LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
VETERINARIJOS AKADEMIJA
VETERINARIJOS FAKULTETAS
ANATOMIJOS IR FIZIOLOGIJOS KATEDRA
JONAS BARTUSEVIČIUS
BENDRAS IMUNOGLOBULINO E KIEKIS ALERGIŠKŲ ŠUNŲ KRAUJO
SERUME
VETERINARINöS MEDICINOS VIENTISŲJŲ STUDIJŲ
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
DARBO VADOVAS: doc. dr. Arūnas Stankevičius
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas
1. Yra atliktas mano paties/pačios;
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje;
3. Nenaudojau šaltinių, kurie n÷ra nurodyti darbe ir pateikiu visą panaudotos literatūros sąrašą.
(data) (autoriaus vardas, pavard÷) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
(data) (autoriaus vardas, pavard÷) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADOS DöL DARBO GYNIMO
(data) (vadovo vardas, pavard÷) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE
(aprobacijos data) (Gynimo komisijos sekretor÷s/riaus vardas, pavard÷) (parašas)
Magistro baigiamasis darbas yra patalpintas į ETD IS
(gynimo komisijos sekretor÷s/riaus parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentas
Magistro baigiamasis darbas atliktas 2011 – 2013 metais Lietuvos sveikatos mokslų universitete, Veterinarijos akademijoje, Veterinarijos fakulteto Anatomijos ir fiziologijos katedroje.
Magistro baigiamajį darbą paruoš÷: Jonas Bartusevičius
(parašas)
Magistro baigiamojo darbo vadovas: doc. dr. Arūnas Stankevičius
(Anatomijos ir fiziologijos katedra, Imunologijos laboratorija) (parašas)
Recenzentas:
( katedra)
TURINYS SUTRUMPINIMŲ SĄRAŠAS ... 6 LENTELIŲ SĄRAŠAS ... 7 PAVEIKSLŲ SĄRAŠAS... 8 ĮVADAS... 9 1.1 Temos aktualumas... 9 1.2 Darbo tikslas ... 10 1.3 Uždaviniai: ... 10 2. LITERATŪROS APŽVALGA... 11 2.1 Imunoglobulinai... 11 2.2 Imunoglobulinas E ... 12
2.2.1 Šunų B ląstelių sintetinamas imunoglobulinas E ... 13
2.2.2 Imunoglobulino E receptoriai ... 13
2.2.3 Imunoglobulino E prisijungimas prie kraujo ir dendritinių ląstelių ... 14
2.3 Imunoglobulino E ir specifiško monokloninio baltymo (Omalizumab) vaidmuo uždegiminiuose procesuose ... 15
2.4 Imunin÷ eliminacija – imunoglobulino E reikšm÷ ... 15
2.5 Humoralinis imunitetas – imunoglobulino E reikšm÷... 16
2.6 Imunoglobulino E reikšm÷ I tipo alergin÷je (hiperjautrumo) reakcijoje ... 16
2.6.1 I tipo alergin÷s (hiperjautrumo) reakcijos priežastys ir mechanizmas ... 17
2.6.2 Ūmin÷s anafilakcijos ir I tipo alergin÷s (hiperjautrumo) reakcijos klinikiniai požymiai šunims ... 19
2.6.3 Šunų alergijų perdavimas palikuonims... 20
2.7 Imunoglobulino E reikšm÷ šunų atopinio ir alerginio inhaliacinio dermatito metu... 20
2.7.1 Atopinį dermatitą sukeliantys veiksniai ir patogenez÷ ... 20
2.7.2 Atopinio dermatito klinikiniai simptomai ... 22
3. METODIKA... 24
3.1 Tyrimų atlikimo vieta... 24
3.2 Tyrimų atlikimo schema... 24
3.4 Imunoglobulino E nustatymas iš kraujo serumo imunofermentinio tyrimo metodu (ELISA) ... 24
3.5 Statistinis duomenų įvertinimas... 25
4. TYRIMŲ REZULATAI... 26
4.1 Imunoglobulino E nustatymas alergiškų šunų kraujo serume... 26
4.2 I tipo padidinto hiperjautrumo reakcijų klinikiniai požymiai ... 31
5. TYRIMŲ REZULTATŲ APTARIMAS... 33
IŠVADOS ... 35
6. PADöKA... 36
SUMMARY ... 37
LITERATŪROS SĄRAŠAS... 39
SUTRUMPINIMŲ SĄRAŠAS
E izotipo imunoglobulinai – IgE G izotipo imunoglobulinai – IgG M izotipo imunoglobulinai – IgM A izotipo imunoglobulinai – IgA D izotipo imunoglobulinai – IgD B limfocitų receptoriai - BCR
Imunofermentinis tyrimo metodas – ELISA Interleukinas – IL
T ląstelių pagalbinink÷s (T helperiai) – Th1, Th2 Kilodaltonai – kDa
Diferenciacijos antigenas – CD Interferonas - IFN-γ
Tetrametilbenzidinas – TMB Fosfatinis buferio tirpalas – PBS Optinis tankis - OD
LENTELIŲ SĄRAŠAS
1 lentel÷. Pagrindin÷s naminių gyvūnų imunoglobulinų klas÷s (sudaryta autoriaus) ... 11 2 lentel÷. Naminių gyvūnų ir žmogaus kraujo serumo imunoglobulinų kiekiai (sudaryta autoriaus)11 3 lentel÷. Naminių gyvūnų ūmin÷s anafilaksijos požymiai (sudaryta autoriaus) ... 19 4 lentel÷. Alergiškų šunų etaloninio kraujo serumo IgE koncentracija ir OD vidurkis (sudaryta autoriaus) ... 26 5 lentel÷. I tipo hiperjautrumo reakcijų klinikinius simptomus tur÷jusių pacientų kraujo serumo kiekybinio ELISA tyrimo rezultatai (sudaryta autoriaus) ... 27 6 lentel÷. I tipo padidinto hiperjautrumo reakcijas tur÷jusių pacientų pasiskirstymas priklausomai nuo veisl÷s (sudaryta autoriaus) ... 27 7 lentel÷. I tipo padidinto hiperjautrumo reakcijas tur÷jusių pacientų pasiskirstymas priklausomai nuo lyties (sudaryta autoriaus)... 29 8 lentel÷. I tipo padidinto hiperjautrumo reakcijas tur÷jusių pacientų pasiskirstymas priklausomai nuo amžiaus (sudaryta autoriaus) ... 29 9 lentel÷. Nealergiškų šunų etaloninio kraujo serumo IgE koncentracija ir OD vidurkis (sudaryta autoriaus) ... 30 10 lentel÷. I tipo padidinto hiperjautrumo reakcijų klinikinių simptomų netur÷jusių pacientų kraujo serumo kiekybinio ELISA tyrimo rezultatai (sudaryta autoriaus)... 30 11 lentel÷. I tipo padidinto hiperjautrumo reakcijų klinikiniai simptomai (sudaryta autoriaus) ... 31 12 lentel÷. I tipo padidinto hiperjautrumo reakcijos pasiskirstymas (sudaryta autoriaus) ... 32
PAVEIKSLŲ SĄRAŠAS
1 pav. Imunoglobulino E struktūra ... 12 2 pav. Interleukino 4 (IL-4) ir interleukino 5 (IL-5) vaidmuo sukeliant IgE atsaką ... 13 3 pav. I tipo alergin÷s reakcijos patogenez÷ ... 18
ĮVADAS
1.1 Temos aktualumas
Alergijos ir alerginių ligų tyrimai medicinos ir veterinarijos srityse mokslininkus domina jau daugelį metų. Kai kurie autoriai formuluoja alergijos sąvoką kaip organizmo imuninę reakciją, kai pakenkiami savi audiniai. Manoma, kad organizmas tur÷tų sukurti apsauginį imuninį atsaką, tačiau kaip ir kod÷l pasireiškia padidinto jautrumo imuninis atsakas, vadinamas alergija, iki šiol n÷ra aišku. Alergijos terminas laiko atžvilgiu šiek tiek pakito ir dabar šis terminas yra tolygus padid÷jusiam jautrumui (angl. – hypersensitivity). Alergija, arba padid÷jęs jautrumas, - tai sustipr÷jęs imunin÷s sistemos atsakas į išorines antigenines ar alergenines medžiagas.
Šunų imunoglobulino E atradimas, žmogaus ir šunio nepaprastas homologinis panašumas alergin÷s ligos atveju (Wittich, 1941), šunų IgE ištyrimas ir pateikta charakteristika (Rockey and Schwartzman, 1967; Patterson et al., 1968) parod÷, kad žmogaus IgE (Ishizaka et al., 1966) ir šunio IgE yra labai panašūs. Alerginių ligų susirgimų panašumas, pasitaikančių tarp šunų ir žmonių, yra beveik identiškas tod÷l, tai gal÷jo paskatinti palyginti žmogaus ir šunio IgE (Rockey and Schwartzman, 1971). Atlikus išsamius laboratorinius tyrimus buvo pasteb÷ta, kad žmonių ir šunų IgE biologinis aktyvumas ir koncentracija kraujo serume priklauso nuo putliųjų ląstelių ir kraujo bazofilų sužadinimo. Remiantis gautais laboratorinių tyrimų rezultatais paaišk÷jo, kad pasireiškus alerginiai ligai, būdingai savo etiologija, patogeneze ir klinikiniais simptomais ir žmon÷ms, ir šunims, specifinių antikūnių ir bendras IgE koncentracijos kiekis audiniuose ir organizmo skysčiuose buvo labai panašus. Taigi tolimesni tyrimai atliekami su alergiškų šunų IgE ateityje gal÷tų atverti dideles galimybes imunin÷s terapijos srityje ir suteikti daug naudos nagrin÷jant panašias alergines ligas būdingas žmon÷ms ir šunims.
Alergijų epidemiologin÷ situacija Lietuvos šunų populiacijoje praktiškai tyrin÷ta labai mažai. Kai kurie epizodiniai I tipo alerginių reakcijų tyrimų rezultatai buvo pateikti 2011 metų magistriniame darbe (M.Siauryt÷, 2011). Kitų duomenų aptikti nepavyko. Taip pat reikia atsižvelgti į tą faktą, kad alergijų klinikinių atvejų smulkių gyvūnų klinikose kiekvienais metais registruojama vis daugiau, tačiau visos diagnoz÷s dažniausiai nustatomos tik pagal klinikinius simptomus ir dažnus, periodiškus vizitus pas veterinarijos gydytoją. Šunims alerginis atsakas dažniausiai apima odą: pacientas jaučia niež÷jimą, nuolat trinasi, kasosi, to pasekoje vystosi odos uždegimas. Alerginių ligų metu sukeliama audinių edema ir hiperemija, odos ir gleivinių išb÷rimas, kūno temperatūros pakilimas, dusulys, v÷mimas, kraujospūdžio kilimas, kartais galima ir šoko būsena. Dar viena problema, kad pagal klinikinius požymius sud÷tinga atskirti I ir IV tipo alergijas. Tiksliai nustatyti padidinto jautrumo reakcijų tipą galima remiantis imunologiniais tyrimais.
1.2 Darbo tikslas
Klinikiniais ir laboratoriniais tyrimo metodais ištirti bendrą IgE kiekį alergiškų šunų kraujo serume ir I tipo alergijų paplitimą ir atvejus, kurie pasitaiko privačiuose namų ūkiuose tarp medžioklinių, tarnybinių, dekoratyvinių veislių šunų bei mišrūnų.
1.3 Uždaviniai:
1. Įvertinti privačiuose namų ūkiuose esančių medžioklinių, tarnybinių, dekoratyvinių veislių šunims pasitaikančių alergijų atvejų klinikinius požymius, o taip pat veisl÷s, amžiaus ir lyties galimą įtaką padidintam IgE kiekiui kraujo serume;
2. Ištirti bendrą IgE kiekį kliniškai sveikų ir alergijos simptomus turinčių šunų kraujo serumuose;
3. Nustatyti galimas IgE koncentracijos ribas alergiškų šunų kraujo serumuose kiekybiniu ELISA metodu.
2. LITERATŪROS APŽVALGA
2.1 Imunoglobulinai
Imunoglobulinais yra vadinamos antikūnių glikoproteinų molekul÷s. Terminas imunoglobulinas yra naudojamas apibr÷žiant visus žinomus B limfocitų receptorius (angl. BCR). Yra išskiriamos penkios skirtingos imunoglobulinų rūšys (arba izotipai), kurios skiriasi savo sunkiųjų molekulinių grandinių funkcija ir koncentracijos gradientu kraujo serume. Pirmoji rūšis, kurios didžiausia koncentracija aptinkama serume yra vadinama imunoglobulinu G (IgG). Antroji rūšis pagal koncentracijos gradientą kraujo serume ( aptinkama daugumoje žinduolių) yra imunoglobulinas M (IgM). Trečioji rūšis pagal koncentracijos gradientą daugumoje žinduolių yra imunoglobulinas A (IgA). Vis d÷lto, IgA yra labiausiai paplitęs antikūnis biologin÷se išskyrose, tokiose kaip seil÷s, pienas ir žarnyno skysčiai. Imunoglobulinas D (IgD) yra B ląstelių antigenų receptorius ir yra retai aptinkamas organizmo skysčiuose (žiūr÷ti 1 lentelę) (Tizard I.R., 2009).
1 lentel÷. Pagrindin÷s naminių gyvūnų imunoglobulinų klas÷s (sudaryta autoriaus) Imunoglobulinų klas÷s
Savyb÷s IgM IgG IgA IgE IgD
Molekulin÷ mas÷ (kDa) 900,000 180,000 360,000 200,000 180,000
Domenai 5 1 2 1 1 Sunkioji grandin÷ µ γ α ε δ Dažniausiai sintetinamas Blužnis ir limfiniai mazgai Blužnis ir limfiniai mazgai Virškinamas traktas ir respiratorin÷ sistema Virškinamas traktas ir respiratorin÷ sistema Blužnis ir limfiniai mazgai Kraujo serume aptinkama labai maža koncentracija IgE, kuris dalyvauja kaip alerginių reakcijų mediatorius ir yra atsakingas už imunitetą prieš helmintus (parazitines kirm÷les) (žiūr÷ti 2 lentelę) (Tizard I.R., 2009).
2 lentel÷. Naminių gyvūnų ir žmogaus kraujo serumo imunoglobulinų kiekiai (sudaryta autoriaus) Imunoglobulinų kiekis kraujo serume (µg/dl)
Gyvūno rūšis IgG IgM IgA IgE
Arklys 1000 - 1500 100 - 200 60 - 350 Galvijas 1700 - 2700 250 - 400 10 - 50 Avis 1700 - 2000 150 - 250 10 - 50 Kiaul÷ 1700 - 2900 100 - 500 50 - 500 Šuo 1000 - 2000 70 - 270 20 - 150 1 - 7 Kat÷ 400 - 2000 30 - 150 30 - 150 Višta 300 - 700 120 - 250 30 - 60 Žmogus 800 - 1600 50 - 200 150 - 400 0,002 - 0,05
2.2 Imunoglobulinas E
IgE, kaip ir IgA, yra sudarytas iš plazmos ląstelių. Tai yra tipiškas γ formos, keturių grandinių su keturiomis pastoviomis ε sunkiųjų grandinių sritimis (domenais) imunoglobulinas, kurio molekulin÷ mas÷ 190 kDa (žiūr÷ti 1 pav.). Kadangi kraujo serume aptinkama labai maža IgE koncentracija, jis paprasčiausiai negali dalyvauti surišant ir apvelkant (apgaubiant) antigenus, kaip kiti imunoglobulinai, tačiau yra labai svarbus veiksnys nustatant anafilaksinį šoką ir ankstyvuosius alerginių reakcijų požymius odoje bei iš plaučių ir virškinamojo trakto gleivių (Wang et al., 2008; Wood et al., 2007). IgE sukelia ūmią uždegiminę reakciją veikdamas kaip signalą pakeičianti molekul÷, tokiu būdu IgE molekul÷s tvirtai sujungiamos su kraujo bazofilų ir putliųjų ląstelių (FcεRI) receptoriais. Kada antigenas prisijungia prie tokio susidarusio IgE, putliosiose lątel÷se yra sužadinama sparti uždegiminių molekulių gamyba ir jų išskyrimas. D÷l to ūmaus uždegimo fone yra aktyvuojama lokali organizmo imunin÷ apsauga, kuri padeda pašalinti uždegimą suk÷lusį veiksnį. IgE dalyvauja sukeltose I tipo alergin÷se (hiperjautrumo) reakcijose ir yra atsakingas už imunitetą nuo helmintų. IgE iš visų imunoglobulinų turi trumpiausią pusin÷s eliminacijos laiką (nuo 2 iki 3 dienų) ir yra lengvai suyrantis 56°C temperatūroje. Preliminarių tyrimų duomenimis yra manoma, kad IgE turi du poklasius: IgE1 and IgE2. Be to, šunys turi IgA, IgM, IgD (Tizard I.R., 2009).
1 pav. Imunoglobulino E struktūra1
1 Šaltinis: http://www.google.lt/imgres?q=the+structure+of+IgE&um=1&hl=lt&tbo=d&biw=1024&bih=645&tbm=isch&tbnid=la NuCu9tePVtMM:&imgrefurl=http://www.usnon.com/focus-on-omalizumab- xolair.htm&docid=Eb0x84YzsugVlM&imgurl=http://www.usnon.com/wp-content/uploads/2010/06/Figure-2.- Structure-of-immunoglobulin-E.png&w=412&h=318&ei=kT31UNLHCcXJsgbi-ICwBg&zoom=1&iact=hc&vpx=400&vpy=119&dur=1166&hovh=197&hovw=256&tx=137&ty=98&sig=106568327 184952121539&page=1&tbnh=130&tbnw=169&start=0&ndsp=23&ved=1t:429,r:2,s:0,i:85
2.2.1 Šunų B ląstelių sintetinamas imunoglobulinas E
Individai, turintys polinkį į alergines reakcijas, nuolat gamina Th2 ląsteles. Th2 ląstel÷s gamina IL-4 ar IL-13. Šie citokinai, pasižymintys sinergistiniu veikimu (CD40), skatina B ląsteles, kad jos gamintų IgE (Goedert et al., 2000). IL-4 sintez÷s gausumas tiesiogiai priklauso nuo putliųjų ląstelų stimuliacijos (Goedert et al., 2000). Putliosios ląstel÷s padeda subalansuoti ir išlaikyti pakankamą IL-4 kiekį, d÷l to Th2 ląstelių gali pasigaminti dar daugiau. Ši kombinacija leidžia labai stipriai paskatinti IgE sintezę (žiūr÷ti 2 pav.). Atlikus tyrimus nustatyta, kad didelis IgE kiekis šunų kraujo serume nebūtinai turi būti susijęs su alerginę ligą rodančiais ar nerodančiais jai būdingais klinikiniais simptomais.
2 pav. Interleukino 4 (IL-4) ir interleukino 5 (IL-5) vaidmuo sukeliant IgE atsaką2
Didelis IgE kiekis kraujo serume gali būti d÷l to, kad kraujyje cirkuliuoja gausus suaktyvintų B ląstelių skaičius arba tai gali būti paveldimumo faktorius, nustatytas tarp gimingų šunų veislių ar individų (de Weck et al., 1997; Redman et al., 2001).
2.2.2 Imunoglobulino E receptoriai
Yra išskiriami 2 pagrindiniai IgE receptorių tipai: • aukštos sąveikos j÷gos FcεRI;
• mažos sąveikos j÷gos FcεRII (CD23).
IgE receptorių aukštos sąveikos j÷gos tipas FcεRI yra randamas ant acidofilų, audinių ir kraujo bazofilų. Ant putliosios ląstel÷s paviršiaus prisijungęs IgE receptorių tipas FcεRI neduoda jokio staigaus atsako, tačiau atsiradus antikūnio - antigeno kompleksui, putlioji ląstel÷ sudirginama ir išskiria lizocimus bei uždegiminius mediatorius į aplinkinius audinius.
Yra išskiriamos 2 aukštos sąveikos j÷gos FcεRI formos:
a) Pirmoji yra randama ant putliųjų ląstelių, kraujo bazofilų, neutrofilų ir eozinofilų. Šią formą sudaro 4 sunkiosios grandin÷s – α, β ir dvi γ (αβγ2). α jungiasi prie IgE, β stabilizuoja junginį, o γ atlieka signalo perdav÷jo vaidmenį. Šis FcεRI afiniškumas su IgE yra labai aukštas (10-10 mol/l). FcεRI buvimas garantuoja, kad putlioji ląstel÷ yra pastoviai padengta IgE;
b) Antrąją formą sudaro 3 sunkiosios grandin÷s – α ir dvi γ (αγ2). Ši forma randama ant dendritinių ląstelių ir monocitų (didelių vienabranduolių leukocitų). Antigenas susidūręs su IgE būna „suryjamas“. Tokį FcεRI atsidūrimą ant antigeno užtikrina Th2 ląstel÷s, kurių sintetinamo IL-4 išskyrimas pastiprina IgE sintezę, įvyksta alerginis atsakas.
IgE receptorių mažos sąveikos j÷gos tipas FcεRII (CD23) yra vadinamas selektinu, kuris randamas ant B limfocitų, NK ląstelių, makrofagų, dendritinių ląstelių, eozinofilų ir trombocitų. Būdamas IgE receptorių tipu, FcεRII geba jungtis prie komplemento receptoriaus CR2 (CD21). Vadinasi FcεRII kaupiančios B ląstel÷s per komplemento receptorių (CD21) gali jungtis su kitomis B ląstel÷mis, o svarbiausia kad su dendritin÷mis ląstel÷mis. Sujungdamas B limfocitus su dendritin÷mis ląstel÷mis, FcεRII apsaugo juos nuo apoptoz÷s ir paskatina IgE sintezę (Tizard I.R., 2009).
2.2.3 Imunoglobulino E prisijungimas prie kraujo ir dendritinių ląstelių
IgE geb÷jimas jungtis su įvairiomis kraujo bei audinių ląstel÷mis tik įrodo, kokia šio antikūnio svarbi reikšm÷ dalyvaujant alerginių ligų mechanizmuose suteikiant imuninį atsaką į antigeną (Chang et al., 2007). IgE receptorių tipo FcεRI jungimasis prie žmogaus dendritinių ląstelių jau yra žinomas daugiau kaip 20 metų, tačiau konkreti IgE receptorių sąveikos reikšm÷ su dendritin÷mis ląstel÷mis alergin÷s ligos metu lieka nežinoma iki šiol (Novak et al., 2003, 2008; Bieber, 2007). Viena iš priežasčių gal÷tų būti tyrimams naudojamų graužikų netinkamumas, kadangi jų dendritinių ląstelių afiniškumas su IgE receptorių tipu FcεRI yra labai silpnas (Novak et al., 2003). Priešingai negu graužikų, tuo labiau žmonių, dideli šunų dendritinių ląstelių CD1c+ kiekiai buvo pasteb÷ti kraujyje (Jackson et al., 2002) ir odoje (Olivry et al., 2001; Olivry et al., 2006).
2.3 Imunoglobulino E ir specifiško monokloninio baltymo (Omalizumab) vaidmuo uždegiminiuose procesuose
Manymas, kad IgE, sintetinamas putliųjų ląstelių ir audinių bazofilų, geriausiai parodo alerginę ligą, yra per daug supaprastintas ir paneigia uždegiminio proceso sud÷tingumo mechanizmus (Novak et al., 2003; Novak and Bieber, 2005) bei IgE sintezę lokaliai pažeistuose audiniuose (Bruhns et al., 2005; Zemann et al., 2002). Klinikin÷je praktikoje IgE vaidmuo uždegiminiuose procesuose yra labai gerai parodomas su naujai atrastu, humanizuotu pel÷s monokloniniu specifišku IgE – Omalizumab baltymu. Omalizumab yra specifiškas monokloninis baltymas, išskirtas iš žmogaus pastovaus antikūnio geno ir sujungtas su pel÷s klono kintamu antikūnio genu, kuris sintetina monokloniškai specifišką antikūnį IgE receptorių FcεRI tipui ir nesuteikia galimyb÷s sintetinti putliųjų ląstelių ir audinių bazofilų (Chang, 2000). Pagrindin÷ Omalizumab specifiško monokloninio baltymo funkcija yra surišti laisvą IgE ir nukreipti jį ant audinių bazofilų ir putliųjų ląstelių tada, kai IgE receptorių FcεRI kiekis yra akivaizdžiai nepakankamas. To pasekoje, atliekama šių ląstelių stabilizacija (Chang ir Shiung, 2006). Tokia Omalizumab specifiško baltymo savyb÷ palengvino gydyti astmą ir kitas alergines ligas (Chang et al., 2007). S÷kmingas Omalizumab specifiško baltymo panaudojimas klinikin÷je praktikoje paskatino bandymus stimuliuoti savaiminę IgG auto-antikūnių sintezę prieš IgE sunkiosios grandin÷s ε pasirinktas epitopų vietas ir prad÷ti modifikuotų peptidų vakcinų gamybą šunims (Ledin et al., 2006). Neabejojama, jeigu Omalizumab specifiško baltymo panaudojimas pasitvirtins bandymuose su šunimis, kurių bendras IgE kiekis kraujo serume yra daug aukštesnis negu žmonių, ir tai nesukels jokios rizikos bei šalutinių poveikių žmon÷ms (Ledin et al., 2006), vadinasi tokie pat bandymai ir praktinis pritaikymas galbūt bus atliktas ir su žmon÷mis (Hellman, 2008).
2.4 Imunin÷ eliminacija – imunoglobulino E reikšm÷
IgA veikia imuniniame atsake, tačiau jis n÷ra aktyvus komplementas. Antigenui skverbiantis pro gleivių užtvarą (imunin÷ eliminacija), yra aktyvuojama „antroji apsaugos sistema“. Šį procesą kontroliuoja IgE. Ląstel÷s, kurios sintetina IgE, šiuo atveju dažniau lokalizuojasi kūno paviršiuje negu limfiniuose mazguose ar blužnyje. IgE prisitvirtina prie putliųjų ląstelių per virškinamojo trakto, respiratorinio trakto ir odos sieneles. Taigi jeigu antigenas sugeba prasilaužti pro IgA ir stengiasi patekti ant audinių, nedelsiant aktivuojamas IgE atsakas. Tokiu būdu sukeliama staigi putliųjų ląstelių degranuliacija, leidžianti išskirti vazoaktyvias molekules į aplinkinius audinius. Analogiškas procesas gali pasikartoti, pavyzdžiui, helmintams esant virškinamajame trakte. IgA turi silpną imuninį atsaką šiems svetimkūniams, tod÷l jie nesunkiai gali skverbtis giliau į jiems palankesnius parazituoti audinius. Tuo metu, kai helmintas susiduria su sudirginta putliąja ląstele,
jos išskirtos vazoaktyvios molekul÷s, stiprus lokalizuotas uždegimas padeda pašalinti helmintus iš organizmo (Tizard I.R., 2009).
Vadinasi IgA su IgE veikia harmoningai. IgA veikia kaip pirminis imuninis atsakas, o IgE kaip antrinis, tačiau IgE atsakas veikia nedelsiant, jeigu antigenas sugeba prasilaužti pro IgA. Nedideli IgA kiekiai skatina IgE sintezę ir geb÷jimą sukelti imunininį atsaką maisto ir inhaliaciniams antigenams (Tizard I.R., 2009).
2.5 Humoralinis imunitetas – imunoglobulino E reikšm÷
Manoma, kad aukštas IgE kiekis kraujo serume ir lokalizuotuose audiniuose gal÷tų būti tiesiogiai susijęs su organizme parazituojančiomis kirm÷l÷mis (Bethony et al., 2005; Turner et al., 2005, Mitre and Nutman, 2006), d÷l to IgE sistemin÷ koncentracija padid÷ja ir tur÷tų buti suduodamas imuninis atsakas (Capron and Capron, 1994). Šiai hipotezei prieš 15 metų buvo paprieštarauta mokslininkų, kurie ilgą laiką atliko laboratorinius tyrimus šia tema (Else and Finkelman, 1998). Atlikus tyrimus su graužikais buvo nustatyta, kad parazitams-specifinis IgE nebuvo pagrindinis faktorius užtikrinant organizmo apsaugą nuo parazitinių kirm÷lių (Finkelman et al., 2004; Zhao et al., 2008). Užkr÷tus suaugusius šunis pakartotinai Ancylostoma ir Trichuris šeimų nematodais nustatyta, kad konkrečiai šiems nematodams-specifinis IgE nesugeb÷jo suteikti pakankamo imuninio atsako ir parazitų skaičius sumaž÷jo labai nežymiai (nepublikuojama). Tik÷tina, kad parazitinių kirm÷lių sukeliamas parazitams-specifinio IgE imuninis atsakas labai dažnais atvejais yra priklausomas nuo putliųjų ląstelių sudirginimo. Vis d÷lto, parazitams-specifinis IgE palengvina putliosioms ląstel÷ms sukelti efektyvesnį ir greitesnį uždegiminį atsaką audiniuose (Else and Finkelman, 1998).
IgE kiekis ir eozinofilų skaičius pas gyvūnus, turinčius parazitinių kirm÷lių, dažnai būna gan aukštas, kadangi šie svetimkūniai sukelia Th2 ląstelių atsaką. Apsikr÷timas parazitais sukelia labai panašius klinikinius simptomus į I tipo alergin÷s reakcijos metu pasireiškiančius klinikinius požymius: eozinofilija, edema, astma ir dilg÷linis dermatitas. Th2 ląstelių reguliuojama IgE sintez÷ yra labai svarbus aspektas kontroliuojant parazitinių kirm÷lių buvimą individo organizme – sukeliama putliųjų ląstelių degranuliacija, leidžianti išskirti į audinius vazoaktyvias molekules, citokinus ir proteazes. Tuo metu makrofagai ir eozinofilai susijungia su IgE receptorių tipu FcεR (CD23), jungiasi su pačiu IgE, kuris jau yra prisitvirtines prie parazitinių kirm÷lių, aktyvuojasi ir sunaikina svetimkūnius (Tizard I.R., 2009).
2.6 Imunoglobulino E reikšm÷ I tipo alergin÷je (hiperjautrumo) reakcijoje
I tipo alergin÷s (hiperjautrumo) reakcijos metu putliosios ląstel÷s dalyvauja kaip „apsaugos“ lastel÷s, nes šių ląstelių paviršiuje yra išsid÷stę daugyb÷ receptorių, kurie joms leidžia atitinkamai
reaguoti į daugelį skirtingų aplinkos dirgiklių. Pavyzdžiui, kaip atsaką į audinių pažeidimą ar mikrobin÷s infekcijos invaziją į organizmą šios ląstel÷s atpalaiduoja uždegimines molekules. Toks molekulių išskyrimas paprastai yra kontroliuojamas, tod÷l atsižvelgiant į sukelto uždegimo ūmumą yra užtikrinamas adekvatus organizmo imuninis atsakas (Tizard I.R., 2009).
I tipo alergin÷ reakcija, priešingai nuo min÷tos putliųjų ląstelių sukeliamo uždegimino atsako, yra uždegimin÷s reakcijos išraiška, kuri sukeliama antigenui prisijungus prie prie putliųjų ląstelų IgE receptorių. To pasekoje, yra skatinamas putliųjų ląstelių išskiriamų molekulių turinio atpalaidavimas, kuris sukelia ūmų uždegimą. Klinikiniu požiūriu šio uždegimo išraiška yra labai svarbi veterinarin÷je medicinoje (Tizard I.R., 2009).
IgE dalyvauja kaip mediatorius sužadinant ūmias I tipo hiperjautrumo reakcijas. Šios reakcijos vadinamos ūmiomis d÷l to, kad patekus antigenui išsivysto staiga, per kelias sekundes ar minutes. Dažniausiai šio tipo hiperjautrumo reakcijos vadinamos alergijomis, o antigenas, kuris sukelia alerginę reakciją, vadinamas alergenu. Jeigu staigi hiperjautrumo alergin÷ reakcija yra sistemin÷ ir pavojinga gyvybei, ši reakcija dar apibr÷žiama kaip anafilaksin÷ alergija, kuri sukelia anafilaksinį šoką. Kartais gyvūnai gali tur÷ti panašią reakciją į anafilaksinę alergiją, tačiau ji nesukelia anafilaksinio šoko. Tokia reakcija vadinama anafilaktoidine reakcija (Tizard I.R., 2009).
2.6.1 I tipo alergin÷s (hiperjautrumo) reakcijos priežastys ir mechanizmas
Kai kuriems gyvūnams gali būti sukeliamas nenormaliai padid÷jęs Th2 receptorių atsakas į aplinkoje esančius antigenus ir skatinama IgE antikūnų hipersintez÷. Šiems gyvūnams išsivysto I tipo hiperjautrumo reakcija arba alergija. IgE hipersintez÷ yra vadinama atopija. Atopijos ir I tipo hiperjautrumo reakcijos išsivystymas priklauso nuo genų sąveikos ir aplinkos veiksnių. Taigi jeigu abu t÷vai yra atopiški, tai dauguma jų palikuonių irgi bus atopiški ir alergiški. Jeigu tik vienas iš t÷vų yra atopiškas, tai alergijos paveldimumas palikuonims procentaliai skirsis. Genetin÷ predispozicija (polinkis paveldimumui) atopijai taip pat priklauso nuo šuns veisl÷s. Pavyzdžiui, dažniausiai atopinis dermatitas pasireiškia terjerams (bulterjerams, Velso terjerams, kernterjerams, Vakarų Škotijos baltiesiems terjerams, škotų terjerams), dalmantinų, airių seterių veisl÷s šunims, bet gali pasireikšti ir negrynaveisliams šunims. Pastebima gana didelis n=0,47% atopinio dermatito paveldimumo dažnis Labradoro ir auksiaspalvių retriverių šunų tarpe (Tizard I.R., 2009).
Atopinių ligų išsivystymą taip pat įtakoja aplinkos veiksnių faktoriai, bei vaikyst÷je persirgtos ligos. Vadinasi tie palikuonys, kurie ankstyvoje vaikyst÷je dažnai sirgo įvairiomis infekcin÷mis ligomis yra atsparesni alergijoms, lyginant su tais palikuonimis, kurie nesirgo ankstyvoje vaikyst÷je. Taigi pas tokio pačio amžiaus šuniukus aptinkamas ryškiai padid÷jęs IgE kiekis, lyginant IgE kiekį su 4 m÷n. amžiaus šuniukuose aptinkamu IgE kiekiu, kurie ankstyvoje vaikyst÷je netur÷jo kontakto su alergenu (Tizard I.R., 2009).
Didelis IgE kiekis aptinkamas ir tų gyvūnų kraujo serume, kurie turi parazitų (blusų) ir helmintų (kirm÷lių). Manoma, kad specifiškai reaguodamas į šiuos parazitus ir juose esantį chitiną, organizmas padidina IgE kiekį kraujo serume bandydamas juos pašalinti. Chitinas sužadina eozinofilų ir bazofilų kaupimąsi audiniuose, d÷l ko yra manoma, kad tai gali būti pagrindinis dirgiklis, skatinantis išsivystyti min÷toms alergin÷ms reakcijoms (Tizard I.R., 2009).
IgE prisijungus prie audinių bazofilų FcεRI receptoriaus, ląstel÷je neįvyksta žymesnių pokyčių. Tačiau jei prie IgE prisijungia antigenas, tuomet ląstel÷s granul÷s pradeda jud÷ti link paviršiaus ir jų turinys išsilieja į aplinkinius audinius (žiūr÷ti 3 pav.). D÷l šios priežasties sužadinama uždegiminių mediatorių ir citokinų sintez÷, suaktyvinamos kai kurios tirozino kinaz÷s, kurios aktyvina C fosfolipazę. Aktyvinta fosfolipaz÷ sužadina membranos fosfolipidus ir pradedama gaminti arachidono rūgštis. Kiti fermentai metabolina arachidono rūgštį iki leukotrienų ir prostaglandinų. D÷l to proteinkinaz÷s sustiprina genų ekspresiją ir tranlokaciją ir prasideda įvairių citokinų sintez÷ bei sekrecija. Kai kurių audinių bazofilų atsakas į antigeną yra labai greitas (vos keletas sekundžių). Periferinio kraujo bazofilai, panašiai kaip ir audinių bazofilai, yra sensibilizuojami su IgE, jie reaguoja su antigenu ir suaktyvina visą įvykių eigą (Tizard I.R., 2009).
D÷l antigeno ir IgE sąveikos iš audinių bazofilų granulių atsipalaiduoja vazoaktyvūs veiksniai ir yra sintetinamos naujos, sukeliančios I tipo hiperjautrumo uždegiminius procesus, medžiagos. Audinių bazofilų granul÷se yra didelis kiekis histamino ir serotonino (Tizard I.R., 2009).
3 pav. I tipo alergin÷s reakcijos patogenez÷3
3
2.6.2 Ūmin÷s anafilakcijos ir I tipo alergin÷s (hiperjautrumo) reakcijos klinikiniai požymiai šunims
Šunims, priešingai negu kitiems naminiams gyvūnams, dažniausiai pažeidžiamos kepenys, jų venos. Šunys vemia, dažnai šlapinasi, viduriuoja. Progresuojančiai anafilaksijai būdingas kolapsas, susilpn÷jęs kv÷pavimas, traukuliai (žiūr÷ti 3 lentelę). Šunys per valanda krenta. Skrodimo metu kepenys ir žarnos yra perpildytos krauju. Didžiausi patologiniai anatominiai pakitimai matyti kepenyse. Šunų anafilaksijos mediatoriai yra histaminas, prostaglandinai ir leukotrienai (Tizard I.R., 2009).
3 lentel÷. Naminių gyvūnų ūmin÷s anafilaksijos požymiai (sudaryta autoriaus)
Gyvūno rūšis
Šoko lokalizacijos
vieta
Požymis Patologija Šoko
mediatoriai Galvijai Respiratorinis traktas Kosulys, dusulys, kolapsas Plaučių edema, emfizema, hemoragija Leukotrienai, kininai, histaminas Arkliai Respiratorinis traktas, žarnos Kosulys, dusulys, kolapsas, viduriavimas Emfizema, žarnų kolapsas, viduriavimas Serotininas, kininai, histaminas Kiaul÷s Respiratorinis traktas, žarnos Cianoz÷, kasymasis Sistemin÷ hipotonija Histaminas Šunys Kepenų venos V÷mimas, dusulys, kolapsas, viduriavimas Kepenų kraujo staz÷, vidurių hemoragija Histaminas, leukotrienai Kat÷s Respiratorinis traktas, oda Dusulys, seil÷jimasis, v÷mimas, viduriavimas Plaučių edema, emfizema, hemoragija Histaminas, leukotrienai
Avys Plaučiai Viduriavimas
Plaučių edema, emfizema, hemoragija Serotininas, kininai, histaminas, leukotrienai
10 – 15% šunų yra jautrūs maisto alergenams, tod÷l jie dažnai serga virškinamojo trakto ligomis, pasireiškiančiomis viduriavimu, v÷mimu bei odos niežuliu (Tizard I.R., 2009).
Dulkių alergenai šunims sukelia slogą, konjunktyvitą, dusulį, kosulį, ašarojimą bei odos niežulį (Tizard I.R., 2009).
2.6.3 Šunų alergijų perdavimas palikuonims
Tyrimai teigia, kad t÷vų klinikin÷ būsena alergijų atžvilgiu, ypač motinų, turi tiesioginę įtaką jų palikuoniams. Atlikti ekperimentai tarp dviejų vadų biglių veisl÷s jauniklių, kurie buvo alergiški specifin÷ms žiedadulk÷ms ir tarp nealergiškų dviejų vadų biglių veisl÷s jauniklių (genetinis skirtumas tarp t÷vų buvo labai nedidelis). Palikuonims, kurie buvo iš alergiškos vados, alerginis atsakas įkv÷ptoms specifin÷ms žiedadulk÷ms pasireišk÷ jau pirmą savaitę po gimimo. Jiems būnant 40 savaičių amžiaus, jų kraujo serume bendras IgE ir žiedadulk÷ms-specifinio IgE kiekis buvo labai didelis. Palikuonims, kurie buvo iš nealergiškos vados, kraujo serume aptiktas IgG antikūnių kiekis reikalingas prieš specifinius žiedadulkių antigenus. Alergiškų t÷vų palikuonims buvo nustatytas padidintas eozinofilų kiekis ir pasireišk÷ astmos klinikiniai simptomai įkv÷pus specifinių žiedadulkių. To nebuvo nustatyta nealergiškų t÷vų palikuonims. Kas tai įtakoja ir d÷l ko taip atsitinka yra nežinoma, tačiau sp÷jama, kad viena iš priežasčių, sukelianti naujagimių automatinį Th2 ląstelių atsaką, gal÷tų būti alergiškos motinos naujagimių maitinimas krekenomis (Barret, E.G., Rudolph, K., Bowen, L.E., Bice, D.E., 2003).
2.7 Imunoglobulino E reikšm÷ šunų atopinio ir alerginio inhaliacinio dermatito metu
Atopin÷ liga (atopija, įgimtas alerginis inhaliacinis šunų dermatitas) tai genetiškai užprogramuota šunų liga, kurios metu pacientas tampa jautrus įvairiems aplinkoje esantiems antigenams, kurie patekę į kv÷pavimo takus sukelia alerginę reakciją. Be to, atopija dar apibr÷žiama kaip IgE antikūnų sukeliama liga, kurios metu svarbus vaidmuo atitenka alergeno specifiniam IgG ir priklausomai nuo ligos uždegimin÷s reakcijos faz÷s yra aktyvuojami tokie imunin÷s sistemos komponentai, kaip Langerhanso ląstel÷s, T limfocitai, eozinofilai (Muller & Kirk’s, 2001).
2.7.1 Atopinį dermatitą sukeliantys veiksniai ir patogenez÷
Kad šunų atopija yra genetiškai paveldima liga įrodo atlikti tyrimai veisiant šunis, taip pat stiprus veisl÷s polinkis alergin÷ms reakcijoms, t÷vų ir senelių polinkis į ligą. Skalikų veislių šunų tarpe yra paveldimas aukštos sąveikos j÷gos IgE atsakas imunizuojant antigeną. Aukštos sąveikos j÷gos IgE atsakas yra dominuojantis bruožas skalikų veisl÷s šunims, tačiau atopinis dermatitas kliniškai pasireiškia tik 40% skalikų veislių palikuonims. Labai svarbus aspektas yra tas, kad aukštos sąveikos j÷gos IgE indukuojama imunin÷ reakcija su alergenu turi įvykti iškarto po gimimo, bet jeigu tai neįvyksta iki 3 - 4 m÷nesių amžiaus – ji neefektyvi (Muller & Kirk’s, 2001).
Atopijos klinikinei išraiškai, be genetinių veiksnių, yra ir kiti svarbūs veiksniai. Vieno iš tyrimų metu nustatyta, kad yra ryšys tarp gimimo m÷nesio ir šunų atopijos pasireiškimo dažnumo. Atlikti tyrimai šunims, kurie buvo gimę žiedadulkių sezono pradžioje ir jiems dažniau pasireikšdavo atopija lyginant su ta grupe šunų, kuri buvo gimusi ne žiedadulkių sezono metu
.Galima daryti išvadą, kad šie šunys per pirmuosius 4 savo gyvenimo m÷nesius būna labai jautrūs pirminei sensibilizacijai, o tai patvirtina aukštos sąveikos j÷gos IgE eksperimento su skalikais modelį (Muller & Kirk’s, 2001).
30% iš skalikų veisl÷s šunų su aukštos sąveikos j÷gos IgE savaime išsivysto IgE reakcija į namų dulkių erkes, tuo tarpu kitiems skalikų veisl÷s šunims, tiek su aukštos sąveikos j÷gos IgE, tiek su žemos sąveikos j÷gos IgE išsivysto namų dulkių erk÷ms specifinis IgG. Tokie laboratorinių tyrimų duomenys rodo, kad visi tirti gyvūnai tur÷jo kontaktą su namų dulkių erk÷mis, be to, besivystantis specifinis IgE namų dulkių erk÷ms yra susietas su kitais faktoriais. Netgi tuo metu, kai aukštos sąveikos j÷gos IgE turintys individai, sergantys atopiniu dermatitu buvo veisiami tarpusavyje, tik daliai palikuonių buvo nustatytas atopinis dermatitas (Muller & Kirk’s, 2001).
Kai alergenas patenka skalikui į pašarą, skatinama IgG, bet ne IgE sintez÷. Šunų savininkai man÷, kad jų šunys neturi alerginiai ligai būdingų simptomų, tačiau supažindinti su niežulio klinikiniais požymiais jie papraš÷, kad jų augintiniai būtų išsamiau ištirti. Pasteb÷ta, kad tirtų šunų tarpe buvo tokių, kurie tur÷jo alergenui specifinį IgE, bet jiems nebuvo pasireiškę klinikiniai ligos simptomai (Muller & Kirk’s, 2001).
Šunų atopija klasifikuojama kaip I tipo alergin÷ (hiperjautrumo) reakcija, kurios metu sukeliama alergenui specifinio IgE sintez÷ šunims, turintiems genetinį polinkį į alergiją. Šunų IgE savyb÷s yra:
1. Esant antigenui nevyksta precipitacijos reakcija; 2. Netenka savo savybių 56°C temperatūroje; 3. Neaktyvina komplemento klasikiniu keliu; 4. Antigenin÷mis savyb÷mis panašus į žmogaus IgE;
5. Prausnitz-Küstner testo metu pasyviu būdu galintis pernešti (perduoti) atopinį jautrumą sveikiems šunims (Muller & Kirk’s, 2001).
Alergija sergantiems šunims stebima padid÷jusio bendro IgE kraujo serume kiekio stoka lyginant su sveikais šunimis. Pas sveikus šunis aptinkamas labai aukštas bendrojo IgE kiekis lyginat su žmoguje aptinkamu IgE kiekiu. Šį padid÷jimą įtakoja parazitų sukeltos infekcijos. IgE kiekis yra mažesnis pas laboratoriniuose eksperimentuose naudojamus šunis d÷l jų izoliacijos nuo aplinkos. IgE kiekis did÷ja su amžiumi iki 4 metų. Daugelis laboratorinių tyrimų rodo, kad alergenui specifinis IgE yra susietas su atopine liga. Šunų IgE taip pat jungiasi su epidermin÷mis Langerhanso ląstel÷mis pažeistoje atopin÷je odoje (Muller & Kirk’s, 2001).
Šie klinikinių tyrimų duomenys yra įtikinami įrodymai, kad alergeno specifinis IgE atlieka patogeno vaidmenį šunų atopin÷s ligos atveju. Tačiau yra skirtumų tarp žmogaus ir šuns atopin÷s ligos metu stebimo IgE:
1. Atopija buvo pasteb÷ta pacientams sergantiems agammaglobulinemija;
2. Alergenui specifinis IgE neaptinkamas nei atopiniuose šunyse, nei eksperimentiniu būdu susintezuotiems alergenams sveikuose šunyse;
3. Nenormaliai padid÷jęs IgE kiekis kraujo serume paprastai kinta esant nenuosekliam ligos paūm÷jimui ar gydymo metu (Muller & Kirk’s, 2001).
Vis d÷lto, alergenui specifinis IgE kiekis kraujo serume d÷l hiposensibilizacijos gali sumaž÷ti. In vitro testai, kurių metu galima įvertinti kraujo serume bendrą alergenui specifinio IgE kiekį, pateik÷ kitokias IgE sintez÷s galimybes. Daugelyje klinikinių tyrimų šių testų d÷ka buvo nustatyta, kad sveikų šunų kraujo serume taip pat vyksta alergenui specifinio IgE gamyba ir kad tai n÷ra tarpusavyje susiję su klinikiniais ligos simptomais. Atliekant šiuos bandomuosius steb÷jimus, šunų kraujo serume ir kitokius tyrimus su žmonių kraujo serumu pasteb÷ta, kad egzistuoja IgE heterogeniškumas. Atskirų tyrimų metu nustatyti du IgE poklasiai: IgE1 ir IgE2. Individams, kurių kraujo serume ir audiniuose yra prisijungęs IgE2, gali būti minimali klinikin÷ ligos išraiška arba gali visai nepasireikšti jos simptomatika. Kai aptinkamas IgE+ - stebima atopinis dermatitas (Muller & Kirk’s, 2001).
Atopinio dermatito patogenez÷ - IgE prisitvirtina prie minkštųjų audinių putliųjų ląstelių, ypatingai odoje, kuri yra pirminis organas „taikinys“ dalyvaujantis šunų atopin÷je ligoje. Putliosios ląstel÷s prisijungusios IgE reaguoja su jo specifiniu alergenu arba alergenais, ko pasekoje putliosios ląstel÷s degranuliuoja ir atpalaiduoja vazoaktyvias medžiagas. Tokia reakcija pasireiškia po intradermin÷s alergeno injekcijos ir yra teigiamos reakcijos bruožas. Įrodyta, kad IgE prisitvirtina prie epidermyje esančių Langerhanso ląstelių. Šunims, kuriems buvo stebimi atopiniai odos pažeidimai, epidermyje steb÷ta eozinofilų mikroagregacija ir Langerhanso ląstelių pagaus÷jimas. Netgi kliniškai sveikoje atopin÷je odoje steb÷tas Langerhanso ląstelių pagaus÷jimas. Taip pat šunio atopin÷je odoje vyksta aktyvi citokinų IL-4 ir IL-5 sintez÷, kuriuos gamina Th2 ląstel÷s. L÷tinio uždegimo metu vyksta aktyvi Th1 ląstelių gamyba, kurios sintetina IL-2 ir IFN-γ (Muller & Kirk’s, 2001).
Šunų atopinis dermatitas geriausiai apibr÷žiamas kaip daugiaveiksn÷ liga (angl. multifactoral), kuria sirgti turinčių genetinį polinkį šunų odos IgE savyb÷s yra sukelti ūmios ir v÷lyvos faz÷s alergines reakcijas patekus aplinkos antigenams į organizmą. Visi veiksniai, kaip imunologinių reakcijų nesuderinamumai, antigenų įtaka, pakitusios fiziologin÷s ir farmakologin÷s reakcijos bei genetinis polinkis yra labai svarbūs ligos patogenezei(Muller & Kirk’s, 2001).
2.7.2 Atopinio dermatito klinikiniai simptomai
Tam tikros šunų veisl÷s tokios kaip bokseriai, čichuachua, Gordono seteriai, Jorkšyro terjerai, šarp÷jai, kernterjerai, Vakarų Škotijos baltieji terjerai, škotų terjerai, Lasos apsai, ši cu,
šiurkščiaplaukiai foksterjerai, dalmantinai, mopsai, airių seteriai, Bostono terjerai, auksiaspalviai retriveriai, anglų seteriai, Labradoro retriveriai, kokerspanieliai, nykštukiniai šnauceriai, belgų terviurenai, šiba inu ir bošeronai yra linkusios sirgti atopine šunų liga. Kai kurie klinikiniai tyrimai teigia, kad atopija sirgti dažniau linkusios patel÷s, tačiau kitų klinikinų tyrimų duomenimis lytis tam įtakos neturi (Muller & Kirk’s, 2001).
Pirmieji klinikiniai simptomai, rodantys atopin÷s ligos pradžią, gali pasireikšti skirtingame šunų amžiuje - nuo 4 m÷nesių. iki 7 metų. Apie 70% šunų pirmieji ligos simptomai pasireiškia 1 ir 3 metų amžiuje. Tokioms veisl÷ms kaip akita, čiau čiau, auksiaspalviai retriveriai ir šarp÷jai pirmieji atopin÷s ligos simptomai pasireiškia per pirmuosius 2 gyvenimo m÷nesius. Tokie atvejai labiau būdingi palikuonims, kurių abu t÷vai serga atopine liga bei galima įvertinti kokioje aplinkoje šuniukai buvo auginami. Retai pasitaiko atvejų, kad vyresni šunys pakeitę gyvenamąją aplinką patiria atopin÷s ligos simptomatiką. Atopinei ligai yra būdingas sezoniškumas, tačiau apie 80% visų atopin÷s ligos klinikinių simptomų gali pasireikšti ir ne sezono metu. Nuo pavasario iki rudens, apie 80% atopine liga sergančių šunų stebimas klinikinių simptomų paūm÷jimas ir tik 20% atopine liga sergančių šunų simptomai pasireiškia žiemą (Muller & Kirk’s, 2001).
3. METODIKA
3.1 Tyrimų atlikimo vieta
Tyrimai buvo vykdomi 2011 - 2013 metais. 2011 - 2012 metais iš privačiuose namų ūkiuose esančių medžioklinių veislių šunų - Vakarų Sibiro laikų, rusų europinių laikų, takso, Labradorų retriverių, auksiaspalvių retriverių, Tailando ridžbeko, škotų terjero, Džeko Raselo terjerų, Vakarų Škotijos baltųjų terjerų, Velso terjerų, šiurkščiaplaukių ir trumpaplaukių foksterjerų, Jorkšyro terjerų, rusų spanielio, Sibiro haskių, tarnybinių šunų veislių - vokiečių aviganių, belgų aviganio (malinua), kelių dekoratyvinių veislių šunų - čiau čiau, pekino, čihuahua, amerikiečių Stafordšyro terjero, prancūzų buldogo, toiterjerų ir neveislinių šunų buvo paimti kraujo m÷giniai (n=60), iš paimtų kraujo m÷ginių gautas kraujo serumas. Iš įtariamų alergijai pacientų savininkų surinkta anamnez÷, įvertinta gyvūno elgsena ir būsena. Šunys tyrimams buvo pasirinkti visiškai atsitiktinai, įvairaus amžiaus, lyties, įvairių veislių bei tirti kai kurių t÷vų ir jų palikuonių kraujo serumai.
Imunologiniai kraujo serumo tyrimai atlikti Lietuvos sveikatos mokslų universitete, Veterinarijos akademijoje, Veterinarijos fakulteto Anatomijos ir fiziologijos katedros Imunologijos laboratorijoje, ištirti 55 veislinių šunų ir 5 neveislinių šunų kraujo serumai.
3.2 Tyrimų atlikimo schema
Mokslino tyrimo metu duomenys apie pacientą buvo registruojami sudarytoje lentel÷je (žr. 1 priedą). M÷giniai laboratoriniams tyrimams, atliktiems Anatomijos ir fiziologijos katedros Imunologijos laboratorijoje, imti iš 30 alergiškų ir 30 sveikų šunų. Imunoglobulinas E nustatytas iš kraujo serumo imunofermentinio tyrimo (ELISA) metodu.
Gavus tyrimų rezultatus, atliktas jų apibendrinimas, statistinis įvertinimas ir interpretavimas.
3.3.Tyrimo metodai
Duomenys, reikalingi moksliniam tyrimui atlikti, gauti pasinaudojant šiais duomenų gavimo būdais:
• 2011 - 2012 metais vykdytas šunų, esančių privačiuose namų ūkiuose registravimas, rinkta anamnez÷, įvertinta gyvūno elgsena ir būsena, atlikta duomenų analiz÷;
• 2013 metais iš kraujo serumo nustatytas bendras IgE kiekis iš alergiškų ir nealergiškų pacientų, atlikta duomenų analiz÷.
3.4 Imunoglobulino E nustatymas iš kraujo serumo imunofermentinio tyrimo metodu (ELISA)
Kraujo serumas laboratoriniams tyrimams buvo surinktas atsitiktinai iš 60 pacientų, iš kurių 30 šunų tur÷jo alerginiai ligai būdingus klinikinius požymius, o 30 netur÷jo. Į alergiją linkusių
pacientų savininkai pabr÷ž÷, kad klinikiniai simptomai, būdingi alergijai, pasikartodavo. Daugumai pacientų pasireikšdavo klasikiniai simptomai būdingi alergijai: kasymasis (nukasytose vietose infekcijos požymiai), papilv÷s ir tarpupirščių išb÷rimai, niež÷jimas, nedideli išb÷rimai ir žaizdel÷s išorin÷je ausies dalyje, kai kuriems pasireišk÷ rinitas ir konjunktyvitas. Kontrolinei grupei buvo atsitiktinai atrinkti 30 kliniškai sveiki pacientai, kurie netur÷jo alergijai būdingų simptomų.
Bendram IgE kiekiui kraujo serume nustatyti buvo atlikta imunofermentinio tyrimo ELISA reakcija, remiantis instrukcija, kurią nurodo gamintojas. Tyrimams buvo panaudotas „Benthyl Laboratories“ kompanijos ELISA rinkinys su visais reikalingais reagentais. Pirmiausia, ELISA plokštel÷ buvo padengiama ožkų anti-IgE antikūniais. Ant plokštel÷s užnešamas pagal instrukcijos nurodymus atskiestas tiriamasis šunų kraujo serumas ir teigiamas bei neigiamas kontroliniai serumai. Inkubuojama kambario temperatūroje (20 – 25 °C) 60 minučių. Po inkubacijos plokštel÷ plaunama buferiniu tirpalu (PBS) 5 kartus ir plokštel÷ užpildoma 200 µl blokuojančiu tirpalu. Tada v÷l inkubuojama kambario temperatūroje (20 – 25 °C) 30 minučių. Po inkubacijos plokštel÷ plaunama PBS 5 kartus ir užpildoma 100 µl standartu bei inkubuojama kambario temperatūroje (20 – 25 °C) 60 minučių. Po inkubacijos v÷l atliekamas plovimas PBS 5 kartus ir užnešama izotipinis žym÷tas fermentas krienų peroksidaz÷. Inkubuojama kambario temperatūroje (20 – 25 °C) 60 minučių. Po inkubacijos atliekamas plovimas PBS 5 kartus ir užpilamas substratas tetrametilbenzidinas (TMB), kurį gerai skaido krienų peroksidaz÷s fermentas. Po 15 minučių inkubacijos tamsoje kambario temperatūroje (20 – 25 °C), reakcija stabdoma 0,18 M H2SO4, plokštel÷ švelniai pasukin÷jama kelis kartus ratu ir sureagavę teigiami m÷giniai nusidažo m÷lynai. ELISA rezultatai buvo įvertinami vizualiai, o fotometru išmatuojamas optinis tankis (OD), sugerties spektras – 450 nm. Visiems pacientų kraujo serumams ištirti buvo iš viso panaudotos 3 plokštel÷s Gautas OD rezultatas naudojamas apskaičiuoti imunofermentin÷s reakcijos santykinį dydį:
OD vidurkis = OD tiriamojo serumo – OD neig. kontrol÷s OD teig.kontrol÷ – OD neig. kontrol÷s
3.5 Statistinis duomenų įvertinimas
Tyrimo duomenų statistinis įvertinimas atliktas statistiniu paketu SPSS Windows (13 versija). Apskaičiuotas lyginamų grupių tiriamųjų požymių vidutin÷s reikšm÷s (aritmetiniai vidurkiai) ir standartiniai nuokrypiai. Statistin÷ duomenų analiz÷ atlikta kompiuterine programa Microsoft Excel (2003, 2010). Paskaičiuoti aritmetiniai vidurkiai, duomenys pateikti procentine išraiška.
4. TYRIMŲ REZULATAI
4.1 Imunoglobulino E nustatymas alergiškų šunų kraujo serume
Imunologiniams kraujo serumo tyrimams buvo surinkti alergiškų šunų (n=30) kraujo serumai ir ištirti kiekybiniu imunofermentin÷s analiz÷s tyrimo metodu ELISA, fotometru išmatuotas optinis tankis, sugerties spektras – 450 nm. Gauti OD rezultatai buvo naudojami apskaičiuoti tiriamų m÷ginių OD vidurkiui. Imunoglobulino E (IgE) koncentracija buvo nustatoma pagal etaloninį „Benthyl Laboratories“ kraujo serumą, kuris buvo atskiestas nuo 1000 ng/ml iki 0 ng/ml IgE koncentracijos (žiūr÷ti 4 lentelę), iš viso 8 kartus.
4 lentel÷. Alergiškų šunų etaloninio kraujo serumo IgE koncentracija ir OD vidurkis (sudaryta autoriaus) Eil. nr. IgE konc. (ng/ml) OD Teigiamo kontrolinio serumo IgE konc., (ng/ml) 1. 1000 2,133 995,55 2. 500 1,924 495,61 3. 250 1,614 253,02 4. 125 1,059 123,38 5. 62,5 0,848 59,91 6. 31,25 0,455 34,24 7. 15,6 0,373 13,15 8. 0 0 0
Remiantis rezultatais, gautais 4 lentel÷je, pirmiausia buvo apskaičiuoti I tipo hiperjautrumo reakcijų klinikinius simptomus tur÷jusių šunų (n=30) OD vidurkiai ir tiriamojo kraujo serumo koncentracijos (žiūr÷ti 5 lentelę).
5 lentel÷. I tipo hiperjautrumo reakcijų klinikinius simptomus tur÷jusių pacientų kraujo serumo kiekybinio ELISA tyrimo rezultatai (sudaryta autoriaus)
Eil. nr. Veisl÷ Lytis Amžius, metais OD, 450 nm Apskaičiuota tiriamojo serumo IgE konc. (ng/ml) 1. Sibiro haskis ♂ 4 2,208 124,58 2. Sibiro haskis ♀ 3 2,278 124,62 3. Sibiro haskis ♀ 9 m÷n 2,090 124,43 4. Sibiro haskis ♀ 2 2,252 124,61
5. Vakarų Sibiro laika ♂ 5 1,908 61,88
6. Vakarų Sibiro laika ♀ 6 2,300 124,72
7. Vakarų Sibiro laika ♀ 1,5 2,404 124,87
8. Vakarų Sibiro laika ♀ 1 2,355 124,83
9. Vakarų Sibiro laika ♀ 1 2,468 124,89
10. Vakarų Sibiro laika ♀ 1 2,135 124,44
11. Vakarų Sibiro laika ♀ 1 2,046 124,44
12. Vakarų Sibiro laika ♂ 1 2,277 124,62
13. Trumpaplaukis taksas ♂ 4 2,337 124,83
14. Labradoro retriveris ♀ 3 2,111 124,44
15. Auksiaspalvis retriveris ♂ 7 2,136 124,44
16. Tailando ridžbekas ♂ 1 1,961 62,11
17. Škotų terjeras ♂ 10,5 2,317 124,73
18. Džeko Raselo terjeras ♂ 2 2,370 124,84
19. Vokiečių aviganis ♂ 1,5 1,833 61,83
20.
Amerikiečių Stafordšyro
terjeras ♂ 5 2,329 124,74
21. Jorkšyro terjeras ♂ 3 2,101 124,43
22. Vakarų Škotijos baltasis terjeras ♀ 6 2,306 124,73
23. Rusų europin÷ laika ♀ 6 2,236 124,49
24. Rusų europin÷ laika ♂ 5 2,348 124,83
25. Karelų-suomių laika ♂ 1,5 1,811 61,81 26. Velso terjeras ♂ 2 1,867 61,82 27. Velso terjeras ♀ 2 1,856 61,81 28. Trumpaplaukis foksterjeras ♀ 3 2,028 124,44 29. Kurtsharas ♂ 5 1,925 62,06 30. Dratharas ♂ 6 2,038 124,44
Kiekybinis ELISA tyrimas parod÷, kad I tipo hiperjautrumo reakcijų klinikinius simptomus turintys pacientai pasižym÷jo palyginus aukšta IgE koncentracija kraujo serume, kuri siek÷ 61,81 ng/ml – 124,89 ng/ml, tačiau statistiškai patikimo IgE bendrojo kiekio padid÷jimo nebuvo nustatyta. Remiantis 5 lentel÷je pateiktais duomenimis, buvo nuspręsta pacientus (n=30) suskirstyti pagal veislę, amžių, lytį ir atitinkamai apskaičiuoti kraujo serumo IgE koncentracijas ir OD vidurkius, kuriems pasireiškia I tipo padidinto hiperjautrumo reakcijų klinikiniai simptomai (žiūr÷ti 6 lentelę).
6 lentel÷. I tipo padidinto hiperjautrumo reakcijas tur÷jusių pacientų pasiskirstymas priklausomai nuo veisl÷s (sudaryta autoriaus)
Veisl÷ Pacientų skaičius, n=30 Pacientų skaičius, % OD, vidurkis Apskaičiuota tiriamojo serumo IgE
konc. (ng/ml), vidurkis
Sibiro haskis 4 13,33 2,207 124,56
Vakarų Sibiro laika 8 26,70 2,236 116,84
Trumpaplaukis taksas 1 3,33 2,337 124,83
Labradoro retriveris 1 3,33 2,111 124,44
Auksiaspalvis retriveris 1 3,33 2,136 124,44
Tailando ridžbekas 1 3,33 1,961 62,11
Škotų terjeras 1 3,33 2,317 124,73
Džeko Raselo terjeras 1 3,33 2,370 124,84
Vokiečių aviganis 1 3,33 1,733 61,83
Amerikiečių Stafordšyro terjeras 1 3,33 2,323 124,74
Jorkšyro terjeras 1 3,33 2,101 124,43
Vakarų Škotijos baltasis terjeras 1 3,33 2,306 124,73
Rusų europin÷ laika 2 6,67 2,292 124,66
Karelų-suomių laika 1 3,33 1,811 61,81
Velso terjeras 2 6,67 1,861 61,82
Trumpaplaukis foksterjeras 1 3,33 2,028 124,44
Kurtsharas 1 3,33 1,925 62,06
Šunų pasiskirstymas pagal veislę netur÷jo įtakos reikšmingam IgE koncentracijos padid÷jimui alergiškų šunų kraujo serumo m÷giniuose, beje, tas pats pasteb÷ta, kai pacientai buvo suskirstyti pagal lyties faktorių (žiūr÷ti 7 lentelę).
7 lentel÷. I tipo padidinto hiperjautrumo reakcijas tur÷jusių pacientų pasiskirstymas priklausomai nuo lyties (sudaryta autoriaus)
Lytis Pacientų skaičius, n=30 Pacientų skaičius, % OD, vidurkis Apskaičiuota tiriamojo serumo IgE konc. (ng/ml), vidurkis Patel÷s, ♀ 14 46,70 2,204 120,13 Patinai, ♂ 16 53,30 2,110 101,12
Pacientus suskirsčius pagal amžiaus grupes buvo nustatyta, kad amžius tur÷jo įtakos IgE koncentracijai kraujo serume ir gautas statistiškai patikimas dydis (p<0,05) (žiūr÷ti 8 lentelę).
8 lentel÷. I tipo padidinto hiperjautrumo reakcijas tur÷jusių pacientų pasiskirstymas priklausomai nuo amžiaus (sudaryta autoriaus)
Amžius Pacientų skaičius, n=30 Pacientų skaičius, % OD, vidurkis Apskaičiuota tiriamojo serumo IgE konc. (ng/ml), vidurkis iki 6 m÷n. 0 0,00 0,000 0,00 6 - 12 m÷n 1 3,33 2,090 124,43 1 - 3 metų 13 43,30 2,126 103,77 3 - 6 metų 10 33,30 2,176 105,33 nuo 6 metų 6 20,00 2,222 124,59
Duomenų palyginimui, kaip I tipo padidinto hiperjautrumo reakcijos pasiskirsto tarp alergiškų ir nealergiškų pacientų, buvo atsitiktinai atrinkta 30 kliniškai sveikų šunų kraujo serumai. Imunoglobulino E koncentracija juose buvo nustatoma lygiai taip pat, pirmiausia atskiedžiant „Benthyl Laboratories“ etaloninį kraujo serumą 8 kartus nuo 1000 ng/ml iki 0 ng/ml (žiūr÷ti 9 lentelę)
9 lentel÷. Nealergiškų šunų etaloninio kraujo serumo IgE koncentracija ir OD vidurkis (sudaryta autoriaus) Eil. nr. IgE konc. (ng/ml) OD Teigiamo kontrolinio serumo IgE konc., (ng/ml) Nustatyta, skaičius ir % (n=30) 1 1000 - 995,55 - - 2 500 - 495,61 - - 3 250 - 253,02 - - 4 125 - 123,38 - - 5 62,5 0,822 59,91 6 20,00 6 31,25 0,620 34,24 8 26,67 7 15,6 0,448 13,15 6 20,00 8 0 - 0 - -
Remiantis duomenimis 9 lentel÷je buvo apskaičiuota I tipo padidinto hiperjautrumo reakcijų klinikinių simptomų netur÷jusių šunų tiriamojo kraujo serumo koncentracija ir OD vidurkiai ( žiūr÷ti 10 lentelę)
10 lentel÷. I tipo padidinto hiperjautrumo reakcijų klinikinių simptomų netur÷jusių pacientų kraujo serumo kiekybinio ELISA tyrimo rezultatai (sudaryta autoriaus)
Eil. nr. Veisl÷ Lytis Amžius, metais OD, 450 nm Apskaičiuota tiriamojo serumo IgE konc. (ng/ml) 1. Labradoro retriveris ♂ 3,5 0,471 1,65 2. Pekinas ♀ 3 0,360 1,63 3. Prancūzų buldogas ♂ 4 0,421 1,71 4. Mišrūnas ♂ 6 0,329 1,48 5. Mišrunas ♂ 1,5 0,360 1,63 6. Mišrūnas ♂ 5 0,303 1,08 7. Mišrūnas ♂ 5 0,341 1,52 8. Mišrūnas ♂ 5 0,421 1,71 9. Čihuahua ♂ 3 0,820 7,36 10. Jorkšyro terjeras ♂ 6 0,829 7,37
11. Vakarų Sibiro laika ♂ 6 0,287 0,00
12.
Šiurkščiaplaukis
foksterjeras ♀ 5 0,806 7,32
14. Belgų aviganis (malinua) ♀ 6 m÷n. 0,460 4,23 15. Čiau čiau ♀ 2 0,686 4,47 16. Toiterjeras ♂ 5,5 0,798 4,57 17. Toiterjeras ♀ 7 0,512 4,26 18. Toiterjeras ♀ 5 0,444 1,65 19.
Vakarų Škotijos baltasis
terjeras ♀ 5 0,835 7,37
20. Vokiečių aviganis ♀ 9 m÷n 0,389 1,69
21. Rusų spanielis ♂ 2 0,447 1,72
22. Džeko Raselo terjeras ♀ 2 0,665 4,43
23. Trumpaplaukis foksterjeras ♂ 3 0,841 7,37
24.. Rusų europin÷ laika ♂ 3 0,322 1,18
25. Rusų europin÷ laika ♂ 4 0,371 1,65
26. Sibiro haskis ♀ 9 m÷n 0,487 1,77
27. Vokiečių aviganis ♂ 14 0,287 0,00
28. Karelų-suomių laika ♀ 3 0,625 4,43
29. Velso terjeras ♀ 3 0,804 7,36
30. Velso terjeras ♂ 2 0,711 4,47
Kiekybinis ELISA tyrimas parod÷, kad I tipo hiperjautrumo reakcijų klinikinius simptomus neturintys pacientai pasižym÷jo žema IgE koncentracija kraujo serume, kuri siek÷ 0 ng/ml – 7,37 ng/ml, tačiau statistiškai patikimo IgE bendrojo kiekio sumaž÷jimo nebuvo nustatyta.
4.2 I tipo padidinto hiperjautrumo reakcijų klinikiniai požymiai
Atlikus laboratorinius tyrimus su alergiškų šunų kraujo serumais ir nustačius juose IgE koncentraciją, buvo nuspręsta nustatyti, kokius dažniausiai pasitaikančius I tipo padidinto hiperjautrumo reakcijos klinikinius simptomus tur÷jo pacientai . Klinikiniai simptomai nustatyti remiantis pacientų savininkų anamneze (žiūr÷ti 11 lentelę).
11 lentel÷. I tipo padidinto hiperjautrumo reakcijų klinikiniai simptomai (sudaryta autoriaus) Eil.
nr.
I tipo hiperjautrumo
reakcija Klinikiniai simptomai
1.
Atopija
Niež÷jimas ypatingai snukio, p÷dų ir pilvo srityje, tačiau gali niež÷ti ir visą kūną; išplikimas, paraudimas, hiperpigmentacija dažnai tampa niež÷jimo priežastimi; išorin÷s ausies uždegimas; konjunktyvitas; paraanalinių liaukų uždegimas; antrinis bakterinis uždegimas; antrinis bakterinis dermatitas; antrin÷ seborijin÷ dermatoz÷; laižymo sukeltas dermatitas; viršutinių kv÷pavimo takų uždegimo požymiai
2. Alerginis kontaktinis dermatitas
Niež÷jimas, ypač tų kūno vietų, kurios negausiai apaugusios plaukais: krūtin÷s, kirkšnių, tarpviet÷s, letenų; alerginis kontaktinis dermatitas gali apimti bet kurią kūno vietą, tačiau
dažniausiai pažeidžiama išorin÷ ausies landa
3. Otitas Ausų purtymas, viduje šlapia, juoda siera
4.
Konjunktyvitas Paraudimas, patinimas, padid÷jęs ašarojimas, nenoras atverti akis
5.
Alergija pašarui
Nuolatinis niež÷jimas, niežti pilvo, kai kurioms šunų veisl÷ms (škotų terjeras it kt.) snukio, uodegos ir tarpviet÷s sritis, pasitaiko išorin÷s ausies uždegimas. L÷tinis uždegimas sąlygoja išplikimą, paraudimą, odos sustor÷jimus
Remiantis 9 lentel÷je pateiktais duomenimis, buvo nustatytas I tipo padidinto hiperjautrumo reakcijos pasiskirstymas tarp tirtų pacientų (n=12), kuriems pasireišk÷ alergijai būdingi simptomai (žiūr÷ti 10 lentelę)
12 lentel÷. I tipo padidinto hiperjautrumo reakcijos pasiskirstymas (sudaryta autoriaus) Padidinto jautrumo reakcija Pacientų skaičius, vnt %, n=12 Atopija 4 33,33 Alerginis kontaktinis dermatitas 3 25,00 Otitas 1 8,33 Konjunktyvitas 0 0,00 Pioderma 1 8,33 Alergija pašarui 3 25,00
Remiantis 12 lentel÷je pateiktais duomenimis nustatyta, kad dažniausiai pasitaikantys I tipo padidinto hiperjautrumo klinikiniai simptomai buvo atopija (n=4), alerginis kontaktinis dermatitas
5. TYRIMŲ REZULTATŲ APTARIMAS
Mūsų atlikti 60 šunų kraujo serumo tyrimai parod÷, kad jie visi tur÷jo pakankamai aukštus IgE kiekius (61,81 iki 124,89 ng/ml). IgE koncentracijos skirtumai tarp įvairių šunų veislių ir skirtingų lyčių pacientų kraujo serume nebuvo statistiškai patikimi. Nors mokslin÷je literatūroje sitinkama duomenų, kad imunoglobulinų konventracija priklauso ne tik nuo padidinto jautrumo reakcijos alergenui, bet ir nuo veisl÷s (Provost et al., 2003). Be to, didesn÷s IgE koncentracijos nustaytos patelių nei patinų serume (Racine et al., 1999) bei senesniems šunims (Glickman et al., 1988). Mūsų tyrimai parod÷, kad tikslinga yra tirti privačiuose namų ūkiuose esančius šunys, nes dažniausiai jų šeimininkai su savo augintiniu pas veterinarijos gydytoją apsilanko labai retai, periodiškai. Ištirti šunų kraujo serumai parod÷, kad IgE koncentracijos atžvilgiu galima patvirtinti I tipo padidinto hiperjautrumo reakcijų pasireiškimą ir diagnozę.
Atlikus tyrimus ir patikrinus lyties faktorio įtaką alergiškų šunų IgE koncentracijai kraujo serume nustatyta, kad n÷ra statistiškai reikšmingo skirtumo tarp patinų ir patelių (žiūr÷ti 7 lentelę). Tyrimams buvo surinkta panašus skaičius moteriškosios lyties atstovių (n=14) vyriškosios (n=16). Optinis vidurkis (OD) ir perskaičiuotas IgE kiekis tiriamajame kraujo serume buvo atitinkamai panašūs (žiūr÷ti 7 lentelę), vadinasi galime teigti, kad šie skirtumai n÷ra reikšmingi.
Įdomūs rezultatai gauti iš tyrimų kur buvo tiriama IgE koncentracijos įtaka pacientų amžiui. Tyrimais nustatyta statistiškai reikšmingas dydis (8 lentel÷). Vyresnių pacientų IgE koncentracija kraujo serume buvo didesn÷, nes mūsų manymu, I tipo padidinto hiperjautrumo reakcijai atsirasti reikia ilgesn÷s organizmo sensibilizacijos, kuomet IgE receptorių Fc sritis prisijungia prie putliųjų ląstelių ir bazofilų.
Atlikti tyrimai su kliniškai sveikų nealergiškų šunų kraujo serumais parod÷, kad I tipo padidinto hiperjautrumo reakcijų alergijos klinikinių simptomų netur÷ję pacientai nepasižym÷jo didel÷mis IgE koncentracijomis (žiūr÷ti 10 lentelę). Kai kurių pacientų IgE koncentracija kraujo serume tokia kaip 7,37 ng/ml, gal÷tų galbūt būti signalu, kad pacientas yra sensibilizuotas, tačiau tai neįrodo IgE kiekio padid÷jimo.
Mokslin÷je literatūroje yra duomenų nagrin÷jančių veisl÷s jautrumą alergin÷ms reakcijoms (Počta ir Svoboda, 2007). Manoma, kad terjerai, bokseriai, dalmantinai, buldogai, seteriai ir Labradoro retriveriai pasižymi didesniu padidintu jautrumou alergenams (Saridomichelakis et al., 1999; Picco et al., 2008). Mūsų duomenimis, ženklus I tipo padidinto hiperjautrumo reakcijos pareiškimas skirtingoms veisl÷ms nenustatytas (žiūr÷ti 12 lentelę). Vienos dažniausiai nustatomų padidinto jautrumų reakcijų šunims yra atopija n=33,33%, alerginis kontaktinis dermatitas
n=25,00% (Marsella ir Girolomoni, 2009; Počta ir Svoboda, 2007) ir alergija pašarui n=25,00%. Tai sutinka ir su mūsų duomenimis.
Privačiuose namų ūkiuose atlikti klinikiniai pacientų ir laboratoriniai tyrimai aiškiai parod÷, kad I tipo padidnto jautrumo reakcijos tam tikrų veislių medžioklinių, tarnybinių, dekoratyvinių bei mišrūnų šunų tarpe yra pakankamai dažnos ir reikalauja išsamesnių tyrimų. Taip pat reik÷tų pamin÷ti faktą, kad gauti tyrimų rezultatai yra tik prelimenarūs, kadangi reik÷tų ilgesnio laiko ir žymiai daugiau pacientų nustyti statistiškai patikimus rezultatus.
IŠVADOS
1. Privačiuose namų ūkiuose esančių medžioklinių, tarnybinių, dekoratyvinių veislių šunų (n=12) pagrindiniai klinikiai I tipo alergijai būdingi požymiai yra atopija (n=4), alerginis kontaktinis dermatitas (n=3), maistin÷ alergija (n=3), otitas (n=1) ir pioderma (n=1), kurie tyrimų metu kartojosi du ir daugiau kartų.
2. I tipo padidinto jautrumo reakcijai būdingus klinikinius simptomus turinčių šunų (n=30) imunoglobulino E (IgE) koncentracija kraujo serume padid÷ja nuo 61,81 iki 124,89 ng/ml. 3. Maksimali IgE koncentracija kliniškai sveikų, netur÷jusių I tipo padidinto jautrumo
reakcijos simptomų, šunų (n=30) kraujo serume gali siekti 1,08 ng/ml - 7,37 ng/ml, tačiau visais nustatytais atvejais ji buvo reikšmingai mažesn÷ už alergiškų šunų IgE koncentraciją (P<0,05).
4. Lyties ir šunų veisl÷s faktoriai netur÷jo įtakos reikšmingam IgE koncentracijos padid÷jimui alergiškų šunų kraujo serumo m÷giniuose, tačiau atskirų pacientų IgE koncentracija atitinkamai siek÷ 101,12 - 120,13 ng/ml lyties atžvilgiu ir 61,81 iki 124,89 ng/ml veisl÷s atžvilgiu.
5. Vyresnių nei 6 metų amžiaus alergiškų šunų IgE koncentracija (124,59 ng/ml ) buvo statistiškai reikšmingai didesn÷ už 3-6 metų (105,33 ng/ml) ir 1-3 metų alergiškų šunų (103,77 ng/ml ) IgE koncentraciją kraujo serume (p< 0,05).
PADöKA
Nor÷čiau pad÷koti savo darbo vadovui gerb. doc. dr. Arūnui Stankevičiui už nuoširdžią pagalbą atliekant laboratorinius tyrimus ir kritines pastabas rašant baigiamajį magistro darbą.
SUMMARY
The study of allergy and allergic diseases has fascinated scientists in veterinary field for many years. The immune responses and supposed to be protective. It is very important to answer the question how and why does the damaging immune response (allergy) develop. Therefore, the understanding of the disease process and immunological mechanisms will help with the delivery of better therapeutic approaches.
The aim of this work was to estimate the total immunoglobulin E level in allergic dogs blood serum and to evaluate the prevalance and circumstances of type I hypersensitivity reactions using clinical and laboratory methods among foxhounds, war-dogs, decorative breeds and nonpurebred dogs, which occurs in private home property.
Tasks:
1. To evaluate the most common symptoms of allergies between foxhounds, war-dogs, decorative breeds and nonpurebred dogs in private home property, and to investigate the affect of dogs sex and age;
2. To estimate common total immunoglobulin E level content and to compare it with clinically healthy dogs data;
3. To estimate the immnunoglobulin E antibodies concentration in atopic dogs blood serum by ELISA.
For our study we have collected the blood serum from 60 patients, where 30 of them had clinical simptoms appropriate to atopic disease and 30 were clinically healthy. The owners of some atopic patients accentuated that clinical simptoms of allergy such as scratching, underbelly and inter-digists exanthemas, pruritus, tiny wounds and small exanthemas in the auricle were recurring from time to time. The blood serum of all patients have been analised by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of dogs immunoglobulin E (IgE).
Our studies exposed that patients (n=30) with IgE concentration in blood serum from 61,81 ng/ml to 124,89 ng/ml had clinical signs appropriate to atopic disease, whereas IgE concentration in healthy dogs (n=30) blood serum were from 1,08 ng/ml to 7,37 ng/ml. Furthermore, we evaluated the IgE concentrations of atopic dogs considering breed, age and sex. Results had showed that IgE concentration magnificence according to dog‘s breed was not statistically purposeful value between atopic dogs, because breeds like Siberian huskies or West Siberian laikas have had high level of IgE in blood serum, but dogs have not showed any clinical simptoms. The more important role in this study that performed was atopic dogs age, which was estimated statistically dependable value. Senior dogs (n=6) from 6 years of age had higher IgE concentration in blood serum 124,59 ng/ml, while younger dogs (n=10) from 3 to 6 years of age had 105,33 ng/ml and dogs (n=13) from 1 to 3
years of age had 103,77 ng/ml. Lastly, we investigated the sex factor between atopic dogs. Females (n=14) had higher IgE concentration in blood serum 120,13 ng/ml, when males (n=16) had 101,12 ng/ml.
LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Barret, E.G., Rudolph, K., Bowen, L.E., Bice, D.E.: Immunology 110: 493 – 500, 2003.
2. Bethony, J., Loukas A., Smout, M., Brooker, S., Mendez, S., Plieskatt, J., Goud, G., Botazzi, M.E., Zhan, B., Wang, Y., Williamson A., Lustigman, S., Correa-Oliveira, R., Xiao, S., Hotez, P.J., 2005. Antibodies against a secreted protein from hookworm larvae reduce the intensity of hookworm infection in humans and vaccinated laboratory animals. FASEB. J. 19, 1743 – 1745.
3. Bieber, T., 2007. The pro- and anti-inflammatory properties of human antigen-presenting cells expressing the high affinity receptor for IgE (Fc epsilon RI). Immunobiology 212, 499 – 503.
4. Bruhns, P., Fremont, S., Daeron, M., 2005. Regulations of allergy by Fc receptors. Curr. Opin. Immunol. 17, 662 – 669.
5. Capron, M., Capron, A., 1994. Immunoglobulin E and effector cells in schistosomiasis. Science 264, 1876 – 1877.
6. Chang, T.W., 2000. The pharmacological basis of anti-IgE therapy. Nat. Biothechnol. 18, 157 – 162.
7. Chang, T.W., Shiung, Y.Y., 2006. Anti-IgE as a mast cell-stabilizing therapeutic agent. J. Allergy Clin. Immunol. 117, 1203 – 1212.
8. Chang, T.W., Wu, P.C., Hsu, C.L., Hung, A.F., 2007. Anti-IgE antibodies for the treatment of IgE-mediated allergic diseases. Adv, Immunol. 93, 63 – 119.
9. de Weck, A.L., Mayer, P., Stumper, B., Schiessl, B., Pickart, L., 1997. Dog allergy – a model for allergy genetics. Int. Arch. Allergy Immunol. 113, 55 – 57.
10. Else, K.J., Finkelman, F.D., 1998. Intestinal nematode parasites, cytokines and effector mechanisms. Int. J. Parasitol. 28, 1145 – 1158.
11. Finkelman, F.D., Shea-Donuhue, T., Morris, S.C., Gildea, L., Strait, R., Madden, K.B., Schopf, L., Urban Jr., J.F., 2004. Interleukin-4- and interleukin-13-mediated host protection against intestinal nematode parasites. Immunol. Rev. 201, 139 – 155.
12. Goedert, S., Schiessl, B., Zunic, M., Schiebl, C., Mayer, P., de Weck, A.L., Liehl, E., Mudde, G.C., 2000. In vitro IgE but not IgG production of canine peripheral blood B cells is inhibited by CD40 ligation. Vet. Immunol. Immunopathol. 75, 135 – 149.
13. Hellman, L., 2008. Therapeutic vaccines against IgE-mediated allergies. Expert Rev. Vaccines 7, 193 – 208.
