PAPRASTŲJŲ ĄŽUOLŲ (QUERCUS ROBUR L.) ŽIEVĖS IR LAPŲ FITOCHEMINIS TYRIMAS

MEDICINOS AKADEMIJA FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

AGNĖ JABLONSKYTĖ

PAPRASTŲJŲ ĄŽUOLŲ (QUERCUS ROBUR L.) ŽIEVĖS IR LAPŲ

FITOCHEMINIS TYRIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas Dr. Deividas Burdulis

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanas prof. dr. Vitalis Briedis ____________________________

(parašas, data)

PAPRASTŲJŲ ĄŽUOLŲ (QUERCUS ROBUR L.) ŽIEVĖS IR LAPŲ

FITOCHEMINIS TYRIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas Dr. Deividas Burdulis _______________ (parašas, data) Darbą atliko Recenzentas Magistrantė ________________ Agnė Jablonskytė (vardas, pavardė, parašas) _______________ ________________ (parašas, data) (data)

Turinys

2.1. Paprastųjų ąžuolų (Quercus robur L.) aprašymas ir cheminė sudėtis ... 10

2.1.1. Augalo morfologiniai požymiai ir paplitimas ... 10

2.1.2 Paprastojo ąžuolo (Quercus robur L.) žievės ir lapų cheminė sudėtis ... 11

2.2 Paprastųjų ąžuolų (Quercus robur L.) augalinės žaliavos ir jų ruošimas ... 12

2.3 Paprastojo ąžuolo (Quercus robur L.) žievės ir lapų vartojimas medicinoje ... 13

2.3.1 Paprastojo ąžuolo (Quercus robur L.) vaisto formos, dozavimas, nepageidaujamos reakcijos, toksiškumas ir sąveika su vaistais. ... 16

2.5 Svarbiausių paprastojo ąžuolo žaliavose, esančių biologiškai aktyvių junginių, apžvalga ... 17

2.5.1 Taninai (raugai) ir jų klasifikacija ... 17

2.5.1.1 Taninų (raugų) poveikis ... 19

2.5.2 Fenoliniai junginiai, jų klasifikacija ir medicininė reikšmė ... 19

2.5.3 Flavonoidai, jų klasifikacija ir medicininė reikšmė... 20

3. TYRIMO OBJEKTAI IR METODAI ... 23

3.1 Tyrimo objektas ... 23

3.2 Naudotos medžiagos ir reagentai ... 23

3.3 Naudota aparatūra ir priemonės ... 23

3.3 Tyrimo metodai ... 24

3.3.1 Nuodžiuvio nustatymas vaistinėje augalinėje žaliavoje ... 24

3.3.2 Paprastojo ąžuolo žievės ir lapų ėminių ekstraktų paruošimo metodika ... 25

3.3.3 Bendrojo raugų kiekio nustatymo metodika ... 26

3.3.4 Suminio flavonoidų kiekio, išreikšto kvercetino ekvivalentu, nustatymo metodika ... 27

3.3.5 Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymo metodika ... 28

3.4 Statistinis duomenų įvertinimas... 29

4. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 31

4.1 Nuodžiuvio nustatymas paprastojo ąžuolo žievės ir lapų ėminiuose ... 31

4.3 Bendrojo raugų (taninų) kiekio įvairavimas paprastojo ąžuolo žievės ir lapų ėminiuose ... 34

4.4 Suminio flavonoidų kiekio nustatymas paprastojo ąžuolo žievės ir lapų ėminių ekstraktuose spektrofotometriniu metodu ... 38

4.5 Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas paprastojo ąžuolo žievės bei lapų ėminių ekstraktuose spektrofotometriniu metodu. ... 41

5. IŠVADOS ... 46

6. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 48

SANTRAUKA

A. Jablonskytės magistro baigiamasis darbas „Paprastųjų ąžuolų (Quercus robur L.) žievės ir lapų fitocheminis tyrimas“/ mokslinis vadovas dr. D. Burdulis; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Farmakognozijos katedra. – Kaunas. Tyrimo tikslas - ištirti Lietuvoje natūraliai augančių paprastųjų ąžuolų (Quercus robur L.) žievės ir lapų ėminių raugų, suminį flavonoidų ir bendrą fenolinių junginių kiekybinę sudėtį. Tyrimo uždaviniai: Nustatyti tinkamiausią ąžuolų žievės ir lapų mėginių ekstrakcijos metodą ir optimaliausias ekstrakcijos sąlygas.Ištirti bendrą raugų kiekį Lietuvoje natūraliose augimvietėse rinktų paprastųjų ąžuolų (Quercus robur L.) žievės ir lapų ėminiuose. Nustatyti suminį flavonoidų kiekį paprastųjų ąžuolų žievės ir lapų mėginiuose rinktuose natūraliose Lietuvos Respublikos augimvietėse.Ištirti bendrą fenolinių junginių kiekį Lietuvoje natūraliose augimvietėse rinktuose paprastųjų ąžuolų žievės ir lapų pavyzdžiuose.Įvertinti rauginių medžiagų, flavonoidų, bendrą fenolinių junginių kiekinių rodiklių įvairavimą paprastojo ąžuolo (Quercus robur L.) žievės ir lapų ėminiuose rinktuose skirtingose Lietuvos augimvietėse. Įvertinti rauginių medžiagų, flavonoidų, bendro fenolinių junginių kiekinių rodiklių dinamiką paprastojo ąžuolo vegetacijos metu.Tyrimo objektas ir metodai: Ekstrakcijai buvo pasirinkta maceracija ultragarso vonelėje ir ekstrahentas buvo naudotas 80 proc. V/V etanolis žievės ir 70 proc. V/V etanolis lapų ėminiams. Bendras fenolinių junginių kiekis įvertintas, naudojant Folin – Ciocalteu reagentą, o suminis flavonoidų kiekis aptiktas spektrofotometriškai. Bendrasis raugų kiekis paprastojo ąžuolo žievės ir lapų mėginiuose buvo nustatytas titruojant šviežiai laboratorijoje pasigamintu 0,02 M kalio permanganato tirpalu. Rezultatai: Bendrasis raugų kiekis skirtingose Lietuvos Respublikos augimvietėse Q. robur L. žievės mėginiuose svyravo nuo 5,16 (±1,23) proc. iki 9,07 (±0,87) proc., o lapų ėminiuose šis rodiklis įvairavo 9,11 (±0,89) – 14,38 (±1,38) proc. ribose. Suminis flavonoidų kiekis paprastojo ąžuolo žievės ėminių ekstraktuose varijavo nuo 0,0030 (±0,0007) mg/g iki 0,0061 (±0,0011) mg/g, o lapų ėminių ekstraktuose šis kiekis svyruoja nuo 0,0242 (±0,0025) mg/g iki 0,0385 (±0,0007) mg /g. Bendrasis fenolinių junginių kiekis paprastojo ąžuolo žievės ėminių ekstraktuose įvairavo nuo 5,90 (±0,56) proc. iki 11,77 (±0,43) proc., o lapų ėminių ekstraktuose – nuo 5,95 (±0,76) proc. iki 18,82 (±2,51) proc.

SUMMARY

Jablonskytė master’s thesis. Phytochemical research of English Oaks’ (Quercus robur L.) bark and leaves materials/ supervised by Dr. D. Burdulis; Lithuanian University of Heath Sciences, Faculty of Pharmacy, Department of Pharmacognosy. – Kaunas. Objective: to explore medicinal herbal raw materials of the English Oak (Quercus robur L.) by assessing this plant tannins, total flavonoids amount and total phenolic compounds quantitative composition. Objectives: to determite the most suitable extraction method of Oak bark and leaves and the optimal extraction condition; to determine total tannins quantitative composition of the English Oak (Quercus robur L.) extracts’; to determine total flavonoids’ amount in English Oak

(Quercus robur L.) extracts’ ; to determine total phenolic compounds quantative composition; to evaluate

total tannins, total flavonoids amount in English Oak (Quercus robur L.) extracts’ and total phenolic compounds quantative composition in differents habitats Lithuania collected samples. Materials and methods: The maceration by ultrasonic bath using 80 proc. V/V etanolum in bark samples, and 70 proc. V/V etanolum in leaves samples was selected for extraction.It was carried out naturally growing common oak bark and leaves samples, collected in 2016 from May. 22. until October. 30 d., using spectrophotometric analysis , where were evaluated the total phenolic compounds using the Folin - Ciocalteu reagent, and total flavonoid content. General tannins content was determined by titration with a freshly constructed in the laboratory of 0.02 M potassium permanganate solution. Results: Total tannins amount of different production areas of the Republic of Lithuania Q. robur L. bark was detected from 5.16 (±1,23) proc.. to 9.07 (±0,87) proc., and in leaf was detected from 9,11 (±0,89) to 14,38 (±1,38) proc. Total flavonoid content, expressed in quercetin equivalent, in bark ranged from 0.0030 (±0,0007) mg/g to 0.0061 (±0,0011) mg /g and in leaf from 0,0242 (±0,0025) mg/g to 0,0385 (±0,0007) mg /g. General phenolic compounds common oak bark ranged from 5.90 (±0,56) percent. up to 11.77 (±0,43) per cent., and the leaves - from 5.95 (±0,76) percent. up to 18,82 (±2,51) percent.

SANTRUMPOS

LC-ESI-MS – skysčiu chromatografija integruota su jonizuotu elektropurškimu bei masių spektrofotometrija

DPPH – 1,1 – difenil – 2 -pirilhidrazilas MS – masių spektrofotometrija

TNF – auglio nekrozinis faktorius UV – ultravioletiniai spinduliai

1. ĮVADAS

Nuo senovės laikų yra vartojami vaistiniai augalai ir jų preparatai ir iki šių dienų išlieka populiarūs. Pasaulinės sveikatos organizacijos duomenimis, fitopreparatų rinka sudaro apie 62 milijonus dolerių ir yra prognozuojama, kad iki 2050 m. gali pasiekti penkis trilijonus dolerių. [1] Didėjantis susidomėjimas vaistiniais augaliniais preparatais yra susijęs su ilgamete jų vartojimo patirtimi, nusistovėjusiomis indikacijomis. Iki dabar yra domimasi apie vaistiniuose augaluose esančias biologiškai aktyvias medžiagas, jų poveikį organizmui.

Raugai (taninai) – sudėtingos, biologiškai aktyvios medžiagos, randamos augalų žievėje, medienoje, vaisiuose, lapuose, šaknyse, gumbuose. Šių junginių skonis yra stipriai sutraukiantis, kuris asocijuojasi su raudonu vynu, arbatomis ir neprinokusiais vaisiais. Maistas, gausus rauginėmis medžiagomis, yra mažos maistinės vertės, nes atlikus eksperimentą su gyvūnais, paaiškėjo, kad šie junginiai sumažina gyvūnų vystymosi greitį ir slopina virškinimo procesus. Nors buvo siejama, kad maistas, gausus raugais, gali sukelti stemplės vėžį, tačiau ši prielaida buvo atmesta, kadangi raugai pasižymi antikancerogeniniu ir antimutageniniu potencialu, apsaugodami ląstelės nuo oksidacinio streso, įskaitant lipidų peroksidaciją. [2] Paprastasis ąžuolas (Quercus robur L.) taip pat yra natūralus raugų šaltinis. Tai daugiametis augalas, priklausantis bukinių šeimai (lot.Fagaceae) [6;7]. Nuo senų laikų žinomos ir gaminamos farmacinės formos: užpilai ir nuovirai yra naudojami kaip priemonės prakaitavimui mažinti, pasižymi sutraukiančiu poveikiu, todėl tinka gydyti viduriavimą ir gastritą. [21] Vėliau buvo nustatyta, jog šio medžio žievėje gausu taninų, kurie ir sukelia minimą efektą. [2]

Paprastojo ąžuolo (Quercus robur L.) žievė ir lapai yra praturtinti fenoliniais junginiais , kurie suteikia augalui spalvą ar apsaugo nuo ultravioletinių spindulių. [4; 5] Pastarosios medžiagos yra naudingos žmogaus sveikatai, kadangi pasižymi uždegimą mažinančiu, antioksidantiniu ir priešvėžiniu efektu [4]

Paprastojo ąžuolo (Quercus robur L.) žievėje ir lapuose yra gausu raugų, flavonoidų, fenolinių junginių, todėl buvo aktualu išanalizuoti ir palyginti Lietuvoje augančių ąžuolų žievę ir lapus bei nustatyti biologiškai aktyvių medžiagų sudėties dinamiką augalo vegetacijos metu ir šių rodiklių įvairavimą skirtinguose regionuose.

Darbo tikslas: ištirti bendrą raugų, suminį flavonoidų ir bendrą fenolinių junginių kiekybinę sudėtį natūraliuose augimvietėse surinktų paprastųjų ąžuolų (Quercus robur L.) žievės ir lapų ėminiuose.

TIKSLAS

Ištirti Lietuvoje natūraliai augančių paprastųjų ąžuolų (Quercus robur L.) žievės ir lapų ėminių raugų, suminį flavonoidų ir bendrą fenolinių junginių kiekybinę sudėtį.

UŽDAVINIAI

1. Nustatyti tinkamiausią ąžuolų žievės ir lapų mėginių ekstrakcijos metodą ir optimaliausias ekstrakcijos sąlygas.

2. Ištirti bendrą raugų kiekį Lietuvoje natūraliose augimvietėse rinktų paprastųjų ąžuolų (Quercus

robur L.) žievės ir lapų ėminiuose.

3. Nustatyti suminį flavonoidų kiekį paprastųjų ąžuolų žievės ir lapų mėginiuose rinktuose natūraliose Lietuvos Respublikos augimvietėse.

4. Ištirti bendrą fenolinių junginių kiekį Lietuvoje natūraliose augimvietėse rinktuose paprastųjų ąžuolų žievės ir lapų pavyzdžiuose.

5. Įvertinti rauginių medžiagų, flavonoidų, bendrą fenolinių junginių kiekinių rodiklių įvairavimą paprastojo ąžuolo (Quercus robur L.) žievės ir lapų ėminiuose rinktuose skirtingose Lietuvos augimvietėse.

6. Įvertinti rauginių medžiagų, flavonoidų, bendro fenolinių junginių kiekinių rodiklių dinamiką paprastojo ąžuolo vegetacijos metu.

2. LITERATŪROS APŽVALGA

2.1. Paprastųjų ąžuolų (Quercus robur L.) aprašymas ir cheminė sudėtis

2.1.1. Augalo morfologiniai požymiai ir paplitimas

Pavadinimas – paprastasis ąžuolas (Quercus robur L.), šeima - Fagaceae – bukiniai. [5;6] Lotyniškai: robur – jėga. [7] Ąžuolai yra daugiamečiai augalai, augantys, kaip medžiai, dažniausiai užauga 20-35m aukščio. [8] Medžio stiebas yra gana trumpas, šakotas. Jaunų ąžuolų žievė yra lygi, blizganti, o subrendusių medžių – juosvai pilka, suaižėjusi, giliais vertikaliais skiautais. Paprastojo ąžuolo lapas yra 7-12 cm ilgio, jų viršus - ryškiai žalias, kartais šiek tiek žvilgantis, atvirkščiai kiaušiniškos formos, bukai skiautėtas, odiškas. Lapkotis trumpas, plikas, o jo pamatas dažniausiai širdiškas, su auselėmis. Rudenį lapai pagelsta arba paruduoja, nuo kai kurių ąžuolų lapai nenukrenta, išsilaiko iki pavasario. [9] Paprastasis ąžuolas yra vienanamis augalas, kurio moteriški ir vyriški žiedai yra sukrauti ant to pačio medžio. Žydi gegužės mėn. lapams skleidžiantis. Žiedai neryškūs, smulkoki, nusvirę, kuokeliniai žirginiuose, piesteliniai žiedai auga paskirai po 1 ar keletą ant 6-8 ar 15 cm ilgio žiedkočių ir primena pumpurus, jų apyžiedis rausvas ir iš piestelinių žiedų susidaro gilės. Vaisiai – buko kiaušinio formos, vienasėklės gilės, kurių pamatus gaubia goželė. Goželė yra gelsvai žalia, žvynuota, dengia maždaug trečdalį gilės. Gilės yra 1,5-3,5 cm ilgio, 1-2 cm skersmens, išauga po 1-4, rečiau 5-6 ant 1,5-4 cm ilgio kotelio, vaisiaus viršuje yra labai trumpas dygliukas. Prinoksta ir krinta rugsėjo-spalio mėn. Nesubrendusios gilės, jos yra šviesiai žalios spalvos, vėliau bręsdamos tamsėja ir tampa šviesoko ar tamsiai rudoko, su kiek gelsvu ar žalsvu atspalviu, su išilginėmis tamsiomis juostelėmis. [8]

Paprastasis ąžuolas (Quercus robur L.) paplitęs Šiaurės Afrikoje, vakarų Azijoje, Kaukaze bei Europoje. Jis buvo pagrindine Anglijos miškų dalimi. XVII amžiuje įvežtas į Amerikos kolonijas iš Anglijos. Ten jis plačiai paplitęs Kanadoje ir šiaurinėje JAV dalyje. [6] Europos miškuose yra paplitęs lygumose ir drėgnose žemumose, žemose kalvose iki 350-400 m virš jūros lygio. Vis dėlto, pasitaiko atvejų, kuomet ąžuolą galima aptikti augant 700 m virš jūros lygio (Ukraina). [9] Lietuvoje natūraliose Quercus genties augimvietėse auga 2 rūšių augalai: raudonasis (Quercus rubra L.) ir paprastasis (Quercus robur L) ąžuolai. [12] Bet pasaulyje aptinkama virš 450 rūšių ąžuolų. [11]

Lietuvoje ąžuolynų plotai vis auga. 2003 – 2014 metų laikotarpiu ąžuolyno plotas išaugo nuo 35,7 tūkst. ha iki 42,5 tūkst. ha ir tai sudaro apie 2 proc. visų medynų plotų Lietuvoje. [14] Lietuvos miškų institutas pateikė duomenis apie paprastųjų ąžuolų paplitimą Lietuvoje 2015 metais, pastebima, kad Žematijos nacionaliniame parke, Šilutės Kretingos, Rietavo bei vidurio Lietuvoje t.y. Kėdainių, Kauno,

Jonavos, Ukmergės, Kaišiadorių miškų urėdijose šių daugiamečių medžių procentinė dalis yra didžiausia, jų kiekis svyruoja nuo 5,1 iki 20,1 %, mažiausiai paprastųjų ąžuolų aptinkama Šalčininkų, Varėnos, Švenčionėlių, Rokiškio, Šiaulių, Kuršėnų miškų urėdijose, jų paplitimas šiuose Lietuvos miškų urėdijose yra iki 5,1 %. [13] Paprastasis ąžuolas mėgsta nerūgščius ir neužmirkusius vidutinio derlingumo bei derlingus gilius priemolius ir priesmėlius, turtingus kalcio, azoto, magnio bei kalio, kadangi turi plačią ir gilią šaknų sistemą, medžiai nesunkiai ištveria užsitęsusias sausras. [14] Vis gi, paprastasis ąžuolas yra jautrus paviršinio vandens pertekliui, vidutiniškai reiklus atmosferos oro drėgmei, šalčiui beveik atsparus, bet esant šaltai žiemai, gali įplyšti kamieno žievė, apšalti pumpurai ir ūgliai. [9]

Ąžuolai dauginasi sėklomis – gilėmis. [15; 16] Paprastasis ąžuolas derlingas sėklas pradeda vesti, kai sulaukia 40-50 metų amžiaus. Kas tris – penkis metus, augalas subrandina didesnį gilių skaičių. Vaisiai nukrenta anksčiau nei lapai ir nukritusi lapų paklodė apsaugo giles nuo šalčio, suteikia reikiamą drėgmę, paslepia nuo gyvūnų, kurie galėtų suėsti sėklas [17]. Visgi, dauginimasis gilėmis nėra labai sėkmingas komerciniu mastu, kadangi giles sunku išlaikyti parduotuvėje tinkamomis sąlygomis, kad vėliau pirkėjas galėtų užauginti norimą derlių, todėl pastaraisiais dešimtmečiais buvo ieškoma kitų dauginimosi variantų, vienas iš jų vegetatyvinis būdas - tuo tikslu yra naudojamos jauno ąžuolo (Quercus robur L.) šaknys, tuomet yra užauginami augalai, kurie yra identiški motininiam augalui – klonai. Dar yra atliktų mokslinių tyrimų, kuomet yra bandoma išauginti paprastąjį ąžuolą iš kamieninių ląstelių in vitro, taikant somatinės embriogenezės metodus, šis būdas leidžia masiškai klonuoti augalus bei turėti paprastąjį ąžuolą su norimu genų fondu. [18]

2.1.2 Paprastojo ąžuolo (Quercus robur L.) žievės ir lapų cheminė sudėtis

Išanalizavus įvairius mokslinius tyrimus, paprastojo ąžuolo žievėje ir lapuose yra nustatyta įvairi biologiškai aktyvių medžiagų sudėtis. Paprastasis ąžuolas yra augalinis taninių šaltinis – aptinkama 10-20 proc. elagotaninų bei kondensuotų taninų. [26] Yra žinoma, kad ąžuolų (Quercus robur L.) žievėje yra gausu hidrolizuotų ir kondensuotų taninų 15- 20 %, senų medžių žievėje gali būti aptinkama 5-10 proc. [30; 31], polifenolinių junginių, flavanolių, oligomerinių proantocianidinų. Mokslinio tyrimo metu, ekstrahuoti taninai iš ąžuolų žievės ėminių buvo analizuojami skysčių chromatografijos – elektronų jonizacijos – masių spektrofotometrijos būdu. Sudėtyje esančios medžiagų struktūros buvo dalinai identifikuotos, aptikti galo ir elago rūgščių esteriai, roburinas E, mono – ir digalilgliukozės, elago rūgšties ramnozidai, kvercetinas ir galo

bei elago rūgštys. [31] Be taninų, mokslinio tyrimo metu, paprastojo ąžuolo žievės vandeniniame ekstrakte buvo aptikta flavonoidų, fitocianidinų, flabofenų ir floroglucino cheminių junginių, kurie pasižymėjo antibakteriniu poveikiu prieš K. pneumoniae bakterijų rūšį. [30]

Polifenolinius junginius augalai gamina, tam, kad apsisaugotų nuo ultravioletinės radiacijos bei patogenų, vis gi šie junginiai naudingi ir žmogui: apsaugo nuo vėžinių ląstelių vystymosi, kardiovaskulinių ligų, diabeto, osteoporozės ir neurodegeneracinių ligų. [11] Paprastojo ąžuolo medienoje, žievėje ir lapuose taip pat yra kaupiama didelis kiekis polifenolinių junginių, kurių daugiausiai yra elagotaninai ir proantocianidinai – kondensuoti raugai, o pastarosios medžiagos suteikia augalo medienai ilgaamžiškumą. Augalo lapuose aptinkamų biologiškai aktyvių medžiagų esteriuose identifikuotos jų sudedamosios dalys: pedunkulaginas (angl. pedunculagin), kastalaginas (angl. castalagin), veskalaginas (angl. vescalagin), kasuariktinas (angl. casuarictin), proantocianidinai ir flavanolių glikozidai. [82] Paprastojo ąžuolo lapuose taninų yra aptinkama daugiau, tačiau atliktų tyrimų metu, paaiškėjo, kad dėl didelio kiekio raugų, galima neigiama įtaka skrandžio fermentų sekrecijai. [28] 2004 metais buvo atliktas tyrimas, kurio tikslas - išsiaiškinti fenolinių junginių kiekį paprastųjų ąžuolų lapuose esant sezoniniams svyravimams. Jų augimo laikotarpiu buvo stebimi septyni skirtingi ąžuolo medžiai. Įdomu, kad pirmą kartą paprastojo ąžuolo lapuose buvo aptiktas retas dimerinis elagotaninas, pavadintas kociferinu D2 (angl. Cocciferin D2) bei dominavo hidrolizuoti taninai lapuose, stebint šią vaistinę augalinę žaliavą visą tyrimo laikotarpį. Jaunų ąžuolų lapuose buvo aptikta žymiai daugiau hidrolizuotų taninų ir flavonoidinių glikozidų negu senų medžių lapuose, bet proantocianidinų buvo daugiau nustatyta senų ąžuolų lapuose. [31]

2013 metuose publikuotame moksliniame straipsnyje minima, kad buvo atliktas tyrimas Serbijoje, kurio tikslas buvo ištirti paprastojo ąžuolo šakeles, lapus ir giles bei nustatyti tam tikras biologiškai aktyvias medžiagas. Bendras fenolių, taninų, flavanoidų, proantocianidinų, chlorofilų bei karotinoidų kiekis buvo didžiausias lapuose; šakelėse šių minėtų junginių buvo mažiausiai, išskyrus chlorofilo ir karotinoidų, buvo minimaliai aptikta paprastojo ąžuolo vaisiuose – gilėse. [11]

2.2 Paprastųjų ąžuolų (Quercus robur L.) augalinės žaliavos ir jų ruošimas

Paprastųjų ąžuolų vaistinė augalinė žaliava – jaunų medelių žievė (Querci roburi cortex), kurioje gausu 10-20 proc. taninų. [19; 20] Europos farmakopėjoje paprastojo ąžuolo vaistinė augalinė žaliava yra apibūdinama kaip sausa, susmulkinta ir atskirta nuo jaunų medelių šakų. Minimalus taninų kiekis yra 3,0 proc., tačiau šis kiekis yra nustatomas, identifikuojant piragalolį. [21]

Ąžuolo žievė būna susmulkinta į gabalėlius ir turi būti ne didesnio kaip 3 mm storio. Išorinis paprastojo ąžuolo žievės paviršius yra šviesiai pilkos ar žalsvai pilkas su lenticelėmis – poromis; vidinis žievės paviršius yra gelsvai rudos ar raudonai rudos spalvos su išilginiais 0,5 – 1 mm dryžiais. [21] Per lūžį išorinė – paviršinė – žievė grūdėta, lygi, o vidinė – labai plaušėta. Sausa žievė bekvapė, tačiau išmirkyta vandenyje įgauna savitą kvapą, skonis yra stipriai sutraukiantis. [22]

Paprastųjų ąžuolų žievė yra lupama nuo plonų kamienų ir šaknų anksti pavasarį prieš lapų skleidimąsi, darant kas 25-30 cm žiedinius pjūvius ir 1 ar 2 išilginius. Džiovinama nuo saulės apsaugotoje, gerai vėdinamoje patalpoje ar džiovykloje esant 70 o_{C temperatūroje. Išdžiūvusi žievė turi būti lygiu}

blizgančiu ar kiek raukšlėtų paviršiumi, pilkai ruda. Paprastųjų ąžuolų vaistinė augalinė žaliava yra laikoma medinėse dėžėse ar maišuose. Gerai paruošta ši žaliava yra tinkama vartoti 4 -5 metus. [23]

Paprastųjų ąžuolų lapai gali būti naudojami kaip fitocheminio tyrimo objektas. Lapas yra 7-12 cm ilgio, gali būti trumpesnis, forma yra pailga, plunksniška, turi nuo 3 iki 7 skilčių, kurių galai yra suapvalinti. Lapai auga kekėmis ir turi trumpą stiebą. Lapų spalva yra žalia, tačiau artėjant rudeniuo sezonui, lapų spalva tamsėja. [24] Lapai džiovinami nuo saulės apsaugotoje vietoje ir gerai vėdinamoje patalpoje. Poto šias žaliavas galima laikyti kambario temperatūroje. Išdžiūvę lapai šiek tiek susiraukšlėja, jei nėra supresuojami. Prieš tiriant pasirinktą vaistinę augalinę žaliavą, patartina nuplauti distiliuotu vandeniu, kad būtų pašalintos priemaišos, gautos iš aplinkos. [25]

2.3 Paprastojo ąžuolo (Quercus robur L.) žievės ir lapų vartojimas medicinoje

Keltų dvasininkai – dar kitaip vadinami druidais - ąžuolą, kaip ir pelkinę vingiorykštę ar amalą, dėl jiems jau žinomų gydomųjų savybių laikė šventu augalu. [33] Ąžuolų žievės pagaminta farmacinė forma: užpilas ir nuoviras, nuo viduramžių buvo naudojama kaip sutraukiamoji priemonė, kuri buvo taikoma lokaliai nudegimams ir žaizdoms gydyti bei buvo skalaujamos suprakaitavusios pėdos. Taip pat vartojant per os, buvo gydomas gastritas ir/ar viduriavimas. [20]

Bukinių šeimos atstovas – paprastasis ąžuolas (Quercus robur L.) žievėje yra sukaupęs didelę elagotaninų koncentraciją, kur vaistinė augalinė žaliava plačiai naudojama tradicinėje medicinoje kaip efektyvus būdas mažinti uždegimą. Dažnai liaudies medicinoje yra rekomenduojama gydyti su uždegimunu susijusias vidaus ligas, vartojant elagotaninais turtingas augalines žaliavas. 2011 metais publikuotame straipsnyje, rašoma, kad paprastojo ąžuolo (Quercus robur L.) žievės farmacinės formos vartojamos į vidų, yra veiksmingos gydomosios priemonės sergant anemija, nemiga, padidėjusiu nervingumu, esant padidėjusiai kraujo cirkuliacijai, plaučių, skrandžio ir žarnyno kraujavimams, skaudant nugarą ar jaučiant spazmus. Taip pat veiksminga priemonė valyti kraują, ar gydyti kepenų negalavimus. 2009 metais paprastojo ąžuolo apvirinta žievė buvo naudojama gydyti diabetą. [34] Europos vaistų agentūra (EMA) nurodo, kad paprastojo ąžuolo žievės paruošta arbata arba nuoviras gali būti naudojamas per os gydyti burnos gleivinės ar odos susirgimus. Taipogi, išskiriamos trys tradicinės indikacijos, kuomet galima nuodoti paprastojo ąžuolo žievės preparatus:

1. Simptominiam gydymui, esant viduriavimui - lengva forma;

2. Simptominiam gydymui, sergant burnos gleivinės ar odos lengvu uždegimu;

3. Simptominiam gydymui, sergant hemarojumi, kad palengvintų niežėjimo ir deginimo pojūčius. [20] Paprastojo ąžuolo žievės ir lapų ekstraktai pasižymi antioksidaciniu aktyvumu. 2004 metais publikuotame straipsnyje buvo norima išsiaiškinti, ar paprastojo ąžuolo žievės 80 proc. V/V metanolinis ekstraktas pasižymi antioksidaciniu veikimu. Mokslininkai žaliavą įsigijo iš Farmacijos Universiteto, Suomijoje ir paruošė jos ekstraktus. Antioksidacinis aktyvumas buvo nustatytas ant lėkštutės, kur buvo atlikta plonasluoksnė chromatografija su ąžuolo žievės ekstraktais. Apipurškus DPPH reagentą ant sausos lėkštutės su mėginiais, buvo identifikuotos antioksidacinio aktyvumo zonos. [77] Kito mokslinio tyrimo metu, buvo norima įvertinti, ar Serbijoje surinkti paprastojo ąžuolo lapai ir pagamintos jų vandeninės ištraukos, pasižymi antioksidaciniu poveikiu. Paaiškėjo, jog ištirti lapų ekstraktai, kurių sudėtyje gausu taninų, flavonoidų, proantocianidinų, fenolinių junginių, pasižymėjo dideliu antioksidantiniu potencialu. gauti labai aukšti antiradikalinio aktyvumo parametrai. [11] In vitro tyrimo metu mokslininkai išnagrinėjo antioksidancinį poveikį, naudojant paprastojo ąžuolo lapų ekstraktą. Šis lapų ekstraktas pasižymėjo didele potencija kovojant su reaktyviomis deguonies rūšimis. Be to, pastarasis ekstraktas pasižymėjo stipriu apsauginiu poveikiu ląstelei, kai ši buvo paveikta aktyviomis deguonies formomis. [35]

Paprastojo ąžuolo žievė pasižymi antimikrobiniu veikimu. Taninai yra tirpūs vandenyje ir sudaro koloidinius tirpalus. Šie biologiškai aktyvūs junginiai yra atsakingi už antimikrobinį poveikį. Citotoksinis poveikis pastebėtas in vivo tyrimuose prieš tam tikrą lervų rūšį (lot. Artemia salina), naudojant paprastųjų ąžuolų žievės vandeninį ekstraktą. Tame pačiame tyrime, buvo naudotas tas pats ekstraktas kovojant su

Klebsiella pneumoniae bakterijomis remiantis disko difuzijos metodu. Maksimalus slopinamasis efektas

buvo nuo 0,03-30 mg/diske, kai koncentracija buvo 30 mg diske. Mokslininkai aptiko, kad paprastųjų ąžuolų žievėje yra daugiakomponenčių medžiagų, kurios veikia į bakterijas bei jų ląstelėse esančias bendravimo sistemų mechanizmus. [37;77] Apibendrinant, teigiama, kad ąžuolo (Quercus robur L.) žievė yra daug žadanti vaistinė augalinė žaliava, kadangi sąlyginai nedaug mokslinių tyrimų yra atlikta apie žaliavos antioksidacinį ir antimikrobinį veikimus. Istorijoje kalbant apie vynų gamybą, produkto laikymui buvo naudojamos statinės pagamintos iš ąžuolo, kad pagamintame vyne būtų galima kontroliuoti oksidacinius procesus ir jis būtų apsaugotas nuo mikrobiologinio užterštumo. [77]

Taip pat, paprastojo ąžuolo žievė gali būti naudinga gydyti vėžį ir sergant koaguliacijos ligomis. 2002 m. paprastojo ąžuolo žievės metanolinis ir metileno chlorido ekstraktai buvo naudojamas in vitro tyrimame, kuriame dalyvavo pelės, sergančios leukemija, sergant tokia liga, būdingas nenormalių, funkciškai nepilnaverčių vienos ar keletos rūšių leukocitų ar jų pirmtakų padidėjimas kraujyje ir kaulų čiulpuose, todėl kokybiškai ir kiekybiškai pakinta kraujo sudėtis ir yra slopinama normali kraujodara, to pasekoje atsiranda savaiminis kraujavimas. Buvo išsiaiškinta, jog metanolinis paprastojo ąžuolo žievės ekstraktas pasižymi kur kas didesniu aktyvumu nei metileno chlorido ekstraktas kovojant su vėžinėmis ląstelėmis bei paaiškėjo antikoaguliacinis poveikis, nes esant augliui, padidėja trombozių ir krešulių susidarymo tikimybė. Ąžuolo žievės metanoliniai ekstraktai pasižymėjo didesniu nei 90 proc. aktyvumu slopinant trombiną ir pelių leukemijos ląsteles. Tokio tipo vėžio gydymui, metanolinis ekstraktas yra geresnis variantas galimai vaistų gamybai, kadangi metanolis gerai tirpsta vandeninėje aplinkoje, todėl šis ekstrahentas nesukeltų audinių nekrozės. [36]

Ąžuolo (Quercus robur L.) vaistinė augalinė žaliava mažina nuovargio jaučiamus simptomus. Naujausi atlikti tyrimai parodė, kad iš paprastųjų ąžuolų žievės išgautas polifenolinis ekstraktas mažina energijos stokos jaučiamą lygį, įtampą ir nuovargį. Savanoriai vartoję preparatą keturias savaites nepajuto jokių pašalinių efektų. [38] Kitame moksliniame tyrime dalyvavo 38 pacientai, sergantys lėtiniu nuovargio sindromu, kuris yra siejamas su padidėjusiu oksidaciniu stresu, vartojo paprastojo ąžuolo žievės ekstraktą kapsulių farmacinėje formoje kaip maisto papildą. Po keturių savaičių pastebėta, kad pagerėjo pacientų savijauta, o vėliau po 6 mėnesių plazmoje nebuvo rasta jokių ligos žymenų t.y. sumažėjo laisvų radikalų kiekis. [39]

Paprastojo ąžuolo žievė pasižymi uždegimą mažinačiu veikimu. Vaistinė augalinė žaliava yra gausi elagotaninais, todėl yra plačiai naudojama tradicinėje medicinoje kaip veiksminga priešuždegiminė priemonė. Esant uždegimui žarnų ląstelėse gaminamas citokinas TNF-α, kurį slopina urolitinai. 2014 m.

atliktame moksliniame tyrime, buvo pastebėtas įspūdingas uždegimo slopinamasis efektas vartojant paprastojo ąžuolo žievės ekstraktą, kadangi urolitinų koncentracija plazmoje žymiai padidėjo. [34]

2014 metais buvo atliktas tyrimas, jo metu buvo vartojamas paprastojo ąžuolo žievės ekstraktas kaip maisto papildas “Robuvit” ir buvo išsiaiškinta, kad teigiamai veikia pacientus, sergančius laikinu kepenų funkcijos nepakankamumu. Paprastojo ąžuolo ekstraktas pasižymi priešuždegiminiu poveikiu, nes vartojant per os šią vaisto formą, pacientams padidėjo albuminų ir bilirubino koncentraciją kraujo serume, sumažėjo kepenų fermentų: alanino aminotransferazės ir aspartato aminotransferezės. [40]

Be to, kaip ir iš daugelio vaistinių augalų, taip ir iš paprastojo ąžuolo žievės yra gaminamas homeopatinis vaistinis preparatas, kuris skirtas gydyti tulžies ir blužnies pūslės sutrikimus [15].

2.3.1 Paprastojo ąžuolo (Quercus robur L.) vaisto formos, dozavimas, nepageidaujamos

reakcijos, toksiškumas ir sąveika su vaistais.

Europos vaistų agentūra (EMA) nurodo, kad paprastojo ąžuolo žievė, kuri yra vaistinė augalinė žaliava, gali būti naudojama susmulkinta kietiems ir skystiems vaistiniams preparatams gaminti. Nurodomas dozavimas suaugusiems:

A) Tradicinis vaistinio augalinio preparato skyrimas gydyti simptominį lengvą viduriavimą:  1g vaistinės augalinės žaliavos miltelių vaistinėje formoje per os, vartoti 3 kartus per parą;

arba 3 g susmulkintos vaistinės augalinės žaliavos kartu su 250 ml vandens per os, vartoti 3 kartus per parą;

 Sausojo žievės ekstrakto: 140 mg per os, vartoti 4 kartus per parą. Vartojimo trukmė ne ilgiau 3 paros, nebent gydytojas nuspręstų kitaip.

B) Tradicinis ąžuolo skyrimas gydyti simptominį mažą burnos gleivinės ar odos uždegimą:  Odos uždegimui malšinti yra gaminamas 5g/1l, burnos gleivinės skalavimui - 20g/l

paprastojo ąžuolo (Quercus robur L.) žievės nuoviras.

 Vartojimo trukmė ne ilgiau 1 savaitė, nebent gydytojas nuspręstų kitaip.

Dėl duomenų stokos, vaikams iki 18 metų ir neščiosioms bei maitinančiomis krūtimi moterims nerekomenduojama vartoti paprastojo ąžuolo preparatų dėl anksčiau aprašytų indikacijų. [20] Apie ąžuolo lapų farmacines formas nepavyko rasti duomenų.

Pretorijos universiteto veterinarijos fakulteto mokslininkai domėjosi paprastojo ąžuolo žaliavų sukeliama toksine reakcija gyvūnams, kurie vartojo paprastojo ąžuolo žievę, lapus ir giles per os. Buvo išsiaiškinta, jog hidrolizuoti galotaninai metabolizmo metu (priešskrandyje) yra konvertuojami į galo rūgštį, pirogalolį ir rezorcinolį. Įdomu, kad žalios paprastojo ąžuolo gilės pasižymi didesniu toksiškumu nei kitos

vaistinės augalinės žaliavos. Virškinamąjame trakte pasireiškia šie simptomai: nėra apetito, pilvo skausmas, pradžioje vidurių užkietėjimas, o poto seka viduriavimas, kur to pasekoje atsiranda dehidratacija ir išsekimas. Pažeidžiama taip pat šlapimo šalinimo sistema, atsiranda poliurija arba anurija, pradžioje šlapimas yra tamsus, hemoraginis, vėliau pašviesėja, vėliau gali atsirasti inkstų nepakankamumas. Neskiriant priešnuodžių, apie 80 proc. gyvūnų nugaišta. Autopsijos metu, buvo pastebėtas inkstų uždegimas, užuostas šlapimo kvapas, matomos edemos bei yra pakraujavimų iš įvairių organų. [41]

Europos vaistų agentūra (EMA) nurodo, kad paprastojo ąžuolo žievės vaistiniai preparatai gali sukelti alergines reakcijas, tačiau jų dažnumas nėra nurodytas. Be to, vartojant kitus vaistinius preparatus kartu su ąžuolo žievės preparatu, galima sulėtėjusi absorbcija sintetinio vaistinio preparato, todėl rekomenduojama paprastojo ąžuolo žievės nuovirą vartoti 1 valandą prieš ar po sintetinio vaistinio preparato pavartojimo. [20]

Taninai suteikia sutraukiantį skonį burnoje ir keičia vaistų biopraeinamumą – mažina veikliosios medžiagos absorbciją per os: atropino, karbinoksi – amino (vaistas nuo uždegimo), kodeino, efedrino ir pseudoefedrino bei teofilino ir aminofilino. [42]

2.5 Svarbiausių paprastojo ąžuolo žaliavose, esančių biologiškai aktyvių junginių,

apžvalga

2.5.1 Taninai (raugai) ir jų klasifikacija

Taninų pavadinimas yra kilęs iš prancūzų žodžio “tanin”, kuris reiškia deginanti/ įdegio medžiaga, šis terminas apibūdina iš gamtos išgaunamus natūralius polifenolinius junginius. Taninų molekulinė masė gali siekti net 20 000D. Didelė taninų koncentracija aptinkama paprastojo ąžuolo žievėje, medienoje, lapuose, vaisiuose, šaknyse ir sėklose. Jei ypač padidėja taninų gamyba augale, galima manyti, kad tas augalas serga arba vykdo apsaugą nuo infekcijos, vabalų ar gyvūnų. [43]

Taninai yra šviesiai geltoni ar balti amorfiniai milteliai, kurie gerai tirpsta vandenyje, alkoholyje, glicerolyje, acetone ir šarmuose. Sunkiai tirpsta chloroforme, etilacetate ir kituose organiniuose tirpikliuose. Pasižymi sutraukiamuoju skoniu bei keistu kvapu. [45] Taninų apibūdinimas buvo išplėstas ir dabar jis apima didžiulę grupę organinių junginių. Išskirtinė taninų (raugų) savybė yra gebėjimas reaguoti ir susijungti su baltymais, polisacharidais – pektinais ir alkoloidais. [46]

Taninų nomenklatūra nėra visiškai tiksli ir vieninga, nes ne visos rauginančios medžiagos gali būti vadinaožmos taninais, o ir daug taninų nepasižymi rauginančiomis savybėmis, bet turi taninans būdingus struktūrinius ypatumus. [43] Natūraliai gamtoje randami raugai, atsižvelgiant į hidrolizės produktus, yra skirstomi į:

a) hidrolizuojamus raugus – galotaninai (esterių tipo piragalolio dariniai). Hidrolizuojamaisiais raugais vadinamos medžiagos, kurias veikiant praskiestomis rūgštimis ar fermentais, suskyla į monosacharidą D-gliukozę bei aciklinius junginius – galo rūgštį arba elago rūgštį. Hidrolizuojami raugai skiriasi chemine struktūra, todėl jie skirstomi į tris grupes: depsidai, galotaninai, elagotaninai. b) kondensuotus raugus - pirokatecholio dariniai. Kondensuotus raugus veikiant fermentais ar praskiestomis rūgštimis, jie nesihidrolizuoja, o kondensuojasi ir sudaro sudėtingesnius kondensacijos produktus. Ši grupė raugų neturi cukrų, o juos lydant kartu su šarmais gali būti suskaidomi į paprastesnius junginius. Atsižvelgiant į cheminę struktūrą, kondensuoti raugai skirstomi: leukoantocianidinų (flavan-3,4-diolių) dariniai, katecholių (flavan-3-olių) dariniai. [70]

Remiantis struktūrine charakteristika, taninus galima suskirstyti ir į keturias grupes: [43; 46]

1) Galotaninai – taninai, kurių galo rūgšties vienetai ar depsidai yra prisijungę iki 5 gliukozės molekulių ar kitokių struktūrinių vienetų.

2) Elagotaninai - toks taninų pogrupis, kuriame mažiausiai dvi galo rūgštys yra susijungusios C-C ryšiais tarpusavyje ir neturi glikozidine jungtimi prijungto katechino fragmento.

3) Taninų kompleksas – tai taninai, kur katechino fragmentas yra glikozidine jungtimi susijungęs su galotanino ar elagotanino fragmentu.

4) Kondensuoti taninai – tai oligomeriniai ar polimeriniai proantocianidinai, turintys monomerinių katechinų fragmentų. [43; 46]

2.5.1.1 Taninų (raugų) poveikis

Ajurvedoje ir indų medicinoje yra plačiai naudojamos vaistinės augalinės žaliavos turinčios taninų. Nuovirais yra gydomi tam tikri dizenterijos tipai, taip pat naudojama kaip priemonė dantenoms stiprinti. Kadangi taninai geba nusodinti baltymus ir kovoti ir mikroorganizmais, todėl taninų tirpalas yra dedamas ant mažos atviros žaizdos, taip sustabdomas kraujavimas ir pagreitinamas gijimo procesas, nes yra vykdoma nauja epitelizacija, pagretėja fibroblasto proliferacija ir kolageno sintezė ir angiogenezė [47], taip yra sukuriamas izoliuojantis ir apsauginis sluoksnis, kuris ramina dirginamą ir skaudamą odos plotą. [46]

Taninai pasižymintys antioksidaciniu poveikiu, gali kovoti su vėžinėmis ir mutageninėmis ląstelėmis, nes apsaugo sveikąsias ląsteles nuo oksidacinės žąlos, įskaitant lipidų peroksidaciją. Taip pat, šir junginiai mažina grybelių, bakterijų, mielių ir virusų augimą bei vystymąsi. [48] 2014 m. publikuotame moksliniame tyrime, išsiaiškinta, jog taninai yra stiprūs antioksidantai, pasižymi kepenis apsaugojančiu poveikiu bei tinkama vartoti kaip uždegimą mažinanti ir alergiją slopinanti priemonė. [49; 50] Be to, 2010 m. ir 2014 m. mokslinėse publikacijose buvo pranešta, kad taninai paskatina kraujo krešėjimo procesus, mažina kraujo spaudimą, sumažina lipidų lygį kraujo serume, todėl tinka vartoti sergant cukriniu diabetu bei apsaugo kardiovaskulinę sistemą. [51; 52]

2.5.2 Fenoliniai junginiai, jų klasifikacija ir medicininė reikšmė

Fenoliniai junginiai yra sudaryti arba jų struktūroje galima įžvelgti fenolio fragmentą. [53] Tai junginiai, turintys vieną ar daugiau aromatinių ciklų su viena ar daugiau hidroksi- (-OH) grupe. Tai yra antriniai augalų metabolitai. Yra žinoma daugiau nei 8000 fenolinių struktūrų, vienos gana paprastos t.y. fenolinė rūgštis ir kitos formos – žymiai sudėtingesnės t.y. taninai. Augaluose esantys fenoliniai junginiai

dalyvauja kaip gynybinė priemonė nuo ultravioletinių spindulių, patogenų, parazitų ir plėšrūnų, suteikdamas augalui spalvą. [3; 54]

Fenoliniai junginiai esantys augaluose net yra charakterizuojami pagal tai, kokį poveikį žmogaus organizmui gali sukelti, jie pasižymi anti - oksidantiniu, prieš - uždegiminiu, prieš - vėžiniu poveikiu, gali apsaugoti ląsteles nuo oksidacinio streso ir kai kurių ligų. Paprasti fenoliai pasižymi antibakteriniu, antiseptiniu ir prieškirmėliniu poveikiais. [3]

Fenolinių junginių grupė yra labai plati, ir klasifikacija gali būti skirtinga. [58] Remiantis struktūros klasifikacija, gali būti fenoliai išskirstomi :

a) pagal hidroksigrupių skaičių: mono- t.y. turintys vieną –OH grupę aromatiniame žiede, ir poli- fenoliai t.y. turintys dvi ar daugiau –OH grupes aromatiniame žiede;

b) pagal pakaitus, esančius anglies aromatiniame cikle, aromatinių ciklų skaičių ir anglies atomų kiekį šoninėje grandinėje. Čia dar yra pogrupis: fenoliai su vienu aromatiniu ciklu, fenoliai su dviem aromatiniais ciklais , chinonai ir polimerai. [3]

Taip pat, yra išskiriamos 8 pagrindinės fenolinių junginių grupės: flavonoidai, fenolinės rūgštys, stilbenai, chinonai, kumarinai, ligninai, ksantonai ir chromonai. [4; 55]

Fenoliniai junginiai yra biologiškai aktyvios medžiagos, antioksidantis aktyvumas pastebėtas prieš dešimtmečius, bet ir pasižymi priešuždegiminiu [56; 57], širdies sistemą apsaugančiu, hepatoprotekciniu, priešvėžiniu aktyvumu. [58] Atlikus tyrimą, kuris paskelbtas 2014 m., nustatyta, jog fenolinės rūgštys pasižymi antidiabetiniu poveikiu, skatina tulžies išsiskyrimą, mažina cholesterolio kiekį kraujyje. [59]

2.5.3 Flavonoidai, jų klasifikacija ir medicininė reikšmė

Flavonoidai yra viena didžiausių augalinių fenolinių junginių grupių. Tai organiniai junginiai, turintys heterociklinę sistemą. Flavonoidai yra kaupiami įvairiose augalo dalyse: stiebuose, lapuose, vaisiuose ir žieduose. [82] Jų kiekis augaluose priklauso nuo saulės šviesos, rūšių įvairovės, augalų genetikos, sudygimo, aplinkos ir kt. sąlygų. [83] Šių biologiškai aktyvių medžiagų struktūros pagrindas yra 2 aromatiniai benzolo žiedai, kurie sujungti per C heterociklinį piramo žiedą.

Flavonoidų klasifikacijų yra pateikiama įvairių. Pagal pirano žiedo oksidacijos laipsnį ir pagal cheminę struktūrą, flavonoidai skirstomi į šias klases: flavonai, flavonoliai, flavanonai, flavan-3-oliai (katechinai), antocianidinai, izoflavonai, auronai, chalkonai, biflavonoidai, neoflavonoidai. [83] Iš

flavonoidų, labiausiai ištirti ir geriausiai žinomi yra rutinas, hisperidas, kvercetinas, antocianinai, proantocinidinai, flavanai. [84]

Kvercetinas yra polifenolinis junginys, mažos molekulinės masės ir sudarytas iš 15 anglies atomų – kvercetinas, pavaizduota 3 paveikslėlyje, priklausantis flavonoidų grupei, kurie suteikia augalo vaisiams, žiedams, daržovėms spalvą. [64; 65] Šis junginys priklauso flavonolių poklasiui. [66] Šio junginio gausu svogūnuose, oboliuose, arbatoje ar net raudonąjame vyne. Augaluose šis biologiškai aktyvus junginys būna glikozidinėje formoje,

dažniausiai atpažįstamas kaip rutinas. [67]

Absorbcija kvercetino ir jo glikozidų nėra visiškai aiški, tačiau manoma, kad vyksta viršutiniame virškinimo trakte. Po absorbcijos, kvercetinas yra greitai metabolizuojamas, susidaro gliukoronidai. Organizme pašalinamas gana greitai, nes kvercetino eliminacijos pusperiodis yra 10-11 val. Didžiausias kiekis yra pašalinamas su šlapimu, dažniausiai glikozidinėje formoje. [68]

Kvercetinas yra stiprus antioksidantas, jis sugeba kovoti su laisvaisias radikalais, kurie geba pažeisti ląstelės sieneles ir sukelti ląstelės žūtį. Antioksidantas gali neutralizuoti ir sumažinti ar padėti išvengti padarinių, kuriuos sukelia laisvieji radikalai. Kvercetinas apsaugo imuninės ląstelės nuo histamino, kuris sukelia alergines reakcijas. To pasekoje, sumažėja ar išnyksta alergijos simptomai: varvanti nosis, ašarojančios akys, prakaitavimas. Žmonės, kurie vartoja daug vaisių ir daržovių, yra linkę rečiau susirgti vėžinėmis ligomis. Kvercetinas ir kiti flavonoidai slopina vėžinių ląstelių augimą krūtinės, gaubtinės žarnos, prostatos, kiaušidžių, gimdos gleivinės bei plaučių srityse. [64]

Mokslinių tyrimų duomenimis, fenolinės rūgštys ir flavonoidai pasižymi gastroprotekciniu poveikiu. Skrandžio gleivinė yra apsaugoma, nes šios biologiškai aktyvios medžiagos pasižymi antioksidaciniu ir priešuždegiminiu poveikiu, gerina gleivinės kraujotaką, skatina prostaglandinų ir gleivių sintezę skrandžio gleivinėje. [61; 62] Atlikus tyrimus, paaiškėjo, kad vartojant flavonoidus: kvercetiną ir rutiną, yra išvengiamas etanolio sukeliamas skrandžio kraujavimas, edemos, nekrozės, erozijos ir gilūs išopėjimai. [63] Flavonoidai normalizuoja kraujagyslių pralaidumą, padidina jų elastingumą bei sudaro kompleksus su sunkiųjų metalų jonais, todėl gali būti vartojami apsinuodijus sunkiaisiais metalais. [60]

Kvercetinas, kaip stiprus antioksidantas, gali sąveikauti su sintetiniais vaistiniais preparatais: su antikoaguliantais (varfarinu, klopidogreliu, aspirinu) ir padidina kraujavimo tikimybę; vartojant kvercetiną kartu su chemoterapijoje vartojamais vaistais (doksorubicinu ir cisplatina) gali būti pakeistas terapeutinis efektas; kartu su kortikosteroidais, gali sulėtinti kortikosteroidų eliminacijos procesą; kvercetinas ir 3 pav. Kvercetino struktūrinė formulė

ciklosporinas, sulėtinta antibiotiko absorbcija; tačiau vartojant su fluorchinolonais sumažėja pastarųjų efektyvumas; vartojant kvercetino preparatus su širdį veikiančiu glikozidu (digoksinu), padidėja digoksino koncentracija plazmoje. [64]

3. TYRIMO OBJEKTAI IR METODAI

3.1 Tyrimo objektas

Tyrimo objektas – natūraliai augančių paprastųjų ąžuolų (Quercus robur L.) žievės ir lapų ėminiai, kurie surinkti 2016 metais. Vaistinio augalo žievė ir lapai rinkti nuo 2016 metų gegužės 22 d. iki spalio 30 d. Paprastojo ąžuolo (Quercus robur L.) žievės ir lapų surinkta po 15 mėginių. Naudoti mėginiai, surinkti iš gamtinių cenopopuliacijų, esančių Kauno mieste, Panemunės mikrorajone ir Alytaus m. Parke, Varėnos miške, Vilniuje prie Gedimino kalno, Kauno Panemunės Šile, K. Naumiesčio parke, buvo naudojami cheminės sudėties dinamikos kitimo tyrimams atlikti. Surinkti žievės ir lapų mėginiai buvo paskleisti plonu sluoksniu ant laikrasčių ir sudžiovinti gerai vėdinamoje patalpoje, sausoje ir nuo tiesioginių saulės spindulių apsaugotoje vietoje. Išdžiovinti žievės ir lapų ėminiai buvo laikomi popieriniuose maišeliuose, sausoje ir gerai vėdinamoje vietoje.

3.2 Naudotos medžiagos ir reagentai

1. Rektifikuotas etilo alkoholis, 96,3 proc. V/V („Stumbras“, Lietuva); 2. Distiliuotas vanduo;

3. Indigosulfonrūgšties tirpalas („Fluka“, Šviecarija);

4. Kalio permanganato 0,02 M tirpalas („Fluka“, Šviecarija); 5. 30 proc. acto rūgšties tirpalas („Sgma- Aldrich“, Anglija); 6. Aliuminio chloridas („Mecobenzon“, Danija);

7. Heksametilentetraminas („Sgma- Aldrich“, Anglija);

8. Galo rūgšties monohidrato standartas („Sgma- Aldrich“, USA); 9. Folin – Ciocalteu reagentas („Sgma- Aldrich“, Anglija);

10. Natrio karbonatas („Chempur“, Lenkija).

1. Elektrinis malūnėlis („First”, Austrija);

2. Analitinės svarstyklės („Sartorius CP6M-0CE”, Vokietija); 3. Mikropipetės („Eppendorf Research”, JAV);

4. Popieriniai filtrai („ODR – 9303”, Vokietija);

5. Ultragarsinė vonelė („ Bandelin electronic DK 255p”, U=230V, V=50-60Hz, I=2A, Vokietija);

6. Elektrinė plytelė („First“, Austrija);

7. Mechaninė purtyklė („Laboratory shaker 358S”, Lenkija); 8. Nuodžiuvio nustatymo aparatas („Swiss quality“, Šveicarija);

9. Spektrofotometras („Beckman DU – 70”, 4273041, „Beckman Instruments”, JAV).

3.3 Tyrimo metodai

3.3.1 Nuodžiuvio nustatymas vaistinėje augalinėje žaliavoje

Analizei skirtas vaistinės augalinės žaliavos mėginys susmulkinamas elektriniu malūnėliu. Džiovinimo spintoje iki pastovios masės išdžiovinami ir pasveriami biuksai. Juose sveriama po tris augalinės žaliavos svėrinius po 1,000 ± 0,005 g. Tada vaistinė augalinė žaliava džiovinama 100 – 105 oC temperatūroje iki pastovios masės t.y. daugiau nebekintančios, masės. Džiovinimo pradžia – tai laikas, kai temperatūra džiovinimo spintoje pasiekia 100- 105 o_{C ir tampa pastovi. Pirmą kartą augalinės žaliavos}

mėginys sveriamas po 2 val džiovinio. Tada, kai dviejų paskutinių svėrimų rezultatai, praėjus 30 min po džiovinimo spintoje ir dar po 30 min. po vėsinimo eksikatoriuje, tarpusavyje skiriasi ne daugiau kaip ± 0,001g nustatoma pastovioji masė. [68]

Vaistinės augalinės žaliavos nuodžiūvis (proc.) apskaičiuojamas pagal formule: 𝑚1 − 𝑚2

𝑚2 𝑥 100 m1 – žaliavos masė gramais prieš džiovinimą (g); m2 – žaliavos masė gramais po džiovinimo (g).

Galutinis rezultatatas apskaičiuojamas sudarant trijų svėrimų rezultatų aritmetinį vidurkį, kuris įvertinamas dešimtųjų procento dalių tikslumu. Nuokrypis tarp vienu metu atliekamų vaistinės augalinės žaliavos nuodžiūvio tyrimų negali būti didesnis kaip ± 0,5 proc. [68]

Europos farmakopėjoje nurodoma, kad maksimalus paprastojo ąžuolo augalinės žaliavos - žievės nuodžiūvis gali būti 10 %, kuris yra apskaičiuotas 1,000 g miltelių. [21] Apie paprastojo ąžuolo lapų nuodžiuvį nėra pateikta duomenų nei Europos, Amerikos, Rusijos, Prancūzijos farmakopėjose.

3.3.2 Paprastojo ąžuolo žievės ir lapų ėminių ekstraktų paruošimo metodika

Paprastojo ąžuolo žievės ekstraktų paruošimo metodika. Gaminami etanoliniai ekstraktai iš kiekvienos vaistinės augalinės žaliavos (žievės), santykiu 1:100. Atveriamia po 0,1000 g (±0,01) kiekvienos gelsvai rudos miltelių pavidalo vaistinės augalinės žaliavos, kuri buvo prieš tai sumalta elektriniu malūnėliu. Ant atsvertos žaliavos masės yra užpilama po 10 ml (± 0,01) 80 proc. V/V etanolio. Šis mišinys yra atsargiai suplakamas, kad ekstrahentas tolygiai bei gerai pasiskirstytš tarp vaistinės augalinės žaliavos miltelių. Ekstrakcija vykdoma ultragarso vonelėje 30 min, kur ekstrahento ir vaistinės augalinės žaliavos mišinys yra supiltas ir laikomas sandariai užkimštuose rudo stiklo buteliukuose. Ultragarso vonelės nustatyti parametrai – kambario temperatūra (±5 o_{C), naudojama galia yra 10 x 10 vatai.}

Gauti paprastojo ąžuolo žievės ėminių ekstraktai yra nufiltruojami per distiliuotu vandeniu sudrėkintą popierinį filtro popierių. Vėliau be pašalinių priemaišų gauti ėminių ekstraktai supilami į švarius rudo stiklo buteliukus, sandariai užkemšami bei yra laikomi kambario temperatūroje tamsioje vietoje – spintoje.

Paprastojo ąžuolo lapų ėminių ekstraktų paruošimo metodika. Gaminami etanoliniai ekstraktai iš kiekvienos vaistinės augalinės žaliavos (lapų), santykiu 1:100. Atveriamia po 0,1 g (±0,01) kiekvienos žalsvos – gelsvai žalsvos miltelių vaistinės augalinės žaliavos, kuri buvo prieš tai sumalta elektriniu malūnėliu. Ant atsvertos žaliavos masės yra užpilama po 10 ml (±0,01) 70 proc. V/V etanolio. Šis mišinys yra atsargiai suplakamas, kad ekstrahentas tolygiai bei gerai pasiskirstytų tarp vaistinės augalinės žaliavos miltelių. Ekstrakcija vykdoma ultragarso vonelėje 30 min, kur ekstrahento ir lapų mišinys yra supiltas ir laikomas sandariai užkimštuose rudo stiklo buteliukuose. Ultragarso vonelės nustatyti parametrai – kambario temperatūra (±5 oC), naudojama galia yra 10 x 10 vatai.

Gauti paprastojo ąžuolo lapų ėminių ekstraktai yra nufiltruojami per distiliuotu vandeniu sudrėkintą popierinį filtro popierių. Vėliau be pašalinių priemaišų gauti ekstraktai supilami į švarius rudo stiklo buteliukus, sandariai užkemšami bei yra laikomi kambario temperatūroje tamsioje vietoje – spintoje.

Iš paprastojo ąžuolo žievės ir lapų ėminių yra pagaminami po 3 etanolinius ekstraktus, taikant aukščiau aprašytą metodiką, nes norima atlikti pakartojimus ir gauti patikimesnius rezultatus.

Etanoliniai paprastojo ąžuolo žievės ir lapų ekstraktai yra naudojami flavonoidų ir fenolinių junginių kiekybiniame nustatyme.

3.3.3 Bendrojo raugų kiekio nustatymo metodika

Paprastojo ąžuolo žievės ir lapų ėminiuose, raugų kiekis nustatomas titrimetriniu metodu. Šis metodas paremtas raugų oksidacijos – redukcijos reakcijomis. Raugai nustatomi oksidatoriais, pvz.: kalio permanganatu. Taninai nustatomi oksiduojant juos kalio permanganato tirpalu, dalyvaujant indigosulfonrūgščiai. [70]

Atsveriama 0,400 ± 0,005 g susmulkintos augalinės žaliavos (žievės ar lapų) ir 500 ml talpos kūginėje kolboje užpilama 50 ml distiliuoto verdančio vandens. Toks mišinys virinamas 30 min vandens vonelėje su grįžtamuoju kondensatoriumi, todėl, kad nesumažėtų vandens kiekis ekstrakte. Virinant mišinys dažnai maišomas. Po 30 min virinimo vandens vonelėje ekstraktas atvėsinimas iki kambario temperatūros. Apie 20 ml gautos vaistinės augalinės žaliavos ištraukos nukošiama per vatą į 200 ml talpos kūginę kolbą atidžiai saugant, kad į nukoštą ekstraktą nepatektų VAŽ dalelių. Po to į 100 ml talpos kūginę kolbą įpilama 5 ml gautos vaistinės augalinės žaliavos ištraukos, 100 ml distiliuoto vandens ir 5 ml indigosulfonrūgšties tirpalo. Mišinys titruojamas šviežiai laboratorijoje pagamintu kalio permanganato 0,02 M tirpalu nuolant maišant iki tol, kol atsiranda geltona spalva. Ji palyginama su tuščiojo mėginio. Atliekamo kartu, tirpalo spalva. 1ml 0,02 M kalio permanganato tirpalo atititinka 0,004157 g raugų (perskaičiuotų į taniną).

Visiškai sausos vaistinės augalinės žaliavos raugų kiekis procentais apskaičiuojamas pagal formulę: 𝑥 =(𝑉 − 𝑉1) 𝑥 0,004157 𝑥 50 𝑥 20 𝑥 100

𝑚 𝑥 5 (100 − 𝑊) =

(𝑉 − 𝑉1)𝑥 415,7 𝑚 𝑥 5(100 − 𝑊)

V – tiriamosios žaliavos ištraukai titruoti sunaudotas kalio permanganate 0,02 M tirpalo tūris ml; V1 – tuščiajam mėginiui titruoti sunaudotas kalio permanganate 0,02 M tirpalo tūris ml;

m – žaliavos masė g; W – žaliavos drėgmė proc.

Reagentai: laboratorijoje prieš bendrąjį raugų kiekio nustatymo tyrimą pagaminamas indigosulfonrūgšties tirpalas. 1,0 g indigokarmino ištirpinama 25 ml sulfato rūgšties, ištirpinus įpilama dar 25 ml sulfato rūgšties ir praskiedžiama distiliuotu vandeniu iki 110 ml. [70]

3.3.4 Suminio flavonoidų kiekio, išreikšto kvercetino ekvivalentu, nustatymo

metodika

Suminis flavonoidų kiekis nustatomas spektrofotometriškai, naudojant reagentą - aliuminio chloridą. Rezultatai įvertinami, naudojant kvercetino kalibracinę kreivę. [71]

Tiriamasis tirpalas ruošiamas į 5 ml matavimo kolbutę įplinat 1 ml tiriamojo ekstrakto, 2 ml 96 proc. (V/V) etanolio, 0,1 ml 30 proc. Acto rūgšties tirpalo, 0,3 ml 10 proc. Aliuminio chloride tirpalo. Gautas mišinys laikomas tamsioje vietoje, kambario temperatūroje 30 min. Po 30 min. pilama 0,4 ml 5 proc. heksametilentetramino tirpalo ir kolbutės turinys skiedžiamas distiliuotu vandeniu iki žymės, gerai sumaišoma. Matuojamas tirpalo absorbcijos dydis ir lyginamas su palyginamuoju tirpalu, esant 407 nm bangos ilgiui. Palyginamasis tirpalas ruošiamas į 5ml matavimo kolbutę įpilant 0,2 ml tiriamojo ekstrakto, 2 ml 96 proc. (V/V) etanolio, 0,1 ml 30 proc. Acto rūgšties tirpalo ir kolbutės turinį praskiedus distiliuotu vandeniu iki 5 ml nurodytos žymės.

Kvercetino kalibracinei kreivei gauti buvo ruošiami etanoliniai galo rūgšties tirpalai. Jie buvo ruošiami tiokiomis pačiomis sąlygomis kaip tiriamieji tirpalai, tačiau vietoje 0,2 ml tiriamojo ekstrakto, buvo pilama 0,2 ml 6-ių žinomų koncentracijų kvercetino tirpalai (0,5 mg/ml; 0,25 mg/ml; 0,125 mg/ml; 0,0625 mg/ml, 0,03125 mg/ml, 0,015625 mg/ml)

Suminis flavonoidų kiekis išreiškiamas kvercetino ekvivalentais (QE) gramui absoliučiai sausos žaliavos pagal kalibracinę kreivę. Apskaičiuojama pagal formulę:

𝑄𝐸 = 𝑐 𝑥 𝑉

𝑚 (mg/g)

c- kvercetino koncentracija (mg/ml) nustatyta iš kalibracinės kreivės V- ekstrakto tūris (ml)

g –tikslus atvertas žaliavos kiekis (g)

Kvercetino kalibracinė kreivė, koreliacijos koeficientas ir tiesinė regresijos lygtis pateikti 4 paveiksle.

3.3.5 Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymo metodika

Bendras fenolinių junginių kiekis nustatomas spektrofotometru, naudojant Folin –Ciocalteu reagentą [11]. Folin – Ciocalteu reagentą sudaro 100 ml natrio volframato dihidrato, 25ml natrio molibdato dihidrato, 50 ml 85 proc. fosforo rūgšties tirpalo ir 100 ml 36 proc. vandenilio rūgšties tirpalo [72]. Metodas yra paremtas nespecifine fenolinių junginių oksidacija dvejais stipriais neorganiniais oksidatoriais (fosfomolibdato ir fosfovolframato rūgštimis) bazinėje terpėje. Reakcija vykdoma 30 min [73;74;75] arba mišinys 5 min pašildomas vandens vonioje esant 50 o_{C. [74] Matuojama 760-765nm bangos ilgio šviesos}

absorbcija. [73;74;75] Naujant šį metodą, priklausomai nuo fenolinių junginių struktūros, gaunami skirtingi rezultatai. Folin – Ciocalteu reagentas kartu su fenoliniais junginiais gali oksiduoti ir keletą ne fenolinių organinių junginių bei tam tikras neorganines rūgštis, taip pervertinant fenolinių junginių kiekį mėginyje. Nepaisant galimo fenolinių junginių pervertinimo, Folin – Ciocalteu metodas labai plačiai taikomas fenolinių junginių kiekybinės sudėties įvertinimui augalinės kilmės mėginiuose. [72;73;74;75] Tai greitas, sudėtingos ir brangios aparatūros nereikalaujantis metodas.

Tirpalo A paruošimas: 1 ml tiriamojo eksktrakto sumaišomas su 4 ml 96 proc. (V/V) etanolio. Tirpalo B paruošimas: 0,25 ml tirpalo A sumaišoma su 5ml 10 proc. Folin – Ciocalteu reagento ir 4 ml 7,5 proc. Natrio karbonato tirpalais. Lyginimasis mėginys gaminamas vietoje tirpalo A naudojant išgryninto vandens. y = 1,8832x + 0,014 R² = 0,988 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 Abso rb cija Kvercetino koncentracija mg/ml 4 pav. Kvercetino kalibracinė kreivė

Gautasis tirpalas paliekamas 60 min tamsoje. Po to spektrofotometru išmatuojama 765 nm bangos ilgio šviesos absorbcja. Bendras fenolinių junginių kiekis išreiškiamas galo rūgšties ekvivalentu (mg/ml) pagal kalibracijos lygtį. [78]

Paruošti standartiniai galo rūgšties tirpalai skirtingomis koncentracijomis intervale (0,01 mg/ml – 0,00625 mg/ml. Išmatavus absorbcija, sudaroma galo rūgšties kalibracinė kreivė, pavaizduota 5 paveiksle.

Bendras fenolinių junginių kiekis (proc.) absoliučiai sausoje žaliavoje apskaičiuojamas remiantis formule:

𝑋 =𝑋1 𝑥 𝑉 𝑥 100 𝑚 𝑥 1000 X1 – bendras fenolinių junginių kiekis mg/ml ;

V – tiriamosios žaliavos ekstrakto gamybai naudoto ekstrahento tūris ml; m – absoliučiai sausos žaliavos masė g.

3.4 Statistinis duomenų įvertinimas

Duomenų statistinis įvertinimas atliktas naudojant „MS Excel 2013“ (Mirosoft, JAV) kompiuterinę programą, kur buvo naudojami specialūs kompiuteriniai taikomųjų programų paketai. Šių tyrimų rezultatams apdoroti naudota Microsoft Office Excel programų paketo specializuota elektroninė

y = 11,992x + 0,0471 R² = 0,9951 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 A bsorbci ja

Galo rūgšties koncentracija, mg/mg

skaičiuoklė. Naudojant šią programą, buvo susisteminti duomenys, apskaičiuoti vidurkiai, vidutiniai standartiniai nuokrypiai, paklaidos bei nubraižyti grafikai. „SPSS 20“ (IBM, JAV) programine įranga buvo įvertintas statistinis duomenų reikšmingumas bei Pearson‘o korealiacinis ryšys.

4. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

4.1 Nuodžiuvio nustatymas paprastojo ąžuolo žievės ir lapų ėminiuose

Europos farmakopėjoje yra nurodyta, kad maksimalus paprastojo ąžuolo žievės nuodžiuvis gali būti 10 proc., kuris yra apskaičiuotas 1,000 ± 0,005 g miltelių masei. 1 lentelėje yra pateikta ąžuolo (Q.

robur L.) rinkimo data bei nuodžiuvio vidurkio reikšmė, kuris nustatyta naudojant 3.1 skyriuje aprašytą

metodiką.

1 lentelė. Nuodžiūvio rodikliai paprastojo ąžuolo žievės ir lapų ėminiuose Paprastojo ąžuolo žievės ir

lapų rinkimo laikas (2016 m.) ir vieta

Nuodžiūvio vidurkis (proc.) su VSN

Žievės ėminiuose

Lapų ėminiuose

05.22 Panemunės mikro raj. 5,6 ± 0,1 3,1 ± 0,2 06.10 Panemunės mikro raj. 5,4 ± 0,2 3,1 ± 0,1 06.26 Panemunės mikro raj. 5,4 ± 0,1 3,3 ± 0,2 07.10 Panemunės mikro raj. 5,7 ± 0,2 3,3 ± 0,2 07.29 Varėnos miškas 5,7 ± 0,2 3,4 ± 0,2 07.29 Alytaus miesto centre 5,4 ± 0,2 3,5 ± 0,3 07.30 Kudirkos Naumiesčio

parke

5,8 ± 0,2 3,4 ± 0,2

07.31 Vilniaus miesto centre 5,9 ± 0,2 3,7 ± 0,2 07.31 Kauno Panemunės Šile 6,2 ± 0,1 3,6 ± 0,3 08.15 Panemunės mikro raj. 6,3 ± 0,0 3,8 ± 0,2 09.04 Panemunės mikro raj. 6,2 ± 0,2 4,0 ± 0,2 09.18 Panemunės mikro raj. 6,4 ± 0,2 4,0 ± 0,3 10.02 Panemunės mikro raj. 6,8 ± 0,2 4,2 ± 0,3 10.16 Panemunės mikro raj. 7,2 ± 0,2 4,4 ± 0,2 10.30 Panemunės mikro raj. 7,4 ± 0,3 4,8 ± 0,2

Pastebėta, kad surinkti paprastojo ąžuolo žievės ėminiai atitinka keliamus 01/2008:1887 Europos farmakopėjos reikalavimus, kadangi didžiausia randama drėgmė žievės mėginyje yra 7,4 ± 0,3 proc., mažiausias drėgmės kiekis aptiktas birželio 10 d. ir birželio 26 d. surinktuose žievės ėminiuose t.y. 5,4 ± 0,1 proc. ir 5,4 ± 0,2 proc., o didžiausias drėgmės kiekis buvo nustatytas spalio 30 d. surinktoje žievėje t.y. 7,4 ± 0,3 %, o tai neviršija 10 proc. keliamo reikalavimo. Atlikus paprastojo ąžuolo lapų ėminių nuodžiuvio tyrimą, pastebėta, kad drėgmės kiekis svyruoja nuo 3,1 ± 0,1 proc. iki 4,8 ± 0,2 proc., didžiausias drėgmės kiekis aptiktas lapų mėginyje, kuri surinkta spalio 30 dieną. Nors Europos farmakopėjoje nėra nurodyta, kokia turi būti didžiausia aptinkama drėgmė paprastojo ąžuolo (Q. robur L.) lapuose, o moksliniuose tyrimuose nėra pateiktų ąžuolų lapų nuodžiuvio rezultatų, tai leidžia daryti prielaidą, kad šio medžio lapų mėginių nuodžiuvis nebuvo dar tirtas.

4.2 Ekstraktų pasiruošimo metodikos optimizavimas

Elektriniu malūnėliu sumalti paprastojo ąžuolo žievės ir lapų ėminiai, sudedami sandariai į popierinius maišelius. Siekiant išsiaiškinti optimaliausias ąžuolo žievės ir lapų ėminių ekstrakcijos sąlygas taikytas, fenoliniai junginiai ekstrahuojami skirtingų koncentracijų vandeniniais etanolinio mišiniais ir pasirenkami tokie tirpikliai: 20 proc., 30 proc., 40 proc., 50 proc., 60 proc., 70 proc., 80 proc., 96 proc. V/V etanolio ir vandens mišiniai.

Ekstraktų gamyba: atsveriama žievės bei lapų ėminių mišinio atsikirai po 0,1 g (±0,01), užpilamas žievės ar lapų mišinys 10 ml (±0,1) skirtingos koncentracijos vandeniniais etanoliniais tirpalais (20 proc., 30 proc., 40 proc., 50 proc., 60 proc., 70 proc., 80 proc., 96 proc. ) ir laikytas ultragarso vonelėje 30 min. Vėliau gauti mišinių ekstraktai nufiltruoti, naudojant popierinį filtro popierių, kurį suvilgytas distiliuotu vandeniu. Gauti įvairios koncentracijos ekstraktai su žievės ar lapų mėginių mišiniu buvo naudojami matuojant fenolinių junginių kiekybę, naudojant Folin – Ciocalteu reagentą.

Nustatyta (6 paveikslas), kad paprastojo ąžuolo žievės ėminių ekstrahentas yra geriausias 80 proc. V/V etanolis, o lapų ėminių ekstrakcijai labiausiai tinka 70 proc. V/V etanolio koncentracija, kadangi taikant minėtą metodą, nustatytas didžiausas fenolinių junginių kiekis.

Vėliau buvo nustatinėjamos kokios sąlygos (7 ir 8 paveikslai): ultragarso (5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 30 min) ar maceracija purtyklėje yra tinkamiausios ekstrakcijai. Atsveriama po 0,1 g (±0,01) paprastojo ąžuolo žievės ir po 0,1 g (±0,01) lapų ėminių mišinio, kur žievė yra užpilama 80 proc. V/V etanoliu, o lapai – 70 proc. V/V etanoliu. Pirmi ąžuolo žievės ir lapų mėginiai kratomi purtyklėje – 30 min., antri – 1 val., treti – 2 val., ketvirti ir penkti mėginiai buvo palikti laboratorijoje 2 + 24 val. ir 2 + 48 val., tamsioje, nuo šviesos apsaugotoje vietoje, kambario temperatūroje, uždarytuose rudo stiklo induose.

6 pav. Fenolinių junginių ekstrakcijos išeigos priklausomybė nuo etanolio koncentracijos (p<0,05) 0 2 4 6 8 10 12 14 20 30 40 50 60 70 80 96 Fe n o linių ju n ginių k ie kis , p ro c.

Etanolio konc. V/V proc.

Žievės ėminių fenolinių junginių išeiga Lapų ėminių fenolinių junginių išeiga

7 pav. Fenolinių junginių kiekio priklausomybė nuo ekstrakcijos ultragarso vonelėje trukmės (p<0,05) 0 2 4 6 8 10 12 14 16

5 min 10 min 15 min 20 min 30 min

Fen ol ini ų jun gi ni ų ki ek is, pr oc .

Ekstrakcijos ultragarso vonelėje trukmė, min

Atliktų tyrimų metu, gauta, jog naudojant ultragarso vonelę, kurios parametrai nustatyti, kad būtų kambario temperatūra (± 5 o_{C) bei apsisukimų skaičius 10 x 10, tiriamųjų ąžuolo žievės ir lapų ėminių}

ekstraktuose fenolinių junginių kiekis buvo nustatytas didžiausias laikant pastaruosius ekstraktus 30 min. nei naudojant purtyklę, todėl tolimesniems bandymams ekstrakcija pasirinkta ultragarso vonelėje, nes šio metodo trukmė yra trumpesnė bei šiuo būdu išsiekstrahavo didesnis biologiškai aktyvių medžiagų kiekis.

4.3 Bendrojo raugų (taninų) kiekio įvairavimas paprastojo ąžuolo žievės ir lapų

ėminiuose

Bendrasis raugų kiekis įvertintas aliekant 3.3.3. skyriuje aprašytą metodą. Remiantis tyrimu, kad nustatinėjant raugus, naudojamas ekstrahavimas karštu vandeniu, tokiu būdu išekstrahuojami didesni kiekiai raugų ir fenolinių glikozidų. [81] Atlikus fitocheminę analizę 3 kartus su paprastojo ąžuolo lapų ir žievės mėginiais, pastebėta, kaip matoma 9 paveiksle, kad raugų kiekis paprastojo ąžuolo žievės ėminiuose nuo liepos mėnesio pabaigos vis nuosekliai didėjo iki spalio mėnesio pabaigos t.y. padidėjo 2,96 proc. Per visą paprastojo ąžuolo žievės ėminių rinkimo laikotarpį, vidutinis aptiktas raugų kiekis yra 6,72 (±1,31) proc. Didžiausias nustatytas raugų kiekis – 8,68 (±0,57) proc. spalio mėnesyje rinktoje žievėje.

0 2 4 6 8 10 12

0,5 val 1 val 2 val 2+24 val 2+48 val.

Fenol ini ų jung ini ų ki ek is, pr oc.

Maceracijos trukmė, val.

Žievės ėminių fenolinių junginių išeiga Lapų ėminių fenolinių junginių išeiga

10 paveiksle pateikta, kad tuo pačiu metu rinktuose paprastojo ąžuolo žievės mėginiuose, Varėnos miške, Kudirkos Naumiesčio parke bei Kauno Panemunės Šile raugų kiekis aptiktas didesnis – vidurkis

9 pav. Raugų (taninų) kiekio dinamika paprastojo ąžuolo žievės ėminiuose, rinktuose vegetacijos metu Kauno m. Panemunės mikrorajone (proc.)

0 1 2 3 4 5 6 7 2016 07 29 Varėnos miškas 2016 07 29 Alytaus m. parke 2016 07 30 K. Naumiesčio parkas 2016 07 31 Vilnius, prie Gedimino kalno

2016 07 31 Kauno m. Panemunės Šilas R aug ų kiekis proc .

Paprastojo ąžuolo žievės ėminių rinkimo data ir vieta

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 R aug ų kiekis proc .

Paprastojo ąžuolo žievės ėminių rinkimo data Kauno Panemunės mikrorajone

10 pav. Bendrasis raugų (taninų) kiekio įvairavimas paprastojo ąžuolo žievės ėminiuose, rinktuose skirtinguose regionuose (proc.)

6,13 (±0,22) proc., nei tuose mėginiuose, kurie buvo surinkti Alytaus bei Vilniaus miestų centre – vidurkis 5,49 (±0,10) proc.

Rudenėjant, kai paprastasis ąžuolas brandina ir meta giles, pastebimas taninų kiekio padidėjimas, tai leidžia daryti prielaidą, kad augalas bando vykdyti apsaugą nuo žoliaėdžių vabalų, kurie pavasarį galėtų pažeisti augalo lapijos kokybę. [43] Taikant šį tyrimo metodą, negalima spręsti, kurių taninų yra daugiau: elago - ar kondensuotų taninų, tačiau mokslinėje literatūroje minima, kad paprastojo ąžuolo žievėje taninų kiekis turėtų svyruoti nuo 15 iki 20 proc. jaunų medžių žievėje, o senų medžių 5-10 proc.[32; 33] o tirtoje žaliavoje taninų kiekis svyruoja nuo 5,16 (±1,23) iki 9,07 (±0,87) proc. Norėdama įvertinti, ar bendrasis taninų kiekis priklauso nuo paprastojo ąžuolo (Quercus robur L.) žievės ėminių rinkimo laiko, apskaičiuota, jog rezultatai yra statistiškai reikšmingi (p<0,05), taip pat nustatytas stiprus korealiacinis ryšys tarp šių kintamųjų. (R2 _=0,93).

Nustatytas bendras raugų kiekis paprastojo ąžuolo lapų ėminiuose, jų kiekis surinktose žaliavose varijuoja 9,11 (±0,89) – 14,38 (±1,38) proc. ribose. 11 paveiksle matoma, jog bendrasis raugų kiekis ąžuolo (Quercus robur L.) lapų mėginiuose yra didėjo nuo rugpjūčio 15 d. iki spalio 30 d, šiuo laikotarpiu.

Bendrasis vidutinis raugų kiekis augalo lapų ėminiuose yra 13,39 (±0,92) proc., o per visą žaliavos surinkimo laikotarpį, nustatytas vidutinis bendrojo raugų kiekis - 11,70 (±1,68) proc. Gegužės – liepos mėnesiais, ąžuolo lapų ėminiuose esantys raugai net nesiekia apskaičiuoto vidutinio kiekio per visą žaliavos surinkimo laikotarpį.

11 pav. Raugų (taninų) kiekio dinamika paprastojo ąžuolo žievės ėminiuose rinktuose vegetacijos metu (proc.) 0 2 4 6 8 10 12 14 16 2016.05.22 2016.06.10 2016.06.26 2016.07.10 2016.08.15 2016.09.04 2016.09.18 2016.10.02 2016.10.16 2016.10.30 R aug ų kiekis proc .