LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS
VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA
SIMONA JANKEVIČIŪTĖ
TIOFENO DARINIŲ ANTIMIKROBINIO IR PRIEŠVĖŽINIO
AKTYVUMO TYRIMAS BEI JŲ TOKSIŠKUMO,
FARMAKOKINETINIŲ SAVYBIŲ IR STRUKTŪROS –
AKTYVUMO RYŠIO ĮVERTINIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovė Doc. dr. Vilma Petrikaitė
Konsultantai
Dr. Jonas Šarlauskas Prof. dr. Alvydas Pavilonis
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS
VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis Data
TIOFENO DARINIŲ ANTIMIKROBINIO IR PRIEŠVĖŽINIO AKTYVUMO TYRIMAS BEI JŲ TOKSIŠKUMO, FARMAKOKINETINIŲ SAVYBIŲ IR STRUKTŪROS – AKTYVUMO
RYŠIO ĮVERTINIMAS Magistro baigiamasis darbas
Konsultantai Darbo vadovė
Dr. Jonas Šarlauskas Doc. dr. Vilma Petrikaitė
Data Data
Prof. dr. Alvydas Pavilonis Data
Recenzentas Darbą atliko
Magistrantė
Simona Jankevičiūtė
Data Data
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 6
SANTRUMPOS ... 8
ĮVADAS ... 9
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 10
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 11
1.1. Naujų antimikrobinių vaistų poreikis ... 11
1.2. Tiofeno darinių antimikrobinis aktyvumas... 11
1.3. Pasirinktų mikroorganizmų savybių apžvalga ... 15
1.4. Naujų vaistų nuo vėžio poreikis ... 16
1.5. Tiofeno darinių priešvėžinis aktyvumas ... 16
1.6. Pasirinktų vėžinių ląstelių savybių apžvalga ... 17
1.7. Farmakokinetinių savybių ir toksiškumo nustatymo svarba ... 18
2. TYRIMO METODIKA IR METODAI ... 20
2.1. Tyrimo objektas ... 20
2.2. Reagentai, priemonės ir aparatūra ... 21
2.3. Antimikrobinio aktyvumo tyrimai in vitro ... 22
2.4. Priešvėžinio aktyvumo tyrimai in vitro ... 24
2.5. Junginių farmakokinetinių savybių ir toksiškumo įvertinimas ... 24
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 25
3.1. Tiofeno darinių antimikrobinis aktyvumas... 25
3.3. Tiofeno darinių struktūros – aktyvumo ryšys ... 31
3.4. Tiofeno darinių farmakokinetinės savybės ... 32
3.5. Tiofeno darinių toksiškumas ... 35
3.6. Perspektyviausi tiofeno dariniai ... 36
4. IŠVADOS ... 38
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 39
6. LITERATŪROS SĄRAŠAS... 40
5
SANTRAUKA
S. Jankevičiūtės magistro baigiamasis darbas „Tiofeno darinių antimikrobinio ir priešvėžinio aktyvumo tyrimas bei jų toksiškumo, farmakokinetinių savybių ir struktūros – aktyvumo ryšio įvertinimas“. Mokslinė vadovė – doc. dr. V. Petrikaitė, konsultantai: dr. J. Šarlauskas, prof. dr. A. Pavilonis. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmacijos fakulteto Vaistų chemijos katedra. Kaunas, 2015.
Darbo tikslas – įvertinti tiofeno darinių struktūros įtaką jų antimikrobiniam ir priešvėžiniam aktyvumui bei parinkti perspektyviausius junginius tolimesniems tyrimams.
Darbo uždaviniai:
1. Ištirti tiofeno junginių antimikrobinį (priešgrybelinį ir antibakterinį) aktyvumą in vitro. 2. Ištirti tiofeno darinių priešvėžinį aktyvumą in vitro.
3. Nustatyti tiofeno darinių antimikrobinio ir priešvėžinio aktyvumo bei cheminės struktūros ryšio dėsningumus, gautus eksperimentinių duomenų pagrindu.
4. Įvertinti tiofeno darinių toksiškumą bei farmakokinetines savybes in silico.
5. Atrinkti perspektyviausius junginius – lyderius tolimesniems vystymo etapams, atsižvelgiant į gautus rezultatus.
Tyrimo metodai. Junginių antimikrobinis aktyvumas tirtas serijinio skiedimo standžioje terpėje metodu in vitro gramteigiamoms ir gramneigiamoms bakterijoms bei grybeliui Candida
albicans. Priešvėžinio aktyvumo tyrimai atlikti MTT metodu, įvertinant žmogaus krūties, melanomos
ir plaučių vėžio ląstelių proliferaciją slopinančias junginių koncentracijas. Junginių toksiškumas ir farmakokinetinės savybės išnagrinėtos in silico naudojant „ACD/I-Lab“ programą.
Rezultatai. Tiofeno dariniai pasižymėjo skirtingu antibakteriniu aktyvumu. Labiausiai jie buvo aktyvūs prieš Staphylococcus genties ir sporines bakterijas (2-91 μM koncentracijomis), beveik neveikė gramneigiamų bakterijų ir grybelio Candida albicans. Dauguma tiofeno darinių slopino A549, IGR39 arba MCF7 vėžio ląstelių proliferaciją mažesnėmis nei 10 μM koncentracijomis. Antimikrobiniam ir priešvėžiniam tiofeno darinių aktyvumui svarbi prie heterociklo esanti nitro grupė ir prie amidinės jungties esantis fenilo, fluorfenilo arba nitrofenilo pakaitas. Piešvėžinį aktyvumą taip pat padidina bromo pakaitas prie tiofeno ir benzeno. Beveik visi tirti tiofeno dariniai galėtų būti vidutiniškai arba gerai pasisavinami per os, spėjama, kad visi stipriai jungtųsi su kraujo plazmos baltymais ir turėtų būti mažai ar vidutiniškai toksiški.
6
SUMMARY
S. Jankevičiūtė Master Thesis „Analysis of antimicrobial and anticancer activity of thiophene derivatives, evaluation of their toxicity, pharmacokinetic properties and structure – activity relationship“. Scientific supervisor – Assoc. Prof. V. Petrikaitė, advisors: Dr. J. Šarlauskas, Prof. A. Pavilonis. Department of Drug chemistry, Faculty of Pharmacy, Lithuanian University of Health Sciences. Kaunas, 2015.
The aim of the research was to evaluate the structure influence of thiophene derivatives on their antimicrobial and anticancer activity and to identify the lead compounds for their development.
Objectives:
1. To test antimicrobial (antibacterial and antifungal) activity of thiophene derivatives in vitro. 2. To test anticancer activity of thiophene derivatives in vitro.
3. To identify the relationship between the structure of thiophene derivatives and their antimicrobial and anticancer activity.
4. To evaluate ADME/Tox properties of thiophene derivatives in silico. 5. To identify the lead compounds for their development.
Methods. Antimicrobial activity of thiophene derivatives was tested in vitro by serial dilution in agar with grampositive and gramnegative bacteria and fungus Candida albicans. Anticancer activity was tested in vitro using MTT assay by establishing concentrations that inhibit human breast cancer, melanoma and lung cancer cell proliferation. Toxicity and pharmacokinetics of the derivatives was predicted in silico using „ACD/I-Lab“application.
Results. Thiophene derivatives had a different antimicrobial activity. They inhibited the growth of Staphylococcus and Bacillus bacteria with 2-91 μM concentrations, but were almost inactive against gramnegative bacteria and fungus Candida albicans. Most of the compounds inhibited the proliferation of A549, IGR39 or MCF7 cancer cells with concentrations less than 10 μM. It is important for antimicrobial and anticancer activity of thiophene derivatives to have a nitro group substituent in heterocycle and phenyl, fluorophenyl or nitrophenyl substituent in amide group. Almost all compounds should be well absorbed per os, all of them could bind strongly to plasma proteins and should have low or medium toxicity.
7
PADĖKA
Dėkoju savo baigiamojo darbo vadovei doc. dr. Vilmai Petrikaitei už visapusę pagalbą atliekant tyrimus bei nuolatinį skatinimą domėtis moksline veikla. Taip pat noriu padėkoti dr. Jonui Šarlauskui už tiriamųjų junginių tiekimą bei analizę, prof. dr. Alvydui Paviloniui – už suteiktą galimybę dirbti mikrobiologijos laboratorijoje ir Neuromokslų instituto darbuotojams – už pagalbą atliekant priešvėžinius tyrimus bei galimybę naudotis inventoriumi.
8
SANTRUMPOS
%F biologinis pasisavinimas
%PPB jungimasis prie plazmos baltymų (angl. plasma protein binding)
ADME/Tox absorbcija, pasiskirstymas, metabolizmas, šalinimas (angl. absorption, distribution,
metabolism, excretion) ir toksiškumas
ATCC Amerikos ląstelių kultūrų kolekcija (angl. American type culture collection) BMR branduolių magnetinis rezonansas
DMEM Dulbecc'o modifikuota Eagle ląstelių mitybinė terpė (angl. Dulbecco's Modified Eagle
Medium)
DMSO dimetilsulfoksidas
ESC efektyvioji skysčių chromatografija
FBS fetalinis veršiukų serumas (angl. fetal bovine serum)
GI50 koncentracija, slopinanti 50 proc. ląstelių augimą (angl. growth inhibition)
IC50 koncentracija, sukelianti 50 proc. ląstelių biologinių ar
biocheminių funkcijų netekimą (angl. inhibitory concentration) IR infraraudonieji spinduliai
LD50 medžiagos dozė, sukelianti 50 proc. laboratorinių gyvūnų mirtį (angl. lethal dose)
LogP pasiskirstymo koeficiento tarp vandens ir 1-oktanolio logaritmas
MRDD didžiausia rekomenduojama paros dozė, vartojant per os (angl. maximum recommended
daily dose)
MSK mažiausia slopinamoji koncentracija
MTT 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromidas PBS fosfatinis druskų tirpalas (angl. phosphate-buffered saline)
9
ĮVADAS
Nuo 1990 m. smarkiai sumažėjo mirštamumas nuo kai kurių infekcinių ligų (tymų, stabligės ir kt.), tačiau jos išlieka tarp trijų labiausiai paplitusių susirgimų, kartu su vėžiu bei širdies ir kraujagyslių sistemos ligomis [1]. Tam turi įtakos vis didėjantis mikroorganizmų atsparumas antibiotikams, kuris kyla dėl neracionalaus šių vaistų vartojimo: tiek įsigijus jų be recepto [2], tiek neteisingai paskyrus gydymo įstaigoje [3]. Todėl didėja naujų antimikrobinių medžiagų, kurios veiktų atsparias padermes, poreikis.
Vėžiniai susirgimai ypač paplitę išsivysčiusiose šalyse [4]. Kasmet Europoje užfiksuojama apie 3,2 mln. naujų vėžio atvejų ir 1,7 mln. mirčių nuo šios ligos [5]. Prognozuojama, kad šie skaičiai tik didės [4]. Dėl to išlieka poreikis kurti naujus vaistus nuo vėžio.
Tiofeno žiedas svarbus junginių antimikrobiniam [6], priešvėžiniam bei priešuždegiminiam aktyvumui [7]. Taip pat tiofeno dariniai galėtų būti pritaikyti gydyti Alzheimerio ligą [8] ir hepatitą C [9]. Dėl galimo tiofeno darinių aktyvumo prieš mikrobus ir vėžio ląsteles, nutarėme ištirti tokių junginių grupę, įvertinti jų aktyvumą bei farmakokinetines ir toksines savybes.
Darbo tikslas – įvertinti tiofeno darinių struktūros įtaką jų antimikrobiniam ir priešvėžiniam aktyvumui bei parinkti perspektyviausius junginius tolimesniems tyrimams.
Šio darbo rezultatai buvo pristatyti:
Lietuvos sveikatos mokslų universitete 2013 m. lapkričio 23 d. vykusioje 4-oje tarptautinėje farmacijos mokslų konferencijoje. Pranešimo pavadinimas: „Antimicrobial properties of thiophene derivatives“ (1 priedas).
Lietuvos sveikatos mokslų universitete 2014 m. gegužės 21-23 d. vykusioje Jaunųjų mokslininkų ir tyrėjų konferencijoje. Pranešimo pavadinimas: „Tiofeno darinių antimikrobinio aktyvumo tyrimas“ (2 priedas).
Tarptautinėje mokslinėje stovykloje „Idėjų kalvė“, vykusioje 2014 m. birželio 19-22 d. Pranešimo pavadinimas: „Antimicrobial properties of thiophene derivatives“ (3 priedas).
10
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas – įvertinti tiofeno darinių struktūros įtaką jų antimikrobiniam ir priešvėžiniam aktyvumui bei parinkti perspektyviausius junginius tolimesniems tyrimams.
Darbo uždaviniai:
1. Ištirti tiofeno junginių antimikrobinį (priešgrybelinį ir antibakterinį) aktyvumą serijinio skiedimo standžioje terpėje metodu in vitro.
2. Ištirti tiofeno darinių priešvėžinį aktyvumą MTT metodu in vitro.
3. Nustatyti tiofeno darinių antimikrobinio ir priešvėžinio aktyvumo bei cheminės struktūros ryšio dėsningumus eksperimentinių duomenų pagrindu.
4. Įvertinti tiofeno darinių toksiškumą bei farmakokinetines savybes in silico.
11
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Naujų antimikrobinių vaistų poreikis
Nors šiuo metu infekcinių ligų gydymui yra platus antibiotikų pasirinkimas, vis didėja naujų antimikrobinių medžiagų poreikis. Manoma, kad naujos vaistinės medžiagos turėtų veikti kitokiais mechanizmais nei dabartiniai antibiotikai, kuriems jau išsivystė mikroorganizmų rezistentiškumas [10]. Atsparumas antibiotikams gali būti skirstomas į kelias kategorijas (mikrobiologinis, klinikinis, kryžminis bei paralelinis) ir gali priklausyti nuo įvairių faktorių [11], todėl sunku užtikrinti, kad esami ar kuriami vaistiniai preparatai bus ilgą laiką veiksmingi.
Naujų antimikrobinių vaistų poreikį patvirtina įvairūs epidemiologiniai tyrimai. Lietuvoje atliktas tyrimas parodė, kad iš 746 apklaustų respondentų net 22 proc. vartojo antibiotikus be recepto – daugiausia viršutinių kvėpavimo takų infekcijų gydymui [12]. Kita vertus, neracionalus šių vaistų vartojimas galimas ir sveikatos priežiūros įstaigose. Buvo pastebėti skirtingi dažniausiai pasitaikantys neteisingo antibiotikų vartojimo ligoninėse atvejai: nebuvo indikacijos šių vaistų vartojimui (75 proc.), netinkamai parinktas tirpiklis (54,81 proc.), vaisto dozė ar skiedimas (29,81 proc.), taip pat buvo netinkamas vartojimo laikas (49,04 proc.), labai ilgas gydymo kursas (44,23 proc.) ir dažnas vaistų keitimas be rimtos priežasties (37,5 proc.) [3]. Šiuos atvejus galima laikyti svarbiais rizikos veiksniais, sąlygojančiais mikrobų rezistentiškumą antibiotikams.
Nepaisant fakto, kad reikalinga naujų vaistinių medžiagų paieška, kai kurie autoriai mano, jog sprendimą galima rasti pasitelkus senesnių kartų antibiotikus. Kadangi tokie vaistai (polimiksinai, fosfomicinas, fuzido rūgštis, klotrimoksazolas ir kt.) ilgą laiką nebuvo plačiai vartojami, nemaža dalis mikrobų dar nėra jiems atsparūs. Todėl iš naujo pradėtos vertinti jų savybės gydant sunkias infekcijas, o norint padidinti jų aktyvumą ar sumažinti toksiškumą, pradėta ieškoti genetinių ir molekulinių modifikacijų [13].
Bet kokiu atveju, antimikrobinių medžiagų tyrimai yra reikalinga ir perspektyvi mokslo sritis.
1.2. Tiofeno darinių antimikrobinis aktyvumas
12
aktyvumo prieš S. aureus ir Streptococcus pyogenes (S. pyogenes) kaip cefalotinas (MSK 13,3 μM) [14]. Tačiau minėti junginiai neprilygo vankomicinui, kurio MSK reikšmė prieš meticilinui atsparias
S. aureus bakterijas daug mažesnė – 1,0 μM [15]. Prieš gramneigiamas bakterijas ir grybelius junginiai
1 ir 2 nebuvo aktyvūs [14]. (1) R = C6H5 (2) R = OC2H5 N S NH O S N H2 O R N H S R1 O R2 (3) R1 = Cl; F; OCH3
1 pav. Tiofeno dariniai, kurie buvo aktyvūs prieš S. aureus, S. pyogenes arba Mycobacterium padermes
Junginys 3, kurio struktūroje R1 = Cl, pasižymėjo maža MSK in vitro tyrimuose, bet nebuvo
efektyvus in vivo, priešingai nei junginiai su fluoro ar metoksi pakaitais. Tai parodo, kad nepakanka tik
in vitro tyrimų. Kai kurie iš šių junginių efektyvesni už fluorchinolonus gydant antibiotikams atsparią Mycobacterium fortuitum infekciją. Taip pat nustatytas aktyvumas prieš kitas Mycobacterium
padermes: M. avium, M. marinum, M. kansasii, M. abscessus ir M. tuberculosis [16].
Tyrimų metu nustatytas daug žadantis junginio 4 su dviem tiofeno žiedais (2 pav.) aktyvumas prieš dvi Mycobacterium padermes: M. avium (MSK ≤ 25,7 μM) ir M. maomoense (MSK 51,5 μM), kuris buvo didesnis negu izoniazido. Tokio poveikio buvo galima tikėtis, kadangi junginys turi dvi nitro grupes [17], kurios gali padidinti antibakterinį aktyvumą [18].
S O2N N N S NO2 (4) S N H2 NH2 R NH O N CH3 O (5) R = CN (6) R = COOC2H5
13
Du tiofeno dariniai 5 ir 6, besiskiriantys tik vienu pakaitu, pasižymėjo antimikrobiniu aktyvumu prieš Bacillus cereus (B. cereus), Bacillus subtilis (B. subtilis) ir Candida albicans (C. albicans). Junginio su karboksirūgšties etilo esterio grupe 6 aktyvumas kiek didesnis – MSK prieš skirtingus mikroorganizmus buvo nuo 55 iki 111 μM [19]. Lyginant šias koncentracijas su kai kurių vaistų nuo grybelio MSK, matyti, kad toks aktyvumas yra nedidelis. Pavyzdžiui, vorikonazolo MSK skirtingoms C. albicans padermėms yra 0,03-11,5 μM, kaspofungino – 0,03-0,05 μM, anidulafungino – 0,003 μM, o posakonazolo – mažesnė nei 0,001 μM [20].
Keli tiofeno žiedą turintys junginiai 7 buvo labai aktyvūs prieš grybelius Aspergillus
fumigatus, Geotrichum candidum, C. albicans, Syncephalastrum racemosum (3 pav.). Taip pat stipriai
slopino gramteigiamų bakterijų S. aureus ir B. subtilis bei gramneigiamų bakterijų Pseudomonas
aeruginosa (P. aeruginosa) bei Escherichia coli (E. coli) augimą, lyginant su penicilinu G ir
streptomicinu [21]. N N C H3 CH3 NH O S R R1 (7) S CH3 O C H3 O R2 (8) R2 = H; Cl; CH3; OCH3 NH S CH3 O C H3 O S C H3 NH O CH3 R3 R3 (9)
3 pav. Junginių, veikiančių įvairius mikroorganizmus, struktūrinės formulės
Įvertinus kitų tiofeno junginių 8, 9 aktyvumą prieš gramneigiamas bakterijas (E. coli ir
P. aeruginosa), nustatyta, kad jų MSK reikšmės buvo iki 15 μM, t. y. veikė vienodai arba stipriau nei
azitromicinas. Aktyviausi buvo junginiai 8, kurių R2 = H/Cl/CH3/OCH3 [22].
Kito tyrimo metu nustatyta, kad junginiai su 2,5-dichlortienilo grupe 10 (4 pav.) antimikrobiškai veikė bakterijas E. coli, S. aureus, P. aeruginosa, Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae) bei grybelius Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, Penicillium marneffei ir
14 N S R S Cl Cl (10) S CN NH2 R1 O S (11) R1 = 4-BrC6H4; 4-CH3OC6H4
4 pav. Junginiai, veikiantys antimikrobiškai kelias bakterijų ir grybelių rūšis
Antibakteriniu ir priešgrybeliniu aktyvumu pasižymėjo ir junginiai, turintys 4 pakaitus prie tiofeno žiedo 11. Jie slopino E. coli, Staphylococcus albus ir C. albicans augimą [7].
5 paveiksle pavaizduotas 4-fluorbenzoinės rūgšties darinys su tiofeno žiedu 12, kurio struktūra itin panaši į kai kuriuos šiame darbe tirtus junginius. Jis pasižymėjo antituberkulioziniu aktyvumu in vitro 21,3 μM koncentracijos [24].
R1 R2 NH N O S NO2 (13) NH N F O S NO2 (12)
5 pav. Nitrotiofeno dariniai, veikiantys antimikrobiškai S. aureus bei M. tuberculosis
Nustatytas kitų 5-nitrotiofeno junginių 13 antimikrobinis aktyvumas prieš vaistams atsparias
S. aureus padermes. Didžiausiu aktyvumu pasižymėjo junginiai, kurių R1 = R2 = Cl ir R1 = COCH3,
R2 = H – jų MSK mažesnės nei 3,3 μM [25]. Kuomet 13 R1 = OCH3, R2 = H, junginys 6,6 μM
koncentracija veikė M. tuberculosis [24]. Ne tik šis, bet ir kai kurie kiti aprašyti tiofeno dariniai slopino M. tuberculosis augimą, todėl verta palyginti jų ir tuberkuliozės gydymui vartojamų vaistų MSK. Izoniazidas skirtingas šios bakterijos padermes veikia 1,5-7,3 μM koncentracijomis, rifampicino MSK lygi 1,2 μM, etambutolio – nuo 24,5 iki 48,9 μM, o streptomicino – 3,4-17,2 μM [26]. Taigi, tiofeno junginys 13 su metoksi pakaitu antituberkulioziškai veikia panašiai kaip izoniazidas ar streptomicinas ir yra aktyvesnis už etambutolį, nes pastarojo MSK žymiai didesnė.
15
leidžia daryti prielaidą, kad kai kurie iš jų gali būti aktyvesni už rinkoje esančius antimikrobinius vaistus.
1.3. Pasirinktų mikroorganizmų savybių apžvalga
Antimikrobiniams tyrimams pasirinktos 4 gramneigiamos, 5 gramteigiamos bakterijos ir grybelis. Šie mikroorganizmai skiriasi tarpusavyje ne tik sandara, bet ir patogeniškumu.
Staphylococcus genties bakterijos – gramteigiami kokai, kurių du atstovai pasirinkti
tyrimams. Virulentiškiausias yra S. aureus, kurio sukeliamos infekcijos itin dažnos ir varijuoja nuo apsinuodijimo maistu simptomų ar vietinių odos infekcijų [27] iki gyvybei pavojingų būklių – pneumonijos, sepsio ir kitų vidaus organų pažeidimo. Tuo tarpu S. epidermidis, randamas ant sveikų individų odos ir gleivinių, gali sukelti infekcijas, susijusias su implantais ir kateteriais [28].
Enterococcus faecalis – gramteigiamas streptokokas, laikomas normalia žarnyno flora [27],
bet gali tapti oportunistiniu patogenu, sukeliančiu bakteriemiją ir endokarditą [29].
Pasirinkti net trys atstovai iš Enterobacteriaceae šeimos, kuriai priklauso gramneigiami lazdelių formos fakultatyviniai anaerobai, randami žmonių ir gyvūnų virškinimo trakte [27]. E. coli yra oportunistinis ligų sukėlėjas, galintis tapti sepsio, meningito, viduriavimo bei šlapimo organų sistemos infekcijų priežastimi. Tos pačios šeimos, Proteus genties, mikrobai sukelia kvėpavimo sistemos, akių, ausų, odos, nudegimų ir žaizdų infekcijas, o konkrečiai P. mirabilis dažniausiai infekuoja šlapimo šalinimo sistemos organus [30]. Dar vienas Enterobacteriaceae atstovas K. pneumoniae taip pat yra oportunistinis patogenas, sukeliantis hospitalines infekcijas ir atsparus daugeliui antibiotikų [31].
Pseudomonas genčiai priklauso gramneigiami, judrūs, aerobiniai mikroorganizmai, o
patogeniškiausias iš jų – P. aeruginosa, kurio mažais kiekiais yra ant odos ir žarnyne. Šiai bakterijai patekus į žaizdas ir nudegimus, atsiranda pūlių, o kitos infekcinės ligos (šlapimo, kvėpavimo sistemos, akių, kraujotakos) [27] yra pavojingos gyvybei ir sunkiai gydomos dėl didelio atsparumo antimikrobinėms medžiagoms [32].
Taip pat pasirinktos dvi sporinės gramteigiamos lazdelių formos aerobinės Bacillus genties bakterijos, dažniausiai randamos dirvoje, vandenyje bei ore [27]. B. cereus dažniausiai siejama su apsinuodijimu maistu (vėmimu, viduriavimu), bet gali sukelti ir nemažai kitų pavojingų būklių, tokių kaip sepsis ar nervų sistemos infekcijos [33].
16
Žinant bent pagrindines bakterijų ir grybelių savybes, galima kryptinga antimikrobinių medžiagų paieška. Taip pat šie duomenys padeda suvokti atliktų tyrimų rezultatus ir juos teisingai interpretuoti.
1.4. Naujų vaistų nuo vėžio poreikis
Nors onkologinių ligų prevencija, diagnozavimas ir gydymas nuolat tobulėja, jų paplitimas bei kaštai išlieka dideli [35]. JAV Nacionalinio sveikatos statistikos centro duomenimis, 2014 m. šalyje buvo daugiau nei 1,6 mln. naujų vėžinių susirgimų atvejų ir apie 500 tūkst. mirčių nuo vėžio [36]. Tuo tarpu Europoje 2008 m. užfiksuota 3,45 mln. naujų onkologinių susirgimų atvejų ir 1,75 mln. mirčių nuo šios ligos [37], o viso pasaulio mastu 2012 m. mirė 8,2 mln. onkologinių ligonių [38].
Priklausomai nuo auglio dydžio, išplitimo bei kitų individualių faktorių, yra kelios vėžio gydymo alternatyvos: chemoterapija, radioterapija, chirurgija arba paliatyvus gydymas [39], tačiau visi šie metodai turi didelių trūkumų. Dabartiniai chemoterapijai skirti vaistai sukelia daug nepageidaujamų poveikių – alopeciją [40], virškinimo trakto [41], širdies ir kraujagyslių sistemos sutrikimus [42], kurie neigiamai veikia onkologinių ligonių gyvenimo kokybę. Be to, gydymo galimybės mažėja, kuomet formuojasi chemoterapijai atsparios vėžinės ląstelės. Toks įgytas atsparumas gali atsirasti keliais mechanizmais, kurie susiję su ląstelės ciklo pokyčiais, sutrikusiu signalų perdavimu, sumažėjusia apoptoze, padidėjusiu vaistų metabolizmu ir kt. [43]. Dėl to mažėja chemoterapijos taikymo galimybės.
Ir demografiniai, ir tyrimų duomenys patvirtina naujų priešvėžinių medžiagų poreikį.
1.5. Tiofeno darinių priešvėžinis aktyvumas
Nustatyta, kad tiofeno dariniai pasižymi ne tik antimikrobiniu aktyvumu, bet ir slopina vėžinių ląstelių augimą [7].
17 N NH S NH O O CF3 (14)
6 pav. Tiofeno darinio OSI-930 struktūrinė formulė
Tiofeno darinys 15 (7 pav.) pasižymėjo beveik tokiu pačiu aktyvumu kaip daunorubicinas prieš hepatoceliulinio HEPG-2 vėžio ląsteles ir buvo aktyvesnis prieš krūties adenokarcinomą MCF7 – atitinkamai jo koncentracija, sukelianti 50 proc. ląstelių biologinių ar biocheminių funkcijų netekimą (IC50) 5,1 ir 1,07 µM [45].
S C H3 N CN O C2H5 O O H5C2 (15) NH S R1 CH3 O R R2 (16)
7 pav. Kiti tiofeno dariniai, slopinantys vėžinių ląstelių augimą
Junginių serija 16, tirta su keliomis ląstelių linijomis, buvo labai aktyvi prieš žmogaus plaučių karcinomos A549 ląsteles (IC50 nuo 0,01 iki 2 µM) [46].
Nėra daug literatūros duomenų apie tiofeno darinių priešvėžinį aktyvumą, tačiau šis faktas tik įrodo mūsų darbe atliktų tyrimų aktualumą.
1.6. Pasirinktų vėžinių ląstelių savybių apžvalga
18
2012 m. duomenimis, plaučių ir krūties vėžys yra tarp trijų dažniausių vėžio formų Europoje pagal sergamumą bei mirštamumą [37]. Plaučių vėžys gali būti dviejų pagrindinių potipių – smulkialąstelinis ir nesmulkialąstelinis, o pastarasis dar skirstomas į adenokarcinomą (A549), plokščiųjų ląstelių ir stambiųjų ląstelių karcinomą. 75 proc. plaučių vėžio atvejų yra nesmulkialąstelinis vėžys, po kurio diagnozės prognozuojamas išgyvenamumas siekia tik 5 metus, o dažniausia jo forma – būtent A549 [47].
Viena iš priežasčių, kodėl sunku išgydyti krūties vėžį, yra jo ląstelių heterogeniškumas. Išskirta daugiau nei 50 krūties vėžio ląstelių linijų, iš kurių viena – MCF7 [48]. Šios ląstelės labai dažnai naudojamos priešvėžiniuose tyrimuose, kadangi yra atsparios daugeliui vaistų [49].
Melanoma vadinamas piktybinis auglys, susidarantis iš melanocitų ir dažniausiai išsivystantis odoje, o kartais pasitaikantis akyje arba gleivinėse. Liga pavojinga dėl savybės greitai metastazuoti, net ir iš nedidelių navikinių darinių. Apie 90 proc. visų mirčių dėl odos navikų sudaro būtent melanoma [50]. Šiame darbe tirta IGR39 ląstelių linija yra pirminės odoje randamos melanomos ląstelės [51].
Dėl minėtų savybių nutarėme pasirinkti šias tris ląstelių linijas priešvėžiniams tiofeno darinių tyrimams.
1.7. Farmakokinetinių savybių ir toksiškumo nustatymo svarba
Farmakokinetinių savybių nustatymas in silico dar vaisto kūrimo pradžioje yra vienas iš svarbiausių žingsnių, padedančių vykdyti kryptingą medžiagų atranką ir užtikrinti saugų bei efektyvų dozavimą [52].
Dažnai apibūdinant junginių biologinio pasisavinimo galimybes, nustatoma, ar jie atitinka Lipinskio taisyklę. Ji teigia, kad junginys bus gerai pasisavinamas ir lengvai pereinantis pro membranas, jeigu:
Vandenilio donorų grupių molekulėje bus ne daugiau kaip 5; Vandenilio akceptorių grupių bus ne daugiau kaip 10;
Junginio molekulinė masė ne didesnė kaip 500;
Pasiskirstymo koeficiento tarp vandens ir 1-oktanolio logaritmo (LogP) reikšmė neviršys 5 [53]. Vaistinių medžiagų jungimasis su kraujo plazmos baltymais aktualus todėl, kad nuo laisvos frakcijos priklauso vaisto efektyvumas ir galimas toksinis poveikis. Jeigu su baltymais nesusijungusi labai maža vaisto dalis, net ir maži baltymų kiekio svyravimai labai keičia vaisto poveikį [54]. Todėl naudinga jau ankstyvose junginių tyrimų stadijose prognozuoti šį rodiklį.
19
žmogaus organizmui. Tai galima atlikti pasitelkus Hodge ir Sterner skalę (1 lentelė), kurioje pateikiamos tikėtinos mirtinos dozės žmogui, atitinkančios tam tikras medžiagos dozes, sukeliančias 50 proc. laboratorinių žiurkių mirtį (LD50) [55].
1 lentelė. Hodge ir Sterner toksiškumo skalė [55]
Toksiškumo balas Apibūdinimas LD50 žiurkėms per os
(mg/kg)
Tikėtina mirtina dozė žmogui
1 Ypatingai toksiškas <1 1 kruopelė
2 Labai toksiškas 1-50 1 arbatinis šaukštelis
3 Vidutiniškai toksiškas 50-500 30 g
4 Mažai toksiškas 500-5000 250 g
5 Praktiškai netoksiškas 5000-15000 1000 g
6 Santykinai nežalingas >15000 >1000 g
20
2. TYRIMO METODIKA IR METODAI
2.1. Tyrimo objektas
Tyrimo objektas – tiofeno dariniai (8 ir 9 pav.), susintetinti dr. Jono Šarlausko (Vilniaus universiteto Biochemijos institutas).
S NO2 N NH R O S NH O N S NO2 SJV-1 NH O N S NO2 SJV-2 NH NH O N S NO2 SJV-3 NH O N S NO2 F SJV-4 NH O N S NO2 F SJV-5 NH O N S NO2 NH2 SJV-6 N H2 NH O N S NO2 SJV-7 Cl O NH N S NO2 JST-4 S Br Br O NH N S NO2 JST-6 S Br O NH N S NO2 JST-7 O NH N S NO2 O2N JST-8 O NH N S O2N NO2 JST-9
21 S R3 R2 R1 O CF3 NH O S N S O C H3 NH O S Br S Br O O N Br N NH O S Br Br JST-1 JST-2 JST-3 JST-5 *HCl
9 pav. Kitų tiofeno darinių struktūrinės formulės
Šių junginių struktūra patvirtinta infraraudonųjų spindulių (IR), branduolių magnetinio rezonanso (BMR) spektroskopijos metodais, o grynumas, kuris buvo 95-99 proc., įvertintas efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodu.
2.2. Reagentai, priemonės ir aparatūra
Tyrimų metu naudoti šie reagentai: 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromidas (MTT, Sigma-Aldrich, ≥97 proc.); Antibiotikų tirpalas (10000 vienetų/ml penicilino ir 10 mg/ml streptomicino, Gibco); Dimetilsulfoksidas (DMSO, Sigma-Aldrich Co, ≥99,5 proc.);
Dulbecc'o modifikuota Eagle ląstelių mitybinė terpė (DMEM, Gibco); Fetalinis veršiukų serumas (FBS, Gibco);
Fosfatinis druskų tirpalas, pH 7,4 (PBS, Gibco); Miulerio-Hintono agaras (FLUKA);
Sabūro agaras (FLUKA);
22
Tyrimams naudotos aparatūros sąrašas:
Automatinė mėgintuvėlių purtyklė (IKA Lab Dancer, GRIDA);
BMR spektrometras (Varian Unity Inova 300, 300 MHz, d6-DMSO/TMS); Densitometras (DEN-1 McFarland, BIOSAN);
ESC chromatografas (kolonėlė „Silachrom AP-18”, gradientinis metodas, sistema acetonitrilas (nuo 100 iki 40 proc.)/vanduo);
IR spektrometras (Perkin Elmer Spectrum GX FT-IR); Laminarinė spinta (Telstar AV-100);
Spektrofotometras (Multiskan GO 1.00.40, 560 nm); Termokamera (Heracell™ 150i, Thermo Scientific).
Antimikrobinio aktyvumo tyrimuose naudoti mikroorganizmai:
Staphylococcus aureus (Amerikos ląstelių kultūrų kolekcija (ATCC) 25923); Staphylococcus epidermidis (ATCC 12228);
Enterococcus faecalis (ATCC 29212); Escherichia coli (ATCC 25922); Proteus mirabilis (ATCC 12459); Klebsiella pneumoniae (ATCC 33499); Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853); Bacillus subtilis (ATCC 6633);
Bacillus cereus (ATCC 8035); Candida albicans (ATCC 60193).
Priešvėžinio aktyvumo tyrimuose naudotos vėžio ląstelių linijos: žmogaus plaučių karcinomos (A549, ATCC);
žmogaus melanomos (IGR39, ATCC);
krūties adenokarcinomos (MCF7, ATCC) ląstelės.
2.3. Antimikrobinio aktyvumo tyrimai in vitro
Bakterijos auginamos mėgintuvėliuose ant nuožulnaus Miulerio-Hintono agaro, o
C. albicans – nuožulniame Sabūro agare. Mikroorganizmai laikomi šaldytuve ir persėjami kas
23
Tyrimams pagaminami pradiniai visų tiofeno darinių tirpalai DMSO, kurių koncentracija yra 10 mg/ml. Iš jų daromi skiedimai ir paimami tokie kiekiai, kad aseptinėmis sąlygomis sumaišius su 10 ml išlydyto šilto Miulerio-Hintono agaro būtų gaunamos 50; 100; 200 ir 400 µg/ml koncentracijos. Šie tirpalai supilami į sterilias plastikines Petri lėkšteles. Didesnės nei 400 µg/ml koncentracijos nenaudojamos, kadangi jose ribotas tirtų junginių tirpumas.
Bakterijų ir grybelio suspensijos gaminamos skaidriuose stikliniuose mėgintuvėliuose. Į juos įpilamas nedidelis kiekis fiziologinio tirpalo ir į kiekvieną iš jų sterilia kilpele perkeliama dalis agare užaugintų mikroorganizmų. Trumpai pamaišoma automatine purtykle ir densitometru patikrinamas suspensijų tankis, kuris turi būti 1,5×108
ląstelių/ml.
Sustingus terpei, steriliomis kilpelėmis į Petri lėkšteles (10 pav.) sėjama po 1 μl mikroorganizmų suspensijos fiziologiniame tirpale ir lėkštelės dedamos į termokamerą, kur palaikoma 37°C temperatūra. Bakterijų augimas tikrinamas po 24 val., o grybelio – po 48 val.
10 pav. Mikrobų suspensijų sėjimo į Petri lėkštelę schema
Junginiai, kurie aktyvūs esant 50 µg/ml, toliau tiriami mažesnėmis koncentracijomis (nuo 0,1 iki 25 µg/ml). Tokiu būdu nustatomos junginių MSK – koncentracijos, kurioms esant slopinamas mikrobų augimas, o vėliau jos perskaičiuojamos į koncentracijas mikromoliais.
24
2.4. Priešvėžinio aktyvumo tyrimai in vitro
Ląstelės auginamos DMEM ląstelių mitybinėje terpėje su 10 proc. FBS ir 1 proc. antibiotikų, persėjant kas 3-4 dienas. Ląstelių persėjimui ir suspensijų gamybai naudojamas tripsino tirpalas, kuris atkabina ląsteles nuo lėkštelių dugno. Į 96 šulinėlių plokšteles pilama po 100 μl ląstelių suspensijos taip, kad viename šulinėlyje būtų 2000 ląstelių. Ląstelės 24 val. inkubuojamos 37°C temperatūroje, 5 proc. CO2 atmosferoje.
Tiriamieji junginiai tirpinami DMSO ir gaunami 20 mM koncentracijų tirpalai. Skiedžiant juos ląstelių auginimo terpe pagaminami 6 skirtingų koncentracijų tirpalai (50; 25; 12,5; 6,25; 3,125; 1,6 μM), kurie po 100 μl pilami į 96 šulinėlių plokšteles su ląstelėmis. Plokštelės laikomos toje pačioje termokameroje 72 val. Tuomet į šulinėlius pilama po 10 µl MTT 5 mg/ml tirpalo PBS ir po 2 val. skystis iš šulinėlių išpilamas. Susidarę formazano kristalai tirpinami 100 µl DMSO, o jų kiekis nustatomas spektrofotometru, matuojant absorbciją 560 nm bangos ilgyje.
Metodika sudaryta remiantis ATCC gairėmis [56]. Kiekvienas eksperimentas kartojamas du kartus. Gauti duomenys apdorojami „MS Excel 2010“ programa. Nustatomos junginių koncentracijos, slopinančios 50 proc. vėžio ląstelių augimą (GI50), apskaičiuojamas standartinis nuokrypis.
2.5. Junginių farmakokinetinių savybių ir toksiškumo įvertinimas
Tiofeno darinių farmakokinetinės savybės ir toksiškumas nagrinėjamas naudojant kompiuterinę „ACD/I-Lab“ programą, kuri pagal junginių struktūrines formules nuspėja pageidaujamus parametrus. Nustatoma, ar junginiai atitinka Lipinskio taisyklę, apskaičiuojamas jų pasiskirstymo koeficiento tarp vandens ir 1-oktanolio logaritmas (LogP), biologinis pasisavinimas (%F), jungimasis su kraujo plazmos baltymais (%PPB), pasiskirstymo tūris (VD), didžiausia
25
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1. Tiofeno darinių antimikrobinis aktyvumas
Tirtų tiofeno darinių antimikrobinį aktyvumą apibūdina MSK, kurios reikšmės pateiktos 2 lentelėje.
2 lentelė. Tiofeno darinių MSK (µM);
26
11 iš 16 tirtų tiofeno darinių veikė bent vieną iš dešimties mikroorganizmų kultūrų mažesnėmis nei 400 µM MSK. Net šeši junginiai buvo aktyvūs prieš kai kurias bakterijas mažesnėmis nei 100 µM MSK.
Lyginant su esamų antibiotikų MSK reikšmėmis, tiofeno darinių aktyvumas buvo daug mažesnis. Pavyzdžiui, tokią pačią S. aureus padermę (ATCC 25923, kuri naudota ir šiame darbe), oksacilinas veikė 0,6-1,2 µM, cefoksitinas – 4,7-9,4 µM [57], vankomicinas – 0,7 µM, o teikoplaninas – 0,3 µM koncentracijomis [58]. Šiame darbe tirto tiofeno darinio SJV-3, labiausiai veikusio S. aureus, MSK buvo 14 µM – didesnė nei esamų antibiotikų. Prieš S. epidermidis aktyviausio junginio SJV-4 MSK buvo 2 µM, o rinkoje esantys antibiotikai tą pačią padermę (ATCC 12228) veikė šiomis koncentracijomis: eritromicinas ≤0,3 µM, klindamicinas ≤0,6 µM, oksacilinas ≤0,6 µM, ciprofloksacinas ≤1,5 µM, chloramfenikolis ≤3,1 µM, gentamicinas ≤4,2 µM [59]. Taigi, kai kurių tiofeno darinių aktyvumas panašus, lyginant su dažniausiai naudojamais antibiotikais.
Junginiai SJV-2, SJV-3, SJV-4 ir SJV-6 buvo aktyvūs prieš S. aureus 14-91 µM koncentracijomis, o kartu su SJV-5 ir SJV-7 veikė ir S. epidermidis – MSK atitinkamai 14 ir 23 µM (11 pav.). Jie visi turi panašią struktūrą, kuriai būdinga nitro grupė tiofeno žiedo orto padėtyje. Kai kurios MSK šioms bakterijoms buvo tokios pačios (SJV-2 ir SJV-3), tuo tarpu SJV-4, SJV-5, SJV-6 ir SJV-7 junginiai daug labiau veikė S. epidermidis nei S. aureus – MSK reikšmės skiriasi daugiau nei 10 kartų. Įdomu tai, kad junginiai SJV-4 ir SJV-5 yra izomerai, kurie skiriasi tik fluoro pakaito padėtimi prie benzeno žiedo, bet SJV-5 nebuvo aktyvus prieš S. aureus (MSK>100 µM), vadinasi fluoro padėtis turi įtakos junginio antimikrobiniam poveikiui. Mažiausiomis koncentracijomis (MSK<10 µM) S. epidermidis augimą slopino junginiai SJV-4 ir SJV-6, savo struktūroje turintys atitinkamai fluoro arba amino grupę benzeno žiedo orto padėtyje. Mokslininkai Masunari ir Tavares tyrė panašios į SJV-4 struktūros tiofeno darinius. Jie nustatė, kad junginys, turintis po chloro pakaitą
meta ir para padėtyse benzeno žiede, ir kitas tos pačios grupės atstovas su acetilo grupe para padėtyje
veikė S. aureus mažesnėmis nei 3 μM koncentracijomis [25]. Tai parodo, kad chloro ir acetilo pakaitai benzeno žiede lemia didesnį aktyvumą prieš S. aureus nei amino grupė ar fluoras.
27
11 pav. Tiofeno dariniai, kurie veikė Staphylococcus genties bakterijas mažesnėmis nei 100 µM koncentracijomis
Sporines Bacillus genties bakterijas mažesnėmis nei 100 µM kocentracijomis veikė keturi junginiai (12 pav.). SJV-3, SJV-4 ir SJV-6 maždaug dvigubai stipriau veikė prieš B. subtilis, o SJV-7 pasižymėjo tokia pačia MSK abiems bakterijoms – 47 µM. Vėlgi izomerai SJV-4 ir SJV-5 veikė skirtingai – SJV-5 nebuvo labai aktyvus.
Junginiai, kurie veikė sporines bakterijas, struktūroje turi amino grupę, prijungtą prie amidinės molekulės dalies, benzeno žiedą, prijungtą per amino grupę, benzeno žiedą su amino grupe arba fluoru orto padėtyje. Todėl galima teigti, kad junginių aktyvumui prieš sporines bakterijas svarbi amino grupė ir orto padėties pakaitai.
28
Penki iš tirtų junginių nepasižymėjo antimikrobiniu aktyvumu prieš pasirinktus mikrobus, t. y. jų MSK buvo didesnės nei 500 µM. Nė vienas junginys neslopino P. aeruginosa ir
K. pneumoniae augimo, o bakterijų E. faecalis, E. coli, P. mirabilis ir grybelio C. albicans augimą
keli junginiai slopino didelėmis koncentracijomis – nuo 161 iki 252 µM.
Tirtų tiofeno darinių antibakterinis aktyvumas skirtingas. Labiausiai jie veikė
Staphylococcus genties ir sporinių bakterijų augimą, tačiau buvo beveik neaktyvūs prieš
gramneigiamas bakterijas ir grybelį.
3.2. Tiofeno darinių priešvėžinis aktyvumas
Priešvėžinio aktyvumo tyrimų rezultatai įvertinti apskaičiuojant GI50 (μM) ir standartinius
nuokrypius. Gauti duomenys pateikti 3 lentelėje.
3 lentelė. Tiofeno darinių GI50 (μM); GI50<5,0 μM; GI50 5,0-10,0 μM;
29
Iš 16 tirtų junginių 14 veikė bent vieną vėžio ląstelių liniją mažesnėmis nei 10 μM koncentracijomis. Keturi iš jų – JST-5, JST-8, JST-9 ir SJV-6 – pasižymėjo itin mažomis GI50 (nuo 0,2
iki 4,9 μM). Du junginiai – JST-2 ir JST-3 – buvo aktyvūs tik labai didelėmis koncentracijomis. Junginys JST-5, kurio struktūroje prie benzeno žiedo prijungtas vienas, o prie tiofeno – du bromo pakaitai, pasižymėjo didžiausiu aktyvumu prieš visas tirtas ląstelių linijas (GI50 nuo 0,2 iki
1,2 μM). Todėl galima teigti, kad priešvėžiniam jo aktyvumui reikalingi elektronų donorų pakaitai. Taip pat prieš visas ląstelių linijas buvo aktyvūs JST-4, SJV-5 ir SJV-6 (GI50 nuo 3,6 iki
9,3 μM). Jų struktūrai būdinga nitrogrupė, esanti tiofeno žiedo orto padėtyje, bei chloro, fluoro arba amino liekana, prijungta prie benzeno žiedo. Įdomu tai, kad izomerai SJV-5 ir SJV-4, kurie skiriasi tik fluoro pakaito padėtimi prie benzeno žiedo, turėjo skirtingą poveikį: SJV-4 veikė tik dvi ląstelių linijas, o prieš MCF7 dideliu aktyvumu nepasižymėjo (GI50>10 μM).
Prieš A549 ląsteles aktyviausi buvo 7 junginiai, jų GI50 svyravo nuo 1,2 iki 9,2 μM (13 pav.).
Be jau minėto JST-4, JST-5, SJV-5 ir SJV-6 poveikio, vienas junginys veikė selektyviai šioms ląstelėms. Tai JST-1, kurio struktūrai būdingas pakaitų prie tiofeno žiedo nebuvimas, trifluormetano grupė benzeno žiedo meta padėtyje ir trumpa atomų grandinė tarp dviejų ciklinių elementų. Junginys SJV-2 pagal poveikį prieš A549 ląsteles yra trečioje vietoje ir turi struktūrą, kuri būdinga didžiajai daliai tirtų junginių ir benzeno žiedą be pakaitų. O junginys SJV-4 pasižymėjo labai panašiu aktyvumu, kaip ir jo izomeras SJV-5.
Junginio SJV-6 GI50 A549 ląstelėms buvo beveik tokia pati kaip plaučių vėžiui gydyti
vartojamo vaisto cisplatinos (atitinkamai 3,6 ir 3,5 μM), kuri nustatyta Becker ir kitų mokslininkų atlikto tyrimo metu [60]. Junginys JST-5 veikė netgi stipriau nei cisplatina, jo GI50 buvo 1,2 μM.
30
IGR39 ląstelių proliferaciją mažesnėmis nei 10 μM koncentracijomis slopino visa SJV junginių grupė ir JST-4 (14 pav.). Jų visų panašumas – nitro grupė prie tiofeno žiedo, amidinė jungtis ir dviguba jungtis tarp azoto ir anglies atomų. Tačiau panašią struktūrą turi dar keturi junginiai, kurių
GI50 viršija 10 μM. Vėlgi geriausiai veikiantis tiofeno darinys yra JST-5.
14 pav. Junginiai, kurių GI50 mažesnė nei 10 μM prieš IGR39
Devyni junginiai labai slopino (GI50<10 μM) MCF7 ląstelių augimą (15 pav.). Įdomu tai, kad
stipriai veikė SJV-1 (GI50 7,2 μM), kurio vienintelio struktūroje yra du tiofeno žiedai. Tai įrodo, kad
šis struktūros elementas reikalingas priešvėžiniam aktyvumui.
Selektyviu veikimu prieš MCF7 pasižymėjo junginiai JST-6 ir JST-7, kurie turi nitro grupę tiofeno žiedo orto padėtyje ir vieną arba dvi bromo liekanas, prijungtas prie kito tiofeno žiedo. Galima teigti, kad mono- arba dibromtiofeno fragmentai šių molekulių struktūroje yra vieni iš būtinų elementų junginių poveikiui prieš MCF7 ląstelių liniją, kadangi tai vieninteliai du tiofeno dariniai, turintys šį pakaitą. Panašiai veikė ir izomerai JST-8 bei JST-9, jų GI50 dar mažesnės nei prieš tai aptartų junginių
(2,0 ir 4,9 μM). Pastarųjų selektyvumą galimai lemia jų vienintelių struktūroje esanti prie benzeno žiedo prijungta nitro grupė.
Christodoulou ir kiti mokslininkai nustatė, kad krūties vėžiui gydyti vartojamo vaisto tamoksifeno GI50 šiai ląstelių linijai buvo 12 μM [61]. Vadinasi, net devyni tirti tiofeno dariniai buvo
31
15 pav. Junginiai, kurie slopino ląstelių MCF7 augimą mažesnėmis nei 10 μM koncentracijomis
Palyginus tiofeno darinių ir esamų vaistų nuo vėžio aktyvumą, matome, kad šie junginiai galėtų būti chemoterapiniai preparatai, kadangi jų GI50 vertės panašios ar net mažesnės.
3.3. Tiofeno darinių struktūros – aktyvumo ryšys
Antimikrobiškai veikusių junginių bendros struktūrinės formulės pavaizduotos 16 paveiksle. Šią struktūrą turintys junginiai veikė Staphylococcus ir Bacillus genčių bakterijas.
Antimikrobiniam junginių aktyvumui būtina nitro grupė prie tiofeno žiedo. Kad junginys būtų aktyvus prieš S. epidermidis, jis turėtų būti be pakaitų prieš benzeno žiedo, su amino grupe orto padėtyje arba su fluoro pakaitu orto ar meta padėtyje A cheminėje formulėje ir su laisva amino grupe arba prie jos prijungtu fenilo pakaitu B formulėje. Junginiai, turintys fluoro pakaitą arba amino grupę
orto padėtyje A struktūroje, taip pat abu B struktūros variantai slopino sporinių bakterijų augimą.
32 S NO2 N NH O R2 R1 R S NO2 N NH NH O R3 CF 3 NH O S Br N NH O S Br Br (A) (B) (C) (D)
16 pav. Aktyviausių junginių struktūrinės formulės
Didžiausiu priešvėžiniu aktyvumu pasižymėjo A struktūros junginiai, turintys nitro grupę
meta arba para padėtyje ir junginys su amino grupe orto padėtyje. Mažiausiomis koncentracijomis
prieš visas tris ląstelių linijas veikė C struktūros junginys, vadinasi, plataus priešvėžinio aktyvumo junginiui būdingi bromo pakaitai.
Selektyvumą MCF7 ląstelėms lemia nitro grupės prie benzeno žiedo buvimas arba bromo pakaitų turintis ciklopentadieno žiedas vietoje benzeno. Tuo tarpu A549 ląsteles atrankiai veikė mažesnės struktūros junginys D, kuriam būdingas trifluormetano pakaitas. Pastebėta, kad prieš IGR39 aktyviausi junginiai turi B struktūros variantus.
Tiek antimikrobinis, tiek priešvėžinis aktyvumas būdingas nitrotiofeno grupę turintiems junginiams. Jų aktyvumui ir atrankumui turi įtakos fluoro, bromo pakaitai, amino, nitro grupės bei jų padėtis prie penkianario ar šešianario anglies atomų ciklo.
3.4. Tiofeno darinių farmakokinetinės savybės
17 paveiksle pavaizduotos tirtų tiofeno darinių biologinio pasisavinimo reikšmių tikimybės procentais. Visų junginių didesnio nei 30 proc. %F tikimybės buvo didesnės nei 0,5, išskyrus JST-3. Pastarojo junginio reikšmė 0,35, vadinasi jo %F mažesnis nei 30 proc. JST-3 nepasižymėjo nei antimikrobinėmis, nei priešvėžinėmis savybėmis. JST-1, JST-4, SJV-2, SJV-4, SJV-6 ir SJV-7 junginių prognozuojamas %F yra daugiau nei 70 proc. JST-1 ir JST-4 neveikė antimikrobiškai, tačiau pasižymėjo dideliu priešvėžiniu aktyvumu (GI50<10 μM). SJV-2, SJV-4, SJV-6 ir SJV-7 veikė
33
išskyrus JST-2, veikė bent vieną vėžio ląstelių liniją mažesnėmis nei 10 μM koncentracijomis. Tuo tarpu antimikrobinėmis savybėmis iš jų pasižymėjo tik SJV-3 ir SJV-5.
17 pav. Tiofeno darinių %F tikimybės
Lipinskio taisyklę atitinka beveik visi tirti junginiai (4 lentelė). JST-5 neatitinka vieno kriterijaus – šios struktūros junginio LogP yra 5,3, tačiau, kaip jau minėta, JST-5 prognozuojamas vidutinis %F, t. y. 30-70 proc.
Prognozuojamas tirtų tiofeno darinių jungimasis su kraujo plazmos baltymais svyruoja nuo 80,95 iki 98,62 proc., o laisvoji frakcija atitinkamai 1,38-19,05 proc. Plazmos baltymų pokyčiai turėtų mažiausią įtaką junginiams JST-3 ir SJV-7, kadangi jų %PPB nesiekia 90 proc. JST-3 nepasižymėjo nei priešvėžiniu, nei antimikrobiniu aktyvumu, o SJV-7 veikė kai kurias bakterijas ir IGR39 ląstelių liniją.
Didžiausias pasiskirstymo tūris prognozuojamas junginiams JST-3 ir JST-5 (atitinkamai VD
34
4 lentelė.Tiofeno darinių fizikocheminės ir farmakokinetinės savybės
Junginiai Molinė masė H donorų skaičius
H akceptorių skaičius LogP %PPB, proc. VD, l/kg JST-1 217,19 1 2 3,81 98,09 2,07 JST-2 397,32 1 4 4,63 98,62 2,84 JST-3 318,23 0 3 3,68 84,88 4,75 JST-4 309,73 1 6 3,53 97,07 2,18 JST-5 466,98 1 3 5,3 97,74 3,68 JST-6 439,10 1 6 4,34 98,05 2,98 JST-7 360,21 1 6 3,66 97,18 2,57 JST-8 320,29 1 9 3,12 97,61 2,15 JST-9 320,29 1 9 3,12 97,61 2,1 SJV-1 281,31 1 6 3,2 96,41 2,12 SJV-2 275,29 1 6 3,21 95,83 2,07 SJV-3 290,3 2 7 3,2 96,73 2,2 SJV-4 293,28 1 6 3,13 94,12 2,05 SJV-5 293,28 1 6 3,13 94,12 2,21 SJV-6 290,3 3 7 2,64 95,81 1,83 SJV-7 214,2 3 7 0,92 80,95 1,37
Aktyviausi antimikrobiniai junginiai (SJV-2-7) galimai turi vidutinį (30-70 proc.) arba gerą (>70 proc.) biologinį pasisavinimą, yra linkę didžiąja dalimi jungtis su kraujo plazmos baltymais (išskyrus SJV-7) ir turi vidutinį pasiskirstymo tūrį. Keturi aktyviausi priešvėžiniai junginiai JST-5, JST-8, JST-9 ir SJV-6 (GI50 < 5 μM) turėtų būti vidutiniškai pasisavinami (30-70 proc.), išskyrus
junginį SJV-6 (>70 proc.). Taip pat turėtų pasižymėti nuo mažo iki didelio VD ir būti didžiąja dalimi
(>95 proc.) susijungę su plazmos baltymais.
35
3.5. Tiofeno darinių toksiškumas
Pagal Hodge ir Sterner skalę, ypatingai ir labai toksiškų tiofeno darinių, kurių LD50 būtų iki
50 mg/kg, neturėtų būti. SJV-4 ir SJV-5 gali būti vidutiniškai toksiški, kadangi prognozuojama jų LD50
yra 400 mg/kg (18 pav.). Abu šie junginiai pasižymėjo priešvėžiniu ir antimikrobiniu aktyvumu. Visi likę tiofeno dariniai patenka į mažai toksiškų junginių intervalą, jų LD50 turėtų būti 510-1900 mg/kg.
18 pav. Tiofeno darinių LD50 žiurkėms po vienkartinės dozės per os
36
19 pav. Tiofeno darinių numatoma MRDD
Didžiausiomis MRDD reikšmėmis pasižymėjo junginiai JST-1, JST-2, JST-5 ir SJV-7 – atitinkamai 19,33; 22,75; 15,42 ir 14,79 mg/kg/d. Iš jų tik SJV-7 veikė antimikrobiškai, o prieš vėžines ląsteles buvo aktyvūs JST-1; JST-5 ir SJV-7. Dozuojant šias medžiagas, kiltų mažiausia toksiškumo tikimybė.
Prognozuojamas tirtų tiofeno darinių toksiškumas yra mažas arba vidutinis, todėl šie junginiai galėtų būti perspektyvūs kaip vaistinės medžiagos. Šiuos preliminarius duomenis (LD50, MRDD ir kt.)
naudinga žinoti tolimesniuose junginių vystymo etapuose.
3.6. Perspektyviausi tiofeno dariniai
Apibendrinus in vitro tyrimų rezultatus ir in silico gautus duomenis, galima teigti, kad perspektyviausi tiofeno dariniai yra JST-4, SJV-5 ir SJV-6, kurie turi nitrotiofeno grupę ir atitinkamai chlorfenilo, fluorfenilo arba aminofenilo pakaitą prie amidinės jungties, bei JST-5, kuris turi bromo pakaitus prie benzeno ir tiofeno žiedo (20 pav.). Visi šie junginiai labai aktyvūs prieš visas tris vėžio ląstelių linijas (GI50 nuo 0,2 iki 9,3 μM) ir turėtų būti gerai pasisavinami (>30 proc.) bei vidutiniškai
toksiški. SJV-6 taip pat aktyvus prieš Staphylococcus ir Bacillus genčių bakterijas, o SJV-5 veikė selektyviai prieš S. epidermidis (MSK 14 μM).
37
struktūroje turintys nitrotiofeno grupę ir besiskiriantys nitro grupės padėtimi prie benzeno žiedo, yra perspektyvūs dėl savo selektyvaus poveikio krūties vėžio ląstelėms (GI50 atitinkamai 2,0 ir 4,9 μM).
Cl
O
NH
N
S
NO
2 JST-4Br
N
NH
O
S
Br
Br
JST-5O
NHN
S
NO
2O
2N
JST-8O
NHN
S
NO
2O
2N
JST-9NH
O
N
S
NO
2F
SJV-4NH
O
N
S
NO
2F
SJV-5NH
O
N
S
NO
2NH
2 SJV-638
4. IŠVADOS
1. Tiofeno dariniai pasižymi skirtingu antibakteriniu aktyvumu. Labiausiai jie aktyvūs prieš
Staphylococcus genties ir sporines bakterijas, beveik neveikia gramneigiamų bakterijų ir grybelio Candida albicans.
2. Dauguma tiofeno darinių slopina A549, IGR39 arba MCF7 vėžio ląstelių proliferaciją.
3. Antimikrobiniam ir priešvėžiniam tiofeno darinių aktyvumui svarbi prie heterociklo esanti nitro grupė ir prie amidinės jungties esantis fenilo, fluorfenilo arba nitrofenilo pakaitas. Piešvėžinį aktyvumą taip pat padidina bromo pakaitas prie tiofeno ir benzeno.
4. Beveik visi tirti tiofeno dariniai atitinka Lipinskio taisyklę, yra vidutiniškai arba gerai pasisavinami
per os, visi stipriai jungiasi su kraujo plazmos baltymais ir turėtų būti mažai ar vidutiniškai toksiški.
39
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS
Remiantis literatūros analize ir eksperimentų metu gautais rezultatais, rekomenduotume toliau tirti tiofeno darinius, kaip perspektyvius antimikrobinius bei priešvėžinius junginius.
Būtų naudinga atlikti daugiau ir platesnių tyrimų su aktyviausiais junginiais in vitro, ypač pritaikant skirtingas metodikas, kurios patvirtintų esamus rezultatus. Taip pat verta išnagrinėti daugiau farmakokinetinių savybių in silico, pvz., gebėjimą pereiti per hematoencefalinį barjerą, pasišalinimo iš organizmo ypatumus ir pan.
40
6. LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Lozano R, Naghavi M, Foreman K, Lim S, Shibuya K, Aboyans V, et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet [Internet]. 2012 Dec 15 [cited 2014 Jul
10];380(9859):2095–128. Available from:
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0140673612617280
2. Grigoryan L, Haaijer-Ruskamp FM, Burgerhof JGM, Mechtler R, Deschepper R, Tambic-Andrasevic A, et al. Self-medication with antimicrobial drugs in Europe. Emerg Infect Dis [Internet]. 2006;12(3):452–9. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3291450/pdf/05-0992.pdf
3. Shi T, De-cai D, Yan-cai S, Shen A, Zhang S, Lin-lin L, et al. Rational Use of Antibiotics and Establishment of Implementing Regulations on Three Types of Clean Operations in Perioperative Period. Chinese J Nosocomiology [Internet]. 2009; Available from: http://en.cnki.com.cn/Article_en/CJFDTOTAL-ZHYY200912042.htm
4. Kanavos P. The rising burden of cancer in the developing world. Ann Oncol [Internet].
2006;17(8):15–23. Available from:
http://annonc.oxfordjournals.org/content/17/suppl_8/viii15.full.pdf+html
5. Ferlay J, Autier P, Boniol M, Heanue M, Colombet M, Boyle P. Estimates of the cancer incidence and mortality in Europe in 2006. Ann Oncol. 2007;18(3):581–92.
6. Shaaban MR, Saleh TS, Farag AM. Synthesis and antimicrobial evaluation of new thiophene and 1,3,4-thiadiazole derivatives. Heterocycles [Internet]. Elsevier; 2009 [cited 2015 May 10];78(1):151–9. Available from: http://cat.inist.fr/?aModele=afficheN&cpsidt=21125038
7. Darwish ES. Facile Synthesis of Heterocycles via 2-Picolinium Bromide and Antimicrobial Activities of the Products. Molecules [Internet]. 2008 May 1 [cited 2014 Jun 4];13(5):1066–78. Available from: http://www.mdpi.com/1420-3049/13/5/1066/
8. Chandra R, Kung M-P, Kung HF. Design, synthesis, and structure-activity relationship of novel thiophene derivatives for beta-amyloid plaque imaging. Bioorg Med Chem Lett [Internet]. 2006 Mar 1
[cited 2015 May 10];16(5):1350–2. Available from:
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960894X05014769
41
10. Kaplancikli ZA, Turan-Zitouni G, Ozdemir A, Revial G. New triazole and triazolothiadiazine derivatives as possible antimicrobial agents. Eur J Med Chem [Internet]. 2008 Jan [cited 2015 May 6];43(1):155–9. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0223523407001547 11. Shah PM. The need for new therapeutic agents: what is in the pipeline? Clin Microbiol Infect [Internet]. Blackwell Publishing Ltd; 2005 May 1 [cited 2015 May 6];11(s3):36–42. Available from: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1469-0691.2005.01141.x/full
12. Berzanskyte A, Valinteliene R, Haaijer-Ruskamp F, Gurevicius R, Grigoryan L. Self-Medication With Antibiotics in Lithuania. Int J Occup Med Environ Health [Internet]. 2006 Jan 1 [cited 2014 Mar 18];19(4):246–53. Available from: http://www.degruyter.com/view/j/ijmh.2006.19.issue-4/v10001-006-0030-9/v10001-006-0030-9.xml
13. Falagas ME, Grammatikos AP, Michalopoulos A. Potential of old-generation antibiotics to address current need for new antibiotics. Expert Rev Anti Infect Ther [Internet]. Informa HealthcareLondon; 2008 Oct 10 [cited 2015 May 6];6(5):593–600. Available from: http://informahealthcare.com/doi/abs/10.1586/14787210.6.5.593#.VUprHlU3vHE.mendeley
14. Bondock S, Fadaly W, Metwally M a. Synthesis and antimicrobial activity of some new thiazole, thiophene and pyrazole derivatives containing benzothiazole moiety. Eur J Med Chem [Internet]. Elsevier Masson SAS; 2010 Sep [cited 2014 Mar 18];45(9):3692–701. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20605657
15. Musta AC, Riederer K, Shemes S, Chase P, Jose J, Johnson LB, et al. Vancomycin MIC plus heteroresistance and outcome of methicillin-resistant Staphylococcus aureus bacteremia: Trends over 11 years. J Clin Microbiol [Internet]. 2009;47(6):1640–4. Available from: http://jcm.asm.org/content/47/6/1640.full.pdf+html
16. Kashyap VK, Gupta RK, Shrivastava R, Srivastava BS, Srivastava R, Parai MK, et al. In vivo activity of thiophene-containing trisubstituted methanes against acute and persistent infection of non-tubercular Mycobacterium fortuitum in a murine infection model. J Antimicrob Chemother [Internet].
2012 May [cited 2014 Mar 18];67(5):1188–97. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22311937
17. Rando DG, Doriguetto a C, Tomich de Paula da Silva CH, Ellena J, Sato DN, Leite CQF, et al. A duplicated nitrotienyl derivative with antimycobacterial activity: synthesis, X-ray crystallography, biological and mutagenic activity tests. Eur J Med Chem [Internet]. 2006 Oct [cited 2014 Mar 18];41(10):1196–200. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16828526
42
19. Mohareb RM. The Reaction of Cyanoacetic Acid Hydrazide with 2-Acetylfuran: Synthesis of Coumarin, Pyridine, Thiophene and Thiazole Derivatives with Potential Antimicrobial Activities. Sci Pharm [Internet]. 2009 [cited 2014 Jun 3];77(2):355–66. Available from: http://www.scipharm.at/default.asp?id=384&lid=2
20. Katragkou A, Chatzimoschou A, Simitsopoulou M, Dalakiouridou M, Diza-Mataftsi E, Tsantali C, et al. Differential activities of newer antifungal agents against Candida albicans and Candida parapsilosis biofilms. Antimicrob Agents Chemother [Internet]. 2008;52(1):357–60. Available from: http://aac.asm.org/content/52/1/357.full.pdf+html
21. Aly HM, Saleh NM, Elhady HA. Design and synthesis of some new thiophene , thienopyrimidine and thienothiadiazine derivatives of antipyrine as potential antimicrobial agents. Eur J Med Chem [Internet]. Elsevier Masson SAS; 2011;46(9):4566–72. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.ejmech.2011.07.035
22. Sable PN, Ganguly S, Chaudhari PD. An efficient one-pot three-component synthesis and antimicrobial evaluation of tetra substituted thiophene derivatives. Chinese Chem Lett [Internet]. Chinese Chemical Society; 2014 Apr [cited 2014 Jun 3];1:3–7. Available from: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1001841714001466
23. Sarojini BK, Krishna BG, Darshanraj CG, Bharath BR, Manjunatha H. Synthesis, characterization, in vitro and molecular docking studies of new 2,5-dichloro thienyl substituted thiazole derivatives for antimicrobial properties. Eur J Med Chem [Internet]. Elsevier Masson SAS; 2010 Aug [cited 2014 Jun 4];45(8):3490–6. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20451305
24. Rollas S, Küçükgüzel SG. Biological activities of hydrazone derivatives. Molecules [Internet].
2007 Jan;12(8):1910–39. Available from:
http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=3135049&tool=pmcentrez&rendertype=ab stract
25. Masunari A, Tavares LC. A new class of nifuroxazide analogues: synthesis of 5-nitrothiophene derivatives with antimicrobial activity against multidrug-resistant Staphylococcus aureus. Bioorg Med Chem [Internet]. 2007 Jun 15 [cited 2014 Jun 4];15(12):4229–36. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0968089607002684
26. Lee J, Armstrong DT, Ssengooba W, Park JA, Yu Y, Mumbowa F, et al. Sensititre MYCOTB MIC plate for testing mycobacterium tuberculosis susceptibility to first-And second-Line drugs. Antimicrob
Agents Chemother [Internet]. 2014;58(1):11–8. Available from:
http://www.researchgate.net/profile/Willy_Ssengooba/publication/257530446_Sensititre_MYCOTB_
MIC_Plate_for_Testing_Mycobacterium_tuberculosis_Susceptibility_to_First-_and_Second-Line_Drugs/links/0a85e52d909e8418b8000000.pdf
43
28. Cornelissen CN, Fisher BD, Harvey RA. Lippincott’s Illustrated Reviews: Microbiology. 3rd ed. Baltimore; 2013.
29. Nallapareddy SR, Singh K V., Sillanpää J, Garsin D a., Höök M, Erlandsen SL, et al. Endocarditis and biofilm-associated pili of Enterococcus faecalis. J Clin Invest. 2006;116(10):2799–807.
30. Jacobsen SM, Stickler DJ, Mobley HLT, Shirtliff ME. Complicated catheter-associated urinary tract infections due to Escherichia coli and Proteus mirabilis. Clin Microbiol Rev. 2008;21(1):26–59. 31. Diancourt L, Passet V, Verhoef J, Patrick a D, Grimont P a D, Brisse S. Multilocus Sequence Typing of Klebsiella pneumoniae Nosocomial Isolates Multilocus Sequence Typing of Klebsiella pneumoniae Nosocomial Isolates. J Clin Microbiol. 2005;43(8):4178–82.
32. Aloush V, Navon-venezia S, Seigman-igra Y, Cabili S, Carmeli Y. Multidrug-Resistant Pseudomonas aeruginosa : Risk Factors and Clinical Impact. Society. 2006;50(1):43–8.
33. Bottone EJ. Bacillus cereus, a volatile human pathogen. Clin Microbiol Rev [Internet]. 2010;23(2):382–98. Available from: http://cmr.asm.org/content/23/2/382
34. Warnock DW. Trends in the epidemiology of invasive fungal infections. Japanese J Med Mycol. 2007;48(1):1–12.
35. Laviano A, Rossi Fanelli F. Toxicity in Chemotherapy — When Less Is More. N Engl J Med
[Internet]. 2012;366(24):2319–20. Available from:
http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMcibr1202395#t=article
36. Siegel R, Ma J, Zou Z, Jemal A. Cancer Statistics , 2014. A Cancer J Clin [Internet]. 2014;64(1):9– 29. Available from: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.3322/caac.21208/pdf
37. Ferlay J, Parkin DM, Steliarova-Foucher E. Estimates of cancer incidence and mortality in Europe in 2008. Eur J Cancer [Internet]. Elsevier Ltd; 2010;46(4):765–81. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0959804909009265
38. All Cancers (excluding non-melanoma skin cancer). Estimated Incidence, Mortality and Prevalence Worldwide in 2012 [Internet]. [cited 2015 Apr 21]. Available from: http://globocan.iarc.fr/Pages/fact_sheets_cancer.aspx
39. Sano T, Kodera Y. Japanese gastric cancer treatment guidelines 2010 (ver. 3). Gastric Cancer [Internet]. 2011;14(2):113–23. Available from: http://link.springer.com/article/10.1007/s10120-011-0042-4
40. Lemieux J, Maunsell E, Provencher L. Chemotherapy-induced alopecia and effects on quality of life among women with breast cancer: a literature review. Psychooncology [Internet]. 2008;17(4):317– 28. Available from: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/pon.1245/pdf
44
42. Monsuez J-J, Charniot J-C, Vignat N, Artigou J-Y. Cardiac side-effects of cancer chemotherapy. Int J Cardiol [Internet]. Elsevier; 2010 Sep 24 [cited 2015 Apr 14];144(1):3–15. Available from: http://www.internationaljournalofcardiology.com/article/S0167527310001786/fulltext
43. Chekhun VF, Lukyanova NY, Kovalchuk O, Tryndyak VP, Pogribny IP. Epigenetic profiling of multidrug-resistant human MCF-7 breast adenocarcinoma cells reveals novel hyper- and hypomethylated targets. Mol Cancer Ther [Internet]. 2007;6(3):1089–98. Available from: http://mct.aacrjournals.org/content/6/3/1089.full.pdf+html
44. Garton AJ, Crew AP a, Franklin M, Cooke AR, Wynne GM, Castaldo L, et al. OSI-930: A novel selective inhibitor of kit and kinase insert domain receptor tyrosine kinases with antitumor activity in mouse xenograft models. Cancer Res. 2006;66(2):1015–24.
45. Shaaban M a., Ghorab MM, Heiba HI, Kamel MM, Zaher NH, Mostafa MI. Novel thiophenes, thienopyrimidines, and triazolothienopyrimidines for the evaluation of anticancer and augmentation effects of gamma-radiation. Arch Pharm (Weinheim). 2010;343:404–10.
46. Beroza PP, Damodaran KV., Lui S, Ma W, Wang Z, Xu H. Substituted 4-amino-5-benzoyl-2-(phenylamino)thiophene-3-carbonitriles and substituted 4-amino-5-benzoyl-2-(phenylamino)thiophene-3-carboxamides as tubulin polymerization inhibitors [Internet]. United states; US8410163, 2013. Available from: http://www.google.com/patents/US8410163
47. Tonon G, Wong K-K, Maulik G, Brennan C, Feng B, Zhang Y, et al. High-resolution genomic profiles of human lung cancer. Proc Natl Acad Sci U S A [Internet]. 2005;102(27):9625–30. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1160520/
48. Neve RM, Chin K, Fridlyand J, Yeh J, Baehner FL, Fevr T, et al. A collection of breast cancer cell lines for the study of functionally distinct cancer subtypes. Cancer Cell [Internet]. 2006 Dec [cited
2014 Jul 11];10(6):515–27. Available from:
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S153561080600314X
49. Liscovitch M, Ravid D. A case study in misidentification of cancer cell lines: MCF-7/AdrR cells (re-designated NCI/ADR-RES) are derived from OVCAR-8 human ovarian carcinoma cells. Cancer Lett [Internet]. 2007;245(1):350–2. Available from: http://www.cancerletters.info/article/S0304-3835%2806%2900063-2/fulltext
50. Garbe C, Peris K, Hauschild A, Saiag P, Middleton M, Spatz A, et al. Diagnosis and treatment of melanoma. European consensus-based interdisciplinary guideline - Update 2012. Eur J Cancer
[Internet]. Elsevier Ltd; 2012;48(2):2375–90. Available from:
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0959804909008193#
51. Ravindranath MH, Muthugounder S, Presser N. Ganglioside signatures of primary and nodal metastatic melanoma cell lines from the same patient. Melanoma Res [Internet]. 2008;18(1):47–55.
