmis, mioglobinu) arba cheminėmis (magnio dioksidu, kalio persulfatu ir kt.) medžiagomis [48]. Radikalams pasigaminti reikalingas ilgas laiko tarpas (naudojant kalio persulfatą – 16 valandų) [44]. Tiriamieji junginiai sumaišomi su ABTS tirpalu jau pasigaminus radikalams, jog būtų išvengta antioksidanto poveikio radikalų susidarymui [48]
Tirpalą su radikalais sumaišius su antioksidantu, po tam tikro laiko matuojamas absorbcijos maksimumas. Jei naudojama vandeninė terpė, matuojama esant 414, 645, 734 ar 815 nm bangos ilgiams, tačiau optimaliausia matavimus atlikti esant 734 nm bangos ilgiui, nes esant tokiam bangos ilgiui, rezultatus mažiau veikia kiti absorbuojantis junginiai (ne antioksidantai) ir mažiau įtakos turi galimas tirpalo drumstumas. Naudojant lipofilinę terpę matavimai atliekami esant 414, 730, 873 nm bangos ilgiams [46,48]. ABTS tyrimas dažnai naudojamas junginių antioksidantinių savybių įvertinimui, antioksidantų klasifikavimui bei struktūros – aktyvumo ryšio tyrimams biologiniuose ir augaliniuose ruošiniuose [48,49]. Šis tyrimas yra paprastai atliekamas bei nereikalaujantis sudėtingos aparatūros, todėl dažnai naudojamas daugelyje laboratorijų [44,46].
DPPH yra ryškiai violetinės spalvos organinis azoto radikalų šaltinis (4 pav.). Šio radikalo nereikia aktyvinti prieš tyrimo pradžią [45].
Metodas remiasi violetinio chromogeninio radikalo sąveika su antioksidantu. Tirpalų spalva iš ryškiai violetinės spalvos pakinta į blyškiai geltoną spalvą. Šis metodas nesudėtingas, lengvai atliekamas bei nereikalauja sudėtingos aparatūros, taip pat yra galimybė vienu metu tirti daug bandinių (naudojant lėkšteles su šulinėliais) [45,48].
DPPH metodo trūkumas, jog sudėtinga nustatyti hidrofilinius radikalus – DPPH tirpus tik organiniuose tirpikliuose. Rezultatams taip turi įtakos reagento jautrumas šviesai bei organinio tirpiklio pasirinkimas [47].
4 pav. DPPH radikalas [44]
FRAP (geležies jonų redukcijos antioksidantinė galia). Šis metodas paremtas fenolinių junginių gebėjimu geltoną trivalentės geležies kompleksą (Fe(III)-TPTZ) paversti mėlynu dvivalentės geležies kompleksu (Fe(II)-TPTZ) (5 pav.)[43,50]. Geležies druska yra naudojama kaip oksidantas, kurios redokso potencialas panašus į ABTS reagento. Šis metodas panašus į ABTS, tačiau FRAP tyrimai yra atliekami rūgštinėje (siekiant pagerinti geležies tirpumą), o ABTS neutralioje aplinkoje [48].
5 pav. Elektronų perdavimas aktyvaus komplekso (Fe(III)-TPTZ) sąveikos su antioksidantu metu[44]
Antioksidanto sukelta redukcija iš Fe (III) į Fe (II) kompleksą apibūdinama kaip antioksidantinė galia, nes manoma, jog tai atspindi medžiagos gebėjimą neutralizuoti laisvuosius radikalus. Tačiau ne visi junginiai gebantys redukuoti geležies jonus yra antioksidantai. Bet kuri elektronų donorinė medžiaga, turinti mažesnį už Fe(III)/Fe(II) potencialą gali sukelti nepagrįstai dideles rezultatų reikšmes, o kai kurie antioksidantai in vivo gali būti nepajėgūs redukuoti Fe (III) jonų (pvz., glutationas). Taip pat šis metodas neatskleidžia aiškaus ryšio tarp rezultatų ir tiriamojo junginio perduotų elektronų skaičiaus. FRAP metodu negalima nustatyti ir antioksidantų, perduodančių vandenilio atomą (proteinų, tiolių)[51].
FRAP metodas yra greitas, paprastas, patikimas, nebrangus ir nereikalaujantis specialios įrangos. Jis gali būti atliekamas automatiniu, pusiau automatiniu ir neautomatiniu būdais [44,48].
CUPRAC (vario jonų redukcijos antioksidantinės galia). Metodas remiasi mėginyje esančių antioksidantų sukelta Cu (II) redukcija į Cu (I) (6 pav.). Šio tyrimo metu kaip chromogeninis oksidantas naudojamas vario (II) ir neokuproino junginys. Tiriamasis mėginys sumaišomas su vario (II) chloridu, neokuproinu ir amonio acetatu. Po pusės valandos matuojama mišinio absorbcija esant 450 nm bangos ilgiui [51].
6 pav. Cu (II)-neokuproino sąveika su antioksidantu [44]
CUPRAC metodas yra šiek tiek jautresnis nei FRAP. Juo galima nustatyti tiolio tipo antioksidantus, kuriuos sunku nustatyti FRAP metodu (pvz., glutationas). CUPRAC naudojami reagentai yra stabilesni ir lengvai pritaikomi rutininiams matavimams. Taip pat absorbcijos nuo koncentracijos kreivei yra būdingas didesnis linijiškumas nei kitais antioksidantiniais metodais. Šiuo metodu galima nustatyti tiek lipofilinius, tiek hidrofilinius radikalus. Metodas patogus ir dėl trumpo reakcijos laiko, tačiau kaip ir kitais aptartais metodais, jį sunku pritaikyti antioksidantų mišiniui [44,51,52].
2. TYRIMO METODIKA
2.1. Tyrimų objektas
Tyrimų objektas – paprastųjų aviečių lapai. Lapų žaliava surinkta natūraliose augavietėse (7 pav.) bei įsigyta vaistinėse.
7 pav. Tyrimuose naudotų aviečių lapų pavyzdžių apytikslės radavietės. ( http://www.gpsvisualizer.com)
Paprastųjų aviečių lapai surinkti skirtinguose Lietuvos regionuose (n=12) 2013 m. liepos - rugpjūčio mėnesiais (1 priedas).
Paprastųjų aviečių lapų žaliava rinkta skirtingais vegetacijos tarpsniais vienoje augavietėje - Paežerės kaime, Telšių rajone. Iš viso 2014 m. balandžio - spalio mėnesiais surinkta 13 aviečių lapų mėginių.
Vaistinėse (2014 – 2015 m.) įsigytos keturių skirtingų gamintojų ir skirtingų serijų aviečių lapų arbatos (n=15). Arbatų bandiniams suteikti kodai. UAB ,,Švenčionių vaistažolių fabrikas‘‘– skirtingų serijų bandiniai A1, A2, A3, A4; UAB „Acorus calamus“– B1, B2, B3, B4; Dr. P. Karvelio terapijos - fitoterapijos įmonės ,,Dr. Karvelis‘‘„– C1, C2, C3, C4; UAB „Herba Humana“ – „Emili“ arbatos – D1, D2, D3.
2.2. Reagentai ir aparatūra
Aparatūra: augalinė žaliava ir reagentai atsverti analitinėmis svarstyklėmis „Sartorius AG Gottingen CP64 - OCE“ (Vokietija), o ekstrakcija vykdyta ultragarso vonelėje „Elmasonic P“ (Elma,
Vokietija). Mėginių nuodžiūvis nustatytas „Precisa H 300“ aparatu. Mėginių suminio fenolinių junginių ir flavonoidų kiekio bei antioksidantinio aktyvumo nustatymas atliktas spektrofotometru „Beckman DU – 70“ (Backman Coulter, JAV). Chromatografinė analizė atlikta „Waters 2695“ (JAV) chromatografu su „Waters 996 PDA“ (JAV) detektoriumi. Naudota „Sunfire“ C18 5 µm, 4,6 x 150 mm (Airija) kolonėlė, o duomenys apdoroti naudojant „Empower 2 Chromatography Data Software“ (JAV) programą.
Reagentai. Naudotas vanduo išgrynintas „Millipore“ (JAV) vandens valymo sistema. Naudotas 96,3 proc. V/V etanolis (UAB „Stumbras”, Lietuva), ledinė acto rūgštis (UAB „Fasuotos cheminės medžiagos“, Lietuva), aliuminio chlorido heksahidratas („Sigma-Aldrich“, Vokietija), heksametilentetraminas („Lachema“, Čekija), rutino trihidratas („ROTH“, Vokietija), galo rūgšties monhidratas („Sigma-Aldrich“, Vokietija), Folin–Ciocalteu reagentas („Sigma-Aldrich“, Vokietija), natrio karbonatas („ROTH“, Vokietija), vandenilio chlorido rūgštis Aldrich“, Vokietija), troloksas („Sigma-Aldrich“,Vokietija), 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilas (DPPH) („Sigma-Aldrich“, Vokietija), 2,2'-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfoninė rūgštis) (ABTS), kalio persulfatas („Alfa Aesar“, Vokietija), amonio acetatas („Sigma Aldrich“, Vokietija), neokuproinas (2,9- Dimetil – 1,10 - pfenantrolinas) („Alfa Aesar“, Vokietija), vario (II) chlorido dihidratas („ROTH“, Vokietija), natrio acetatas („Sigma-Aldrich“, Vokietija),), geležies (III) chlorido heksahidratas, 2,4,6-tripiridil-s-triazinas (TPTZ) („Alfa Aesar“, Vokietija), acetonitrilas („Sigma-Aldrich“, Vokietija), 2 % acto rūgštis („Sigma-Aldrich“, Vokietija).
2.3. Tyrimų metodai
Tiriamojo mėginio paruošimas. Paprastųjų aviečių lapai džiovinti kambario temperatūroje, nuo tiesioginių saulės spindulių apsaugotoje vietoje. Sausa žaliava susmulkinta elektriniu smulkintuvu. Vaistinėse įsigytos arbatos buvo smulkinamos papildomai.
Ekstraktai ruošti 0,25 g susmulkintos žaliavos užpilus 10 ml 70 % V/V etanolio. Ekstrakcija vykdyta ultragarso vonelėje 10 min, esant 37 Hz bangų dažniui ir 50ºC temperatūrai. Perfiltravus per vatą, žaliava pakartotinai užpilama 10 ml šviežia tirpiklio porcija ir ekstrakcija analogiškomis sąlygomis vykdoma dar 10 min. Trečiąjį kartą pilama 5 ml tirpiklio. Visos trys ekstrakto porcijos surenkamos į 25 ml kolbutę ir 70 % V/V etanoliu skiedžiama iki matavimo brūkšnio. Gauti ekstraktai iš kolbučių perpilami į rudo stiklo buteliukus, sandariai uždaromi ir laikomi kambario temperatūroje, nuo tiesioginių saulės spindulių apsaugotoje vietoje. Iš kiekvieno mėginio paruošta po tris ekstraktus. Rezultatuose pateikti jų matavimų vidurkiai.
Bendro flavonoidų kiekio nustatymas. Tiriamasis tirpalas paruoštas į 10 ml matavimo kolbutę įpylus 1,2 ml žaliavos ekstrakto, 4 ml 96 % V/V etanolio, 0,2 ml 33 % V/V acto rūgšties, 0,6 ml 10 % aliuminio chlorido tirpalo. Tirpalas gerai sumaišomas ir paliekamas tamsioje vietoje. Po 30 min. pilama 0,8 ml 5 % heksametilentetramino tirpalo ir skiedžiama distiliuotu vandeniu iki žymės. Matuojamas paruošto tirpalo absorbcijos dydis esant 407 nm šviesos bangos ilgiui [53].
Palyginamasis tirpalas ruošiamas į 10 ml matavimo kolbutę pilant 1,2 ml etanolinio žaliavos ekstrakto, 4 ml etanolio 96 % V/V etanolio, 0,2 ml 33 % acto rūgšties bei skiedžiant distiliuotu vandeniu iki žymės.
Rutino tiriamasis ir palyginamasis tirpalai ruošiami analogiškai, tik vietoje žaliavos ekstrakto pilama 1,2 ml etaloninio rutino tirpalo.
Etaloninis rutino tirpalas ruoštas 25 mg rutino ištirpinant 50 ml 70 % etanolio. Bendras flavonoidų kiekis apskaičiuojamas pagal formule (1):
(1) Bendras flavonoidų kiekis (proc.) = 𝒎(𝒓𝒖𝒕𝒊𝒏𝒐)𝒙 𝑽(𝑽𝑨Ž)𝒙 𝑫(𝑽𝑨Ž)𝒙 𝟏𝟎𝟎 𝒎(𝑽𝑨Ž) 𝒙 𝑫(𝒓𝒖𝒕𝒊𝒏𝒐) 𝒙 𝟓𝟎
Čia:
m - rutino masė sunaudota etaloninio tirpalo ruošimui (g). V(VAŽ) - vaistinės augalinės žaliavos ekstrakto tūris (ml). D(VAŽ) – tiriamojo tirpalo adsorbcijos dydis.
m(VAŽ) – vaistinės augalinės žaliavos svoris, naudotas ekstraktui paruošti (g). D(rutino) - etaloninio rutino tirpalo adsorbcijos dydis.
Suminio fenolinių jungnių kiekio nustatymas. Suminis fenolinių junginių kiekis R. idaeus L. lapų mėginiuose nustatytas Folin – Ciocalteu metodu [50].
Aviečių lapų ekstraktas skiestas santykiu 1:9 70 % V/V etanoliu. Tiriamasis tirpalas ruošiamas 1 ml skiesto aviečių lapų ekstrakto sumaišant su 5 ml darbinio Folin – Ciocalteu tirpalo (naudojamas dešimt kartų distiliuotu vandeniu praskiestas Folin – Ciocalteu reagentas). Po 4 min. pilama 4 ml 7,5 % natrio karbonato tirpalo, sumaišoma ir paliekama tamsioje vietoje. Palyginamasis tirpalas ruoštas analogiškomis sąlygomis, tik vietoje žaliavos ekstrakto naudota 1 ml 70 % V/V etanolio. Po valandos matuojamas tirpalų absorbcijos dydis esant 765 nm šviesos bangos ilgiui.
Galo rūgšties kalibracinio grafiko sudarymui paruošti 0,01 mg/ml, 0,025 mg/ml, 0,05 mg/ml, 0,075 mg/ml, 0,1 mg/ml koncentracijų standartiniai galo rūgšties tirpalai. Tirpalų absobcijos dydis nustatytas tomis pačiomis sąlygomis kaip ir tiriamųjų ekstraktų.
Suminis fenolinių junginių kiekis vertinimas pagal galo rūgšties kalibracinės kreivės lygtį: y = 10,229x + 0,0184, R² = 0,9981. Apskaičiuojama pagal formulę (2):
(2) Suminis fenolinių junginių kiekis= ((A – 0,0184) / 10,229) x VVAŽ x B / mVAŽ (mg/g)
Čia:
A – tiriamojo tirpalo absorbcijos dydis. VVAŽ - ekstrakto tūris (ml).
B – ekstrakto skiedimas
mVAŽ – sausos žaliavos masė (g)
Antioksidantinio aktyvumo įvertinimo metodai:
DPPH radikalų surišimo geba. Etaloninis tirpalas ruoštas atsveriant 2,4 mg DPPH miltelių ir supilant į 100 ml kolbutę. DPPH milteliai tirpinti 70 % etanolyje V/V, ultragarso vonelėje. Paruošus DPPH tirpalą, laukiama kol nusistovės stabili etaloninio tirpalo absorbcija.
Tiriamasis tirpalas ruošiamas į mėgintuvėlį pilant 3 ml etaloninio DPPH tirpalo ir 20 µl skiesto aviečių lapų ekstrakto. Aviečių lapų etanolinis ekstraktas skiestas santykiu 1:2 70 % etanoliu V/V. Reakcijos mišinys gerai sumaišomas ir paliekamas tamsioje vietoje, kambario temperatūroje. Po 30 min. matuojamas tirpalo absorbcijos dydis esant 515 nm šviesos bangos ilgiui. Pagal trolokso kalibracijos lygtį, apskaičiuojamos absorbcijos pokytį atitinkančios trolokso koncentracijos (µmol/l) bei tiriamųjų ekstraktų antiradikalinis aktyvumas (3 formulė)(µmol/g). Absorbcijos pokytis gautas iš etaloninio DPPH tirpalo absorbcijos dydžio atėmus tiriamojo tirpalo absorbcijos dydį.
ABTS katijonų – radikalų surišimo geba. Pradinis ABTS tirpalas ruošiamas 0,0548 g ABTS miltelių ištirpinus 50 ml distiliuoto vandens (rudo stiklo buteliuke). Po 4 min. beriama 0,0095 g kalio persulfato miltelių. Gautas tirpalas sumaišomas ir paliekamas 16 valandų tamsioje vietoje, kambario temperatūroje [54].
Darbinis ABTS tirpalas gautas praskiedus pradinį tirpalą distiliuotu vandeniu, kol tirpalo absorbcija pasieks 0,8 absorbcijos vienetų. Spektrofotometru matuojama esant 734 nm bangos ilgiui, palyginamasis tirpalas - distiliuotas vanduo.
Tiriamasis tirpalas ruoštas į 3 ml darbinio ABTS tirpalo įpilant 20 µl penkis kartus praskiesto aviečių lapų ekstrakto. Tirpalas sumaišomas ir paliekamas tamsioje vietoje, kambario temperatūroje. Po 60 min. spektrofotometru matuojamas mišinio absorbcijos dydis.
Pagal trolokso kalibracijos lygtį apskaičiuojamos absorbcijos pokytį atitinkančios trolokso koncentracijos (TE µmol/l). Absorbcijos pokytis gautas iš darbinio ABTS tirpalo absorbcijos (0,8) atimant nustatytą tiriamojo tirpalo absorbcijos dydį. Remiantis nurodyta formule (3) apskaičiuojamas tiriamųjų ekstraktų antiradikalinis aktyvumas (µmol/g).
CUPRAC (vario jonų redukcijos antioksidantinė galia). Darbinis CUPRAC reagentas gaunamas sumaišant amonio acetato, neokuproino ir vario (II) chlorido tirpalus lygiomis dalimis. CuCl2 tirpalas
pagamintas atsvėrus 0,4262 g vario (II) chlorido miltelių ir ištirpinus 250 ml distiliuoto vandens. Gaunamas 10 mM koncentracijos tirpalas. 1 M amonio acetato buferis gaminamas atsveriant 19,27 g amonio acetato miltelių ir ištirpinant 250 ml distiliuoto vandens (pH=7,4). 7,5 mM koncentracijos neokuproino tirpalas gaminamas atsveriant 0,039 g neokuproino miltelių ir ištirpinant 96 % etanolyje (skiedžiat matavimo kolbutėje iki 25 ml) [51].
Tiriamasis tirpalas gaminamas į 3 ml darbinio CUPRAC reagento įpilant 20 μl aviečių lapų ekstrakto. Mišinys laikomas tamsoje, kambario temperatūroje 1 val. Spektrofotometru išmatuojama mišinio absorbcija esant 450 nm bangos ilgiui. Palyginamasis tirpalas gaminamas tomis pačiomis sąlygomis, tačiau vietoje ekstrakto pilama 70 % V/V koncentracijos etanolio. Pagal kalibracijos lygtį apskaičiuojamos absorbcijos dydį atitinkančios trolokso koncentracijos (µmol/l) bei vario jonų redukcijos antioksidantinė galia ( remiantis 3 formule)(µmol/g).
FRAP (geležies jonų redukcijos antioksidantinė galia). Darbinis FRAP tirpalas ruošiamas iš trijų tirpalų: 250 ml acetatinio buferio sumaišoma su 25 ml TPTZ tirpalo ir 25 ml 20 mM geležies (III) chlorido heksahidrato vandeninio tirpalo. 300 mM acetatinis buferis ruoštas 3,1 g natrio acetato suberus į 1000 ml matavimo kolbą ir ištirpinus 16 ml ledinės acto rūgšties, kolbos tūrinį praskiedžiant distiliuotu vandeniu iki žymės, (pH=3,6). 10 mM TPTZ tirpalas pagamintas TPTZ miltelius ištirpinus 40 mM druskos rūgšties tirpale [43].
Tiriamasis tirpalas ruoštas į 3 ml darbinio FRAP reagento įpilant 10 μl aviečių lapų ekstrakto. Reakcijos mišinys sumaišomas ir laikomas tamsoje, kambario temperatūroje. Po valandos spektrofotometru išmatuota tirpalo absorbcija. Matavimai atlikti esant 593 nm bangos ilgiui. Pagal trolokso kalibracijos lygtį nustatytos absorbcijos dydį atitinkančios standarto trolokso koncentracijos (µmol/l) ir apskaičiuota geležies jonų redukcijos antioksidantinė galia (3 formulė) (µmol/g).
Gradavimo grafiko sudarymas. Standartu pasirinktas antioksidantas troloksas. Nustačius skirtingų koncentracijų trolokso tirpalų absorbcijos dydžius, sudarytos trolokso kalibracijos kreivės bei įvertinti kreivių regresijos koeficientai (R2). Kiekvienu metodu sudarytas atskiras gradavimo grafikas:
1. DDPH: y = 0,0001x + 0,0947, R² = 0,998. Naudoti 0 – 0,5 mg/ml koncentracijų trolokso etanoliniai tirpalai. Gradavimo grafikas sudarytas remiantis motininio DPPH tirpalo ir tiriamojo tirpalo, kuriame yra antioksidantas troloksas absobcijos dydžių skirtumu (Amot.- Atyr.).
2. ABTS: y = 0,0002x + 0,0442, R² = 0,9961. Naudoti 0-0,5 mg/ml koncentracijos trolokso etanoliniai tirpalai. Gradavimo grafikas sudarytas remiantis darbinio ABTS tirpalo (0,8) ir tirpalo kuriame yra antioksidantas troloksas absobcijos dydžių skirtumu (0,8 - Atyr.).
3. CUPRAC: y = 0,00008x + 0,0331, R² = 0,9967. Gradavimo grafikas sudarytas atliekant CUPRAC tyrimą su 0 - 5 mg/ml koncentracijų trolokso tirpalais ir išmatavus jų absorbcijos dydžius.
4. FRAP: y = 0,0001x – 0,0172, R² = 0,9973. Trolokso gradavimo grafikas ruoštas FRAP metodu nustačius 0 - 3 mg/ml koncentracijos trolokso tirpalų absorbcijos dydžius.
Pagal gautą trolokso kalibracijos lygtį apskaičiuojamos absorbciją ar absorbcijos pokytį atitinkančios trolokso koncentracijos (µmol/l). Antioksidantinis aktyvumas išreiškiamas trolokso ekvivaletais (TE) 1 gramui orasausės žaliavos (µmol/g). Skaičiuojama pagal formulę (3):
(3) TE= c* V*B/ m (µmol/g)
čia:
c – pagal trolokso kalibracijos lygtį nustatyta koncentracija, µmol/l V – ekstrakto tūris, ml
B – skiedimas (naudojamas DPPH ir ABTS metoduose) m – tikslus sausos žaliavos kiekis, g
Chromatografinis R. idaeus tyrimas. Efektyvioji skysčių chromatografija atlikta „Waters Alliance 2695” sistema su „Waters 996 PDA“ detektoriumi. Naudota ACE C18 kolonėlė, kurios parametrai: 150 mm x 4,6 mm, 5 µm. Naudotas eliuavimo greitis – 1 ml/min, injekcijos tūris 10 µl. Analitėms išplauti naudota judri fazė, kurią sudaro tirpiklis A – 2 proc. acto rūgštis ir tirpiklis B – acetonitrilas. Judrios fazės tirpiklių procentinis kiekio kitimas pateiktas 1 lentelėje. Fenolinės rūgštys nustatytos esant 324 nm, o kvercetinas 367 nm bangų ilgiams. Tyrimui naudoti etanoliniai ekstraktai. Rezultatai išreikšti µg/g orasausės žaliavos.
1 lentelė. ESC naudotų judrių fazių gradientų kitimas
Laikas, min Komponentas A, proc. V/V Komponentas B, proc. V/V
0 100 0
30 85 15
50 50 50
55 0 100
60 100 0
Sudarytos ir įvertintos standartinių tirpalų (chlorogeno rūgšties ir kvercetino) kalibracinių kreivių tiesinės regresijos lygtys bei regresijos koeficientai (R2):
Kvercetinas: y=4,34*104 x, R2= 0,999998.
Chlorogeno r.: y=3,46*104 x, R2= 0,999657.
Statistinis apdorojimas. Gauti tyrimų rezultatai apdoroti naudojant statistinius duomenų analizės paketus SPSS 20.0 (SPSS Inc., JAV) ir Microsoft Office Excel (Microsoft, JAV).
Rezultatuose pateikti trijų matavimų vidurkiai, apskaičiuotas standartinis nuokrypis ir santykinis standartinis nuokrypis (SSN). Darbe nagrinėjamas tiesinis regresijos modelis. Kiekvieno regresijos modelio tinkamumui įvertinti buvo naudotas regresijos koeficientas R2. Duomenų apdorojimui naudotas Spirmano
koreliacijos koeficientas rs, duomenys laikyti statistiškai patikimais kai p <0,05. Aviečių lapų mėginiai
tarpusavyje palyginti pagal cheminę sudėtį ir antioksidantinį aktyvumą klasterinės analizės metodu (remiantis kvadratiniais Euklido atstumais). Skirtumui tarp kintamųjų įvertinti naudota vieno faktoriaus dispersinė analizė (One - Way ANOVA), naudojant aposteriorinį Tukey kriterijų (p < 0,05).
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1. Ekstrakcijos sąlygų parinkimas
Ekstrakcijos tirpiklio koncentracijos nustatymas. Susmulkinta prastųjų aviečių lapų žaliava ekstrahuota įvairių koncentracijų etanoliu (50, 60, 70, 80, 90 %). Tyrimui pasirinktas atsitiktinis aviečių lapų mėginys. Mėginių ekstrakcija atlikta ultragarso vonelėje 25 min., veikiant 37 Hz bangų dažniu.
Tiriamuosiuose ekstraktuose įvertintas bendras flavonoidų kiekis (rutino ekvivalentais (proc.)). Didžiausias flavonoidų kiekis nustatytas ekstraktuose, pagamintuose naudojant 70 proc. etanolį – 0,78 (±0,03 %) (8 pav.).
8 pav. Ekstrakcijos tirpiklio koncentracijos parinkimas (n=3)
Ekstrakcijos trukmės nustatymas. Ekstrakcija ultragarso vonelėje vykdyta 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 min. (9 pav.). Gautuose ekstraktuose įvertintas bendras flavonoidų kiekis. Didžiausias flavonoidų kiekis nustatytas praėjus 10 ir 90 min (atitinkamai 0,74 (±0,08) % ir 0,75 (±0,02) %). Siekiant išekstrahuoti kuo didesnį veikliųjų junginių kiekį bei juos apsaugoti nuo nepageidaujamų struktūros pokyčių ilgai vykdant ekstraciją ultragarso vonelėje, pasirinkta ekstrakciją vykdyti 10 min, tačiau trimis etapais (užpilant vis nauja tirpiklio porcija).
9 pav. Ekstrakcijos trukmės parinkimas (n=3) 0.60 0.69 0.78 0.40 0.21 0.10 0.30 0.50 0.70 0.90 50 60 70 80 90 Ben d ras flavo n o id ų ki eki s, p ro c.
Etanolio kocentracija, proc.
0.74 0.51 0.56 0.57 0.58 0.63 0.66 0.70 0.75 0.10 0.30 0.50 0.70 0.90 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Bend ras f lav o n o id ų ki e ki s, p ro c.
Ekstrakcijos temperatūros nustatymas. Tyrimo metu palaikyta pastovi 40, 50, 60, 70, 80 laipsnių temperatūra. Gautuose ekstraktuose įvertintas bendras flavonoidų kiekis (10 pav.). Didžiausias bendras flavonoidų kiekis (0,68 ± 0,03 proc.) nustatytas esant 50ºC temperatūrai. Ši temperatūra pasirinkta tiriamųjų aviečių lapų ekstraktui paruošimui.
10 pav. Ekstrakcijos temperatūros parinkimas (n=3)
3.2. Suminių flavonoidų ir fenolinių junginių kiekių įvertinimas R. idaeus lapuose
Veikliųjų junginių kokybiniai ir kiekybiniai rodikliai turi didžiausią reikšmę vaistinės augalinės žaliavos kokybės įvertinimui. Kiekybiniam flavonoidų ir fenolinių junginių kiekių nustatymui paprastųjų aviečių (R. idaeus) lapų žaliavose naudoti spektrofotometriniai metodai. Tyrimo metu įvertintas veikliųjų junginių kiekis R.idaeus lapų žaliavose, surinktose įvairiuose Lietuvos regionuose, vienoje augavietėje skirtingais vegetacijos periodais bei aviečių lapų arbatose, kurios įsigytos vaistinėse. Tyrimo rezultatai gali būti naudingi fitocheminių žinių praplėtimui apie kiekybinių rodiklių kitimą aviečių lapų žaliavose.3.2.1. Flavonoidų ir fenolinių junginių kiekių įvertinimas įvairiose Lietuvos
augavietėse surinktuose R. idaeus lapuose
Bendro flavonoidų kiekio įvertinimas. Atlikto tyrimo metu nustatyta, jog skirtingose augavietėse
surinktuose mėginiuose nustatomas bendras flavonoidų kiekis varijuoja. Nustatytas kintamumas sudarė nuo 0,78 (± 0,03) proc. iki 3,85 (± 0,27) proc. Didžiausias bendras flavonoidų kiekis nustatytas Molėtų raj. Paisetės II kaime (SSN=6,99%) ir Rokiškio raj. Kriaunų kaime rinktuose mėginiuose (SSN=5,40%).
0.54 0.68 0.43 0.38 0.41 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 40 50 60 70 80 Bend ras f lav o n o id ų ki e ki s, p ro c.
Mažiausias Radviliškio rajone, Pilvelių kaime rinktame mėginyje (SSN=4,33%)(11 pav.). Vidutinis bendras flavonoidų kiekis sudarė 2,16 ± 1,03 %.
Atlikus duomenų statistinę analizę, nustatyta, jog flavonoidų kiekio skirtumai įvairiose augavietėse rinktuose mėginiuose yra statistiškai reikšmingi. Labiausiai išsiskyrė Molėtų ir Rokiškio raj. rinkti mėginiai. Šie mėginiai reikšmingai skyrėsi nuo visų skirtingose augavietėse rinktų mėginių. Utenoje rinktas mėginys taip pat reikšmingai skyrėsi nuo kitų analizuotų mėginių (skirtumas nebuvo reikšmingas tik su Anykščiuose rinkta žaliava).
Siekiant įvertinti surinkimo vietovės įtaką veikliųjų junginių kiekiams, augavietės suskirstytos į šešis regionus – Panevėžio, Utenos, Vilniaus, Alytaus, Telšių, Šiaulių ir įvertintas nustatyto flavonoidų kiekio skirtumų reikšmingumas skirtinguose regionuose rinktuose mėginiuose. Didžiausias flavonoidų kiekis nustatytas Utenos regione rinktuose mėginiuose, mažiausias – Šiaulių ir Vilniaus regionuose rinktuose mėginiuose. Nustatyta, jog Utenos ir Telšių regionuose surinktuose mėginiuose gautas kiekis statistiškai reikšmingai skiriasi nuo Šiaulių ir Vilniaus regionuose surinktų mėginių. Vertinant augavietės geografinių koordinačių įtaką bendram flavonoidų kiekiui mėginyje, nepavyko nustatyti reikšmingo sąryšio - gautas statistiškai nepatikimas silpnas koreliacinis ryšys. Radaviečių apytikslės koordinatės pateikos pirmame priede.
11 pav. Bendro flavonoidų kiekio nustatymas skirtinguose Lietuvos regionuose rinktuose R. idaeus lapuose (n=3)
Mūsų tyrimo rezultatai skiriasi nuo kitų autorių literatūros šaltiniuose skelbiamų tyrimų rezultatų. J. Gudej ir kt. (2004, Lenkija) atliko spektrofometrinį tyrimą su natūraliai augančių (n=2) ir kultivuotų paprastųjų aviečių veislių (n=13) lapais. Suminis flavonoidų kiekis (perskaičiavus pagal hiperozidą)
2.11 0.93 2.92 2.30 1.09 3.85 2.64 0.78 3.44 2.58 2.92 0.86 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00
Utenos raj. Žiezdrelė Vievio m. Švenčionių raj. Labanoras Anykščių raj., Krepšiagalis Vilnius (botanikos sodas) Molėtų raj. Paisietė II Lazdijų raj. Kapčiamiestis Radviliškio raj. Pilveliai Rokiškio raj. Kriaunai Telšių raj., Paežerė Telšių raj., Rapaliai Panevėžio raj. Plukiai
Bendras flavonoidų kiekis, proc.
Pap rastų jų av ie či ų au gav ie tė s
įvairavo nuo 0,65 proc. iki 0,92 proc. laukinių aviečių bandiniuose ir nuo 0,50 proc. iki 0,83 proc. įvairiose aviečių veislėse. V.S.Nikitina ir kt. (2000, Rusija) spektrofotometrinio tyrimo metu nustatytas bendras flavonoidų kiekis kito nuo 2,8 proc. iki 5,6 proc (skirtingų aviečių veislių mėginiuose). J. Bajer (2014, Lietuva) atlikto tyrimo metu nustatytas kintamumas Kauno regione surinktuose aviečių lapuose sudarė nuo 0,5 iki 2,71 proc. A. Dagilytės (2001 m, Lietuva) tyrimo metu nustatytas bendras flavonoidų kiekis aviečių lapų mėginiuose sudarė nuo 0,32 iki 0,5 proc. Lyginant gautus tyrimo rezultatus su literatūros šaltiniuose publikuojamais rezultatais, matome, jog bendras flavonoidų kiekis (nuo 0,78 proc. iki 3,85 proc.) yra didesnis už J. Gudej ir kt., J.Bajer ir A. Dagilytės tyrimų metu gautus rezultatus, tačiau mažesnis už V.S.Nikitina tyrimuose nustatytą bendrą flavonoidų kiekį. Kitų autorių tyrimų metu daugiausiai analizuoti skirtingų veislių aviečių bandiniai, todėl rezultatams įtakos gali turėti genetiniai veiksniai. Neatmetama, jog bendram flavonoidų kiekiui mėginyje įtakos turi ir įvairūs su augaviete susiję veiksniai (dirvožemis, klimatinės sąlygos, aukštis virš jūros lygio, patogenų poveikis ir kt.).
Fenolinių junginių kiekio įvertinimas. Suminio fenolinių junginių kiekio kintamumas įvairiose
augavietėse surinktuose mėginiuose sudarė nuo 22,2 (± 0,1) mg/g, SSN=0,36% iki 116,1 (± 7,2) mg/g, SSN=6,2 % (12 pav.). Didžiausias fenolinių junginių kiekis nustatytas Labanoro girioje Švenčionių raj., Paisietės II k. Molėtų raj., Kriaunų k. Rokiškio raj. ir Rapalių k. Telšių raj. rinktuose mėginiuose. Mažiausias fenolinių junginių kiekis nustatytas Plukių k. Panevėžio raj. rinktame mėginyje. Matematinis suminio fenolinių junginių kiekio vidurkis siekė 84 ± 27,5 mg/g.
Didžiausias fenolinių junginių kiekis nustatytas Utenos ir Alytaus regionuose, mažiausias – Šiaulių ir Panevėžio regionuose rinktuose mėginiuose. Atlikus vieno faktoriaus dispersinę analizę (ANOVA), nustatyta, jog fenolinių junginių kiekio skirtumai skirtingose augavietėse surinktuose mėginiuose, yra statistiškai reikšmingi. Utenos regione rinktuose mėginiuose nustatytas kiekis statistiškai reikšmingai skyrėsi nuo Šiaulių ir Panevėžio regionuose rinktuose mėginiuose nustatyto kiekio. Įvertinus geografinių koordinačių įtaką, nustatytas labai silpnas statistiškai nepatikimas koreliacinis ryšys su platumos koordinatėmis ir silpnas koreliacinis ryšys su ilgumos koordinatėmis (p > 0,05).
Mūsų atliktų tyrimų rezultatai skyrėsi nuo kitų autorių literatūros šaltiniuose publikuotų tyrimų rezultatų. P.R. Venskutonis ir kt. (2006) Lietuvoje atliktas spektrofotometrinis Folin – Ciocalteu tyrimas su R. idaeus lapų mėginiais, surinktais iš skirtingų Lietuvos vietų. Tyrimo metu nustatytas suminis fenolinių junginių kiekis varijavo nuo 4,8 ± 0,02 iki 12 ± 0,3 mg/g, o vidutinis fenolinių junginių kiekis sudarė 8,9 ± 1,9 mg/g. J. Bajer (2014, Lietuva) spektrofotometrinės analizės metu nustatytas fenolinių junginių kiekio vidurkis Kauno regione surinktuose lapų mėginiuose sudarė 3,5 proc. Mūsų tyrimo metu nustatytas vidutinis suminis fenolinių junginių kiekis yra ~ 9,4 karto didesnis už P.R.Venskutonis ir kt. ir ~ 2,6 karto didesnis
