KARPOTŲJŲ IR PLAUKUOTŲJŲ BERŽŲ LAPŲ IR PUMPURŲ FENOLINIŲ JUNGINIŲ KIEKIO IR ANTIOKSIDANTINIO AKTYVUMO TYRIMAS

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS

FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

KRISTINA MISIŪNAITĖ

KARPOTŲJŲ IR PLAUKUOTŲJŲ BERŽŲ LAPŲ IR PUMPURŲ FENOLINIŲ

JUNGINIŲ KIEKIO IR ANTIOKSIDANTINIO AKTYVUMO TYRIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovė Doc. dr. Lina Raudonė

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS

FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanas: prof., dr. Vitalis Briedis Data

KARPOTŲJŲ IR PLAUKUOTŲJŲ BERŽŲ LAPŲ IR PUMPURŲ FENOLINIŲ

JUNGINIŲ KIEKIO IR ANTIOKSIDANTINIO AKTYVUMO TYRIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas

Doc. dr. Lina Raudonė Data

Recenzentas

Doc. dr. Algirdas Baranauskas Darbą atliko Magistrantė

Kristina Misiūnaitė Data Data

TURINYS

SANTRAUKA ... 5

SUMMARY ... 6

1. SANTRUMPOS ... 7

2. ĮVADAS ... 8

3. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 9

4. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10

4.1. Beržų genties augalų apibūdinimas, paplitimas ir morfologiniai požymiai ... 10

4.2. Karpotųjų ir plaukuotųjų beržų žaliavų kaupiami junginiai ... 13

4.3. Karpotųjų ir plaukuotųjų beržų žaliavų panaudojimas medicinoje ... 13

4.4. Fenoliniai junginiai, jų struktūros ir poveikio ypatumai ... 15

4.5. Laisvieji radikalai, antioksidacinis stresas, antioksidantai ... 16

4.6. Fenolinių junginių struktūros ir aktyvumo ryšys, antioksidacinio poveikio mechanizmai... 18

4.7. Antioksidantinio aktyvumo nustatymo metodai ... 21

5. TYRIMO METODIKA ... 23

5.1. Tyrimo objektas ... 23

5.2. Naudoti reagentai ... 25

5.3. Naudota aparatūra ... 25

5.4. Duomenų statistinis vertinimas ... 26

5.5. Tiriamų mėginių paruošimas ... 26

5.6. Spektrofotometriniai beržų lapų ir pumpurų ekstraktų nustatymo metodai ... 26

5.6.1. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas Folin-Ciocalteu spektrofotometriniu metodu 26 5.6.2. Bendro flavonoidų kiekio nustatymas ... 27

5.6.3. Laisvųjų radikalų surišimo nustatymas ABTS metodu ... 28

5.6.4. Redukcinio aktyvumo nustatymas FRAP metodu ... 29

6. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS... 31

6.1. Suminis fenolinių junginių ir flavonoidų kiekių nustatymas karpotųjų ir plaukuotųjų beržų lapų ekstraktuose ... 31

6.2. Antioksidantinio ir redukcinio aktyvumo nustatymas karpotųjų ir plaukuotųjų beržų lapų ekstraktuose ... 34

6.3. Suminių fenolinių junginių ir flavonoidų kiekių nustatymas beržų pumpurų ekstraktuose37 6.4. Antiradikalinio ir redukcinio aktyvumo nustatymas beržų pumpurų ekstraktuose ... 38

6.5. Beržų lapų ir pumpurų ekstraktų fenolinių junginių kokybinės ir kiekybinės sudėties ESC

tyrimas ... 40

6.6. Beržų lapų suminio fenolinių junginių ir flavonoidų kiekio, antioksidantinio, redukcinio aktyvumo pasiskirstymo skirtingose augavietėse klasterinės analizės dendrogramos ... 43

6.7. Beržų pumpurų suminio fenolinių junginių ir flavonoidų kiekio, antioksidantinio, redukcinio aktyvumo pasiskirstymo skirtingose augavietėse klasterinės analizės dendrogramos . 46 7. APIBENDRINIMAS ... 49

8. IŠVADOS ... 50

9. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 51

10. LITERATUROS SĄRAŠAS... 52

SANTRAUKA

K. Misiūnaitės magistro baigiamasis darbas/ mokslinė vadovė doc. dr. L. Raudonė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmacijos fakulteto Farmakognozijos katedra. – Kaunas.

Pavadinimas: Karpotųjų ir plaukuotųjų beržų lapų ir pumpurų fenolinių junginių kiekio ir

antioksidantinio aktyvumo tyrimas.

Raktiniai žodžiai: Beržas, Betula L., fenoliniai junginiai, Folin – Ciocalteu, spektrofotometrinis

tyrimas, ABTS, FRAP.

Darbo tikslas: Nustatyti karpotųjų beržų (Betula pendula Roth.) ir plaukuotųjų beržų (Betula

pubescens Ehrh.) lapų ir pumpurų fenolinių junginių kiekybinę, kokybinę sudėtį ir antioksidantinį

aktyvumą.

Darbo uždaviniai: Įvertinti suminį fenolinių junginių ir bendrą flavonoidų kiekį Betula L. lapuose

ir pumpuruose; ABTS metodu ištirti žaliavų antioksidantinį aktyvumą; nustatyti žaliavų redukcinį aktyvumą FRAP metodu; efektyviosios skysčių chromatografijos metodu įvertinti Betula L. lapų ir pumpurų fenolinių junginių kokybinę ir kiekybinę sudėtį.

Tyrimo objektas ir metodika: karpotųjų ir plaukuotųjų beržų, augančių skirtingose augavietėse,

lapai ir pumpurai. Fenolinių junginių suminis kiekis nustatomas Folin – Ciocaleu metodu; kokybinė ir kiekybinė sudėtis – efektyviosios skysčių chromatografijos metodu (ESC). Antioksidantinis aktyvumas įvertintas ABTS ir FRAP spektrofotometriniais metodais.

Rezultatai: Suminis fenolinių junginių kiekis B. pendula lapų ėminiuose įvairuoja atitinkamai -

35,31 ± 0,55 - 57,11 ± 0,86 mg/g, pumpuruose - 61,47 ± 0,64 - 94,7 ± 0, 85 mg/g; B. pubescens lapų ėminiuose - 52,11 ± 0,92 - 86,42 ± 0,94 mg/g, pumpuruose -72,18 ± 1,4 - 118,53 ± 0,6 mg/g. Betula L. pumpuruose nustatytas didesnis (p<0,05) bendras flavonoidų kiekis lyginant su Betula L. lapais. ESC metodu nustatyti šie junginiai: chlorogeno ir neochlorogeno rūgštys, hiperozidas, kvercitrinas, avikuliarinas, astragalinas, kempferolio gliukuronidas, akacetinas. B. pendula lapuose nustatyti dominuojantys junginiai - hiperozidas (8,54 ± 0,42 mg/g) ir chlorogeno rūgštis (4,95 ± 0,13 mg/g), B. pubescens lapuose – chlorogeno rūgštis (6,39 ± 0,23 mg/g), akacetinas (3,25 ± 0,17 mg/g). Betula L. pumpuruose nustatytas didesnis (p<0,05) antioksidantinis ir redukcinis aktyvumas nei lapuose.

SUMMARY

K. Misiūnaitė master’s thesis/ supervisor doc. dr. L. Raudonė; Lithuanian University of Health Sciences Faculty of pharmacy Department of Pharmacognosy. – Kaunas

Title: Research on phenolic compounds and antioxidant activity in Betula L. leaves and buds. Keywords: Birch, Betula L., phenolic compounds, Folin – Ciocalteu, spectrophotometry, ABTS,

FRAP.

The aim: To determine total content of phenolic compounds in birch (Betula pendula Roth. and

Betula pubescens Ehrh.) leaves and buds and to evaluate antioxidant activity.

Tasks: to determine total content of phenolic compounds and total amounts of flavonoids in leaves

and buds of Betula L., to determine antioxidant activity using ABTS, to estimate reducing activity using FRAP, to determine qualitative and quantitative composition of phenolic compounds using HPLC.

Objects and methods of the study: Research object - leaves and buds of Betula L.; the total

amount of total phenolic compounds in leaves and buds of Betula L. was determined using Folin – Ciocalteu spectrophotometric method; qualitative and quantitative composition of phenolic compounds was determined using HPLC; antioxidant activity was determined using spectrophotometric methods ABTS for radical scavenging and FRAP for reducing activity.

Results: The total determined amounts of phenolic compounds in B. pendula leaves were in a

range of - 35,31 ± 0,55 - 57,11 ± 0,86 mg/g, in buds - 61,47 ± 0,64 - 94,7 ± 0, 85 mg/g; in B. pubescens leaves - 52,11 ± 0,92 - 86,42 ± 0,94 mg/g, in buds - 72,18 ± 1,4 - 118,53 ± 0,6 mg/g. The greatest total amounts of flavonoids was determined in Betula L. buds. Chlorogenic and neochlorogenic acid, hyperoside, quercitrin, avicularin, keampferol-glucuronide, astragalin, acacetin were identified and quantified in leaves and buds of Betula L. Hyperoside and chlorogenic acid were predomonant compounds in the leaves of B.

pendula and its values were determined - 8,54 ± 0,42 mg/g (hyperoside); 4,95 ± 0,13 mg/g (chlorogenic

acid). Chlorogenic acid and acacetin were predomonant compounds in the leaves of B. pubescens and its values were determined – 6,39 ± 0,23 mg/g (chlorogenic acid); 3,25 ± 0,17 mg/g (acacetin). Radical scavenging and reducing activites were greater in Betula L. buds compared with leaves.

1. SANTRUMPOS

ABTS – 2,2„-azino-bis-(3-etilbenztiazolino-6-sulfono rūgštis)

CRAC – tai elektrocheminis metodas, kuris nustato oksiduotų cerio (𝐶𝑒4+) jonų sunaudojimą

CUPRAC – vario jonų redukcijos antioksidantinė galia (ang. cupric Reducing Antioxidant Capacity)

DPPH - 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo laisvasis radikalas

ESC – efektyvioji skysčių chromatografija

FRAP – geležies redukcijos antioksidacinė galia (angl. ferric reducing antioxidant power)

GAE – galo rūgšties ekvivalentai (angl. gallic acid equivalents)

HAT – vandenilio atomo atidavimas (angl. hydrogen atom transfer)

ORAC - deguonies radikalų absorbcijos galia (angl. oxygen radical absorbance capacity)

QE - kvercetino ekvivalentas (angl. ąuercetin equivalent)

RNS – reaktyviosios azoto formos (angl. reactive nitrogen species)

ROS – reaktyviosios deguonies formos (angl. reactive oxygen species)

SET–laisvo elektrono prisijungimas (angl. single electron transfer)

TE – troloksui ekvivalentiška antioksidantinė galia (ang. trolox equivalent antioxidant capacity)

TRAP - bendro radikalų gaudyklės parametro nustatymas

2. ĮVADAS

Pаsаulinė sveikаtos organizаcija nustаtė, jog vidutiniškаi 3300 milijonаi žmonių reguliаriai gydosi vаrtodаmi vаistines аugаles žaliavas ir iš jų pagamintus preparatus. Vаistinių аugalų žaliavų poreikis аugа, todėl jų žaliavų kokybės užtikrinimui yra svаrbu аtlikti kаupiamų veikliųjų cheminių junginių sudėties ir kiekio nustаtymo tyrimus [1]. Biologiškаi аktyvių junginių kiekis аugаlų žаliаvose kintа priklаusomai nuo аplinkos sąlygų ir augаlo vystymosi stаdijų. Tikslingа ištirti, kuriose аugаvietėse vаistiniai аugalai kаupia didžiаusius kiekius veikliųjų cheminių junginių [2]. Svаrbu surinkti vаistinių augalų žаliаvаs optimаliu lаiku, kai jos yra sukаupę didžiаusius kiekius biologiškаi аktyvių junginių [1].

Beržų lаpаi ir pumpurаi yra vаrtojami šlаpimo tаkų ligų, infekcijų ir uždegimų gydymui [3]. Įvаirių tyrimų metu tirtаs skirtingų beržų rūšių lapų аntioksidantinis aktyvumаs, fitocheminė sudėtis, skirtingų žаliаvų (lаpų, vidinės ir išorinės žievės, pumpurų) аntimikrobinis аktyvumаs [4-7]. Beržų žаliavų ekstrаktai ir iš jų išskirti junginiai pаsižymi uždegimą slopinаnčiu, аntimikrobiniu, аntivirusiniu, аntioksidantiniu, skrandžio gleivinę аpsaugančiu, imunomoduliаciniu ir аntidiabetiniu poveikiais in vivo ir in vitro [6]. Fаrmаkologiniu аktyvumu pаsižymi beržų žаliаvose fitocheminės аnаlizės metu nustаtyti junginiai: flаvonoidаi, fenolinės rūgštys, eterinio аliejaus komponentаi ir kiti junginiai. Fenoliniai junginiai pаsižymi аntioksidantinėmis ir rаdikаlus sujungiаnčiomis savybėmis, kurios priklauso nuo jų cheminės struktūros. Augаlаi, kаupiantys fenolinius junginius, gаli аpsaugoti žmogаus organizmą nuo oksidаcinio streso, kurį skаtina lаisvieji rаdikаlаi [3]. Fenoliniаi junginiаi įvairiais mechanizmais trukdo lаisviesiems rаdikаlаms formuotis ir blokuojа tolimesnes jų reаkcijаs [7]. Skirtingose augаvietėse surinktų beržų žаliavų cheminė sudėtis skiriаsi, nes biologiškаi аktyvių junginių kiekis priklаuso nuo įvairių fаktorių: аugalo ontogenezės ir genotipo, dirvožemio mаistingumo, žolėdžių skаičiaus, UV rаdiаcijos, oro temperаtūros, kritulių [8-9].

Mokslinio darbo naujumas. Pirmą kartą įvertintas Lietuvoje augančių plaukuotųjų ir karpotųjų

beržų pumpurų bendras fenolinių junginių kiekis, suminis flavonoidų kiekis, nustatytas antioksidantinis aktyvumas, fitocheminė sudėtis.

Darbo tikslas - nustatyti karpotųjų beržų (Betula pendula Roth.) ir plaukuotųjų beržų (Betula

pubescens Ehrh.), augančių skirtingose augavietėse, lapų ir pumpurų fenolinių junginių kiekybinę, kokybinę

3. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas - nustatyti karpotųjų beržų (Betula pendula Roth.) ir plaukuotųjų beržų (Betula

pubescens Ehrh.), augančių skirtingose augavietėse, lapų ir pumpurų fenolinių junginių kiekybinę,

kokybinę sudėtį ir antioksidantinį aktyvumą.

Darbo uždaviniai:

1. Nustatyti natūraliose augavietėse surinktų karpotųjų beržų (Betula pendula) ir plaukuotųjų beržų (Betula pubescens) lapų bendrą fenolinių junginių ir flavonoidų sudėtį ir jos įvairavimą skirtingu metų laiku (rudenį ir pavasarį).

2. Nustatyti natūraliose augavietėse surinktų karpotųjų (Betula pendula) ir plaukuotųjų (Betula

pubescens) beržų pumpurų bendrą fenolinių junginių ir flavonoidų sudėtį.

3. Nustatyti natūraliose augavietėse surinktų karpotųjų beržų (Betula pendula) ir plaukuotųjų beržų (Betula pubescens) lapų ir pumpurų antiradikalinį aktyvumą taikant ABTS radikalų katijonų surišimo spektrofotometrinį metodą.

4. Nustatyti natūraliose augavietėse surinktų karpotųjų beržų (Betula pendula) ir plaukuotųjų beržų (Betula pubescens) lapų ir pumpurų redukcinį aktyvumą taikant FRAP spektrofotometinį metodą.

5. Nustatyti natūraliose augavietėse surinktų karpotųjų beržų (Betula pendula) ir plaukuotųjų beržų (Betula pubescens) lapų ir pumpurų fenolinių junginių kokybinę ir kiekybinę sudėtį efektyviosios skysčių chromatografijos metodu.

4. LITERATŪROS APŽVALGA

4.1. Beržų genties augalų apibūdinimas, paplitimas ir morfologiniai požymiai

Pasaulyje yra žinoma daugiau nei 140 beržų rūšių, vien Europoje - daugiau kaip 65 beržų rūšys [6, 10]. Lietuvoje natūraliai yra paplitusios keturios beržų rūšys: liekninis beržas, beržas keružis, karpotasis beržas ir plaukuotasis beržas, iš kurių vyrauja karpotasis beržas (Betula pendula Roth, angl. Silver birch) [11].

Svarbios beržų rūšys, karpotasis ir plaukuotasis beržai, yra plačiai paplitusios Europos ir Azijos žemynuose, driekiasi nuo Atlanto iki rytų Sibiro. Gausiausi beržų ištekliai yra vidutinių platumų ir šiaurės miškuose šiaurės Europoje (1 pav.). Pietų Europoje daugiausia pasitaiko kalnuotose vietovėse, nes sunkiai toleruoja ilgai besitęsiančias vasaros sausras. Šiaurės Europos šalyse beržų suminis kiekis yra nuo 11 iki 16 proc.; Baltijos šalyse – 17 – 28 proc. [12]. Lietuvoje beržynai užima 19,99 proc. medynų ploto [13].

1 pav. Beržų rūšių pasiskirstymas pasaulyje [6]

Plaukuotasis beržas (Betula pubescens Ehrh, angl. Downy birch) auga durpynuose ir skurdžiose sausose dirvose; karpotasis beržas auga daugiausiai drėgnose ir derlingose dirvose, apleistuose, medžiais apaugusiuose laukuose. Jis dažniausiai aptinkamas įvairiose vietovėse, ypač spygliuočių miškuose [10]. Karpotųjų beržų sparčiam augimui labai svarbu yra pakankamas drėgmės kiekis ir oro sudėtis [14]. Esant geroms aplinkos sąlygoms per 30 metų beržai gali pasiekti 24 - 25 m aukštį. Esant skurdžiam dirvožemiui per 30 metų beržai paauga tik 6 m. Beržai įprastai gyvena 90 - 100 metų, kartais iki 150 metų [6].

Beržai dažniausiai turi baltą žievę. Lapai – ištisiniai, paprasti, pražanginiai, dantyti. Pumpurai padengti žvyneliais. Vaisiai – lengvi, vienasėkliai, sparnuoti riešutėliai, kurie vasarą yra išbarstomi pučiant vėjui [11]. Žiedai – vienalyčiai, vėjo apdulkinami žirginiai. Kuokeliniai žirginiai dažniausiai

išsidėstę po keletą, nusvirę, ilgi. Piesteliniai žirginiai smulkesni, trumpesni, labiau išlenkti, kabantys, susiformuoja jaunų lapų pažastyse [13, 15]. Dažniausiai yra sunku atskirti karpotąjį ir plaukuotąjį beržus. Jų morfologinių požymių skirtumai ir panašumai pateikti 1 lentelėje.

1 lentelė. Karpotojo ir plaukuotojo beržų morfologinių požymių palyginimas [12]

Vertinimo kriterijus Karpotasis beržas Plaukuotasis beržas

Medžio aukštis Iki 30 m Iki 25 m

Pumpurai Nelipnūs arba tik šiek tiek lipnūs Lipnūs

Chromosomų rinkinys 2n (28 chromosomos) 4n (56 chromosomos)

Lapai Nuo plataus trikampio iki rombo

formos, be plaukelių, dvigubai dantytais kraštais. Turi ploną lapkotį.

Apvalesnio ar ovalesnio trikampio formos, turi plonesnį lapkotį. Lapo kraštas taip pat dantytas, tačiau ne dvigubai.

Žievė Žievė dažniausiai yra giliai

sutrūkinėjusi, tamsi ir šiurkšti.

Žievė yra šiek tiek lygesnė, ne tokia šiurkšti ir mažiau sutrūkinėjusi

Šakos Lygios (be plaukelių), su sakingomis išaugomis bei dažniausiai gausybe lenticelių.

Su plaukeliais, be sakingų išaugų ir turi kelias arba išvis neturi lenticelių.

Beržų identifikavimui gali būti naudojami įvairūs metodai: anatominiai, biocheminiai, morfologiniai, genetiniai, fiziologiniai, žiedadulkių metodai [16]. Vienas iš patikimiausių ir paprastai atliekamų yra cheminis ir morfologinis metodai [12]. Beržų rūšių identifikavimo metodas, paremtas cheminėmis beržų žievės savybėmis, buvo atrastas Švedijoje [17]. Šio metodo metu vidinėje beržo žievėje esantys gliukozidai - platifiliozidai reaguoja su 1,4-dinitrofenilhidrazino reagentu. Karpotojo beržo vidinėje žievėje yra daugiau gliukozidų nei plaukuotojo beržo žievėje, todėl tik karpotojo beržo žievės gabaliukai reaguoja su reagentu ir įvykus reakcijai iškrinta oranžinės spalvos nuosėdos (2 pav) [16].

2 pav. Vidinės beržo žievės gabaliukų reakcija su 1,4-dinitrofenilhidrazino reagentu (1, 2, 4, 5 mėgintuvėliuose karpotojo beržo žievės gabaliukai, 3 – plaukuotojo, 6 – reagentas palyginimui)

4.2. Karpotųjų ir plaukuotųjų beržų žaliavų kaupiami junginiai

Skirtingos beržų rūšys aprašytos įvairių šalių farmakopėjose: Rusijos, Prancūzijos, Europos, Vokietijos, Jugoslavijos ir Indijos farmakopėjose [6, 18]. Europos farmakopėjoje aprašyta vaistinė augalinė žaliava - plaukuotųjų ir karpotųjų beržų išdžiovinti lapai arba jų gabaliukai. Europos farmakopėjoje teigiama, jog lapai turi turėti ne mažiau nei 1,5 % flavonoidų, perskaičiuotų pagal hiperozido kiekį [19].

Fenoliniai junginiai. Nustatyta, jog abiejų rūšių beržų lapai kaupia fenolinius junginius: 3,4‘

– dihidroksipropiofenono 3-glikozidą, kavos rūgštį ir chlorogeno rūgštį, neochlorogeno rūgštį [20].

Flavonoidai. Beržų lapuose nustatyti 1,96-5,56 proc. flavonoidų, iš kurių pagrindiniai yra

kvercetinas, miricetino ir kempferolio glikozidai. Kiti flavonoidai, kuriuos kaupia karpotojo ir plaukuotojo beržų lapai yra hiperozidas (kvercetino-3-O-galaktozidas), avikuliarinas, kvercitrinas. Abiejų rūšių beržų lapai kaupia flavonus: akacetiną ir apigeniną [6]. Karpotųjų beržų pumpurai, priešingai, nei lapai kaupia mažiau flavonoidų. Juose nustatyti flavonoidai: apigeninas, izorhamnetinas, kempferolis, kvercetinas [3]. Išorinėje beržo žievėje nustatyta 0,05 proc. flavonoidų [21].

Eterinio aliejaus komponentai. Beržų lapai kaupia apie 0,05 – 0,1 proc. eterinio aliejaus,

kuriame nustatyta α-pinenas, bornilo acetatas [20]. Beržų pumpuruose eterinio aliejaus kiekis didesnis - nuo 0,2 iki 6,25 proc – jame nustatyta daugiau nei 50 įvairių junginių. Pagrindiniai komponentai yra α -kopaenas, δ-kadinenas ir germakrenas [3]. Vidinėje beržo žievėje nustatyta 0,052 proc. eterinių aliejų [21]. Pagrindiniai eterinio aliejaus, gauto iš vidinės karpotųjų beržų žievės, komponentai yra α-santalenas ir trans α-bergamotenas [22].

Triterpeniniai junginiai. Vieni iš svarbiausių junginių, kuriuos kaupia beržų lapai yra

betulinolis ir betulinino rūgštis, kurie priskiriami pentacikliniams lupano triterpenoidams [6]. Vidinėje beržų žievėje betulino, betulinolio aldehido ir betulino rūgšties kiekis yra nuo 1,8 iki 14 proc. [21].

Vitaminai. Beržų lapuose ir pumpuruose nustatyta askorbo ir nikotino rūgštys, karotenai [6]. Riebalų rūgštys. Beržų pumpuruose nustatyta linolo, linoleno ir palmitino rūgštys; palmitino

rūgštis taip pat nustatyta ir vidinėje beržų žievėje [21].

Biologiškai aktyvių junginių kiekis аugаluose priklаuso nuo аplinkos sąlygų: šviesos, tаršos, drėgmės ir kt. [23]. Sausros metu kaupiamas mažesnis fenolinių junginių kiekis [3].

4.3. Karpotųjų ir plaukuotųjų beržų žaliavų panaudojimas medicinoje

Beržų pumpurų nuovirai ir užpilai yra naudojami stomatologijoje ir otolaringologijoje, kadangi pasižymi uždegimą mažinančiomis savybėmis, gydo stomatitą, periodontitą, gingivitą, glositą, tonzilitą, gerklės skausmą. Beržų pumpurų vartojimas gydymui yra saugus, netoksiškas [18].

Beržų lapų ekstraktai dažnai yra odai skirtų kosmetinių priemonių sudedamoji dalis. Germanò et al. (2012) tyrė karpotųjų beržų etanolinio ekstrakto gebėjimą paveikti grybų tirozinazės aktyvumą. Tirozinazė yra vario turintis fermentas katalizuojantis monofenolių ir 0-difenolių oksidaciją melanino biosintezės pirmoje stadijoje. Tyrimo rezultatai parodė, jog karpotųjų beržų etanolinis ekstraktas slopina nuo dozės priklausomą L-dopa oksidaciją, kurią katalizuoja tirozinkinazė. Kadangi ekstraktai inhibuoja tirozinazes, jie gali būti naudojami žmogaus odos lokalizuotų hiperpigmentacijų gydymui [24]. Hyuke et al. (2006) tyrė beržų žievės tepalo gydomąjį poveikį aktininei keratozei. Tyrime dalyvavo 28 pacientai, iš kurių 14 buvo gydomi tik beržų žievės tepalu. Likusiems pacientams buvo taikomas kombinuotas gydymas, į kurį taip pat įėjo beržų žievės tepalas. Praėjus 2 mėn. 79 proc. pacientų, kurie buvo gydyti tik beržo žievės tepalu, keratozės pažeidimai sumažėjo daugiau nei 75 proc. arba visai išnyko. Keratozes gydančiu poveikiu labiausiai pasižymi betulinas, kurio tiriamajame tepale buvo net 80 proc, betulino rūgštis (3 proc.), oleanolio rūgštis (1 proc.) ir lupeolis (2 proc.) [25].

Germanò et al. (2013) nustatė, jog metanolinis karpotųjų beržų lapų ekstraktas pasižymi skrandžio gleivinę apsaugančiu ir skrandžio opas gydančiu poveikiais. Tyrimo metu panaudojant 90 proc. etanolį žiurkėms buvo sukeltos opos. Gyvūnėliams buvo duodami 100, 200 ir 400 mg/𝑘𝑔−1 metanoliniai karpotųjų beržų lapų ekstraktai, iš kurių stipriausiu skrandžio gleivinę apsaugančiu poveikiu pasižymėjo 400 mg/𝑘𝑔−1_{ekstraktas. Mokslininkai taip pat nustatė, jog karpotųjų beržų} ekstraktų skrandžio opas gydantis poveikis susijęs su lipidų peroksidacijos procesų inhibacija ir sulfhidrilinių jungčių kiekio skrandžio gleivinėje atkūrimu [26].

Karpotųjų beržų lapų ekstraktas yra vartojamas reumatoidinio artrito ir osteoartrito gydymui. Aktyvūs limfocitai yra vieni iš svarbiausių veiksnių dalyvaujančių reumatoidinio artrito patogenezėje, todėl Gründemann et al. (2011) tyrinėjo vandeninio karpotųjų beržų lapų ekstrakto antiproliferacinį aktyvumą pries žmogaus limfocitus in vitro. Apoptozė buvo analizuojama stebint fosfatidilsterinų paviršiaus nusidažymą ir viduląstelinę kaspazės - 3 ir kaspazės - 7 aktyvaciją ir lyginami su vaistu metotreksatu naudojant tėkmės citometrijos ir fotometrijos metodus. Tirtų beržų lapų ekstraktai inhibavo augimą ir ląstelių dalijimąsi CD8+ limfocitai: 40 g/ml: 45 proc.; 80 g/ml: 60 proc.; 160 g/ml: 87 proc.; CD4+: 40 g/ml: 33 proc.; 80 g/ml: 54 proc.; 160 g/ml: 79 proc.. Limfocitų proliferacijos inhibavimas lyginant su kontroline grupe, kuri iš viso nebuvo gydoma: 40 g/ml: 163 proc.; 80 g/ml: 240 proc.; 160 g/ml: 348 proc. Nustatyta, jog karpotųjų beržų lapų ekstraktai gali sumažinti imuninių susirgimų, tokių kaip reumatoidinio artrito požymius, susilpnindami limfocitų proliferaciją [27].

Metanoliniai karpotųjų beržų pumpurų, lapų, žiedų, žievės ekstraktai buvo tyrinėjami dėl jų antibakterinio aktyvumo prieš gramneigiamas bakterijas, Escherichiacoli ir Pseudomonas aeruginosa ir gramteigiamas bakterijas, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus. Prieš bacillus subtilis buvo aktyvūs vidinės žievės, žiedų ir pumpurų ekstraktai; prieš Pseudomonas aeruginosa – vidinės žievės, lapų, žiedų ir pumpurų ekstraktai [5].

Bljajić et al. (2016) tyrė karpotųjų beržų etanolinio ir vandeninio ekstraktų gebėjimus inhibuoti karbohidratus hidrolizuojančius fermentus ir atkurti glutationo koncentraciją dėl hiperglikemijos atsiradusių oksidaciniu stresu paveiktose Hep G ląstelėse. Glutationas - vienas iš svarbiausių ląstelių antioksidantų, kuris apsaugo ląsteles nuo deguonies ir azoto laisvųjų radikalų. Neįprastai žemas glutationo kiekis ląstelėse gali sukelti 𝛽 ląstelių disfunkciją ir paskatinti cukrinio diabeto patogenezės procesus. Nustatyta, jog karpotųjų beržų etanolinis lapų ekstraktas efektyviai padidino glutationo kiekį ir inhibavo 𝛼-glukozidazę [28].

4.4. Fenoliniai junginiai, jų struktūros ir poveikio ypatumai

Fenoliniаi junginiаi – аugаluose plаčiai paplitę аntriniаi metаbolitаi, turintys vieną ar kelis аromаtinius žiedus su prijungtomis hidroksilo grupėmis ir pаsižymintys fаrmаkologiniu аktyvumu [29], [30]. Apskaičiuotа, jog iš viso egzistuojа 100000 - 200000 аntrinių metabolitų, o fenoliniаi junginiаi yra vienа iš gаusiаusiаi pаplitusių аntrinių metаbolitų klаsių gаmtoje [31]. Jie skirstomi į flаvonoidus ir neflаvonoidų fenolinius junginius, kuriems priskiriаmi tаninаi, fenolinės rūgštys ir rečiau pаsitaikantys junginiai - stilbenаi, lignаnаi [29, 32].

Dаuguma fenolinių junginių pagаminama iš аminorūgščių fenilаlanino ir tirozino [31]. Susintetinti fenoliniаi junginiаi yra svаrbūs аugаlams, nes аpsaugo juos nuo mikroorgаnizmų, pаtogenų ir vаbzdžių; suteikiа unikаlų skonį, kvаpą, аpsaugo chloroplаstus nuo аrdomojo šviesos poveikio аbsorbuodаmi didelį kiekį energijos [4, 31]. Fenoliniаi junginiаi pаsižymi įvairiаis poveikiais ir biologinėse sistemose. Jie pasižymi uždegimą mаžinаnčiu, аntioksidаntiniu, citotoksiniu, vėžį slopinаnčiu ir depresiją mаžinаnčiu poveikiаis [30]. Fenolinių junginių аktyvumui yra svаrbios hidroksilo grupės, juo jų dаugiau, tuo junginys pаsižymi stipresniu аntimikrobiniu poveikiu. Fenolinių junginių аntimikrobinis poveikis pаsireiškiа dėl fermentų slopinimo, reаkcijų su sulfhidrilinėmis grupėmis arbа dėl nespecifinių reаkcijų su bаltymais [4]. Fenoliniаi junginiai dėl savo struktūros ypаtumų: hidrofobinių benzeno žiedų, fenolinių grupių vаndenilių gebа stipriаi sąveikаuti su bаltymаis. Tаi ypač svаrbu jų gebėjimui inhibuoti fermentus, tokius kaip įvairios citochromo P450 izoformos, ciklooksigenаzė, ksаntino oksidаzė, lipoksigenаzės. Dėl hidroksilinių grupių fenoliniai junginiаi tаip pаt pаsižymi аntioksidantinėmis sаvybėmis.Tаi svаrbu siekiаnt išvengti oksidаcinio streso [33].

Flаvonoidаi – fenoliniai junginiаi, аugalų аntriniаi metаbolitаi, kurių pаgrindinę cheminę struktūrą sudаro flаvano brаnduolys iš 15 аnglies аtomų, išsidėsčiusių trijuose A, B, C žieduose (3 pav.) [32].

3 pav. Flаvonoidų struktūra [34]

Šiuo metu yra išskirtа ir identifikuotа apie 9000 flаvonoidų junginių, kurie аptinkаmi аugaluose. Pаgal centrinio аnglies аtomo oksidаcijos lаipsnį flаvonoidаi skirstomi į šešiаs grupes: flаvonolius, flаvonus, izoflаvonus, flаvononus, flаvаn-3-olius, аntocianidinus [31]. Flаvonoidаi аugaluose dаžniausiаi sutinkаmi glikozidų formomis, nes glikozidinti junginiаi yra geriau tirpūs vаndenyje, todėl gali būti kаupiami аugalų ląstelių vаkuolėse [35].

Flаvonoidаi pаsižymi teigiаmаis poveikiais žmogаus sveikаtаi. Jie mažina gliukozės ir lipidų koncentraciją žmogаus krаujyje, pаsižymi аntimikrobiniu аktyvumu, mаžina uždegimą, skirtingаis mechаnizmais slopina vėžį: reguliuoja ląstelių dalijimąsi ir аugimą, аuglio formąvimąsi, imuninės sistemos аktyvumą, hormonų metаbolizą ir kitus procesus [7, 36, 37]. Flаvonoidų slopinamąjį vėžio poveikį įrodo аtlikti tyrimai: 2009 m. JAVmokslininkų atlikto tyrimo rezultаtai parodė, jog kempferolis inhibavo kiаušidžių vėžio ląstelių linijų аugimą [38], 2013 m. Kinijos mokslininkų atlikto tyrimo rezultаtai pаrodė, jog kvercetinas sukėlė MCF-7 krūties vėžio ląstelių linijų аpoptozę ir inhibavo tų pačių ląstelių linijų proliferaciją [39].

Flаvonoidаi slopinа uždegimą per keletą mechаnizmų: jie pаsižymi аntioksidаntinėmis savybėmis ir surišа lаisvuosius rаdikalus, reguliuoja uždegimo apimtų ląstelių аktyvumą, moduliuoja genų ekspresiją, moduliuojа аrаchidono rūgšties metabolizmo fermentų, tokių kaip ciklooksigenаzės, lipooksigenаzės ir pan., аktyvumą [7].

4.5. Laisvieji radikalai, antioksidacinis stresas, antioksidantai

Laisvieji radikalai – molekulės, kurios turi vieną ar daugiau nesuporuotų elektronų išoriniame sluoksnyje. Jie yra chemiškai aktyvūs ir nestabilūs, todėl dažniausiai veikia susidarymo vietoje. Reaktyviausi yra deguonies ir azoto radikalai [40-41].

Reaktyvios azoto ir deguonies formos ląstelėje gali susidaryti dviem būdais: fermentinėmis ir nefermentinėmis reakcijomis. Fermentinės reakcijos apima tokius procesus kaip fagocitozė, prostaglandinų sintezė, citochromo P450 sistemos procesai, kvėpavimo grandinė. Superoksidas (•O¯2) pasigamina, kai prie deguonies prisijungia vienas elektronas veikiant

dihidronikotinamidoadeninodinukleotidofosfato (NADPH) oksidazei, ciklooksigenazei, ksantino oksidazei. Hidroksilo radikalas (OH•) yra aktyviausias radikalas in vivo. Nitrito oksido radikalas pagaminamas biologiniuose audiniuose iš L-arginino oksidacijos metu veikiant nitrito oksido sintazei [42]. Nefermentiniu būdu laisvieji radikalai gali būti pagaminami reakcijų metu, kai deguonis reaguoja su organiniais junginiais, kurie sužadina jonizuojančią radiaciją arba aerobinio kvėpavimo metu mitochondrijose [43]. Išoriniai šaltiniai taip pat skatina reaktyvių deguonies formų gamybą. Pernelyg didelis laisvųjų radikalų kiekis gaminasi į organizmą patenkant toksinams ar teršalams, sunkiesiems metalams. Egzogeniniams toksinams taip pat priskiriami vaistai nuo vėžio ir skausmo; anestetikai. Endogeniniai toksinai gali būti pagaminti bakterijų, parazitų, virusų ir grybelių. Toksinų atsiradimui svarbūs ir šie veiksniai: traumos, elektromagnetinis laukas, cigarečių rūkymas, šaltis, alkoholio ir vaistų vartojimas, alergenai, intensyvios treniruotės, stresas ir kt. [44]. Nedidelė laisvųjų radikalų koncentracija būtina ląstelės funkcijoms palaikyti, kadangi laisvieji radikalai dalyvauja kaip antriniai signalo perdavėjai, lygiųjų raumenų ląstelėse susidaręs azoto oksidas dalyvauja reguliuojant kraujo spaudimą, leukocituose susidaręs vandenilio peroksidas, hipochlorito rūgštis yra aktyvūs ir stiprūs oksidatoriai, nukenksminantys mikroorganizmus [43, 45]. Per didelė laisvųjų radikalų gamyba, kuri atsiranda dėl mitochondrijų elektronų transporto grandinės arba pernelyg didelio NAD(P)H stimuliavimo, skatina oksidacinį stresą, kuris gali pažeisti ląstelių struktūras: membranas, baltymus, lipidus, DNR ir kt.

Laisvieji deguonies radikalai gali pažeisti DNR sudėtyje esančius fosfatus, purino ir pirimidino bazes arba cukrus. Laisvųjų radikalų nulemtos reakcijos gali sukelti struktūrinius DNR pakitimus: bazių porų mutacijas, intarpų susidarymą, delecijas, DNR sekos padidėjimą, persitvarkymą. Bazių praradimas lemia įvairių naujų produktų, tokių kaip timino glikolio, hidroksimetilšlapalo susidarymą [46]. Nors lipidų peroksidacija pažeidžia daugumą ląstelių komponentų, svarbiausios yra nesočios riebalų rūgštys. Membranoje esančių riebiųjų rūgščių ir cholesterolio peroksidacija pakeičia ląstelės membranos pralaidumą įvairioms medžiagoms ir ląstelė gali žūti. Laisvieji radikalai gali inaktyvuoti ir denatūruoti svarbius organizmo baltymus, ypač amino rūgštis, kurios turi sulfitinių jungčių (metioniną ir cisteiną). Kuomet inaktyvuojami membranos baltymai, sutrinka medžiagų pernaša. Dažniausiai pažeidžiami šie baltymai: kalmodulinas, gliukozės – 6 – fosfatato dehidrogenazė, gliceraldehido – 3 – fosfato dehidrogenazė, kalcio ATP – azė [47]. Laisvieji radikalai skatina onkogeninio fenotipo vėžinių ląstelių formavimąsi; ląstelių senėjimą, apoptozę [43].

Ląstelės geba apsisaugoti nuo laisvųjų radikalų poveikio. Jų perteklių neutralizuoja endogeninė antioksidacinė sistema [48-49]. Apsauginį vaidmenį atlieka fermentiniai antioksidantai: glutationo peroksidazė, gliukozės-6-fosfatazės dehidrogenazė, superoksido dismutazė, gliutationas bei nefermentiniai antioksidantai. Jie visi paverčia laisvuosius radikalus į mažiau reaktyvias molekules [50]. Nefermentiniai antioksidantai yra skirstomi į vidinius antioksidantus, kurie gaminasi organizme medžiagų apykaitos metu: glutationas, melatoninas, L-argininas, bilirubinas, transferinas ir kt., ir

išorinius, kurie gaunami su maistu: vitaminas E, flavonoidai, omega-3 ir omega-6 riebiosios rūgštys, vitaminas C, karotenoidai ir kt. [51].

Kai susiformuoja labai didelis laisvųjų radikalų kiekis, kurio nebesujungia antioksidacinė sistema, jie kaupiasi organizme ir sukelia oksidacinį stresą, kurio lygis nustatomas išmatavus laisvųjų radikalų koncentraciją [50]. Oksidacinis stresas yra svarbus veiksnys, kuris skatina įvairių būklių ir susirgimų, tokių kaip uždegimas, autoimuninis susirgimas, katarakta, vėžys, Parkinsono liga, hipertenzija, cukrinis diabetas, reumatoidinis artritas, aterosklerozė, atsiradimą [43, 52].

Norint išvengti oksidacinio streso, reikia vartoti pakankamai antioksidantų. Antioksidantai - specifiniai junginiai, kurie trukdo laisviesiems radikalams formuotis bei blokuoja tolesnes laisvųjų radikalų reakcijas, saugo žmogaus, gyvūnų ir augalų ląsteles nuo žalojančio laisvųjų radikalų poveikio [32, 50].

Augalai yra svarbus antioksidantų šaltinis, nes kaupia anksčiau aptartus fenolinius junginius ir flavonoidus. Šiuo metu fenoliniai junginiai ir flavonoidai yra laikomi puikiais antioksidantais ir yra efektyvesni nei vitaminas C, E ir karotenoidai [32, 47].

4.6. Fenolinių junginių struktūros ir aktyvumo ryšys, antioksidacinio poveikio

mechanizmai

Antioksidantinės ir radikalus sujungiančios fenolinių junginių savybės labai priklauso nuo jų struktūros. Jų antioksidantinis aktyvumas susijęs su hidroksilo grupių skaičiumi, rezonanso efektu ir dvigubojo ryšio konjugacija [53]. Pagrindinės funkcinės grupės, kurios fenoliniams junginiams lemia antioksidantinį ir antiradikalinį aktyvumus yra fenolinių žiedų hidroksilo grupės, nes fenoliniai junginiai gali atiduoti OH grupės vandenilio atomą laisviesiems radikalams. Alkilinė grandinė sujungta su fenolio žiedu ir alkoholio ar karboksilo grupė fenoliniame junginyje gali stabilizuoti po oksidacijos susiformavusį radikalą. Kai antra hidroksilo grupė yra katecholio žiedo orto padėtyje, sumažėja OH ryšio disociacijos entalpija ir pagreitėja vandenilio atomo perdavimas peroksido radikalui. Trečios hidroksilo funkcinės grupės buvimas fenoliniame žiede bei pirminės alkoholio grupės buvimas vietoj karboksilinės grupės taip pat padidina antioksidantinį fenolinių junginių aktyvumą [54].

Ferreira et al., (2009) CRAC metodu tyrinėjo įvairių fenolinių junginių antioksidantinį aktyvumą ir jo ryšį su struktūra. CRAC – tai elektrocheminis metodas, kuris nustato oksiduotų cerio (𝐶𝑒4+_{) jonų sunaudojimą, chronoamperometriniu detektoriumi kiekybiškai matuojant tiriamų} pavyzdžių redukcinę galią [55]. Tiriant CRAC metodu kaip oksidatorius yra naudojamas rūgštinis cerio (IV) sulfato tirpalas. Tyrimo metu nustatyta, jog rezorcinolio grupių buvimas B žiedo C‘2, C‘4 padėtyse padidina morino antioksidantinį aktyvumą iki 39,9 proc. lyginant su kvercetinu, kuris turi katecholio grupes B žiedo tose pačiose padėtyse. C5 OH grupės konjuguotos su C3 OH grupe nebuvimas ir 4-okso

grupių atitikimas lemia 28,4 proc. sumažėjusį fisetino antioksidantinį aktyvumą lyginant su kvercetinu. C3 OH grupės konjuguotos su C5 OH grupe ir 4-okso grupių atitikimas sumažina luteolino antioksidantinį aktyvumą net 46,5 proc. lyginant su kvercetinu [56]. 3-OH grupių pakeitimas metilo arba glikozilintomis grupėmis linoleino rūgštyje visiškai panaikina kvercetino ir kempferolio aktyvumą prieš β –karoteno oksidaciją [57].

Piszcz et al. (2014) aprašė 15 skirtingų flavonoidų antioksidantinio aktyvumo tyrimų atliktų skysčių plonasluoksnės chromatografijos su elektrocheminiu detektoriumi (HPLC-ED) ir potenciometriniu metodais [58]. Iš visų tyrinėtų flavonoidų kvercetinas pasižymėjo stipriausiomis antioksidantinėmis savybėmis ir buvo geriausias elektronų donoras. Katechinas struktūriškai panašus į kvercetiną: abu jie turi rezorcinolio fragmentą A žiede, katecholio grupę B žiede, 3C žiedo padėtyje hidroksilo grupę; tačiau katechinas C žiede neturi dvigubojo ryšio – kvercetinas yra nekonjuguotas ir pasižymi mažesnėmis mezomerinėmis struktūromis. Visa tai lemia mažesnį katechino antioksidantinį aktyvumą [58]. Be to, 3’4’-katecholio struktūra B žiede labai sustiprina lipidų peroksidacijos inhibavimą [57]. Junginiai, kuriuose hidroksilo grupė yra pakeista metoksi funcine grupe, pavyzdžiui, hesperitinas, pasižymėjo dar silpnesnėmis antioksidantinėmis savybėmis [58].

Flavonoidų antiradikalinį aktyvumą užtikrina:

1.

Katecholio grupių – 3‘,4‘- dihidroksi buvimas B žiede, kadangi suteikia flavonoidų fenoksil radikalams didesnį stabilumą.

2.

C2 – C3 dvigubas ryšys. Jis padidina elektronų delokalizaciją nuo B žiedo.

3.

Hidroksilo grupės C3 ir C5, kurios paskatina elektronų delokalizaciją iš 4-okso grupės į C3 ir C5 OH grupes [35].

Fenolinės rūgštys pagal struktūros skirtumus yra skirstomos į dvi grupes: hidroksibenzenkarboksirūgštis (galo rūgštis, p – hidroksibenzoinė rūgštis, siringo rūgštis, vanilino rūgštis) ir hidroksicinamono rūgštis (kavos rūgštis, ferulo rūgštis, p-kumaro rūgštis, sinapo rūgštis) [59-60]. Silva et al. (2000) DPPH metodu tyrė antiradikalinį kavos rūgšties, dihidrokavos rūgšties ir jų n-alkilintų esterių aktyvumą. Dihidrokavos rūgštis ir kavos rūgštis pasižymėjo stipriausiu antiradikaliniu aktyvumu, kuris buvo stipresnis net už (±)-α-tokoferolio aktyvumą. Kavos rūgšties metilo, alkilo ir propilo esteriai pasižymėjo didesniu antiradikaliniu aktyvumu lyginant su kavos rūgšimi, tačiau dihidrokavos rūgšties esterių aktyvumas buvo silpnesnis lyginant su dihidrokavos rūgštimi. Esterių antiradikalinis aktyvumas nepriklausė nuo alkilinės grandinėlės ilgio [61]. Hidroksilo ir metoksi grupių buvimas fenolinių rūgščių ir jų esterių struktūrose ir dvigubo ryšio buvimas šoninėje grandinėje padidina antioksidantinį aktyvumą [60].

Fenolinių junginių ir flavonoidų antioksidantinės savybės pasireiškia tokiais mechanizmais: jie silpnina laisvųjų radikalų formavimąsi inhibuodami kai kuriuos baltymus; susijungia į chelatus su

sunkiaisiais metalais, taip mažindami laisvųjų radikalų gamybą; tiesiogiai sujungia laisvuosius radikalus arba padeda atsinaujinti antioksidantams, pavyzdžiui α-tokoferoliui [32, 35, 47]. Sunkiųjų metalų sujungimui yra svarbu 3’,4’-dihidroksi grupės B žiede, C-3 ir C-5 hidroksi grupės ir 4-karbonilo grupė [35].

Fenoliniai junginiai gali silpninti laisvųjų radikalų formavimąsi inhibuodami kai kuriuos baltymus. Fermentas ksantino oksidazė katalizuoja ksantino ir hipoksantino oksidaciją į šlapimo rūgštį, kurios perteklius organizme gali sukelti podagrą. Ši liga gydoma fermento ksantino oksidazės inhibitoriais. Kroatijos mokslininkai tyrė flavonoidų aktyvumą inhibuoti fermentą ksantino oksidazę.

Nustatyta, jog aktyvumui prieš ksantino oksidazę yra būtini dvigubas ryšys tarp C2 ir C3 atomų ir laisvų hidroksilo grupių C5 ir C7 padėtyse, buvimas.Svarbiausiu laikomas C7 padėtyje hidroksilo grupės buvimas ir katecholio arba pirogalolio fragmentai B žiede – tokie junginiai yra stipriausi ksantino oksidazės inhibitoriai (4 pav.) [35].

4 pav. Ksantino oksidazės inhibavimui flavonoidų struktūroje būtini pakaitai [35]

Marangoni et al. (2004) mokslininkai nustatė, jog vienas iš svarbiausių veiksnių lemiančių ksantino oksidazės inhibavimą yra geometrinės flavonoidų savybės: kai tarp C ir B žiedų esantis sukimo kampas yra didesnis nei 27°, flavonoidai praranda aktyvumą. O hidrofobinių savybių buvimas ir mažas dydis, priešingai, jį padidina [62].

Nustatyti du pagrindiniai fenolinių junginių mechanizmai, kurie sukelia apsauginį antioksidantinį poveikį. Pirmasis mechanizmas paremtas antioksidanto vandenilio atomo atidavimu laisvajam radikalui [53]. Šiuo atveju antioksidantas turi turėti orto-dihidroksi pakaitus B žiede, C4 karbonilo grupę C žiede ir C2-C3 dvigubąjį ryšį. Šis mechanizmas vyksta taip: antioksidanto hidroksilo grupės atiduoda vandenilį radikalui – jis yra stabilizuojamas (5 pav.). Susidaro fenoksilo radikalas, kuris yra gana stabilus. Jis gali reaguoti su kitu radikalu sudarydamas stabilią kvinono struktūrą (6 pav.)[35].

5 pav. Fenoksilo radikalo susidarymas ir jo stabilizavimas vandeniliniais ryšiais[35]

6 pav. stabilaus kvinono susidarymas fenoksilo radikalui prijungus laisvąjį radikalą [35]

Fenoliniai junginiai pasižymi daugybe poveikio mechanizmų: baltymų inhibavimu, sunkiųjų metalų ir laisvųjų radikalų sujungimu, o jų veikimas ir aktyvumas tiesiogiai priklauso nuo cheminės struktūros [32].

4.7. Antioksidantinio aktyvumo nustatymo metodai

Antioksidantiniam aktyvumui nustatyti gali būti naudojami įvairūs metodai. Pagal veikimo mechanizmą jie skirstomi į atiduodančius vandenilio atomą (HAT) ir prijungiančius laisvą elektroną (SET). HAT metodo mechanizmas vyksta taip: antioksidantas atiduoda vandenilio atomą nestabiliam laisvajam radikalui ir suteikia jam stabilumo [63]. SET metodo mechanizmas: antioksidantas prisijungia nesuporuotą laisvojo radikalo elektroną ir sumažina radikalo poveikį. HAT ir SET metodų pavyzdžiai pateikiami 2 lentelėje. SET reakcijos dažniausiai trunka ilgai. Leopoldini et al. (2004) aprašė, jog gali būti tarpinis HAT ir SET mechanizmas [64].

ABTS reagentas - 2,2‟-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfonorūgštis). ABTS metodas paremtas (ABTS•+) radikalo spalvos pasikeitimu šiam reaguojant su antioksidantais.Tai elektronų ir atomų perdavimo reakcijomis paremtas metodas. Šis metodas tinka ir lipofilinių, ir hidrofilinių junginių antioksidantiniam aktyvumui nustatyti. Absorbcijos maksimumas vandeniniams tirpalams nustatytas regimosios šviesos spektre esant 414, 752 ir 842 nm; etanoliniams tirpalams - 414, 730 ir 873 nm [17, 47].

DPPH ( 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilas) radikalas – tai ilgos gyvavimo trukmės, ryškiai violetinės spalvos, stabilus azoto radikalas. Antioksidantų redukcinis aktyvumas matuojamas įvykus spalvos pasikeitimui iš violetinės į geltoną bangos ilgiui esant 515– 528 nm intervale [17]. DPPH metodas yra tinkamas tyrinėti organiniams antioksidantų tirpalams [65].

2 lentelė. SET ir HAT metodų pavyzdžiai [17]

HAT metodas SET metodas Tarpinis HAT ir SET metodas

ORAC FRAP (geležies redukavimo

metodas)

ABTS

TRAP (bendro radikalų gaudyklės parametro nustatymas)

CUPRAC (vario jonų

redukavimo metodas)

DPPH

CL (chemiliuminescencinis) PCL (fotochemiliuminescencinis)

FRAP metodas įvertina vandenyje tirpių antioksidantų gebėjimą rūgštinėje terpėje (pH apie 3,6) redukuoti geltonos spalvos geležies 2,4,6-tripiridil-s-triaziną į ryškiai mėlynos spalvos Fe2þ-tripiridiltriaziną. Tai elektronų perdavimo reakcijomis paremtas metodas. Absorbcija matuojama bangos ilgiui esant 593 nm [47, 66].

CUPRAC metodo esmė – komplekso, kurį sudaro dvivalentis varis ir neokuproinas, redukcija į vienvalentį varį ir neokuproiną. Šis metodas yra tinkamas tiek lipofilinių, tiek hidrofilinių antioksidantų aktyvumo nustatymui. Reagentas yra stabilesnis nei ABTS, DPPH reagentai [32, 67]. Tiriant šiuo metodu nėra reikalinga rūgštinė ar šarminė terpė. Absorbcija matuojama bangos ilgiui esant 450 nm [68].

Folin – Ciocalteu metodas pagrįstas oksidacijos redukcijos reakcijomis [32, 66]. Folin -Ciocalteu metodas paremtas fenolinių junginių elektronų atidavimu fosfomolibdininei rūgščiai šarminėje aplinkoje (pH apie 10) ir mėlynos spalvos fosfomolibdininės rūgšties komplekso susidarymu. Analizė atliekama spektrofotometriškai matuojant susidariusį mėlynos spalvos tirpalą bangos ilgiui esant 760 nm. Kaip lyginamasis standartas dažniausiai yra naudojama galo rūgštis, tačiau taip pat gali būti naudojami katechinas, chlorogeno rūgštis, kavos rūgštis, ferulino rūgštis, tanino rūgštis [17, 32]. Kadangi fenolinių junginių redukcinis aktyvumas priklauso nuo laisvų hidroksilo grupių junginio molekulėje skaičiaus, galutinė absorbcijos reikšmė yra proporcinga reaktyvių hidroksilo grupių skaičiui. Folin – Ciocalteu metodas gali būti atliekamas hidrofiliniams junginiams, lipofiliniams junginiams nėra taikomas [16, 31].

5. TYRIMO METODIKA

5.1. Tyrimo objektas

Tyrimo objektas – karpotųjų beržų (Betula pendula Roth.) ir plaukuotųjų beržų (Betula

pubescens Ehrh.), kurie auga natūraliai gamtoje, 2015 metais surinkti lapai ir 2016 metais surinkti

pumpurai. Vaistinių augalų lapai ir pumpurai buvo renkami skirtingose augavietėse: Druskininkų rajone, Merkinės rajone, Daugų rajone, Alytaus rajone, Balbieriškio rajone, Prienų rajone, Birštono rajone ir Kauno rajone. Beržų lapai buvo renkami gegužės, rugsėjo ir spalio mėnesiais, pumpurai – kovo mėnesio pabaigoje. Tyrimams rinktų augalinių žaliavų ėminių duomenys yra pateikti 3 lentelėje. Surinkti lapai buvo džiovinami juos plačiai paskleidus patalpoje apsaugotoje nuo tiesioginių saulės spindulių poveikio. Pumpurai buvo džiovinami tamsioje, vėsioje vietoje. Išdžiovinta augalinė žaliava buvo laikoma popieriniuose maišeliuose ir stikliniuose indeliuose sausoje, tamsioje, apsaugotoje nuo saulės spindulių, vietoje.

3 lentelė. Beržų tiriamųjų žaliavų rinkimo data ir vieta

Tiriamoji žaliava Rinkimo

data

Fenologinis tarpsnis Rinkimo vieta, koordinatės Karpotųjų beržų lapai,

Plaukuotųjų beržų lapai

2015-05-15 Sulapojimo pradžia Druskininkų raj., Druskininkų miškas 53° 59' 55.59", 23° 58' 35.24" (WGS)

Karpotųjų beržų lapai 2015-09-20 Prieš geltimą Druskininkų raj., Druskininkų miškas Karpotųjų beržų lapai 2015-10-05 Lapų pageltimas Druskininkų raj.,

Druskininkų miškas Karpotųjų beržų lapai,

Plaukuotųjų beržų lapai

2015-05-15 Sulapojimo pradžia Merkinės raj., pamiškė 54° 9' 34.89", 24° 11' 38.35" (WGS)

Karpotųjų beržų lapai 2015-09-20 Prieš geltimą Merkinės raj., pamiškė Karpotųjų beržų lapai 2015-10-05 Lapų pageltimas Merkinės raj., pamiškė Karpotųjų beržų lapai,

Plaukuotųjų beržų lapai

2015-05-15 Sulapojimo pradžia Daugų raj., Daugų miškas 54° 21' 34.85", 24° 17' 38.31" (WGS)

Karpotųjų beržų lapai 2015-09-20 Prieš geltimą Daugų raj., Daugų miškas Karpotųjų beržų lapai 2015-10-05 Lapų pageltimas Daugų raj., Daugų miškas Karpotųjų beržų lapai,

Plaukuotųjų beržų lapai

2015-05-15 Sulapojimo pradžia Alytaus raj., Kalesninkų miškas 54° 24' 25.78", 24° 14' 27.21" (WGS)

Karpotųjų beržų lapai 2015-09-20 Prieš geltimą Alytaus raj., Kalesninkų miškas Karpotųjų beržų lapai 2015-10-05 Lapų pageltimas Alytaus raj.,

Kalesninkų miškas Karpotųjų beržų lapai,

Plaukuotųjų beržų lapai

2015-05-15 Sulapojimo pradžia Balbieriškio raj., Balbieriškio miškas 54° 31' 48.12", 23° 48' 10.08" (WGS)

Karpotųjų beržų lapai 2015-09-20 Prieš geltimą Balbieriškio raj., Balbieriškio miškas Karpotųjų beržų lapai 2015-10-05 Lapų pageltimas Balbieriškio raj.,

Balbieriškio miškas Karpotųjų beržų lapai,

Plaukuotųjų beržų lapai

2015-05-15 Sulapojimo pradžia Prienų raj., Mačiūnų miškas 54° 38' 55.23", 23° 54' 56.09" (WGS)

Karpotųjų beržų lapai 2015-09-20 Prieš geltimą Prienų raj., Mačiūnų miškas Karpotųjų beržų lapai 2015-10-05 Lapų pageltimas Prienų raj.,

Mačiūnų miškas Karpotųjų beržų lapai,

Plaukuotųjų beržų lapai

2015-05-15 Sulapojimo pradžia Birštono raj., Buktos miškas 54° 32' 24.5", 23° 54' 10.53" (WGS) Karpotųjų beržų lapai 2015-09-20 Prieš geltimą Birštono raj.,

Buktos miškas Karpotųjų beržų lapai 2015-10-05 Lapų pageltimas Birštono raj.,

Buktos miškas Karpotųjų beržų lapai,

Plaukuotųjų beržų lapai

2015-05-15 Sulapojimo pradžia Kauno raj.,

Ilgakiemio miškas 54° 38' 55.23", 23° 54' 56.09" (WGS)

Karpotųjų beržų lapai 2015-09-20 Prieš geltimą Kauno raj.,

Ilgakiemio miškas Karpotųjų beržų lapai 2015-10-05 Lapų pageltimas Kauno raj.,

Ilgakiemio miškas Karpotųjų beržų pumpurai,

Plaukuotųjų beržų pumpurai

2016-03-27 Pumpurų sprogimo laikas

Druskininkų raj., Druskininkų miškas Karpotųjų beržų pumpurai,

Plaukuotųjų beržų pumpurai

2016-03-27 Pumpurų sprogimo laikas

Merkinės raj., pamiškė Karpotųjų beržų pumpurai,

Plaukuotųjų beržų pumpurai

2016-03-27 Pumpurų sprogimo laikas

Daugų raj., Daugų miškas Karpotųjų beržų pumpurai,

Plaukuotųjų beržų pumpurai

2016-03-27 Pumpurų sprogimo laikas

Alytaus raj., Kalesninkų miškas Karpotųjų beržų pumpurai,

Plaukuotųjų beržų pumpurai

2016-03-27 Pumpurų sprogimo laikas

Balbieriškio raj., Balbieriškio miškas Karpotųjų beržų pumpurai,

Plaukuotųjų beržų pumpurai

2016-03-27 Pumpurų sprogimo laikas

Birštono raj., Buktos miškas Karpotųjų beržų pumpurai,

Plaukuotųjų beržų pumpurai

2016-03-27 Pumpurų sprogimo laikas

Prienų raj., Mačiūnų miškas Karpotųjų beržų pumpurai,

Plaukuotųjų beržų pumpurai

2016-03-27 Pumpurų sprogimo laikas

Kauno raj.,

5.2. Naudoti reagentai

Naudoti standartai, reagentai ir tirpikliai yra analitinio švarumo. Ekstraktai buvo ruošiami naudojant tirpiklį, 96,3 proc. V/V etilo alkoholį (AB „Stumbras“, Lietuva). Folin-Ciocalteau metodui buvo naudojama: Folin-Ciocalteu reagentas ir galo rūgšties monohidratas, kurie įsigyti iš ,,SigmaAldrich“ (St. Louis, JAV), natrio karbonatas (Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe, Vokietija). ABTS metodui: ABTS (2,2-azinobis (etil-2,3-dihidrobenzotiazolin-6-sulfoninė rūgštis) iš ,,Alfa Aesar“, Massachusetts, JAV), kalio persulfatas (,,Alfa Aesar GmbH & Co“, Karlsruhe, Vokietija), troloksas ((±)-6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilchromano-2-karboksilinė rūgštis) (,,Sigma-Aldrich“ St. Louis, JAV). FRAP metodui: 98 - 100 proc. V/V acto rūgštis (,,Sigma–Aldrich“, St. Louis, JAV), geležies (III) chlorido heksahidratas iš Vaseline-Fabrik Rhenania (Bonn, Vokietija), natrio acetatas iš Sigma-Aldrich Chemie (Steinheim, Vokietija), 35 proc. V/V vandenilio chlorido rūgštis (,,Sigma – Aldrich“, St. Louis, JAV), 2,4,6-tripiridil-s-triazinas (TPTZ) – iš Alfa Aesar (Vokietija).Aliuminio chlorido heksahidratas iš „Sigma-Aldrich Chemie GmbH“ (Steinheim, Vokietija), kvercetino dihidratas (,,Carl Roth GmbH & Co“, Karlsruhe, Vokietija), heksametilentetraminas („Alfa Aesar“, Massachusetts, JAV).

5.3. Naudota aparatūra

Tiriamieji ėminiai buvo smulkinami elektriniu malūnėliu (Binatone, Jungtinė Karalystė). Augalinės žaliavos svėrimui buvo naudojamos elektroninės svarstyklės ,,Sartorius Cp6M-0CE“ (Vokietija). Nuodžiūvis tirtas aparatu „Precisa HA 300“ (Dietikon, Šveicarija), ekstrakcija vykdyta ultragarso vonelėje Bandelin SONOREX Digital (Vokietija). Tiriamųjų ekstraktų fenolinių junginių ir flavonoidų kiekis, antioksidantinis aktyvumas buvo matuojamas naudojant spektrofotometrą "Spectronic Camspec M550" (Jungtinė Karalystė).

ESC analizė atlikta naudojant Waters 2695 chomatografą (Milford, USA) su diodų matricos detektoriumi Waters 2998 (Milford, USA). Chromatografinis skirstymas atliktas naudojant 5-μm ACE C18 analitinę kolonėlę (250 × 4.6 mm) su prieškolone 5-μm ACE C18 (20 × 4.0 mm) (Aberdeen, Scotland), 25 °C temperatūroje. Eliuentų sistema: 1% (v/v) skruzdžių rūgšties (A) ir acetonitrilo (B). Eliucijos sistema: 10–15% tirpiklis B 0–20 min, 15% tirpiklis B 20–30 min, 15–30% tirpiklis B 30–45 min, 30–40% tirpiklis B 45–55 min. Judrios fazės tėkmės greitis 1 ml/min, injekcijos tūris - 10 μl. Fenoliniai junginiai identifikuoti pagal smailių sulaikymo trukmę ir UV spektrą (λ = 200–600 nm) palyginant juos su žinomais standartais. Kiekybinis fenolinių junginių įvertinimas atliktas pagal standartų kalibracines kreives.

5.4. Duomenų statistinis vertinimas

Gauti tyrimų duomenys įvertinti ir susisteminti Microsoft Office Excel (Microsoft, JAV) ir SPSS 23.0 (SPSS Inc., JAV) kompiuterinėmis programomis. Visi tyrimai buvo pakartojami tris kartus, iš gautų duomenų pakartojimų apskaičiuotas standartinis nuokrypis, išvestas vidurkis. Koreliacinio ryšio stiprumas tarp kintamųjų buvo nustatomas apskaičiuojant Spirmeno koreliacijos koeficientą (R). Analizuojant duomenis buvo naudojamas tiesinis regresijos modelis, kurio tinkamumas vertintas naudojant determinacijos koeficientą 𝑅2 _{ir p-reikšmę (p), gautą tikrinant hipotezę apie regresijos} netiesiškumą. Gautų rezultatų statistinis patikimumas įvertintas, taikant vienfaktorinę dispersinę analizę (ANOVA). Pasirinktas reikšmingumo lygmuo α=0,05.

5.5. Tiriamų mėginių paruošimas

Vienam pavyzdžiui žaliavos renkamos nuo bent 10 skirtingų augalų. Prieš žaliavos rinkimą, atliekamas cheminis identifikavimo metodas, kuriuo nustatoma beržo rūšis. Pasigaminamas 2,4 - dinitrofenilhidrazino tirpalo reagentas. Atsveriama 0,4 g 2,4- dinitrofenilhidrazino miltelių, kurie ištirpinami 100 ml 2 M vandenilio chlorido rūgštyje. Tirpalas paliekamas 24 valandoms, tuomet filtruojamas. Šviežio beržo žievės gabaliukai dedami į mėgintuvėlius, užpilami 2,4- dinitrofenilhidrazino reagento tirpalu. Tyrimo rezultatai analizuojami po 1 valandos [1].

Žaliavos sumalamos elektriniu malūnėliu. Atsveriama 0,25 g žaliavos, suberiama į tamsaus stiklo buteliukus ir užpilama 25 ml 70 proc (v/v) etanoliu. Vykdoma ekstrakcija ultragarso vonelėje 30 min. Gaunami ekstraktai, kurie filtruojami į tamsaus stiklo buteliukus pro sudrėkintą popierinį filtrą. Buteliukai sandariai užsukami ir laikomi tamsioje vietoje.

5.6. Spektrofotometriniai beržų lapų ir pumpurų ekstraktų nustatymo metodai

5.6.1. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas Folin-Ciocalteu

spektrofotometriniu metodu

Pasigaminamas darbinis Folin – Ciocalteu reagentas: pradinis Folin – Ciocalteu reagentas praskiedžiamas distiliuotu vandeniu santykiu 1:9 (1 dalis Folin - Ciocalteu reagento ir 9 dalys vandens).

Pasigaminamas 7,5 proc. natrio karbonato tirpalas: 7,5 g natrio karbonato ištirpinama distiliuotame vandenyje 100 ml matavimo kolboje.

Į mėgintuvėlį įpilama 0,25 ml tiriamo etanolinio ekstrakto, 1,25 ml pasigaminto Folin – Ciocalteau reagento ir, galiausiai, 1 ml pasigaminto 7,5 % natrio karbonato tirpalo. Sumaišomas gautas

mišinys ir paliekamas stovėti 1 val. kambario temperatūroje, tamsioje vietoje. Praėjus 1 val spektrofotometru matuojama tiriamojo tirpalo absorbcija bangis ilgiui esant 765 nm [69].

Gauti duomenys vertinami pagal etaloninių galo rūgšties tirpalų, kurie gaminami tokiomis pačiomis sąlygomis kaip ir tiriamieji tirpalai, tačiau vietoje 0,25 ml ekstrakto pilami 0,25 ml įvairių koncentracijų (0,0125 mg/ml, 0,025 mg/ml, 0,05 mg/ml, 0,075 mg/ml, 0,1mg/ml) galo rūgšties tirpalai, duomenis. Kalibracinė galo rūgšties kreivė, tiesinė regresijos lygtis ir koreliacijos koeficientas pavaizduoti 7 paveiksle.

7 pav. galo rūgšties kalibracinė kreivė

Suminis fenolinių junginių kiekis išreiškiamas galo rūgšties ekvivalentais (GAE) gramui sausos žaliavos pagal formulę:

𝐺𝐴𝐸 = 𝐶×𝑉

𝑚 ; mg/g

C – iš kalibracinės kreivės nustatyta galo rūgšties koncentracija (mg/ml), V- ekstrakto tūris (ml); m – atsvertas tikslus vaistinės augalinės žaliavos kiekis (g).

5.6.2. Bendro flavonoidų kiekio nustatymas

Suminis flavonoidų kiekis nustatomas tiriamą etanolinį ekstraktą veikiant aliuminio chlorido tirpalu parūgštintoje terpėje. Duomenys vertinami pagal kvercetino kalibracinę kreivę. Tiriamojo tirpalo paruošimas: į 5 ml matavimo kolbutę įpilama 0,2 ml tiriamo žaliavos etanolinio ekstrakto, 2,0 ml 96 proc. V/V etanolio, 0,1 ml 30 proc. acto rūgšties tirpalo, 0,3 ml 10 proc. aliuminio chlorido tirpalo. Gautas tirpalas paliekamas 30 minučių pastovėti tamsioje kambario temperatūros vietoje. Praėjus nurodytam laikui į gautą mišinį pilama 0,4 ml 5 proc. heksametilentetramino tirpalas. Galiausiai gautas mišinys praskiedžiamas išgrynintu vandeniu iki žymės, sumaišoma. Matuojamas gauto tirpalo absorbcijos dydis, kuris lyginamas su palyginamuoju tirpalu bangos ilgiui esant 407 nm.

y = 12,517x + 0,006 R² = 0,9969 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 Op tin is tan k is , A

Palyginamojo tirpalo paruošimas: į 5 ml matavimo kolbutę įpilama 0,2 ml žaliavos etanolinio ektraktro, 2,0 ml 96 proc. V/V etanolio, 0,1 ml 30 proc. acto rūgšties tipalo. Skiedžiama išgrynintu vandeniu iki žymės. Bendras flavonoidų kiekis išreiškiamas kvercetino ekvivalentais gramui sausos žaliavos. Apskaičiuojama remiantis formule:

X = 𝐶 ×𝑉 𝑚 , mg/g

C – iš kalibracinės kreivės nustatyta kvercetino koncentracija (mg/ml), V- ekstrakto tūris (ml); m – atsvertas vaistinės augalinės žaliavos kiekis (g).

Gauti duomenys vertinami pagal etaloninių kvercetino tirpalų, kurie gaminami tokiomis pačiomis sąlygomis kaip ir tiriamieji tirpalai, tačiau vietoje 0,2 ml ekstrakto pilami 0,2 ml įvairių koncentracijų (0,1 mg/ml, 0,2 mg/ml, 0,4 mg/ml, 0,6 mg/ml, 0,8 mg/ml) kvercetino tirpalai, duomenis. Bendras flavonoidų kiekis išreiškiamas kvercetino ekvivalentais (QE) gramui sausos žaliavos [69] pagal kalibracinę kreivę. Kvercetino kalibracinė kreivė, tiesinė regresijos lygtis ir koreliacijos koeficientas pavaizduoti 8 paveiksle.

8 pav. kvercetino kalibracinė kreivė

5.6.3. Laisvųjų radikalų surišimo nustatymas ABTS metodu

Laisvųjų radikalų surišimo įvertinimas nustatytas analizuojant ABTS metodu, naudojant spektrofotometrą. Pagaminamas pradinis ABTS reagentas: atsveriama 0,0548 g ABTS miltelių, kurie suberiami į tamsaus stiklo buteliuką. Milteliai ištirpinami 50 ml distiliuoto vandens, pridedama 0,0095 g kalio persulfato. Buteliuko turinys sumaišomas. Paliekama tamsoje 12 - 16 val.

Pagamintas pradinis ABTS tirpalas skiedžiamas distiliuotu vandeniu iki 0,8 absorbcijos vienetų. Absorbcija matuojama bangos ilgiui esant 734 nm [70] – gaunamas darbinis ABTS tirpalas.

y = 1,2724x + 0,0113 R² = 0,9971 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 Op tin is tan k is , A Kvercetino koncentracija, mg/ml

Atliekant tyrimus imama 3 ml darbinio ABTS tirpalo, į kurį pridedama 20 µl tiriamo etanolinio ekstrakto. Reakcija vyksta tarp ABTS•+ radikalo ir antioksidanto – blunka tirpalo spalva. Praėjus 1 val matuojamas tirpalo absorbcijos pokytis bangos ilgiui esant 734 nm.

Laisvųjų radikalų surišimo geba išreiškiama standartinio antioksidanto trolokso ekvivalentais (TE) gramui žaliavos [71]. Apskaičiuojama remiantis formule:

TE (ABTS) =C ×V

m , µmol/g

C – trolokso koncentracija (µmol/L), nustatyta iš kalibracinės kreivės; V – ekstrakto tūris (l); m – tikslus atsvertas žaliavos kiekis (g).

Gauti duomenys vertinami pagal etaloninių trolokso tirpalų, kurie gaminami tokiomis pačiomis sąlygomis kaip ir tiriamieji tirpalai, tačiau vietoje 20 µl ekstrakto pilami 20µl įvairių koncentracijų trolokso tirpalai, duomenis. Kvercetino kalibracinė kreivė, tiesinė regresijos lygtis ir koreliacijos koeficientas pavaizduoti 9 paveiksle.

9 pav. Trolokso kalibracinė kreivė

5.6.4. Redukcinio aktyvumo nustatymas FRAP metodu

FRAP reagentas yra pagaminamas 10:1:1 santykiu sumaišant 300 mM acetatinį buferį, 10 mM TPTZ (2, 4, 6 – tri (2-piridil) – 1, 3, 5 – triazino) miltelių tirpalą ir 20 mM geležies (III) chlorido heksahidrato tirpalą. FRAP metodas paremtas geležies jonų redukcija, kuri vyksta geležies jonams reaguojant su antioksidantais [72]. Pamatuojama 3 ml pasigaminto darbinio FRAP reagento, pridedama 20 µl tiriamojo etanolinio ekstrakto. Praėjus 1 val. spektrofotometru išmatuojamas mišinio optinis tankis bangos ilgiui esant 593 nm [60].

y = 0,0002x + 0,0006 R² = 0,9942 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0 1000 2000 3000 4000 5000 A b so rb cij o s p o kyt is

Redukcinio aktyvumo galia išreiškiama standartinio antioksidanto trolokso ekvivalentais (TE) gramui žaliavos (kaip standartas taip pat gali būti naudojama askorbo rūgštis) [73]. Redukcinio aktyvumo galia apskaičiuojama pagal formulę:

TE =𝐶 ×𝑉

𝑚 , µmol/g

C – trolokso koncentracija, kuri nustatyta iš kalibracinės kreivės; V – tiriamo ekstrakto tūris, (l); m – atsvertas žaliavos kiekis, g

Gauti duomenys vertinami pagal etaloninių trolokso tirpalų, kurie gaminami tokiomis pačiomis sąlygomis kaip ir tiriamieji tirpalai, tačiau vietoje 20 µl ekstrakto pilami 20 µl įvairių koncentracijų trolokso tirpalai, duomenis. Trolokso kalibracinė kreivė, tiesinė regresijos lygtis ir koreliacijos koeficientas pavaizduoti 10 paveiksle.

10 pav. Trolokso kalibracinė kreivė

y = 0,0003x + 0,0189 R² = 0,9963 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 Op ti n is tan k is , A

6. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

6.1. Suminių fenolinių junginių ir flavonoidų kiekių nustatymas karpotųjų ir

plaukuotųjų beržų lapų ekstraktuose

Suminių fenolinių junginių ir flavonoidų kiekių nustatymas gegužės mėnesį rinktuose beržų lapų ekstraktuose

Atliktas gegužės mėnesį rinktų beržų lapų ekstraktų fenolinių junginių kiekio palyginimas (11 pav.). Nustatyta, jog karpotųjų beržų lapų ekstraktuose fenolinių junginių kiekis įvairavo nuo 35,31 ± 0,55 mg/g iki 57,11 ± 0,86 mg/g, o plaukuotųjų beržų lapų ekstraktuose - 52,11 ± 0,92 mg/g - 86,42 ± 0,94 mg/g. Plaukuotųjų beržų lapai sulapojimo pradžioje kaupia didesnį vidutinį kiekį (p<0,05) (68,82 ± 1,32 mg/g) fenolinių junginių lyginant su karpotųjų beržų lapais (44,97 ± 1,87 mg/g). Didžiausias fenolinių junginių kiekis (p<0,05) nustatytas Birštono rajone rinktuose plaukuotųjų beržų lapuose - 86,42 ± 0,94 mg/g; mažiausias (p<0,05) – Daugų rajone rinktuose karpotųjų beržų lapuose – 35,31 ± 0,55 mg/g.

11 pav. Beržų lapų ekstraktų bendro fenolinių junginių (mg/g) kiekio (gegužės mėn., sulapojimo pradžia) (n=3) palyginimas

Gauti rezultatai yra mažesni nei Kroatijos mokslininkų: Kristina Bljajić et al. (2016) nustatė, jog karpotųjų beržų etanoliniuose lapų ekstraktuose bendras fenolinių junginių kiekis – 160,4 ± 20,6 mg/g. [28]. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 Druskininkai,

miškas Merkinė,pamiškė

Daugai, miškas

Alytus,

miškas Balbieriškis,miškas

Prienai,

miškas Birštonas,miškas

Kaunas, miškas c, m g /g

Lapų rinkimo vietos

Nustatytas suminis flavonoidų kiekis sulapojimo pradžioje rinktuose beržų lapuose (12 pav). Flavonoidų kiekis karpotųjų beržų lapų ėminiuose įvairavo nuo 10,04 ± 3,09 mg/g iki 24,11 ± 0,52 mg/g, plaukuotųjų beržų lapų ėminiuose – 13,84 ± 0,52 – 27,65 ± 0,76 mg/g.

12 pav. Beržų lapų ekstraktų bendro flavonoidų kiekio palyginimas (mg/g, n=3, gegužės mėn.)

Didžiausias flavonoidų (p<0,05) kiekis nustatytas Birštono rajone surinktuose plaukuotųjų beržų lapų ėminiuose - 27,65 ± 0,76 mg/g, mažiausias (p<0,05) - Daugų rajone surinktuose karpotųjų beržų lapų ėminiuose - 10,04 ± 3,09 mg/g. Kristina Bljajić et al. (2016) nustatė didesnį flavonoidų kiekį: etanoliniame karpotųjų beržų lapų ekstrakte bendras flavonoidų kiekis nustatytas – 45 ± 2,8 mg/ [28]. A. Mashentseva et al. (2011) Šiaurės Kazachstane rinktuose karpotųjų beržų lapų ėminiuose nustatė panašų flavonoidų kiekį lyginant su šio darbo rezultatais - 22,8 ± 1,14 mg/g, kuris buvo įvertintas pagal kvercetino ekvivalentą [69].

Nustatytas stiprus koreliacinis ryšys (R=0,826; p<0,05) tarp fenolinių junginių ir flavonoidų kiekio beržų lapuose, rinktuose sulapojimo pradžioje. Kristina Bljajić et al. (2016) tarp beržų lapų fenolinių junginių ir flavonoidų kiekio nustatė šiek tiek silpnesnį koreliacinį ryšį (R=0,79) [28].

Suminių fenolinių junginių ir flavonoidų kiekių nustatymas rugsėjo ir spalio mėnesiais rinktuose karpotųjų beržų lapuose

Nustatytas skirtingas bendras fenolinių junginių kiekis karpotųjų beržų lapuose, rinktuose rugsėjo viduryje, ir karpotųjų beržų lapuose, rinktuose spalio pradžioje. Spalio mėnesį rinktuose geltonuose lapuose nustatytas didesnis vidutinis (p<0,05) fenolinių junginių kiekis (69,07 ± 0,61 mg/g) nei rugsėjo mėnesį rinktuose žaliuose lapuose ( 49,68 ± 1,92 mg/g) (13 pav.)

0 5 10 15 20 25 30 Druskininkai,

miškas Merkinė,pamiškė

Daugai, miškas

Alytus,

miškas Balbieriškis,miškas

Prienai,

miškas Birštonas,miškas

Kaunas, miškas c, m g /g

Lapų rinkimo vietos

Fenolinių junginių kiekis rugsėjo viduryje rinktuose beržų lapuose įvairavo nuo 45,07 ± 0,82 mg/g iki 56,59 ± 0,56 mg/g, spalio pradžioje rinktuose – nuo 57,32 ± 0,35 mg/g iki 74,32 ± 0,49 mg/g.

13 pav. Karpotųjų beržų lapų ekstraktų bendro fenolinių junginių (c, mg/g, (n=3), rugsėjo ir spalio

mėn.) kiekio palyginimas

Atliktas tyrimas, kurio metu nustatyta, jog beržų lapai daugiausia fenolinių junginių sukaupia gegužės pradžioje, jų kiekis sumažėja liepos viduryje ir vėl pakyla vasaros pabaigoje ir rudenį. Fenolinių junginių kiekis taip pat sumažėja sausros metu [20].

Nustatytas skirtingas bendras flavonoidų kiekis karpotųjų beržų lapuose, rinktuose rugsėjo viduryje, ir karpotųjų beržų lapuose, rinktuose spalio pradžioje (14 pav).

14 pav. Karpotųjų beržų lapų ekstraktų bendro flavonoidų kiekio palyginimas (mg/g, n=3, rugsėjo, spalio mėn.) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Druskininkai,

miškas Merkinė,pamiškė

Daugai, miškas

Alytus,

miškas Balbieriškis,miškas

Prienai,

miškas Birštonas,miškas

Kaunas, miškas c, m g /g

Lapų rinkimo vietos

Rugsėjo mėn. Spalio mėn. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Druskininkai, miškas Merkinė, pamiškė Daugai, miškas Alytus, miškas Balbieriškis, miškas Prienai, miškas Birštonas, miškas Kaunas, miškas c, m g /g

Lapų rinkimo vietos