KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA
KRISTINA GAIVELYTĖ
5-nitrofuraldehido darinių antimikrobinio aktyvumo tyrimas,
toksiškumo, farmakokinetikos ir struktūros-aktyvumo ryšio
įvertinimas
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovai Lekt. Dr. Vilma Petrikaitė Kauno medicinos universitetas, Biotechnologijos institutas
Dr. Jonas Šarlauskas Biochemijos institutas
Prof. habil. dr. Alvydas Pavilonis Kauno medicinos universitetas
KAUNAS, 2010
2
TURINYS
SANTRAUKA 3 SUMMARY 4 SANTRUMPOS 5 ĮVADAS 6 2. LITERATŪROS APŽVALGA 72.1. Antimikrobinių medžiagų reikšmė ir poreikis 7
2.2. Naujų antimikrobinių vaistų kūrimo tendencijos 9
2.3. Nitrofurano dariniai 10
2. 4. Farmakokinetinių savybių ir toksiškumo įvertinimo reikšmė 14
2. EKSPERIMENTINĖ DALIS 16
2.1. Antimikrobinio aktyvumo prognozė, panaudojant PASS programą 16
2.2. Antimikrobinio aktyvumo tyrimai in vitro 17
2.3. Farmakokinetinių savybių ir toksiškumo prognozė, panaudojant ADME/Tox Boxes programą
24
3. REZULTATŲ APTARIMAS 28
3.1. Nitrofurano darinių antimikrobinis aktyvumas 28
3.2. Nitrofurano darinių toksiškumas 42
3.3. Nitrofurano darinių farmakokinetinės savybės 45
3.4. Perspektyviausi antimikrobiniai nitrofurano dariniai 45
IŠVADOS 47
LITERATŪROS SĄRAŠAS 48
3
SANTRAUKA
5-nitrofuraldehido darinių antimikrobinio aktyvumo tyrimas, toksiškumo, farmakokinetinių savybių ir struktūros-aktyvumo ryšio įvertinimas. K. Gaivelytės magistro baigiamasis darbas. Moksliniai vadovai: dr. V. Petrikaitė, dr. J. Šarlauskas, prof. habil. dr. A. Pavilonis; Kauno medicinos universiteto, Farmacijos fakulteto, Vaistų chemijos katedra. Kaunas, 2010.
Darbo tikslas – įvertinti 5-nitrofuraldehido darinių struktūros įtaką jų antimikrobiniam aktyvumui ir parinkti perspektyviausius antimikrobinius junginius tolimesniems tyrimams.
Tyrimo metodai. Junginių antimikrobinio aktyvumo prognozė atlikta panaudojant PASS programą. Antimikrobinis aktyvumas ištirtas in vitro serijinio skiedimo standžioje terpėje metodu. Junginių farmakokinetinių savybių ir toksiškumo prognozė atlikta, panaudojant ADME/Tox Boxes programą.
Tyrimo rezultatai. PASS programa antibakterinį ir priešgrybelinį aktyvumą prognozavo visiems tiriamiems junginiams. Atlikus tyrimus in vitro, nustatyta, kad junginių aktyvumas prieš įvairius mikroorganizmus skyrėsi, nitrofurano fragmento neturintys junginiai buvo visai neaktyvūs. Nitrofurano bisdariniai yra gana aktyvūs prieš visas bakterijas (MSK = 0,5-100 μg/ml), išskyrus P. aeruginosa,
K. pneumoniae ir P. mirabilis. Bisjunginys BIC-34, turintis butilo fragmentą, buvo aktyviausias prieš S. aureus, E. faecalis ir B. subtilis, o piridino liekaną turintis bisjunginys BIC-67 – prieš K. pneumoniae, P. aeruginosa, P. mirabilis (MSK = 50 μg/ml). Gali būti, kad šio junginio (BIC-67) aktyvumui įtakos turi
ne tik heterociklo įjungimas, bet ir jo dviguba (bis) struktūra. Junginys BIC-22, kurio molekulėje dichlorbenzeno liekana prijungta per deguonies tiltelį, selektyviai ir gana nedidele koncentracija (MSK = 10 μg/ml) slopina B. subtilis augimą. Halogenų įjungimas į fenilo pakaitą 5-nitrofurano darinių šoninėje grandinėje, padidina aktyvumą prieš C. albicans, lyginant su nitrofuraliu. Bisjunginiams (išskyrus junginį BIC-67) ir aktyviausiam antimikrobiniam junginiui, turinčiam furanilo liekaną (BIC-24) prognozuotas mažesnis toksiškumas nei nitrofuraliui. Bisjunginiams prognozuotos gana didelės toksinio poveikio organams tikimybės, o junginiui BIC-24 jos mažesnės. 5-Nitrofurano darinių toksiškumas didėja iki 2 kartų, 2-oje padėtyje grandinėlę pailginus papildoma dviguba jungtimi, tačiau didėja ir antimikrobinis aktyvumas. Toksinis poveikis organams didėja, didinant nitrogrupių skaičių 5-nitrofurano darinių struktūroje. Nitrofurano bisdarinių ir benzimidazolo pakaitą turinčių junginių struktūra gali lemti mažą jų bioprieinamumą, tad panašios struktūros junginius nėra tikslinga kurti kaip geriamuosius vaistus.
Išvados. Aktyvumo prognozės programa yra reikalinga, nes padeda pasirinkti junginius tyrimui, tačiau visiškai pasikliauti ja negalima, būtina atlikti tyrimus in vitro. Remdamiesi junginių antimikrobinio aktyvumo tyrimų rezultatais, o taip pat toksiškumo ir farmakokinetinių savybių prognozės duomenimis, išskyrėme keletą nitrofurano darinių kaip labiausiai perspektyvių antimikrobinių medžiagų: BIC-22, BIC-24, BIC-34, BIC-67.
4
SUMMARY
Analysis of 5-nitrofuraldehyde derivatives antimicrobial activity, evaluation of toxicity, pharmacokinetic properties and structure – activity relationship. K. Gaivelytė Master Thesis. Scientific supervisors: Dr. V. Petrikaitė, Dr. J. Šarlauskas, Prof. Habil. Dr. A. Pavilonis; Kaunas University of Medicine, Faculty of Pharmacy, Department of Medicinal Chemistry. Kaunas, 2010.
The Aim of the Research – to evaluate the influence of the structure of 5-nitrofuraldehyde derivatives and identify the most promising compounds for the further research.
Methods. Prognosis of antimicrobial activity of all compounds was carried out by using PASS software. Antimicrobial activity was tested in vitro by using a serial dilution in agar technique. Pharmacokinetic properties and toxicity were predicted by using ADME/Tox Boxes program.
Results. PASS program predicted antibacterial and antifungal activity for all tested compounds. The results of experiments in vitro showed that activity against various microorganisms was different; compounds without nitrofuran fragment were not active. Biscompouds were active enough against all bacteria (MIC = 0,5-100 μg/ml), except P. aeruginosa, K. pneumoniae and P. mirabilis. Biscompoud possessing butyl fragment in its structure was the most active against S. aureus, E. faecalis and B. subtilis and biscompound BIC-67 with the moiety of pyridine was the most active against K. pneumoniae,
P. aeruginosa, P. mirabilis (MIC = 50 μg/ml). It could be that the activity of this compound (BIC-67) is
influenced not only by the presence of heterocycle, but also by its double (bis) structure. Compound BIC-22 having dichlorbenzene moiety connected through the oxygen bridge in its structure selectively and in low concentration (MIC = 10 μg/ml) inhibited the growth of B. subtilis. Halogenation of benzene moiety in the side chain of 5-nitrofuran derivatives increased the activity against C. albicans compared to nitrofural. The lower toxicity was predicted for biscompounds (except compound BIC-67) and for the most active antimicrobial compound having furanyl moiety (BIC-24) compared to nitrofural. High probability of toxicity to organs was predicted for the biscompounds, and these probabilities were lower for the compound BIC-24. Toxicity of 5-nitrofurans increases almost two times after chain lengthening by the double bond in the second position, however antimicrobial activity increases, too. Toxicity to organs increases by increasing the number of nitro groups in the structure of 5-nitrofuran derivatives. The structure of nitrofuran bisderivatives and incorporation of benzimidazole moiety into nitrofuran structure may lead to their low bioavailability, so it is not advisable to develop compounds with similar structure for oral use.
Conclusions. Prognosis of activity is useful because it helps to identify the compounds for testing but it is not advisible to rely in it completely; it is necessary to carry out the experiments in vitro. On the basis of the results of microbiological experiments and the prognosis data for toxicity and pharmacokinetic properties we identified the most promising nitrofuran derivatives: BIC-22, BIC-24, BIC-34, BIC-67.
5
SANTRUMPOS
ADME – absorbcija, pasiskirstymas, metabolizmas ir pašalinimas (Absorption, Distrubution,
Metabolism, Excretion)
CL50 – mažiausia koncentracija, kuri mirtina 50 proc. eksperimente naudotų ląstelių
DMSO – dimetilsulfoksidas
FDA – Maisto ir vaistų administracija (Food and Drug Administration)
FIP – Tarptautinė farmacijos federacija (International Pharmaceutical Federation)
In silico – atliekama kompiuteryje arba taikant kompiuterinį modeliavimą
JAV – Jungtinės Amerikos Valstijos
LD50 – mažiausia dozė, kuri yra mirtina 50 proc. eksperimente naudotų gyvūnų ar ląstelių
mRNR – matricinė ribonukleorūgštis
PASS – Prediction of Activity Spectra for Substances
Per os – per burną
PSO – Pasaulinė sveikatos organizacija
TPSA – topologinis polinis paviršiaus plotas (topological polar surface area) ŽIV – žmogaus imunodeficito virusas
H. pylori – Helicobacter pylori S. aureus – Staphylococcus aureus E. coli – Escherichia coli
E. faecalis – Enterococcus faecalis
P. aeruginosa – Pseudomonas aeruginosa K. pneumoniae – Klebsiella pneumoniae P. mirabilis – Proteus mirabilis
B. subtilis – Bacillus subtilis B. cereus – Bacillus cereus C. albicans – Candida albicans
6
ĮVADAS
Infekcinės ligos yra svarbi visuomenės sveikatos sritis. Pasaulinės sveikatos organizacijos (PSO) duomenimis iš visų mirčių 2004 m. mirtys dėl infekcinių ir parazitinių ligų užėmė antrą vietą (po širdies ir kraujagyslių ligų) [45]. Lietuvos sveikatos informacijos centro duomenimis 2008 m. Lietuvoje 100 tūkst. gyventojų teko 16,1 mirtis dėl infekcinių ir parazitinių ligų. Pagal mirtį sukėlusias priežastis tai yra aštuntoji vieta iš devyniolikos [1].
Mirštamumas nuo infekcinių ligų labai sumažėjo pradėjus vartoti antimikrobines medžiagas. Pasauliniu mastu sergamumas ir mirštamumas sumažėjo ne tik dėl šių medžiagų vartojimo, bet ir dėl pagerėjusių higienos sąlygų, skiepijimo ir supratimo, kad kai kurias infekcines ligas sukelia bakterijos. Vis dėlto didžiausia visų šių veiksnių įtaka buvo pastebėta industrializuotame pasaulyje, kuriame vaistai buvo lengvai prieinami [35].
Deja, vartojant antibiotikus buvo pastebėta, kad kai kurie mikroorganizmai tampa atsparūs vartojamiems vaistams. Susirūpinimą kelia ir kai kurios suaktyvėjusios senos, bei naujai registruojamos infekcinės ligos. Plečiantis tarptautiniams ryšiams, išaugus turistų ir keliautojų srautui, didėja rizika susidurti su naujų užkrečiamų ligų atsiradimo ir išplitimo galimybe [1]. Visa tai lemia naujų antimikrobinių vaistų kūrimo poreikį.
XX a. 5 deš. pasirodžius nitrofuraliui, susintetinta daugiau nei 3500 5-nitrofurano darinių, pasižyminčių aktyvumu prieš bakterijas ir pirmuonis [15]. Nitrofurano dariniai yra labai aktyvūs ir turi labai platų antimikrobinio veikimo spektrą: mažomis koncentracijomis slopina daugelio gramteigiamų ir gramneigiamų bakterijų, pirmuonių, spirochetų, riketsijų gyvybinę veiklą. Šiuo metu, kuomet vis daugėja turimiems antimikrobiniams vaistams atsparių mikroorganizmų, nitrofuranai išlieka aktyvūs net ir prieš sukėlėjus, kurie yra atsparūs kitiems vaistams [18]. Nitrofurano dariniai, kaip furadoninas, furaginas, nifuratelis, ir dabar yra naudojami infekcijoms gydyti. Be to, kuriami ir nauji nitrofurano dariniai. Kai kurie nauji junginiai yra aktyvūs prieš tuberkuliozės sukėlėjus [44], atsparią Helicibacter pylori (H. pylori) [34], pirmuonis [12, 31].
Kauno medicinos universiteto Vaistų chemijos katedroje taip pat daugelį metų sintetinami nitrofurano dariniai, tiriamas jų antimikrobinis aktyvumas. Šioje srityje dirba mokslininkai Eduardas Tarasevičius [4, 5], Vilma Petrikaitė [2].
Ankstesni sėkmingi mokslininkų darbai šioje srityje paskatino mus ištirti naujų 5-nitrofuraldehido darinių antibakterinį ir priešgrybelinį aktyvumą bei įvertinti, ar šie junginiai galėtų būti vystomi kaip efektyvūs antimikrobiniai vaistai.
7 Darbo tikslas - įvertinti 5-nitrofuraldehido darinių struktūros įtaką jų antimikrobiniam aktyvumui ir parinkti perspektyviausius antimikrobinius junginius tolimesniems tyrimams.
Uždaviniai:
1. Ištirti 5-nitrofuraldehido darinių priešgrybelinį ir antibakterinį aktyvumą: - panaudojant PASS programą;
- serijinio skiedimo standžioje terpėje in vitro metodu.
2. Nustatyti 5-nitrofuraldehido darinių priešgrybelinio ir antibakterinio aktyvumo bei cheminės struktūros ryšio dėsningumus gautų eksperimentinių duomenų pagrindu.
3. Įvertinti 5-nitrofuraldehido darinių toksiškumą, panaudojant ADME/Tox Boxes programą.
4. Įvertinti 5-nitrofuraldehido darinių farmakokinetines savybes panaudojant ADME/Tox Boxes programą.
5. Atsižvelgiant į gautus rezultatus, parinkti perspektyviausius junginius-lyderius tolimesniems junginių vystymo etapams.
Magistrinio darbo apimtis ir struktūra
Magistrinį darbą sudaro įvadas, literatūros apžvalga, eksperimentinė dalis (tyrimų metodikos), rezultatų aptarimas, išvados, literatūros sąrašas (51 literatūros šaltinis). Pateikta 5 lentelės ir 16 paveikslų, priedas. Magistrinio darbo apimtis yra 52 puslapiai.
Darbo rezultatų pristatymas
Šio darbo rezultatai buvo pristatyti Kauno technologijos universitete 2010 m. balandžio 21 d. vykusioje mokslinėje konferencijoje „Organinė chemija“. Pranešimo pavadinimas „5-Nitrofuraldehido hidrazonų sintezė, antimikrobinio aktyvumo ir SAR tyrimai“ (stendinio pranešimo kopija pateikta priede).
8
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Antimikrobinių medžiagų reikšmė ir poreikis
Antibakterinių medžiagų tyrimai ir kūrimas yra didžiulės sėkmės istorija. Prieš Aleksandrui Flemingui 1928 m. atrandant peniciliną, kuris klinikoje pradėtas vartoti tik 1945 m., streptokokinės anginos diagnozavimas galėjo reikšti mirties nuosprendį [10]. Antrojo pasaulinio karo metais pirmieji sisteminiai antimikrobiniai vaistai (sulfanilamidai ir penicilinas) dėl nepakankamo kiekio ir brangumo buvo skiriami tik kariuomenei. Sukūrus daugiau antimikrobinių vaistų, jie pradėti plačiai vartoti [6] ir įgijo lemiamą reikšmę kontroliuojant infekcinių ligų plitimą.
Šiuo metu klinikinėje praktikoje infekcinėms ligoms gydyti vartojama daugiau kaip 200 antibiotikų. Vis dėlto naujų antimikrobinių vaistų poreikis yra būtinybė. Tai lemia keletas priežasčių.
Pastaruoju metu padaugėjo pacientų, kurių imunitetas labai susilpnėjęs. To priežastis yra ŽIV, padažnėjusios organų transplantacijos, vėžiniai susirgimai, stresas ir kt. Tokie pacientai dažniau serga grybelinėmis ir kitomis infekcijomis. Iki 1970 metų grybelinių susirgimų nebuvo daug, todėl ir vaistų paklausa buvo nedidelė [43]. Dėl šios priežasties dar ir dabar tebėra skurdus pasirinkimas priešgrybelinių vaistų, tad naujų efektyvių priešgrybelinių vaistų poreikis dar niekad nebuvo toks didelis.
Atrasti nauji antimikrobiniai preparatai sumažina klinikinio gydymo trukmę ir/ar dozavimą. Ampiciliną pakeitus amoksicilinu, vaisto dozavimas sumažėjo nuo keturių iki trijų kartų per dieną; vieną kartą per dieną vartojamas ceftriaksonas yra dažniau skiriamas nei cefotaksimas, kurį reikia vartoti tris kartus per dieną. Dėl šių dozavimo pokyčių pacientai, ypač ambulatoriniai, vaistą dažniau vartoja tinkamai. Retesnis dozavimo dažnumas gali sumažinti ligoninės išlaidas. Nauji antimikrobiniai vaistai paprastai yra mažiau toksiški, nebeturi tokio didelio šalutinio poveikio (rečiau sukelia vėmimą, viduriavimą, alergines reakcijas) [13].
Vartojant antimikrobines medžiagas kai kurie mikroorganizmai tampa jiems atsparūs. Pirmas greitos atrankos pavyzdys buvo Staphylococcus aureus (S. aureus) atsparumo penicilinui padidėjimas nuo 8% iki beveik 60% 1945-1949 metais [10]. Jautriausios bakterijos žūva, o atsparios išlieka. Pastebėtas reiškinys yra apibūdinamas kaip selektyvus poveikis. Šis procesas labai sparčiai žengia į priekį. Atsparūs mikroorganizmai plinta ne tik ligoninėse, bet ir visuomenėje, jų sukeliamos ligos yra sunkiai gydomos ir pavojingos visiems gyventojams, ypač mažiems vaikams, pagyvenusiems žmonėms ir tiems, kurių imunitetas susilpnėjęs. 2004 metais Amerikos infekcinių ligų draugija paskelbė, kad vien tik JAV ligoninėse bakterinėmis infekcijomis kasmet suserga apie 2 mln. žmonių. 90 000 atvejų šios infekcijos baigiasi paciento mirtimi [35]. Be to, daugiau nei 70 proc. bakterijų rūšių
9 yra atsparios mažiausiai vienam antibakteriniam vaistui [13]. Nustačius atsparumą tam tikrai medžiagai ar visai cheminių junginių klasei, farmacijos pramonė pradėjo kurti naujos kartos ir net naujos klasės antimikrobinius junginius. Pavyzdžiui, siekiant išvengti atsparumo streptomicinui, sukurti antros kartos aminoglikozidai, o norint pagerinti aminoglikozidų aktyvumą prieš gramneigiamus patogenus, sukurti trečios kartos aminoglikozidai. Dar vėliau sukurtas linezolidas, naujos sintetinių oksazolidinonų klasės atstovas, neturintis kryžminio atsparumo nė vienam tuo metu žinomam antibiotikui. Tačiau visais atvejais net ir naujoms antimikrobinėms medžiagoms palaipsniui išsivystė atsparumas. Kai kurie mokslininkai mano, kad atsparių mikroorganizmų sukeltas infekcijas būtų galima išgydyti derinant keletą antimikrobinių vaistų, ir naujų kurti nereikia. Deja, tai nėra išeitis. Naujų antimikrobinių medžiagų tyrimai yra perspektyvūs ir labai naudingi, nes dar neatrastas vaistas, kurio poveikiui po tam tikro laiko bakterijos vėl neįgytų atsparumo. Be to, gali suaktyvėti šiuo metu kontroliuojamos infekcijos, pavyzdžiui, cholera, kokliušas, arba atsirasti naujų infekcijų [10], kurių gydymui reikėtų naujų antimikrobinių vaistų.
Didėjant atsparumui daugeliui antimikrobinių vaistų yra grėsmė visiems turimiems antibiotikams, todėl būtina tęsti naujų medžiagų kūrimą ir tyrimus [10].
1.2. Naujų antimikrobinių vaistų kūrimo tendencijos
Šiuo metu naujų antimikrobinių medžiagų poreikis yra didesnis nei bet kada anksčiau. Paradoksalu, tačiau kai kurios farmacijos kompanijos pareiškė apribojančios priešinfekcinių junginių tyrimų programas [43]. Tai būtų galima paaiškinti tuo, kad tokių infekcijų, kurių gydymui vis dar nėra tinkamų vaistų, yra mažai, o jomis sergantys asmenys gyvena labai skirtingose pasaulio šalyse. Tai apsunkina klinikinių tyrimų administravimą, ir kompanijoms nėra patrauklu kurti naujus vaistus nuo šių infekcijų [30]. Dauguma didžiųjų farmacijos kompanijų nusprendė, kad vaistai lėtinių ligų gydymui teikia daug didesnes pajamas nei antibakterinės medžiagos, tad labai stipriai sumažino arba išvis atsisakė vaistų nuo infekcijų kūrimo ir tyrimų [36].
Mažėjančias antimikrobinių vaistų kūrimo tendencijas patvirtina 2003 metais atlikto JAV registruotų vaistų tyrimo duomenys. 1998-2002 metais Maisto ir vaistų administracija (FDA) registravo du su puse karto mažiau naujų antimikrobinių vaistų negu 1983-1987 metais. Tik septyni vaistai iš 1998-2002 metais registruotų 225 naujų veikliųjų medžiagų turi antimikrobinį aktyvumą, o 2002 metais neužregistruota nei viena antimikrobinė medžiaga. Svarbu pastebėti, kad iš devynių naujų antimikrobinių medžiagų, registruotų 1998-2002 metais tik dvi (linezolidas ir ir daptomicinas) turi naują veikimo mechanizmą. Beje, mažiau užregistruojama ir naujų priešgrybelinių vaistų: per tą patį laikotarpį FDA registravo tik dvi naujas priešgrybeliniu aktyvumu pasižyminčias medžiagas -
10 kaspofunginą ir vorikonazolą. Įdomu tai, kad kitų antiinfekcinių vaistų registracija nesulėtėjo: pavyzdžiui, 1998-2002 metais FDA užregistravo 9 priešvirusines medžiagas, iš kurių penkios veikia žmogaus imunodeficito virusą (ŽIV). Remiantis šiuo metu didžiausių farmacijos ir biotechnologijų kompanijų naujų vaistų kūrimo programų duomenimis, spėjama, kad ateityje iš sukuriamų naujų 506 vaistų tik šeši bus antiinfekciniai [42].
Akivaizdu, kad dabartinė antimikrobinių vaistų paieška yra nepakankama ir neatitinka visuomenės poreikių. Naujų antimikrobinių vaistų atradimas ir optimizavimas yra labai svarbus [9], todėl reikalingi plataus masto politiniai sprendimai, kurie skatintų naujų antimikrobinių medžiagų kūrimą ir vystymą [43]. 2008 metais Tarptautinė farmacijos federacija (FIP) nusprendė skatinti naujų, ekonomiškai pagrįstų antimikrobinių preparatų paieškas ir kūrimą [16].
1.3. Nitrofurano dariniai
Susidomėjimas nitrofuranais ir jų taikymu medicinoje prasidėjo nuo Stillman ir Dodd 2-pakeistų 5-nitrofurano darinių tyrimų [15]. Pirmasis šios cheminės klasės junginys, turintis antimikrobinį aktyvumą, yra nitrofuralis (2-((5-nitro-2-furanil)metilen)hidrazino karboksamidas). Po to susintetinta šimtai įvairių 5-nitrofurano darinių, turinčių antimikrobinį aktyvumą [15, 24].
Nitrofurano dariniai yra plataus veikimo spektro antimikrobinės medžiagos, veiksmingos prieš gramteigiamas ir gramneigiamas bakterijas, įskaitant ir Salmonella rūšis. Ši vaistų grupė veiksminga prieš Giardia, amebas, trichomonas ir keletą Coccidia rūšių. Kai kurios gramneigiamos bakterijos, kaip Pseudomonas, Serratia, Enterobacter ir Proteus, taip pat ir mieliniai grybeliai yra atsparūs nitrofurano dariniams [23]. Nitrofuranai veikia bakteriostatiškai, tačiau didesnėmis dozėmis gali veikti ir baktericidiškai. Šie vaistai aktyviausi yra rūgštinėje aplinkoje (optimalus pH yra 5,5), mažai tirpsta vandenyje ir nepasižymi sisteminiu poveikiu. Jie vartojami per os, išoriškai ir retai parenteraliai. Blogai absorbuojami iš virškinamojo trakto, greitai pašalinami. Dėl minėtų veiksnių nitrofuranų mikroorganizmų augimą slopinančios koncentracijos pasiekiamos tik šlapime [18].
Svarbu pastebėti, kad kai kurie nitrofuranai turi kancerogeninių savybių ir jų vartojimas yra abejotinas, tačiau šiuo metu jie vis dar vartojami medicinoje, o dar plačiau veterinarijoje [20]. Be kancerogenezės, skirtingiems nitrofuranams būdingi ir kiti toksiniai poveikiai: centrinės nervų sistemos pažeidimai, virškinimo trakto sutrikimai, methemoglobinemija, svorio kritimas, sumažėjusi spermatogenezė. Literatūros duomenimis, nitrofuranai (pavyzdžiui, nitrofuralis, nitrofurantoinas ir furazolidonas) yra silpnos mutageninės medžiagos [9]. Taip pat aprašytos padidėjusio jautrumo reakcijos nitrofuranams. Paskyrus per dideles furazolidono dozes veršiukams, dažnai pasireiškia
11 neurotoksiškumas. Manoma, kad žmonės, vartojantys nitrofurantoiną, gali susirgti polineuropatija [18].
Nitrofuranai dažnai vartojami kaip antro pasirinkimo vaistai gydyti odos infekcijas, dažniausiai sukeltas gramteigiamų ir gramneigiamų bakterijų. Taip pat gali būti vartojami deriniuose, gydyti daugeliui vaistų atsparaus S. aureus ir kitų bakterijų sukeltas infekcijas.
Pagrindinis nitrofurano darinių veikimo mechanizmas nėra aiškus, tačiau žinoma, kad jie slopina daugelį mikrobų fermentinių sistemų, įskaitant ir dalyvaujančius angliavandenių metabolizme. Nitrofuranų veikimas priklauso nuo bakterijų flavininio fermento nitroreduktazės aktyvinimo, kurio metu susidaro chemiškai aktyvūs hidroksilamino dariniai [9], slopinantys genų transliaciją, ribosominius procesus, kuomet pagal matricinę ribonukleorūgštį (mRNR) aminorūgštys yra jungiamos į polipeptido grandinę. Kita vertus, manoma, kad reakcija gali vykti ir amidiniame molekulės gale, susidarant aminui ir atsipalaiduojant formamidui – toksiškam produktui [37]. Taigi, nitrofuranai yra perspektyvi provaistų klasė, o provaistai yra ypač patrauklios terapinės medžiagos dėl jų selektyvaus toksiškumo mikroorganizmams, turintiems specifinį šiuos junginius aktyvuojantį fermentą [9].
Mikroorganizmų atsparumas nitrofurano dariniams vystosi lėtai. H. pylori paprastai yra jautri nitrofurantoinui ir furazolidonui, tačiau svarbu pastebėti, kad keletą šios bakterijos padermių nitrofuranai veikia didesnėmis koncentracijomis. Atsparumo mechanizmas nėra žinomas. Gali pasireikšti kryžminis atsparumas tarp pačių nitrofuranų, tačiau kitoms antimikrobinėms medžiagoms kryžminis atsparumas nebūdingas [18].
Nitrofuralis, nitrofurantoinas ir furazolidonas šiuo metu yra vartojami gydyti šlapimo takų infekcijas, taip pat – kaip vietinės antibakterinės medžiagos. Escherichia coli (E. coli), S. aureus,
Streptococcus pyogenes ir Aerobacter aerogenes paprastai yra jautrūs nitrofuraliui, tačiau Proteus
rūšys, Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) ir Streptococcus faecalis dažniausiai yra atsparūs. Nitrofuralio veikimo spektras panašus į nitrofurantoino. Klinikoje pradėtas vartoti 1946 m.
per os gydyti bakterines infekcijas ir Šago ligą. Dėl toksinio poveikio šiuo metu vartojamas tik
išoriškai [47], nes tik labai nedidelės jo koncentracijos absorbuojamos per odą ar gleivines [21]. Kraujo, pūlių ar pieno buvimas sumažina vaisto veiksmingumą. Nitrofuralis taip pat vartojamas kaip maisto priedas gyvuliams, siekiant kontroliuoti žarnyno bakterines infekcijas ir kokcidiozę. Nepaisant pareiškimų apie jautrumą furacilinui, gaunami palankūs rezultatai, gydant juo daugelį odos infekcijų, tarp jų ir varikozinį išopėjimą. Be to, iki šiol nėra paskelbta duomenų apie nitrofuralio toksiškumą, kuris pasireikštų dėl absorbcijos [40].
Furazolidonas veiksmingas prieš E. coli, Clostridium, Salmonella, Shigella, Staphylococcus,
Streptococcus, Eimeria ir Histomonas rūšis. Vaistas yra vartojamas per os, tačiau gali būti vartojamas
12 priemonė prieš H. pylori. Veterinarijoje furazolidonas pirmiausiai vartojamas gydyti veršiukų žarnyno infekcijas [49].
Nifuroksazidas, sintetinis antimikrobinis vaistas, naudojamas kaip antro ar trečio pasirinkimo vaistas gydyti žarnyno infekcijas ir turi labai platų veikimo spektrą [15], nesukelia bakterijų atsparumo [33]. Jo struktūra yra tinkama cheminiam modifikavimui. Vaistas netirpsta vandenyje, todėl neabsorbuojamas virškinimo trakte ir yra praktiškai netoksiškas [24].
Svarbu pastebėti, kad kai kurie 5-nitrofurano dariniai nėra vartojami dėl jų sukeliamų nepageidaujamų poveikių. Nepaisant to, pastaruoju metu išaugo susidomėjimas šiais nitroheterocikliniais junginiais, tiriami nauji jų dariniai [24].
Antai, per pastarąjį dešimtmetį sukurta nemažai antimikrobiniu aktyvumu pasižyminčių nitrofurano darinių. Nustatyta, kad N1-(4-metoksibenzamido)benzoil]-N2 -[(5-nitro-2-furil)metilen]-hidrazinas (1) gana aktyviai slopina keleto bakterijų ir grybelių augimą [26]:
O N N H O2N O N H O OCH3 (1)
Nifuroksazidas ir šeši jo analogai (2) buvo susintetinti, keičiant pakaitą benzeno ciklo para padėtyje ir nitroheterociklo heteroatomą:
X O2N N N H O R (2)
Įvertinus šių junginių antimikrobinį aktyvumą prieš S. aureus nustatyta, kad jie yra aktyvūs 0,16-63,00 µg/ml koncentracijomis [25].
Siekdami sukurti naujas antimikrobines medžiagas, Rollas ir kiti mokslininkai susintetino seriją hidrazidų hidrazonų ir 4-fluorbenzoinės rūgšties hidrazidų 1,3,4-oksadiazolinų. Ištyrus šių junginių antibakterinį ir priešgrybelinį aktyvumą prieš S. aureus, E. coli, P. aeruginosa ir C. albicans, nustatyta, kad 4-fluorbenzoinės rūgšties [(5-nitro-2-furil)metilen]hidrazidas (3) prieš S. aureus buvo toks pats aktyvus, kaip ir ceftriaksonas [39]:
O N N H O2N O F (3)
13 4-pakeisti benzoinės rūgšties [(5-nitrotiofen-2-il)metilen] hidrazidai (4) buvo susintetinti kaip potencialūs bakteriostatinį aktyvumą turintys junginiai. Ištyrus šių junginių aktyvumą, išankstinė hipotezė pasitvirtino [33]. S N N H O2N O R R (4) 1 2
Buvo susintetinta daug skirtingų 2,3,4-pentantrion-3-[4-[[5-nitro-2-furil/piridil/pakeistų-fenil)-metilen]hidrazin]karbonil]fenil]hidrazonų. Buvo įvertintas visų susintetintų junginių aktyvumas prieš M. fortuitum ir M. tuberculosis. Junginys (5) buvo aktyviausias iš šių junginių prieš
M. tuberculosis (jo MSK yra 3,13 µg/ml) [28]:
O N N H O2N O N H N CH3 O O CH3 (5)
N2-pakeisti alkiliden/ariliden-6-fenilimidazo[2,1-b]tiazol-3-acto rūgšties hidrazidai yra aktyvūs prieš S. aureus, S. epidermidis, T. mentagrophytes var. Erinacei, T. rubrum ir M. audounii (MSK 0,24-25 µg/ml) [48]: S N N H O N N O O2N (6)
Buvo susintetinti benzoinės rūgšties [(5-nitro-tiofen-2-il)metilen] hidrazidai ir įvertintas jų aktyvumas prieš M. tuberculosis. 4-metoksibenzoinės rūgšties [(5-nitro-tiofen-2-il)metilen] hidrazidas (7) buvo pats aktyviausias (MSK 2,0 µg/ml) [38]:
N N H O S O2N O (7) CH3
14 Iš 5-nitrotiofeno hidrazonų, turinčių 4-pakeistą benzoinės rūgšties liekaną, prieš tuberkuliozės bakterijas aktyviausias buvo junginys, kurio struktūroje benzeno ciklo para padėtyje įjungtas fluoro pakaitas (8) (MSK yra 6,25 µg/ml) [23]: S N N H O2N O F (8)
Ši nitrofurano darinių antimikrobinio aktyvumo tyrimų apžvalga leidžia manyti, kad nitrofurano fragmentas galėtų būti panaudojamas kaip antimikrobinis farmakoforas naujų perspektyvių antiinfekcinių medžiagų paieškai. Be to, antimikrobinį aktyvumą turi ir nitrobenzeno bei nitrotiofeno dariniai, todėl tyrimui pasirinkome ir šiuos darinius, siekiant išsiaiškinti, kiek įtakos antimikrobiniam aktyvumui gali turėti nitrofurano ciklo pakeitimas kitais heterociklais arba nitroaromatiniu pakaitu.
1. 4. Farmakokinetikos ir toksiškumo įvertinimo reikšmė
Didėjant naujų vaistų įvedimo į rinką kaštams, farmacijos kompanijos vis dažniau imasi priemonių, kad kuo ankstesniuose vaistų kūrimo etapuose būtų įmanoma atmesti neperspektyvius junginius, ir į vėlesnius etapus patektų tik kuo didesnį potencialą tapti vaistais turinčios medžiagos [7, 14]. Literatūros duomenimis, dažniausiai junginiams-lyderiams tapti vaistais kelią užkerta jų netinkamos absorbcijos, pasiskirstymo, metabolizmo ir pašalinimo (ADME) savybės [11]. Todėl pastaraisiais metais kyla poreikis kuo ankstesniuose vaistų kūrimo etapuose nuspėti junginių farmakokinetiką ir toksiškumą [29].
Dėl didelio našumo vis dažniau ADME savybių ir toksiškumo prognozei naudojami įvairūs in
silico metodai [22]. Tai metodai, naudojami įvertinti junginių farmakokinetines savybes ir toksiškumą
dar prieš jų sintezę [7].
Tinkamo ADME savybių balanso pasirinkimas yra sudėtingas, nes taisyklės, lemiančios sėkmę, nėra tiksliai apibrėžtos.
Surinkus didelį kiekį duomenų apie savybes, padidinančias junginio galimybes patekti į tolesnius vaisto kūrimo etapus, buvo sukurta „Lipinskio penketo taisyklė“. Ji nubrėžė ribas, kurių neatitinkantis junginys gali būti blogai absorbuojamas ar turėti prastą praeinamumą vartojant per os.
„Lipinskio penketo taisyklė“ [46]:
1. Junginio molekulinė masė turi būti mažesnė nei 500;
15 3. Vandenilinio ryšio akceptorių skaičius molekulėje turi būti ne didesnis nei 10;
4. Lanksčiųjų jungčių skaičius molekulėje būtų ne didesnis nei 10; 5. LogP reikšmė turi būti mažesnė nei 5.
LogP reikšmė – tai junginio neutralios formos pasiskirstymo tarp oktanolio ir vandens koeficiento logaritmas, naudojamas junginio hidrofiliškumo įvertinimui. Įrodyta, kad gerai besiabsorbuojančių junginių logP reikšmė yra mažesnė nei 5. Vaistą vartojant per os, optimali pasyvi absorbcija per žarnyno epitelį yra tuomet, kai logP reikšmė yra intervale nuo 0 iki 3 [19].
Prastas tirpumas gali apriboti junginio absorbciją virškinimo trakte, taip sumažindamas bioprieinamumą, vaistą vartojant per os. Be to, gali pareikalauti naujos, neįprastos farmacinės formos kūrimo strategijos, taip padidindamas kainą ir sugaištą laiką. Nepakankamas junginio tirpumas gali iškreipti tyrimų in vitro rezultatus. Taigi junginio tirpumo vandenyje nustatymas yra svarbus dalykas. Tirpumas gali būti išreikštas logS (mol/l). Jeigu logS reikšmė yra didesnė nei -4 elektrolitams ir didesnė nei -3 neelektrolitams, tuomet laikoma, kad tirpumas yra geras. Jeigu logS reikšmė elektrolitams yra mažesnė nei -6, o neelektrolitams mažesnė nei -4,5, tuomet laikoma, kad tirpumas yra prastas.
Topologinis polinis paviršiaus plotas (TPSA) taip pat svarbus parametras, nusakantis vaisto absorbcijos galimybes. Jis parodo molekulės polinės dalies paviršiaus plotą.
Jeigu vaisto molekulės TPSA yra didesnis nei 140 Å2, toks vaistas sunkiai praeina pro ląstelės membraną ir jo absorbuojama mažiau nei 10 proc.
Jeigu vaisto molekulės TPSA yra mažesnis nei 60 Å2, tokio vaisto absorbuojama daugiau nei 90 proc. ir jis praeina pro hematoencefalinį barjerą.
Jeigu vaistui praeiti pro hematoencefalinį barjerą nereikia, tuomet TPSA turėtų būtų intervale nuo 70 iki 120 Å2 [32].
Toksiškumo klasifikacija pagal Hodge ir Sterner [8].
Medžiagos, pagal LD50 žiurkėms paskyrus per os, skirstomos taip:
1. LD50 ne daugiau nei 1 mg/kg – nepaprastai toksiška;
2. LD50 1-50 mg/kg – labai toksiška;
3. LD50 50-500 mg/kg – vidutinio toksiškumo;
4. LD50 500-5000 mg/kg – šiek tiek tokšiška;
5. LD50 5000-15000 mg/kg – praktiškai netoksiška;
16
2. EKSPERIMENTINĖ DALIS
2.1. Antimikrobinio aktyvumo prognozė, panaudojant PASS programą
Junginių biologinio aktyvumo prognozė atlikta panaudojant PASS (Prediction of Activity
Spectra for Substances) programą, prognozuojančią sukurtų molekulių biologinio aktyvumo spektrą
pagal junginio struktūrinę formulę ir apimančią 3678 biologinio aktyvumo rūšių, įskaitant farmakologinius efektus, veikimo mechanizmus, mutageniškumą, kancerogeniškumą, teratogeniškumą ir embriotoksiškumą. Kompiuterinė struktūros ir aktyvumo ryšio analizė ir molekulių modeliavimas plačiai taikomi ieškant naujų vaistų lyderių. PASS programa vienu metu nuspėja keleto šimtų tipų biologinį aktyvumą iš skirtingų cheminių klasių [50].
PASS programa panaudota susintetintų junginių antibakteriniam ir priešgrybeliniam aktyvumui nuspėti. Ši programa pateikia aktyvumų pavadinimų sąrašą ir kiekvieno aktyvumo tikimybės reikšmę (Pa). Pa reikšmės gali būti interpretuojamos taip [51]:
1. Pa > 0,7. Junginio aktyvumą patvirtinti eksperimentiškai yra didelė tikimybė, tačiau daugeliu atvejų junginys gali būti žinomų farmacinių preparatų analogas.
2. 0,5 < Pa < 0,7. Junginys galimai pasižymės sistemos nurodytu biologiniu aktyvumu eksperimento metu, tačiau šiuo atveju tikimybė yra mažesnė, o tiriamas junginys nėra labai panašus į žinomus farmacinius preparatus.
3. Pa < 0,5. Šiuo atveju tikimybė eksperimentiškai nustatyti programos spėjamą junginio farmakologinį aktyvumą yra labai maža, junginys tik nežymiai panašus į junginius, sukauptus sistemos duomenų bazėje.
Atlikta visų šiame darbe aprašytų nitrofurano darinių biologinio aktyvumo prognozė (1 lentelė).
1 lentelė. Antibakterinio ir priešgrybelinio aktyvumo prognozė
Antibakterinis Priešgrybelinis Junginys Pa Pi Pa Pi 1 2 3 4 5 BIC-1 0,493 0,011 0,500 0,030 BIC-2 0,500 0,011 0,500 0,030 BIC-3 0,500 0,011 0,500 0,030 BIC-4 0,559 0,008 0,514 0,027 BIC-5 0,325 0,033 0,332 0,068 BIC-6 0,266 0,051 0,172 0,157
17 1 2 3 4 5 BIC-7 0,561 0,008 0,231 0,110 BIC-8 0,485 0,012 0,560 0,020 BIC-9 0,535 0,009 0,569 0,019 BIC-10 0,584 0,007 0,673 0,009 BIC-11 0,523 0,009 0,489 0,031 BIC-12 0,578 0,008 0,633 0,013 BIC-13 0,581 0,007 0,656 0,011 BIC-17 0,468 0,013 0,558 0,021 BIC-18 0,472 0,013 0,567 0,019 BIC-20 0,525 0,009 0,535 0,024 BIC-22 0,461 0,014 0,578 0,018 BIC-23 0,551 0,008 0,472 0,034 BIC-24 0,598 0,007 0,615 0,015 BIC-25 0,610 0,007 0,457 0,037 BIC-34 0,533 0,009 0,541 0,023 BIC-35 0,521 0,010 0,549 0,022 BIC-39 0,533 0,009 0,541 0,023 BIC-62 0,351 0,027 0,477 0,033 BIC-63 0,452 0,014 0,398 0,050 BIC-64 0,502 0,011 0,528 0,025 BIC-65 0,492 0,011 0,530 0.,025 BIC-66 0,539 0,009 0,487 0,032 BIC-67 0,518 0,010 0,521 0,026 BIC-68 0,496 0,011 0,411 0,046 BIC-69 0,455 0,014 0,516 0,027 JGL-1 0,538 0,009 0,569 0,019 JGL-2 0,520 0,010 0,632 0,013 JGL-3 0,401 0,020 0,433 0,042 JGL-4 0,392 0,021 0,428 0,043 JGL-5 0,329 0,032 0,366 0,058 JGL-6 0,548 0,009 0,585 0,017 JBI-7 0,472 0,013 0,523 0,026 JBI-8 0,554 0,008 0,601 0,016 JBI-9 0,527 0,009 0,564 0,020 Nitrofuralis 0,495 0,11 0,369 0,057
2.2. Antimikrobinio aktyvumo tyrimai in vitro
18 O O2N N N H O NO2 N H N O O2N O NH2 O N N H O2N O NH2 N H N O O2N O Br O N N H O2N O Br N H O N O Cl NO2 Cl N H O N O NO2 Cl Cl O N H O N O O2N N H N O O2N O F F N H O N O O2N N H N O O2N O I N H N O O2N O O CH3 COOH COOH N H N O O2N N H N O O2N COOH O N N H O OH O2N O N N H O2N O OH N H O N O O2N OH N H O N O O2N OH O N N H O2N O NO2 O N N H O2N O NO2 O O2N N N H O R BIC-1 BIC-66 BIC-4 BIC-69 BIC-8 BIC-18 BIC-17 BIC-22 BIC-65 JBI-7 BIC-68 BIC-64 JGL-1 JGL-6 BIC-10 BIC-9 JBI-9 JBI-8 BIC-3 BIC-2
19 O N N H N H NH O O2N NO2 O2N CH3COOH O N N H O2N O N N N OH OH N H N O O2N O N N H O S Br O2N O N N H S Br O O2N O N N H O O2N O N N H O O2N O O N N H O O O2N O N N H O2N NH N H O NO2 O2N R N H N O O2N BIC-6 X BIC-11 BIC-63 BIC-7 BIC-25 BIC-12 BIC-24 BIC-23 BIC-5
20 O N N H O N H O N O NO2 NO2 O O NO2 N N H O O N H N NO2 N N H O O N H N O O NO2 O2N N H O N H N O O N O NO2 NO2 NH N O O2N O N O N H N O NO2 O N N H N H N O O O O2N NO2 O O NO2 N N H R O N H O N O2N BIC-20 BIC-13 BIC-34 BIC-35 BIC-67 BIC-39
21 O2N N N H O O CH3 COOH COOH N H N S O2N COOH COOH N H N NO2 COOH COOH N H N O2N COOH COOH N H N O2N R N N H BIC-62 JGL-2 BIC-5 BIC-3 BIC-4
4 pav. Nitrobenzeno ir nitrotiofeno darinių struktūrinės formulės
Susintetintų junginių mikrobiologinis tyrimas buvo atliktas tiriant jų biologinį aktyvumą in
vitro šioms bakterijų ir grybelio kultūroms:
Staphylococcus aureus ATCC 25923
Enterococcus faecalis ATCC 29212
Escherichia coli ATCC 25922
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
Klebsiella pneumoniae ATCC 33499
Proteus mirabilis ATCC 12459
Bacillus subtilis ATCC 6633
Bacillus cereus ATCC 8035
22 Bakterijos S. aureus (gramteigiama), E. coli (gramneigiama), B. subtilis ir B. cereus (sudarančios sporas), K. pneumoniae (sudaranti kapsulę), P. mirabilis (šliaužianti) pasirinktos dėl skirtingų struktūrinių ypatumų, siekiant ištirti, kaip susintetinti junginiai veikia šiuos mikrobus. Be to, jie dažnai naudojami kaip standartiniai mikrobai, tiriant junginių priešmikrobinį aktyvumą.
P. aeruginosa yra atspari daugeliui antimikrobinių vaistų, o E. faecalis – vienas dažniausių
hospitalinių infekcijų sukėlėjų, be to, jis labai jautrus nitrofurantoino poveikiui [41], todėl naudinga nustatyti, ar susintetinti nauji nitrofurano dariniai yra aktyvūs prieš šias bakterijas. C. albicans – tai vienas dažniausių grybelinių infekcijų sukėlėjų ir taip pat dažnai naudojamas priešgrybelinio aktyvumo tyrimuose kaip standartinis grybelis.
Šios bakterijų ir grybelio kultūros buvo auginamos 5 ml talpos mėgintuvėliuose ant nuožulnaus Miulerio-Hintono agaro. Kas 7 dienas jos buvo persėjamos į šviežią Miulerio-Hintono agarą, laikomos šaldytuve (2–8 ºC temperatūroje).
Bakteriostatinės (fungistatinės) junginių koncentracijos nustatytos serijinio skiedimo būdu standžioje terpėje (Mueller-Hinton broth II, BBL, Cockeysville, JAV).
Etaloninių mikroorganizmų kultūrų paruošimas. Etaloninės bakterijų ir grybelio C. albicans
kultūros buvo auginamos 20–24 val. 35–37 ºC temperatūroje ant Miulerio-Hintono agaro. Mikrobų suspensija gaminama iš išaugintų mikrobų kultūrų fiziologiniame natrio chlorido (0,9 proc.) tirpale, standartizuojama McFarland standartiniu indikatoriumi, kuris matuoja mėgintuvėlyje esančios suspensijos drumstumą. Mikrobų suspensija laikoma standartizuota, kai indikatoriaus reikšmė lygi 0,5 (tai reiškia, kad 1 ml mikrobų suspensijos yra 1,5 × 108 mikrobų ląstelių).
Tiriamųjų junginių paruošimas mikrobiologiniam tyrimui. Pagrindiniai susintetintų junginių
tirpalai (10000 μg/ml) paruošti junginius tirpinant dimetilsulfokside (DMSO), kadangi dauguma naujų junginių yra blogai tirpūs kituose tirpikliuose. DMSO ir pats turi priešmikrobinį veikimą, todėl lygiagrečiai buvo atliekamas kontrolinis bandymas ir nustatyta koncentracija, kurioje jau nepasireiškia jo priešmikrobinis veikimas. Skiedžiant pagrindinį tiriamojo junginio tirpalą, buvo pagaminti mažesnių koncentracijų tirpalai (1; 10; 100; 1000 µg/ml). Atitinkamas kiekis praskiesto pagrindinio tiriamojo junginio tirpalo aseptinėmis sąlygomis buvo perkeliamas sterilia pipete į sterilų matavimo cilindrą, kuriame sumaišomas su išlydyta standžia Miulerio–Hintono terpe ir perkeliamas į Petri lėkštelę. Standartizuotos mikrobų kultūrų suspensijos kilpele po 0,1 ml buvo sėjamos ant sustingusios standžios terpės su atitinkama junginių koncentracija. Pasėtai mikrobų kultūrų suspensijai išdžiūvus, Petri lėkštelės dedamos į termokamerą parai laiko.
Kitą dieną vertinamas mikrobų augimas ir lyginamas su kontrole. Kontrolei mikrobų kultūros buvo sėtos ant standžios mitybinės terpės be tiriamosios medžiagos.
23 Tas mažiausias praskiedimas, kuriame mikrobai neauga, yra mažiausioji slopinančioji koncentracija (MSK), kurioje pasireiškė tiriamojo junginio bakteriostatinis veikimas.
Tirtų junginių MSK pateiktos 2 lentelėje.
2 lentelė. Antimikrobinio aktyvumo tyrimų rezultatai MSK, µg/ml Junginys S . au re u s A T C C 25923 E . fae cal is A T C C 29212 E . col i A T C C 25922 P . ae ru gi n os a A T C C 27853 K . pn eu m on iae A T C C 33499 P . m ir abi li s A T C C 12459 B . su bt il is A T C C 6633 B . ce re u s A T C C 8035 C . al bi can s A T C C 60193 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 BIC-1 25 25 50 >500 >500 100 25 25 500 BIC-2 25 >500 500 >500 >500 >500 25 5 >500 BIC-3 5 >500 >500 >500 >500 >500 25 25 500 BIC-4 5 5 25 >500 >500 >500 5 5 >500 BIC-5 >500 50 250 >500 >500 >500 50 >500 >500 BIC-6 5 5 100 >500 >500 >500 5 5 >500 BIC-7 >500 500 500 >500 >500 >500 125 500 250 BIC-8 5 5 100 >500 >500 >500 5 5 75 BIC-9 5 5 50 >500 >500 >500 25 25 >500 BIC-10 5 5 25 >500 >500 >500 5 5 500 BIC-11 25 25 50 >500 >500 500 25 50 100 BIC-12 5 5 25 >500 >500 500 5 1 50 BIC-13 5 5 100 >500 >500 >500 5 5 100 BIC-17 10 50 >500 >500 >500 >500 5 10 500 BIC-18 10 100 50 >500 >500 500 5 10 100 BIC-20 50 500 >500 >500 >500 >500 50 50 500 BIC-22 >500 >500 >500 >500 >500 >500 10 >500 >500 BIC-23 10 50 10 >500 >500 >500 1 10 >500 BIC-24 1 1 10 500 50 250 1 1 50 BIC-25 1 1 >500 >500 >500 >500 1 1 50 BIC-34 2 0,5 500 >500 >500 >500 0,5 2 >500 BIC-35 5 50 10 >500 >500 500 2 50 50 BIC-39 10 10 >500 >500 >500 >500 10 10 500 BIC-62 >500 >500 >500 >500 >500 >500 >500 >500 500 BIC-63 10 250 50 >500 >500 250 10 10 500
24 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 BIC-64 5 5 500 >500 >500 >500 1 5 500 BIC-65 10 50 50 >500 >500 >500 5 10 50 BIC-66 5 10 10 >500 50 50 5 10 50 BIC-67 10 10 5 50 50 50 10 10 500 BIC-68 10 50 50 >500 >500 >500 5 10 50 BIC-69 10 50 50 >500 >500 500 5 10 50 JGL-1 >500 >500 >500 >500 >500 >500 500 >500 >500 JGL-2 >250 >250 >250 >250 >250 >250 >250 >250 >250 JGL-3 >500 >500 >500 >500 >500 >500 >500 >500 >500 JGL-4 >500 >500 >500 >500 >500 >500 >500 >500 >500 JGL-5 >500 >500 >500 >500 >500 >500 >500 >500 >500 JGL-6 >500 >500 500 >500 >500 >500 50 250 >500 JBI-7 5 50 10 >500 >500 >500 2 10 10 JBI-8 5 50 50 >500 >500 >500 5 50 >500 JBI-9 10 5 10 >500 250 250 5 5 500 Nitrofuralis 25 100 100 >250 50 100 10 5 >250
2.3. Farmakokinetinių savybių ir toksiškumo prognozė, panaudojant
ADME/Tox Boxes programą
Junginių farmakokinetinių savybių bei toksiškumo prognozė atlikta naudojant ADME/Tox Boxes programą, kuri prognozuoja farmakokinetines savybes bei toksiškumą, remiantis junginio chemine struktūra. Šios programos prognozuojami bioprieinamumo, pasiskirstymo organizme, tirpumo parametrai ir fizikocheminės savybės, kuriomis remiasi Lipinskio penketo taisyklė, pateikti 3 lentelėje, o toksiškumo prognozės rezultatai pateikti 4 lentelėje.
3 lentelė. ADME savybių prognozės rezultatai.
Bioprieinamumas Pasiskirstymas Fizikocheminės savybės
Ju n gi n ys %F ( pe r os ) > 30% %F ( pe r os ) > 70% pe r P P B % V d ( l/ k g ) M H d on or as H ak ce p tor iu s logP Lan k sč ios ios ju gt ys T P S A logS 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 BIC-1 0,919 0,269 89,47 1,56 304,21 1 10 2,22 5 152,26 -3,65 BIC-2 0,819 0,269 90,67 1,63 304,21 1 10 2,47 5 152,26 -4,17 BIC-3 0,819 0,269 91,26 1,81 304,21 1 10 2,61 5 152,26 -4,12
25 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 BIC-4 0,950 0,799 70,82 1,38 274,23 3 8 1,53 4 129,45 -3,27 BIC-5 0,819 0,269 86,03 1,62 377,23 3 15 2,45 6 225,15 -4,15 BIC-6 0,465 0,170 93,74 1,96 417,29 3 15 3,08 8 225,15 -4,80 BIC-7 0,935 0,799 92,26 2,16 344,14 1 7 3,62 4 131,67 -3,88 BIC-8 0,935 0,799 90,24 2,07 338,11 1 7 3,37 4 103,43 -3,82 BIC-9 0,950 0,799 84,12 1,42 275,22 2 8 1,67 4 123,66 -3,12 BIC-10 0,950 0,799 90,98 1,47 301,25 2 8 1,86 5 123,66 -3,52 BIC-11 0,950 0,799 81,21 1,32 260,21 1 8 1,25 4 116,32 -3,35 BIC-12 0,950 0,799 63,00 1,56 265,26 1 7 2,28 6 103,43 -3,94 BIC-13 0,716 0,186 88,89 1,76 472,41 2 14 2,62 13 206,86 -5,09 BIC-17 0,950 0,799 85,68 1,98 293,66 1 7 3,13 4 103,43 -3,72 BIC-18 0,950 0,799 82,45 1,83 293,66 1 7 2,68 4 103,43 -3.69 BIC-20 0,716 0,109 99,22 1,97 440,32 2 14 2,97 8 206,86 -4.31 BIC-22 0,827 0,259 97,87 2,38 358,13 1 8 4,22 6 112,66 -4.45 BIC-23 0,950 0,799 68,80 1,45 249,18 1 8 1,82 4 116,57 -3.26 BIC-24 0,950 0,799 68,01 1,50 275,22 1 8 2,01 5 116,57 -3.77 BIC-25 0,884 0,432 94,06 2,24 370,18 1 7 3,81 5 131,67 -4.25 BIC-34 0,716 0,269 91,19 1,88 420,33 2 14 2,75 11 206,86 -4.83 BIC-35 0,716 0,269 99,60 0,68 420,33 2 14 3,65 10 206,86 -3.92 BIC-39 0,716 0,168 97,55 2,27 448,39 2 14 3,80 13 206,86 -5.18 BIC-62 0,663 0,324 94,52 2,14 299,28 1 7 3,57 6 99,52 -4.14 BIC-63 0,711 0,269 52,75 0,58 265,18 3 10 -0,03 4 152,60 -2.72 BIC-64 0,950 0,799 80,03 1,60 289,24 1 8 2,37 5 112,66 -3.79 BIC-65 0,950 0,799 75,28 1,59 277,21 1 7 2,34 4 103,43 -3.93 BIC-66 0,950 0,799 88,96 1,28 274,23 3 8 1,07 4 129,45 -3.12 BIC-67 0,716 0,109 99,49 1,97 441,31 2 15 2,96 8 219,75 -4.22 BIC-68 0,935 0,799 91,54 1,98 385,11 1 7 3,13 4 103,43 -3,90 BIC-69 0,950 0,799 86,72 1,85 338,11 1 7 2,73 4 103,43 -3.81 JGL-1 0,073 0,068 97,28 0,23 319,23 3 10 3,74 6 160,96 -2,90 JGL-2 0,063 0,044 99,32 0,28 335,29 3 9 5,00 6 176,06 -2,64 JGL-3 0,073 0,068 98,57 0,28 329,26 3 9 4,31 6 147,82 -3,54 JGL-4 0,073 0,068 98,58 0,28 329,26 3 9 4,31 6 147,82 -3,58 JGL-5 0,073 0,068 98,16 0,28 329,26 3 9 4,06 6 147,82 -3,12 JGL-6 0,950 0,799 94,16 0,23 275,22 2 8 2,71 5 123,66 -2,81 JBI-7 0,950 0,799 79,29 1,86 277,21 1 7 2,76 4 103,43 -3,95 JBI-8 0,950 0,799 89,04 1,03 275,22 2 8 2,56 4 123,66 -3,13 JBI-9 0,950 0,799 86,83 1,52 275,22 2 8 2,07 4 123,66 -3,08 Nitro-furalis 0,950 0,799 38,04 1,61 198,14 3 8 0,52 3 129,45 -3,16
26
4 lentelė. Toksiškumo prognozės rezultatai.
Poveikio sveikatai tikimybė
Junginys
Kraujas kraujagyslių Širdies ir sistema
Virškinimo
sistema Inkstai Kepenys Plaučiai
LD50 (mg/kg), paskyrus žiurkėms per os 1 2 3 4 5 6 7 8 BIC-1 0,53 0,28 0,50 0,51 0,44 0,79 830 BIC-2 0,53 0,28 0,50 0,51 0,44 0,79 530 BIC-3 0,53 0,28 0,50 0,51 0,44 0,79 750 BIC-4 0,33 0,21 0,33 0,52 0,52 0,64 790 BIC-5 0,91 0,21 0,90 0,61 0,95 0,85 350 BIC-6 0,93 0,17 0,90 0,71 0,98 0,99 440 BIC-7 0,17 0,19 0,12 0,50 0,29 0,91 810 BIC-8 0,27 0,21 0,28 0,58 0,47 0,75 940 BIC-9 0,30 0,20 0,42 0,47 0,44 0,61 800 BIC-10 0,57 0,16 0,42 0,57 0,61 0,69 500 BIC-11 0,35 0,19 0,40 0,43 0,41 0,55 230 BIC-12 0,62 0,22 0,36 0,34 0,61 0,92 1100 BIC-13 0,96 0,47 0,70 0,88 0,98 0,99 1400 BIC-17 0,36 0,20 0,42 0,53 0,48 0,72 870 BIC-18 0,36 0,20 0,42 0,53 0,48 0,72 660 BIC-20 0,82 0,05 0,84 0,74 0,92 0,97 2100 BIC-22 0,44 0,63 0,87 0,54 0,47 0,75 530 BIC-23 0,33 0,17 0,29 0,43 0,66 0,57 1400 BIC-24 0,62 0,15 0,29 0,54 0,78 0,85 1300 BIC-25 0,39 0,18 0,14 0,61 0,45 0,94 490 BIC-34 0,92 0,23 0,70 0,78 0,95 0,98 2600 BIC-35 0,75 0,04 0,46 0,79 0,96 0,78 2400 BIC-39 0,90 0,52 0,68 0,77 0,95 0,98 2700 BIC-62 0,30 0,27 0,91 0,43 0,23 0,33 1600 BIC-63 0,39 0,17 0,65 0,44 0,38 0,08 740 BIC-64 0,34 0,23 0,80 0,44 0,43 0,41 830 BIC-65 0,34 0,84 0,28 0,52 0,49 0,90 740 BIC-66 0,33 0,21 0,33 0,52 0,52 0,64 610 BIC-67 0,85 0,05 0,89 0,74 0,92 0,96 400 BIC-68 0,37 0,69 0,30 0,42 0,64 0,75 540 BIC-69 0,27 0,21 0,28 0,58 0,47 0,75 1000 JGL-1 0,40 0,07 0,49 0,46 0,46 0,36 560 JGL-2 0,26 0,07 0,29 0,64 0,41 0,32 710
27 1 2 3 4 5 6 7 8 JGL-3 0,38 0,09 0,53 0,18 0,26 0,32 1300 JGL-4 0,38 0,09 0,53 0,23 0,26 0,32 840 JGL-5 0,38 0,09 0,53 0,22 0,26 0,32 1000 JGL-6 0,46 0,20 0,45 0,24 0,44 0,51 490 JBI-7 0,34 0,84 0,28 0,52 0,49 0,90 980 JBI-8 0,30 0,20 0,55 0,47 0,44 0,75 1000 JBI-9 0,30 0,20 0,42 0,47 0,44 0,75 800 Nitrofuralis 0,37 0,23 0,40 0,31 0,45 0,65 860
28
3. REZULTATŲ APTARIMAS
3.1. Nitrofurano darinių antimikrobinis aktyvumas
Panaudojus PASS programą nustatyta, kad galimas antibakterinis ir priešgrybelinis aktyvumas yra prognozuojamas visiems tiriamiems junginiams (1 lentelė). Net 22 junginiams prognozuotas antibakterinis, o 24 junginiams – priešgrybelinis aktyvumas su didesnė nei 0,5 tikimybe (5 pav.). Be to, didesnė nei nitrofuraliui antibakterinio aktyvumo tikimybė buvo prognozuojama 25 junginiams, o didesnė priešgrybelinio aktyvumo tikimybė – net 36 junginiams. Tai leido mums iš anksto tikėtis, kad visi junginiai bus aktyvūs in vitro prieš tirtus mikroorganizmus. Svarbu pastebėti, kad visiems junginiams PASS programa prognozuoja prieštuberkuliozinį aktyvumą (Pa>0,7), todėl reikėtų jį ištirti eksperimentiškai.
0 10 20 30 40 50 J u n g in ių s k a ič iu s Antibakterinis aktyvumas 40 39 35 22 1 Priešgrybelinis aktyvumas 40 38 35 24 6
Pa>Pi Pa>0,3 Pa>0,4 Pa>0,5 Pa>0,6
5 pav. Junginių antibakterinio ir priešgrybelinio aktyvumo tikimybės prognozė
5 lentelėje pateiktos junginių, kuriems buvo prognozuota didesnė nei 0,6 priešgrybelinio aktyvumo tikimybė, struktūrinės formulės. Tik vienam junginiui prognozuotas antibakterinis aktyvumas su didesne nei 0,6 aktyvumo tikimybe, jo struktūrinė formulė pateikta 6 paveiksle. Įdomu tai, kad šių junginių struktūros yra gana skirtingos: vienas jų yra bisdarinys (BIC-13), kitas vietoj nitrofurano ciklo turi nitrotiofeno liekaną (JGL-2), o likusieji junginiai turi skirtingus pakaitus šoninėje grandinėlėje (pakeistą fenilo, furanilo, pakeistą tiofenilo arba net alifatinį pakaitą).
29
5 lentelė. Junginiai, kuriems priešgrybelinis aktyvumas prognozuotas su didesne nei 0,6 tikimybe
Junginys Struktūra Pa Pi BIC-10 O N N H O OH O2N 0,673 0,009 BIC-13 O O NO2 N N H O O N H N NO2 0,656 0,011 BIC-12 O N N H O O2N 0,633 0,013 JGL-2 COOH COOH N H N S O2N 0,632 0,013 BIC-24 O N N H O O2N O 0,615 0,015 JBI-8 O N N H O2N O Br 0,601 0,016 O N N H S Br O O2N
6 pav. Junginys BIC-25, kuriam antibakterinio aktyvumo tikimybė prognozuota su didesne nei 0,6 tikimybe (Pa=0,610, Pi=0,007)
Nors kai kuriems junginiams antibakterinio ir priešgrybelinio aktyvumo tikimybė prognozuota nedidelė, tačiau buvo nuspręsta visus junginius tirti in vitro, taip įvertinant, ar eksperimentinis tyrimas patvirtins išankstinę prognozę.
Atlikus tyrimus in vitro, pastebėta, kad junginių aktyvumas prieš įvairius mikroorganizmus skyrėsi: tas pats junginys įvairiai veikė skirtingas bakterijas ir grybelį. Nagrinėjant aktyvumą prieš
30 atskirus mikroorganizmus, matyti, kad mažesnėmis koncentracijomis tirti junginiai veikė S. aureus,
E. faecalis, E. coli, B. subtilis, B. cereus, o bakterijų P. aeruginosa, K. pneumoniae ir P. mirabilis
augimą slopino tik labai didelės daugelio tirtų junginių koncentracijos (≥500 μg/ml).
Tie junginiai, kuriems PASS programa prognozavo didžiausią antibakterinį aktyvumą, buvo vieni aktyviausių prieš tirtas bakterijas S. aureus, E. faecalis, E. coli, B. subtilis ir B. cereus. Pavyzdžiui, junginys BIC-25, kuriam prognozuota pati didžiausia antibakterinio aktyvumo tikimybė, buvo 1-2 vietoje pagal aktyvumą in vitro prieš S. aureus, E. faecalis, B. subtilis ir B. cereus. Praktiškai visi junginiai, išskyrus BIC-24, BIC-66 ir BIC-67, buvo neaktyvūs prieš P. aeruginosa, K. pneumoniae ir P. mirabilis, todėl vertinti aktyvumo prieš šias bakterijas prognozės rezultatų negalima. Taigi antibakterinio aktyvumo prognozė gana gerai pasitvirtina ir yra naudinga.
Priešgrybelinio aktyvumo prognozė nebuvo tokia tiksli. Pavyzdžiui, junginys BIC-10, kuris turėtų būti aktyviausias prieš grybelius iš tirtų junginių, tik labai didele koncentracija (MSK = 500 µg/ml) slopino C. albicans augimą. Taip pat nebuvo labai aktyvūs ir junginiai BIC-13, JGL-2 ir JBI-8 (MSK ≥ 100 µg/ml). Kiti du junginiai – BIC-12 ir BIC-24 – nebuvo patys aktyviausi prieš C. albicans, tačiau už juos aktyvesnis buvo tik vienas junginys – JBI-7 (MSK = 10 µg/ml). Svarbu pastebėti, kad šiam junginiui prognozuota taip pat gana didelė priešgrybelinio aktyvumo tikimybė (Pa = 0,523). Priešgrybelinio aktyvumo prognozę tikslingiau naudoti atmetant neperspektyvius junginius, kadangi programos prognozės rezultatai gana gerai koreliavo lyginant neaktyviausių junginių priešgrybelinį poveikį in vitro su prognozės duomenimis. Antai, junginiai BIC-6, BIC-7, BIC-5, BIC-63, JGL-5, kuriems prognozuotos labai nedidelės priešgrybelinio aktyvumo tikimybės (0,172 < Pa < 0,398), nebuvo aktyvūs in vitro prieš C. albicans.
Vertinant atskirų aktyviausių junginių tyrimo rezultatus, reikia paminėti, kad vienas aktyviausių junginių yra BIC-34 – nitrofurano bisdarinys. Jis turi didžiausią aktyvumą prieš S. aureus (MSK 2 μg/ml), E. faecalis (MSK 0,5 μg/ml) ir B. subtilis (MSK 0,5 μg/ml). Šis junginys taip pat gana aktyvus ir prieš B. cereus (MSK 2 μg/ml), tačiau E. coli augimą slopina tik esant 500 μg/ml koncentracijai, o kitų bakterijų ir grybelio C. albicans visai neveikė.
Bakterijos E. coli augimą labiausiai slopino net keli junginiai: BIC-23, BIC-24, BIC-35, BIC-66, BIC-67 ir JBI-9. Jų MSK (5-10 μg/ml) yra daugiau nei 25 kartus mažesnė už nitrofuralio ir panaši kaip šiandien vartojamų priešmikrobinių vaistų (pvz., aminopenicilinų MSK prieš E. coli yra 1,25-12,5 μg/ml).
Bakterijos P. aeruginosa augimą geriausiai slopino junginys BIC-67 – nitrofurano bisdarinys, turintis pakeistą piridino liekaną (MSK = 50 μg/ml). Visi kiti junginiai buvo gana neaktyvūs prieš
P. aeruginosa, nitrofuralis šios bakterijos taip pat neveikė. Gauti rezultatai patvirtina kitų mokslininkų
išvadą, kad P. aeruginosa paprastai būna atspari nitrofurano dariniams [16].
Prieš K. pneumoniae aktyvūs buvo tik keli junginiai BIC-24, BIC-66 ir BIC-67, ir jų aktyvumas buvo toks pats kaip ir nitrofuralio (MSK 50 μg/ml). Bakterijos P. mirabilis augimą
31 junginiai BIC-66 ir BIC-67 slopina du kartus mažesnėmis koncentracijomis nei nitrofuralis, o visi kiti junginiai 2,5 karto ir didesnėmis koncentracijomis.
Trečdalis tirtų junginių B. cereus veikia aktyviau arba taip pat kaip nitrofuralis (1-5 μg/ml), o daugiau nei pusė junginių buvo aktyvesni už nitrofuralį prieš B. subtilis (jų MSK yra 0,5-5 μg/ml).
Įdomu tai, kad net 12 junginių grybelį C. albicans veikė mažesnėmis koncentracijomis nei nitrofuralis, o junginio JBI-7 MSK yra 10 μg/ml. Visų šių junginių struktūroje yra nitrofurano liekana, o daugelis turi halogeno pakaitą.
Siekdami išsamiau panagrinėti nitrofurano darinių struktūros ir aktyvumo ryšį, junginius suskirstėme į atskiras grupes, o jų aktyvumo prieš kiekvieną mikroorganizmą rezultatus pateikėme atskiruose paveiksluose. Tais atvejais, kai nustatyta MSK yra didesnės nei 500 μg/ml, dėl grafinių vaizdavimų patogumo jos pažymėtos 501 μg/ml, t. y. pasirenkama artimiausia didesnė galima koncentracija.
Taigi struktūros-aktyvumo analizė atlikta keliomis kryptimis: 1. Junginių aktyvumas įvertintas prieš atskirus mikroorganizmus.
2. Įvertintas aktyvumas atskirose grupėse pagal junginių cheminę struktūrą.
Junginių aktyvumas prieš atskirus mikroorganizmus.
0 100 200 300 400 500 600 B IC -1 B IC -2 B IC -3 B IC -6 6 B IC -4 J B I-8 J B I-9 B IC -9 B IC -1 0 B IC -6 9 B IC -8 B IC -1 8 B IC -1 7 B IC -2 2 B IC -6 5 J B I-7 B IC -6 8 B IC -6 4 J G L -1 J G L -6 B IC -6 3 B IC -1 1 B IC -6 7 B IC -7 B IC -2 5 B IC -2 3 B IC -2 4 B IC -5 B IC -6 B IC -1 2 B IC -2 0 B IC -1 3 B IC -3 4 B IC -3 9 B IC -3 5 B IC -6 2 J G L -2 J G L -3 J G L -4 J G L -5 N it ro fu ra li s Junginys M S K , μ g /m l
7 pav. Tirtų junginių antibakterinis aktyvumas prieš S. aureus (geltona spalva pavaizduoti junginiai, turintys pakeistą fenilo pakaitą; žalia – heterociklo arba alifatinį pakaitą; mėlyna – bisdariniai; ruda – nitrobenzeno ir nitrotiofeno dariniai)
32 Iš 7 paveikslo matyti, kad dauguma tirtų nitrofurano darinių yra gana aktyvūs prieš S. aureus. Daugiau nei pusė junginių yra aktyvesni už nitrofuralį, šią bakteriją jie slopino 1-10 µg/ml koncentracijomis. Praktiškai visi bisdariniai buvo aktyvesni prieš S. aureus nei nitrofuralis (tik junginys BIC-20, kurio molekulėje dvi grandinės sujungtos per benzeno ciklo liekaną, buvo 2 kartus mažiau aktyvus už nitrofuralį). Nitrobenzeno ir nitrotiofeno dariniai aktyvumo prieš S. aureus neturėjo. 0 100 200 300 400 500 600 B IC -1 B IC -2 B IC -3 B IC -6 6 B IC -4 J B I-8 J B I-9 B IC -9 B IC -1 0 B IC -6 9 B IC -8 B IC -1 8 B IC -1 7 B IC -2 2 B IC -6 5 J B I-7 B IC -6 8 B IC -6 4 J G L -1 J G L -6 B IC -6 3 B IC -1 1 B IC -6 7 B IC -7 B IC -2 5 B IC -2 3 B IC -2 4 B IC -5 B IC -6 B IC -1 2 B IC -2 0 B IC -1 3 B IC -3 4 B IC -3 9 B IC -3 5 B IC -6 2 J G L -2 J G L -3 J G L -4 J G L -5 N it ro fu ra li s Junginys M S K , μ g /m l
8 pav. Tirtų junginių antibakterinis aktyvumas prieš E. faecalis (geltona spalva pavaizduoti junginiai, turintys pakeistą fenilo pakaitą; žalia – heterociklo arba alifatinį pakaitą; mėlyna – bisdariniai; ruda – nitrobenzeno ir nitrotiofeno dariniai)
Daugelis tirtų junginių, kaip ir nitrofuralis, buvo mažiau aktyvūs prieš E. faecalis, nei prieš
S. aureus (8 pav.). Pažymėtina, kad net 26 junginiai E. faecalis veikė mažesnėmis koncentracijomis
(1-50 µg/ml) nei nitrofuralis. Beje, nitrobenzeno ir nitrotiofeno dariniai nebuvo aktyvūs prieš šią bakteriją. Aktyviausiai E. faecalis augimą slopinančių junginių buvo tarp hidroksi arba amino grupę fenilo cikle turinčių nitrofurano darinių ir tarp papildomą dvigubą jungtį šoninėje grandinėlėje turinčių junginių.
33 Stipriau už nitrofuralį E. coli augimą slopinančių junginių buvo visose nitrofurano darinių grupėse (9 pav.). Daugiau nei pusė tirtų junginių šios bakterijos augimą slopino mažesne ar tokia pačia koncentracija kaip ir nitrofuralis (100 µg/ml). Tik vienas junginys iš bisdarinių grupės, savo struktūroje turintis propilo liekaną, aktyviau už nitrofuralį veikė E. coli. Pats aktyviausias junginys prieš E. coli buvo BIC-67, kurio MSK = 5 µg/ml. Nitrobenzeno ir nitrotiofeno dariniai neslopino ir šios bakterijos augimo.
0 100 200 300 400 500 600 B IC -1 B IC -2 B IC -3 B IC -66 B IC -4 J B I-8 J B I-9 B IC -9 B IC -10 B IC -69 B IC -8 B IC -18 B IC -17 B IC -22 B IC -65 J B I-7 B IC -68 B IC -64 J G L-1 J G L-6 B IC -63 B IC -11 B IC -67 B IC -7 B IC -25 B IC -23 B IC -24 B IC -5 B IC -6 B IC -12 B IC -20 B IC -13 B IC -34 B IC -39 B IC -35 B IC -62 J G L-2 J G L-3 J G L-4 J G L-5 N it rof ur al is Junginys M S K , μ g /m l
9 pav. Tirtų junginių antibakterinis aktyvumas prieš E. coli (geltona spalva pavaizduoti junginiai, turintys pakeistą fenilo pakaitą; žalia – heterociklo arba alifatinį pakaitą; mėlyna – bisdariniai; ruda – nitrobenzeno ir nitrotiofeno dariniai)
P. aeruginosa augimo neslopino beveik visi tirti junginiai (10 pav.). Tik piridino liekaną savo
struktūroje turintis junginys BIC-67 (jis taip pat yra ir bisjunginys) buvo aktyvus prieš šią bakteriją (MSK = 50 µg/ml). Nitrofuralis taip pat nebuvo aktyvus prieš P. aeruginosa, net esant didžiausiai tirtai koncentracijai. Tai leidžia manyti, kad ieškant antimikrobinių junginių nuo P. aeruginosa sukeltų infekcijų, netikslinga pasirinkti nitrofurano darinius kaip potencialius antipseudomoninius vaistus, arba reikėtų atlikti visiškai kitokias molekulės modifikacijas, į struktūrą įjungiant skirtingus pakaitus.
34 0 100 200 300 400 500 600 B IC -1 B IC -2 B IC -3 B IC -6 6 B IC -4 J B I-8 J B I-9 B IC -9 B IC -1 0 B IC -6 9 B IC -8 B IC -1 8 B IC -1 7 B IC -2 2 B IC -6 5 J B I-7 B IC -6 8 B IC -6 4 J G L -1 J G L -6 B IC -6 3 B IC -1 1 B IC -6 7 B IC -7 B IC -2 5 B IC -2 3 B IC -2 4 B IC -5 B IC -6 B IC -1 2 B IC -2 0 B IC -1 3 B IC -3 4 B IC -3 9 B IC -3 5 B IC -6 2 J G L -2 J G L -3 J G L -4 J G L -5 N it ro fu ra li s Junginys M S K , μ g /m l
10 pav. Tirtų junginių antibakterinis aktyvumas prieš P. aeruginosa (geltona spalva pavaizduoti junginiai, turintys pakeistą fenilo pakaitą; žalia – heterociklo arba alifatinį pakaitą; mėlyna – bisdariniai; ruda – nitrobenzeno ir nitrotiofeno dariniai)
Tirti junginiai šiek tiek geriau veikė K. pneumoniae nei P. aeruginosa (11 pav.). Pažymėtina, kad nei vienas iš jų nebuvo aktyvesnis už nitrofuralį. Tomis pačiomis koncentracijomis kaip ir nitrofuralis (50 µg/ml) K. pneumoniae augimą slopino nitrofurano darinys, struktūroje turintis aminofenilo liekaną, ir du junginiai, molekulėje turintys heterociklo liekaną: BIC-67 yra bisdarinys ir turi piridino liekaną, o BIC-24 šoninėje grandinėlėje turi furano ciklą ir papildomą dvigubą jungtį.
0 100 200 300 400 500 600 B IC -1 B IC -2 B IC -3 B IC -6 6 B IC -4 J B I-8 J B I-9 B IC -9 B IC -1 0 B IC -6 9 B IC -8 B IC -1 8 B IC -1 7 B IC -2 2 B IC -6 5 J B I-7 B IC -6 8 B IC -6 4 J G L -1 J G L -6 B IC -6 3 B IC -1 1 B IC -6 7 B IC -7 B IC -2 5 B IC -2 3 B IC -2 4 B IC -5 B IC -6 B IC -1 2 B IC -2 0 B IC -1 3 B IC -3 4 B IC -3 9 B IC -3 5 B IC -6 2 J G L -2 J G L -3 J G L -4 J G L -5 N it ro fu ra li s Junginys M S K , μ g /m l
11 pav. Tirtų junginių antibakterinis aktyvumas prieš K. pneumoniae (geltona spalva pavaizduoti junginiai, turintys pakeistą fenilo pakaitą; žalia – heterociklo arba alifatinį pakaitą; mėlyna – bisdariniai; ruda – nitrobenzeno ir nitrotiofeno dariniai)
