PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „ANTOCIANINŲ IR ANTOCIANIDINŲ STABILUMAS VIRŠKINIMO TRAKTO PH IR TEMPERATŪROS SĄLYGOMIS IN VITRO“. 1. Yra atliktas mano paties.
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.
Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
2020-05-18 Dovydas Vėžauskas
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuviu kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
2020-05-18 Dovydas Vėžauskas
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
2020-05-19 prof. Valdas Jakštas
Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
2020-05-21 prof. Sonata Trumbeckaitė
(aprobacijos data ) (katedros vadovės vardas, pavardė) (parašas) Baigiamojo darbo recenzentas
Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
(vardas, pavardė) (parašas) Baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
DOVYDAS VĖŽAUSKAS
ANTOCIANINŲ IR ANTOCIANIDINŲ STABILUMAS VIRŠKINIMO TRAKTO
PH IR TEMPERATŪROS SĄLYGOMIS IN VITRO
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas Prof. dr. Valdas Jakštas
MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanė prof. dr. Ramunė Morkūnienė
Data
ANTOCIANINŲ IR ANTOCIANIDINŲ STABILUMAS VIRŠKINIMO TRAKTO
PH IR TEMPERATŪROS SĄLYGOMIS IN VITRO
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Prof. dr. Valdas Jakštas Data Recenzentas Data Darbą atliko Magistrantas Dovydas Vėžauskas Data
KAUNAS, 2020
SANTRAUKA ... 7
SUMMARY ... 8
SANTRUMPOS ...10
ĮVADAS ...11
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ...13
1.LITERATŪROS APŽVALGA ...14
1.1. Antocianinų apibūdinimas ...14
1.2. Antocianinų cheminės savybės ...14
1.3. Antocianinų farmakologinės savybės ...16
1.4. Antocianinų stabilumas ...17
1.4.1. pH įtaka antocianinų stabilumui ...17
1.4.2. Kopigmentacijos įtaka antocianinų stabilumui ...18
1.4.3. Temperatūros ir šviesos įtaka antocianinų stabilumui ...20
1.5. Antocianinų biopraeinamumas ir kitimai žmogaus organizme ...21
1.6. Mėlynių vaisių (Vaccinium myrtillus L.) antocianinai ...24
1.7. Juodųjų serbentų vaisių (Ribes nigrum L.) antocianinai ...24
2. TYRIMO METODIKA ...25
2.1. Tyrimo objektas ...25
2.2. Reagentai ...25
2.3. Aparatūra ...25
2.4. Ekstraktų paruošimas ...26
2.5. Antocianinų stabilumo tyrimo sąlygos in vitro ...26
2.6. Antocianinų identifikavimas naudojant ESC metodą ...27
2.7. Antocianinų identifikavimas naudojant UESC-MS metodą ...27
3. TYRIMO REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ...29
3.1. Kokybinis antocianinų chromatografinių profilių charakterizavimas ...29
3.1.1.Mėlynių (Vaccinium myrtillus L.) chromatografinių profilių charakterizacija ...29
3.1.2. Juodųjų serbentų (Ribes nigrum L.) chromatografinių profilių charakterizacija...30
3.2. Antocianinų bei antocianidinų stabilumo vertinimas ...32
3.2.1. Mėlynių (Vaccinium myrtillus L.) antocianinų stabilumo vertinimas ...32
3.2.2. Mėlynių (Vaccinium myrtillus L.) antocianidinų stabilumo vertinimas ...36
3.3. Antocianidinų stabilumo esant 37 ± 0,5 oC ir 39 ± 0,5 oC temperatūrai palyginimas ...42
3.3.1. Mėlynių (Vaccinium myrtillus L.) antocianidinų stabilumo esant 37 ± 0,5 oC ir 39 ± 0,5 oC temperatūrai palyginimas ...42
3.3.2. Juodųjų serbentų (Ribes nigrum L.) antocianidinų stabilumo esant 37 ± 0,5 oC ir 39 ± 0,5 oC temperatūrai palyginimas ...43
4. IŠVADOS ...45
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ...46
D. Vėžausko magistro baigiamasis darbas „Antocianinų ir antocianidinų stabilumas virškinimo trakto pH ir temperatūros sąlygomis in vitro“. Mokslinis vadovas prof. dr. V. Jakštas; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmacijos fakulteto Farmakognozijos katedra. Kaunas, 2020.
Darbo tikslas: nustatyti liofilizuotų mėlynių ir juodųjų serbentų vaisių miltelių individualių antocianinų ir antocianidinų stabilumą virškinimo trakto pH ir temperatūros sąlygomis in vitro.
Darbo uždaviniai: Nustatyti ir palyginti mėlynių (Vaccinium myrtillus L.) ir juodųjų serbentų (Ribes nigrum L.) liofilizuotų vaisių miltelių antocianinų chromatografinius profilius pradiniuose ir stabilumo tyrimų mėginiuose. Įvertinti mėlynių (Vaccinium myrtillus L.) ir juodųjų serbentų (Ribes nigrum L.) liofilizuotų vaisių miltelių antocianinų bei antocianidinų stabilumą imitacinėmis virškinamojo trakto pH sąlygomis in vitro. Palyginti mėlynių (Vaccinium myrtillus L.) ir juodųjų serbentų (Ribes nigrum L.) liofilizuotų vaisių miltelių antocianidinų stabilumą esant skirtingai terpės temperatūrai (37 °C ir 39 °C) in vitro.
Tyrimo objektas ir metodai: tyrimo metu tirti mėlynių (Vaccinium myrtillus L.) ir juodųjų serbentų (Ribes nigrum L.) liofilizuotų vaisių milteliai. Antocianinų identifikacija ir stabilumo įvertinimas atliktas ESC ir UESC-MS metodais.
Tyrimo rezultatai ir išvados: pradinių mėginių mėlynių (Vaccinium myrtillus L.) ir juodųjų serbentų (Ribes nigrum L.) antocianinų profiliai atitiko mokslinėse publikacijose skelbtus rezultatus. Mėlynių stabilumo tyrimų mėginiuose silpnai rūgštinėje (pH 6,8 ir 6,0) ir silpnai šarminėje (pH 7,4) terpėse nebuvo identifikuoti delfinidino ir petunidino galaktozidai, arabinozidai ir gliukozidai. Mėlynių ir juodųjų serbentų tyrimo mėginiuose nėra statistiškai reikšmingo skirtumo tarp to paties aglikono cukrinių pakaitų (p > 0,05). Palyginus mėlynių ir juodųjų serbentų liofilizuotų vaisių miltelių antocianidinų stabilumą, nustatyta, kad šie junginiai išlieka stabilūs imituotame skrandžio, bet ne žarnyno virškinimo procese. Po simuliuoto virškinamojo proceso sąlygų, mėlynių mėginiuose didžiausiu stabilumu pasižymėjo malvidinas (52,72 %) ir peonidinas (46,64 %), mažiausiu - delfinidinas ir petunidinas, kurių stabilumo tyrimų paskutiniame taške nebuvo įmanoma identifikuoti (p < 0,05). Juodųjų serbentų mėginiuose didžiausiu stabilumu pasižymėjo cianidinas (26,98 %), mažesniu - delfinidinas (9,16 %) (p < 0,05). Palyginus mėlynių ir juodųjų serbentų antocianidinų stabilumą skirtingose tyrimų temperatūrose, nustatyta, kad padidinus temperatūrą 2 ± 0,5 oC, silpnai rūgštinėje (pH 6,8 ir 6,0) ir silpnai šarminėje (pH 7,4) terpėse peonidino,
malvidino ir cianidino procentiniai likučiai sumažėjo iki 11,04 %. Temperatūros įtaka mažiausia mėlynių cianidinui.
Master Thesis by D. Vėžauskas “Anthocyanins and anthocyanidins stability under gastrointestinal pH and temperature conditions in vitro“. Research supervisor professor V. Jakštas; Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Faculty of Pharmacy, Pharmacognosy Cathedral. Kaunas, 2020.
The aim: to determine lyophilized blueberry and black currant fruit powder individual anthocyanins and anthocyanidins stability under gastrointestinal pH and temperature conditions in vitro.
Objectives: To determine and compare lyophilized bilberry (Vaccinium myrtillus L.) and black currant (Ribes nigrum L.) fruit powder anthocyanins chromatographic profiles in the initial and stability test samples;To evaluate lyophilized blueberries (Vaccinium myrtillus L.) and blackcurrants (Ribes nigrum L.) fruit powder anthocyanins and anthocyanidins stability under simulated gastrointestinal pH conditions in vitro; To compare lyophilized fruit powder blueberry (Vaccinium myrtillus L.) and blackcurrant (Ribes nigrum L.) anthocyanidins stability at different media temperatures (37 °C and 39 °C) in vitro.
Research object and methodology: during the study bilberry (Vaccinium myrtillus L.) and black currants (Ribes nigrum L.) lyophilized fruit powder were examined. Anthocyanins identification and stability were assessed by HPLC and UHPLC-MS methods.
Results and conclusions: bilberry (Vaccinium myrtillus L.) and black currant (Ribes nigrum L.) initial anthocyanin profile samples were in line with the results of scientific publications. Delphinidin and petunidin galactosides, arabinosides, and glucosides were not identified in weakly acidic (pH 6.8 and 6.0) and weakly alkaline (pH 7.4) media of bilberry stability test samples. There was no statistically significant difference between the sugar substitutes of the same aglycone in the bilberry and black currant test samples (p > 0.05). In comparison, bilberry and black currant lyophilized fruit powder anthocyanidins were stable in the simulated gastric but not in intestinal digestion process. Under simulated digestive process conditions, malvidin (52.72 %) and peonidin (46.64 %) had the best stability in bilberry samples, while delphinidin and petunidin had the worst stability, these compounds could not be identified in the end of digestive process. In black currant samples cyanidin (26.98 %) had better stability than delphinidin (9.16 %). Comparing bilberry and black currant anthocyanidins stability at different test temperatures, revealed that increasing temperature by 2 ± 0.5 oC in weakly acidic (pH 6.8 and 6.0) and weakly basic (pH 7.4) media, the
percentages of peonidin, malvidin, and cyanidin decreased to 11.04 %. The effect of temperature is minimal for bilberry cyanidin.
PADĖKA
Dėkoju lekt. Mindaugui Marksai už pagalbą atliekant stabilumo tyrimus, už patarimus, susijusius su gautų rezultatų interpretacija bei už išsamius teorinius ir praktinius atsakymus į tyrimo eigoje iškilusius klausimus.
SANTRUMPOS
Cy-3-rut - Cianidino-3-rutinozidas Cy-3-sop - Cianidino-3-sofrozidas Cy-3-glu-rut - Cianidino-3-gliukozid-rutinozidas Cy-3-gal - Cianidino-3-galaktozidas Cy-3-glu - Cianidino-3-gliukozidas Cy-3-ara - Cianidino-3-arabinozidas Dp-3-gal - Delfinidino-3-galaktozidas Dp-3-glu - Delfinidino-3-gliukozidas Dp-3-ara - Delfinidino-3-arabinozidas Dp-3-rut - Delfinidino-3-rutinozidasESC / HPLC - efektyvioji skysčių chromatografija / high performance liquid chromatography Mv-3-gal - Malvidino-3-galaktozidas Mv-3-glu - Malvidino-3-gliukozidas Mv-3-ara - Malvidino-3-arabinozidas Pt-3-glu - Petunidino-3-gliukozidas Pt-3-gal - Petunidino-3-galaktozidas Pt-3-ara - Petunidino-3-arabinozidas Pn-3-gal - Peonidino-3-galaktozidas Pn-3-ara - Peonidino-3-arabinozidas Pn-3-glu - Peonidino-3-gliukozidas
UESC-MS / UHPLC-MS - ultra efektyvioji skysčių chromatografija su tandemine masių spektrometrija / ultra high performance liquid chromatography with tandem mass spectrometry
ĮVADAS
Remiantis epidemiologinių tyrimų duomenimis, įrodyta, kad į maisto racioną įtraukus pakankamą kiekį vaisių ir daržovių sumažėja degeneracinių ligų, tokių kaip Parkinsono liga, Alzheimerio liga, vėžys bei širdies ir kraujagyslių ligų, paplitimas [9,14]. Dėl šios priežasties, biologiškai aktyvūs junginiai, išgauti iš augalinės kilmės maisto, ypač iš spalvingų vaisių, susilaukia vis daugiau dėmesio dėl galimo teigiamo poveikio žmogaus sveikatai [35]. Mokslinėje literatūroje tokio tipo junginiams yra priskiriami antocianinai - biologiškai aktyvūs, vandenyje tirpūs junginiai, priklausantys flavonoidų grupei. Šie junginiai yra gausiai paplitę vaisiuose ir daržovėse, kuriuose jie nulemia augalų žiedlapių, lapų bei stiebų spalvų asortimentą (nuo raudonos iki mėlynos). JAV atliktų mokslinių tyrimų dėka nustatyta optimali referencinė maistinė vertė, kuri siekia iki 200 mg per parą vienam asmeniui [1, 20, 35].
Remiantis mokslinių publikacijų duomenimis, antocianinai turi priešvėžinį, priešuždegiminį, neuroprotekcinį aktyvumą, tačiau kai kurie tyrimuose pateikti rezultatai yra prieštaringi [9]. Junginių bioaktyvumo tyrimų skirtumas tampa ypač aktualus lyginant in vitro ir in vivo tyrimų duomenis. Pavyzdžiui: in vitro tyrimo rezultatai parodė teigiamą antocianinų poveikį regėjimo funkcijos korekcijai, apsaugant tinklainės ląsteles ir greitinant jų sintezę iš rodopsino, tačiau daugelyje in vivo studijų toks antocianinų poveikis nebuvo pastebėtas [35].
Kadangi junginio bioaktyvumas priklauso ne tik nuo farmakologinių, tačiau ir nuo farmacinių veiksnių, todėl bioaktyvumo variacijos suvokimui svarbu įvertinti ir tokius farmacinius veiksnius kaip bioaktyvaus junginio ar medžiagos stabilumas įvairiose terpėse. Nors mokslinėse duomenų bazėse yra paskelbta tyrimų, kurie aprašo antocianinų stabilumą virškinamajame trakte ir modelinėse terpėse, tačiau skelbtų tyrimų duomenų nepakanka ir nėra bendrų aspektų, kuriais būtų galima pilnai paaiškinti skirtingų augalinių žaliavų antocianinų kitimą žmogaus organizme. Dėl šios priežasties gali būti komplikuotas augalinių preparatų su antocianais skyrimas ir efektyvus vartojimas [35, 36, 37, 49, 50]. Todėl, siekiant papildomų duomenų apie individualių antocianinų stabilumą virškinamojo proceso metu tikslinga tirti skirtingų antocianų profiliu pasižyminčių žaliavų, ruošinių ar produktų mėginius tikslinėse terpėse.
Yra žinoma, kad antocianinai pasižymi tautomerinių formų įvairove. Mokslinėje literatūroje išskiriamos 4 pagrindinės cheminės struktūros: flavilio katijonas, chinoidinė bazė, karbinolio ir chalkono formos [16, 17]. Šie joninės prigimties junginiai yra nestabilūs ir lengvai suyrantys. Jų stabilumui įtakos turi įvairūs faktoriai, tokie kaip pH, cheminė struktūra, koncentracija, temperatūra, šviesa, deguonis, fermentai, baltymai ir metalų jonai [15]. Apžvelgus in vitro tyrimų modelius, taikytus atkuriant virškinamojo trakto sąlygas, dažniausiai šių junginių stabilumui įvertinti buvo pasirenkamas temperatūros,
pH ir fermentų poveikis [36, 37, 49]. Kituose tyrimų modeliuose virškinimo fermentai nebuvo įtraukti į tyrimo sąlygas, dėl duomenų, pagrindžiančių fermentų įtaką fenolinių junginių virškinime, trūkumo [35, 50].
Šiame tyrime buvo pasirinkta vertinti dviejų skirtingų augalinių žaliavų- mėlynių (Vaccinium myrtillus L.) ir juodųjų serbentų (Ribes nigrum L.) liofilizuotų vaisių miltelių antocianinų ir antocianidinų stabilumą žmogaus virškinimojo trakto pH ir temperatūros sąlygomis. Suformuotas in vitro tyrimų modelis, kuris kiek įmanoma tiksliau atitiktų žmogaus organizme vykstančius fiziologinius pokyčius, atsižvelgiant į tai, kad šių junginių tautomerinės formos yra jautrios pH ir temperatūros pokyčiui.
Darbo tikslas: nustatyti liofilizuotų mėlynių ir juodųjų serbentų vaisių miltelių individualių antocianinų ir antocianidinų stabilumą virškinimo trakto pH ir temperatūros sąlygomis in vitro.
Darbo reikšmė: gauti rezultatai ir išvados suteikia papildomas žinias apie atocianinų stabilumą virškinamojo trakto terpėje ir gali būti tikslingai taikomi vertinant biologinio aktyvumo tyrimų rezultatus, vykdant eksperimentinės plėtros tyrimus fitofarmacijoje, vystant naujus augalinės kilmės žaliavų produktus sveikatinimui ir tokių produktų kokybės užtikrinimo modelius. Dalis gautų tyrimų rezultatų bus panaudota vystant funkcinį gėrimą projekto UAB „AKVAVITA“ investicijų į MTEP veiklas skatinimas, kuriant inovatyvius produktus gėrimų pramonėje“ Nr. J05-LVPA-K-03-0117 apimtyje.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Tikslas: nustatyti liofilizuotų mėlynių ir juodųjų serbentų vaisių miltelių individualių antocianinų ir antocianidinų stabilumą virškinimo trakto pH ir temperatūros sąlygomis in vitro.
Uždaviniai:
1. Nustatyti ir palyginti mėlynių (Vaccinium myrtillus L.) ir juodųjų serbentų (Ribes nigrum L.) liofilizuotų vaisių miltelių antocianinų chromatografinius profilius pradiniuose ir stabilumo tyrimų mėginiuose.
2. Įvertinti mėlynių (Vaccinium myrtillus L.) ir juodųjų serbentų (Ribes nigrum L.) liofilizuotų vaisių miltelių antocianinų bei antocianidinų stabilumą imitacinėmis virškinamojo trakto pH sąlygomis in vitro.
3. Palyginti mėlynių (Vaccinium myrtillus L.) ir juodųjų serbentų (Ribes nigrum L.) liofilizuotų vaisių miltelių antocianidinų stabilumą esant skirtingai terpės temperatūrai (37 °C ir 39 °C) in vitro.
1.LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Antocianinų apibūdinimas
Antocianinai – tai mažos molekulinės masės, vandenyje tirpūs augalų antriniai metabolitai. Šie pigmentai priklauso flavonoidų klasei ir yra atsakingi už platų spalvų asortimentą (nuo raudonos iki mėlynos) augalų žiedlapiuose, lapuose bei stiebuose. Jie atlieka svarbų vaidmenį pritraukiant gyvūnus, taip skatindami sėklų pasklidimą ir apdulkinimą. Antocianinai sugeria šviesą, todėl gali apsaugoti nuo ultravioletinių (UV) spindulių daromos žalos [1,20].
1.2. Antocianinų cheminės savybės
Antocianidinai yra pagrindinė antocianinų struktūrinė dalis. Antocianidinai (aglikonai) susideda iš aromatinio žiedo (A), sujungto su heterocikliniu žiedu (C), kuris savo struktūroje turi deguonies atomą. Heterociklinis žiedas anglis-anglis jungtimi prijungtas prie trečio aromatinio žiedo (B). Struktūriškai tai yra aglikono vieneto (antocianidino) heterozidai, kurie yra flavilio jonų dariniai [1,2].
1 pav. Bendrinė antocianų ir antocianidinų strukrūra[6]
Gamtoje randami 702 skirtingi antocianinai ir 27 antocianidinai. Tačiau tik šeši antocianidinai: cianidinas, delfinidinas, pelargonidinas, peonidinas, malvidinas ir petunidinas (2 pav.) yra plačiausiai paplitę ir sudaro daugiau nei 90 % visų žinomų antocianinų. Tokiai junginių įvairovei įtakos turi šie veiksniai: 1) hidroksilo grupių skaičius, vieta ir metilinimo laipsnis; 2) prie aglikono prisijungusių cukrų prigimtis, padėtis ir skaičius; 3) alifatinių ir aromatinių rūgščių, prisijungusių prie cukrinės dalies, skaičius
ir prigimtis [3]. Aglikono dalis yra ganėtinai reaktyvi dėl elektronų trūkumo, todėl gamtoje antocianidinai randami tik stabilioje glikozidų formoje. Prie aglikono dažniausiai prisijungia gliukozė, L-ramnozė, D-galaktozė, D-ksilozė ir arabinozė. Šios cukrinės dalys gali prisijungti viena prie kitos, taip suformuodamos mono-, di- arba trisacharidus. Iš visų struktūroje esančių pozicijų, dažniausiai aptinkamas C-3 padėties glikozilinimas. Visi antocianinai yra O-glikozidai, tai reiškia, kad cukraus pakaitas yra prijungtas per O jungtį [3,4].
2 pav. Šešių labiausiai paplitusių antocianidinų cheminės struktūros [1]
Antocianinų cukrinė dalis gali būti acilinama organinėmis rūgštimis. Dažniausiai naudojami junginiai acilinimui yra cinamono rūgštys (kofeino,p-kumarino, sinapo) ir alifatinės rūgštys (acto, obuolių, malono, oksalo ir gintaro) [7]. Antocianinai gali turėti įvairų acilo grupių skaičių. Jei antocianino struktūroje aptinkamas vienas acilo pakaitas, glikozidas laikomas monoacilintu. Antocianinai, kurie savo struktūroje turi daugiau acilo pakaitų, vadinami diacilintais arba poliacilintais. Dažniausiai acilo pakaitai prisijungia prie antocianinų C-6 padėtyje esančios cukrinės dalies. Įrodyta, kad šie pakaitai taip pat gali prisijungti ir prie 2-hidroksi, 3-hidroksi bei 4-hidroksi radikalų. Antocianinų acilinimas gali padidinti atsparumą įvairiems fizikocheminiams ir biocheminiams faktoriams (temperatūrai, šviesai, pH pokyčiams, vandenilio peroksidui, virškinimo fermentams). Dėl šio struktūrinio pokyčio, gamtoje tam tikrų augalo dalių (žiedų, vaisių) spalvos išlieka intensyvesnės ir stabilesnės [7,8].
1.3. Antocianinų farmakologinės savybės
Pastaruoju dešimtmečiu didėjo mokslinių publikacijų, susijusių su antocianinų farmakologinėmis savybėmis, skaičius. Šie junginiai yra gausiai paplitę ir saugūs vartoti, nes pasižymi mažu citotoksiškumu. Antocianinų teigiamas poveikis žmogaus organizmui yra įrodytas in vivo ir in vitro, taip pat epidemiologinių ir klinikinių tyrimų pagalba. Šie junginiai pasižymi priešvėžiniu, priešuždegiminiu, neuroprotekciniu aktyvumu ir gali būti naudojami diabeto, širdies ir kraujagyslių ligų gydyme bei profilaktikoje [9].
Naujausių tyrimų duomenimis buvo įrodyta, kad priešvėžinis aktyvumas, kuris siejamas su įvairių vaisių ir daržovių antocianinais, gali slopinti tam tikrų vėžio formų (krūtinės, prostatos, kepenų, gaubtinės ir tiesiosios žarnų) kancerogenezės etapus (iniciacija, promocija ir progresija) [9]. Nustatyta, kad antocianinų priešvėžinis aktyvumas yra glaudžiai susijęs su jų antioksidaciniu ir priešuždegiminiu aktyvumu. Antocianinai gali paveikti antioksidacinę sistemą ir tokiu būdu neutralizuoti laisvuosius radikalus, ko pasekoje sumažėja oksidacinio streso sukelta sveikų ląstelių genomo pažaida ir taip užkertamas kelias potencialių navikų išsivystymui [10, 11]. Įrodyta, kad lėtinis uždegimas gali sudaryti palankias sąlygas vėžinių ląstelių susiformavimui. Padidėjęs priešuždegiminių mediatorių išsiskyrimas yra kritinė tumorogenezės priežastis. Pastebėta, kad cianidino-3-gliukozidas, delfinidino-3-gliukozidas ir petunidino-3-gliukozidas slopina uždegiminių mediatorių, tokių kaip gama interferono (IFN-γ), ciklooksigenazės-2 (COX-2), prostaglandino E2 (PGE2) hipersekreciją ir taip sumažina naviko susiformavimo tikimybę [10, 12].
Priešuždegiminis poveikis gali būti siejamas ne tik su priešvėžiniu aktyvumu, bet ir su sveikatos sutrikimais ar ligomis (kolitas, periodontitas, Peirono liga), kurių patogenezėje svarbi uždegimo eiga ir uždegiminių mediatorių aktyvumas. Įrodyta, kad cianidino-3-gliukozidas yra efektyvus gydant karagenino sukeltą edemą ir peritonitą, nes slopina ciklooksigenazės-2 (COX-2) išsiskyrimą ir inhibuoja prostaglandino E2 (PGE2) gamybą [9]. Taip pat nustatyta, kad cianidino-3-gliukozidas gali sukelti nuo azoto oksido (NO) priklausomą vazorelaksacinį poveikį [13].
Neuroprotekcinis antocianinų aktyvumas pasireiškia kognityvinių, atminties ir motorikos funkcijų pagerėjimu, todėl šie junginiai gali būti pritaikyti neurodegeneracinių ligų (Parkinsono liga, Alzheimerio liga) prevencijoje ir gydyme. Parkinsono ligos metu pasireiškia dopaminerginių neuronų degeneracija viduriniųjų smegenų dalyje. Įrodyta, kad antocianinų ekstraktai, gauti iš juodųjų serbentų, vynuogių bei mėlynių, slopina dopaminerginių neuronų degeneraciją, nes sumažina mitochondrijų disfunkciją, kurią gali sukelti oksidacinis stresas. Tyrimų su pelėmis metu nustatyta, kad cianidino-3-gliukozidas pasižymi neuroprotekciniu poveikiu prieš išeminį insultą, nes blokuoja apoptozę indikuojančio faktoriaus (AIF) išsiskyrimą iš mitochondrijų [9, 14].
1.4. Antocianinų stabilumas
Antocianinai yra nestabilūs ir lengvai suyrantys junginiai. Šių junginių stabilumui turi įtakos pH, jų cheminė struktūra, koncentracija, temperatūra, šviesa, deguonis, fermentai, baltymai ir metalų jonai [15]. Antocianinai gali būti naudojami kaip alternatyva dirbtiniams dažikliams, todėl jų cheminis stabilizavimas išlieka pagrindiniu tikslu [2].
1.4.1. pH įtaka antocianinų stabilumui
Antocianinai yra joninės prigimties junginiai, todėl jų cheminė struktūra ir stabilumas priklauso nuo tirpalo pH. Vandeniniuose tirpaluose dėl skirtingų pH vyksta įvairūs struktūriniai pokyčiai. Išskiriamos 4 pagrindinės cheminės struktūros: flavilio katijonas, chinoidinė bazė, karbinolio ir chalkono formos (3 pav.) Rūgštinėje terpėje antocianinai yra raudonos spalvos, neutralioje pH- violetinės, o didėjant pH spalva pasikeičia į mėlyną [17, 18]. Raudoną spalvą suteikia flavilio katijonas. Tokie antocianinai yra stabilesni esant žemesniam pH (1-3). Šioje terpėje antocianinai išlaiko flavilio katijono struktūrą, todėl pagerėja jų tirpumas vandenyje. Sumažėjus vandens koncentracijai, padidėja flavilio katijono deprotonizacijos greitis ir taip sumažėja spalvos stabilumas [16, 17].
Didėjant pH (iki 4-5), vandeniniuose tirpaluose vyksta hidratacijos reakcijos ir susiformuoja karbinolio struktūra. Šios formos stabilumas sumažėja, kai pH > 6, nes įvyksta tautomeriniai pokyčiai, kurių metu suyra heterociklinio žiedo struktūra ir susiformuoja chalkono forma. Nevandeninėje terpėje, kai pH pasiekia 6-7, susidaro anijoninė chinoidinė forma. Susidariusi chinoidinė forma yra nestabili esant žemesniam pH. Kai pH siekia 4-5, antocianinų tirpalo spalva yra neryški dėl nedidelio flavilio katijono ir chinoidinio anijono kiekio. Esant neutraliam pH, vyksta chinoidinių formų deprotonizacija ir susidaro stabilūs violetinės spalvos chinoidų anijonai. Didėjant pH reikšmei, įvyksta antocianinų degradacijos reakcijos (4 pav.) [2, 17, 18, 22].
4pav. Degradacijos reakcijos pavyzdys [18]
Individualių antocianinų spalvos pokytis taip pat priklauso nuo pH vertės. Kai pH < 3, cianidinas yra raudonos spalvos, kai pH 7-8 -violetinės, kai pH> 11- mėlynos spalvos. Peonidinas turi raudonai vyšninį atspalvį, esant žemesniam pH (1-3), tačiau pasikeičia į tamsiai mėlyną, kai pH vertė lygi 8. Peonidinas skiriasi nuo kitų antocianidinų (cianidino, delfinidino, pelargonidino), nes pasižymi didesniu stabilumu esant aukštesnei pH vertei, tai paaiškintų stabilų tam tikrų mėlynų gėlių atspalvį, kurį suteikia šis antocianidinas. Didžioji dalis antocianidinų (cianidinas ir delfinidinas) yra stabilesni rūgščioje pH terpėje. Vis dėlto, egzistuoja išimtys. Nors delfinidinas yra violetinės spalvos pigmentas ir pasižymi stabilumu rūgštinėje aplinkoje, jis gali suteikti mėlyną spalvą žiedams šarminėje aplinkoje [17].
1.4.2. Kopigmentacijos įtaka antocianinų stabilumui
Kopigmentacijos fenomenas apibūdinamas kaip molekulinė asociacija tarp pigmentų ir kitų (dažniausiai nespalvotų) tirpale esančių organinių molekulių, kurios vadinamos kofaktoriais. Kofaktoriais gali būti įvairūs junginiai: fenolinės rūgštys, flavonoidai ( flavonolių ir flavonų dariniai), alkaloidai, amino rūgštys bei patys antocianinai. Kopigmentacijos metu vyksta savotiškas cheminių struktūrų suartėjimas,
kuris būdingas tik antocianinams ir nebuvo pastebėtas kituose polifenolinių junginių poklasiuose ar nefenolinių junginių klasėse. Šiam procesui įtakos turi dalyvaujančių antocianinų tipas ir koncentracijos, pH vertė, temperatūra bei tirpiklis [21, 24].
Kopigmentacija gali būti kelių tipų (5 pav.). Kai kopigmento molekulė yra organinės prigimties (pvz., alkaloidas arba flavonoidas), susiformuoja intermolekulinė kopigmentacija. Šio proceso metu antocianinai yra sujungti nekovalentiniais (hidrofobiniais) ryšiais. Kai kopigmentas yra antocianinas, pasireiškia specifinė intermolekulinė kopigmentacija – antocianinų molekulių asociacija. Ši kopigmentacija vyksta esant didelei antocianinų koncentracijai, ko pasekoje tirpalo spalva tampa intensyvesnė ir stabilesnė. Kai kopigmetas yra metalo katijonas, susiformuoja metalo-antocianino kompleksas. Visos šios kopigmentacijos modifikuoja heterociklinio žiedo absorbcijos spektrą, nes sąlygoja nelokalizuotų elektronų pasiskirstymą molekulėje [22, 23, 24, 25].
5 pav. Kopigmentacijos tipai [24]
Išskirtinis kopigmentacijos tipas yra intramolekulinė kopigmentacija. Silpnai rūgščiuose tirpaluose antocianinai, kurių cukrinė liekana yra acilinta aromatinių acilo liekanų ar fenolio rūgštimis, pasižymi neįprastu spalvos stabilumu. Šioje sąveikoje kopigmentas gali būti organinė rūgštis, aromatinė acilo grupė ar flovonoidas, kuris prisijungia prie antocianino kovalentiniais ryšiais. Ši kopigmentacija yra efektyvesnė už intermolekulinę kopigmentaciją, nes gali vykti ir praskiestuose tirpaluose [22, 26].
Kopigmentacijos reakcijos stabilizuoja antocianinų spalvą. Antocianinai po šio proceso turi ryškesnes, stipresnes ir stabilesnes spalvas, lyginant su natūraliais antocianinais. Spalvos stabilumas šiuose junginiuose yra tiesiogiai siejamas su struktūriniu stabilumu [26].
1.4.3. Temperatūros ir šviesos įtaka antocianinų stabilumui
Vidutinės ir aukštos temperatūros poveikis antocianinų struktūros stabilumui yra gerai žinomas. Įrodyta, kad terminė antocianinų degradacija vyksta pagal pirmos eilės reakcijų kinetiką ir jos greitis padvigubėja temperatūrai pakitus 10 °C [22, 29]. JAV, Indijanoje, Puero universitete buvo atliktas šešių antocianinų, įskaitant cianidino 3-gliukozidą, išgrynintų ekstraktų stabilumo tyrimas. Tyrimo sąlygos buvo: dvi skirtingos pH vertės (3,0 ir 4,0) ir trys skirtingos temperatūros (6, 25, 40 °C). Po 19 dienų pastebėta, kad tirpalo spalva 40 °C temperatūros mėginiuose pakito iš raudonos į oranžinę. Tuo pačiu metu buvo pastebėta, kad 6 ir 25 °C temperatūrų mėginiuose antocianinams būdingas raudonas atspalvis pakito nežymiai. Šis tyrimas parodo, kad temperatūra iki 40 °C turi įtakos antocianinų terminės degradacijos greičiui, net ir esant žemoms pH vertėms [27]. Vis dėlto, antocianinų terminė degradacija gali vykti greičiau esant aukštesnei pH vertei [22]. Tailande, Mahasarakhamo universitete, buvo atliktas antocianinų, gautų iš juodujų ryžių sėlenų, terminio ir pH stabilumo tyrimas. Tyrimo sąlygos buvo: 60, 80 ir 100 °C temeperatūros, o pH vertės kito atitinkamai nuo 2,0 iki 5,0. Šio tyrimo metu buvo pastebėta koreliacija tarp antocianinų tirpalo spalvos pokyčio, temperatūros ir pH vertės. Taip buvo įrodyta, kad pH vertės virš 4,0 ženkliai pagreitina terminę antocianinų degradaciją [28].
Antocianinai gerai absorbuoja regimąją šviesą, todėl šie junginiai yra atsakingi už jiems būdingą oranžinę, raudoną bei melsvą spalvą. Šviesos sukelta degradacija gali priklausyti nuo deguonies koncentracijos. Stiprus šviesos degradacijos poveikis fiksuojamas, kai antocianinai veikiami fluorescencine šviesa [29]. Kituose tyrimuose nustatyta, kad ultravioletiniai ir infraudonieji spinduliai turi stipresnį poveikį degradacijos reakcijos greičiui nei fluorescencinė šviesa. Brazilijoje, Federaliniame Para universitete buvo atliktas tyrimas, kuriuo metu vertintas iš mangosteno žievės išskirtų antocianinų ekstraktų stabilumas ir pusinės eliminacijos laikas, kontroliuojant deguonies tiekimą ir veikiant atitinkamais šviesos šaltiniais (fluorescencinė, kaitrinė, infraraudonoji bei ultravioletinė šviesa). Visi eksperimentiniai duomenys šiame tyrime buvo surinkti pagal pirmos eilės kinetinį modelį. Pusinės elimincijos laikas fluorescencinės šviesos atveju buvo 597 valandos, kaitrinės- 306 valandos, ultravioletinės- 177 valandos ir infraraudonosios- 100 valandų. Šis tyrimas įrodo, kad fluorescencinė šviesa antocianinų spalvos stabilumui turi mažiausią poveikį ir atitinkamai didžiausią pusinės eliminacijos laiką [30].
1.5. Antocianinų biopraeinamumas ir kitimai žmogaus organizme
Biopraeinamumas gali būti apibūdinamas kaip rodiklis, kuris parodo, kiek veikliosios medžiagos ar jos dalies absorbuojama į sisteminę kraujotaką ir pasiekia specifinę veikimo vietą [31]. Įrodyta, kad antocianinų biopraeinamumas yra labai žemas, nes siekia tik 1 % suvartotos dozės. Vis dėlto, kito biopraeinamumo tyrimo metu, kuriame buvo naudotas izotopiškai žymėtas cianidio-3-gliukozidas, pastebėtas 12,4 % suvartotos dozės likutis po metabolizmo [3, 31].
Nurijus antocianinai juda virškinamuoju traktu, kuriame pH reikšmė kinta laipsniškai [3]. Skrandyje pH reikšmės kinta nuo 1-3, dvylikapirštėje žarnoje pH padidėja iki 6, didžiausia pH reikšmė virškinamajame trakte fiksuojama galinėje klubinės žarnos dalyje – 7,8. Storajame žarnyne pH reikšmė gali būti labiau rūgštinė (pH 6,6) dėl mikrobiotos sukelto fermentacijos proceso [33]. Žarnyno pH vertė gali priklausyti nuo įvarių faktorių: maisto, virškinimo trakto ligų, amžiaus, cirkadinio ritmo, vartojamų medikamentų [34].
Dėl savo struktūrinių pokyčių antocianinai gali būti pasisavinami įvairiose virškinimo trakto dalyse. Skrandyje, dėl tinkamų rūgštinių salygų, antocianinai išlieka stabilūs ir gali išlaikyti glikozidinę formą. Glikozidų aptikimas žmogaus kraujyje per kelias minutes nuo suvartojimo įrodo, kad antocianinai, skirtingai nei kiti flovonoidai, gali būti absorbuojami iš virškinimo trakto nepakitę. Antocianinai pasižymi hidrofilinėmis savybėmis, todėl negali pereiti ląstelių membranos pasyviosios difuzijos būdu - reikalinga tam tikra transportinė sistema. Manoma, kad greitą antocianinų absorbciją į sisteminę kraujotaką lemia tokie specifiniai membraniniai nešikliai kaip bilitranslokazė ir gliukozės pernašos baltymas (GLUT1). Pagrindinė antocianinų absorbcijos vieta yra plonasis žarnynas, kuriame, dėl deglikozilinimo proceso, susidaro lipofiliniai aglikonai, kurie gali patekti į epitelio ląsteles pasyviosios difuzijos būdu. Aglikonai, kurie patenka į žarnyno epitelio ląsteles, gali būti iškart metabolizuojami prieš patenkant į sisteminę kraujotaką. Šiems junginiams, kaip ir daugumai ksenobiotikų, kepenyse būdinga ta pati metabolinė detoksikacija, kurios metu padidėja junginių hidrofiliškumas ir pagerėja pašalinimas iš organizmo su tulžimi ir šlapimu. Taip pat nustatyta, kad storajame žarnyne dėl mikrobiotos gali vykti antocianinų aglikonų degradaciniai procesai iki fenolinių rūgščių ir aldehidų [3, 32].
Antocianinų biopraeinamumas gali būti nustatomas in vivo, ex vivo bei in vitro tyrimų pagalba, tačiau šių tyrimų duomenys gali skirtis. Kai kurie autoriai in vivo tyrimus laiko patikimesniais, nes reakcijos atliekamos gyvame organizme. Vis dėlto, nustatyta koreliacija tarp gautų rezultatų, atliekant in vivo ir in vitro tyrimus. Esminiai in vitro tyrimų privalumai, lyginant su in vivo, yra paprastesnė metodika, supaprastinti biurokratiniai reikalavimai, susiję su etikos komitetu, ir didesnis mėginių skaičius. Naujesniuose tyrimuose buvo aptartas mikrobiotos vaidmuo antocianinų transformacijoje. Šis aspektas nėra
vertinamas in vitro tyrimų metu, o in vivo bei ex vivo tyrimuose nėra plačiai ištirtas [31]. Kai kurie in vitro tyrimai apžvelgti 1 lentelėje.
1 lentelė. In vitro antocianinų stabilumo ir absobcijos tyrimai, kurių rezultatai gauti ESC metodu.
Vieta ir laikas
Objektas Stabilumo tyrimas (trukmė, terpės pH, naudoti reagentai, temp.) Pagrindiniai tirti antocianinai ir jų procentiniai likučiai po virškinamojo trakto simuliacijos Antocianinų absorbcija (metodas ir procentiniai likučiai) 2014 m. Kinija, Jimei universitetas [35] Mėlynės (Vaccinium myrtillus L.) 4 valandos (2 val.
rūgštinė ir 2 val. šarminė terpė ) Temperatūra 37 oC Delfinidino-3-gliukozidas (42,36 %) Delfinidino-3-galaktozidas (50,19 %) Delfinidino-3-arabinozidas (53,61 %) Petunidino-3- galaktozidas (55,5 %) Malvidino-3-gliukozidas (59,12 %) Cianidino-3-galaktozidas (64,4 %) Naudojant Caco-2 ląstelių modelį delfinidino-3-gliukozidas (2,05 %) Delfinidino-3-galaktozidas (1,59 %) Delfinidino-3-arabinozidas (2,77 %) Petunidino-3- galaktozidas (1,98 %) Malvidino-3-gliukozidas (4,22 %) Cianidino-3-galaktozidas (2,52 %) Rūgštinė terpė: 2 g/L NaCl ir koncentruota HCl iki pH 2.
Šarminė terpė: NaHCO3
iki pH 7,4. 2012 m. Kinija, Šilkmedis (Morus 4 valandos (2 val.
rūgštinė ir 2 val. šarminė terpė) Cianidino-3-gliukozidas ir cianidino-3-Naudojant dializei pritaikytą sistemą (vamzdelį), kuri
Jiangsu universitetas [36]
atropurpurea L.)
Temperatūra 37 oC rutinozidas (abiejų
po 5 %) atitinka plonojo žarnyno fiziologines savybes. Cianidino-3-gliukozidas ir cianidino-3-rutinozidas (abiejų po 0,34 %) Rūgštinė terpė: 3,2 g. pepsino, 2 g NaCl, ir koncentruota HCl iki pH 2. Šarminė terpė: 4 mg/ml pankreatino, 25 mg/ml tulžies druskos ir 1 M NaHCO3 iki pH 7,5. 2012 m. JAV, Glazgo universitetas [37] „Konkordo“ vynuogių sultys 3 valandos (1 valanda rūgštinėje terpėje ir 2 valanda šarminėje terpėje). Vėliau tyrimo trukmė pratęsta iki 6 val. Temperatūra 37 oC Malvidino-3-gliukozidas (57 %) Peonidino-3-glikozidas (48 %) Cianidino-3-gliukozidas (37 %) Petunidino-3- gliukozidas (14 %) Delfinidino-3-gliukozidas (5,5 %) Absorbcija buvo įvertinta in vivo, o ne in vitro tyrimų pagalba. Rūgštinė terpė: 1,43 ml simuliuojamų skrandžio sulčių (0,32 % pepsino) ir koncentuota HCl iki pH 2 Šarminė terpė: 1 % pankretino, 950 µL tulžies ir 0,5 N Na2CO3 iki pH 7
Analizuojant in vitro tyrimus pastebėta, kad dažniausiai naudojamas analizės metodas yra efektyvioji skysčių chromatografija (ESC) [35, 36, 37]. Efektyvioji skysčių chromatografija yra analitinis metodas, kuris naudojamas atskirti, identifikuoti ir kiekybiškai įvertinti kiekvieną mišinyje esantį komponentą. Šio metodo efektyvumas yra susijęs su didele junginių skiramąja geba, greitu ir jautriu analičių atskyrimu. Dėl analitinio tikslumo, šis metodas kombinuojamas kartu su masių spektrofotometrija. Masių spektrometrija padeda pilnai įvertinti ir identifikuoti sunkiai atskiriamas medžiagas [38].
1.6. Mėlynių vaisių (Vaccinium myrtillus L.) antocianinai
Apie 60- 70 %, visų antocianinų yra randama mėlynių uogų žievelėse ir sėklose. Šie junginiai yra atsakingi už vaisių pigmentaciją, tai reiškia, kad skirtingas antocianinas gali suteikti kitokį vaisiaus luobelės atspalvį [42]. Remiantis Europos farmakopėjos monografijoje pateikta informacija ir 2014 m. Australijoje IMCD grupės atliktu mėlynių ekstraktų profilio tyrimo duomenimis, šio augalo vaisiuose galima aptikti iki 15 skirtingų antocianinų: delfinidino-3-galaktozidas (Dp-3-gal); delfinidino-3-gliukozidas (Dp-3-glu); cianidino-3-galaktozidas gal); delfinidino-3-arabinozidas (Dp-3-ara); cianidino-3-gliukozidas (Cy-3-glu); peonidino-3-galaktozidas 3-gal); cianidino-3-arabinozidas (Cy-3-ara); petudinido-gliukozidas (Pt-3-glu); peonidino-3-galaktozidas (Pn-3-gal); petunidino-3-arabinozidas (Pt-3-ara); peonidino-3-gliukozidas (Pn-3-glu); galaktozidas (Mv-3-gal); peonidino-3-arabinozidas (Pn-3-ara); malvidino-3-gliukozidas (Mv-3-glu); malvidino-3-arabinozidas (Mv-3-ara) [40,41]. Visi junginiai pateikti analičių sulaikymo trukmės tvarka.
Suomijoje, Karadenizo technikos universitete buvo atliktas tyrimas, kurio metu tirtos mėlynės iš aštuonių skirtingų regionų. Nustatyta, kad priklausomai nuo augimo sąlygų (regiono, klimato, aukščio, kuriame auga) bendras antocianinų kiekis vaisiuose svyravo nuo 206,18 iki 867,52 mg/100 g sausos žaliavos [43]. Ženkliai skiriasi rezultatai, gauti Suomijoje, Kuopio universitete, kai atlikus 20 mėlynių mėginių iš skirtingų regionų analizę, bendras antocianinų kiekio vidurkis buvo 2878 mg/100 g sausos žaliavos [44].
1.7. Juodųjų serbentų vaisių (Ribes nigrum L.) antocianinai
Atliekant juodųjų serbentų cheminės sudėties analizę, nustatyta, kad pagrindinė junginių grupė yra antocianinai. 2014 m. Turkijoje, Canakkale Onsekiz Mart universitete buvo įvertintas komercinis juodųjų serbentų sulčių ekstaraktas. Tyrimo eigoje buvo identifikuoti keturi antocianinai: delfinidino-3-gliukozidas (Dp-3-glu); delfinidino-3-rutinozidas (Dp-3-rut); gliukozidas (Cy-3-glu); cianidino-3-rutinozidas (Cy-3-rut) [46]. Visi junginiai pateikti analičių sulaikymo trukmės tvarka. Suomijoje, Turku universitete, tiriant 21 skirtingą juodųjų serbentų veislę, buvo identifikuoti ne tik paminėti, bet ir pelargonidino, malvidino ir petunidino rutinozidai ir gliukozidai [47]. 2016 m. Suomijoje taip pat buvo atliktas tyrimas, kuriame buvo ištirtos 32 juodųjų serbentų veislės. Gautas bendras antocianinų kiekis svyravo nuo 1260- 2878 mg / 100 g sausos žalaivos [45].
2. TYRIMO METODIKA
2.1. Tyrimo objektas
Tyrimui atlikti pasirinkti dviejų skirtingų augalų: mėlynių (Vaccinium myrtillus L.) ir juodųjų serbentų (Ribes nigrum L.) liofilizuotų vaisių milteliai. Liofilizatai gauti iš Lietuvos Agrarinių ir Miškų mokslų Centro sodininkystės ir daržininkystės instituto kolekcijų ir sodų. Laikymo sąlygos -5 °C.
2.2. Reagentai
Išgrynintas vanduo (paruoštas naudojant gryninimo sistemą Milipore, JAV);
37 % Vandenilio chlorido rūgštis (Sigma- Aldrich Chemie GmbH, Vokietija);
96 % Etanolis (Stumbras, Lietuva);
85 % Fosforo rūgštis (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Vokietija);
Natrio fosfato hidratas (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Vokietija).
Acetonitrilas (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Vokietija);
Bevandenė skruzdžių rūgštis (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Vokietija).
2.3. Aparatūra
Analitinės svarstklės „Sartorius CP6M-0CE“ (Vokietija);
Purtyklė (Laboratory shaker type 358S, Lenkija);
Maišyklė su kaitlente ir temperatūros matavimo zondu „TQC-VF8800“ (JAV);
Mikropipetės „Eppendorf Research“ (JAV);
Membraninis, 0,22 μm porų dydžio filtras Carl Roth GmbH, Karlsruhe (Vokietija);
Waters 2695 chromatografas (Waters Corporation, Milfordas, JAV);
Waters 2998 PDA detektorius (Waters, Milfordas, JAV);
Acquity H-class skysčių chromatografas („Waters“, Milfordas, MA, JAV);
2.4. Ekstraktų paruošimas
Tyrimo metu kiekvieno liofilizato buvo paimta po 0,5 g ir ekstrahuojama 30 min. purtyklėje, naudojant 96 % etanolio tirpalą. Gauti ekstraktai filtruoti per popierinį filtrą į matavimo kolbutes ir praskiesti 96 % etanolio tirpalu iki 10 ml. Šie ekstraktai buvo naudoti stabilumo tyrimų metu.
2.5. Antocianinų stabilumo tyrimo sąlygos in vitro
Eksperimentiniu būdu modifikuota ir pritaikyta Rasos Kalėdaitės ir kolegų naudota metodika [39]. Šių stabilumo tyrimų metu naudota magnetinė maišyklė su kaitlente ir temperatūros matavimo zondu, terpės tūris – 200 ml (250 ml Erlenmejerio kolboje su šlifu), maišyklės magneto sukimosi greitis - 100 k/min. Liofilizuoti mėlynių ir serbentų mėginiai buvo vertinami dvejose temperatūrose: 37 ± 0,5 °C ir 39 ± 0,5 °C. Pagal aukščiau aprašytą tvarką, paruošti antocianinus kaupiančių augalų ekstraktai patalpinti į Erlenmejerio kolbą.
Stabilumo tyrimo laiko intervalai ir naudotų terpių pH reikšmės: 1. Nuo 0 iki 120 min. terpės pH= 1,2 – druskos rūgšties tirpalas;
2. Nuo 120 iki 240 min. pH reikšmė terpėje padidinama iki 6,8, įdedant į tirpalą 1,35 g Na3PO4 · 12
H2O;
3. Nuo 240 iki 300 min pH reikšmė terpėje padidinta iki 7,5, įdedant 1,46 g Na3PO4 · 12 H2O;
4. Nuo 300 iki 420 min terpės pH reikšmė sumažinama iki 6 su praskiesta fosforo rūgštimi.
Iš terpės, naudojant mikropipetę, paimta 2 ml tirpalo ESC metodui atlikti. Mėginiai iš Erlenmejerio kolbos paimti: iškart sumaišius ekstraktą su terpe (0 min), po 120, 240, 300 ir 420 min. Paėmus mėginį, prieš atliekant ESC metodą, visi mėginiai buvo parūgštinami 85 % fosforo rūgštimi, kad likę antocianinai būtų stabilioje flavilio katijono formoje.
Stabilumo tyrimo rezultatų kokybei garantuoti, prie abiejų temperatūrų buvo atliekama teigiama kontrolė (10 ml gauto ekstrakto patalpinta į 200 ml distiliuoto vandens terpę - pH 5,8) Atsižvelgiant į antocianinų stabilumą, tyrimo metu mėginiai buvo uždengti aliuminio folija, kad būtų užtikrinta apsauga nuo šviesos poveikio. Virškinimo fermentai nebuvo įtraukti į šio tyrimo sąlygas, nes nėra pakankamai duomenų, įrodančių fermentų įtaką fenolinių junginių virškinime [50].
2.6. Antocianinų identifikavimas naudojant ESC metodą
Antocianinų identifikavimui, kiekvieno mėginio paimta po 2 ml. Visi mėginiai filtruoti pro membraninį 0,22 μm porų dydžio filtrą (Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Vokietija). Analizė atlikta naudojant ,,Waters 2695“ chromatografą su detektoriumi ,,Waters 2998 PDA“. 10 μl analitinio mėginio injekuota į atvirkštinių fazių ESC kolonėlę ACE 5 C18, kurios diametras 4,6 x 250 mm. Analizė atlikta kambario temperatūroje. Vieno mėginio analizės trukmė – 60 min.
Buvo taikytas gradientinis eliuavimas (2 lentelė). Eliuentų tėkmės greitis- 1ml/min. Eliuentas (mobili fazė) A – praskiesta bevandenė fosforo rūgštis (8,5 : 91,5 V/V), eliuentas (mobili fazė) B – acetonitrilas.
2 lentelė. Eliucijos gradiento kitimas
Laikas (min.) Mobili fazė A (%) Mobili fazė B (%)
0 - 35 93 → 75 7 → 25
35 - 45 75 → 35 25→ 65
45 - 46 35 → 0 65→ 100
46 -50 0 100
Identifikuojant antocianinus buvo lyginamos analičių sulaikymo trukmės su standartų sulaikymo trukmėmis ir spektrais, kurie buvo gauti su PDA detektoriumi. Šių junginių detekcija atlikta prie 525 nm bangos ilgio.
2.7. Antocianinų identifikavimas naudojant UESC-MS metodą
Naudojant ultra efektyviosios skysčių chromatografijos su tandemine masių spektrometrija metodą (UESC-MS) buvo galima pilnai įvertinti antocianinų profilį pradiniame ir stabilumo tyrimų mėginiuose. Šio metodo pagalba buvo įmanoma identifikuoti juodųjų serbentų (Ribes nigrum L.) liofilizuotų vaisių miltelių antocianinų profilį.
Chromatografinis skirstymas atliktas naudojant YMC Triart C18 (100 Å, 1,9 µm 100 × 2,0 mm) („YMC“, Kiotas, Japonija) kolonėlė su prieškolonėle. Kolonėlėje palaikoma pastovi 40 °C temperatūra. Buvo taikytas gradiantinis eliuavimas (3 lentelė), metodikoje mobilę fazę sudarė eliuentas A (0,1 %
vandeninis skruzdžių rūgšties tirpalas) ir eliuentas B (acetonitrilas). Bendra gradientinės eliucijos trukmė – 10 min. Eliuento tėkmės greitis – 0,5 ml/min. Injekcijos tūris – 1 µl.
3 lentelė. Eliucijos gradiento kitimas
Laikas Mobili fazė A (%) Mobili fazė B (%)
1 95 % 5 % 5 70 % 30 % 7 50 % 50 % 7,5 0 % 100 % 8 0 % 100 % 8,1 95 % 5 % 10 95 % 5 %
Masių spektrometro parametrai: teigiama elektropurkštuvinė jonizacija, kapiliaro įtampa – 2500 V, jonų šaltinio temperatūra – 150 °C, eliuento išgarinimo temperatūra – 500 °C, eliuento išgarinimo dujų tėkmės greitis – 800 l/val. Antocianinų smailės buvo analizuojamos MRM režimu. Chromatografinės smailės identifikuotos pagal analitės bei etaloninio junginio sulaikymo laiką ir masių spektrometriniu detektoriumi gautus etaloninių junginių ir analičių masių spektrus.
Statistinis duomenų įvertinimas. Statistiniam gautų rezultatų įvertinimui buvo naudojamas Excel 2013 (Microsoft, JAV), Empower® programos analizės įrankių paketas. Atliktas 2 pakartojimų vidurkių palyginimas ir dispersinė (ANOVA) analizė, kai stabilumo tyrimų temperatūra buvo 37 ± 0,5 °C. Tokiu būdu buvo paskaičiuotas rezultatų statistinis patikimumas. Pagal patikimumą duomenys suskirstyti į statistiškai patikimus, kai p < 0,05 arba nepatikimus, kai p > 0,05. Dėl Lietuvoje įvesto COVID-19 karantino nebuvo atlikti bandymų pakartojimai esant 39 ± 0,5 °C temperatūrai, todėl nebuvo įmanoma įvertinti šių rezultatų statistinio patikimumo.
3. TYRIMO REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1. Kokybinis antocianinų chromatografinių profilių charakterizavimas
Antocianinų kokybiniam charakterizavimui ir junginių identifikavimui naudotas ESC (su diodų matricos detekcija) ir UESC-MS metodas. Siekiant nustatyti ir palyginti chromatografinius profilius, gauti chromatospektriniai duomenys buvo lyginti su standartizuoto mėlynių (Vaccinium myrtillus L.) ekstrakto smailių sulaikymo trukme bei Europos farmakopėjos monografijose ir mokslinėse publikacijose pateiktais chromatografiniais profiliais ir duomenimis. Chromatografiniai tirpalų profiliai vertinti atsižvelgiant į stabilumo tyrimų eigą ir mėginių seką (6 pav.).
6 pav. Stabilumo tyrimų sekos schema, kuri buvo taikyta tirpalų chromatografinių profilių palyginimui
3.1.1.Mėlynių (Vaccinium myrtillus L.) chromatografinių profilių charakterizacija
Įvertinus antocianinų ESC sulaikymo laikus ir sulyginus su mėlynių ekstrakto standarto tirpalu pradiniame mėginyje (A) ir stabilumo tyrimo mėginyje (B) kokybiškai nustatyta 15 junginių 3-gal; Dp-3-glu; Cy-3-gal; Dp-3-ara; Cy-Dp-3-glu; Pt-3-gal; Cy-3-ara; Pt-Dp-3-glu; Pn-3-gal; Pt-3-ara; Pn-Dp-3-glu; Mv-3-gal; Pn-3-ara; Mv-3-glu; Mv-3-ara (7 pav.). Stabilumo tyrimo mėginiuose (C, D, E) identifikuoti 9 junginiai: Cy-3-gal; Cy-3-glu; Cy-3-ara; Pn-3-gal; Pn-3-glu; Mv-3-gal; Pn-3-ara; Mv-3-glu; Mv-3-ara. Pastebėta, kad 5 antocianinų:Dp-3-gal; Dp-3-glu; Dp-3-ara; Pt-3-gal; Pt-3-ara nebuvo įmanoma identifikuoti, kai terpės pH reikšmė pakeista iš pH 1,2 (B mėginys) į pH 6,8 (C mėginys) – tai parodo, kad mėlynių antocianinų profilis stabilumo tyrimo mėginiuose kinta priklausomai nuo aplinkos terpės. Gauti rezultatai atitiko Europos farmakopėjos monografijoje pateikto chromatografinio profilio smailes ir sutapo su Australijos IMCD grupės atliktų mėlynių ekstraktų profilio tyrimų rezultatais [40,41]. Taigi, palyginus gautą antocianinų profilį su mėlynių ekstrakto standartu ir kitais tyrimais, nustatyta, kad pradinio tirpalo ir stabilumo tyrimo mėginio tirpalo profilis yra būdingas mėlynių žaliavos ruošiniams.
B pH – 1,2 120 min. A pH - 1,2 0 min. C pH – 6,8 240 min. D pH – 7,5 300 min. E pH - 6 420 min.
7 pav. Mėlynių (Vaccinium myrtillus L.) mėginių chromatogramos (A-E): 1. Dp-3-gal; 2. Dp-3-glu; 3. Cy-3-gal; 4. Dp-3-ara; 5. Cy-3-glu; 6. Pt-3-gal; 7. Cy-3-ara; 8. Pt-3-glu; 9. Pn-3-gal; 10. Pt-3-ara; 11.
Pn-3-glu; 12. Mv-3-gal; 13. Pn-3-ara; 14. Mv-3-glu; 15. Mv-3-ara
3.1.2. Juodųjų serbentų (Ribes nigrum L.) chromatografinių profilių charakterizacija
Įvertinus antocianinų sulaikymo laikus chromatogramose ir sulyginus juos su standarto tirpalu, identifikuoti antocianinai Dp-3-glu ir Cy-3-glu. Likę serbentų antocianinai identifikuoti pagal analitės bei etaloninio junginio sulaikymo laiką ir masių spektrometriniu detektoriumi gautus etaloninių junginių ir analičių masių spektrus: Dp-3-rut (611 m/z); Cy-3-rut (595 m/z); Cy-3-sop (611 m/z). ESC ir UESC-MS metodų pagalba pradiniame mėginyje (A) ir stabilumo tyrimo mėginiuose (B-E) nustatyti visi 5 junginiai: Dp-3-glu; Cy-3-sop; Dp-3-rut; Cy-3-glu; Cy-3-rut (8 pav.). Identiškas antocianinų profilis nustatytas Z. Diaconeasa ir kitų mokslininkų tyrime, kuriame buvo vertinamos juodųjų serbentų antiproliferacinės ir antioksidacinės savybės [46]. Šio tyrimo metu buvo nustatyti Dp-3-glu; Dp-3-rut; Cy-3-glu; Cy-3-rut. Panašų antocianinų profilį identifikavo Tian Y. ir kiti mokslininkai, tirdami juodųjų serbentų (Ribes nigrum
L.) veislių, gautų iš skirtingų Europos šalių, cheminės sudėties įvairovę. Šio tyrimo metu identifikuoti ne tik aukščiau paminėti, bet ir pelargonidino, malvidino ir petunidino rutinozidai ir gliukozidai [47]. Taigi, palyginus šiame tyrime identifikuotą serbentų antocianinų profilį su rezultatais, gautais iš mokslinių publikacijų, galima teigti, kad profilis yra būdingas juodiesiems serbentams. Duominuoja cianidino ir delfinidino grupės antocianinai. Pagrindiniai glikozdiniai pakaitai: gliukozė ir rutinozė.
8 pav. Juodųjų serbentų (Ribes nigrum L.) mėginių chromatogramos (A-E): 1. Dp-3-glu; 2. Cy-3-sop; 3. Dp-3-rut 4. Cy-3-glu; 5. Cy-3-rut
Atsižvelgiant į metodikoje aprašytas stabilumo tyrimo sąlygas, liofilizuoti mėlynių ir juodųjų serbentų mėginiai buvo vertinami dvejose temperatūrose: 37 ± 0,5 °C ir 39 ± 0,5 °C. Pateiktos tik tos liofilizuotų mėlynių ir juodųjų serbentų vaisių chromatogramos, kurios gautos esant 37 ± 0,5° C temperatūrai. Taip buvo padaryta, turint omenyje, kad prie abiejų temperatūrų buvo identifikuoti identiški antocianinai.
3.2. Antocianinų bei antocianidinų stabilumo vertinimas
Siekiant įvertinti skirtingų antocianinų bei antocianidinų stabilumą virškinamajame trakte, buvo lyginti antocianinų kiekybiniai rodikliai - chromatografinių smailių plotai. Kiekybinių rodiklių pokyčiams vertinti buvo taikytos ESC metodu gautos chromatogramos. Pradinių mėginių antocianinų smailių plotai prilyginti 100 %. Stabilumo tyrimų mėginių antocianinų glikozidų likučiai įvertinti pagal pakitusius smailių plotus bei prilyginus juos pradinių mėginių smailių plotams, visus duomenis pateikiant procentinėmis išraikomis pagal stabilumo tyrimų seką (6 pav.). Stabilumo tyrimo mėginiuose antocianinų procentiniai likučiai įvertinti pagal pradinius mėginius.
Siekiant reprezentatyvaus duomenų pateikimo, kiekvieno lifiolizuoto vaisių ruošinio rezultatai tirti stabilumo tyrimo temperatūrai esant 37 oC lyginti dviem etapais:
1. Pirmame etape buvo sugrupuoti antocianinai (glikozidai), kurių struktūrinis pagrindas yra tas pats aglikonas, ir įvertintas individualių antocianidino glikozidų stabilumas pagal nustatytus procentinius likučius. Gauti rezultatai palyginti su publikuotais moksliniais duomenimis.
2. Antrame etape buvo sudėti smailių plotai tų antocianinų, kurie turi tą patį aglikoną ir pateiktos jų procentinės išraiškos pagal aukščiau aprašytą tvarką. Tokiu būdu buvo galima įvertinti visų žaliavoje identifikuotų antocianidinų stabilumą pagal procentinius likučius ir palyginti su publikuotais moksliniais straipsniais. Mokslinių straipsnių rezultatai perskaičiuoti taip, kad būtų galima palyginti gautus tyrimo ir skelbtus duomenis.
3.2.1. Mėlynių (Vaccinium myrtillus L.) antocianinų stabilumo vertinimas
9 pav. Mėlynių (Vaccinium myrtillus L.) cianidino glikozidų stabilumas
0.00 20.00 40.00 60.00 80.00 100.00 120.00
pH 1,2; 0 min pH 1,2; 120 min pH 6,8; 240 min pH 7,5; 300 min pH 6,0; 420 min
L ik u tis , %
Terpės pH ir mėginio paėmimo laikas
Cy-3-gal Cy-3-glu Cy-3-ara
Pradiniame mėginyje aptiktų Cy-3-gal; Cy-3-glu ir Cy-3-ara smailių plotai buvo prilyginti 100 % (9 pav.). Po 120 min., kai terpės pH 1,2, pastebėtas visų cianidino glikozidų procentinio rodiklio padidėjimas: Cy-3-ara (102 %) > Cy-3-gal (100,74 %) > Cy-3-glu (100,14 %) (p < 0,05). Pakeitus terpės pH iš 1,2 į 6,8 ir paėmus mėginį po 240 min, visų cianidino glikozidų ženkliai sumažėjo (procentiniai antocianinų likučiai, lyginant su pradiniu mėginiu, pateiktas reikšmių mažėjimo seka: Cy-3-gal (18,14 %) > Cy-3-glu (14,8 %) > Cy-3-ara. (14,76 %)) (p < 0,05). Nežymus visų antocianinų mažėjimas nustatytas ir po 300 min (pH 7,5), antocianinai pateikti reikšmių mažėjimo seka: Cy-3-gal (15,69 %) > Cy-3-glu (13,42 %) > Cy-3-ara. (11,24 %). Po simuliuoto virškinamojo trakto proceso daugiausiai liko nesuirusio Cy-3-gal (13,7 %), mažiausiai - Cy-3-ara (11,02 %). Statistiškai reikšmingo cianidino glikozidų skirtumo tarp stabilumo tyrimo terpių (pH 6,8; pH 7,5; pH 6,0) nepastebėta (p > 0,05). Panašūs rezultatai buvo gauti Vokietijos Potsdamo universitete atliktame tyrime, kurio vienas iš tikslų buvo išsiaiškinti mikrofloros fermentacijos proceso įtaką išgrynintų antocianinų-3-glikozidų ekstraktų (Cy-3-glu; Pn-3-glu; Mv-3-glu) degradacijai. Nustatyta, kad po 120 min. 0,05 M kalio fosfato buferyje (pH 7,4), esant 37 oC temperatūrai, procentinis Cy-3-glu likutis buvo 10 % [48]. Taigi, lyginant aptartus rezultatus, galima teigti, kad Cy-3-glu nėra stabilus kai kurių virškinamojo trakto segmentų aplinką imituojančioje silpnai šarminėje ir silpnai rūgštinėje tepėje. Nėra statistiškai reikšmingo skirtumo tarp cianidino glikozidinių pakaitų (galaktozė, gliukozė, arabinozė) (p > 0,05).
10 pav. Mėlynių (Vaccinium myrtillus L.) peonidino glikozidų stabilumas
Pradiniame mėginyje aptiktų Pn-3-gal; Pn-3-glu; Pn-3-ara smailių plotai buvo prilyginti 100 % (10 pav.). Paėmus mėginį po 120 min. (terpės pH 1,2), nustatytas visų peonidino glikozidų procentinio rodiklio padidėjimas: Pn-3-ara (102,88 %) > Pn-3-glu (101,11 %)> Pn-3-gal (101,06 %) (p < 0,05). Pakeitus terpės pH iš 1,2 į 6,8 ir paėmus mėginį po 240 min. pastebėtas ženklus peonidino glikozidų sumažėjimas
0.00 20.00 40.00 60.00 80.00 100.00 120.00
pH 1,2; 0 min pH 1,2; 120 min pH 6,8; 240 min pH 7,5; 300 min pH 6,0; 420 min
L
ik
u
tis
, %
Terpės pH ir mėginio paėmimo laikas
Pn-3-gal Pn-3-glu Pn-3-ara
(procentiniai likučiai, lyginant su pradiniu mėginiu pateikti reikšmių mažėjimo seka Pn-3-glu (63,8 %) > Pn-3-ara (51,22 %) > Pn-3-gal (46,95 %) (p < 0,05). Po 300 min (pH 7,5), peonidino glikozidų nežymiai sumažėjo (reikšmių mažėjimo seka: Pn-3-glu (54,67 %) > Pn-3-ara (46,30 %) > Pn-3-gal (34,81 %)). Po simuliuoto virškinamojo trakto proceso daugiausiai liko nesuirusio glu (51,52 %), o mažiausiai Pn-3-gal (32,59 %). Statistiškai reikšmingo peonidino glikozidų skirtumo tarp stabilumo tyrimų terpių (pH 6,8; pH 7,5; pH 6,0) nepastebėta (p > 0,05). Panašūs rezultatai buvo gauti Stalmach A. ir kitų mokslininkų atliktame tyrime, kuriame buvo vertinamas iš „Konkordo“ vynuogių sulčių išskirtų fenolinių junginių stabilumas ir biologinis praeinamumas. Rezultatai atskleidė, kad rūgštinėje terpėje (1,43 ml skrandžio sulčių (0,32 % pepsino) ir HCl iki pH 2, esant 37 oC) po 60 min. Pn-3-glu procentinis likutis pakito nežymiai (95,83 %). Po papildomų 120 min. šarminėje terpėje (1 % pankretino, 950 µL tulžies ir 0,5 N Na2CO3 iki
pH 7 esant 37 oC) Pn-3-glu procentinis likutis sumažėjo iki 48 % [37]. Taigi, įvertinus abiejų tyrimų rezultatus, galima daryti prielaidą, kad Pn-3-glu yra stabilus kai kurių virškinamojo trakto segmentų aplinką imituojančioje silpnai šarminėje ir silpnai rūgštinėje tepėse. Nėra statistiškai reikšmingo skirtumo tarp skirtingų glikozidinių pakaitų (galaktozė, gliukozė, arabinozė) (p > 0,05).
11 pav. Mėlynių (Vaccinium myrtillus L.) malvidino glikozidų stabilumas
Pradiniame mėginyje aptiktų Mv-3-gal; Mv-3-glu ir Mv-3-ara smailių plotai buvo prilyginti 100 % (11 pav.). Po 120 min. kai terpės pH 1,2, pastebėtas visų malvidino glikozidų procentinio rodiklio padidėjimas: Mv-3-gal (102,38 %) > Mv-3-ara (102,33 %) > Mv-3-glu (101,36 %) (p < 0,05). Pakeitus terpės pH iš 1,2 į 6,8 ir paėmus mėginį po 240 min. pastebėtas peonidino glikozidų sumažėjimas (procentiniai antocianinų likučiai, lyginant su pradiniu mėginiu: Mv-3-glu (66,37 %) > Mv-3-ara (56,05 %) > Mv-3-glu (54,03 %)) (p < 0,05). Nežymus visų malvidino glikozidų mažėjimas nustatytas ir po 300 min
0.00 20.00 40.00 60.00 80.00 100.00 120.00
pH 1,2; 0 min pH 1,2; 120 min pH 6,8; 240 min pH 7,5; 300 min pH 6,0; 420 min
L
ik
u
tis
, %
Terpės pH ir mėginio paėmimo laikas
Mv-3-gal Mv-3-glu Mv-3-ara
(pH 7,5). Po simuliuoto virškinamojo trakto proceso daugiausiai liko 3-glu (55,69 %), mažiausiai - Mv-3-gal (46,45 %). Statistiškai reikšmingo malvidino glikozidų skirtumo tarp stabilumo tyrimų terpių (pH 6,8; pH 7,5; pH 6,0) nepastebėta (p > 0,05). Panašūs rezultatai buvo gauti Kinijoje, Fudžou universitete, kur buvo tiriama mėlynių (Vaccinium myrtillus L.) antocianinų cheminės struktūros įtaka šių junginių stabilumui, imituojant virškinimojo trakto sąlygas. Nustatyta, kad po 120 min. rūgštinėje terpėje (2 g/L NaCl ir koncentruota HCl, pH 2, 37 oC) Mv-3-glu procentinis likutis nežymiai padidėjo (101,14 %), po papildomų
120 min. šarminėje terpėje (NaHCO3, pH 7,4, 37 oC) Mv-3-glu procentinis likutis sumažėjo iki 59,12 %
[35]. Taigi, lyginant aptartus rezultatus galima teigti, kad Mv-3-glu pasižymi geru stabilumu kai kurių virškinamojo trakto segmentų aplinką imituojančioje silpnai šarminėje ir silpnai rūgštinėje terpėse. Nenustatyta statistiškai reikšmingo skirtumo tarp malvidino glikozidinių pakaitų (galaktozė, gliukozė, arabinozė) (p > 0,05).
12 pav. Mėlynių (Vaccinium myrtillus L.) delfinidino ir petunidino glikozidų stabilumas
Pradiniame mėginyje aptiktų delfinidino glikozidų (Dp-3-gal, Dp-3-glu, Dp-3-ara) ir petunidino glikozidų (Pt-3-gal; Pt-3-glu; Pt-3-ara) smailių plotai buvo prilyginti 100 % (12 pav.). Po 120 min., nekeičiant terpės (pH 1,2), užfiksuotas nežymus visų delfinidino ir petunidino glikozidų procentinio rodiklio padidėjimas: Pt-3-ara (102,14 %) > Pt-3-gal (101,93 %) > Dp-3-glu (101,68 %) > Pt-3-glu (100,55 %) > Dp-3-ara (100,36 %) > Dp-3-gal (100,25 %) (p < 0,05). Pakeitus terpės pH iš 1,2 į 6,8 delfinidino ir petunidino glikozidų procentinių likučių rodikliai sumažėjo tiek, kad taikant pasirinktas metodologines sąlygas jų nebuvo įmanoma paskaičiuoti (p < 0,05). ESC metodu stabilumo tyrimo mėginiuose (7 pav.) nebuvo identifikuoti, todėl nebuvo galima įvertinti šių junginių smailių plotų. Panašūs rezultatai gauti mokslininko Correa-Betanzo J. ir kitų atlikto tyrimo metu, vertinant siauralapių šilauogių (Vaccinium
85.00 90.00 95.00 100.00 105.00 110.00 pH 1,2; 0 min pH 1,2; 120 min L ik u tis , %
Terpės pH ir mėginio paėmimo laikas
angustifolium L.) polifenolių stabilumą ir biologinį aktyvumą atliekant in vitro virškinamojo trakto simuliaciją. Tyrimo rezultatai po 120 min. rūgštinėje terpėje (koncentruota HCl, 15720 vienetų pepsino, pH 2, 37 oC) parodė nežymų Dp-3-ara ir Pt-3-gal pokytį (atitinkamai 103,5 % ir 96,29 %). Po papildomų 120
min. šarminėje terpėje (0,5 N NaHCO3; 2,5 ml pankreatino; pH 7,5; 37 oC) Dp-3-ara ir Pt-3-gal buvo aptikti
tik likučiai, todėl mokslininkai šių junginių kiekio nevertino. Skirtumas buvo pastebėtas vertinant Dp-3-glu ir Dp-3-gal stabilumą, kurių procentiniai likučiai šarminėje terpėje buvo atinkamai 28,83 % ir 4,41 % [49]. Taigi, lyginant tyrimų rezultatus, galima teigti, kad Dp-3-ara ir Pt-3-glu pasižymi prastu stabilumu silpnai šarminėje ir rūgštinėje terpėse. Nėra statistiškai reikšmingo skirtumo tarp skirtingų delfinidino ir petunidino glikozidinių pakaitų (galaktozė, arabinozė, gliukozė) (p > 0,05).
3.2.2. Mėlynių (Vaccinium myrtillus L.) antocianidinų stabilumo vertinimas
13 pav. Mėlynių (Vaccinium myrtillus L.) antocianidinų stabilumas
Remiantis tyrimo duomenimis galima daryti prielaidą, kad mėlynių (Vaccinium myrtillus L.) antocianidinų procentinai likučiai laiko ir pH atžvilgiu skiriasi (13 pav.). Didžiausiu procentiniu likučiu pasižymėjo malvidinas, kurio kiekis per 420 min. esant 37 oC temperatūros ir keičiant terpės pH (1,2 →
0.00 20.00 40.00 60.00 80.00 100.00 120.00
pH 1,2; 0 min pH 1,2; 120 min. pH 6,8; 240 min pH 7,5; 300 min pH 6,0; 420 min
L
ik
u
tis
, %
Terpės pH ir mėginio paėmimo laikas
Malvidinas Petunidinas
Peonidinas Cianidinas
6,8 → 7,5 → 6,0) pakito atitinkamai tokia seka: 100 % < 101,79 % > 61,42 % > 55,78 % > 52,72 %. Panašų procentinį pokytį turėjo ir peonidinas: 100 % < 101,29 % > 59,18 % > 49,91 % > 46,62 %. Cianidino procentinis likutis ženkliai skyrėsi nuo malvidino ir peonidino: 100 % < 100,83 % > 16,05 % > 13,74 % > 12,76 %. Mažiausiu procentiniu likučiu pasižymėjo delfinidinas ir peonidinas, kurių po terpės pH pokyčio iš 1,2 į 6,8 nebuvo įmanoma įvertinti.
Norint suprasti antocianidinų struktūros įtaką jų stabilumui simuliuojant virškinamo trakto sąlygas, buvo stebimi skirtingi mėlynių (Vaccinium myrtillus L.) antocianidinai. Pasirinkta vertinti antocianidinus, nes nebuvo pastebėtas statistiškai reikšmingas skirtumas tarp mėlynių antocianinų glikozidinių pakaitų (galaktozės, arabinozės, gliukozės) (p > 0,05). Atsižvelgiant į šį teiginį, tyrimo duomenis buvo galima pateiktireprezentatyvesne forma – linijine diagrama. Rezultatai parodė, kad antocianidinai išlieka stabilūs simuliuotame skrandžio, bet ne žarnyno virškinimo procese. Silpnai šarminė terpė plonajame žarnyne gali būti pagrindine antocianidinų nestabilumo priežastimi [15, 35]. Aukščiau pateikti antocianidinų procentiniai likučiai (13 pav.) atsipindi šių junginių stabilumą (kuo didesnis procentinis likutis, tuo stabilesniu laikomas pats antocianidino struktūrinis fragmentas).
Nustatyta, kad antocianidinų cheminė struktūra skirtingose pH sąlygose išlaiko pusiausvyrą. Pakeitus terpės pH į rūgštinę, didžioji dalis antocianidinų išlaikė flavilio katijono konformaciją. Dėl tokio konformacijos poslinkio pagerėja antocianidinų tirpumas vandenyje, todėl gali padidėti bendras antocianidinų procentinis likutis simuliuojant skrandžio virškinimo procesą [17, 50, 51]. Toks reiškinys pastebėtas ir šio tyrimo metu (visų antocianidinų procentinis likutis po 120 min. rūgštinėje terpėje neženkliai padidėjo (13 pav.) (p > 0,05). Procentinio likučio sumažėjimą žarnyno virškinimo procese galėtų paaiškinti tautomeriniai pokyčiai, kurių metu suyra heterociklinio žiedo struktūra ir susiformuoja chalkono forma. Didėjant pH reikšmei chalkono forma suyra, įvyksta degradacijos reakcijos (4 pav.), po kurių antocianidinų procentiniai likučiai gali ženkliai sumažėti [17, 18, 50].
Antocianidinų stabilumas yra susijęs su jų chemine struktūra. Šių junginių cheminės savybės ir struktūrinės ypatybės (1. hidroksilo grupių skaičius, vieta ir metilinimo laipsnis; 2. prisijungusių cukrų prigimtis, padėtis ir skaičius; 3. alifatinių ir aromatinių rūgščių skaičius ir prigimtis [3]) nulemia ne tik įvairovę, bet ir stabilumą. Delfinidinas, kurio B žiede yra trys hirdoksilo grupės, pasižymėjo blogiausiu stabilumu, analogišku stabilumu pasižymėjo ir petunidinas. Labiau hidroksilintų antocianidinų nestabilumą galėtų paaiškinti didesnis oksidacinis poveikis šio tipo cheminei struktūrai [15, 35]. Hidroksi grupė 3’ B žiedo padėtyje buvo pakeista metoksi grupe petunidino struktūroje, todėl šis junginys teoriškai turėjo pasižymėti geresniu stabilumu nei delfinidinas [1, 35]. Remiantis šio tyrimo rezultatais patebėta, kad petunidino stabilumas buvo praktiškai identiškas delfinidino stabilumui, nes abiejų junginių identifikacija
