TECHNOLOGINIŲ VEIKSNIŲ ĮTAKOS TYRIMAS JUODŲJŲ SERBENTŲ LAPŲ ETANOLINĖS IŠTRAUKOS KOKYBEI

FARMACIJOS FAKULTETAS

VAISTŲ TECHNOLOGIJOS IR SOCIALINĖS FARMACIJOS KATEDRA

GINTARĖ DEDELAITĖ

TECHNOLOGINIŲ VEIKSNIŲ ĮTAKOS TYRIMAS JUODŲJŲ

SERBENTŲ LAPŲ ETANOLINĖS IŠTRAUKOS KOKYBEI

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas Doc. Dr. Zenona Kalvėnienė

FARMACIJOS FAKULTETAS

VAISTŲ TECHNOLOGIJOS IR SOCIALINĖS FARMACIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanė prof. dr. Ramunė Morkūnienė Data:

TECHNOLOGINIŲ VEIKSNIŲ ĮTAKOS TYRIMAS JUODŲJŲ

SERBENTŲ LAPŲ ETANOLINĖS IŠTRAUKOS KOKYBEI

Magistro baigiamasis darbas

Recenzentas: Darbo vadovas

Doc. dr. Zenona Kalvėnienė Data: Data:

Darbą atliko

Magistrantė Gintarė Dedelaitė Data

SANTRUMPOS ... 5 SANTRAUKA ... 6 SUMMARY ... 7 PADĖKA ... 8 ŽODYNĖLIS ... 9 ĮVADAS ... 10

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 11

1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 12

1.1 Ekstrakcijos metodai ... 12

1.1.1.Maceracija ... 12

1.1.2. Ekstrakcija ultragarsu ... 13

1.1.3. Perkoliacija ... 14

1.2 Juodieji serbentai vieni vertingiausių uoginių augalų ... 14

1.3 Juodųjų serbentų žaliava ... 15

1.4 Juodųjų serbentų žaliavos cheminė sudėtis ... 16

1.5 Juodųjų serbentų gydomosios savybės ... 17

1.5.1 Juodųjų serbentų gydomojo poveikio tyrimai ... 18

1.6 Fenoliniai junginiai – natūralios augalų veikliosios medžiagos ... 19

1.7 Flavonoidai ... 20

1.8 Antioksidantai ... 21

1.9. Literatūros apžvalgos apibendrinimas ... 22

2. TYRIMO METODIKA IR METODAI ... 23

2.1. Darbo objektai ... 23

2.2. Darbe naudotos medžiagos ir prietaisai ... 23

2.3. Atlikti tyrimai ... 24

2.4. Juodųjų serbentų lapų augalinės žaliavos tyrimų metodikos ... 25

2.4.1 Nuodžiūvio nustatymas vaistinėje augalinėje žaliavoje. ... 25

2.4.2 Juodųjų serbentų lapų žaliavos smulkumo nustatymas ... 25

2.4.3 Sausos liekanos nustatymas augalinėse ištraukose ... 25

2.5 Ištraukų gamyba iš juodųjų serbentų lapų ... 25

2.5.1 Ištraukos gamyba panaudojant ultragarsą nebrinkinant žaliavos ... 26

2.5.2 Ištraukos gamyba panaudojant ultragarsą su brinkinimu ... 26

2.5.3 Ištraukos gamyba maceracijos būdu ... 26

2.7.1 Antioksidacinio aktyvumo nustatymas juodųjų serbentų lapų ištraukoje ... 28

2.8. Statistinė duomenų analizė ... 28

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 29

3.1 Maceracijos būdu pagamintų ištraukų analizė ... 29

3.2 Ištraukos gamyba brinkinant žaliavą ir panaudojant ultragarsą ... 30

3.3 Ištraukos gamyba panaudojant ultragarsą be brinkinimo ... 35

4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 37

5. IŠVADOS ... 38

6. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 39

IFV-A – A tipo gripo virusas IFV-B - B tipo gripo virusas AdV– adenovirusas

RSV – respiracinis sincitinis virusas DTL – didelio tankio lipoproteinai MTL– mažo tankio lipoproteinai H7N7 – paukščių gripo virusas H1N1 – kiaulių gripo virusas

Gintarės Dedelaitės magistro baigiamasis darbas „Technologinių veiksnių įtakos tyrimas juodųjų serbentų lapų etanolinės ištraukos kokybei“

/

mokslinė vadovė doc. dr. Z. Kalvėnienė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Vaistų technologijos ir socialinės farmacijos katedra. – Kaunas.

Tikslas: ištirti kai kurių technologinių veiksnių įtaką juodųjų serbentų lapų etanolinės ištraukos kokybei, naudojant klasikinį maceracijos metodą ir dinaminę ekstrakciją - ultragarsą.

Darbo uždaviniai: 1. Išsiaiškinti, kurie technologiniai veiksniai turi įtakos juodųjų serbentų žaliavoje esančių veikliųjų medžiagų išeigai, atsižvelgiant į ekstrahavimo metodą, žaliavos ir ekstrahento santykį ir ekstrahavimo laiką. 2. Parinkti ekstrahavimo metodus ir parengti procedūras juodųjų serbentų lapų etanolinių ištraukų gamybai. 3. Pagamintose juodųjų serbentų lapų ištraukose nustatyti fenolinių junginių kiekį naudojant Folin-Ciocalteu metodą ir antioksidacinį aktyvumą DPPH● laisvojo radikalo sujungimo metodą.

Tyrimo metodai: sietų metodas, augalinės žaliavos norimo smulkumo frakcijai atskirti gravimetrinis – sausos liekanos nustatymui, spektrofotometrinis – fenolinių junginių nustatymui, antioksidaciniam aktyvumui nustatyti - DPPH●laisvojo radikalo inaktyvinimo metodas.

Tyrimo rezultatai: Atlikus juodųjų serbentų lapų ekstrahavimą 70 procentų etanoliu, nustatyta, kad technologiniai veiksniai - ekstrahavimo metodas, ekstrahavimo laikas, žaliavos ir ekstrahento santykis turi reikšmingą įtaką ištraukų kokybės rodikliams: fenoliniams junginiams, antioksidaciniam aktyvumui ir sausai liekanai.

Įvertinus žaliavos ir ekstrahento santykio įtaką ištraukos kokybei nustatyta, kad esant didesniam ekstrahento kiekiui kokybės rodikliai mažėja, todėl netikslinga gaminti ištraukas didesniu santykiu kaip 1:10

Ekstrahuojant juodųjų serbentų žaliavą ultragarso pagalba nustatyta, kad ekstrahavimo laikas (10 ir 30 min. ) ištraukos kokybei reikšmingos įtakos neturėjo, jeigu žaliava yra vieną valandą brinkinama prieš paveikiant ultragarsu. Nebrinkinant žaliavos fenolinių junginių kiekis ir antioksidacinis aktyvumas gaunamas trigubai mažesnis.

G. Dedelaitė. Master's thesis ,,Investigation of the influence of technological factors on the quality of ethanolic extract of black currant leaves“/ Scientific leader doc . Dr. Z. Kalvėnienė; Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, Department of Drug Technology and Social Pharmacy. - Kaunas.

The aim: To investigate some of the technological factors influence on the quality of ethanol extracts of black currant leaves prepared by classic maceration method and dynamic extraction using ultrasound.

Objectives: 1. To find out which technological factors can influence the yield of active substances in the herbal material of black currant leaves, depending on the extraction method, the ratio of the raw material to the extraction solvent and the extraction time. 2. To select extraction methods and prepare procedures for the production of ethanolic extracts of black currant leaves. 3. To determine the total amount of phenolic compounds using Folin-Ciocalteu method and antioxidant activity by DPPH ● free radical inhibition method in the extracts of black currant leaves.

Methodology: The sieve method to separate the plant material to the desired fineness fractions, gravimetric - determination of dry residue, spectrophotometric method for determination of total amount of phenolic compounds, determination of DPPH free radical inactivation reaction for antioxidant activity.

In vivo – bandymas ar tyrimas atliekamas arba stebimas gyvame organizme In vitro - bandymas, atliekamas dirbtinėje sistemoje

ĮVADAS

Gausus fenolinių junginių kiekis, esantis juodųjų serbentų žaliavoje, lemia jų platų medicininį pritaikymą. Juodųjų serbentų lapų, pumpurų ir uogų ištraukos pasižymi priešuždegiminiu, antimikrobiniu, priešvirusiniu, antialerginiu ir net priešvėžiniu poveikiu. Pasaulio mokslininkų atlikti tyrimai parodė, kad juodųjų serbentų lapuose esantis fenolinių junginių kiekis penkis kartus didesnis už uogose esantį kiekį [20]. Juodųjų serbentų ištraukų antioksidacinį aktyvumą tyrę Belgijos mokslininkai nustatė, kad didžiausiu antioksidaciniu aktyvumu pasižymi serbentų lapų ištraukos, po jų seka pumpurų ištraukos ir uogos [30]. Išdžiovintų juodųjų serbentų lapai gausiai kaupia rutino, kvercetino, hyperozido, izokvercetino, kamferol -3-O- rutinozido, kumaro ir chlorogeno rūgšties [20].

Tiriamasis objektas šiame darbe yra juodųjų serbentų lapai ir jų etanolinės ištraukos, pagamintos naudojant klasikinį maceracijos metodą ir dinaminį maceracijos metodą ultragarsu. Literatūros duomenimis augalinių ištraukų kokybei įtakos taip pat turi ekstrahavimo laikas, temperatūra, žaliavos ir ekstrahento santykis. Optimalias ekstrahavimo sąlygas įvairioms augalinėms žaliavoms savo publikacijose pateikia tyrėjai. Australijos mokslininkai optimizavo ultragarso galią, laiką ir temperatūrą makadamijų ištraukos gamybai, Vokietijos mokslininkai mėlynių ir spanguolių , Ispanijos – vynuogių ištraukoms gaminti.

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Tikslas: ištirti kai kurių technologinių veiksnių įtaką juodųjų serbentų lapų etanolinės ištraukos kokybei.

Darbo uždaviniai:

1. Išsiaiškinti, kurie technologiniai veiksniai turi įtakos juodųjų serbentų žaliavoje esančių veikliųjų medžiagų išeigai, atsižvelgiant į ekstrahavimo metodą, žaliavos ir ekstrahento santykį ir ekstrahavimo laiką.

2. Parinkti ekstrahavimo metodus ir parengti procedūras juodųjų serbentų lapų etanolinių ištraukų gamybai.

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1 Ekstrakcijos metodai

Ištraukų iš vaistinės augalinės žaliavos kokybę sąlygoja eilė veiksnių, kuriuos galima skirti į dvi grupes, tai žaliavos kokybė ir hidrodinaminės ekstrahavimo sąlygos. Pastarąsias galima keisti pasirenkant vieną ar kitą ekstrahavimo būdą, temperatūrą, laiką ar kitus veiksnius. Ekstrahavimo metu vyksta sudėtingi masės mainų procesai, todėl tik derinant ekstrahavimą lemiančius veiksnius galima gauti kokybišką ištrauką. Augalinės vaistinės žaliavos klasikiniai ekstrahavimo metodai aprašyti Europos farmakopėjoje tai maceracija, perkoliacija, ištraukos gamyba naudojant Soksleto įrangą. Tai seniai naudojami, pakankamai paprasti ir pigūs metodai [39]. Tačiau jau kurį laiką yra naudojami kiti ekstrahavimo metodai: ekstrakcija panaudojant ultragarsą ar mikrobangas, superkritinių skysčių ekstrakcija ir kt. Šie metodai optimizuojami nustatant temperatūros, laiko, ekstrahento optimalias reikšmes. Šie metodai, sutrumpina ekstrahavimo laiką, mažina toksiškų teršalų išsiskyrimą, organinių tirpiklių suvartojimą.

1.1.1.Maceracija

(Macerare lot. – mirkyti). Tai vienas seniausių ir paprasčiausių ekstrakcijos metodų. Europos farmakopėja šį metodą pateikia kaip ekstraktų ir tinktūrų gamybos metodą augalinės ar gyvūninės kilmės žaliavai ekstrahuoti. Šis metodas ilgai buvo laikomas pagrindiniu ekstrakcijos metodu. Septynių dienų žaliavos ekstrahavimas, kai žaliava su tirpikliu talpinama į indą, kuris gerai uždengiamas, ekstrahuojama kambario temperatūroje, dažnai pamaišant. Po to ekstraktas nupilamas, košiamas, likusi žaliava nuspaudžiama ir praplaunama švariu tirpikliu ir dar kartą nuspaudžiama, papildant gautą ištrauką ekstrahentu iki nustatyto tūrio.

Šiuo metu dažniau naudojami dinaminės maceracijos metodai, kurie pagreitina ekstrakcijos procesą, nes nuolat palaiko didelį koncentracijų skirtumą žaliavos ir ekstrahento sąlyčio vietoje. Iš dinaminės maceracijos metodų yra cirkuliacinė maceraciją - ekstrahentas praėjęs pro žaliavą vėl užpilamas ant žaliavos, frakcinė maceracija – ektrahentas pilamas ne visas, o dalimis, tuomet ant žaliavos patenka vis nauja ekstrahento porcija, išcentrinė ekstrakcija – ekstrahentas centrifuguojant skverbiasi pro žaliavą, srautinė ekstrakcija – žaliavos ir ekstrahento mišinį maišo maišytuvas darantis per 1000 apsisukimų per minutę ir ultragarsinė maceracija, kuomet žaliavos ir ekstrahento mišinys veikiamas ultragarsu.

1.1.2. Ekstrakcija ultragarsu

Tai vienas iš naujesnių ir dažnai naudojamas ekstrakcijos metodas fenoliniams junginiams išgauti. Ekstrakcijos metu ekstrahuojamas mišinys yra šildomas, ultragarso skleidžiamų bangų pagalba suardomos augalo ląstelių sienelės, tada į ekstrahentą išsiskiria išekstrahuotos veikliosios medžiagos. Ekstrakcijai ultragarso bangomis tinkamiausi ekstrahentai yra etanolis ir vandens mišinys [39]. Pagrindiniai ekstrakcijos ultragarsu privalumai: greitas ir paprastas metodas, mažiau sunaudojama organinių tirpiklių, išgaunamas produktas su didesniu kiekiu veikliųjų medžiagų [39].

Australų mokslininkai Adriana Dailey ir Quan V. Vuong naudojo ultragarso bangas makadamijos (Macadamia tetraphylla L) žaliavos ekstrahavimui. Siekdami išekstrahuoti polifenolinius junginius, gerus rezultatus gavo ekstrahuodami 35 minutes esant 40 °C temperatūrai, naudodami 200 W galią. Savo publikacijoje jie akcentavo pagrindinius ekstrakcijos kokybę lemiančius veiksnius, tai temperatūra, laikas ir ultragarso galia. [43]

Vokiečių mokslininkai Peter Heffels, Fabian Weber ir Andreas Schieber ultragarsinę ekstrakciją panaudojo norėdami išekstrahuoti antocianinus iš mėlynių (Vaccinium myrtillus L.) ir spanguolių (Vaccinium macrocarpon Ait) augalinės žaliavos. [44]

Ispanų mokslininkai Z. Pineiro, R. F. Guerrero, M. I. Fernandez-Marin, Emma Cantos-Villar ir M. Palma ultragarsinę ekstrakciją naudojo stilbenoidų ekstrakcijai iš vynuogių. Ekstrahavimo sąlygos 15 min, 75 °C temperatūra ir 80 proc. etanolis kaip ekstrahentas. [45]

1.1.3. Perkoliacija

Metodas aprašytas Europos farmakopėjoje kaip ekstraktų ir tinktūrų gamybos būdas. Dažnai naudojamas metodas gaminant ekstraktus iš augalinės žaliavos. Šis metodas lyginant su maceracija yra pranašesnis. Tai dinaminis ekstrahavimo metodas, kurio metu žaliava yra plaunama nauju tirpikliu, taip susidaro dideli koncentracijos skirtumai, sudarom os palankios sąlygos vykti intensyviai difuzijai ir žaliavos išekstrahavimui. Ekstrahentas nuolat juda per žaliavą nuplaudamas ektrahuojamas medžiagas. Šiuo metodu išekstrahuojama 95 proc. veikliųjų medžiagų. Perkoliacija skirstoma į stadijas, kurių metu: augalinė žaliava susmulkinama, užpilama tirpikliu ir paliekama pastovėti 4 – 6 val. Taip vyksta brinkinimo stadija. Maceravimo stadijoje maceruojama žaliava, kuri trunka 24 – 48 valandas. Perkoliavimo stadijoje išlašinamas perkoliatas, augalinė žaliava išplaunama švariu tirpikliu. Perkoliacija yra baigta, kai išbėga švarus ekstraktas [12].

1.2 Juodieji serbentai vieni vertingiausių uoginių augalų

Botaninis augalo pavadinimas: Juоdаsis serbentаs – Ribes nigrum L. Šeima: Uоlаskėliniai (Agrаstiniai) – Saxifragaceae (Grossulariaceae DC.)

Juоdаsis serbentаs (Ribes nigrum L.) tai vienas iš vertingiausių uoginių augalų, turintis maistinių ir gydomųjų savybių. Juodieji serbentai užima svarbią vietą Europos uoginių kultūrų auginimo srityje. Lietuvoje jų plotai siekia 4 000 hektarų [4,3]. Juodieji serbentai pradėti auginti viduramžiais, Rusijoje pirmą kartą paminėti buvo XI a., Vakarų Europoje XVII a. Lietuvoje juodųjų serbentų selekcija buvo pradėta XX a. Manoma, kad kultūriniai juodieji serbentai kilo iš laukinių juodųjų serbentų porūšių [3].

spalvos, apačia pilkai žalios spalvos. Švieži lapai yra labai aromatingi, džiovinti lapai neturi kvapo ir skonio. Lapai renkami tuoj po žydėjimo [1].

1 pav. Juodasis serbentas Ribes nigrum L.

Žydi balandžio – gegužės mėnesiais, uogos sunoksta liepos – rugpjūčio mėnesiais. Vaisius uoga – sultinga, juoda arba violetinė, daugiasėklė, specifinio kvapo, minkšta, rutuliškos formos. Pradeda derėti po 2-3 metų [1, 17]. Lietuvoje dažniausiai sutinkamas drėgnuose vietose, miškuose, upių ir ežerų pakrantėse. Tai pat juodasis serbentas plačiai paplitęs Šiaurės Europoje, Vidurinėje Azijoje, Mongolijoje, Kaukaze, Sibire [1].

Pagrindiniai serbentų komponentai yra fenoliniai junginiai, randami dideliais kiekiais tiek augalo uogose, tiek ir lapuose. Pramonėje dažniausiai naudojamos uogos, lapai ir pumpurai, dėl savo sukauptų cheminių junginių ir puikaus skonio, panaudojama žaliava ir kosmetikos pramonei [20].

1.3 Juodųjų serbentų žaliava

Juodųjų serbentų lapai (folium Ribis nigri).

Juodųjų serbentų uogos (fructus Ribis nigri).

Uogos renkamos tik gerai išnokusios ir sveikos. Jas galima rinkti liepos - rugpjūčio mėnesiais. Surinktos uogos džiovinamos džiovyklose 50-60 °C. Džiovintos uogos turi išlikti apvalios, raukšlėtos kiek sutraukiančio rūgštaus skonio [2,16].

Juodųjų serbentų pumpurai (gemmas Ribis nigri).

Neišsprogusiuose pumpuruose yra sukaupiama daugiausiai veikliųjų medžiagų. Renkami anksti pavasarį prieš jiems išsprogstant. Pašalinamos priemaišos užpilama 50 °C etanoliu arba džiovinama džiovykloje 15-20 °C temperatūroje [16].

1.4 Juodųjų serbentų žaliavos cheminė sudėtis

Juodieji serbentai kaupia įvairius cheminės struktūros junginius, kurių pagrindą sudaro fenoliai, daugiausiai flavanoidai, kurie dar kitaip vadinami antocianinai. Moksliniais tyrimais nustatyta, kad juodieji serbentai antocianinus kaupia visuose augalo dalyse [8]. Juoduosiuose serbentuose sukaupti cheminiai junginiai pasiskirsto pumpuruose, lapuose, uogose (1 lentelė).

Atliktų tyrimų duomenimis, juodųjų serbentų lapuose polifenolių kiekis yra penkis kartus didesnis už uogose esanti kiekį [20]. Flavanoliai juodųjų serbentų ekstraktuose aptinkami dažniausiai, iš kurių 68 procentus sudaro fenolio junginiai [42]. Belgijos mokslininkų tyrimų metu buvo nustatomas antioksidacinis aktyvumas juodųjų serbentų lapų, pumpurų ir uogų ištraukose. Rezultatuose mokslininkai pateikė, kad didžiausiu antioksidaciniu aktyvumu pasižymėjo serbentų lapų ištraukos, po jų seka pumpurų ištraukos ir uogos [30].

Švedų mokslininkai juodųjų serbentų pumpuruose nustatė 23 fenolinius junginius, o lapuose ir uogose 22 junginius [22] .

Išdžiovintų juodųjų serbentų lapai gausiai kaupia cheminių junginių, pagrindiniai yra šie: rutinas, kvercetinas, hyperozidas, izokvercetinas, kamferol -3-O- rutinozidas, kumaro rūgštis, chlorogeno rūgštis [20].

Cheminių junginių kiekis augaluose ir jų dalyse priklauso ir nuo klimato sąlygų, t.y. nuo temperatūros, drėgmės. Taip pat tyrimai parodė, kad didelę įtaką veikliųjų medžiagų kiekiui turi ir augalo amžius, genotipas, geografinė zona, derliaus nuėmimo laikas [18].

1 Lentelė. Cheminiai junginiai kaupiami augalo organuose

Lapai Rutinas, hyperozidas, izokvarcetinas, kumaro rugštis, hiperozidas, kvercetinas, izokvercitinas, chlorogeno rūgštis, kempferol-3-O-gliukozidas, kvercetino-3-O-rutinosidas, kvercetino-3-O-glukozidas, kemferol-3-O-rutinosidas, kemferol-3-O-gliukozidas, kemferol-3-O-malonyloksidas, kvercetinas, kempferolis, miretikinas ir katechinas, eterinis aliejus, askorbo rūgštis, manganas, vitaminai, cukrus, katechinas, chlorogeno rūgštis, kvercetino glikozidas, kvercetino rutinozidas [19, 20, 36].

Uogos Cianidin-3-rutinozidas, delfinidin-3-rutinozidas, cianidin-3-gliukozidas, delfinidin-3-gliukozidas. Vitaminai: C, P, B1, K, B2, folio rūgštis, PP, karotinas, sacharidai, pektinai, organinės rūgštys (citrinų, obuolių, gintaro, salicilo, fosfato, vyno), raugai, mineralinės medžiagos: kalis, natris, kalcis, magnis, fosforas, geležis. Flavanoliai - kvercetinas, miricetinas, kemferolis, fenolinės rūgštys, tokoferolis, [17,25,49]

Pumpurai Alifatiniai terpenai: sabinenas, terpineolis, cis ir trans beta ocimenai. Nelakieji junginiai: galokatechinas, katechinas, chlorogeninė rūgštis, kavos rūgštis, rutinas, astragalinas, kvercetinas, naringeninas, kamferolis, karnozolis, miricetin-3-gliukozidas, mircetin-3-rutinozidas, kamferolio gliukuronidas [8,27].

1.5 Juodųjų serbentų gydomosios savybės

daugybė in vitro ir in vivo tyrimų, kurių dėka įrodytas juodųjų serbentų lapų veiksmingumas sveikatai [20 ]. Tyrimų metu buvo pastebėtas juodųjų serbentų lapų antimikrobinis, priešuždegiminis, antivirusinis, antitoksinis, antiseptinis ir antioksidacinis poveikis [29].

1.5.1 Juodųjų serbentų gydomojo poveikio tyrimai

Gripo virusu kiekvienais metais užsikrečia daugybė žmonių. Tai sezoninis virusinis susirgimas. Apsaugantys nuo gripo šiuo metu yra tik dviejų klasių vaistai, kuriems daugelis gripo virusų tipų yra atsparūs. Pasaulio mokslininkai ieško naujų preparatų, kurie būtų veiksmingi prieš gripo virusus, ir vis dažniau dėmesį skiria augalinės kilmės ekstraktams [21].

Vokietijos mokslininkai pagamino iš juodųjų serbentų lapų ekstraktą "LADANIA067". Jų tikslas buvo išsiaiškinti, ar juodųjų serbentų lapų ekstraktas turi antivirusinį poveikį. Tyrimo metu buvo tirti keli gripo virusai ir stebėtas poveikis „LADANIA067" ekstrakto virusams. Buvo pasirinktas A tipo virusas, patogeniškas paukščių H7N7 gripo virusas ir oseltamivirui atsparus kiaulių gripo virusas H1N1. Eksperimento, metu pastebėtas platus antivirusinis aktyvumas visiems trims tirtiems virusams. ‘‘LADANAIA067‘‘ ekstraktas slopina labai ankstyvą infekcijos procesą. Tyrimo rezultatų duomenimis, ‘‘LADANIA067‘‘nesukėlė atsparumo virusams [21].

Japonų mokslininkai ieškodami priemonių nuo infekcinių ligų ištyrė juodųjų serbentų uogų ekstraktą. Gauti tyrimų rezultatai parodė, kad juodųjų serbentų uogų ekstraktas apsaugo organizmą nuo tokių virusų kaip RSV, IFV-A ir IFV-B, AdV , HSV-1. 1 proc. koncentracijos juodųjų serbentų ekstraktas slopino 50 –čia procentų RSV, IFV-A ir -B bei HSV-1 virusų replikacijos. 10 proc. ekstraktas slopina šių virusų adsorbciją ląstelių paviršiuje net iki 95 proc. 10 proc. ekstraktas sunaikino iki 99,8 proc. H. Influenzae ir 78,9 proc. S. pneumoniae virusus [28].

Daugelis atliktų tyrimų parodė, kad fenoliai mažina širdies ir kraujagyslių ligų riziką. Nustatyta, kad gausus flavonų ir flavanolių vartojimas apsaugo nuo hipertenzijos, mažina kraujagyslių sienelių paburkimą, slopina trombocitų susidarymą, mažina galimybę susirgti skleroze, veikia kaip antioksidantai, saugantys ląsteles ir membranas nuo žalingo laisvųjų radikalų poveikio [10,37,41].

Daugėja mokslinių pranešimų apie juodųjų serbentų priešvėžinį poveikį. Fenoliai turi priešvėžinį aktyvumą, slopina vėžio ląstelių dauginimąsi ir augimą, sukeldami joms apoptozę. Amerikos mokslininkai atliko tyrimą, kurio metu nustatė, kad juodųjų serbentų uogų ekstraktai, kuriuose gausu fenolinių junginių, turi priešvėžinį poveikį. 25 arba 0,5 proc. juodųjų serbentų ekstraktas slopina storosios žarnos vėžį ir krūties karcinomos ląstelių proliferaciją [24,29,31]. Antocianinais (cianidino ir delfinidino) grupėmis tai pat gydomos ir akių ligos [29]. Juoduosiuose serbentuose esantys fenoliniai junginiai apsaugo akies lęšiuką nuo ligas sukeliančių fermentų poveikio, stabdo kataraktos vystimąsi [13].

Azijos mokslininkai ištyrė, kad flavonoidai sumažina gliukozės kiekį kraujyje [35]. Augalus kaupiančius flavonoidus galima naudoti ir kaip prevencinę priemonę nuo diabeto apsisaugoti [10]. Mokslinių tyrimų metu buvo įrodytas ir antocianinų poveikis svoriui mažinti [29]. Flavonoidai taip pat atlieka svarbų vaidmenį apsaugant biologines sistemas nuo kenksmingų oksidacinių procesų [35]. Uogose randami flavanoidai turi poveikį prieš Parkinsono ligą, taip pat gali pagerinti pagyvenusių žmonių atmintį [21].

1.6 Fenoliniai junginiai – natūralios augalų veikliosios medžiagos

Fenoliniai junginiai tai antriniai augalo metabolitai. Jų molekulės svyruoja nuo paprasto individualaus hidroksilinto aromatinio žiedo iki sudėtingų polimerinių molekulių [18]. Šiuo metu atrasta apie 8000 fenolinių junginių, iš kuriu apie 4000 priskiriami flavonoidams [50]. Fenoliniai junginiai yra labai svarbūs augalams, nes būtent jie kontroliuoja jų augimą, dauginimąsi, atstato sužeistą augalą ar jo dalis [35]. Vykdo apsauginę funkciją augale apsaugodami jį nuo UV spinduliuotės ir oksidacinio streso [6].

Mokslinių tyrimų metu pastebėta, kad fenoliniai junginiai augale sparčiau pradeda gamintis esant stresinėm aplinkos sąlygoms: temperatūros pokyčiams, drėgmės trūkumui, šviesos intensyvumui, esant mineralinių medžiagų stygiui [51]. Fenoliai padeda apsaugoti augalą nuo patiriamo streso [32]. Fenoliniai junginiai pagal savo struktūrą yra skirstomi į 5 klases: fenolinės rūgštys, flavonoidai,

1.7 Flavonoidai

Flavonoidai – bioaktyvūs junginiai randami augaluose. Tai viena iš didžiausių augalinių junginių grupių, šiuo metu žinoma apie 6,5 tūkstančių junginių. Flavonoidų cheminė struktūrą sudaro C6-C3 –C6 anglies atomų struktūra. Flavonoidų molekulė sudaryta iš dviejų benzeno žiedų A ir B, kuriuos jungia C3 fragmentas (2 pav.) [23].

2 pav. Flavonoidų cheminė struktūra

Flavonoidų pavadinimas kilęs iš lotynų kalbos žodžio flavus – geltonas [18]. Šie junginiai suteikia augalams spalvą ir kvapą. Flavonoidai aptinkami visuose augalo dalyse [35].

Flavonoidai klasifikuojami į grupes pagal propaninio fragmento oksidacijos laipsnius, šoninio fenilo radikalo padėtį, heterociklo dydį, prisijungusių cukrų molekulių kiekį, cukraus prisijungimo prie anglikono pobūdį [18]. Flavonoidai skirstomi į grupes (2 lentelė) [33,41].

2 lentelė. Flavonoidų klasės ir atstovai

Pavadinimas Atstovai

Flavonai Apigeninas; Kristinas; Liuteolinas

Flavanoliai Flavonolis; Kvercetinas; Kemferolis; Rutinas

Flavononai Flavanonas; Likviritigeninas; Likviritinas;

Eriodiktinas

Flavanonoliai, Flavanonolis; Pinobaksinas, Taksifolinas Flavan-3-oliai Katechinai; Proantocianidinai; Kondensuoti

taninai

Leukoantocianidinai Leukoantocianidinas; Leukopianidinas

Chalkonai Izolikviritinas; 3,4-dihidroksichalkonas; Chalkonas

Auronai Auronas; 3,4-dihidroksiauronas

Izoflavonoidai Izoflavonas; Ononinas; Genistinas

Flavonoidai dažniausiai išekstrahuojami metanoliu, etanoliu, acetonu, vandeniu arba šių tirpiklių mišiniais [12,39]. Taigi ir ekstrakcijos metodo pasirinkimas priklauso nuo norimos ekstrahuoti augalinės žaliavos, ir joje kaupiamų cheminių junginių savybių, nuo turimos ekstrahavimo įrangos ir kt.

1.8 Antioksidantai

Antioksidantų pagrindinė funkcija apsaugoti ląsteles nuo pažeidimų, kuriuos sukelia laisvieji radikalai [52]. Laisvieji radikalai – organizme atsiranda natūraliai vykstant oksidacijos reakcijų metu, susidariusios molekulės sukelia įvairius ląstelių pažeidimus [34].Antioksidantai klasifikuojami į sintetinius arba natūralius [52].

Natūralių antioksidantų daugiausiai aptinkama šviežiuose vaisiuose ir daržovėse, tai pat ir grūdiniuose produktuose, riešutuose, žalioje arbatoje, įvairiuose prieskoniuose [48]. Tai natūralūs antioksidantai augaluose randami fenolinių junginių forma, dažniausiai tai gali būti flavanoidai: ( antocianai, fenolinės rūgštis) [11]. Taip pat natūraliems antioksidantams priskiriami vitaminai: C (askorbo rūgštis), E ( tokeferolis) ir B grupė. Šie vitaminai svarbus daugeliui organizmo funkcijų atlikti [52]. Natūraliems antioksidantams priskiriami ir kai kurie mineralai, tai cinkas, selenas, varis, geležis bei manganas [52].

Sintetiniai antioksidantai – sudaryti iš fenolinių junginių. Vieni dažniausiai naudojamų yra: butilintas hidroksianizolas, butilintas hidroksitoluenas, propilo galatas, etilendiaminotetraacto rūgštis (EDTA) [52]. Sintetiniai antioksidantai naudojami kosmetikoje ir maisto pramonėje kaip konservantai.

kraujagyslių ligos, artritas, atminties praradimas, insultas, Alzhaimerio liga, cukrinio diabeto, kataraktos. Taip pat lėtina senėjimo procesą. [48].

1.9. Literatūros apžvalgos apibendrinimas

2. TYRIMO METODIKA IR METODAI

2.1. Darbo objektai

Juodųjų serbentų lapai

Juodųjų serbentų lapų etanolinės ištraukos

2.2. Darbe naudotos medžiagos ir prietaisai

Medžiagos:

Išgrynintas vanduo (LSMU laboratorija) Etanolis 96 proc. (UAB „Stumbras“ , Lietuva)

Folin - Ciocalteau fenolinis reagentas („Sigma Aldrich“, Vokietija) DPPH–2,2-difenil-1-pikrilhidrazil hidratas („Sigma Aldrich“, Vokietija) Natrio karbonatas („Sigma – Aldrich Chemie GmbH“, Šveicarija) Juodųjų serbentų lapai (Belgija)

Prietaisai:

Drėgnomatis (KERN MLS,Vokietija)

Spektrofotometras Shimadzu 1800 (Japonija) Ultragarso vonelė Bandelin DT156HB ( Vokietija)

Sietai Ø 300μm, 4000μm (Fisher Scientifie GmbH, Vokietija) Automatinės pipetės (Ependorf, Didžioji Britanija)

2.3. Atlikti tyrimai

Pirmiausiai buvo atliekamas juodųjų serbentų žaliavos paruošimas. Žaliava naudojama ištraukų gamyboje buvo smulkinama ir sijojama, nustatytas nuodžiūvis. Atlikus tyrimus, kad žaliava yra kokybiška, toliau gaminamos ištraukos.

Ištraukų gamybai pasirinkti klasikinės maceracijos ir dinaminės maceracijos metodas naudojant ultragarsą. Pasigaminus etanolinės ištraukas buvo atliekami kokybės vertinimai. Nustatyta sausa liekana. Fenolinių junginių kiekiui nustatyti pasirinktas metodas su Folin-Ciocalteu fenoliniu reagentu, spektrofotometrijos metodu. Antioksidacinis aktyvumas nustatytas pagal DPPH∙ antiradikalinį aktyvumą. Visų atliktų darbų eigos schema pavaizduota paveiksle (3pav).

2.4. Juodųjų serbentų lapų augalinės žaliavos tyrimų metodikos

2.4.1 Nuodžiūvio nustatymas vaistinėje augalinėje žaliavoje.

Žaliavos kokybę apibūdina nuodžiūvio rodiklis. Žaliavos nuodžiūvis - tai masės sumažėjimas, kai iš augalinės žaliavos yra pašalinamas vanduo ir lakieji junginiai. Nuodžiūviui nustatyti naudotas drėgnomatis (KERN MLS, Vokietija). Buvo pasverta tiriamojo mėginio apie 1g. Patalpinta į aparatą ir džiovinta 105°C temperatūroje iki nekintamo svorio. Tyrimą pakartojus tris kartus (n=3), buvo išvestas vidurkis ir apskaičiuotas žaliavos drėgmės kiekis. Pagal Europos farmakopėją, drėgmės kiekis lapų žaliavoje neturi viršyti 13 proc., nes didesnis drėgmės kiekis žaliavoje suaktyvina fermentus, kurie skaido glikozidus, augalinė žaliava pradeda pelyti, praranda natūralią spalvą, kvapą ir skonį [5,6,36]

2.4.2 Juodųjų serbentų lapų žaliavos smulkumo nustatymas

Juodųjų serbentų lapai buvo sumalti rankiniu malūnėliu. Sumalta augalinė žaliava nusijota pro 4000 μm sietą. Pagal Europos farmakopėją turi nusisijoti net 97 proc. žaliavos. Pro 4000 μm sietą išbirusi medžiaga buvo naudota ištraukų gamybai. Taip pat pro 300 μm sietą buvo prasijotos smulkios dalelės – dulkės [5,16]

2.4.3 Sausos liekanos nustatymas augalinėse ištraukose

Tiriamosios ištraukos 3 valandas džiovinimo spintoje džiovinamos 100 – 105 °C temperatūroje. Palaukiama, kol lėkštelės atvės ir pasveriama. Rezultatai apskaičiuojami masės procentais. Kiekvienos ištraukos tyrimas pakartotas 3 kartus. (n=3) [5].

2.5.1 Ištraukos gamyba panaudojant ultragarsą nebrinkinant žaliavos

Ištraukos buvo gaminamos naudojant 70 procentų etanolį santykiais 1:10, 1:30, 1:50. Gamybai naudota susmulkinta juodųjų serbentų lapų žaliava, kuri neviršijo 13 proc. drėgmės ir buvo išbyrėjusi pro 4000 μm sietą.

Gaminta 25 ml. ekstrakto. buvo atsvertas reikiamas kiekis žaliavos ir užpiltas tam tikru kiekiu 70 proc. etanolio, uždaram inde ekstrahuota uždengtoje ultragarso vonelėje 10, 15, 30 minučių, esant 24 ºC temperatūrai. Ištrauka nupilama, žaliava nuspaudžiama, nukošiama per keturgubą marlę, papildyta 70 proc. etanoliu, perplaunant žaliavą, iki 25 ml.

2.5.2 Ištraukos gamyba panaudojant ultragarsą su brinkinimu

Gaminta 25 ml. ištraukos. Atsvertas reikiamas kiekis žaliavos buvo užpiltas tam tikru kiekiu 70 proc. etanolio, kad žaliavos ir ekstrahento santykiai 1:10, 1:30, 1:50. Kolbutės uždengiamos ir vieną valandą brinkinama kambario temperatūroje. Ekstrahuota uždengus ultragarso vonelėje 10, 15, 30 minučių, esant 24 ºC temperatūrai. Ištrauka perkošta, į 25 ml. kolbą, nuspaudus žaliavą praplaunama etanoliu, ištrauka papildyta 70 proc. etanoliu iki 25 ml.

2.5.3 Ištraukos gamyba maceracijos būdu

2.6. Fenolinių junginių kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu

Bendras fenolinių junginių kiekio nustatymas atliekamas po reakcijos su Folin-Ciocalteu fenoliniu reagentu, spektrofotometrijos metodu.

Atliekant reakciją 5 ml Folin-Ciocalteu vandeninio tirpalo sumaišoma su 1 ml tiriamojo tirpalo ir 4 ml 7,5 proc. natrio karbonato tirpalo. Tirpalas paliekamas stovėti 30 min., kol įvyksta reakcija – tirpalo spalva pakinta į melsvą. Spektrofotometru matuojami tirpalų optiniai tankiai, esant 750 nm bangos ilgiui. Palyginamieji tirpalai 70 proc. etanolis ir išgrynintas vanduo. [ 7,26,40].

Bendrasis fenolinių junginių kiekis serbentų lapų ekstrakte nustatytas naudojant 1 ml -1:10, 1:30,1:50 ekstrakto skiesto 70 proc. etanoliu 1:10.

Tyrimams buvo paruošti tris mėginiai, rezultatai apskaičiuoti išvedus aritmetinius vidurkius su vidutinėmis standartinėmis paklaidomis.

2.7. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas juodųjų serbentų lapų ištraukose

DPPH● metodas yra labai populiarus ir dažnai naudojamas natūralių antioksidantų tyrimams atlikti. DPPH● yra stabilus laisvas radikalas, jo kristalų spalva tamsiai violetinė, gerai tirpsta įvairiuose organiniuose tirpikliuose [6,24].

4 pav. DPPH radikalo struktūra prieš ir po reakcijos su antioksidantu (A-H) [6].

Remdamiesi Sasaki ir kt. 2013 metais atliktu tyrimu, buvo nustatomas antioksidacinis aktyvumas juodųjų serbentų lapų ištraukoje, tyrimo metu naudojamas ekstrahentas 70 proc. etanolis, ir buvo pasiremta tuo pačiu DPPH laisvojo radikalo surišimo metodu antioksidaciniam aktyvumui nustatyti juodųjų serbentų lapų ištraukoje [38].

2.7.1 Antioksidacinio aktyvumo nustatymas juodųjų serbentų lapų ištraukoje

Į kiuvetę atmatuota 0,4 ml. paruoštos juodųjų serbentų ištraukos, kurią sumaišome su 2,6 ml 0,1 mmol/konc. etanoliniu DPPH ● tirpalu. Kiuvetės paliekamos stovėti tamsoje 30 min. [9,15].

Atliktas matavimas spektrofotometru prie 517 nm bangos ilgio. Etanolis 70 proc. ir išgrynintas vanduo buvo naudojami kaip palyginamieji tirpalai.

Pagaminti mėginiai matuoti tris kartus, rezultatai apskaičiuoti išvedus aritmetinius vidurkius su vidutinėmis standartinėmis paklaidomis.

2.8. Statistinė duomenų analizė

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1 Maceracijos būdu pagamintų ištraukų analizė

Tai vienas seniausių ir paprasčiausių ekstrakcijos metodų. Ilgą laiką buvo pagrindinis ekstrakcijos metodas. Tyrimo metu buvo aktualu įvertinti, ar šis metodas yra efektyvus, pagaminti juodųjų serbentų ištrauką. Ištraukų kokybei įvertinti buvo atliktas fenolinių junginių, antioksidacinio aktyvumo bei sauso likučio kiekio nustatymas. Gauti rezultatai pateikiami 5, 6 ir 7 paveiksluose.

3,89 1,98 1,68 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 01:10 01:30 01:50 Žaliava: ekstrahentas Fe nol ini ai jung ini ai pa ga l G R E m g/ m l Fenoliniai junginiai

5 pav. Fenolinių junginių kiekis ištraukose (atsižvelgiant į žaliavos ir ekstrahento santykį) (n=3)

Maceracijos būdu pagamintuose ekstraktuose buvo įvertintas antioksidacinis aktyvumas žiūrėti 6 paveiksle. 8,66 6,48 5,01 0 2 4 6 8 10 01:10 01:30 01:50 žaliava:ekstrahentas Tr ol ok s m g/ m l Antioksidacinis aktyvumas

6 pav. Antioksidacinis aktyvumas nustatytas ištraukose (n=3)

Antioksidacinis aktyvumas didžiausiai nustatytas ištraukoje pagamintoje santykiu 1:10. Daugiau praskiestose ištraukose nustatytas mažesnis antioksidacinis aktyvumas, nes ir fenolinių junginių kiekis nustatytas mažesnis.

1,81 0,88 _0,703 0 0,5 1 1,5 2 01:10 01:30 01:50 žaliava:ekstrahentas Sa us a lie ka na pr oc . Sausa liekana

7 pav. Sausa liekana nustatyta ištraukose (n=3)

3.2 Ištraukos gamyba brinkinant žaliavą ir panaudojant ultragarsą

Pagamintos juodųjų serbentų lapų ištraukos santykiais 1:10, 1:30, 1:50, valandą buvo brinkinamos ir veikiamos ultragarsu vonelėje 10 ir 30 min. esant 24 ºC temperatūrai. Ištraukų kokybei vertinti atliktas fenolinių junginių, antioksidacinio aktyvumo bei sausos liekanos kiekio nustatymas. Nustatyta fenolinių junginių, antioksidacinio aktyvumo ir sausos liekanos ištraukose priklausomybė nuo žaliavos - ekstrahento santykio bei ekstrahavimo laiko. Gauti rezultatai pateikiami 8, 9, 10, 11, 12, ir 13 paveiksluose.

Ištraukos pagamintos vieną valandą brinkinant žaliavą ir veikiant ultragarsu 10 min.

Žaliavos ir ekstrahento (etanolis 70 % ) mišiniai paruošti santykiu 1:10, 1:30, 1:50 vieną valandą buvo brinkinami ir veikiami ultragarsu vonelėje 10 min. esant 24 ºC. 5 paveiksle pateikiami gautose ištraukose nustatyti fenoliniai junginiai pagal GRE mg/ml.

8 pav. Fenolinių junginių kiekis nustatytas ištraukose pagamintose brinkinant žaliavą ir panaudojant ultragarsą 10 min. (n=3)

8 paveikslo grafike matyti, kad fenolinių junginių kiekiai ištraukose priklauso nuo žaliavos ir ekstrahento santykio. Didžiausias kiekis fenolinių junginių nustatytas ištraukoje, pagamintoje santykiu 1:10 (1,67 GRE mg/ml). Ištraukose pagamintose santykiais 1:30 ir 1:50 priklausomai nuo panaudoto didesnio ekstrahento kiekio nustatyti mažesni kiekiai fenolių.

8,44 7,18 4,04 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 01:10 01:30 01:50 Žaliava:ekstrahentas Tr ol ok s m g/ m l Antioksidacinis aktyvumas pagal troloks mg/ml

9 pav. Antioksidacinis aktyvumas nustatytas ištraukose pagamintose brinkinant žaliavą ir panaudojant ultragarsą 10 min. (n=3)

Gauti rezultatai parodė, kad didžiausias antioksidacinis aktyvumas nustatytas ištraukoje, pagamintoje santykiu 1:10 (8,44 pagal Trolox mg/ml) ir ištraukoje pagamintoje santykiu 1:30 (7,18 pagal Trolox mg/ml),

Nustatyta ir sausa liekana ištraukose, rezultatai pateikti 10 paveiksle.

1,20 0,63 0,40 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 01:10 01:30 01:50 Žaliava:ekstrahentas Sa us a lie ka na pr oc . Sausas likutis

Paveiksle pateiktuose duomenyse sausa liekana didžiausia nustatyta ištraukoje 1:10 (1,24 proc.). rezultatuose matyti sausos liekanos priklausomybė nuo skiedimo. Nustatyta stipri neigiama koreliacija (r=-0,9675) tarp žaliavos – ekstrahento santykio ir sausos liekanos.

Ištraukos pagamintos vieną valandą brinkinant žaliavą ir veikiant ultragarsu 30 min. Žaliavos ir etanolio mišiniai paruošti santykiu 1:10, 1:30, 1:50 valandą brinkinami ir

veikiami ultragarsu 30 min. Ištraukose nustatyta fenoliniai junginiai, antioksidacinis aktyvumas ir sausos liekanos. Rezultatai pateikti 11, 12 ir 13 paveiksluose.

11 pav. Fenolinių junginių kiekis nustatytas ištraukose pagamintose brinkinant žaliavą ir panaudojant ultragarsą 30 min. (n=3)

Paveiksle matoma, kad ekstrakte gamintame santykiu 1:10 išsiskyrė didžiausias fenolių kiekis (1,42 ±0,0467 GRE mg/ml)

Didėjant ekstrahento kiekiui ištraukoje neišekstrahuojamas didesnis fenolių kiekis. Nustatyta labai stipri neigiama koreliacija (r=-0,9643) tarp žaliavos-ekstrahento santykio ir fenolinių junginių kiekio ištraukose.

8,63 5,99 5,24 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 01:10 01:30 01:50 Žaliava:ekstrahentas Tr ol ok s m g/ m l Antioksidacinis

aktyvumas pagal troloks mg/ml

12 pav. Antioksidacinis aktyvumas nustatytas ištraukose pagamintose brinkinant žaliavą ir panaudojant ultragarsą 30 min. (n=3)

Gauti rezultatai parodė, kad didžiausias antioksidacinis aktyvumas nustatytas ištraukoje, pagamintoje santykiu 1:10 (8,63± 0,1428 pagal Trolox mg/ml), didėjant ekstrahento kiekiui ištraukos antioksdacinis aktyvumas sumažėja statistiškai reikšmingai(p<0,05).

1,24 0,61 0,36 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 01:10 01:30 01:50 Žaliava:ekstrahentas Sa us a lie ka na pr oc . Sausas likutis

13 paveiksle pateikti sausos liekanos kiekiai, nustatyti ištraukose pagamintose 30 min veikiant ultragarsu. Sausos liekanos kiekiai ir šiuo atveju skyrėsi statistiškai reikšmingai (p<0,05),

priklausomai nuo naudoto ekstrahento kiekio. Juo ekstrahento kiekis didesnis, juo liekana mažesnė. Tyrimo metu nustatyta, kad netikslinga gaminti ištraukas didesniu žaliavos ir ekstrahento santykiu kaip

1:10.

3.3 Ištraukos gamyba panaudojant ultragarsą be brinkinimo

Pagamintos juodųjų serbentų lapų ištraukos santykiais 1:10, 1:30, 1:50. Ultragarsinėje vonelėje vykdyta ekstrakcija 10 ir 30 min. esant 24 ºC temperatūrai. Gautose ištraukose atliktas fenolinių junginių, antioksidacinio aktyvumo bei sausos liekanos kiekio nustatymas. Nustatyta šių kokybės vertinimo rodiklių priklausomybė nuo žaliavos - ekstrahento santykio bei ekstrahavimo laiko. Gauti rezultatai pateikiami 14 ir 15 paveiksluose.

Nustatytas fenolinių junginių kiekis ištraukose, kurios ultragarsu buvo veikiamos 10 ir 30 min . Rezultatai pateikti 14 paveiksle.

0,77 0,51 0,42 1,03 0,83 0,54 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 01:10 01:30 01:50 Žaliava:ekstrahentas Fe nol ini ai jung ini ai pa ga l G R E m g/ m l 10 min. 30 min.

Paveiksle matoma, kad ištraukose, kurios ultragarsu buvo veikiamos 30 min. išsiskyrė reikšmingai didesnis fenolinių junginių kiekis, nei ištraukose, kurios buvo ultragarsu veikiamos 10 min. Iš gautų rezultatų galima teigti, kad fenolinių junginių išsiskyrimui ekstrahavimo laikas turi įtakos, tačiau 30min. neužtenka, kad ekstrakcija būtų efektyvi (palyginus su maceracija).

Ištraukos antioksidacinio aktyvumo tyrimo rezultatai pateikiami 15 paveikslo grafike.

15 pav. Antioksidacinis aktyvumas nustatytas ištraukose pagamintose panaudojant ultragarsą 10 ir 30 min. (n=3)

Paveiksle matoma, kad ištraukose, kurios ultragarsu buvo veikiamos 30 min., nustatytas didesnis antioksidacinis aktyvumas, tačiau jo reikšmės gaunamos reikšmingai mažesnės lyginant su AA nustatytu ištraukose pagamintose maceracijos metodu.

Lentelėje pateikti duomenys apie sausos liekanos kiekį, nustatytą ištraukose pagamintose veikiant ultragarsu 10 ir 30 min .

3 Lentelė. Sausos liekanos kiekiai ištraukose proc. (n=3)

Ištraukose, kurios buvo gaminamos ultragarsu veikiant 30 min. nustatyta didesnis sausos liekanos procentinis kiekis, tam ir turėjo įtakos ekstrahavimo laikas.

Laikas min.

Žaliavos ir ekstarhento santykis

1:10 1:30 1:50

10 min. 0,844±0,030 % 0,676±0,002 % 0.168±0,002 %

4. REZULTATŲ APTARIMAS

Tyrimų metu juodųjų serbentų lapų ekstrakcija buvo atliekama ekstrahentu naudojant 70 proc. etanolį, kaip ir Sasaki T, Li W ir kt. 2013 m. Atlikus ekstrakciją klasikinės ir dinaminės maceracijos (panaudojant ultragarsą) metodais nustatyta, kad ekstrahavimo metodas yra reikšmingas veiksnys, turintis įtakos ištraukų kokybės rodikliams. Ištraukų kokybė buvo įvertinta atliekant fenolinių junginių nustatymą pagal GRE mg/ml, antioksidacinį aktyvumą DPPH● laisvojo radikalo sujungimo metodu pagal Trolox mg/ml ir sausosios liekanos kiekį proc. Pagaminus ištraukas nustatyta, kad visiems kokybės rodikliams didelę įtaką turi žaliavos ir ekstrahento santykis, nepriklausomai, kokiu metodu yra gaminama ištrauka. Atlikus tyrimus nustatytos labai stiprios neigiamos koreliacijos tarp fenolinių junginių kiekio ištraukose su žaliavos ir ekstrahento santykiu (r=-0,921, -0,948,- 0,964), stiprios neigiamos koreliacijos antioksidacinio aktyvumo su žaliavos ir ekstrahento santykiu (r=0,992 ; r= -0,987, -0,767), sausos liekanos su žaliavos ir ekstrahento santykiu (r=-0,720, r= -0,971, r=-0,957). Ar ekstrahavimo laikas turėjo įtakos ištraukų kokybės rodikliams, buvo matyti, ištraukas gaminant dinaminės maceracijos metodu su brinkinimo stadija. Ištraukose pagamintose ekstrahuojant ultragarso pagalba 10 min. ir 30 min., AA statistiškai reikšmingai nesiskyrė (8,4403±0,0723 ir 8,625±0,1428 pagal Trolox mg/ml) p>0,05, tačiau fenolinių junginių kiekiai šiose ištraukose skyrėsi statistiškai reikšmingai p<0,05 (1,668± 0,1002 ir 1,419±0,0467 GRE mg/ml).

Palyginus ekstrakcijos metodus panaudojant ultragarsą, matyti, kad žaliavą prieš paveikiant ultragarsu yra būtina gerai suvilgyti brinkinant užpylus ekstrahentą. Vienos valandos brinkinimas pagerina ištraukose fenolinių junginių kiekį nuo 0,765± 0,0492 iki 1,668±0,100 GRE mg/ml, antioksidacinį aktyvumą nuo 2,7556±0,028 iki 8,4403±0,072 pagal Trolox mg/ml. Antioksidacinis šių ištraukų aktyvumas gaunamas statistiškai toks pat, kaip ir ekstrahuojant klasikinės maceracijos metodu. Palyginimai buvo atlikti imant tuos pačius žaliavos ir ekstrahento santykius 1: 10.

5. IŠVADOS

1. Atlikus juodųjų serbentų lapų ekstrahavimą 70 procentų etanoliu nustatyta, kad technologiniai veiksniai - ekstrahavimo metodas, ekstrahavimo laikas, žaliavos ir ekstrahento santykis turi reikšmingą įtaką ištraukų kokybės rodikliams: fenoliniams junginiams, antioksidaciniam aktyvumui ir sausai liekanai.

2. Įvertinus žaliavos ir ekstrahento santykio įtaką ištraukos kokybei nustatyta, kad esant didesniam ekstrahento kiekiui kokybės rodikliai mažėja, todėl netikslinga gaminti ištraukas didesniu santykiu kaip 1:10

3. Ekstrahuojant juodųjų serbentų žaliavą ultragarso pagalba nustatyta, kad ekstrahavimo laikas (10 ir 30 min. ) ištraukos kokybei reikšmingos įtakos neturėjo, jeigu žaliava yra vieną valandą brinkinama prieš paveikiant ultragarsu. Nebrinkinant žaliavos fenolinių junginių kiekis ir antioksidacinis aktyvumas gaunamas trigubai mažesnis.

6. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS

7. LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. Ragažinskienė O, Rimkienė S, Sasnauskas V. Vaistinių augalų enciklopedija. Kaunas: Lututė, 2005. 315–317 p.

2. Vasiliauskas J. Augalai ir sveikata. Vilnius: Mokslas; 1991. 107-110 p.

3. Grigaliūnaitė B, Meidus E. Juodųjų serbentų (Ribes nigrum) fitosanitarinė būklė Vilniaus universiteto botanikos sode. Mokslo darbai. 2013 (4) 9. ISSN 2029-1906, IS

4. Blažytė A. Lietuviškos juodojo serbento ir paprastojo agrasto veislės. Lietuvos augalų nacionaliniai genetiniai ištekliai. Lietuvos Respublikos Aplinkos ministerija. Augalų genų bankas. Akademija, 2013. ISBN 978-609-8126-04-4. Prieiga per internetą: http://www.agb.lt/leidiniai/serbentai/serbentai.pdf 5. Daunoras G, Gendrolis A, Grinevičius J, Janulis V, Mauricas M. ir kt. Farmakopėjos straipsnių rinkinys 2001. Kaunas: 2001.

6. Raudonis R. Daktaro disertacija “Skysčių chromatografijos pokolonėlinių metodų optimizavimas augalinių antioksidantų tyrimams”; LSMU FF [Internet], 2012, 18-22.

7. Kasparavičienė G, Briedis V. Juodųjų serbentų ir juodavaisių aronijų uogų sulčių stabilumas ir antioksidacinis aktyvumas. Medicina (2003) 39 tomas, 2 priedas. 65-69.

8. Elijošiutė E, Lukošius A, Ragažinskienė O, Marška A. Juodasis serbentas (Ribes nigrum L.) – svarbus maistas ir vaistas žmogaus sveikatai. MEDICINA (2003) 39 tomas, 2 priedas ISSN 1822-1823 Žmogaus ir gamtos sauga 2015 – 1 dalis, ASU

9. Jasutienė I, Viškelienė R. Mėlynių, juodųjų serbentų ir spanguolių sulčių bei ekstraktų sudėtis ir antioksidacinis aktyvumas. ISSN 1392-0227. Maisto chemija ir technologija. 2006. T. 40, Nr.1

10. Anisimovienė N, Jankauskienė J, Jodinskienė M, Bendokas V, Šikšnianas V. S. T. Phenolics, antioxidative activity and characterization of anthocyanins in berries of blackcurrant interspecific hybrids.t. 60, Nr. 4/2013 767–772, 2013 gruodis.

11.Anisimovienė N, Jankauskienė J, Jodinskienė M, Bendokas V, Šikšnianas V. S. T. Antocianinai serbentų, vyšnių bei šilauogių uogose ir ekstraktų antioksidacinis aktyvumas. Žemdirbystės – Agriculture, t 96, Nr. 3 2009, p 158-167.

12. Briedis V, Grinkevičius J, Savickas A, Švambaris L. K. Vaistų technologija (ketvirtasis tomas). Bendrasis vadovėlis. Kaunas, 2002 m.

14. Rubinskienė M, Viškelis P, Stanys V, Šikšnianas T, Sasnauskas A. Juodųjų serbentų cheminės sudėties ir fizikinių savybių pokyčiai uogoms nokstant . Sodininkystė ir daržininkystė. 2008. 27(4). 15. Briedis V, Povilaitytė V, Kazlauskas S, Venskuonis P.R. Polifenolių ir antocianinių kiekis vynuogėse, vynuogių sultyse ir raudonuose vynuose bei jų antioksidacinio aktyvumo įvertinimas. 2003, Medicina; 39 tomas.

16. European directorate for the quality of medicines and healthcare. European Pharmacopeia 7 th Ed. Council of Europe Strasbourg. 2011

17. Michael Rajeev Vagiri. Phenolic Compounds and Ascorbic Acid in Black Currant (Ribes nigrum

L.) [Internet] 2014; [cited 2017 Mar. 26]. Available from:

https://pub.epsilon.slu.se/11621/1/vagiri_m_141031.pdf

18. Vagiri M. Black currant (Ribes nigrum L.) –an insight into the crop. [Internet] 2012; [cited 2017 Mar. 29]. Available from: https://pub.epsilon.slu.se/8586/17/vagiri_m_120206_small.pdf

19. Anastasia-Varvara Ferlemi and Fotini N. Lamari. Berry Leaves: An Alternative Source of Bioactive Natural Products of Nutritional and Medicinal Value. Antioxidants 2016, 5(2), 17;

20. Vagiri M, Conner S, Stewart D, Andersson SC, Verrall S, Johansson E, et al. Phenolic compounds in blackcurrant (Ribes nigrum L.) leaves relative to leaf position and harvest date. Food Chem.

[Internet] 2015 Apr. [cited 2017 Apr. 14]. Available from:

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0308814614014083

21. Ehrhardt C, Dudek S. E, Holzberg M, Urban S, Hrincius E. R, Haasbach E, Seyer R, et al. A Plant Extract of Ribes nigrum folium Possesses Anti-Influenza Virus Activity In Vitro and In Vivo by Preventing Virus Entry to Host Cells. [Internet] 2013 May. [cited 2017 Apr. 14]. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23717460

22. Vagiri M, Ekholm A, Andersson S. C, Johansson E, Rumpunen K. An Optimized Method for Analysis of Phenolic Compounds in Buds, Leaves, and Fruits of Black Currant (Ribes nigrum L.).Food Chem. [Internet] 2012 Oct [cited 2017Apr. 19]. Available from: http://pubs.acs.org/doi/10.1021/jf303398z

23. Zippel J, Deters A, Pappai D, Hensel A. A high molecular arabinogalactan from Ribes nigrum L.: influence on cell physiology of human skin fibroblasts and keratinocytes and internalization into cells via endosomal transport. [Internet] 2009 May. [cited 2017. May 19]. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0008621509001207?via%3Dihub

24.Tirzitis G,Bartosz G. Determination of antiradical and antioxidant activity: basic principles and new insights. Acta biochim Pol,. 2010;57(2):139-42

26. Stević, Tatjana; Šavikin, Katarina and al. Composition and antimicrobial activity of the essential oil of the leaves of black currant (Ribes nigrum L.) cultivar anskacrna [Internet]. 2010 Sep [cited 2017 Mar 18]. Available from: http://www.doiserbia.nb.rs/img/doi/0352-5139/2010/0352-51391001035S.pdf

27. Donno D, Mellano M. G, Cerutti A. K, Beccaro G, L. Jean Jacques Vanden Eynde, Academic Editor. Biomolecules and Natural Medicine Preparations: Analysis of New Sources of Bioactive Compounds from Ribes and Rubus spp. Buds. Pharmaceuticals (Basel). 2016 Mar; 9(1): 7. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4812371/

28. Ikuta K, Hashimoto K, Kaneko H, Mori S, Suzutan K. O. T.Anti-viral and anti-bacterial activities of an extract of blackcurrants (Ribes nigrum L.) [Internet]. 2012 Nov. [cited 2017 Jun 25]. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22985050

29. Bonarska-Kujawa D, Cyboran S, Żyłka R, Oszmiański J, Kleszczyńska H.Biological Activity of Blackcurrant Extracts (Ribes nigrum L.) in Relation to Erythrocyte Membranes. Published online 2014 Jan.

30. David M Pereira VP. Phenolics: From Chemistry to Biology. Molecules. 2009;14(6). 31. Bishayee A, Mbimba T, Thoppil R. J,Háznagy-Radnai E, Sipos P, .Darvesh A. S, Folkesson H, G.Hohmann J. Anthocyanin-rich black currant (Ribes nigrum L.) extract affords chemoprevention against diethylnitrosamine-induced hepatocellular carcinogenesis in rats.

BiochemistryNov. 2011, Pages 1035-1046. Available from:

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0955286310002287?via%3Dihub

32. Ramakrishna A, Ravishankar G. A. Influence of abiotic stress signals on secondary metabolites in plants. Plant Signal Behav. 2011; 6(11): 1731–1720 Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3329344/

33. Kumar S, Pandey A. K. C;8hemistry and Biological Activities of Flavonoids An Overview. Hindawi Publishing Corporation The Scientific World Journal Volume 2013,

Article ID 162750, 16 pages. Available from:

https://www.hindawi.com/journals/tswj/2013/162750/

34. Sharma M. Antioxidant and lts Applications. Journal of Pharmacology and Toxicological Studies. Accepted date: 14/11/2016

35. Ghаsemzаdeh A., Ghаsemzаdeh N. Flаvоnоids аnd phenоlic аcids: Rоle аnd biоchemicаl аctivity in plаnts аnd humаn. Jоurnаl оf Medicinаl Plаnts Reseаrch Vol. 5(31), pp. 6697-6703, 23 December, 2011. Available from: http://www.academicjournals.org/JMPR

37. Gopalan A, Sharon C, Reuben, Ahmed S, Darvesh A, S. Hohmannb J, Bishayee A. The health benefits of blackcurrants. Food Funct., 2012, 3, 795. Available from: http://www.blackcurrant-iba.com/wp-content/uploads/2017/10/Gopalan-et-al.-Food-Function-2012.pdf

38. Sasaki T, Li W, Zaike S, Asada Y, Li Q, Ma F, et al. Antioxidant lignoids from leaves of Ribes nigrum. Phytochemistry. [Internet]. 2013 Nov. [cited 2017 Sept. 25]. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/m/pubmed/23958345/

39. Khoddami A, Wilkes M. A, Roberts T. H. Techniques for Analysis of Plant Phenolic Compounds.

[Internet]. 19 Feb. [cited 2017 Sept. 29]. Available from:

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23429347

40. Petigny L, Périno-Issartier S, Wajsman J, Chemat F. Batch and Continuous Ultrasound Assisted Extraction of Boldo Leaves (Peumus boldus Mol.). 2013 Mar; 14(3): 5750–5764.

41. Kozłowska A, Szostak-Węgierek D. Flavonoids – food sources and health benefits. [Internet] 2014 [cited 2017 Sept. 21]. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25272572

42. Luzak B, Boncler M, Rywaniak J, Dudzinska D, Rozalski M, Krajewska U, et al. Extract from Ribes nigrum leaves in vitro activates nitric oxide synthase (eNOS) and increases CD39 expression in human endothelial cells. . [Internet] 2014 [cited 2017 Nov. 21]. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/m/pubmed/25407137/

43. Dailey A, Vuong V. Optimisation of Ultrasonic Conditions as an Advanced Extraction Technique for Recovery of Phenolic Compounds and Antioxidant Activity from Macadamia (Macadamia tetraphylla) Skin Waste. Technologies 2015, 3, 302-320;

44. Heffels P, Weber F, Influence A. Accelerated Solvent Extraction and Ultrasound-Assisted Extraction on the Anthocyanin Profile of Different Vaccinium Species in the Context of Statistical Models for Authentication . Food Chem., 2015, 63 (34), pp 7532–7538

45. Piñeiro Z, Guerrero R. F, Fernández-Marin M. I, Cantos-Villar E, Palma M. .Ultrasound-Assisted Extraction of Stilbenoids from Grape Stems Agric. Food Chem., 2013, 61 (51), pp 12549–12556 46. Petigny L, Périno-Issartier S, Wajsman J, Chemat F. Batch and Continuous Ultrasound Assisted Extraction of Boldo Leaves (Peumus boldus Mol.) [Internet] 2013 March. [cited 2017 Nov. 26]. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23481637

47.Spigno G, Tramelli L, De Faveri DM. Effects of extraction time, temperature and solvent on concentration and antioxidant activity of grape marc phenolics. J Food Eng. 2007 Jul;81(1):200–8.

48.Sen S, Chakraborty R. The Role of Antioxidants in Human Health. American Chemical Society:

Washington, DC, Nov. 2011.

Fatty Acids, Tocochromanols, and Phytosterols: A Health Implication. Journal of Chemistry Volume 2015 (2015), Article ID 659541, 8 pages. Available from: https://www.hindawi.com/journals/jchem/2015/659541/

50. Pandey K. B, Rizvi S. I. Plant polyphenols as dietary antioxidants in human health and disease. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2009; 2:5:278-270

51. Ramakrishna A, Ravishankar G, R. Influence of abiotic stress signals on secondary metabolites in plants. Plant Signal Behav. 2011; 6(11): 1731–1720