O TYRIMAS GEBENIŲ LIPIKIŲ ( HEDERA HELIX L.) LAPŲ IR PREPARATŲ ANALITINIŲ RODIKLIŲ ĮVAIRAVIM

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS

ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA

ROLANDAS GEDMINAS

GEBENIŲ LIPIKIŲ (HEDERA HELIX L.) LAPŲ IR PREPARATŲ

ANALITINIŲ RODIKLIŲ ĮVAIRAVIMO TYRIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas: Prof. Dr. V.Jakštas

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS

ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanė Ramunė Morkūnienė Data:

GEBENIŲ LIPIKIŲ (HEDERA HELIX L.) LAPŲ IR PREPARATŲ

ANALITINIŲ RODIKLIŲ ĮVAIRAVIMO TYRIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas: Prof. Dr. V.Jakštas Data: Recenzentas: Data: Darbą atliko: Magistrantas Rolandas Gedminas Data: KAUNAS, 2018

TURINYS

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 10

1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 11

1.1 Gebenių lipikių (Hedera helix L.) augalo morfologija, paplitimas ir augimas... 11

1.2 Gebenių lipikių (Hedera helix L.) lapų biologiškai aktyvūs junginiai ... 12

1.3 Gebenių lipikių (Hedera helix L.) farmakologinis poveikis ... 13

1.3.1 Gydomasis poveikis kvėpavimo sistemai ... 13

1.3.2 Antioksidantinis poveikis ... 13

1.3.3 Priešuždegiminis poveikis ... 14

1.3.4 Antimikrobinis poveikis ... 14

1.3.5 Priešvėžinis poveikis ... 15

1.4 Gebenių lipikių bioaktyvių medžiagų nustatymo metodai ... 15

1.4.1 Analizės metodai naudojant spektrofotometrą ... 15

1.4.2 Plonasluoksnė chromatografija ... 16

1.4.3 Efektyvioji skysčių chromatografija ... 17

2. TYRIMO METODIKA ... 19

2.1 Tyrimo objektas ... 19

2.2 Reagentai ... 19

2.3 Aparatūra ... 20

2.4 Spekrofotometrinio tyrimo metodai ... 20

2.4.1 Bendras fenolinių junginių kiekio, išreikšto galo rūgšties ekvivalentu, nustatymas Folin-Ciocalteu metodu ... 21

2.4.1.1 Tiriamo pavyzdžio ruošimas bei metodika ... 21

2.4.2 Bendras saponinų kiekis naudojant anisaldehido reagentą. ... 21

2.4.2.1 Tiriamo pavyzdžio ruošimas bei metodika ... 21

2.4.3 Antioksidantinis CUPRAC metodo tyrimas UV spektrofotometriniu metodu ... 22

2.4.3.1 Tiriamo pavyzdžio ruošimas bei metodika ... 22

2.5 α-hederino ir hederokosido C kokybinis įvertinimas plonasluoksnės chromatografijos metodu . 23 2.6 α-hederino ir hederokosido C kokybinis įvertinimas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu ... 24

2.7 Statistinis duomenų apdorojimas ... 24

3. REZUTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 25

3.1.1 Bendras fenolinių junginių kiekio tyrimas H. helix lapuose surinktuose iš skirtingų Lietuvos vietovių, spektrofotometriniu metodu ... 25

3.1.2 Bendras saponinų kiekio tyrimas H. helix lapuose rinktuose iš skirtingų Lietuvos vietovių, spektrofotometriniu metodu ... 26

3.1.3 Gebenių lipikių (Hedera helix L.) lapų ekstraktų antioksidantinis įvertinimas ... 27

3.2 Analitinių rodiklių tyrimas plonasluoksnės chromatografijos metodu ... 28

3.2.1 Lapų ekstraktų tyrimas plonasluoksnės chromatografijos metodu ... 29

3.2.2 Augalinių vaistinių preparatų tyrimas plonasluoksnės chromatografijos metodu ... 30

3.3 Analitinių rodiklių tyrimas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu ... 31

3.3.1 Gebenių lipikių lapų ekstraktų tyrimas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu ... 32

3.3.2 Gebenių lipikių vaistinių preparatų tyrimas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu ... 35

4. GAUTŲ REZULTATŲ APIBENDRINIMAS ... 37

5. IŠVADOS ... 39

6. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 39

SANTRAUKA

R. Gedmino baigiamasis magistro darbas „Gebenių lipikių (Hedera helix L.) lapų ir preparatų analitinių rodiklių įvairavimo tyrimas”. Darbo vadovas Prof. Dr. V. Jakštas. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Medicinos akademijos, Farmacijos fakulteto, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra – Kaunas, 2018.

Tyrimo tikslas: Įvertinti skirtingose Lietuvos augavietėse rinktų gebenių lipikių lapų bei

augalinių preparatų su gebenių ekstraktu analitinių žymenų rodiklių įvairavimą.

Tyrimo uždaviniai: Nustatyti gebenių lipikių lapų (H. helix L.), surinktų iš skirtingų Lietuvos

vietovių, fenolinių junginių ir saponinų duomenų įvairavimą spektrofotometriniais metodais; Įvertinti gebenių lipikių lapų antioksidantinį aktyvumą taikant CUPRAC redukcines savybes; Nustatyti Lietuvoje augančių gebenių lipikių (H. helix L.) lapuose ir augaliniuose vaistiniuose preparatuose esančių triterpeninių saponinų kokybinę sudėtį plonasluoksnės ir efektyviosios skysčių chromatografijos metodais.

Tyrimo objektas: Gebenių lipikių lapai surinkti iš skirtingų Lietuvos vietovių (n=9) ir

vaistiniai augaliniai preparatai su gebenių lipikių ekstraktu įsigyti iš vaistinių (n=6).

Tyrimo metodai: Bendras fenolinių junginių kiekis nustatytas spektrofotometriniu metodu,

naudojant Folin – Ciocalteu reagentą, rezultatai apskaičiuoti pagal galo rūgšties ekvivalentą. Bendras saponinų kiekis nustatytas spektrofotometru naudojant anisaldehido reagentą ir apskaičiuotas remiantis saponinų kalibracinės kreivės tiesinės regresijos lygtimi. Bendras antioksidantinis aktyvumas nustatytas vario redukcijos antioksidantinės galios (CUPRAC) spektrofotometriniu metodu ir apskaičiuotas pagal trolokso ekvivalentą. Kokybiniai gebenių lipikių lapų ir preparatų plonasluoksnės ir efektyviosios skysčių chromatografijos analizės metodai atlikti remiantis Europos farmakopėja.

Rezultatai ir išvados: Iš skirtingų Lietuvos vietovių surinktų gebenių lipikių lapų bendras

fenolinių junginių ir saponinų kiekis skyrėsi. Didžiausias kiekis fenolinių junginių identifikuotas lapuose, rinktuose iš Šilutės miesto (1,889 g/ml), o mažiausiais iš Pumpėnų rajono (1,095 g/ml). Didžiausias kiekis saponinų identifikuotas gebenėse rinktuose iš Palangos miesto (0,731 g/ml), o mažiausiai šių aktyvių medžiagų rasta lapuose iš Šilutės miesto (0,296 g/ml). Taip pat buvo įvertintas ir antioksidantinis aktyvumas. Didžiausiu antioksidantiniu aktyvumu pasižymėjo H. helix augalinė žaliava iš Šilutės miesto (4,289 mg/g), o mažiausias antioksidantinis poveikis Pumpėnų rajone (2,440 mg/g). Atliekant plonasluoksnę ir efektyviąją skysčių chromatografiją lapuose ir vaistiniuose preparatuose veikliųjų medžiagų sulaikymo rodyklių ir sulaikymo laiko vidurkių santykinis standartinis nuokrypis neviršijo leistinos 5 proc. ribos. Taip pat chromatografijos analizės rezultatai sutapo su Europos farmakopėjos reglamentuojamais.

SUMMARY

The topic of the master thesis by Rolandas Gedminas is “The Variability of Analytical Indicators in Ivy Leaves (Hedera Helix L.) and Medical Products with Ivy Extracts”. The supervisor is prof. Dr. Valdas Jakštas, Lithuanian University of Health Science, Academy of Medicine, Faculty of Pharmacy, Department of Analytical and Toxicological Chemistry – Kaunas, 2018.

The aim of the research: To evaluate the variability of analytical indicators in medical

products with ivy extracts and in ivy leaves collected from different places in Lithuania by Spectrophotometric and Pharmacopoeial Chromatographic Methods.

The objectives of the research: To determine the total content of phenolic compounds and

saponins and their variability in ivy leaves (Hedera helix L.) collected in different places of Lithuania; To measure the antioxidant activity of ivy leaves; To determine the quality of saponins in ivy leaves (Hedera helix L.) and medical products with ivy extract by TLC and HPLC methods.

The object of the research: Ivy leaves (Hedera helix L.) collected in different places of

Lithuania (n=9) and medical products with ivy extract purchased in pharmacies (n=6).

The methods of the research: The total content of phenolic compounds has been evaluated by

Folin-Ciocalteu method and calculated by gallic acid equivalent. The total content of saponins have been evaluated using spectrophotometer with anisaldehyde reagent and calculated by saponins linear regression equation of the calibration curve. The antioxidant activity has been measured with CUPRAC assay using spectrophotometer. The Quality of saponins have been determined using pharmacopoeial TLC and HPLC methods.

Results and conclusions: The total content of phenolic compounds and saponins collected in

Lithuania were different. Maximum content of phenolic compounds was determined in Šilutė city (1,889 g/ml) and the minimum was in Pumpėnai area (1,095 g/ml). Maximum content of saponins were determined in Palanga (0,731 g/ml) and the minimum were identificated in Šilute city (0,296 g/ml). Moreover, in this research was measured antioxidant activity of ivy leaves. Maximum antioxidantical activity show off leaves from Šilutė city (4,289 mg/g) and the minimum activity were in leaves from Pumpėnai area (2,440 mg/g). Analizing with TLC and HPLC methods relative standard deviation of active substance means did not exceed the limit which is 5 percent. Also, chromatographic analysis results were simmilar as in Europe pharmacopoeia.

PADĖKA

SANTRUMPOS

ESC - efektyvioji skysčių chromatografija PC - plonasluoksnė chromatografija DPPH – 2,2- difenil-1-pikrilhidrazilas HDC – hederakosidas C

α-HN – alfa – hederinas

MTT – [3-(4,5-dimetiltia- zol-2-yl)-2,5-difeniltetrazolio bromidas] RF – sulaikymo rodiklis (plonasluoksnė chromatografija)

RT – efektyviosios skysčių chromatografijos medžiagų sulaikymo laikas CUPRAC – (2,9-dimetil-1,10-fenan-trolino) (Cu(II)-Nc)

PDA – fotodiodo matricos detektorius UV – Ultravioletinė spinduliuotė

ĮVADAS

Pastaruoju metu vis labiau domimasi augaliniais vaistiniais preparatais ne tik besivystančiose, bet ir industrializuotose šalyse. Yra nustatyta, jog geresnių rezultatų, ligos eigoje, yra pasiekiama naudojant visą augalo ekstraktą, o ne išskirtus jo komponentus [1]. Taip pat augalai ir jų ekstraktai yra puiki priemonė atlikti savigydą. Viena iš didžiausių sveikatos sutrikimo būklių, kai griebiamasi savigydos – peršalimas ar kosulys. Kosulys yra priskiriamas prie gynybinių žmogaus organizmo mechanizmų. Nepriklausomai ar lėtinis, ar ūminis kosulys, jis sukelia didelį diskomfortą žmogaus gyvenime [2]. Kosuliui malšinti (ypač esant drėgnam kosuliui) ir jį gydyti dažnai yra vartojami augaliniai vaistiniai preparatai su gebenių ekstraktu. Pagal atliktus tyrimus, Hedera helix L. yra puikiai toleruojamas ir efektyvus žmogaus organizmui esant kosuliui. Šis augalas taip pat pasižymi spazmolitiniu, antioksidantiniu, antimikrobiniu, priešuždegiminiu poveikiu [3].

Farmakologinis gebenės lipikės poveikis daugiausiai priklauso nuo biologiškai aktyvių medžiagų – triterpeninių saponinų (hederageninų), tai yra hederakosido C ir α – hederino. Organizme dauguma iš hederakosidu yra verčiami į α - hederiną arba β – hederiną [3]. Šių aktyvių junginių kokybė ir kiekybė skiriasi priklausomai nuo augalo augimo sąlygų, amžiaus, klimato. Šiuo metu yra skiriamas didelis dėmesys triterpeniniams saponinams, dėl jų naudingo farmakologinio poveikio žmogaus organizmui [4]. Šiuo požiūriu yra naudinga išsiaiškinti gebenių lipikių lapų, augančių Lietuvoje, potencialą ir jų kokybinę bei kiekybinę cheminę triterpeninių saponinų sudėtį. Mokslinių tyrimų, kurie būtų atlikti su gebenių lipikių lapais ar vaistiniais augaliniais preparatais Lietuvoje, rasti nepavyko.

Šiuo darbu siekiama įvertinti Lietuvoje augančiuose Hedera helix lapuose bei rinkoje esančiuose vaistiniuose preparatuose (su gebenės lipikės ekstraktu) biologiškai aktyvių junginių kokybinę sudėtį, naudojant Europos farmakopėjoje reglamentuojamus plonasluoksnės ir efektyviosios skysčių chromatografijos metodus. Taip pat nustatyti Lietuvoje augančių gebenių lipikių lapų bendrą fenolinių junginių, saponinų ir antioksidantinio aktyvumo įvairavimą.

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Tikslas:

Įvertinti skirtingose Lietuvos augavietėse rinktų gebenių lipikių lapų bei augalinių preparatų su gebenių ekstraktu analitinių žymenų rodiklių įvairavimą.

Uždaviniai:

1. Nustatyti gebenių lipikių lapų (H. helix), surinktų iš skirtingų Lietuvos vietovių, bendrą fenolinių junginių ir saponinų kiekį spektrofotometriniais analizės metodais.

2. Įvertinti gebenių lipikių (H. helix) lapų antioksidantinį aktyvumą taikant CUPRAC redukcines savybes.

3. Nustatyti Lietuvoje augančių gebenių lipikių (H. helix) lapuose ir augaliniuose vaistiniuose preparatuose esančių triterpeninių saponinų kokybinės sudėties rodiklius plonasluoksnės chromatografijos metodu.

4. Įvertinti Lietuvoje augančių gebenių lipikių (H. helix) lapuose ir augaliniuose vaistiniuose preparatuose esančių triterpeninių saponinų kokybinės sudėties rodiklius efektyviosios skysčių chromatografijos metodu.

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1 Gebenių lipikių (Hedera helix L.) augalo morfologija, paplitimas ir augimas

Augalas priklauso aralijinių (Araliaceae) šeimai, gebenės (Hedera) genčiai. Visžalis augalas, turintis šakotą stiebą, kuris driekiasi žeme, lipa į medžius, sienas. Pradiniai lapai yra šviesesni, o jiems senstant pasidaro tamsiai žali. Lapai yra apie 4-10 cm ilgio ir pločio, turintys plaukelių. Viršutinė lapo dalis yra tamsiai žalios blizgančios spalvos bei gerai pastebimas gyslotumas. Apatinė lapo dalis yra pilkai žalios spalvos, gyslotumas labiau išryškėjęs [3]. Žydi nuo vasaros pradžios iki vėlyvo rudens, žiedai yra žalsvai geltoni, nedideli, apie 3-5 cm dydžio. Žiedai pritraukia įvairius vabzdžius, ieškančius nektaro ir žiedadulkių [1, 2]. Vaisiai yra mažos juodos uogos iki 9 mm diametro su 2-5 sėklomis ir prinoksta žiemą. Labai populiarus kaip dekoratyvinis augalas, galintis užaugti iki 20 - 30m aukščio ar netgi kaip yra paskelbta iki 50m aukščio [1, 3]. Gebenė gali augti vertikaliai ant įvairių medžių, akmenų, namų sienų. Šis augalas sugeba labai stipriai prisitvirtinti prie paviršiaus, nutraukiamas dažniausiai visas nusiplėšia [6, 7].

1. Pav. Gebenės lipikės lapai ir vaisiai (Hedera helix L.) [8]

Gebenė lipikė auga ir yra paplitusi nuo vakarinės Azijos, šiaurinės Afrikos dalies iki Europos. Taip pat paplitusi šiaurinėje Irano dalyje, Turkijoje, Ukrainoje ir Portugalijoje. Jos auga natūraliose miesto zonose, iškirstuose miškuose ar miškingose vietovėse [8, 9]. Daugumoje šalių yra auginamas tiesiog kaip dekoratyvinis augalas. Gebenė lipikė lengvai auga įvairiomis sąlygomis, pavyzdžiui, sausame dirvožemyje ir toleruoja sausrą. Šis augalas teikia pirmenybę molingam ir turtingam dirvožemiui. Yra atsparus atmosferos užteršimams [3, 6].

Pagal Europos farmakopėją, kaip augalinė žaliava yra naudojami gebenių lipikių (Hedera helix L.) išdžiovinti bei susmulkinti lapai. Jie yra renkami pavasario ar vasaros mėnesiais [10]. Apie cheminę

sudėtį gebenių vaisiuose bei žieduose yra mažai literatūros, tačiau yra publikuota, jog jie taip pat kaupia triterpeninius saponinus, riebalų rūgštis, poliacetilenus, β – lektinus [3, 8].

Iš gebenių lapų yra gaminami įvairūs vaistiniai preparatai: čiulpiamosios pastilės, sirupai, geriamieji/išoriškai vartojami tirpalai, tabletės, šnypšiančios tabletės, kapsulės, arbata [12].

1.2 Gebenių lipikių (Hedera helix L.) lapų biologiškai aktyvūs junginiai

Renkant augalines dalis, jose esančios biologiškai aktyvios medžiagos priklauso nuo šių faktorių:

• Augalų veislės (lapų, lapuočių ar visžalių augalų forma ir paviršius); • Augalijos struktūros (plotis, aukštis, akytumas);

• Biologiškai aktyvių junginių aptikimo, nustatymo sunkumo lygio; • Augimo vietovės (miškas, miestas, geografinė padėtis);

• Aplinkybių (augimo aplinkybės, mikroklimatas) [13].

Biologiškai aktyvūs junginiai, kurie atsakingi už medicininę paskirtį gebenėje yra triterpeniniai saponinai, kurie sudaro apie 2.5-6 proc. visų randamų medžiagų. Svarbiausi yra hederageninai: hederakosidas C (1.7-4.8 proc.), hederakosidas D (0.4-0.8 proc.), hederakoosidas B (0.1-0.2 proc.) ir monodesmosidas hederinas (0.1-0.3 proc.). Organizme dauguma iš hederakosidu yra verčiami į α-hederiną arba β – α-hederiną [1,11]. Taip pat randama flavonoidų (rutino, kvercetino), kofeino rūgšties darinių (chlorogeno rūgštis, rozmarino rūgštis), sterolių, lakiųjų aliejų, kumarinų, antocianų, fenolinių rūgščių, steroidų, aminorūgščių, vitaminų, β-lektinų ir poliacetilenų [11, 12, 13].

1.3 Gebenių lipikių (Hedera helix L.) farmakologinis poveikis

Literatūros šaltiniuose dažniausiai aprašomas gebenės lipikės poveikis yra atsikosėjimą lengvinantis, kai pasireiškia drėgnas kosulys. Taip pat vartojamas ir kitų kvėpavimo takų simptomams ar lėtinio bronchito atvejais [1, 6]. Yra nustatytą savybių, kurias sukelia Hedera helix - padeda atsikratyti svorio bei yra efektyvus gydant celiulitą. Taip pat yra naudojami preparatai tokie kaip kremai, losjonai bei šampūnai įvairioms odos ligoms, niežuliams. Gebenė lipikė pasižymi ir šiomis savybėmis – antimikrobiniu, prieš leišmanijas ar moliuskus bei antihelmintiniu poveikiu [1, 10].

Veikimo mechanizmas yra ne iki galo ištirtas, bet yra manoma, jog hederokosidas C yra provaistas ir virsta organizme į α-hederiną. α-HN veikia į plaučių ląsteles (jungiasi prie β2 adrenerginių receptorių) ir aktyvina gamybą bei produkciją paviršiuje aktyvių medžiagų, kurios skystina gleives. Gleivės kvėpavimo takuose sutepa ir malšina dirginimą, ir taip apsaugo bei gydo nuo įvairių kvėpavimo sutrikimų [12, 14].

1.3.1 Gydomasis poveikis kvėpavimo sistemai

Yra randama daug literatūros šaltinių apie gebenių preparatų monoterapiją ar terapiją su kitais vaistais, pavyzdžiui, čiobreliais gydant kvėpavimo takų sutrikimus. Buvo atliktas tyrimas apie gebenių lipikių poveikį prieš lėtinį bronchitą, kuriame dalyvavo 1,350 pacientų vyresnių nei 4 metai. Jiems buvo skirtos - 2 tabletės per dieną su gebenių lipikių lapų sausu ekstraktu. Poveikis nustatytas ištyrus pokytį pradėjus sirgti lėtiniu bronchitu ir pabaigus gydymą gebenių ekstraktu. Rezultatai gauti, jog po gydymo 92,2% išgijo nuo kosulio, 94,2% nuo gleivių sekreto, 86,9% kvėpavimo sistemos jaučiamo skausmo [15]. Taip pat tyrimais yra nustatytas gebenių lipikių ekstrakto poveikis prieš simptomines kvėpavimo takų ligas, ūmines ar lėtines uždegimines bronchų ligas, bronchinė astmą, peršalimo ligų sukelto kosulio gydymą ar įvairias ūminio kvėpavimo takų ligos [16–21].

1.3.2 Antioksidantinis poveikis

Žmogaus organizmas turi kompleksinę sistemą su natūraliais fermentiniais ir nefermentiniais antioksidantais, kurie saugo nuo kenksmingų poveikio, o juos sukelia laisvieji radikalai ir kiti oksidantai. Yra nustatyta, jog antioksidantai turi labai didelę naudą gerinant gyvenimo kokybę užkertant kelią įvairioms ligoms [22]. Norint nustatyti Hedera helix L. antioksidantinį poveikį, yra atlikti tyrimai su DPPH metodu – tai bendras antioksidantinis poveikis, redukcinis aktyvumas, metalus surišantis aktyvumas. Tyrimas atliktas su pelėmis, kurioms buvo po oda leidžiamas α-HN po 10 ir 30 mmol/kg. Po 3 dienų duomenys parodė, jog padidėjo glutationo kiekis, glutationo peroksido ir

glutationo-S-transferazės kiekis pelėse. Taip pat buvo sumažėjęs katalazės kiekis ir padidėjęs metalotioneinas. Glutationas – antioksidantas svarbus gyvame organizme, kuris stabdo žalą nuo įvairių rūšių laisvųjų radikalų, peroksidų, sunkiųjų metalų. Metalotioneinas padeda surišti sunkiuosius metalus tokius kaip cinkas, varis, selenas, kadmis, gyvsidabris [1, 23, 24, 25, 26].

1.3.3 Priešuždegiminis poveikis

Buvo atliktas tyrimas su vyriškomis suaugusiomis jūrų kiaulytėmis (n=8), kurioms buvo padidėjęs jautrumas ovalbuminui. Jos gydytos su 0.3-3.0mg/kg α-HN leidžiant į pilvo ertmę. Gauti duomenys parodė, jog ženkliai padidėjo uždegiminių mediatorių – interleukino 2,4 ir 17 bei γ – interferono kiekis. Taip pat tai sukėlė histamino kiekio bei baltųjų kraujo kūnelių sumažėjimą, basofilų ir eosinofilų skaičiaus sumažėjimą bei neutrofilų, limfocitų ir monocitų padidėjimą [27, 28, 29]. Interleukinai – tai baltymų grupė dar vadinama citokinais, kurie atsakingi už įvairias imunomoduliacinias funkcijas – tokias kaip ląstelių judėjimas, augimas, adhezija. Jie yra svarbūs imuninių ląstelių diferenciacijai bei aktyvacijai [30, 31].

Kitame tyrime buvo nustatytas potencialus priešuždegiminis α-HN ir HDC duoto per os ir tirta karagenino sukelta ūminė žiurkių edema (n=6). Tyrimo metu, buvo nuspręsta, jog Hederokosidas C veikia antroje uždegimo fazėje ir blokuoja bradikininą arba kitus uždegiminius mediatorius, todėl pasireiškia priešuždegiminis poveikis. α-HN buvo neveiksmingas tiek pirmoje tiek antroje fazėje. Sprendžiant apie struktūros aktyvumo ryšius, manoma, jog prie C3 ir C28 padėties prijungti angliavandeniai apsprendžia ūminį priešuždegiminį poveikį [32].

1.3.4 Antimikrobinis poveikis

Nustatyta, jog gebenių lapų ekstraktas turi poveikį prieš 23 skirtingas padermes (22 gram+ teigiamas bei gram- bakterijas ir 1 mielės) [3]. Mikrobiologiniams testams buvo naudojami Muller-Hinton agaras. Vieno tyrimo metu kultūra buvo inkubuota ties 37oC ir laikyta iki 72 valandų. Antimikrobiškai veikiančių Hedera helix ekstraktų nustatymas buvo ištirtas naudojant agaro „šulinėlių“ difuzijos metodą. Šis metodas pagrįstas tiriamosios medžiagos geba difunduoti mitybinėje terpėje. Kaip standartas naudotas Streptomicinas (2 mg/ml). Skirtingi ekstraktai buvo paruošti su heksanu, chloroformu, etilo acetatu bei metanoliu. Nustatytas žymus antimikrobinis poveikis prieš pasirinktas bakterijas (3 gram teigiamos ir 2 gram neigiamos) Esherichia coli, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumonia, Staphylococcus epidermidis, Bacillus subtilis. Geriausiai veikė ekstraktai su etilo acetatu bei metanoliu, tačiau tik ekstraktas su heksanu vienintelis veikė prieš Klebsiella pneumonia [33].

Kito tyrimo metu buvo tirta lapų, neprinokusių bei prinokusių vaisių ir žiedų etanoliniai ekstraktai. Antibakterinės savybės buvo nustatytos mikropraskiedimo metodu. Muller–Hinton

paruoštos lėkštelės laikytos iki 48 valandų ties 37o_{C. Buvo pasirinktos 3 gram teigiamos bakterijos}

(Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Listeria monocytogenes) ir 3 gram neigiamos (Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium, Esherichia coli). Gauti rezultatai parodė, jog geriausias antibakterines savybes turi neprinokę vaisiai ir žiedai bei jie labiausiai veikia prieš S. aureus ir L. monocytogenes [11].

1.3.5 Priešvėžinis poveikis

Vėžys yra vienas didžiausių mirštamumo problemų. Pasauliniu mastu sudaro maždaug apie 20% visų mirčių atvejų. Pasaulio sveikatos organizacijos duomenimis iki 2014 metų yra paskelbta maždaug apie 14 milijonų įvairių vėžinių susirgimų atvejų. Todėl vis dar yra intensyviai ieškoma būdų bei medžiagų, kaip sumažinti mirštamumą nuo vėžinių ligų [31, 32, 34].

Priešvežinių savybių yra nustatyta ir gebenėje. Buvo išskirtas hederageninas, oleonolio rūgšties darinys ir buvo nustatinėjamas jo poveikis prieš žmogaus storosios žarnos epitelio ląsteles. Norint nustatyti ląstelių gyvybingumą buvo atliktas MTT kiekybinis testas, taip pat atliktas apoptozės aktyvumas, mitochondrinių membranų potencialas, polimerazės grandininė reakcija bei „Wester blotting“ analizė. Šių tyrimų pagalba nustatyta, jog hederageninas išgautas iš Hedera helix L. lapų skatina apoptozę epitelinių ląstelių per mitochrondrinį kelią. Šiuo tyrimų buvo įrodyta, jog medžiaga išskirta iš gebenių lipikių lapų gali būti veiksminga prevencijai bei gydymui žmogaus storosios žarnos vėžio atvejais [35].

Panašiais tyrimais nustatytas poveikis α – hederino prieš krūtų vėžį. Jis sėkmingai stabdo krūties vėžines ląsteles ir skatina apoptozę ir mažina mitochondrijų potencialą vėžinėse ląstelėse. Dar vienas nustatytas poveikis α-HN yra prieš gerklų karcinomą – skatina ląstelių nekrozę bei apoptozę [36, 37].

1.4 Gebenių lipikių bioaktyvių medžiagų nustatymo metodai

1.4.1 Analizės metodai naudojant spektrofotometrą

Yra įvairių metodų, metodikų ir prietaisų norint identifikuoti įvairias medžiagas junginiuose, produktuose, augalų dalyse. Visi metodai ar prietaisai yra daugiau ar mažiau skirtingi ir skiriasi savo veikimo principu, atrenkamumu, jautrumu ar ekonominiu atžvilgiu. Visi metodai ar prietaisai turi tiek pliusų, tiek ir minusų tiriant, nustatant medžiagas ar junginius. Vieni iš plačiausiai naudojamų analizės metodų yra su spektrofotometrio prietaiso pagalba. Šiuo prietaisu yra nesunku naudotis, greita analizė, nereikia specialių patalpų ar tam apmokytų žmonių, nėra brangus iš ekonominės pusės bei galima analizuoti tiek spalvotus, tiek nespalvotus junginius [38]. Yra parašyta daugybė analizės metodų su

spektrofotometru, kurie taikomi įvairių mišinių kiekybinei analizei, kompleksinių junginių kiekybiniams santykiams nustatyti, įvairių priemaišų kiekiui nustatyti ar biologiniams tyrimams. Pagrindinis spektrofotometrijos principas – specialios prizmės pagalba išskaidyti spindulių pluoštą į skirtingus bangos ilgius. Kiekvienas junginys ar medžiaga praleidžia arba sugeria šviesą per tam tikrame diapazone esantį bangos ilgį. Šiuo principu yra matuojamas šviesos intensyvumas ir kiek šviesos tam tikra cheminė medžiaga absorbuoja [3. Pav.] [36, 37]. Spektrofotometriniai analizės metodai yra mažiau jautrūs, lyginant su chromatografiniais analizės metodais, gali būti sunku nustatyti norimos medžiagos absorbcijos spektrą dėl įvairių priemaišų ar per mažos koncentracijos tiriamajame tirpale [41].

3. Pav. Bendra spektrofotometro schema [40].

1.4.2 Plonasluoksnė chromatografija

Tai vienas iš dažniausiai naudojamų analizės metodų, kuris yra taikomas tiek farmacijoje, tiek ir kitose mokslo srityse. Daugelyje tyrimų yra svarbu atskirti mišinį į jo cheminę sudėtį norint izoliuoti tam tikrą junginį arba įvertinti mišinio grynumą. Šio metodo privalumai yra tokie, jog tai paprastas, lengvai atliekamas, patikimas bei atrankus metodas. Plonasluoksnė chromatografija dažniausiai naudojama organinėms bei neorganinėms medžiagoms atskirti, identifikuoti, valyti prieš tai juos išskyrus, ekstrahavus iš vaistinių augalinių žaliavų ar preparatų, biologinių skysčių ar kitų medžiagų. Šis metodas lyginant su kitomis chromatografijomis yra pigus ir paprastas, galima naudoti įvairius sorbentus ar tirpiklių sistemas bei analizės atlikimo laikas yra žymiai trumpesnis. Tačiau plonasluoksnė chromatografija yra mažiau jautrus metodas palyginus, pavyzdžiui, su dujų chromatografija ar efektyviąją skysčių chromatografija [39, 40, 41].

Šio tyrimo metu naudojama aparatūra yra – stiklo talpykla, plonasluoksnės chromatografijos plokštelės, džiovinimo krosnis ar džiovyklė, UV šviesa, purškiklis, purškimo kamera, pieštukas, liniuotė [42].

Plonasluoksnės chromatografijos veikimo principas susideda: judrios fazės, kuri yra skystis bei stacionarios fazės, kuri užsideda plonu sluoksniu tiriamosios medžiagos ant plokštelės paviršiaus. Stacionarios fazės medžiaga dar yra vadinama kaip sorbentas. Judri fazė žinoma kaip tirpiklio fazė, kuri pereina per stacionarią fazę. Tirpiklio molekulės kameroje juda išilgai plokštele ir taip pakartotinai tampa absorbuotos arba desorbuotos. Kylant judriai fazei per plokštelę atsiranda atskiros zonos tam tikrų junginių. Medžiagos, kurios stipriai prisitraukia prie sorbento, judės lėčiau, o tos kurios juda greitai, vadinasi yra geriau tirpios judrioje fazėje. Kai judrioji fazė užkyla iki tam reikiamos ribos, visi norimi cheminiai komponentai iš tiriamųjų mėginių bus ant plokštelės (4 Pav.). Norint juos nustatyti pirmiausia reikia gerai nusausinti plonasluoksnės chromatografijos plokštelę ir toliau vadovaujantis nustatyta metodika identifikuoti norimus cheminius junginius. Identifikavimui dažniausiai naudojama UV lempa arba apipurškiama plokštelė nurodytais reagentais, jeigu reikia pakaitinama. Tokiu būdu išryškėja ant plonasluoksnės plokštelės cheminiai junginiai ir galima atlikti tolimesnę analizę ar skaičiuoti kiekybiškai [42, 43, 45].

4. Pav. Plonasluoksnės chromatografijos metodo schema [46].

1.4.3 Efektyvioji skysčių chromatografija

Šiomis dienomis farmacijos pramonėje efektyviosios skysčių chromatografijos metodas yra neatsiejamas bei pagrindinis, kuriant bei identifikuojant įvairias medžiagas [47]. Šis analitinis metodas yra naudojamas mišinių priemaišoms, kokybiniams ir kiekybiniams tyrimams, remiantis skirtingomis sulaikymo trukmėmis. Mechanizmo principas yra, kai ištirpusios tiriamosios medžiagos juda kartu su judria fazę (eliuentu) ir pereina per stacionarią fazę (sorbentą), kuri yra kolonėlėje [48].

Chromatografinė analizė prasideda nuo tiriamosios medžiagos įleidimo, vyksta pasiskirstymas, analičių detekcija ir gautų duomenų apdorojimas bei įvertinimas. ESC susideda iš – tirpiklio rezervuaro, siurblio, mėginio injekatoriaus, kolonėlės, detektoriaus bei duomenų rinkimo įrenginių arba integratorių (5 Pav.). Tirpiklio rezervuarai yra stikliniai indai, kuriuose laikoma judančioji fazė. Siurblio funkcija yra

siurbti mobiliąją fazę iš tirpiklio rezervuaro ir leisti toliau į kolonėlę, kuri pereina per detektoriu. Siurblio darbinis slėgis dažniausiai būna 42000 KPa. Injektorius gali būti kompiuterizuotas arba vienkartinė injekcija su švirkštu. Kolonėlės dažniausiai yra pagamintos iš nerūdijančio plieno maždaug apie 50 – 300 mm ilgio. ESC detektorius randasi gale ir jis atskiria analites, kurios eliuojasi iš chromatografinės kolonėlės. Detektoriai gali būti paprasti ultravioletinės spinduliuotės arba patogesni diodų matricos ultravioletinės spinduliuotės detektoriai, su kuriais yra paprasta nustatyti smailės grynumą. Taip pat, fluorescuojantiems junginiams dažniausiai naudojama fluorascencinis detektorius, kurie yra daug kartų jautresni nei UV detektoriai. Nevisiškai atskirtiems junginiams arba turintiems panašius chromatoforus yra naudojami masių spektrometriniai detektoriai. Šie detektoriai yra labai jautrus. Oksiduojantiems bei redukuojantiems junginiams galima tirti su elektrocheminiais detektoriais [48, 49].

Efektyviosios skysčių chromatografijos privalumai – reikalingi nedideli kiekiai tirpiklio bei galima vienu metu leisti kelis tiriamuosius mėginius, tai sutaupo laiko bei išlaidų. Taip pat yra jautresnis metodas nei spektrofotometrija ar plonasluoksnė chromatografija. Trūkumai, jog reikalinga brangi ir sudėtinga aparatūra bei ilgas analizės laikas [50].

5. Pav. Efektyviosios skysčių chromatografijos schema [51].

Kosulys yra vienas iš dažniausiai pasitaikančių simptomų, ypač peršalimo atveju, o gebenių lipikių lapuose esantys triterpeniniai saponinai padeda lengvinti šį atsikosėjimą. Norint sėkmingai lengvinti atsikosėjimą sergant peršalimo ligomis ar lėtiniu bronchitu yra būtina nustatytų tiek gebenių lipikių lapų, tiek ir augalinių vaistinių preparatų kokybę. Atlikus literatūros analizę nebuvo rasta tyrimų, kuriuose būtų analizuoti gebenių lipikių lapai rinkti Lietuvoje bei Lietuvoje atliktų analizės tyrimų su vaistiniais augaliniais preparatais, kurių sudėtyje yra gebenės ekstrakto. Todėl buvo nustatinėjami tam tikrų rodiklių įvairavimai, analizuojant gebenių lipikių lapus ir augalinius vaistinius preparatus, naudojant įvairias mokslininkų pateiktas metodikas bei kokybinius tyrimus remiantis Europos farmakopėjoje (01/2013:2148 monografijos) reglamentuotomis metodikomis.

2.

TYRIMO METODIKA

2.1 Tyrimo objektas

Gebenių lipikių (Hedera helix L.) preparatai skirti lengvinti atsikosėjimą sergant peršalimo ligomis arba lėtiniu bronchitu (įsigyti iš Lietuvos vaistinių) ir augalinė vaistinė žaliava - lapai surinkti iš skirtingų Lietuvos miestų bei rajonų (1 lentelė).

1. Lent. Gebenių lipikių (Hedera helix L.) augalinė žaliava bei vaistiniai preparatai Gebenių lipikių (Hedera helix L.) lapai

(rinkimo vietovė ir koordinatės)

Gebenių lipikių (Hedera helix L.) preparatai

Plungė; 55.90409 N, 21.86389 E Herbion (Sirupas A) 7mg/ml Panevėžys; 55.714975 N, 24.386416 E Prospan (Geriamieji lašai A) 20 mg/ml

Vilnius; 54.680302 N, 25.296602 E Hedelix (Geriamieji lašai B) 40 mg/ml Naujoji akmenė; 56.320721 N, 22.884202 E Prospan (Geriamasis tirpalas) 7 mg/ml Pumpėnų rajonas; 55.931550 N, 24.349140E Prospan (Šnypšiančios tabletės) 65 mg

Šilutė; 55.354514 N, 21.460559 E Prospan (Sirupas B) 7mg/ml Kaunas; 54.902506 N, 23.929442 E

Klaipėda; 55.7501555 N,21.1242774 E Palanga; 55.9154019 N,21.0727066 E

Žaliava rinkta pavasario mėnesiais. Surinkti lapai buvo džiovinami kambario temperatūroje, apsaugant nuo tiesioginių saulės spindulių. Išdžiovinti gebenių lipikių lapai buvo laikomi popieriniuose maišeliuose, ne aukštesnėje kaip 25℃ temperatūroje, sausoje vietoje. Vaistiniai preparatai įsigyti iš Lietuvos vaistinių.

2.2 Reagentai

Folin-Ciocalteu reagentas (Galo rūgštis 98 proc., Acros organics), Metanolis 99,8 proc. (Sigma-Aldrich, Vokietija), Anisaldehidas (Sigma-(Sigma-Aldrich, Scnelldorf, Vokietija), Išgrynintas vanduo (vandens

gryninimo sistema Milipore, Bedford MA, JAV), Natrio karbonatas (Sigma-Aldrich, Scnelldorf, Vokietija), Etanolis 96 proc. (Vilniaus degtinė), Sieros rūgštis 50 proc. (Sigma-Aldrich,Scnelldorf, Vokietija), Sieros rūgštis koncentruota (Sigma – Aldrich, Scnelldorf, Vokietija); Ledinė acto rūgštis (99,5 proc. Sigma-Aldrich, Scnelldorf, Vokietija), Aliuminio chloridas (99,99 proc. Sigma-Aldrich, Scnelldorf, Vokietija), Heksametilentetraminas (≥99,9 proc., Roth, Vokietija), Vario (II) chlorido dihidratas („Alfa Aesar GmbH & Co KG“ ,Karlsruhe, Vokietija), Neokuproinas (Sigma-Aldrich,Scnelldorf, Vokietija), Amonio acetatas (Sigma-Aldrich, Scnelldorf, Vokietija), Skruzdžių rūgštis, acetonas, metanolis, etilo acetatas, Acetonitrilas, fosforo rūgštis (Sigma-Aldrich,Scnelldorf, Vokietija).

2.3 Aparatūra

Augalinės žaliavos ekstraktai iš gebenių lipikių (Hedera helix L.) lapų bei augalinių vaistinių preparatų buvo gaminami naudojant ultragarso vonelę (WiseClean). Garinimas vykdomas rotaciniame garintuve Heidolph G3 (Nuremberg, Vokietija). Vandens gryninimo sistema Millipore (Bedford, MA). Svėrimams naudotos analitines svarstyklės (Shimadzu Auw 120 D, Bellingen, Vokietija). Automatinės pipetės (Eppendorf Research, Eppendorf, JAV). Taip pat naudotas centrifugavimo aparatas – Centurion Scientific C2006 (Centurion Scientific Ltd, Jungtinė Karalystė).

Bendras fenolinių junginių, saponinų bei oksidantinis aktyvumas buvo nustatytas naudojant spektrofotometrą (Dynamica, HALO DB-20/ UV spectrofotometer). Bandiniams tirti panaudotos 1 cm skersmens kiuvetės.

Veikliųjų medžiagų atskyrimas buvo atliktas plonasluoksnės chromatografijos CAMAG Twin trough Champer 10x10 cm kameroje. Naudojant pusiau automatinį CAMAG Linomat 5 su specialiu 100 ml švirkštu, mėginiai buvo užnešti ant silikageliu dengtos chromatografinės plokštelės (TLC Silica gel 60 F254, 20x20 cm, Darmstadt, Vokietija). Plokštelės išdžiovinimui bei kaitinimui buvo naudotos

CAMAG kaitlentės. Kokybiškai nagrinėta naudojant CAMAG TLC Visualizer ir winCATS programinę įrangą.

Efektyvioji skysčių chromatografija atlikta su Waters Alliance e2695 Separations Module kartu su Waters 2998 PDA detektoriumi (Milford, JAV).

2.4.1 Bendras fenolinių junginių kiekio, išreikšto galo rūgšties ekvivalentu,

nustatymas Folin-Ciocalteu metodu

2.4.1.1 Tiriamo pavyzdžio ruošimas bei metodika

Ekstraktai buvo ruošiami iš 0,1 g susmulkintų gebenių lipikių lapų. Ekstrakcija vykdoma 50 min. su 10 ml, 70 proc. (v/v) metanoliu vibracinėje vonioje. Gauti ekstraktai filtruojami per filtravimo popierių ir centrifuguojami.

Tyrimams atlikti paruošiamas darbinis reagentas: 7 proc. natrio karbonato tirpalas paruošiamas 17,5 g medžiagos tirpinant 250 ml distiliuoto vandens. Analizei imamas 1 ml augalinės žaliavos metanolio ekstrakto, kuris sumaišomas su 1 ml Folin-Ciocalteu reagento, 9 ml distiliuoto vandens ir po 5 min. įpilama 10 ml 7 proc. natrio karbonato tirpalas bei praskiedžiama iki 25 ml. Gautas mišinys gerai suplakamas ir paliekamas 90 min. kambario temperatūroje, tamsoje. Praėjus nustatytam laikotarpiui spektrofotometru matuojama tirpalo absorbcija ties 750 nm šviesos bangos ilgio. Matavimai yra pakartojami tris kartus.

Taip pat buvo paruoštas lyginamasis tirpalas, kuris ruošiamas lygiai tomis pačiomis sąlygomis kaip ir tiriamasis tirpalas, tačiau vietoje gebenės lipikės augalinės žaliavos ekstrakto yra pilamas 1 ml distiliuoto vandens.

Etaloniniai galo rūgšties tirpalai ruošiami taip pat kaip tiriamieji tirpalai, tik vietoje 1 ml ekstrakto imama 1 ml žinomų koncentracijų galo rūgšties tirpalai.

Gauti duomenys vertinami pagal galo rūgšties kalibracinio grafiko tiesinės regresijos lygtį [52]. y = 0,9068x + 0,0617;

R² = 0,996;

y = absorbcijos dydis;

x = bendras fenolinių junginių kiekis, išreikštas GRE (galo rūgšties ekvivalentu) mg/ml.

2.4.2 Bendras saponinų kiekis naudojant anisaldehido reagentą.

2.4.2.1 Tiriamo pavyzdžio ruošimas bei metodika

Ekstraktai ruošiami imant po 0.3 g žaliavos ir sumaišant su 10 ml išgryninto vandens. Pastatomi į ultragarso vonelę 15 min. Po to mišiniai centrifuguojami - 5 min ties 400 apsisukimo greičiu.

Tyrimams yra paruošiamas darbinis mišinys. Imama po 1ml tiriamojo tirpalo ir sumaišoma su 1ml anisaldehido (0,5 proc.), palaikoma 10 min. pastovėti. Tada įpilama 4 ml sieros rūgšties 50 proc. ir gerai sumaišoma, pašildoma vonelėje ties 60o laipsniu 10 min, pakaitinus mėginiai yra atvėsinami ir centrifuguojami. Matuojama absorbcijos dydis su spektrofotometru 1 cm kiuvetės ties 435 nm bangos ilgiu ir apskaičiuojama pagal saponinų kalibracinio grafiko tiesinės regresijos lygtį [47, 48].

Lyginamas tirpalas – 1 ml anisaldehido ir 4 ml sieros rūgšties. y=1,9584x + 0,1074

R² = 0,983

y = absorbcijos dydis;

x = bendras saponinų kiekis išreikštas bendro saponinų ekvivalentu mg/ml.

2.4.3 Antioksidantinis CUPRAC metodo tyrimas UV spektrofotometriniu metodu

2.4.3.1 Tiriamo pavyzdžio ruošimas bei metodika

Iš smulkintų ir džiovintų gebenių lipikių (Hedera helix L.) žaliavų buvo gaminami 1:100 metanoliniai ekstraktai. Ekstrakcijai panaudota ultragarso vonelė. Ekstrakcija atliekama vandeniniu 70 proc. metanoliniu tirpalu (V/V). Atsveriama 0,1 g (tiksli masė) smulkintos žaliavos, užpilama 10 ml tirpalo ir ekstrahuojama 50 minučių ultragarso vonelėje, palaikant pastovią 25o_{C temperatūrą. Gauti}

ekstraktai buvo filtruojami pro popierinį filtrą.

CUPRAC reagento tirpalas buvo gautas sumaišius vario druską (CuCl2x2H2O), neokuproiną

((CH3)2 C12 H6N2)) ir acetoninį buferį, kurio pH=7, santykiu 1:1:1. Sumaišytas tirpalas 1 valandą buvo

laikytas tamsoje, kambario temperatūroje. CuCl2 tirpalas buvo gamintas atsvėrus 0,17 g CuCl2x2H2O

druskos, kuri buvo tirpinama išgrynintame vandenyje ir skiedžiama matavimo kolboje iki 100 ml. Neokuproino tirpalas buvo gamintas tirpinant 0,1566 g neokuproino 70 proc. metanolyje ir skiedžiant matavimo kolboje išgrynintu vandeniu iki 100 ml. Gaminant acetatinį buferį buvo atsverta 0,077 g amonio acetato (NH4CH3CO2), tirpinama vandenyje ir praskiesta vandeniu matavimo kolboje iki 1000

ml.

Tirtų junginių antioksidantiniam nustatymui buvo naudotas UV spektrofotometras ir CUPRAC reagentas. Į 3 ml kiuvetę įpilama 3 ml sumaišyto reagento tirpalo. Sumaišytas CUPRAC reagentas sudarytas iš lygių dalių: vario (II) chlorido, neokuproino ir buferinio amonio acetato tirpalo, santykiu 1:1:1. Į reagentu užpildytas kiuvetes automatinėmis pipetėmis įpilama 10 µl tiriamojo ekstrakto mėginio.

Spektrofotometru matuojamas tiriamųjų mėginių šviesos absorbcija, esant 450 nm bangos ilgiui. Antioksidantinis aktyvumas CUPRAC metodu išreiškiamas pagal trolokso kalibracinę kreivę [55]. y=0,3899x + 0,0908;

R2 = 0,99;

y = absorbcijos dydis;

x = antioksidantinis aktyvumas išreikštas pagal trolokso kalibracinę kreivę mg/g;

2.5 α-hederino ir hederokosido C kokybinis įvertinimas plonasluoksnės

chromatografijos metodu

Veikliųjų medžiagų įvertinimas plonasluoksnės chromatografijos metodu gebenių lipikių (Hedera helix L.) lapuose bei vaistiniuose preparatuose buvo atliktas remiantis Europos farmakopėja (01/2013:2148 monografija) [10]. Tiriamasis tirpalas paruošiamas iš 0.5g susmulkintos medžiagos arba augalinio vaistinio preparato ir praskiedžiamas su 5ml metanoliu. Tirpalas kondensuojamas rotaciniame garintuve ties 60oC 30 min.

Chromatografija atlikta CAMAG Twin trough Champer 10x10 cm kameroje. Tirpiklių sistema – bevandenė skruzdžių rūgštis, acetonas, metanolis, etilo acetatas (4:20:20:30 V/V/V/V). Bendras tirpiklių sistemos tūris – 74 ml. Kameros prisotinimui, tirpiklių sistemos garais, plonasluoksnės chromatografijos kamera buvo palaikyta 15 min. uždengta.

Chromatografinė plokštelė - naudojant pusiau automatinį CAMAG Linomat 5 su specialiu 100 ml švirkštu, mėginiai buvo užnešti ant silikageliu dengtos chromatografinės plokštelės. Išdžiūvus ekstraktams plokštelė statmenai dedama į chromatografijos kamera, kuri yra prisotinta tirpiklių sistema. Kai tirpiklių sistema pakyla iki nurodytos ribos – 12 cm, plokštelė išimama ir išdžiovinama bei kelias minutes pakaitinama ties 100-105oC ant specialios plokštelių kaitlentės.

Chromatografinės plokštelės ryškinimas - dar karšta plokštelė apipurkškiama alkoholiniu sieros rūgšties tirpalu (20 ml koncentruota H2SO4 ir 80 ml 96% etilo alkoholis) ir vėl kaitinama esant 110oC

temperatūrai ant kaitlentės 10 min.

Atvėsinta plokštelė kokybiškai nagrinėjama naudojant CAMAG TLC Visualizer ir winCATS programinę įrangą. Prietaisų pagalba plokštelė nufotografuojama dienos šviesoje ir tiriami rezultatai. Tiriamieji tirpalai buvo lyginami su Europos farmakopėjoje nurodyta chromatografija.

2.6 α-hederino ir hederokosido C kokybinis įvertinimas efektyviosios skysčių

chromatografijos metodu

Efektyviosios skysčių chromatografijos analizei buvo naudota metodika, kuri aprašyta Europos farmakopėjos „01/2013:2148“ monografijoje [10].

Efektyviajai skysčių chromatografijai kaip tirpiklis buvo naudotas – išgrynintas vanduo bei metanolis (20:80 V/V).

Tiriamojo tirpalo paruošimas – atsveriama po 1g tiriamosios medžiagos ir sumaišoma 250 ml apvaliadugnėje kolboje su 50 ml pagamintu tirpikliu. Kiekvienas paruoštas mėginys kaitinamas ties 80o_C

rotaciniame garintuve po 1 valandą. Praėjus nurodytam laikui, tiriamieji tirpalai atvėsinami ir nufiltruojami per vatą į 100 ml matavimo kolbą. Ant vatos, kartu su liekanomis, yra užpilama su 30 ml tirpiklio ir garinama rotaciniame garintuve 30 min. Atvėsinus ir nufiltravus, gauti filtratai yra supilami į 100 ml matavimo kolbą. Filtravimo vata su liekanomis dar karta yra perplaunama tirpikliu, nufiltruojama ir supilama į išekstrahuotą tirpalą iki 100 ml žymos.

Kolonėlės dydis – ilgis = 0,125 m, plotis = 4 mm;

Judriosios fazės ruošimas – susidaro iš A ir judriosios fazės B. A fazę sudarė – 140 ml acetonitrilas bei 880 ml distiliuoto vandens, pH nustatytas iki 2 su fosforo rūgštim. B fazė – fosforo rūgštis ir acetonitrilas (0,2 : 99,8 V/V).

Tėkmės greitis, kaip reglamentuoja Europos farmakopėja, turi būti 1,5 ml/min ir injekcinis tiriamojo mėginio tūris – 20 µl. Detekcija nustatyta su spektrofotometru ties 205 nm.

2.7 Statistinis duomenų apdorojimas

Tyrimų duomenys apdoroti Microsoft Office Excel 2013 (Microsoft, JAV) ir „SPSS 21“ (IBM, JAV) programomis. Visi bandymai kartoti po tris kartus, o rezultatai pateikti kaip vidutinė reikšmė ± standartinis nuokrypis (SN). Taip pat apskaičiuotas tyrimo duomenų standartinis santykinis nuokrypis (SSN). Įsitikinti, kad skirstinys yra normalus, buvo atliktas „Shapiro–Wilk” testas. Statistiškai reikšmingas skirtumas laikomas jeigu p<0,05.

3. REZUTATAI IR JŲ APTARIMAS

Tyrimams buvo naudojami gebenių lipikių (Hedera helix L.) iš įvairių miestų bei rajonų surinkti lapai ir iš Lietuvos vaistinių įsigyti nereceptiniai augaliniai vaistiniai preparatai. Žaliavos rinktos iš – Plungės, Panevėžio, Vilniaus, Naujosios akmenės, Pumpėnų rajono (Panevėžio apskritis), Šilutės, Kauno, Klaipėdos ir Palangos miestų.

Spektrofotometriniai tyrimai buvo atlikti naudojant vandeninius ar metanolinius gebenių lipikių (Hedera helix L.) lapų ekstraktus. Tiriant šiuos ekstraktus buvo nustatytas bendras fenolinių junginių kiekis, kuris išreikštas galo rūgšties ekvivalentu GRE mg/g. Taip pat nustatytas ir antioksidantinis aktyvumas naudojant CUPRAC spektrofotometrinį metodą, šio metodo rezultatai apskaičiuoti pagal trolokso kalibracinę kreivę mg/ml. Gebenių lipikių (Hedera helix L.) lapuose buvo nustatytas bendras saponinų kiekis, naudojant anisaldehido reagentą ir apskaičiuotas pagal saponinų kalibracinio grafiko tiesinės regresijos lygtį mg/ml. Bandymai pakartoti po tris kartus (n=3). Gauti rezultatai buvo statistiškai įvertinti. Statistiškai reikšmingas skirtumas laikomas, kai p<0,05.

3.1.1 Bendras fenolinių junginių kiekio tyrimas H. helix lapuose surinktuose iš skirtingų Lietuvos vietovių, spektrofotometriniu metodu

Bendras fenolinių junginių kiekis buvo apskaičiuotas pagal galo rūgšties ekvivalentą. Rezultatai pavaizduoti 6 paveiksle. Bendras fenolinių junginių kiekis H. helix lapuose svyravo nuo 1,094 iki 1,886 GRE mg/g. Iš gautos diagramos nustatyta, kad didžiausias fenolinių junginių kiekis H. helix lapų ekstraktuose yra iš Šilutės miesto (1,886 GRE mg/g). Panašūs rezultatai gauti H. helix lapų ekstraktų surinktų iš – Plungės, Naujosios akmenės, Kauno ir Palangos (1,453 ± 0,099 GRE mg/g). Mažiausias fenolinių junginių kiekis nustatytas Pumpėnų rajone (Panevėžio apskritis), kuris siekė 1,094 GRE mg/g. Iš gautų rezultatų galima teigti, jog visų surinktų lapų ekstraktai kaupia skirtingais kiekiais fenolinius junginius. Remiantis „Shapiro-Wilk“ testu vidurkiuose statistiškai reikšmingų skirtumų nenustatyta, p>0,05.

6. Pav. Bendras fenolinių junginių kiekis (mg/g) gebenių lipikių lapuose taikant spektrofotometrinį tyrimo metodą; n=3

2017 metais publikuotame moksliniame straipsnyje buvo tirti gebenių lipikių lapai ir nustatinėjamas bendras fenolinių junginių kiekis juose [11]. Atliktas metodas buvo su Folin-Ciocalteu reagentu. Gebenių lipikių lapai, aprašytame moksliniame straipsnyje, buvo rinkti Rumunijoje ir ten nustatytas bendras fenolinių junginių kiekis - 1.03 ± 0.09 mg/g pagal galo rūgšties ekvivalentą. Mano rinktuose gebenių lipikių lapuose vidurkis siekė 1,40 mg/g pagal galo rūgšties ekvivalentą. Tikėtina, jog Lietuvoje rinktų gebenių lipikių lapų didesnį bendrą fenolinių junginių kiekį galėjo įtakoti aplinkos sąlygos, klimatas bei ekstrakcijos metodas.

3.1.2 Bendras saponinų kiekio tyrimas H. helix lapuose rinktuose iš skirtingų Lietuvos vietovių, spektrofotometriniu metodu

Bendras saponinų kiekis buvo apskaičiuotas pagal saponinų kalibracinio grafiko tiesinės regresijos lygtį. Rezultatai pavaizduoti 7 paveiksle. Bendras saponinų kiekis H. helix lapų vandeniniuose ekstraktuose svyravo nuo 0,291 iki 0,728 mg/ml. Didžiausias saponinų kiekis nustatytas iš Palangos miesto surinktų gebenių lipikių lapų ekstrakto (0,728 mg/ml). Neženkliai skyrėsi (1,09 karto) ir iš Kauno miesto surinktų lapų bendras saponinų kiekis (0,664 mg/ml). Panašūs saponinų kiekiai gauti iš šešių miestų – Plungės, Panevėžio, Vilniaus, Naujosios akmenės, Pumpėnų rajono ir Klaipėdos (0,464 ± 0,077

1,552 1,325 1,162 1,453 1,094 1,886 1,455 1,219 1,462 0,000 0,500 1,000 1,500 2,000 2,500

Plungė Panevėžys Vilnius Naujoji akmenė

Pumpėnų rajonas

Šilutė Kaunas Klaipėda Palanga

Fenol ini ų jung ini ų ki ek is GR E m g/ g

mg/ml). Mažiausias saponinų kiekis buvo gautas iš lapų rinktų Šilutės mieste (0,291 mg/ml). Remiantis „Shapiro-Wilk“ testu vidurkiuose statistiškai reikšmingų skirtumų nenustatyta, p>0,05.

7. Pav. Bendras saponinų kiekis H. helix lapų ekstraktuose išreikštas saponinų ekvivalentu mg/ml; n=3

3.1.3 Gebenių lipikių (Hedera helix L.) lapų ekstraktų antioksidantinio aktyvumo įvertinimas

Antioksidantinis tyrimas buvo atliktas su UV spektrofotometru ir duomenys apskaičiuoti pagal trolokso kalibracinės kreivės regresinę lygtį mg/ml. Rezultatai pavaizduoti 8 paveiksle. Didžiausiu antioksidantiniu aktyvumu pasižymėjo lapai surinkti iš Šilutės miesto (4,299 mg/g). Gan ženkliai mažesniu antioksidantiniu aktyvumu pasižymėjo lapai surinkti iš keturių miestų – Plungės, Naujosios akmenės, Kauno bei Palangos (atitinkamai - 3,483; 3,307; 3,306; 3,325 mg/g). Šiek tiek mažesniu antioksidantiniu aktyvumu pasižymėjo H. helix lapų ekstraktai iš Panevėžio bei Klaipėdos miestų (atitinkamai - 2,987; 2,760 mg/g). Antioksidantinis aktyvumas mažiausias buvo metanolinių lapų ekstraktų rinktų iš Vilniaus (2,625 mg/g) ir Pumpėnų rajono (2,603 mg/g). Statistiškai reikšmingų skirtumų duomenyse nėra, p>0,05.

0,395 0,539 0,386 0,511 0,541 0,291 0,664 0,464 0,728 0,000 0,100 0,200 0,300 0,400 0,500 0,600 0,700 0,800 0,900

Plungė Panevėžys Vilnius Naujoji akmenė

Pumpėnų rajonas

Šilutė Kaunas Klaipėda Palanga

S

aponinų ki

eks m

g/m

8. Pav. Skirtinguose vietovėse surinktų H. helix lapų ekstraktų antioksidantinis aktyvumas mg/g; n=3

3.2 Analitinių rodiklių tyrimas plonasluoksnės chromatografijos metodu

Iš skirtingų miestų surinktų gebenių lipikių (Hedera helix L.) lapų ir augalinių vaistinių preparatų, įsigytų iš Lietuvos vaistinių, kokybinis įvertinimas buvo atliktas su plonasluoksne chromatografija, vadovaujantis Europos farmakopėjoje nurodyta tyrimo metodika. Gauti tyrimo rezultatai buvo lyginami su Europos farmakopėjoje nurodyta chromatograma (1 lentelė).

2. Lent. Europos farmakopėjoje nurodyta H. helix analičių išsidėstymas, plonasluoksnės chromatografijos metodika 3,483 2,987 2,625 3,307 2,603 4,299 3,306 2,760 3,325 0,000 0,500 1,000 1,500 2,000 2,500 3,000 3,500 4,000 4,500 5,000

Plungė Panevėžys Vilnius Naujoji akmenė

Pumpėnų rajonas

Šilutė Kaunas Klaipėda Palanga

Konc entra cij a mg /g

3.2.1 Lapų ekstraktų tyrimas plonasluoksnės chromatografijos metodu

Gebenių lipikių (Hedera helix L.) lapų ekstraktų analizės rezultatai pavaizduoti 10 paveiksle. Chromatografijos pagalba bei Europos farmakopėjoje pateikta monografija apie H. Helix, buvo identifikuoti du junginiai - HDC (hederakosidas C) ir α-HN (Alfa hederinas). Sulyginus su Europos farmakopėjos chromatogramos pateikta lentele, galima daryti išvadą, jog lapai yra kokybiški ir tinkami ankščiau aprašytai metodikai.

10. Pav. Gebenių lipikių lapų ekstraktų chromatogramos pavyzdys. Identifikuoti junginiai – HDC (hederakosidas C) ir α-HN (Alfa hederinas). H. Helix lapai surinkti iš – 1. Plungė 2. Panevėžys 3.

Vilnius 4. Naujoji akmenė 5. Pumpėnų rajonas 6. Šilutė 7. Kaunas 8. Klaipėda 9. Palanga Gebenių lipikių (Hedera helix L.) lapų ekstraktų analizė plonasluoksnės chromatografijos metodu kartota tris kartus. Gauti duomenys įvertinti statistiškai, apskaičiuojant aritmetinį gautų Rf reikšmių vidurkį, standartinį nuokrypį, santykinį standartinį nuokrypį (3 lentelė).

3. Lent. Tiriamųjų medžiagų, išskirtų iš gebenių lipikių lapų metanolinių ekstraktų, Rf reikšmių statistinis vertinimas; n=3

Triterpeniniai saponinai Rf

vidurkis Standartinis nuokrypis

Santykinis standartinis nuokrypis (proc.)

HDC 0,353 0,001245 0,283

Santykinis standartinis nuokrypis neviršijo leistinos 5% ribos. Taikant Europos farmakopėjoje reglamentuotą tirpiklių sistemą (bevandenė skruzdžių rūgštis, acetonas, metanolis, etilo acetatas (4:20:20:30 V/V/V/V) pasiektas visiškas triterpeninių saponinų atskyrimas (vidutinis Rf reikšmių skirtumas tarp hederakosido C ir α – hederino yra 0,492). Gauti rezultatai parodė, jog ši metodika yra tinkama triterpeninių saponinų išryškimui ir atskyrimui iš gebenių lipikių (Hedera helix L.) lapų metanolinių ekstraktų.

3.2.2 Augalinių vaistinių preparatų tyrimas plonasluoksnės chromatografijos metodu

Tiriant vaistinių produktų sudėties rodiklius, keturiuose preparatuose iš šešių identifikuoti triterpeninių saponinų nepavyko. Tiriamieji junginiai aiškiai neišryškėjo galimai dėl įvairių priemaišų preparatuose. Junginiai išryškėjo, taikant Europos farmakopėjoje nurodyta metodika, tik dvejuose vaistiniuose preparatuose – geriamieji lašai B ir geriamasis tirpalas. Šių komercinių preparatų chromatograma pavaizduota 11 paveiksle.

11. Pav. Augalinių vaistinių preparatų plonasluoksnės chromatografijos analizė, 1 – geriamieji lašai 2 – geriamasis tirpalas; n=3

Rf reikšmės numeriu 1 pažymėtame chromatogramos stulpelyje buvo – hederakosidas C (0,341) ir α-hederinas (0,824), o numeriu 2 pažymėtame vaistiniam preparate Rf reikšmės buvo – hederakosidas C (0,339) ir α-hederinas (0,819). Gauti duomenys įvertinti statistiškai, apskaičiuojant aritmetinį gautų Rf reikšmių vidurkį, standartinį nuokrypį, santykinį standartinį nuokrypį (4 lentelė).

4. Lentelė. Tiriamųjų medžiagų, išskirtų iš gebenių lipikių vaistinių preparatų metanolinių ekstraktų, Rf reikšmių statistinis vertinimas; n=3

Triterpeniniai saponinai Rf vid. Standartinis nuokrypis Santykinis standartinis nuokrypis (proc.)

HDC 0,339 0,001247 0,295

α-HN 0,821 0,002055 0,244

Remiantis gautais duomenimis, santykinis standartinis nuokrypis neviršijo 5% ribos. Taikant Europos farmakopėjoje reglamentuotą tirpiklių sistemą (bevandenė skruzdžių rūgštis, acetonas, metanolis, etilo acetatas (4:20:20:30 V/V/V/V)) pasiektas visiškas triterpeninių saponinų atskyrimas (vidutinis Rf reikšmių skirtumas tarp hederakosido C ir α – hederino yra 0,482).

Lyginant Rf reikšmes lapų bei vaistinių preparatų, kuriuose išsiskyrė veikliosios medžiagos, didelio skirtumo nėra (12 Paveikslas). Pagal gautus rezultatus galima daryti išvadą, jog Europos farmakopėjoje nurodytas plonasluoksnės chromatografijos metodas yra tinkamas tiek lapų, tiek ir komercinių preparatų, įsigytų iš Lietuvos vaistinių, analizei atlikti. Tai įrodo mažas skirtumas Rf (lapuose hederakosido C Rf vidurkis – 0,339, preparatuose – 0,353 bei α-hederino lapuose – 0,821 ir preparatuose 0,845) reikšmių tarp išskirtų junginių. Skirtumas yra HDC – 0,014 ir α-HN – 0,024.

12. Pav. Veikliųjų junginių Rf reikšmių palyginimas tarp H. helix lapų ir vaistinių augalinių preparatų

3.3 Analitinių rodiklių tyrimas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu

3.3.1 Gebenių lipikių lapų ekstraktų tyrimas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu

Remiantis įvairiais naujausiais mokslininkų pateiktais literatūros šaltiniais apie efektyviosios skysčių chromatografijos taikymą gebenių lipikių (Hedera helix L.) lapų bei augalinių vaistinių preparatų analizėje, buvo nustatyti ir palyginti HDC ir α – HN absorbciniai spektrai (13 paveikslas) [56]. Pagal šiuos spektrus galima matyti, jog triterpeninių saponinų absorbciniai spektrai mažai skyrėsi nuo standartiškų saponinų spektrų. Moksliniame darbe yra modifikacijų lyginant su Europos farmakopėjoje reglamentuota.

13. Pav. Numeriu 1 pažymėtuose absorbciniuose spektruose pavaizduota gebenių lipikių lapų spektrai, numeriu 2 standartų absorbciniai spektrai [56]

Taip pat remiantis prieš tai nurodyta metodika, buvo palyginta efektyviosios skysčių chromatografija (14 paveikslas). Visų atliktų H. helix lapų chromatogramos buvo panašios į standartinę metodikoje nurodytą chromatogramą.

Atlikus šiuos palyginimus su mokslininkų pateikta literatūra, toliau buvo atliekama šių aktyvių junginių chromatogramų palyginimas tarp visų H. helix lapų.

14. Pav. A chromatograma – H. helix lapų, B – nurodytoje metodikoje standarto chromatograma. 1 – Hederakosidas C, 2 - α –hederinas [56]

Pirmiausia buvo palyginti sulaikymo laikai, tiek hederakosido C, tiek ir α – hederino (15 paveikslas). Pagal diagramą matyti, jog sulaikymo laikai labai mažai skyrėsi ir kiekvienoje chromatogramoje veikliųjų medžiagų išėjimo laikas atitinka. Tai parodo veikliųjų medžiagų buvimą visuose lapuose bei metodikos tinkamumą.

15. Pav. H. helix lapų surinktų iš skirtingų vietovių HDC ir α – HN sulaikymo laikai.

Taip pat statistiškai buvo įvertintas rezultatų glaudumas, kuris pateiktas 5 lentelėje.

3 0 ,2 0 6 3 0 ,1 9 8 3 0 ,1 9 6 3 0 ,2 2 9 3 0 ,2 0 9 3 0 ,2 1 7 3 0 ,2 0 4 3 0 ,2 1 0 3 0 ,2 2 8 3 4 ,7 9 3 3 4 ,7 9 9 3 4 ,7 9 1 3 4 ,7 7 6 3 4 ,7 8 2 3 4 ,7 7 8 3 4 ,8 0 0 3 4 ,7 9 1 3 4 ,7 8 4

Plungė Panevėžys Vilnius Naujoji akmenė

Pumpėnų rajonas

Šilutė Kaunas Klaipėda Palanga

Su la ik y m o la ik a s, m in. HDC α - HN

5. Lentelė. Veikliųjų medžiagų sulaikymo trukmių vidurkio, standartinis ir santykinis standartinis, nuokrypiai. Triterpeniniai saponinai tR, vidurkis Standartinis nuokrypis Santykinis standartinis nuokrypis (%) HDC 30,211 0,010425 0,033 α-HN 34,788 0,008147 0,023

Glaudumas gautas tarpiniu preciziškumu, tai yra dvi dienas iš eilės buvo analizuojami tiriamieji mėginiai. Iš atliktų analizės duomenų apskaičiuotas standartinis nuokrypis bei santykinis standartinis nuokrypis sulaikymo trukmės vidurkiui. Preciziškumui santykinis standartinis nuokrypis negali viršyti 5% ribos.

Toliau buvo lyginami smailių plotai po kreive (µV×s) (16 paveikslas). Išanalizavus gautus duomenis, didžiausias smailės plotas po kreive hederakosido C buvo gebenių lipikių lapų rinktų iš Palangos miesto (10092453 µV×s). Mažiausiu smailės plotu po kreive pasižymėjo lapai rinkti iš Plungės miesto (4383356 µV×s). Veikliosios medžiagos α – hederino didžiausias smailės plotas po kreive buvo nustatytas gebenių lipikių lapų rinktų iš Kauno miesto (622528 µV×s). Mažiausiai α – hederino nustatyta lapuose rinktuose iš Šilutės miesto (126565 µV×s).

16. Pav. Gebenių lipikių lapų veikliųjų medžiagų hederakosido C ir α – hederino smailių plotai po kreive. 4383356 5154519 5057744 8758907 6012235 7387432 5617081 6415052 10092453 189646 469748 323443 182663 145202 126565 622528 313112 413062 0 2000000 4000000 6000000 8000000 10000000 12000000 Plungė Panevėžys Vilnius Naujoji akmenė Pumpėnų rajonas Šilutė Kaunas Klaipėda Palanga

Smailės plotas po kreive (µV×s) α - HN HDC

3.3.2 Gebenių lipikių vaistinių preparatų tyrimas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu

Augaliniai vaistiniai preparatai, kurių sudėtyje yra gebenių lipikių (Hedera helix L.) ekstrakto, analizuoti efektyviosios skysčių chromatografijos pagalba bei sulyginti su gautais lapų rezultatais ir ankščiau nurodyta metodika. Sulaikymo laikų vidurkiai tarp lapų ir preparatų skyrėsi labai mažai. Hederakosido C skirtumas - 0,054, o α–hederino – 0,040. Statistiškai apdorojus augalinių vaistinių preparatų sulaikymo laikus vidurkis gautas Hederakosido C - 30,282, o α–hederino 34,744. Iš šių vidurkių buvo paskaičiuotas standartinis nuokrypis bei santykinis standartinis nuokrypis (6 lentelė).

6. Lentelė. Veikliųjų medžiagų sulaikymo trukmių vidurkio, standartinis ir santykinis standartinis, nuokrypiai Triterpeniniai saponinai tR, vidurkis Standartinis nuokrypis Santykinis standartinis nuokrypis (%) HDC 30,282 0,033896 0,112 α-HN 34,744 0,024973 0,072

Toliau buvo sulyginti sulaikymo laikai tarp visų išanalizuotų preparatų (17 paveikslas). Pagal sulaikymo laikus nustatyta, jog efektyviosios skysčių chromatografijos metodika yra tiksli ir parodo veikliųjų medžiagų būvimą vaistiniuose preparatuose su gebenių lipikių ekstraktu.

17. Pav. Augalinių vaistinių preparatų ekstraktų HDC ir α – HN sulaikymo laikai.

Smailių plotai po kreive skyrėsi žymiai nuo kitų tik dviejuose komerciniuose preparatuose tai sirupas B (HDC smailės plotas po kreive – 765923 µV×s ir α – HN – 42644 µV×s) ir šnypšiančiose tabletėse (HDC smailės plotas po kreive – 689699 µV×s ir α – HN – 45610 µV×s). Didžiausias

30,286 30,276 30,285 30,290 30,295 30,261 34,755 34,746 34,741 34,763 34,722 34,739 28 29 30 31 32 33 34 35 36

Sirupas A Geriamieji lašai A Geriamieji lašai B Geriamasis tirpalas Šnypšiančios tabletės Sirupas B Su laik ym o la ika s, min HDC α - HN

hederakosido C smailės plotas po kreive (2884914 µV×s) buvo nustatytas augaliniame vaistiniame preparate, kurio vaistinė forma yra geriamieji lašai (geriamieji lašai A). Didžiausias α–hederino smailės plotas po kreive (236894 µV×s) buvo taip pat geriamųjų lašų A ekstrakte. Mažiausias smailės plotas hederakosido C (689699 µV×s) nustatytas šnypšiančiose tabletėse, o α–hederino mažiausias smailės plotas po kreive (42644 µV×s) buvo preparato, kurio vaistinė forma – sirupas (B). Geriamasis tirpalas lyginant su kitais, neženkliai skyrėsi nuo geriamųjų lašų A (skirtumas tarp šių preparatų – HDC 109774 ir α–HN 43612). Augaliniai vaistiniai preparatai geriamieji lašai B ir sirupas A pasižymėjo taip pat nemažu veikliųjų medžiagų smailių plotu po kreive, lyginant su kitais preparatais. Smailių plotų po kreive rezultatai pavaizduoti 18 paveiksle.

18. Pav. Vaistinių preparatų su gebenių lipikių lapais veikliųjų medžiagų hederakosido C ir α – hederino smailių plotai po kreive.

2184169 2884914 2084909 2775140 689699 765923 156894 236894 136182 193282 45610 42644 0 500000 1000000 1500000 2000000 2500000 3000000 3500000 Sirupas A Geriamieji lašai A Geriamieji lašai B Geriamasis tirpalas Šnypšiančios tabletės Sirupas B

Smailių plotai po kreive µV×s

4. GAUTŲ REZULTATŲ APIBENDRINIMAS

Atlikus gebenių lipikių (Hedera helix L.) lapų analizę spektrofotometro pagalba ir išanalizavus rezultatus buvo gauta, jog didžiausias kiekis fenolinių junginių identifikuotas lapuose, rinktuose iš Šilutės miesto ir tai buvo 1,72 karto didesnis kiekis negu mažiausiai nustatytuose lapuose rinktuose iš Pumpėnų rajono. Taip pat tiriant spektrofotometru buvo nustatyta ir saponinų kiekiai lapuose pagal anksčiau nurodyta metodiką. Palangos mieste bendras saponinų kiekis buvo didžiausias ir didesnis 2,46 karto negu Šilutės mieste. Naudojant validuotą antioksidantinio aktyvumo metodika buvo ištirti gebenių lipikių lapai. Didžiausiu antioksidantiniu aktyvumu pasižymėjo H. helix augalinė žaliava iš Šilutės miesto, Šilutės mieste rinktų gebenių lipikių lapų antioksidantinis aktyvumas buvo 1,63 ir 1,65 karto didesnis už Vilniuje ir Pumpėnų rajone rinktų lapų. Visų gebenių lipikių (Hedera Helix L.) lapų palyginimas pavaizduotas 19 paveiksle.

19. Pav. Saponinų, fenolinių junginių kiekio bei antioksidantinio aktyvumo įvertinimas ir palyginimas tarp gebenių lipikių (Hedera Helix L.) lapų rinktų iš skirtingų Lietuvos miestų ar rajonų.

Atlikus fenolinių junginių ir saponinų kiekių analizę bei antioksidantinį tyrimą su spektrofotometru, gebenių lipikių lapų profilis, surinktų iš skirtingų vietovių, skyrėsi. Tikėtina, kad šiam rezultatų įvairavimui turi įtakos klimatas, temperatūra, drėgmės kiekis bei augimo sąlygos.

Taip pat buvo atliktas ir Europos farmakopėjoje (01/2013:2148 monografijos) patvirtintas plonasluoksnės ir efektyviosios skysčių chromatografijos metodikų, kurios taikytos tiek gebenių lipikių (Hedera helix L.) lapų, tiek ir augalinių vaistinių preparatų (su gebenių lipikių lapų ekstraktu), tyrimas.

1,532 1,328 1,159 1,454 1,095 1,889 1,453 1,228 1,465 0,4 0,543 0,388 0,514 0,544 0,296 0,67 0,47 0,731 3,494 2,996 2,637 3,327 2,44 4,289 3,294 2,773 3,335 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 Plungė Panevėžys Vilnius Naujoji akmenė Pumpėnų rajonas Šilutė Kaunas Klaipėda Palanga

Pirmiausia iš gautų duomenų atlikus plonasluoksnę chromatografiją, buvo statistiškai apskaičiuotas santykinis standartinis nuokrypis (proc.), kuris negali viršyti 5 proc. ribos. Gebenių lipikių augalinėje žaliavoje, surinktoje iš skirtingų miestų, veikliųjų medžiagų Rf vidurkių santykinis standartinis nuokrypis buvo – hederakosido C 0,283 proc. ir α-hederino 0,355 proc. Augaliniuose vaistiniuose preparatuose, sudėtyje turinčių gebenę lipikę, santykiniai standartiniai nuokrypiai (tuose preparatuose, kuriuose buvo išskirtos ir identifikuotos veikliosios medžiagos) buvo - hederakosido C 0,295 proc. ir α-hederino 0,244 proc. Taip pat buvo palyginta gautos plonasluoksnės chromatogramos tarpusavyje bei su Europos farmakopėjoje pateikta chromatogramos lentele. Visus ant plonasluoksnes chromatogramos gautus gebenių lipikių lapų stulpelius galima sulyginti su Europos farmakopėja ir identifikuoti veikliuosius triterpeninius saponinus. Vaistiniuose preparatuose su gebene, išryškinti veikliuosius junginius ir sulyginti su Europos farmakopėjoje nurodyta chromatogramos lentele, pavyko tik dviejuose preparatuose, tai – geriamieji lašai B ir geriamasis tirpalas. Kituose, tikėtina, dėl įvairių priemaišų išskirti ir dienos šviesoje pamatyti veikliųjų medžiagų nepavyko.

Tiriamųjų tirpalų analizė buvo atlikta ir efektyviosios skysčių chromatografijos metodu. Šiuo metodo pagalba iš gautų rezultatų pirmiausia buvo sulyginti sulaikymo laikai tarp gebenių lipikių lapų ir vaistinių preparatų su šia augaline vaistine žaliava. Microsoft „Excel“ pagalba iš vidurkių buvo suskaičiuotas santykinis standartinis nuokrypis. Lapuose – hederakosido C 0,033 proc. ir α-hederino 0,023 proc. Vaistiniuose preparatuose hederakosido C 0,112 proc. ir α-hederino 0,072 proc. Šie rezultatai parodo, jog nebuvo viršyta santykinio standartinio nuokrypio riba (5 proc.) ir tai parodo metodikos tinkamumą analizuojant gebenių lipikių (Hedera helix L.) lapus bei augalinius vaistinius preparatus. Pagal efektyviosios skysčių chromatografijos atliktą tyrimą nustatyta, jog lapuose rinktuose iš Palangos miesto hederakosido C smailės plotas po kreive buvo didžiausias ir 2,3 karto didesnis, negu rinktuose iš Plungės miesto, kur smailės plotas po kreive nustatytas mažiausias. Vaistiniuose preparatuose hederakosido C smailės plotas po kreive buvo didžiausias geriamieji lašai A „Prospan“, kuris buvo didesnis 4,1 karto didesnis, negu šnypšiančiose tabletėse „Prospan“. α-hederino smailės plotas po kaire didžiausiais buvo lapuose rinktuose iš Kauno miesto ir skirtumas nuo mažiausio (iš Šilutės miesto) buvo 4,9 karto. Vaistiniuose preparatuose 5,5 karto didesnis smailės plotas po kreive, negu sirupe B „Prospan“, buvo geriamieji lašai A „Prospan“.

Šiame darbe nėra galimybės lyginti visų tyrimų su mokslininkų atliktais darbais, kadangi nebuvo rastą panašių analizių, kurios atitiktų sąlygas, metodus, augalines žaliavas ar augalinius vaistinius preparatus.