PAPRASTŲJŲ UOSIŲ (FRAXINUS EXCELSIOR L.) LAPŲ IR VAISIŲ FENOLINIŲ JUNGINIŲ TYRIMAS

MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS

FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

IEVA TACIONYTĖ

PAPRASTŲJŲ UOSIŲ (FRAXINUS EXCELSIOR L.) LAPŲ IR

VAISIŲ FENOLINIŲ JUNGINIŲ TYRIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas Dr. Raimondas Raudonis

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS

FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

PAPRASTŲJŲ UOSIŲ (FRAXINUS EXCELSIOR L.) LAPŲ IR

VAISIŲ FENOLINIŲ JUNGINIŲ TYRIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas

Dr. Raimondas Raudonis

Recenzentas

Darbą atliko

Magistrantė Ieva Tacionytė

KAUNAS, 2017

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanas prof. dr. Vitalis Briedis

TURINYS

SANTRAUKA………...5

SUMMARY ... 6

SANTRUMPOS ... 7

ĮVADAS ... 8

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 9

1.LITERATŪROS APŽVALGA ... 10

1.1. Paprastųjų uosių (Fraxinus excelsior L.) morfologiniai požymiai ... 10

1.2. Paprastųjų uosių (Fraxinus excelsior L.) augavietės ir paplitimas ... 12

1.3. Paprastųjų uosių (Fraxinus excelsior L.) augalinė žaliava ir kaupiamos biologiškai aktyvios medžiagos ... 14

1.4. Paprastųjų uosių kaupiamų fenolinių junginių struktūra ir savybės. ... 15

1.5. Paprastųjų uosių kaupiamų flavonoidų struktūra ir savybės. ... 20

1.6. Paprastųjų uosių preparatų biologinis poveikis ... 22

2. TYRIMO METODIKA ... 25

2.1. Tyrimų objektas ... 25

2.2. Naudoti reagentai ir medžiagos ... 25

2.3.Naudota aparatūra ... 26

2.4. Tyrimų metodai ... 26

2.5. Statistinis duomenų vertinimas ... 29

3. TYRIMŲ REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 30

3.1. Paprastųjų uosių lapų žaliavos ekstrakcijos sąlygų parinkimas ... 30

3.2. Paprastųjų uosių lapų ir vaisių fenolinių junginių spektrofotometrinė analizė ... 31

3.2.1. Bendro hidroksicinamono rūgšties darinių kiekio įvairavimas paprastųjų uosių lapuose vegetacijos laikotarpiu ... 31

3.2.2. Bendro flavonoidų kiekio įvairavimas paprastųjų uosių lapuose vegetacijos laikotarpiu .. 34

3.2.3. Hidroksicinamono rūgšties darinių ir flavonoidų kiekio įvairavimas skirtingose augavietėse augančių paprastųjų uosių lapuose ... 35

3.2.4. Bendro hidroksicinamono rūgšties darinių ir flavonoidų kiekio įvairavimas paprastųjų

uosių vaisiuose ... 37

3.3. Paprastųjų uosių lapų fenolinių junginių chromatografinė analizė ... 39

3.3.1. Paprastųjų uosių flavonoidų ir hidroksicinamono rūgšties kiekybinės sudėties įvairavimo vegetacijos metu tyrimas ... 40

3.3.2. Paprastųjų uosių lapų flavonoidų ir fenolinių rūgščių kiekybinės sudėties įvairavimo vegetacijos metu tyrimas skirtingose Lietuvos augavietėse ... 44

4. IŠVADOS ... 47

5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 48

6. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 49

SANTRAUKA

I. Tacionytės magistro baigiamasis darbas/ darbo vadovas R. Raudonis; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Medicinos akademijos, Farmacijos fakulteto, Farmakognozijos katedra, Kaunas.

Pavadinimas: Paprastųjų uosių (Fraxinus excelsior L.) lapų ir vaisių fenolinių junginių tyrimas.

Raktiniai žodžiai: Fraxinus excelsior L., uosiai, flavonoidai, hidroksicinamono rūgštys, chlorogeno r., neochlorogeno r., 4-O-kafeoilchino r., rutinas, astragalinas, ESC, spektrofotometrija.

Tyrimo objektas ir metodai: Fraxinus excelsior L. lapai ir vaisiai. Kiekybinis fenolinių junginių tyrimas atliktas UV spektrofotometriniu metodu, junginiai identifikuoti ESC.

Darbo tikslas: Nustatyti flavonoidų ir hidroksicinamono rūgšties darinių kokybinę ir kiekybinę sudėtį, jų įvairavimą vegetacijos metu paprastųjų uosių (Fraxinus excelsior L.) lapų ir vaisių mėginiuose bei šių parametrų įvairavimą skirtingose Lietuvos augavietėse surinktuose mėginiuose.

Darbo uždaviniai: Parinkti optimalias ekstrakcijos sąlygas bendro hidroksicinamono rūgšties darinių kiekio nustatymui paprastųjų uosių mėginiuose bei nustatyti jų ir flavonoidų kiekio įvairavimą paprastųjų uosių lapų ir vaisių mėginiuose vegetacijos laikotarpiu bei šių junginių kiekio įvairavimą skirtingose Lietuvos augavietėse surinktuose mėginiuose; ESC metodu ištirti fenolinius junginius būdingus paprastųjų uosių žaliavoms.

Tyrimo rezultatai ir išvados: Didžiausias bendras hidroksicinamono rūgšties darinių (CRE) kiekis paprastųjų uosių lapuose ir vaisiuose nustatytas masinio sulapojimo metu – rugpjūčio mėnesį. Nustatyta, kad bendras hidroksicinamono rūgšties darinių (CRE) kiekis skirtingose Lietuvos augavietėse surinktuose paprastųjų uosių lapų mėginiuose svyravo nuo 27,07 mg/g iki 108,12 mg/g, vaisiuose – nuo 3,15mg/g iki 8,3 mg/g. Nustatyta, kad daugiausiai bendrų hidroksicinamono rūgšties darinių (CRE) sukaupė uosių lapai. Didžiausias bendras flavonoidų (RE) kiekis paprastųjų uosių lapuose ir vaisiuose buvo nustatytas rugpjūčio mėnesį. Nustatyta, kad bendras flavonoidų kiekis skirtingose Lietuvos augavietėse surinktuose paprastųjų uosių lapų mėginiuose svyravo nuo 18,19 mg/g iki 34,91mg/g, vaisiuose – nuo 4,15mg/g iki 8,19 mg/g. Marijampolės raj., Dielinės kaimo miške rinktame lapų mėginyje nustatytas didžiausias suminis flavonoidų ir hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis. Paprastųjų uosių lapuose ir vaisiuose nustatyta: chlorogeno r., neochlorogeno r., 4-O-kafeoilchino r., rutinas ir astragalinas. Paprastųjų uosių lapuose dominuoja neochlorogeno rūgšties kiekis (7,57 mg/g) daugiausiai jos nustatyta Panevėžio parke surinktuose Fraxinus excelsior L. mėginiuose.

SUMMARY

Ieva Tacionyte final master’s thesis/ research supervisor dr. R. Raudonis; Lithuanian University of Health Sciences, Academy of Medicine, Faculty of Pharmacy, Department of Pharmacognosis, Kaunas.

Title: Research of phenolic compounds in leaves and fruits of common ashes (Fraxinus excelsior L.).

Keywords: Fraxinus excelsior L., ashes, flavonoids, phenolic acids, chlorogenic acid, rutin, HPLC, spectrophotometry.

Object and methods: Fraxinus excelsior L. leaves and fruits samples. The total content of phenolic compound was performed using UVspectrophotometric method. Phenolic compounds was determined by the HPLC.

The aim of the research – to determine variation qualitative and quantitative composition of flavonoids and phenolic acids of common ashes leaves and fruits during vegetation also to dermine variaty of these parameters in samples selected from different regions of Lithuania.

The objectives of the research: to select optimal conditions for extraction of hydroxycinnamic acid derivates total quantity evaluation in samples of common ashes and determine variation of quantity of hydroxycinnamic acid and flavonoids of common ashes leaves and fruits samples during vegetation periodalso dermine variaty of these parameters in samples selected from different regions of Lithuania. Determine phenolic compounds of common ashes by HPLC.

Results and conclusions: The biggest amount of hydroxycinnamic acid derivates were found in leaves and fruits of common ashes at massive foliage period (in the midle of August). The total amount of hydroxycinnamic acid derivatesin leaves samples varied from 27,07 mg/g to 108,12 mg/g, in fruits samples from 3,15mg/g to 8,3 mg/g. Leaves store hydroxycinnamic acid derivates more than fruits of common ashes. The biggest amount of flavonoids were found in leaves and fruits of common ashes at massive foliage period (in August). The total amount of flavonoids of different regions varied in leaves from 18,19 mg/g to 34,91mg/g, in fruits from 4,15mg/g to 8,19 mg/g. The biggest amount of flavonoids and hydroxycinnamic acid derivates were found in leaves in district of Marijampole. Were identified phenolic compounds in extracts: chlorogenic acid, neochlorogenic acid, 4-O-kafeoilquinic acid, rutin, astragalin.

SANTRUMPOS

ESC – efektyvioji skysčių chromatografija CRE – chlorogeno rūgšties ekvivalentas UV– ultravioletinė spinduliuotė

p – reikšmingumo lygmuo proc. – procentai

R2 _{– regresijos koeficientas}

RE – rutino ekvivalentas

Rs – koreliacijos koeficientas pagal Spirmaną

ĮVADAS

Paprastieji uosiai (Fraxinus excelsior L.) – vieninteliai, natūraliai augantys Fraxinus genties atstovai Lietuvoje. Gausiausiai auga Vidurio lygumoje, Panevėžio, Pakruojo, Kėdainių apylinkėse. Paprastieji uosiai, šviesiamėgiai, greitai augantys ir mėgstantys derlingą drėgną dirvą, medžiai [1]. Gerai auga drėgnoje molio – priemolio dirvoje, taip pat gali dominuoti pakankamai sausose kalkinėse vietovėse. Paprastieji uosiai įprastai auga dirvose, kurių pH daugiau už 5-7. Dirvožemis, kuris yra derlingas, neutralaus pH, gilus, drėgnas ir lengvai drenuojamas, sukuria optimalias sąlygas paprastųjų uosių augimui [2]. Augant nederlingose ir sausose vietovėse paprastųjų uosių augimas priklauso nuo lietaus vandens kiekio. Paprastieji uosiai yra jautrūs sausroms, todėl vandens tiekimas turi didelę įtaką augimui [3].

Paprastieji uosiai iš kitų medžių išsiskiria morfologinėmis savybėmis: juodais arba rausvai juodais priešiniais pumpurais, sudėtiniais, plunksniškais lapais, susidedančiais iš 11 beveik bekočių, lancetiškų arba pailgai kiaušiniškų pjūkliškai smailiomis viršūnėmis lapelių, kurių viršutinė pusė tamsiai žalia, apatinė šviesiai žalia, prie gyslų kiek plaukuota, vienasėkliais šviesiai rudos spalvos vaisiais [4].

Medicinos praktikoje naudojami paprastųjų uosių preparatai iš lapų (Fraxini folium), žievės (Fraxini cortex), vaisių (Fraxini fructus). Europos farmakopėjoje aprašomi paprastųjų uosių lapai ir žievė. Biologiškai aktyvių medžiagų kaupimuisi įtakos turi aplinkos sąlygos, klimatas, dirvožemis, drėgmės kiekis [5]. Skirtinguose augalo organuose kaupiamos skirtingos biologiškai aktyvios medžiagos ir jų kiekiai [6,7]. Paprastųjų uosių preparatai pasižymi antimikrobiniu, priešuždegiminiu, antioksidantiniu ir odą regeneruojančiu poveikiu [7]. Jų žaliavų ekstraktai ir metabolitai slopina įvairius uždegimus, karščiavimą, skausmą bei yra veiksmingi gydant reumatą, inkstų akmenligę ir podagrą [8].

Darbo naujumas: Pirmą kartą Lietuvoje tirta paprastųjų uosių (Fraxinus excelsior L.) lapų ir vaisių flavonoidų ir hidroksicinamono darinių kiekių įvairavimas vegetacijos laikotarpiu bei šių rodiklių įvairavimas skirtinguose Lietuvos regionuose surinktuose mėginiuose.

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas – nustatyti flavonoidų ir hidroksicinamono rūgšties darinių kokybinę ir kiekybinę sudėtį, jų įvairavimą vegetacijos metu paprastųjų uosių (Fraxinus excelsior L.) lapų ir vaisių mėginiuose bei šių parametrų įvairavimą skirtingose Lietuvos augavietėse surinktuose mėginiuose.

Darbo uždaviniai:

1. Parinkti optimalias ekstrakcijos sąlygas bendro hidroksicinamono rūgšties kiekio nustatymui paprastųjų uosių mėginiuose;

2. Įvertinti bendrą hidroksicinamono rūgšties darinių (CRE) kiekio įvairavimą paprastųjų uosių lapų ir vaisių mėginiuose vegetacijos laikotarpiu bei šių junginių kiekio įvairavimą skirtinguose Lietuvos regionuose surinktuose mėginiuose;

3. Nustatyti bendrą flavonoidų kiekio įvairavimą paprastųjų uosių lapų ir vaisių mėginiuose vegetacijos laikotarpiu bei šių junginių kiekio įvairavimą skirtinguose Lietuvos regionuose surinktuose mėginiuose;

4. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodu ištirti flavonoidus ir fenolines rūgštis, būdingas paprastiesiems uosiams, bei nustatyti jų kiekybinės sudėties kitimą augalų vegetacijos periodo metu.

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. Paprastųjų uosių (Fraxinus excelsior L.) morfologiniai požymiai

Fraxinus L. gentis apima 43 rūšis, pasitaikančias vidutinių ir subtropinių regionų šiaurės pusrutulyje. Dvi pagrindinės paskirstymo vietos yra Šiaurės Amerika (20 rūšių) ir Rytų Azija (20 rūšių). Europoje ir Vakarų Azijoje sutinkamos trys rūšys. Fraxinus L. yra viena iš 24 alyvmedinių šeimos (Oleaceae) išlikusių genčių. 1753 m. Karlas Linėjus ištyrė Fraxinus gentį, nuo tada buvo aprašyta daugiau kaip 450 taksonų, kurių dauguma yra laikomi sinonimais šiandien [9].

Paprastieji uosiai (Fraxinus excelsior L., angl. European ash) – tai medžiai, augantys Lietuvoje, priklausantys alyvmedinių (Oleaceae) šeimai, uosių (Fraxinus) genčiai [7]. Šiuo metu yra žinomos 48 Fraxinus rūšys, kurių dauguma paplitusios šiauriniame pusrutulyje, tačiau Europoje aptinkamos tik trys [9]. Paprastasis uosis (Fraxinus excelsior L.) labai panašus į siauralapį uosį (Fraxinus angustifolia). Nors turi skirtingų savybių, šios dvi rūšys yra neretai painiojamos [10].

Paprastieji uosiai (Fraxinus excelsior L.) užauga iki 35-40 m. aukščio. Jų laja reta, apie 20 m. skersmens, miške augančių uosių viršūnė tinkliška, o pavieniui augančių iš pradžių kiaušiniška, vėliau skėtiška. Liemuo 1,5 m. skersmens, tiesus, miške augančių uosių nelabai nulaibėjęs, atviroje vietoje kūgiškas, su stambiomis šakomis, prasidedančiomis 2-3 m. aukštyje [4]. Jaunų medelių žievė lygi, žaliai pilka, 40-50 metų suaižėjusi, vėliau pasidaro pilka, su stora, išilgai giliai suaižėjusia žiauberimi ir siaurais skersiniais plyšiais, tuo uosis skiriasi nuo ąžuolo [12]. Ūgliai stori, pilkai žali, pliki, kiek suploti. Pumpurai trumpi, juodi arba rausvai juodi, kūgiški, priešiniai. Lapai sudėtiniai, neporomis plunksniški, 40 cm ilgio, paprastai susideda iš 11 (gali būti nuo 5 iki 15) beveik bekočių, lancetiškų arba pailgai kiaušiniškų 4-9 cm ilgio ir 1,5-4 cm pločio, pjūkliškų, smailiomis viršūnėmis lapelių, kurių viršutinė pusė tamsiai žalia, apatinė šviesiai žalia, prie gyslų kiek plaukuota [13]. Žiedai smulkūs, rusvi, kuokštuose arba šluotelėse. Žiedai dvilyčiai ir vienalyčiai. Vaisiai yra sparnavaisiai apie 3 cm ilgio, sunokę šviesiai rudos spalvos, paprastai vienasėkliai [14]. (1 paveikslas)

2 pav. Siauralapis uosis (Fraxinus angustifolia [15]

Siauralapiai uosiai (Fraxinus angustifolia) yra medžiai maksimaliai užaugantys iki 25 metrų aukščio. Jų žievė yra pilka, linkusi smulkiai, giliai ir tinkliškai skilti. Šakelės ir lapkočiai yra lygūs, pumpurai - tamsiai rudi. Vieną lapą sudaro 5-13 lapeliai. Lapeliai yra pailgos formos su smailia viršūne, išpjovų tiek kiek šoninių gyslų. Lapelių matmenys yra 30-90 (-100) x 8-25 (-30) mm. Jaunų medžių lapai susideda iš 7-15 lapelių, ovalūs. Kamienas yra lygus. Neturi taurelės ir vainikėlio. Sparnavaisiai yra pailgos formos, lygūs, 20-45 (- 50) x 6-10 mm dydžio. Ši rūšis paplitusi Pietų ir

Centrinėje Europoje. Gali augti upių krantuose, potvynių užliejamose lygumose ir lapuočių miškuose [10]. (2 paveikslas)

Yra keletas bruožų, kaip galima atskirti Fraxinus angustifolia ir Fraxinus excelsior L. Aiškiausias skirtumas yra žiedyno tipas. Paprastieji uosiai turi žiedyną šluotelėje, F. angustifolia turi paprastą, neišsišakojusį žiedyną. Paprastieji uosiai turi daugiau didelių žiedynų, o F. angustifolia mažesnių žiedynų. Taip pat gali būti lengvai matomas ant medžių kabančių vaisių arba vaisių likučių: F. excelsior L. vaisiuose yra daug šakelių, tačiau tik viena šakelė F. angustifolia. Nors pumpurų spalva keičiasi, paprastųjų uosių pumpurai yra juodi, o F. angustifolia pumpurai dažniausiai rudos spalvos. F. angustifolia lapeliai paprastai siauresnė nei Fraxinus excelsior L. [16]. Žiemą paprastieji uosiai atskiriami iš būdingų juodų pumpurų. Sužaliuoja vėliausiai iš Lietuvos medžių, o rudenį vėluoja medžio lapkritis, kartais lapai nušąla nenukritę [4].

1.2. Paprastųjų uosių (Fraxinus excelsior L.) augavietės ir paplitimas

Paprastieji uosiai (Fraxinus excelsior L.) – šviesiamėgiai, greitai augantys ir mėgstantys derlingą drėgną dirvą, medžiai [1]. Gerai auga drėgnoje molio, priemolio dirvoje, taip pat gali dominuoti pakankamai sausose kalkinėse vietovėse. Paprastieji uosiai įprastai auga dirvose, kurių pH daugiau už 5-7. Dirvožemis, kuris yra derlingas, neutralaus pH, gilus, drėgnas ir lengvai drenuojamas sukuria optimalias sąlygas paprastųjų uosių augimui [2]. Augant nederlingose ir sausose vietovėse paprastųjų uosių augimas priklauso nuo lietaus vandens kiekio. F. excelsior L. yra jautrūs sausroms, todėl vandens tiekimas turi didelę įtaką augimui [3,17]. Klimatas turi mažiau įtakos nei dirvožemis paprastųjų uosių augimui. Jis gerai auga ir nepalankiomis klimato sąlygomis, jei dirvožemis yra tinkamas. Miškuose dažniau auga drėgnose vietose [18]. Paprastųjų uosių augimui yra svarbus šviesos kiekis ir erdvė, jie nemėgsta augti šešėlyje ir kur jiems nėra daug vietos, dėl tos priežasties pasižymi dideliu plastiškumu [19,20,21]. Palankiausios sąlygos augti paprastiesiems uosiams yra „šiltas“ klimatas (>1376 dienos > 5,6 ˚C), drėgnas ir derlingas dirvožemis, kurio pH 5 – 7,5 bei saulės šviesos intensyvumas ir fotoperiodas [3,19,22].

Paprastieji uosiai yra svarbi medžių rūšis paplitusi per visą Europą, Vakarų Aziją ir Šiaurės Afriką [22,10]. Paprastųjų uosių natūralus paplitimas apima didžiąją dalį Europoje nuo Atlanto vandenyno krantų vakaruose iki Volgos rytuose su šiaurinės ir pietinės dalių išsiskyrimu (3 paveikslas). Šiaurinė riba yra apie 64 ° šiaurės platumos Norvegijoje, su pietine riba siekia 37 ° šiaurės

platumos Irane. Kalnuotose vietovėse paprastieji uosiai randami Pirėnuose 1,750-1,800 m virš jūros lygio ir Šveicarijos Alpėse virš 1630 m. Azijoje (Iranas), juos galima rasti iki 2200 m. aukštyje [2].

3 pav. Natūralus paprastųjų uosių (Fraxinus excelsior L.) paplitimas [2]

Uosynai sudaro mažiau kaip 3 proc. visų Lietuvos miškų [23]. Uosiai auga apie 49 tūkst. ha plote, labiausiai išplitę Vidurio Lietuvos centrinėje ir šiaurinėje dalyse. Uosynų ploto dalis nuo šeštojo dešimtmečio padidėjo du su puse karto. Pastaraisiais metais ypač pablogėjo uosynų būklė, didesnioji jų dalis yra pažeista. Uosiai dažniausiai auga su eglėmis, beržais, ąžuolais. Jų būna juodalksnynuose, drebulynuose. Uosių medžių tūris (2,4 proc.) yra lygus uosynų užimamam plotui. Vidutinis uosynų medžių tūris 190 m3/ha. Vidutinis uosynų amžius - 53 metai. Amžiaus struktūra labai netolygi, ypač mažai brandžių ir bręstančių uosynų. Virš 80 metų amžiaus uosynai sudaro tik 10 procentų [24].

4 pav. Paprastųjų uosių (Fraxinus excelsior L.) paplitimas Lietuvoje [25]

1.3. Paprastųjų uosių (Fraxinus excelsior L.) augalinė žaliava ir kaupiamos

biologiškai aktyvios medžiagos

Pagal Europos farmakopėją, kaip augalinė žaliava naudojami uosių lapai, žievė. Kokybiškoje žaliavoje turi būti mažiausiai 2,5 proc. (25 mg/g) hidroksicinamono rūgšties darinių, išreikštų chlorogeno rūgštimi. Žaliava yra kokybiška, jeigu džiovinant 1g sumaltos žaliavos maksimaliai netenkama iki 10 proc. žaliavos masės [26].

Medicinos praktikoje naudojami paprastųjų uosių preparatai iš lapų (Fraxini folium), žievės (Fraxini cortex), vaisių (Fraxini fructus). Europos farmakopėjoje aprašomi paprastųjų uosių lapai ir žievė. Biologiškai aktyvių medžiagų kaupimuisi įtakos turi aplinkos sąlygos, klimatas, dirvožemis, drėgmės kiekis [5]. Skirtinguose augalo organuose kaupiamos skirtingos biologiškai aktyvios medžiagos ir jų kiekis [6,7].

Lapų fitocheminė sudėtis. Kumarinai 0,01-0,05 proc., iš kurių randami eskulinas, fraksinas, askuletinas, fraksetinas, skopoletinas, izoskpoletinas, iridoidai: deoksisiringoksidas, hidroksi- nuezenidas, siringoksidas. Sekoiridoidai: 10-hidroksiligstozidas, 7-β-D-gliukopiranozil-11-metiloleozidas, oleozido-11-metilesteris, oleozidos-7,11-dimetilesteris, oleuropeinas, ligstrozidas, GI 5 [27]. Buvo nustatyta panaši jaunų ir suaugusių medžių lapų kokybinė kvercetino ir kamferolio glikozidų sudėtis. Vidutiniškai lapuose aptinkama 1,4 proc. flavonoidų, vienas iš jų – rutozidas

(=rutinas) sudarė 0,5 proc. Aptinkamas nedidelis kiekis triterpenų, iš kurių yra β-sitosterolis, betulinas. Vidutiniškai apie 3,2 proc. randama fenolinių rūgščių: dihidroksibenzoinės rūgšties, vanilino rūgšties, galo rūgšties, kavos ir ferulino rūgščių. Vandeniniame sausajame ekstrakte yra 5,7 proc. fenolininių komponentų, o etanoliniame ekstrakte – 8,8 proc. [7,10].

Žievės fitocheminė sudėtis. Kumarinai: eskulinas, eskuletinas, eskuzidas, fraksinas, fraksetinas, fraksidinas, fraksinolis, skopoletinas, izoskopoletinas, skopolinas. Fenilpropano dariniai: siriginas, larikirezinolis, cikloolvilas, koniferilo alkoholis, koniferilo aldehidas. Terpenai: stilozinas. Sekoiridoidai: chinensizolis, oleuropeinas, neoleuropeinas, ligustrozidas, salidrozidas. Lignanai: pinorezinolis, aktoksipinorezinolis, pinorezinol-4-O-D-gliukopiranozidas, mediorezinolis, balanofoninas, fukusalas. saponinai, fenolinės rūgštys, steroliai, flavonoidai [28].

Sėklų fitocheminė sudėtis. Tiriant aukšto slėgio skysčių chromatografijos metodu sėklų ekstrakte buvo nustatyta fenolinių ir sekoiridoidinių junginių: salidrozido, oleozido-11-metilesterio, nuzenido, gliukozilformozido, ekselzido B, GI3,GI5, eksalzido A, ligstrozido, oleozido dimetilesterio. Fenoliniai junginiai sudaro 20,35 proc. viso junginių kiekio. Taip pat sėklose gausu angliavandenių, baltymų, riebalų, skaidulų [29].

1.4. Paprastųjų uosių kaupiamų fenolinių junginių struktūra ir savybės.

Fenoliniai junginiai priklauso biologiškai aktyviems augalų komponentams, kurie yra naudingi žmogaus sveikatai [30]. Fenoliniai junginiai yra žinomos fitocheminės medžiagos, randamos visuose augaluose. Jie yra sintetinami augaluose kaip atsakas į ekologinius, fiziologinius veiksnius, pavyzdžiui, patogenų ir vabzdžių atakas, UV spinduliuotes, mechaninius pažeidimus, klimato pasikeitimą ir kitus veiksnius, sukeliančius augalui stresą [31,32]. Augalai, kuriuose yra daug fenolinių junginių, gali veikti kaip antioksidantai siekiant išvengti širdies ligų [33], mažina uždegimą, sumažina riziką sirgti vėžiu, diabetu, taip pat sumažina mutagenezės procesus žmogaus ląstelėse. Didžiausią žmogaus organizmo apsaugą suteikianti savybė yra susijusi su fenolinių junginių buvimu augaluose [34,35,36].

Pagal struktūrą fenoliniai junginiai yra skirstomi į paprastus fenolius, fenolines rūgšis, kumarinus, taninus, ligniną, lignanus ir flavonoidus [37]. Pagrindinis struktūrinis fenolinių junginių bruožas yra aromatinis žiedas, turintis vieną ar daugiau hidroksilo grupių [38].

Kumarinai yra didelė fenolinių junginių grupė, kuri paplitusi tarp daugelio Fraxinus rūšių. Paprastųjų uosių lapuose randama: eskuletinas, eskulinas, cichorinas, skopoletinas, izoskopoletinas,

7-metileskulinas, fraksetinas, fraksinas, fraksidinas, fraksidin–O-β-glikozidas, izofraksidinas, kalinkatozidas, fraksinolis, manšurinas. (5 pav., 1 lentelė)

5 pav. Kumarinų struktūros pagrindas [7]

1 lentelė. Paprastųjų uosių žaliavoje nustatomi kumarinai

R1 _R2 _R3 _R4 _Pavadinimas H OH OH H Eskuletinas H OGlc OH H Eskulinas H OH OGlc H Cichorinas H OMe OH H Skopoletinas H OH OCH3 H Izoskopoletinas

H OCH3 OCH3 H 7-metileskulinas

H OCH3 OH OH Fraksetinas

H OCH3 OH OGlc Fraksinas

H OCH3 OCH3 OH Fraksidinas

H OCH3 OCH3 OGlc Fraksidin–O-β-glikozidas

H OCH3 OH OCH3 Izofraksidinas

H OCH3 OGlc OCH3 Kalinkatozidas

OCH3 OH OCH3 H Fraksinolis

OCH3 OGlc OCH3 H Manšurinas

Kumarinai – bespalvės, kristalinės fitocheminės medžiagos, priklausančios polifenolinių junginių grupei. Tai yra deguonies heterociklas, kuris turi kombinuotą formą su gliukoze arba yra laisvas. Kumarinai priklauso benzopironų šeimai, kuri susideda iš benzeno žiedo, susijungusio su pirono žiedu (5 pav.). Benzopironai skirstomi į benzo-α-pironus ir benzo-γ-pironus. Tyrimai įrodė, kad kumarinai veikia kaip vitamino K inhibitoriai. Kiti sudėtingi junginiai, susidedantys iš kumarino branduolio, panašūs į antikoaguliantus tokius kaip varfarinas, aflatoksinai . Tyrimai taip pat parodė,

kad jie veikia kaip kraujo skiedikliai ir pasižymi priešgrybelinėmis savybėmis. Mokslininkai nustatė kumarinų citotoksiškumą auglių ląstelėms bei jų poveikį reguliuojant imuninį atsaką, ląstelių augimą ir diferenciaciją [39].

Didelė įvairovė sekoiridoidų buvo išskirta iš paprastųjų uosių lapų: 10-hidroksiligstozidas, 7-β-D-gliukopiranozil-11-metil-oleozidas, oleozid-11-metilesteris, oleozid-7,11-dimetilesteris, ekselsiozidas, oleuropeinas, ligstrozidas, nuzenidas, GI5, GI3 [7,40,10]. (6 pav., 2 lentelė)

6 pav. Sekoiridoidų struktūros pagrindas [7]

2 lentelė. Paprastųjų uosių žaliavojenustatomi sekoiridoidai 2 lentelė. Paprastųjų uosių žaliavoje nustatomi sekoiridoidai

R1 _R2 _R3 _Pavadinimas H CH3 CH3 Oleozid-7,11-dimetilesteris H CH3 Oleuropeinas H CH3 (1)-β-D-Glc 7-β-D-glukopiranozil-11- metiloleozidas H HCH2 Ligstrozidas OH CH3 10-hidroksiligstrozidas H CH3 Ekselsiozidas/formozidas

Sekoiridoidai dažniausiai nustatomi glikozidų arba hidroksifeniletilo esterių forma. Oleozido ir 10-hidroksioleozido sekoiridoidai turi būdingas Fraxinus rūšims etilideno ir hidroksietilideno grupes prie C-9. Visi natūralūs sekoiridoidai turi tą pačią konfigūraciją (H-1 yra trans-H-5) ir E-konfigūracijos C8 / C9 dviguba jungtis [7,40]. Buvo tiriamas in vitro išgrynintų sekoiridoidų glikozidų antikomplementinis poveikis ir gebėjimas jo išvengti kobros nuodų sukelto komplemento aktyvavimo normaliame žmogaus serume. Tyrimo rezultatai parodė, kad dauguma sekoiridoidų turi galimybę slopinti komplimento susidarymą. Efektyviausias inhibitorius buvo ligstrozidas (IC50 33 µg / ml). Taip pat buvo nustatyta, kad sekoiridoidai turi stiprų poveikį vainikinių arterijų vazodilatacijai bei inhibuoja S. aureus ir Cladosporum cucumerinum augimą [10].

Paprastųjų uosių augalinėse žaliavose randama fenolinių rūgščių, kurioms priklauso: p-hidroksibenzoinė rūgštis, protokatechino rūgštis., vanilino rūgštis, cinamono rūgštis, galo rūgštis, 5-O-kafeoilchino rūgštis, chlorogeno rūgštis, neochlorogeno rūgštis, siringo rūgštis, p-kumaro rūgštis, kavos rūgštis, ferulino rūgštis, sinapo rūgštis [7].

Bendrai pavadinimas "fenolinės rūgštys" apibūdina fenolius, kurie turi vieną karboksirūgšties funkcinę grupę. Natūraliai fenolinės rūgštys (atsižvelgiant į anglies struktūrą) yra skirstomos į dvi grupes: hidroksicinamono (Xa) – būdinga C3-C6 struktūros pagrindas; hidroksibenzoato (Xb) – būdinga prie fenolinio žiedo prisijungusi karboksi grupė ir C1-C6 struktūros pagrindas. Nors skeletas išlieka tas pats, hidroksilo grupių skaičiai ir padėtys prie aromatinio žiedo sukuria įvairovę. Daugeliu atvejų, aldehido analogai (Xc) yra taip pat sugrupuoti ir vadinami fenolinėmis rūgštimis. Kavos rūgšties, p-kumaro, vanilino, ferulino rūgštys yra kaupiamos beveik visuose augaluose [36]. (7 paveikslas)

Nors daug kas yra dar nežinoma dėl fenolinių rūgščių vaidmenis augaluose, jos yra susiję su įvairiomis funkcijomis, įskaitant maisto medžiagų įsisavinimą, baltymų sintezę, fermentų veiklą, fotosintezę, struktūrinius komponentus. Cinamono ir benzoinės rūgšties dariniai egzistuoja beveik visuose augaluose ir fiziškai yra pasklidę po visą augalą sėklose, lapuose, šaknyse ir stiebuose. Tik nedidelė dalis egzistuoja kaip "laisvos rūgštys". Vietoj to, dauguma yra susijungusios su esteriais, eteriais arba acetalinėmis jungtimis su augalų struktūriniais komponentais (celiuliozė, baltymai, ligninas). Šie ryšiai turi įtakos plačiai darinių įvairovei.

8 pav. Fenolinių rūgščių sintezė [41]

Fenolinių rūgščių ir jų esterių antioksidantinis aktyvumas priklauso nuo hidroksilo grupių skaičiaus, esančio molekulėje. Benzoinių rūgščių karboksilato grupių elektronų atitraukimo savybės turi neigiamą įtaką hidroksibenzoatų gebėjimui H atidavimui. Monohidroksiamino benzoinės rūgštys neturi antioksidantinio aktyvumo orto ir para padėtyse, apibūdinant gebėjimą atiduoti vandenilį prieš vandeninėje fazėje generuotus radikalus. Tai atitinka vienos karboksilo funkcinės grupės elektronų atidavimo potencialą fenolio žiede, veikiant O- ir p- pozicijas. Tai, kad dihidroksibenzoinės rūgšties dariniai rodo antioksidantinį atsaką priklauso nuo hidroksilo grupių žiede. Galo rūgšties turi 3.0 mM antioksidantinį aktyvumą, atitinkantį trijų hidroksilo grupių. Esterinimas galo rūgšties karboksilato grupės taip pat sumažina veiksmingumą (2,4 mM).

Etileno grupės įtraukimas tarp fenilo žiedo pridedant p-hidroksilo grupę ir karboksilato grupę, kaip p-kumaro rūgštis, turi teigiamą poveikį OH grupės redukuojančių savybių (lyginant su cinamono rūgštimi). Įtraukimas hidroksilo grupės p-kumaro rūgštyje, para padėtyje kaip ir kavos rūgšties suteikia 1,26 mM TEAC. Glikozilinant karboksilato grupes kavos rūgšties (chlorogeno rūgšties) neturi įtakos TEAC vertei. Pakeitimas 3-hidroksilo grupės kavos rūgšties į metoksi grupę (ferulo rūgšties) žymiai pagerina antioksidacinį efektyvumą. -CH=CH-COOH grupių buvimas cinamono rūgštyje užtikrina didesnį gebėjimą atiduoti H ir tolesnį radikalo stabilizavimą nei karboksilato grupės benzoinėje rūgštyje. Kiti hidroksicinamono rūgšties tyrimai parodė fenolinių rūgščių efektyvumą: kavos rūgštis > ferulino ūgštis > p-kumaro rūgštis [42].

Neochlorogeno rūgštis gali turėti antikarcinogeninį poveikį žmogaus adenokarcinomai, Caco-2 ląstelių linijoms. Buvo analizuojamas chlorogeno rūgšties ir neochlorogeno rūgšties poveikis prieš gaubtinės žarnos vėžį, siekiant išmatuoti ląstelių proliferaciją ir morfologiją kultūros Caco-2 ląstelių. Gydymas ląstelių su chlorogeno ir neochlorogeno rūgštimis žymiai sumažino ląstelių proliferaciją, kurių koncentracija 150-500 μmol 24, 48, ir 72 valandas 63.7-96.0 proc. ir 69.7-94.2 proc. Šie reikšmingi ląstelių proliferacijos slopinimo duomenys rodo, kad chlorogeno rūgštis ir neochlorogeno rūgštis gali būti storosios žarnos vėžio slopinimo komponentais [43].

Buvo atliktas in vivo tyrimas, kurio metu buvo nustatyta, kad chlorogeno rūgštis padeda reguliuoti gliukozės ir lipidų metabolizmą, pagerinti jautrumą insulinui, bei gali būti pritaikyta nutukimo, cukrinio diabeto ir metabolinio sindromo prevencijai ir gydymui [44].

1.5. Paprastųjų uosių kaupiamų flavonoidų struktūra ir savybės.

Flavonoidai priklauso plačiai mažos molekulinės masės junginių klasei, kuriai būdingas flavano pagrindas (9 pav.). Jie plačiai paplitę augalų lapuose, sėklose, žievėje ir žieduose, iki šiol yra nustatyta daugiau nei 4000 flavonoidų. Augaluose, šie junginiai apsaugo nuo ultravioletinių spindulių, patogenų. Antocianidinų pigmentai žieduose pritraukia vabzdžius apdulkinimui ir yra atsakingai už uogų, vyno, daržovių raudoną ir mėlyną spalvas. Flavonoidai yra pagrindiniai šaltiniai žmogaus mityboje. Daugumos flavonoidų naudingumas sveikatai priklauso nuo antioksidantinio aktyvumo ir gebėjimo sudaryti kompleksonus [45,46].

9 pav. Flavano struktūros pagrindas [47]

Polifenoliniai flavonoidai turi difenilpropano skeletą. Šiai junginių klasei priklauso: monomero flavanoliai, flavanonai (luteoninas, apigeninas), antocianidinai (cianidinas, delfinidinas, peonidinas) , flavonai (hesterinas, naringeninas) ir flavonoliai (kvercetinas, kamferolis, mircetinas) (10 pav.) [48]. Individualūs skirtumai kiekvienoje grupėje atsiranda dėl įvairaus hidroksilo grupių skaičiaus ir išdėstymo. Dažniausiai pasitaikantys flavonai ir flavonoliai yra tie, kurie yra dihidroksilinami B žiedo3 'ir 4' padėtyse. Pageidaujama flavonoidų glikozilinimo vieta yra 3 padėtyje, rečiau pasitaikanti 7-oje padėtyje [42]. Flavonoidų glikozidai skiriasi remiantis flavonoidų glikozilinimo pozicijos skaičiumi, glikozilinimo lygio ir cukrų tipais, dalyvaujančiais glikozilinime. Glikozidai gali būti susijungę per O- arba C- [48]. Be to, iš kelių šimtų aglikonų, išskiriamų iš augalų, tik aštuoni yra plačiai paplitę, tai: kamferolis, kvercetinas, rutinas, katechinas, epikatechingalatas, miricetinas, antocianidinai ir luteolinas [49].

10 pav. Pagrindinių flavonoidų klasių bendra struktūra [49]

A C

Keli struktūriniai bruožai ir pakeitimai B ir C žieduose gali turėti įtakos flavonoidų aktyvumui:

1. Hidroksilinimo laipsnis ir -OH grupių padėtis B žiede, ypatingai orto-difidroksil struktūros B žiede (katecholo grupės) sukelia didesnį aktyvumą, nes suteikia didesnį stabilumą aroksilo radikalui, perkeliant elektronus.

2. Hidroksilo grupių buvimas B žiedo 3`, 4`, ir 5`padėtyse taip pat sustiprina flavonoidų aktyvumą palyginti su tais, kurie turi vieną hidroksilo grupę. Tačiau, esant tam tikroms sąlygoms, tokie junginiai gali veikti kaip prooksidantai tokiu būdu mažinant antioksidantinį poveikį. T Seeram ir Nair tyrimas patvirtina, kad 3`,4`-dihidroksifenilo pakeitimas į 3`,4`,5`-trihidroksilfenilą sustiprina anto-cianidinų aktyvumą, bet sumažina katechinų.

3. Dviguba jungtis tarp C-2 ir C-3, konjuguota su 4-oksi grupe C žiede pagerina flavonoidų gebėjimą sujungti radikalus.

4. Dviguba jungtis tarp C-2 ir C-3, kartu su 3-OH C žiede taip pat didina flavonoidų aktyvią radikalų sujungimo gebą. Pakeitimas 3-OH padidina sukimo kampą ir praradima plokštuma, dėl to sumažėja aktyvumas.

5. Keitimas hidroksilo grupių žiede B metoksilo grupėmis keičia oksidacijos-redukcijos potencialą, kuris veikia flavonoidų gebėjimą jungti sujungti radikalus [49,46].

Flavonoidai pasižymi žmogaus sveikatai naudingomis savybėmis: padeda apsaugoti kapiliarus, sugeba sumažinti kapiliarų sienelių trapumą ir pralaidumą, pasižymi priešuždegiminiu ir opų atsiradimą stabdančiu poveikiu, padeda mažinti cholesterolio kiekį kraujyje, veikia spazmolitiškai, pasižymi antioksidantiniu poveikiu, gerina širdies funkcijos ir kraujagyslių veiklą, didina širdies susitraukimų amplitudę, atstato širdies funkciją po išsekimo [47,48].

1.6. Paprastųjų uosių preparatų biologinis poveikis

Paprastųjų uosių (Fraxinus excelsior L.) preparatai pasižymi antimikrobiniu, priešuždegiminiu, antioksidantiniu ir odą regeneruojančiu poveikiu [7]. Jų žaliavų ekstraktai ir metabolitai slopina įvairius uždegimus, karščiavimą, skausmą bei yra veiksmingi gydant reumatą, inkstų akmenligę ir podagrą [8].

Diuretinis ir antihipertenzinis poveikis. Tradiciškai paprastųjų uosių lapų ekstraktai buvo naudojami siekiant palengvinti skysčių išsiskyrimą per inkstus. Diurezinį poveikį sukelia ekstrakte esantys flavonoidai. Purškiami džiovinti milteliai, pagaminti iš vandeninio ir etanolinio, šio augalo lapų ekstrakto sukėlė nuo dozės priklausomą natrio ir chlorido jonų išsiskyrimą [7].

Moksliniai tyrimai su žiurkėmis parodė, kad paprastojo uosio ekstraktai turi šlapimo išsiskyrimą skatinantį poveikį. Eksperimentinių tyrimų metu buvo nustatyta, kad etanolinis paprastojo uosio lapų ekstraktas turi didesnį poveikį šlapimo kiekio išsiskyrimui negu vandeninis paprastojo uosio lapų ekstraktas [50]. Diurezę skatinantis poveikis yra svarbus sergant arterine hipertenzija, kadangi, sumažėjus skysčių kiekiui organizme, sumažėja kraujagyslių pasipriešinimas ir dėl to sumažėja arterinis kraujo spaudimas [51,52].

Kitame eksperimentiniame tyrime su hipertenzija sergančiomis ir sveikomis žiurkėmis vienai grupei buvo duodama irbesartano (angiotenzino II blokatorius), o kitai vandeninio paprastųjų uosių ekstrakto. Tuo pačiu metu diurezė ir natriurezė padidėjo abejose grupėse. Nors paprastųjų uosių ekstraktas neturėjo įtakos širdies susitraukimų dažniui, tačiau žymiai padidėjo glomerulų filtracijos greitis. Šio tyrimo rezultatai įrodo, kad vandeninis paprastųjų uosių ekstraktas turi hipotenzinį bei diuretinį poveikį [53].

Hepatoprotekcinis poveikis. Nealkoholinis kepenų riebėjimas yra pripažintas vienu iš pavojingiausių metabolinio sindromo ir hapatocitų steatozės padarinių, turinčių ryšį su jautrumo praradimu insulinui, sumažėjusia gliukozės tolerancija bei įtakoja 2 tipo cukrinio diabeto atsiradimą. Paprastųjų uosių sėklų ekstraktas buvo vartojamas Viduržemio jūros liaudies medicinoje ir Glucevia (natūralus paprastųjų uosių sėklų/vaisių ekstraktas standartizuotas 10 proc. nuzenidas bei GI3) gali sureguliuoti antsvorį turinčių žmonių gliukozės homeostazę. Atlikus tyrimą grupėje, kurioje 7 mėn. buvo vartojama Glucevia reikšmingai sumažėjo kepenų riebalų kiekis diabetu sergančioms pelėms. Papildomai pagerėjo šarminės fosfatazės (ALP) aspartato aminotransferazės/ alanino amino-transferazės (AST/ALT) rodikliai. Gerokai sumažėjo insulino koncentracija plazmoje. Gauti rezultatai rodo galimą Glucevia hepatoprotekcinį poveikį, kuris padėtų išvengti riebalų formavimosi kepenyse 2 tipo cukriniu diabetu sergančioms pelėms [5].

Hipoglikeminis ir svorį mažinantis poveikis. Paprastųjų uosių vandeninis ekstraktas Maroke buvo vartojamas diabeto gydymui ir antsvorio mažinimui. Buvo atliktas 3 savaičių mokslinis tyrimas, kuriame dvidešimt du 50 -80 m amžiaus dalyviai (KMI 31,0 kg/m2) kasdien gavo po 3 333 mg paprastųjų uosių sėklų/vaisių ekstrakto kapsules arba placebo kapsules. Po 3 savaičių dalyvių, vartojusių paprastųjų uosių sėklų/vaisių ekstraktą, gliukozės kiekis kraujyje sumažėjo, taip pat sumažėjo riebalų masė (ypač juosmens ir klubų dalyse). Paprastųjų uosių sėklų/vaisių vartojimas kartu su mažai kalorijų turinčia dieta galėtų būti naudingas metabolinių sutrikimų susirgimams, susijusiems

su gliukozės netoleravimu, nutukimu, sumažėjusiu jautrumu insulinui gydyti (ypatingai vyresniame amžiuje) [54].

Kitas tyrimas buvo atliktas obuolių sultis papildžius 2,1 g paprastųjų uosių sėklų ekstraktu, kuriame yra nuzenido ir GI3. Tyrimo rezultatai parodė, kad šie produktai yra naudingi palaikant gliukozės homeostazę [55].

Trečiasis tyrimas buvo atliekamas su pelėmis, joms 16 savaičių buvo skiriamas paprastųjų uosių sėklų ekstraktas kartu su mažai riebalų turinčia mityba arba su daug riebalų turinčia mityba. Po 16 savaičių pelių svoris sumažėjo iki 32 proc., taip pat sumažėjo gliukozės kiekis kraujyje nevalgius. Mityba kartu su paprastųjų uosių sėklų ekstraktu pagerino pelių fiziologinius ir biocheminius parametrus - kūno svorį, riebalų kiekį įvairiuose organuose, gliukozės, insulino rodiklius [8].

Poveikis dislipidemijai ir uždegimui. Tyrimai parodė, kad dislipidemijos ir uždegiminės reakcijos turi įtakos diabeto mikrovaskulinių komplikacijų progresavimui. Eskulinas - kumarino darinys, buvo išgautas iš paprastojo uosio. Rezultatai parodė, kad eskulinas gali sumažinti trigliceridų, cholesterolio ir mažo tankio lipidų kiekį diabetu sergančioms žiurkėms priklausomai nuo dozės [56].

Antibakterinis poveikis. Keletas tyrimų parodė, kad vandeniniai paprastųjų uosių lapų ir žievės ekstraktai stabdo 11 mikroorganizmų augimą. Pastebėta, kad paprastųjų uosių žievėje esantys biologiškai aktyvūs junginiai- kumarinai pasižymi antimikrobinėmis savybėmis prieš S. Aureus ir E. coli. Palyginus, eskuletinas su fraksetinu turi nedidelį slopinamąjį antimikrobinį poveikį. Sekoiridoidai ligstrozidas ir ornozidas bei fenilentaoidas ornozolas slopina S. aureusir Cladosporum cucumerinum augimą [7].

Antioksidantinis poveikis. Yra įrodymų, kad paprastųjų uosių alkoholinis žievės ir metanolinis lapų ekstraktai pasižymi antioksidantinėmis savybėmis. Antioksidantinį aktyvumą suteikia žievėje esantys kumarinai, tai eskuletinas, eskulinas, kraksetinas [7,57]. Chlorogeno rūgštis yra viena iš gausiausių polifenolių nustatomų paprastųjų uosių lapuose. Tyrimai in vivo ir in vitro parodo, kad chlorogeno rūgštis turi stiprų antioksidantinį aktyvumą [58].

2. TYRIMO METODIKA

2.1. Tyrimų objektas

Tirtos natūraliose augavietėse augančių paprastųjų uosių (Fraxinus excelsior L.) augalinės žaliavos: lapų ir vaisių mėginiai, surinkti augalo vegetacijos laikotarpiu 2015 – 2016 metais. Lapų ir vaisių žaliavų ėminiai rinkti nuo trijų paprastųjų uosių reguliariai kas dvi savaites augalo vegetacijos metu (nuo gegužės 24 dienos iki rugpjūčio 28 dienos) Alytaus raj., Dvarčėnų kaimo sodyboje (54° 20' 1.61", 24° 20' 21.19" (WGS)). 2016 metais gegužės 18 – 28 dienomis lapų žaliavos mėginiai rinkti įvairiuose Lietuvos regionuose:

Telšių sodyba – 56° 0' 1.48", 22° 14' 1.47" (WGS)

Vilniaus Pasakų parkas – 54° 41' 5.96", 25° 12' 19.86" (WGS)

Kauno marių regioninis parkas – 54° 53' 30.07", 24° 0' 55.79" (WGS) Birštono miesto centrinis parkas - 54° 36' 31.85", 24° 1' 44.46" (WGS) Panevėžio kultūros ir poilsio parkas – 55° 44' 14.07", 24° 19' 50.12" (WGS) Pakruojo raj. Kuosiškio miškas – 55° 57' 54.89", 23° 51' 21.06" (WGS) Klaipėdos raj. Drevernos kaimo sodyba – 55° 31' 0.86", 21° 14' 52.46" (WGS) Marijampolės raj. Dielinės miškas – 54° 37' 22.66", 23° 20' 12.42" (WGS)

Surinkta vaistinė augalinė žaliava buvo džiovinama gerai vėdinamoje patalpoje, apsaugota nuo tiesioginių saulės spindulių. Išdžiovintas tiriamasis objektas supakuotas į popierinius maišelius ir laikytas tamsioje, sausoje vietoje.

2.2. Naudoti reagentai ir medžiagos

96,3 proc. V/V etilo alkoholis (AB „Stumbras“, Kaunas, Lietuva),98 - 100 proc. V/V acto rūgštis (,,Sigma–Aldrich“, St. Louis, JAV), heksametilentetraminas („Alfa Aesar“, Massachusetts, JAV), aliuminio chloridas ( ≥ 98 proc., bevandenis, Roth, Vokietija), išgrynintas vanduo (vandens gryninimo sistema Milipore, Bedford MA, JAV), rutinas ( ≥ 95 proc., SIGMA-ALDRICH, Vokietija), 37 proc. vandenilio chlorido rūgšties tirpalas, natrio molibdatas, natrio nitritas, natrio šarmas,

chromatografinio švarumo acetonitrilas ir trifluoracto rūgštis įsigyti iš “Sigma-Aldrich GmbH” (Buchs, Šveicarija), dejonizuotas vanduo paruoštas naudojant “Milli-Q” valymo sistemą (Bedford, JAV).

2.3.Naudota aparatūra

Tyrime naudota aparatūra: analitinės svarstyklės (Sartorius Cp6M-0CE, Vokietija), elektrinis malūnėlis (Binatone, Jungtinė Karalystė), ultragarsinė vonelė (Bandelin SONOREX Digital,Vokietija), spektrofotometras (Beckman DU – 70, JAV)), 1 cm skersmens kiuvetės, chomatografas (Waters 2695, Milford, USA), membraniniai filtrai (Carl Roth Gmbh, Karlsrujė, Vokietija). Waters Alliance e2695” sistema (Milfordas, JAV) su diodų matricos detektoriumi “Waters 2998 PDA”. Analičių skirstymas atliktas “ACE Excel 3 SuperC18” (250×4.6 mm, 3 µm) analitine kolonėle (Aberdinas, Škotija), termostatuota 25 °C temperatūroje. Judri faze sudaryta iš 0,1 proc. TFA vandenyje (A) ir acetonitrilo (B), chromatografinių duomenų rinkimas ir apdorojimas atliktas „Empower 3“ programine įranga (Milfordas, JAV).

2.4. Tyrimų metodai

Paprastųjų uosių lapų ir vaisių ėminių ekstraktų paruošimo metodika. Sudžiovinta lapų augalinė žaliava buvo smulkinama elektrine smulkintuve. 0,100 g (0,0001 g tikslumu) orasausės žaliavos buvo dedama į 25 ml talpos kolbutę, užpilama 50 proc. V/V etanolio vandeniniu tirpalu iki žymės, šildoma ultragarso vonelėje 15 min., 40° C temp. Gautas ekstraktas buvo filtruojamas per popieriaus filtrą į 25 ml talpos kolbutę. Ekstrakto tūris buvo patikslintas ekstraktą praskiedus 50 proc. V/V etanoliu iki žymos. Vaisių ekstrakto paruošimas buvo vykdomas panašiai kaip lapų, skyrėsi naudojamas žaliavos kiekis. Ekstrakto gamybai naudojamas 0,900 g (0,0001g tikslumu) vaisių žaliavos kiekis.

Bendro fenolkarboksirūgščių kiekio nustatymas

Pirmiausiai buvo paruošti 0,5 M vandenilio chlorido rūgšties ir praskiesto natrio šarmo tirpalai. Arnow reagentas pagamintas ištirpinus išgrynintame vandenyje 10,0 g natrio molibdato ir 10,0 g natrio nitrito.

Tiriamasis tirpalas. 0,5 ml paruošto augalinės žaliavos ekstrakto sumaišoma su 1 ml 0,5 M vandenilio chlorido rūgštimi, 1 ml Arnow reagentu, 1 ml praskiestu natrio šarmu. Praskiedžiama išgrynintu vandeniu iki 5 ml ir sumaišoma.

Lyginamasis tirpalas. 0,5 ml tiriamojo augalinės žaliavos ekstrakto sumaišoma su 1 ml 0,5 M vandenilio chlorido rūgšties ir 1 ml praskiesto natrio šarmo. Praskiedžiama išgrynintu vandeniu iki 5 ml ir sumaišoma.

Matuojama tirpalų absorbcija esant 525 nm bangos ilgiui.

Bendras procentinis fenolkarboksitrūgščių kiekis ekstrakte perskaičiuotas chlorogeno rūgštimi remiantis formule:

𝑋(𝑚𝑔/𝑔) =

𝑚 /100*1000

A – tiriamojo tirpalo absorbcija esant 525 nm angos ilgiui; V – paruoštos augalinės žaliavos ekstrakto tūris mililitrais; m – tiriamos augalinės žaliavos masė gramais

Bendro flavonoidų kiekio nustatymas spektrofotometrijos metodu

Bendras flavonoidų kiekis (atitinkantis rutino kiekį) nustatomas ekstraktą veikiant aliuminio chlorido tirpalu acto rūgštimi parūgštintoje terpėje. Duomenys įvertinti gautą absorbcijos koeficiento dydį palyginus su rutino etaloninio tirpalo absorbcijos koeficientu.

Tiriamasis tirpalas ruošiamas į 5 ml matavimo kolbutę įpilant 0,2 ml paruoštos vaistinės augalinės žaliavos ištraukos, 2 ml 96 proc. V/V etanolio, 0,1 ml 30 proc. acto rūgšties tirpalo, 0,3 ml 10 proc. aliuminio chlorido tirpalo, 0,4 ml 5 proc. heksametilentetramino tirpalo; kolbutės turinys skiedžiamas išgrynintu vandeniu iki žymės, sumaišoma. Praėjus 30 min. matuojamas 10 mm tirpalo sluoksnio absorbcijos dydis ir lyginamas su palyginamuoju tirpalu esant bangos ilgiui 407 nm.

Palyginamasis tirpalas ruošiamas į 25 ml matavimo kolbutę įpilant 0,2 ml paruoštos vaistinės augalinės žaliavos ištraukos, 2 ml 96 proc. V/V etanolio, 0,1 ml 30 proc. acto rūgšties tirpalo ir kolbutės turinį praskiedus išgrynintuoju vandeniu iki žymės.

Tokiomis pačiomis sąlygomis ruošiami etaloninio rutino tirpalo tiriamasis ir palyginamasis tirpalai, tačiau vietoje 0,2 ml paruoštos vaistinės augalinės žaliavos ištraukos, pilama 0,2 ml etaloninio

rutino tirpalo. Etaloninis rutino tirpalas ruošiamas 0,0125 g rutino (tikslus svėrinys), tirpinant 70 proc. V/V etanolyje 25 ml talpos matavimo kolbutėje.

Flavonoidų kiekis vaistinės augalinės žaliavos, perskaičiuotas rutinu ir išreikštas procentais (X), skaičiuotas naudojantis formule:

mg/g=X /100*1000

m(r) – rutino standarto masė gramais, sunaudota etaloniniam rutino tirpalui ruošti.

V(važ) – visas paruoštos vaistinės augalinės žaliavos ištraukos tūris mililitrais (priklauso nuo ekstrakcijos sąlygų).

A(važ) – paruoštos vaistinės augalinės žaliavos tiriamojo tirpalo absorbcijos dydis.

m(vaistinės augalinės žaliavos) – vaistinės augalinės žaliavos masė gramais, sunaudota ištraukai ruoši.

A(r) – etaloninio rutino tirpalo absorbcijos dydis.

Fenolinių junginių nustatymas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu.

Kiekybinė fenolinių junginių analizė buvo atlikta Waters 2695 Alliance sistema (Waters, Milfordas, MA, JAV) su diodų matricos detektoriumi Waters 996. Fenolinių junginių skirstymas buvo atliktas su ACE (ACT, UK) kolonėle (C18, 150 mm x 4,6 mm, dalelių dydis 3 μm), turinčia ACE (ACT, UK) prieškolonę (C18, dalelių dydis 3 μm). Analizės metu naudota judri fazė, kurią sudarė eliuentas A (0,05 proc. trifluoracto rūgštis) ir eliuentas B (acetonitrilas).

Analizės metu buvo naudojamas gradiento kitimas: 0-5 min. 12 proc. eliuento B, 5-50 min. – 12-30 proc. eliuento B, 50-51 min. – 30-90 proc. eliuento B, 51-56 min. 90 proc. eliuento B, 57 min. 12 proc. eliuento B. Naudotų eliuentų tėkmės greitis buvo 0,5 ml/min., injekcijos tūris – 10 µl. Kolonėlėje buvo palaikoma 25 ° C temperatūra.

Efektyviosios skysčių chromatografijos metodo taikymo metu gautų chromatografinių smailių identifikavimas buvo atliktas pagal analitės ir etalono junginio sulaikymo laiką. Buvo palyginti diodų matricos detektoriumi gauti etaloninių junginių ir analičių UV absorbcijos spektrai. Kiekybinis analičių įvertinimas buvo atliktas išanalizavus analičių smailių priklausomybę nuo analičių koncentracijos tiriamuosiuose tirpaluose. Buvo sudaryti paprastųjų uosių lapų ir vaisių ėminių ekstraktuose identifikuotų junginių kalibravimo grafikai, kuriais naudojantis buvo atlikta kiekybinė

analizė. Chlorogeno rūgšties, neochlorogeno rūgšties ir 4-O-kafeoilchino rūgšties absorbcijos dydžiai gauti ir junginių kiekiai apskaičiuoti esant 325 nm bangos ilgiui, rutino ir astragalino – 350 nm bangos ilgiui. Su kiekvienu žaliavų ėminiu bandymai buvo kartojami 3 kartus ir išvedamas gautų rezultatų vidurkis.

2.5. Statistinis duomenų vertinimas

Gauti duomenys buvo apdorojami naudojantis Microsoft Excel 2016 kompiuterine programa (Microsoft, JAV) ir „IBM SPSS Statistics 23“ („IBM“, JAV) statistiniu paketu. Duomenys statistiškai įvertinti, apskaičiuojant eksperimentinių tyrimų duomenų matematinį vidurkį ir standartinę paklaidą. Koreliacinių ryšių stiprumui nustatyti taikytas Spirmeno koreliacijos koeficientas. Rezultatų statistinis patikimumas įvertintas, taikant vienfaktorinę dispersinę analizę (ANOVA). Pasirinktas reikšmingumo lygmuo p =0,05.

3. TYRIMŲ REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1. Paprastųjų uosių lapų žaliavos ekstrakcijos sąlygų parinkimas

Tirpiklio koncentracijos parinkimas. Tirpikliu ekstrakcijai buvo parinktas etanolis. Norint nustatyti optimalią etanolio koncentraciją, kurios metu išsiekstrahuoja didžiausias bendras hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis, išreikštas chlorogeno rūgštimi, buvo imama skirtinga etanolio koncentracija: 40, 50, 60, 70 proc. V/V. Ekstrahuojama ultragarso vonelėje 15min. Nustatyta, kad statistiškai reikšmingai išsiskiria bendras hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis tirpikliu parinkus 50 proc. V/V etanolį. (1 paveikslas)

1 pav. Bendro hidroksicinamono rūgšties darinių kiekio (išreikšto chlorogeno rūgštimi) įvairavimas esant skirtingai etanolio koncentracijai (n=3). Skirtingos raidės rodo reikšmingus

skirtumus tarp ėminių

Ekstrakcijos trukmė. Ekstrakcijos trukmei įvertinti buvo pasirinkta 50 proc. V/V etanoliniai paprastųjų uosių lapų bandiniai. Maceracija vyko ultragarso vonelėje. Bandiniai ultragarso vonelėje buvo ekstrahuojami skirtingais laiko intervalais: 5, 15, 30, 45, 60 min. Didžiausia bendras hidroksicinamono rūgšties darinių kiekio (išreikšto chlorogeno rūgštimi), išeiga nustatyta po 15min. (2 paveikslas) 55 60 65 70 75 80 40 50 60 70 B endra s hidroksicina mono r . da rinių ki ekis m g/g

Etanolio koncentracija proc. A

C

B

2 pav. Bendras hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis (išreikštas chlorogeno rūgštimi), ekstrakciją vykdant skirtingais laiko intervalais ultragarso vonelėje (n=3). Skirtingos raidės rodo

reikšmingus skirtumus tarp ėminių

Išanalizavus paruoštus paprastųjų uosių lapų mėginius, buvo nustatytos bendro hidroksicinamono rūgšties darinių kiekio (išreikšto chlorogeno rūgštimi) optimalios ekstrakcijos sąlygos. Didžiausias bendras hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis išgaunamas maceruojant 15min. ultragarso vonelėje, ektstrahentu parinkus 50 proc. V/V etanolį.

3.2. Paprastųjų uosių lapų ir vaisių fenolinių junginių spektrofotometrinė analizė

3.2.1. Bendro hidroksicinamono rūgšties darinių kiekio įvairavimas paprastųjų

uosių lapuose vegetacijos laikotarpiu

Europos farmakopėjoje nurodyta, kad bendras hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis išreikštas chlorogeno rūgštimi turi būti ne mažesnis 2,5 proc. [26]. Tiriamas bendras hidroksicinamono rūgšties darinių kiekio (CRE) įvairavimas paprastųjų uosių lapų ekstraktuose, naudojant spektrofotometrinį metodą. Norint nustatyti laiką, kuomet yra didžiausias bendras hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis paprastojo uosio lapuose, tyrimas buvo atliekamas dvejus metus.

2015 metų paprastųjų uosių rinktų lapų ekstraktuose bendras hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis svyravo nuo 73,98 ± 1,41 mg/g iki 104,59 ± 0,84 mg/g. Tyrimo metu nustatyti du maksimumai, kurių metu bendras hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis paprastųjų uosių rinktų

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 5 15 30 45 60 B endra s hidroksicina mono r . da rinių kie kis mg /g laikas min. A B _B C D

lapų ekstraktuose buvo didžiausias per visą vegetacijos laikotarpį. Pirmasis maksimumas nustatytas gegužės 24 dieną, kuomet paprastojo uosio lapai yra neseniai išsiskleidę iš pumpurų. Bendras hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis tuo metu buvo didžiausias t. y. 104,59 ± 0,84 mg/g. Nuo birželio mėnesio bendras hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis pradėjo mažėti ir pasiekė 73,98 ± 1,4 mg/g koncentraciją. Antrasis maksimumas buvo nustatytas rugpjūčio 16 dieną, visiško sulapojimo metu bendras hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis paprastųjų uosių lapų ekstrakte siekė 82,06 ± 2,03 mg/g. (3 paveikslas)

3 pav. Paprastųjų uosių lapų ekstraktų bendro hidroksicinamono rūgšties darinių kiekio (CRE) kitimas vegetacijos laikotarpiu 2015 m. (n=3.). Skirtingos raidės rodo reikšmingus skirtumus

tarp ėminių

2016 metų paprastųjų uosių rinktų lapų ekstraktuose bendras hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis svyravo nuo 70,62 ± 2,43 mg/g iki 107,06 ± 0,53 mg/g. Tyrimo metu nustatyta du laikai, kurių metu bendras hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis paprastųjų uosių lapų ekstrakte buvo didžiausias. Pirmasis maksimumas nustatytas, kuomet lapai buvo neseniai išsiskleidę iš pumpurų t. y. gegužės 22 dieną (tuo metu bendra hidroksicinamono rūgšties darinių koncentracija buvo 107,06 ± 0,56 mg/g). Antrasis maksimumas yra nustatytas visiško sulapojimo metu t. y. rugpjūčio 14 dieną (bendra hidroksicinamono rūgšties darinių koncentracija – 89,21 ± 0,97 mg/g). (4 paveikslas)

0 20 40 60 80 100 120 B endra s hidroksicina mono rūg šti es da rinių ki ekis mg /g

Lapų rinkimo datos C

B

4 pav. Paprastųjų uosių lapų ekstraktų bendro hidroksicinamono rūgšties darinių kiekio (CRE) kitimas vegetacijos laikotarpiu 2016 m. (n=3). Skirtingos raidės rodo reikšmingus skirtumus

tarp ėminių

Palyginus dvejų metų tyrimo rezultatus, ryškių skirtumų tarp bendro hidroksicinamono rūgšties darinių kiekio įvairavimo nepastebima. Remiantis mokslininkų atliktais tyrimais, paprastųjų uosių masei daugiausiai įtakos turi dirvožemis [17]. Mokslininkų buvo nustatyta, kad paprastųjų uosių aukščiui turi įtakos didelis dirvožemio šarmingumas ir geras vandens aprūpinimas nusausintose vietose. Ištirta, kad paprastieji uosiai taip pat gerai auga rūgščiame dirvožemyje ir jų produktyvumas yra sumažėjęs augant sausoje dirvoje arba blogai nusausintose drėgnose vietose. Dėl papildomo medžio aukščio augimo atrodo, kad dirvožemio drėgmės lygis yra svarbesnis negu dirvos maistingųjų medžiagų kiekis [59]. Įvertinus tai, galima spėti, kad panašiam bendram hidroksicinamono rūgšties darinių kiekiui medžių lapuose gali turėti įtakos dirvožemis, kuriame jie auga. Mokslininkų tyrimuose apie aplinkos įtaką paprastųjų uosių augimui nustatyta, kad temperatūra mažai veikia paprastųjų uosių. augimą [18], galbūt todėl Lietuvos hidrometeorologijos tarnybos užfiksuotas stichinis meteorologinis reiškinys 2015 m. gegužės mėnesio pradžioje, kurio metu temperatūra nukrito žemiau nulio [60], neturėjo įtakos bendro hidroksicinamono rūgšties darinių kiekiui.

0 20 40 60 80 100 120 B endra s hidroksicina mono rūg šti es da rinių ki ekis m g/g

Lapų rinkimo datos D

B

A A A

3.2.2. Bendro flavonoidų kiekio įvairavimas paprastųjų uosių lapuose vegetacijos

laikotarpiu

Taikant UV spektrofotometrinį metodą buvo įvertintas bendras flavonoidų kiekis paprastųjų uosių lapuose augalo vegetacijos metu. Ištirta, kad paprastųjų uosių lapų ekstrakte flavonoidų kiekis svyruoja nuo 25,29 ± 0,34 mg/g iki 34,91 ± 0,43 mg/g. (5 paveikslas )

5 pav. Bendro flavonoidų kiekio kitimas paprastųjų uosių lapuose vegetacijos laikotarpiu 2016 m. (n=3). Skirtingos raidės rodo reikšmingus skirtumus tarp ėminių

Atlikus tyrimą nustatyta, kad suminis flavonoidų kiekis jaunuose, neseniai sprogusiuose iš pumpurų lapuose yra 25,29 ± 0,34 mg/g. Didėjant lapų masei ir pasirodžius pirmiesiems vaisiams, iki birželio 19 dienos flavonoidų kiekis mažėjo. Vėliau pradėjo didėti ir didžiausias flavonoidų kiekis buvo nustatytas masinio sulapojimo metu – rugpjūčio 14 dieną 34,91 ± 0,43 mg/g, tačiau statistiškai nesiskiria nuo rugpjūčio 28 dienos. Palyginus gautus rezultatus, nustatyta, kad flavonoidų kiekis paprastųjų uosių lapuose didžiausias yra tuo pačiu metu kaip ir bendro hidroksicinamono rūgšties darinių kiekio. Nustatytas panašus hidroksicinamono rūgšties ir flavonoidų kiekio dėsningumas Fraxinus excelsior L. lapuose, kuris, remiantis literatūra, gali priklausyti nuo tų pačių veiksnių, t. y. dirvožemio derlingumo, pH, kritulių kiekio bei augavietės apšvietimo [22,61].

0 5 10 15 20 25 30 35 40 B endra s fla vonoidų ki ekis m g/g Data B B A B C CD D _D

3.2.3. Hidroksicinamono rūgšties darinių ir flavonoidų kiekio įvairavimas

skirtingose augavietėse augančių paprastųjų uosių lapuose

Ištyrus bendrą hidroksicinamono rūgšties darinių kiekį paprastųjų uosių lapuose vegetacijos laiku, buvo nustatytas laikotarpis, kuriame Fraxinus excelsior L. lapuose buvo rasta didžiausia bendra hidroksicinamono rūgšties darinių koncentracija. Atsižvelgiant į gautus rezultatus buvo nuspręstą ištirti paprastųjų uosių lapuose esantį bendrą hidroksicinamono rūgšties darinių kiekį kituose Lietuvos regionuose, kartu įvertinant ir lapuose kaupiamą bendrą flavonoidų kiekį. Kadangi anksčiau tirtuose bandiniuose didžiausia bendras hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis lapuose buvo gegužės 24 dieną, buvo pasirinktas laiko intervalas, per kurį renkami paprastųjų uosių lapai. (6 paveikslas)

6 pav. Bendro hidroksicinamono rūgšties darinių (CRE) ir flavonoidų (RE) kiekio įvairavimas skirtinguose Lietuvos regionuose rinktuose paprastųjų uosių lapuose (n=3). Skirtingos

raidės rodo reikšmingus skirtumus tarp ėminių. 0 20 40 60 80 100 120 k on ce n tr ac ija m g/g Regionai

flavonoidai hidroksicinamono rūgšties dariniai A BC A C BC A B C F D I _I G E H J

Ištyrus įvairiuose Lietuvos regionuose surinktus paprastųjų uosių lapus, bendras hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis svyravo nuo 34,72 ± 0,56 mg/g iki 108,12 ± 0,56 mg/g. Didžiausias hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis nustatytas Marijampolės rajone, Dielinės kaimo miške augančio paprastojo uosio lapuose, 108,12 ± 0,56 mg/g. Panašūs rezultatai gauti ištyrus Birštono ir Panevėžio parkuose augusių paprastųjų uosių lapus, nors tarp jų statistiškai reikšmingo skirtumo nėra. Bendras hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis Fraxinus excelsior L. augusio Birštone - 96,78 ± 0,53 mg/g, Panevėžyje -95,18 ± 1,09 mg/g. Tuo pačiu metu rinktuose mėginiuose Kauno marių regioniniame parke ir Telšiuose esančioje sodyboje nustatytas mažiausias bendras hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis. Kaune nustatyta – 27,07 ± 0,36 mg/g, Telšiuose – 34,72 ± 0,56 mg/g.

Flavonoidų kiekis tirtuose paprastųjų uosių lapuose svyruoja nuo 18,50 ± 0,78 mg/g iki 45,48 ± 0,81 mg/g. Nustatytas statistiškai neturintis reikšmingų skirtumų flavonoidų kiekis: Birštono miesto centriniame parke 39,64 ± 0,45 mg/g, Panevėžio kultūros ir poilsio parke 43,59 ± 0,76 mg/g, Marijampolės raj. Dielinės kaimo miške 45,48 ± 0,81 mg/g, Pakruojo raj. Kuosiškio kaimo miške 42,29 ± 0,81 mg/g. Tuo tarpu nustatytas flavonoidų kiekio statistiškai reikšmingas skirtumas Telšių sodyboje augusio paprastojo uosio lapuose 18,5 ± 0,78 mg/g ir Kauno marių regioniniame parke augančio uosio lapuose 20,26 ± 0,29 mg/g.

Atlikus tyrimą ir nustačius bendrą hidroksicinamono rūgšties darinių ir flavonoidų kiekį Lietuvos regionuose augančių paprastųjų uosių lapuose galima pastebėti, kad regionuose, kuriuose buvo nustatytas didžiausias bendras hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis taip pat yra ir didžiausias flavonoidų kiekis. Vietovėse, kuriose buvo nustatytas mažiausias bendras hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis Fraxinus excelsior L. lapuose analogiškai nustatyta ir mažiausia flavonoidų koncentracija. Tačiau nei viename Lietuvos regione augusio paprastojo uosio lapuose nustatytas flavonoidų kiekis neviršijo tuose pačiuose medžio lapuose nustatyto bendro hidroksicinamono rūgšties darinių kiekio.

Remiantis mokslininkų tyrimais, dirvožemio bazės sodrumas (proc.), pH vertė, organinės anglies atsargos, bendras azoto kiekis ir Mg 2+ atsargos – svarbiausi veiksniai paprastųjų uosių augimui [62]. Pagal mokslininkų tyrimus Kaunas, priklauso Vidurio Lietuvos žemumai, kuriai būdingas menkas dirvožemio pH margumas, vyrauja priemolis, labai karbonatingos moreninės dirvodarinės uolienos – 20–23 proc. CaCO3. Marijampolės apskritis priklauso Sūduvos aukštumai, kurioje vyrauja priesmėlis ir priemolis, mažas karbonatingumas – 13–16 proc. CaCO3, menkas pH margumas [63]. Gali būti, kad lapuose esančiam bendram hidroksicinamono rūgšties darinių ir flavonoidų kiekiui įtakos turi dirvožemio pH, derlingumas, kuriame auga paprastieji uosiai.

3.2.4. Bendro hidroksicinamono rūgšties darinių ir flavonoidų kiekio įvairavimas

paprastųjų uosių vaisiuose

Taikant UV spektrofotometrinį metodą buvo įvertintas bendras hidroksicinamono rūgšties darinių ir flavonoidų kiekis paprastųjų uosių vaisiuose augalo vegetacijos metu. Ištirta, kad Fraxinus excelsior L. vaisių ekstrakte bendras hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis svyruoja nuo 3,15 ± 0,12 mg/g iki 8,3 ± 0,27 mg/g. Bendras hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis vaisiuose nuo birželio mėnesio mažėja iki liepos mėnesio. Nuo liepos mėnesio pradžios bendras hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis vaisiuose pradėjo didėti ir sėklų brendimo laikotarpiu (rugpjūčio 14 dieną) pasiekė maksimumą 8,30 ± 0,27 mg/g.

Atlikus tyrimus nustatyta, kad flavonoidų kiekis Fraxinus excelsior L. vaisiuose augalo vegetacijos metu svyruoja nuo 4,26 ± 0,07 mg//g iki 8,19 ± 0,09 mg/g. Didžiausias flavonoidų kiekis randamas tomis pačiomis dienomis, kuomet yra didžiausias bendras hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis, t. y. birželio 5 dieną ir rugpjūčio 14 dieną. Tuo metu paprastųjų uosių vaisiuose nustatytas flavonoidų kiekis yra 6,51 ± 0,02 mg/g – vaisių formavimosi metu ir 8,15 ± 0,09 mg/g – masinio lapojimo metu. Vasaros pradžioje flavonoidų kiekis Fraxinus excelsior L. vaisiuose siekė maksimumą, tačiau tiriant vegetacijos laikotarpiu jis beveik sumažėjo 3 mg/g. Vėliau po truputį flavonoidų kiekis didėjo ir rugpjūčio mėnesį pasiekė antrą maksimumą, kurio metu flavonoidų kiekis paprastųjų uosių vaisiuose buvo didžiausias per visą augalo vegetacijos laikotarpį. (7 paveikslas)

7 pav. Bendro hidroksicinamono rūgšties darinių (CRE) ir flavonoidų (RE) kiekio kitimas paprastųjų uosių vaisiuose vegetacijos laikotarpiu (n=3). Skirtingos raidės rodo reikšmingus

skirtumus tarp ėminių

Ištyrus paprastųjų uosių lapus ir vaisius, nustatytas bendras hidroksicinamono rūgšties darinių kiekio ir flavonoidų kiekio dinaminis kitimas vegetacijos laikotarpiu. Tuo pačiu metu rinktuose mėginiuose bendras hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis lapuose buvo beveik 20 kartų didesnis negu vaisiuose. Liepos 3 dieną lapuose nustatyta 71,37 ± 0,66 mg/g, tuo pačiu metu vaisiuose – 3,15 ± 0,12 mg/g .Kadangi lapų ir vaisių ekstraktai buvo ruošiami tokiomis pačiomis sąlygomis, tai parodo, kad Fraxinus excelsior L. lapų ir vaisių fenolinių junginių kiekis skiriasi . Atlikus statistinę analizę, nustatytas stiprus koreliacinis ryšys tarp bendro hidroksicinamono rūgšties darinių kiekio lapuose su bendru hidroksicinamono rūgšties darinių kiekiu vaisiuose (Rs=0,75 p <0,05).

Nustačius bendrą hidroksicinamono rūgšties darinių kiekį lapuose ir vaisiuose pastebimas proporcingas bendro hidroksicinamono rūgšties darinių kiekio kitimas vegetacijos laikotarpiu. Tuo pačiu laikotarpiu flavonoidų kiekio įvairavimas yra panašus hidroksicinamono rūgšties darinių kiekiui. Kuomet didėja bendras hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis, tuo pačiu metu didėja ir flavonoidų kiekis bei analogiškas kiekių pokytis vyksta mažėjant. Įvertinus gautus rezultatus, bendras hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis Fraxinus excelsior L. vaisiuose nėra visą laika didesnis už flavonoidų kiekį, skirtingomis datomis keičiasi vaisiuose vyraujantys junginiai. Pavyzdžiui, birželio 5 dieną didesnis kiekis buvo flavonoidų 5,51 ± 0,02 mg/g (tuo pačiu metu hidroksicinamono rūgšties

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Kie kis m g /g Data

hidroksicinamono rūgšties dariniai flavonoidai

AB A C D E C BC GH F F F G I H H C C