3-AMINO-2-TIOKSO-TIAZOLIDIN-4-ONO DARINIŲ SINTEZĖ IR JŲ ANTIMIKROBINIO POVEIKIO ĮVERTINIMAS

FARMACIJOS FAKULTETAS

VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA

VADIM SMETANIN

3-AMINO-2-TIOKSO-TIAZOLIDIN-4-ONO DARINIŲ SINTEZĖ

IR JŲ ANTIMIKROBINIO POVEIKIO ĮVERTINIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas:

Prof. dr. Hiliaras Rodovičius

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

FARMACIJOS FAKULTETAS

VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanas Prof. dr. Vitalis Briedis

Data

3-AMINO-2-TIOKSO-TIAZOLIDIN-4-ONO DARINIŲ SINTEZĖ

IR JŲ ANTIMIKROBINIO POVEIKIO ĮVERTINIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas

Prof. dr. Hiliaras Rodovičius

Data

Recenzentas

Darbą atliko

Magistrantas Vadim Smetanin

Data

Data

TURINYS

SANTRAUKA ... 5

SUMMARY ... 6

1. ĮVADAS ... 7

2. DARBO TIKSLAI IR UŽDAVINIAI ... 8

3. LITERATŪROS APŽVALGA ... 8

3.1. Antimikrobinių vaistų svarba, rezistentiškumas ... 8

3.2. Rodaninas, 4-tiazolidinono dariniai ... 12

3.3. Rodanino, 4-tiazolidinono darinių farmakologinis ir biologinis poveikis ... 12

3.4. Šifo bazės ... 14

3.5. Azetidinai, beta-laktamai ... 14

4. TYRIMŲ METODIKA IR REZULTATAI ... 15

4.1. 3-amino-2-tiokso-tiazolidin-4-ono darinių sintezė ir gryninimas ... 15

4.2. Lydymosi temperatūros nustatymas ... 22

4.3. Junginių grynumo nustatymas naudojant ESC ... 23

4.4. Junginių UV-Vis absorbcijos maksimumų nustatymas ... 24

4.5. Junginių struktūros nustatymas naudojant FT-IR ... 24

4.6. PASS online junginių antimikrobinio aktyvumo įvertinimas ... 26

4.7. Antimikrobinių savybių tyrimas in vitro ... 28

5. REZULTATŲ APTARIMAS ... 32

5.1. In silico antimikrobinių tyrimų rezultatai ... 32

5.2. In vitro antimikrobinio tyrimo rezultatai ... 33

5.3. In silico junginių žalingumo analizė ... 34

6. IŠVADOS ... 35

7. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS. ... 35

8. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 37

SANTRUMPOS

B. cereus – Bacillus cereus B. subtilis – Bacillus subtilis C. albicans – Candida albicans

DMSO – dimetilsulfoksidas

E. coli – Escherichia coli

FTIR – Fourier transform infrared spectroscopy ESC – efektyvioji skysčių chromatografija

K. pneumoniae – Klebsiella pneumoniae P. aeruginosa – Pseudomonas aeruginosa P. mirabilis – Proteus mirabilis

PASS – Prediction of Activity Spectra for Substances Rodaninas – 2-tiokso-tiazolidin-4-onas

S. aureus – Staphylococcus aureus

SANTRAUKA

3-amino-2-tiokso-tizolidin-4-ono darinių sintezė ir jų antimikrobinio poveikio įvertinimas.

FF V kurso 1-os grupės studento Vadimo Smetanino magistro baigiamasis darbas. Mokslinis vadovas prof. dr. Hiliaras Rodovičius. Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Medicinos akademija, Farmacijos fakultetas, Vaistų chemijos katedra. Kaunas, 2014.

Darbo tikslas: susintetinti 3-amino rodanino pagrindą turinčius junginius ir nustatyti jų

antimikrobinį aktyvumą.

Uždaviniai: 1) Sintezuoti 3-amiono-2-tiokso-4-tiazolidinono darinius; 2) Įvertinti gautų

junginių antimikrobinį aktyvumą, naudojant in silico PASS online. 3) Įvertinti gautų junginių antimikrobinį aktyvumą in vitro standžioje terpėje; 4) Susieti junginių struktūrą su antimikrobiniu aktyvumu.

Tyrimo metodai: sintetintų junginių antimikrobinis poveikis buvo prognozuojamas „PASS

online“ programos pagalba. Antimikrobinis aktyvumas tirtas in vitro, naudojant Miulerio – Hintono agarą. Atlikti ESC tyrimai junginių grynumui nustatyti ir FT-IR tyrimai junginių struktūrai patvirtinti.

Tyrimo rezultatai: 3-aminorodanino pagrindu buvo sintetinti 7 junginiai, turintys Šifo bazės

struktūrą ir 1 turintis azetidino funkcinę grupę. Atlikti junginių lydymosi temperatūros nustatymo tyrimai, grynumas nustatytas naudojant ESC, junginių struktūra patvirtinta naudojant FTIR metodiką. PASS online programos pagalba buvo nustatyta, kad dauguma junginių turį potencialų antimikrobinį poveikį. Antimikrobinio poveikio in vitro tyrimo metu buvo nustatyta, kad plačiausią poveikį turi junginys VS-3, turintis p-chlorbenzaldehido pakaitą, ir VS-2, turintis p-brombenzaldehido pakaitą. Taip pat nustatyta, kad ribotu antimikrobiniu aktyvumu pasižymėjo junginiai VS-6, VS-7, VS-8. Įterpus azetidino struktūrą į VS-1 junginį, aktyvumas padidėjo Candida grybelių atžvilgiu.

Išvados: iš sintetintų junginių plačiausiu antimikrobiniu poveikiu pasižymėjo

3-[(4-chlorofenil)metilenamino]-2-tiokso-tiazolidin-4-onas ir 3-[(4-bromfenil)metilenamino]-2-tiokso-tiazolidin-4-onas.

SUMMARY

Synthesis of 3-amino-2-thioxo-thiazolidin-4-one derivatives and evaluation of antimicrobial activity.

Vadim Smetanin Master's Thesis. Scientific supervisor: Prof. Dr. Hiliaras Rodovičius, Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, Department of Drug Chemistry. Kaunas, 2014.

The aim of the research: Synthesis of 3-aminorhodanine derivatives, antimicrobial

evaluation.

Methods: Antimicrobial activity of synthesized 3-aminorhodanine derivatives was predicted

with the help of PASS online program. Factual antimicrobial activity of compounds was determined using in vitro agar method. The purity and structure of compounds was analyzed with ESC and FT-IR methods accordingly.

Results: 7 Schiff base derivatives and one azetidine compound were synthesized on the base

of 3-aminorhodonine. The melting points were identified, the purity of compounds were determined using ESC, the compound structure was identified using FTIR. Analyzing the compounds with PASS online showed that most of the compounds possess the potential of antimicrobial activity. In vitro antimicrobial studies showed that the widest spectrum of activity was possessed by compound VS-3, which had the 4-chlorbenzaldehyde moiety, and VS-2 with 4-bromobenzaldehyde moiety. Compounds VS-6, VS-7 and VS-8 showed limited antimicrobial activity. Modifying VS-1 structure by adding an azotidine moiety increased the drugs effect on Candida fungi family.

Conclusion: amongst all the synthesized compounds

3-(4-chlorophenyl)methyleneamino]-2-thioxo-thiazolidin-4-one and 3-(4-bromphenyl)methyleneamino]-2-3-(4-chlorophenyl)methyleneamino]-2-thioxo-thiazolidin-4-one showed most antimicrobial promise.

1. ĮVADAS

Patys pirmieji klinikinėje praktikoje antibiotikai turėjo drastišką poveikį infekcinių ligų gydyme. Injekcinio sulfanilamido atradimas sumažino ūmino meningokoko sukelto meningito mirties atvejų tikimybę – nuo 70 – 90 % iki 10 %. Per pastaruosius 60 metų antibiotikai turėjo didžiulį vaidmenį infekcinių ligų, sukeltų bakterijų arba kitų mikroorganizmų, gydime. Antimikrobinė chemoterapija buvo svarbiausias įtakojantis faktorius dvidešimtojo amžiaus vidutinės gyvenimo trukmės augimui [14].

Šiais laikais 70 % sukėlėjų visų infekcijų, įgytų lygininėje yra atsparūs bent vienam antibiotikui iš dažniausiai vartojamų jų gydymui. Kai kuriais atvejais sutinkami mikroorganizmai atsparūs visiems plačiai naudojamiems antibiotikams, tokiais atvejais tenka gydyti infekciją dar tik tiriamais arba toksiškais vaistais [11, 15]. Pastaruoju laiku atsirado nerimą kelianti tendencija – yra pastebėta, kad dažnėja infekcinių susirgimų, sukeltų visuomenėje įgytą atsparumą turinčių mikroorganizmų. Tokių mikroorganizmų pavyzdžiu gali būti stafilakokai Streptococcus pneumoniae, dažni ligų sukėlėjai, didinantys mirštamumą. Tyrime buvo nustatyta kad 25 % Streptococcus

pneumoniae sukeltų infekcijų buvo atsparios penicilinui ir dar papildomi 25 % atvejų turėjo atsparumą

daugiau negu vienam antibiotikui [16].

Jungtinių Amerikos Valstijų CDC (Centern of desease control and prevention) teigia kad kovoje su besivystančiu mikroorganizmų atsparumu yra 4 sudedamosios dalys [11]:

1. infekcinių susirgimų ir rezistentiškų plitimo prevencija; 2. rezistentiškų bakterijų stebėjimas;

3. šiuo metu esančių antibiotikų naudojimo optimizavimas;

4. naujų diagnostikos ir antimikrobinių preparatų plėtros skatinimas.

Šiuo metu yra didelis naujų antimikrobinių vaistų įvedimo į rinką poreikis. Vienas iš svarbiausių ribojančių faktorių naujų vaistų įvedimo į rinką yra finansiniai sunkumai – plataus veikimo antibiotikai greitai sukelia rezistentiškumą, kitą vertus, antibiotikas turintis siaurą pritaikymą gali išlikti naudingais rinkoje, tačiau suteiks mažesnį pelną [14].

Šį poreikį dar labiau pagrindžia vis didėjantis antibiotikams atsparumą turinčių padermių skaičius ir paplitimas. Yra nuomonių kad jei situacija nepagerės žmonija gali netekti savo galimybių gydyti infekcines ligas. Nepaisant to, kad šiuo metu yra vykdoma keleto naujų antimikrobinių preparatų plėtra, to kiekio nepakanka tam kad atitikti porikį. Taip pat verta psatebėti kad per

pastaruosius 20 metu nebuvo atrasta nei viena naujųjų antibiotikų grupė. Visi naujai įvesti antibiotikai yra senesnių grupių modifikuoti dariniai, tai skatina lengvesnį atsparumo atsiradimą [46].

Šio darbo tikslas yra susintetinti 3-aminorodanino pagrindą turinčius junginius ir nustatyti jų antimikrobinį aktyvumą, tokiu būdu potencialiai sukurti naują, veiksmingą antimikrobinį preparatą.

2. DARBO TIKSLAI IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas: susintetinti 3-amino rodanino pagrindą turinčius junginius ir nustatyti jų

antimikrobinį aktyvumą.

Uždaviniai:

1) Sintezuoti 3-amiono-2-tiokso-4-tiazolidinono darinius;

2) Įvertinti gautų junginių antimikrobinį aktyvumą, naudojant in silico PASS online. 3) Įvertinti gautų junginių antimikrobinį aktyvumą in vitro standžioje terpėje.

4) Susieti junginių struktūrą su antimikrobiniu aktyvumu.

3. LITERATŪROS APŽVALGA

3.1. Antimikrobinių vaistų svarba, rezistentiškumas

Šiuo metu pasaulyje yra didelė proporcija atsparumo antibiotikams tarp bakterijų, kuris sukelia dažnai pasitaikančius susirgimus (šlapimo sistemos infekcijas, pneumoniją, širdies ir kraujagyslių sistemos infekcijas). Didelė dalis ligoninėje įgytų infekcijų yra sukeltos didelį atsparumą turinčių bakterijų, tokių kaip meticilinui atsparus Staphylococcus aureus arba keliems vaistams atspari gramneigiama bakterija [9]. 2014 metais Amerikoje atlikta retrospektinė infekcijų analizė parodė, kad

Staphylococcus aureus sudaro didžiausią dalį visų rezistentiškų infekcijų – 41,2 %, po jų seka

enterkokai (24,3 %), Pseudomonas aeruginosa (20,2 %), Streptococcus pneumoniae (16,6 %),

Acinetobacter baumannii (10,0 %), ir Klebsiella pneumoniae (9,9 %). Taip pat buvo nustatyti

didžiausią įtaką turintys rizikos veiksniai: gyvenimas globos namuose, senyvas amžius, onkologinės ligos buvimas, prieš tai jau buvęs guldymas į ligoninę, jaunas amžius būdingas labiausiai S.

pneumoniae. Dažniausiai pasitaikanti infekcija – šlapimo takų infekcija (57 %) [12]. Nesėkmingas

yra aptiktas jau 10 šalių. Yra tikimybė kad gonorėja gali tapti nepagydoma liga todėl, kad šiuo metu nėra ieškoma nei vakcinų, nei naujų vaistų gydyti šia liga sergančius ligonius [9].

Peter M. Hawkey ir Annie M. Jones savo straipsnyje „The changing epidemiology of resistance“ pateikia sekančią informaciją: antibiotinio rezistentiškumo atsiradimas yra problema siejanti visą pasaulį. Naujai atsiradusiu rezistentiškų mikroorganizmų paplitimas yra dažnas reiškinys. Šių padermių plitimo vektorius dažniausiai yra žmogus. Lokalizuotas daugeliui antibiotikų atsparių mikroorganizmų atsiradimas, skatinamas netaisyklingo vaistų vartojimo, yra labai svarbus faktorius atsižvelgiant į horizontalaus genų perdavimo tarp padermių ir net šeimų galimybę. β-Laktamazės gamyba yra labiausiai paplitęs tarp gramneigiamų bakterijų atsparumo pavyzdys kas kartu su pastoviai stebimomis mutacijomis pabrėžia mikroorganizmų sugebėjimą prisitaikyti ir tobulintis esant pastoviam antimikrobinių vaistų poveikiui. Daugelis Enterobacteriaceae šeimos atstovų šiuo metu jau turi plataus veikimo β-laktamazes, tokios kaip CTX-M taip pat svarbu pabrėžti, kad specifiniai genotipai yra siejami su tam tikrais geografiniais regionas, kas reiškia kad šios mutacijos yra kryptingos ir nesusietos. Šios klasės fermentų paplitimas smarkai sumažino netgi kelių betalaktamo klasės antibiotikų klinikinio pritaikomumo galimybes. Vis labiau plintant tarp bakterijų blaKPC genui karbapenemai gali netekti savo pritaikymo klinikinėje praktikoje. Stiprus rezistentiškumas fluorchinolonams (pagrinde sukeltas gyrA mutacijų) taip pat buvo susietas su CTX-M ir CMY-tipo fermentais, kurių genetinis kodas yra aptiktas plazmidėse. Atsparumo atsiradimas ir jo besivystymas tarp gramteigiamų bakterijų taip pat yra plačiai stelbiamas. Vienas svarbiausių ir pavojingiausių gramteigiamų mikroorganizmų artimiausiu laiku taps S. aureus turintis atsparumą meticilinui [44].

Gramneigiamų mikroorganizmų atsparumo didėjimas vyksta pagrinde dėka mobiliųjų genų – plazmidžių, kurios lengvai gali keliauti bakterijų populiacijose. Plazmidžių tipų nustatymas ir rūšiavimas išplečia mūsų supratimą apie tam tikrų mikroorganizmų padermių paplitimą pasaulyje. Viena iš priežasčių tokio plataus rezistentiškumo paplitimo pasaulyje yra tai kad infekcijos vektorius – žmogus - dėka šiuolaikinių technologijų įgavo iki šiol nematyta mobilumą. Toks rezistentiškumo plitimas yra sunkiai aptinkamas nes žmogus gali būti visą gyvenimą nešiotoju be infekcijos pasireiškimo. Plataus veikimo spektro beta-laktamazė CTX-M-15 užkoduota blaCTX-M-15 geno pirmą kartą buvo aptikta 1990 metais. Šis genas perkeliavo iš Kluyvera spp chromosomos į plazmidę ir tokiu būdu plačiai paplito pasaulyje. Būtent šis genas yra atsakingas už didžiąją dalį

Enterobacteriaceae šeimos atstovų įgyto atsparumo trečios kartos cefalosporinams atvejų. Remiantis

paskutiniais duomenimis, Indijoje šiuo metu 70-90 % visų Enterobakteriaceae atstovų turi plataus veikimo spektro beta-laktamazes. Dėl to infekcijų gydymo metu tenka dažnai vartoti karbapenemus, kas skatina atsparumo jiems atsiradimą. Atsparumo karbapenemams atsiradimas yra pavojingas viso pasaulio sveikatai, nes yra tik labai ribotas kiekis rezervinių antibiotikų po karbapenemų. Jau dabar

JAV Graikijoje ir Izraelyje paplytę pneumoniae kolonijos, turinčios karbapenemazes sukelia daug sunkumų gydymo metu [53,54].

Jau prieš 20 metų buvo pastebėta, kad pastoviai auga atsparumą antimikrobiniams vaistams turinčių infekcijų kaip įvairovė, taip ir dažnumas. Efektyviai nepagydomų infekcijų epidemijos yra sutinkamos kaip besivystančiose šalyse taip ir išsivysčiusiose. Padidėjęs dažnumas atsparių mikroorganizmų atsiradimo yra siejamas su keliais faktoriais: individualiais mikroorganizmų adaptaciniais gebėjimais, atranka tarp mikroorganizmų sukelta plataus antibiotikų naudojimo, taip pat šiuolaikinės technologijos, lemiančios lengvesnį jų paplitimą. Kaip pasekmė didėja mirštamumas, sergamumas ir vidutinės išlaidos paciento gydymui. Šių infekcijų prevencijai ir kontrolei reikia naujų antimikrobinių preparatų, atsargesnio naudojimo jau esamų junginių, naujų vakcinų vystymas ir aukštesnių visuomenes sveikatos normų įvedimas [41].

Pacientai, turintys rezistentišką infekciją, dažniausiai patiria žymiai sunkesnes komplikacijas ir ligos pasekmes, jiems būdinga didesnė mirštamumo tikimybė. Taip pat šių pacientų gydymui yra sunaudojama žymiai daugiau sveikatos apsaugos resursų, lyginant su pacientais užsikrėtusiais nerezistentiškomis infekcijomis [9].

Rezistentiškų padermių atsiradimas ir paplitimas visame pasaulyje yra siejamas pagrinde su intensyviu antibiotikų naudojimu ir neteisingu jų taikymu. Naujų atsparumų atsiradimui turi įtakos tiek naudojamų antibiotikų kiekis, tiek ir naudojimo būdas. Taip pat yra nustatyta, kad socialiniai, ekologiniai ir genetiniai faktoriai irgi turi įtakos atsparumo atsiradimui. Bakterijos, įgavusios atsparumą, jį išlaiko net ir ilgalaikiai pašalinus kontaktą su antimikrobiniu preparatu [20].

Staphylococcus aureus yra dažniausiai pasitaikantis bakteremijos sukėlėjas, kuris taip pat yra

siejamas su aukštesne mirštamumo tikimybe nei kiti sukėlėjai. Bakteremija sukelta S. aureus, o ypač meticilinui atsparios padermės gydymas reikalauja didžiulių finansinių investicijų. Ligos perėjimas į metastazę, endokarditas ir kitos galimos komplikacijos skatina kuo ankstesnį infekcijos gydymą. Padermės atsparios meticilinui ankščiau buvo aptinkamos tik sveikatos priežiūros ir ilgalaikes globos įstaigose, tačiau vis dažniau pasitaiko atsparumą turinčių infekcijų įgytų visuomenėje. Švedijoje 2006 metais atlikto tyrimo metu buvo nustatyta kad 2000-2003 metų laikotarpyje meticilinui atsparių

S.aureus infekcijų kiekis išaugo nuo 325 iki 544 atvejų per metus, kas yra prilyginama augimui nuo

3,7 iki 6,1 tenkantys 100,000 [42,45,46].

Jungtinėse Amerikos Valstijose 2005 atlikto tyrimo metu buvo nustatyta, kad dauguma meticilinui atsparaus S.aureus sukeltos infekcijos dažniausiai yra susietos su sveikatos priežiūros įstaigomis: 58,4% vsių infekcijų išsivystė visuomenėje po hospitalizacijos periodo, 26,6% išsivystė hospitalizacijos metu, 13,7% buvo atvejų buvo įgytos visuomenėįe. Sergamumas infekcija buvo

31,8:100000, mirštamumas – 6,3:100000. Didžiausios rizikos grupės – pagyvenę žmonės (>65 metai), juodaodžiai, ir vyrai [47].

Europos sąjungoje atsparios S.aureus padermės yra paplitusios visuose šalyse. 2008 metais buvo nustatyta kad nors ir mažėja meticilinui atspariu S. aureus padermių proporcija tarp infekcinių ligų, daugiau negu trečdalyje šalių jų dalis išlieka >25% visų atvejų. Verta pabriežti, kad lyginant su Jungtinėmis Amerikos Valstijomis, Europos sąjungoje yra žymiai mažesnė visuomenėje įgytų meticilinui atsparių infekcijų proporcija [48,49].

Šios tendencijos yra prilyginamos prieš keletą dešimtmečių įvykusiam penicilinui atsparių padermių atsiradimui. Yra nuomonių, kad ateinančius keletą metų meticilinui atspari padermė žymiai išsiplės. Padidėjęs S. aureus sukeltų infekcijų dažnumas yra siejamas su keletu priežasčių: padidėjęs invazinių gydimo procedūrų skaičius, padidėjęs kiekis pacientų su nusilpusia imuninę sistema ir išaugęs dažnis S. aureus padermių, turinčių atsparumą dažniausiai naudojamiems antibiotikams. Visi šie faktoriai pabrėžia svarbą naujų metodikų ir vaistų paieškos kovoje su S. aureus ir jo sukeltomis komplikacijomis [43].

Streptococcus pneumoniae yra vienas svarbiausių infekcijos sukėlėjų, kuris sukelia apatinių

kvėpavimo takų infekcijas. Penicilino grupės antibiotikai yra pirmo pasirinkimo vaistai, gydant šio mikroorganizmo sukeltas infekcijas nuo pat 1940 metų. Pirmą kartą infekcijos atsparios beta-lakatamams buvo aptiktos 1965 metais Jungtinėse Amerikos Valstijose, po to Australijoje (1967) ir pietų Afrikoje (1977). Nuo to laikotarpio atsparumas tarp S.pneumoniae sparčiai išplito. Šiuo metu Europoje yra jau dvi geografines zonos kur plačiai paplito (25%) beta-laktaminiams antibiotikams atsparios padermės – šiaurės-rytai ir pietvakariai. Ispanijoje atlikto tyrimo metu buvo nustatyta koreliacija tarp metinio ampicilino vartojimo kiekio ir atsparių padermių gausumo. Didelio atsparumo padermės (minimalioji slopinančioji koncentracija > 1mg/l) yra aptinkamos vietovėse, kur ankščiau

S.pneumoniae pasižymėjo tik minimaliu atsparumu. Prancūzyjoje yra didelė padermių, atsparių

makrolidams proporcija – 15%. Panašūs dėsningumai yra pastebėti ir kitose šalyse. Kol kas visos atsparios S. pneumoniae padermės vis dar yra jautrios naujiems fluorchinolonams [50,51,52].

Yra duomenų kad Enterobacter ir Klebsella turi gebėjimą nuslopinti net ir pačios paskutinės kartos penicilinus ir cefalosporinus. Ypač svarbu dar atkreipti dėmesį į tai, kad didėja dažnumas padermių, išskiriančių metalo-b-laktamazes, kurios sugeba inaktyvuoti karbapenemus – rezervinius vaistus, esant ypač pavojingoms gramneigiamų bakterijų sukeltoms infekcijoms [19].

Taip pat didelę svarbą turi grybelinės infekcijos. Candida grybelių rūšis yra ketvirta pagal sukeliamas hospitaliai įgytas kraujotakos infekcijas. Invazinė kandidozė yra labiausiai paplitusi su grybelių infekcija susijusi mirtingumo priežastis Jungtinėse Amerikos Valstijose [22]. Vienas iš

svarbiausiu faktorių, įtakojančių mirtingumą yra ligos identifikavimo sunkumas dėl nespecifinių požymių pradinėje ligos stadijoje dominavimo. Invazinė kandidozė yra aptinkama pas 1–8 % pacientų, paguldytų į ligoninę, tačiau 10 % pacientų paguldytų į intensyviosios terapijos skyrių. Intensyviosios terapijos skyriuje invazinė kandidozė sudaro 15% visų hospitalinių infekcijų [23]. Nuo 1987 iki 1999 metų Jungtinėse Amerikos Valstijose išaugo mirštamumas nuo Candida ablicans infekcijų. Tam yra keletas paaiškinimų – 1) dėl aukšto socialinio lygio žmonės išgyvena iki vyresnio amžiaus, kada imunitetas susilpnėja ir padidėja infekcijų pavojus; 2) suintensyvėjęs onkologinių ligonių gydymas padidina neutropenijos periodų dažnį, kada žmogui yra didesnė tikimybė susirgti infekcine liga [22,23].

3.2. Rodaninas, 4-tiazolidinono dariniai

Tiazolidinonai yra tiazolidinų dariniai, kurie priklauso svarbiai heterociklinių junginių grupei. Jų struktūroje yra penkianaris žiedas į kurio sudėtį įeina azoto ir sieros atomai. Sieros atomas yra pirmoje padėtyje, azoto atomas – trečioje, karboninė grupė gali būti antroje, ketvirtoje arba penktoje padėtyje. Šiuo metu tiazolidinono dariniai yra plačiai studijuojami. Pirmą kartą tiazolidinonas buvo aptiktas natūraliai gamtoje kaip penicilinų struktūros dalis [1,2].

Trečioje padėtyje neturintys pakaitalo 4-tiazolidinonai dažniausiai yra kietos medžiagos, išsilydančios su dekompozicija aukštesnėse temperatūrose, tačiau alkilo grupes prijungimas prie azoto atomo sumažina lydymosi temperatūrą. 4-tiazolidinonai, neturintys arilo arba aukštesnių alkilo pakaitų, yra dalinai tirpūs vandenyje [3].

1 pav. 4-tiazolidinonai: tiazolidinonas, rodaninas, 3-aminorodaninas.

3.3. Rodanino, 4-tiazolidinono darinių farmakologinis ir biologinis poveikis

Tiazolidinonų dariniai turi labai platų pritaikymo spektrą. Įvairių tyrimų metu buvo nustatyta kad tiazolidinonams būdingas antimikrobinis, antituberkuliozinis, antikonvulsinis, hipnotinis,

antihelmintinis, hipotonizuojantis, priešvėžinis, antihistamininis, priešgrybelinis, antivirusinis, folikilus stimuliuojančio hormono agonistinis, priešuždegiminis poveikis [1,2,3,10]. Vienas iš galimų rodanino antimikrobinio poveikio mechanizmų yra Mur C inhibavimas [24]. Mur C yra muramil ligazė, vienas iš fermentų, atsakingų už ląstelės sienelės sintezę.

Didžiausias dėmesys yra skiriamas rodanino antimikrobinių savybių tyrimui. Xin Jin et al. [17] susintezavo rodonono darinius su chalkonu modifikotais pakaitais 5 padėtyje. Antimikrobiniai tyrimai parodė, kad dalis junginių yra panašaus efektyvumo kaip ir palyginimui paimtas norfloksacinas, tačiau nei vienas iš junginių nepasižymėjo poveikiu prieš gramneigiamas bakterijas. Junginys, parodęs didžiausia veiksmingumą, atvaizduotas .

Meng Guo et al. [18] tyrė naujai sintezuotus rodanino darinius, penktoje padėtyje turinčius modifikuotą chinolono pakaitą. Buvo sukurti 2 junginiai, pasižymintys dideliu antimikrobiniu poveikiu prieš gramteigiamus mikroorganizmus. Jų antimikrobinis efektyvumas pasirėškė ne tik prieš standartinius mikroorganizmus, bet ir prieš įgavusius atsparumo antimikrobiniams preparatams štamus, įskaitant atsparius meticilinui ir atsparius chinolonui Staphylococcus aureus. Iš sintezuotų junginių, du parodė nuo 4 iki 8 kartų stipresnį poveikį rezisetntiškiems mikroorganizmams, lyginant su palyginimui paimtais moksifloksacinu, gatifloksacinu, norfloksacinu

Tomasic T ir Masic P straipsnyje [5] teigia, kad rodaninas ir 2,4- tiazolidondionas pastaruoju metu tampa vis daugiau dėmesio sulaukianti heterociklų poklasė. Jie tai sieja su įvairių glitazonų (II tipo diabetes mellitus gydymas) ir epalrestato (diabeto sukeltų komplikacijų gydymas) įvedimų į klinikinę praktiką. Atsižvilgdami į platų rodanino darinių biologinio aktyvumo spektrą, heterociklinio žiedo modifikavimo galimybių įvairumą, teigia kad šis junginys tikriausiai liks privilegijuotu dariniu naujų vaistų paieškoje.

Priešingą nuomonę pateikia Katherine R. Mariner et al. savo moksliniame straipsnyje [6]. Jie teigia, kad nors rodanino dariniai ir turi RNA polimerazės inhibavimo poveikį, dėl plataus, nespecifinio biologinio aktyvumo (šiuo atveju jis pasireiškė kaip malato dehidrogenazės ir chemotripsino inhibitoriai), jie nėra patrauklūs kaip kandidatai į naujus vaistus. Šis tyrimas pabrėžia vieną iš trūkumų, būdingų rodanino dariniams – pernelyg platus biologinio aktyvumo spektras.

Tihomir Tomašić ir Lucija Peterlin Mašič pateikia panašią nuomonę. Straipsnyje [21] jie teigia kad vertinant junginių, turinčių rodanino struktūrą, biologinį aktyvumą reikia būti labai kritiškam. Būtina atidžiai apsvarstyti jų pritaikomumą, nepaisant dažniausiai įtikinančius rezultatus gaunamus tyrimų metu, nustatant biologinį aktyvumą. Šių junginių mažas selektyvumas, sunkiai nuspėjamas struktūros ir aktyvumo ryšio dėsningumas, mažas saugumas, specifiškumas dažniausiai reiškia optimizavimo galimybės nebuvimą.

3.4. Šifo bazės

Jurginiai į kurių struktūrą įeina azemetino grupė (-C=N-), žinomi kaip Šifo bazės, yra sintetinami reaguojant pirminiam aminui su karboksigrupe. Šifo bazės gaunamos iš alifatinių aldehidų dažniausiai yra santykinai nestabilūs junginiai, jie lengvai polimerizuojasi, tuo tarpu Šifo bazės pagamintos iš aromatinių aldehidų yra žymiai stabilesnės. Šifo bazių biologinio aktyvumo platumas gali būti aiškinamas tuo, kad jie dalyvauja dideliame kiekyje fermentinių reakcijų, kurių metų vyksta sąveika tarp fermento ir substrato karboksigrupės arba aminogrupės. Daliai šių junginių būdingas biologinis aktyvumas, ypač antibakterinis, priešgrybelinis, priešvėžinis, antimaliarinis [4,27].

3.5. Azetidinai, beta-laktamai

Beta-laktamai yra junginiai kurių struktūrą sudaro heterociklinis žiedas, sudarytas iš azoto atomo sujungto su karboniline grupe ir dar 2 anglies atomais. Pirmą kartą šios grupes junginys buvo sintezuotas 1907 metais mokslininko Hermann Staudinger [31]. Pirmą kartą betalaktminį antibiotiką susintetino Aleksandras Flemingas 1928 metais. Jis plačiai ištyrė gauto penicilino antimikrobines savybes, tačiau jo tyrimai nepasiekė klinikinių tyrimų stadijos dėl pakankamo išgryninto penicilino kiekio gavimo sunkumų. Į klinikinę praktiką penicilinas buvo įvestas tik 1940-iais metais, o viešai prieinamas tik 1946 [32].

Pav. 2. Azetidino ir beta-laktamo žiedai

Pagal savo struktūrą beta laktamai yra klasifikuojami į kelius pogrupius: turintys penkianarį sotų žiedą (penamai, karbapanemai, oksapenamai), penkianarį nesotų (penemai, karbapenemai), šešianarį ciklą (cefemai, karbacefemai, oksacefemai), neturintys konjuguoto žiedo - monobaktamai. Šiuo metu klinikinėje praktikoje naudojamų beta laktaminių antibiotikų didžiąją dalį sudaro junginiai, kurių azetidinono ciklas yra sujungtas su kitu ciklu, yra tik viena grupė junginių pas kuriuos laktamo žiedas nėra konjuguotas – tai yra monobaktamai [39]. Vienintelis junginys iš monobaktamų naudojamas praktikoje yra aztreonamas.

Beta-laktamai yra istoriškai pati sėkmingiausia ir įtakingiausia antibiotikų grupė. Jų poveikis yra aiškinamas sugebėjimu slopinti gramteigiamų bakterijų membranos sintezę [28]. Šiuo metu β-laktaminiai antibiotikai yra plačiausiai naudojami pirmo pasirinkimo vaistai, gydant jautrių jiems mikroorganizmų sukeltas infekcijas [29,30]. Šiuo metu azetidino žiedas vis dar lieka vienas labiausiai naudojamų struktūrinių pagrindų naujų antimikrobinių preparatų sintezėje [33-35]. Taip pat yra vykdomi kitomis biologinėmis sąvybėmis pasižyminčių vaistų paieškos, tarp jų pasižyminčių gama-aminosviesto rūgšties reabsorbcijos slopinimo, dopamino antagonistinės savybėmis [36,37].

Bush K, ir Macielag M. savo darbe [38] apžvelgė 2007-2010 laikotarpių patentuotus antimikrobinius preparatus turinčius beta-laktamo struktūrinį pagrindą. Savo tyrime autoriai teigia, kad šiuo metu yra mažiau dėmesio skiriama senesniems beta laktaminių antibiotikų grupėms, tokioms kaip penicilinai ir cefalosporinai. Taip pat jie teigia kad yra tik kelios farmacijos kompanijos bando išvystyti antibiotinius preparatus kaip monoterapinę priemonę ir vis daugiau dėmesio yra skiriama kombinuotiems preparatams. Autoriai teigia kad paskutiniu laiku mažiau dėmesio yra skiriama naujų antibiotikų sukūrimui ir vis daugiau naujiems beta-laktamazių inhibitoriams arba jų deriniams.

4. TYRIMŲ METODIKA IR REZULTATAI

4.1. 3-amino-2-tiokso-tiazolidin-4-ono darinių sintezė ir gryninimas

4.1.1. 3-[(E)-(4-fluorofenil)metilenamino]-2-tiokso-tiazolidin-4-ono (VS-1) sintezė ir gryninimas

1 gramas 3-amino-rodanino (0,00676 mol, 148,21 Mr) tirpinamas minimaliame izopropanolio kiekyje (apytiksliai 8-10 ml), šildant (50 oC). Į gautą tirpalą įpilamas 0,964 g p-fluor-benzaldehido (0,00777 mol, 124,11 Mr). Mišinys paliekamas kaitinti 2 val. Reakcijos įvykdymo pilnumas periodiškai tikrinamas naudojant plonasluoksnės chromotografijos (PSC) metodą. Pilnai įvykus reakcijai tirpalas paliekamas ataušti. Susidariusios oranžinės spalvos nuosėdos yra nufiltruojamos, išdžiovinamos ir gryninamos perkristalinimo būdu, naudojant karštą izopropanolio tirpalą. Gautų kristalų grynumas yra nustatomas naudojant PSC. Gautas junginys yra pilkai oranžinės spalvos.

Reakcijos metu atliekamas PSC patikrinimams naudojant tirpiklių sistema - acetono ir heksano 1:5, kaip papildoma sistema naudojamas 2:5 etileterio ir pentano mišinys. Sintezė pavaizduota 4 pav.

4.1.2. 3-[(E)-(4-fluorofenil)metilenamino]-2-tiokso-tiazolidin-4-ono (VS-2) sintezė ir gryninimas

1 gramas 3-amino-rodanino (0,00676 mol, 148,21 Mr) tirpinamas minimaliame izopropanolio kiekyje (apytiksliai 8-10 ml) šildant (50 C). Atskirai minimaliame izopropanolio kiekyje yra ištirpinamas 1,429 g p-brom-benzaldehido (0,00777 mol, 183,95 Mr). Tirpalai sumaišomi. Mišinys paliekamas kaitinti 3 val. Reakcijos įvykdymo pilnumas periodiškai tikrinamas naudojant PSC. Pilnai įvykus reakcijai tirpalas paliekamas ataušti. Susidariusios geltonos spalvos nuosėdos yra nufiltruojamos, išdžiovinamos ir gryninamos perkristalinimo būdu, naudojant karštą izopropanolio tirpalą. Gautų kristalų grynumas yra nustatomas naudojant PSC. Gautas junginysra šviesiai geltonos spalvos. Reakcijos metu atliekamas PSC patikrinimam, naudojant tirpiklių sistemą - acetono ir heksano 1:5, kaip papildoma sistema taip pat naudojamas 2:5 etileterio ir pentano mišinys. Sintezė pavaizduota Pav. 4.

4.1.3. 3-[(E)-(4-chlorofenil)metilenamino]-2-tiokso-tiazolidin-4-ono (VS-3) sintezė ir gryninimas

1 gramas 3-amino-rodanino (0,00676 mol, 148,21 Mr) tirpinamas minimaliame izopropanolio kiekyje (apytiksliai 8-10 ml) šildant (50 C). Atskirai minimaliame izopropanolio kiekyje yra ištirpinamas 1,087 g p-chlor-benzaldehido (0,00777 mol, 140,00 Mr). Tirpalai sumaišomi. Mišinys paliekamas kaitinti 3 val. esant 50 C. Reakcijos įvykdymo pilnumas periodiškai tikrinamas naudojant PSC. Pilnai įvykus reakcijai tirpalas paliekamas ataušti. Susidariusios geltonos spalvos nuosėdos yra nufiltruojamos, išdžiovinamos ir gryninamos perkristalinimo būdu naudojant karštą izopropanolio tirpalą. Gautų kristalų grynumas yra nustatomas naudojant PSC. Gautas junginys yra šviesiai geltonos spalvos. Reakcijos metu atliekamas PSC patikrinimam, naudojant tirpiklių sistemą – acetono ir heksano 1:5, kaip papildoma sistema naudojamas 2:5 etileterio ir pentano mišinys. Sintezė pavaizduota Pav. 4

4.1.4. 3-[(E)-(4-etilfenil)metilenamino]-2-tiokso-tiazolidin-4-ono (VS-4) sintezė ir gryninimas

1 gramas 3-amino-rodanino (0,00676 mol, 148,21 Mr) tirpinamas minimaliame izopropanolio kiekyje (apytiksliai 8-10 ml) šildant (50 C). 1,042 g p-etil-benzaldehido (0,00777 mol, 134,17 Mr) yra įpilamas į tirpalą. Mišinys paliekamas kaitinti 4 valandas esant 75 C. Reakcijos įvykdymo pilnumas periodiškai tikrinamas, naudojant PSC. Pilnai įvykus reakcijai tirpalas paliekamas ataušti per naktį. Susidariusios tamsiai kremines spalvos nuosėdos yra nufiltruojamos, išdžiovinamos ir gryninamos perkristalinimo būdu, naudojant karštą izopropanolio tirpalą. Gautų kristalų grynumas yra nustatomas naudojant PSC. Gautas junginys yra auksinės spalvos. Reakcijos metu atliekamas PSC patikrinimams naudojant tirpiklių sistemą – acetono, etileterio ir heksano 1:1:5, kaip papildoma sistema naudojamas 2:5 etileterio ir pentano mišinys. Sintezė pavaizduota 3pav.

4.1.5. 3-[(E)-2-feniletilideneamino]-2-tiokso-tiazolidin-4-ono (VS-5) sintezė ir gryninimas

0,5 gramo 3-amino-rodanino (0,00337 mol, 148,21 Mr) tirpinamas minimaliame izopropanolio kiekyje (apytiksliai 5 ml) šildant (50 C). 0,410 g fenilacetaldehido (0,00387 mol, 106,04 Mr) yra įpilamas į tirpalą. Mišinys paliekamas kaitinti 4 valandom esant 75 C. Reakcijos įvykdymo pilnumas periodiškai tikrinamas naudojant PSC. Pilnai įvykus reakcijai tirpalas paliekamas ataušti per naktį. Reakcijos mišinys yra destiliuojamas, nuosėdos surenkamos ir perkristalinamos naudojant karštą metanolio tirpalą. Gautų kristalų grynumas yra nustatomas naudojant PSC. Gautas junginys yra rudos spalvos. Reakcijos metu atliekamas PSC patikrinimams naudojant tirpiklių sistemą – acetono, etileterio ir heksano 1:5:10, kaip papildoma sistema naudojamas 4:1:10 etileterio, oktano ir pentano mišinys. Sintezė pavaizduota 3 pav.

4.1.6. 3-[(E)-(10-chloro-9-antril)metilenamino]-2-tiokso-tiazolidin-4-ono (VS-6) sintezė ir gryninimas

0,5 gramo 3-amino-rodanino (0,00337 mol, 148,21 Mr) tirpinamas minimaliame izopropanolio kiekyje (apytiksliai 5 ml) šildant (50 C). 0.988 g 10-chlor-9-antraldehido (0,00387 mol, 240,03 Mr) yra įpilamas į tirpalą. Mišinys paliekamas kaitinti 4 valandas esant 75 C. Reakcijos įvykdymo pilnumas periodiškai tikrinamas naudojant PSC. Pilnai įvykus reakcijai tirpalas paliekamas ataušti. Tirpalas yra filtruojamas, nuosėdos praplaunamos distiliuotu vandeniu, surenkamos ir perkristalinamos, naudojant karštą izopropanolio tirpalą. Gautų kristalų grynumas yra nustatomas naudojant PSC. Gautas junginys yra oranžiniai-raudonos spalvos. Reakcijos metu atliekamas PSC patikrinimams, naudojant tirpikliu sistema – acetono, etileterio ir heksano 1:5:10, kaip papildoma sistema naudojamas 4:1:10 etileterio, oktano ir pentano mišinys. Sintezė pavaizduota 3 pav.

VS- 4

VS-7 VS-5 VS-6

VS-3

VS-1

VS-2

4 pav. VS-1, VS-2, VS-3 junginių sintezė

4.1.7. 3-[(E)-[4-[bis(2-chloretil)amino]fenil]metilenamino]-2-tiokso-tiazolidin-4-ono (VS-7) sintezė ir gryninimas

0,5 gramo 3-amino-rodanino (0,00337 mol, 148,21 Mr) tirpinamas minimaliame izopropanolio kiekyje (apytiksliai 5 ml) šildant (50 C). 0.988 g 10-chlor-9-antraldehido (0,00387 mol, 240,03 Mr) yra įpilamas į tirpalą. Mišinys paliekamas kaitinti 4 valandas esant 75 C. Reakcijos įvykdymo pilnumas periodiškai tikrinamas naudojant PSC. Pilnai įvykus reakcijai tirpalas paliekamas ataušti per naktį. Tirpalas yra filtruojamas, nuosėdos surenkamos ir perkristalinamos, naudojant karštą izopropanolio tirpalą. Gautų kristalų grynumas yra nustatomas naudojant PSC. Gautas junginys yra rudos spalvos. Reakcijos metu atliekamas PSC patikrinimams, naudojant tirpiklių sistemą – acetono, etileterio ir heksano 1:5:10, kaip papildoma sistema naudojamas 4:1:10 etileterio, oktano ir pentano mišinys. Sintezė pavaizduota 3 pav.

4.1.8. 3-[3-chlor-2-(4-fluorofenil)-4-okso-azetidin-1-il]-2-tiokso-tiazolidin-4-ono (VS-8) sintezė ir gryninimas

Pradiniam junginiui gauti yra atkartojama VS-1 junginio sintezė, naudojant dvigubai didesnius pradinių medžiagų kiekius. Reakcijos metodika yra paremta B. M. Gurupadaya et al. darbu [40]. Pagal jų siūlomą metodiką, reakcija turi būti vykdoma esant ekvimoliariniams kiekiams Šifo bazės, trietilamino ir 2-chloroacetil chlorido gryno oksano terpėje. Tačiau įvertinus reakcijos vykdymo sunkumą, buvo nuspręsta modifikuoti metodiką, naudojant 5 kartus didesnį kiekį tiretilamino ir 2-chloracetil chlorido.

2 g VS-1 junginio (0,00787 mol, 253,99 Mr) ištirpinami minimaliame kiekyje gryno dioksano atsargiai šildant (50 C). Į tirpalą įpilamas po lašą 4,40 g 2-chloroacetil chlorido (0,0393 mol, 111,94Mr) ir 3,96 g trietilamino (0,0393 mol, 101,12 Mr). Reakcija vykdoma 4 valandas atsargiai kaitinant (50 C) ir naudojantis magnetine maišykle. Po to, mišinys yra paliekamas dar parai, maišomas magnetine maišykle. Gautas tirpalas yra distiliuojamas, surenkamos rudos spalvos nuosėdos. Nuosėdos yra praplaunamos distiliuotu vandeniu. Dėl pradinių junginių ir produkto struktūrinio giminingumo yra sunku efektyviai išgryninti azetidiną, geriausias rastas būdas – ekstrahavimas naudojant oktaną. Stengiamasis apsieti be kaitinimo, nes taip disproporcionaliai padidinamas priemaišų tirpumas. Nuosėdos tirpinamos oktane trinant grūstuvėje, oktanas surenkamas. Procesas atkartojamas keletą kartų. Surinktas oktanas yra distiliuojamas. Gautų nuosėdų grynumas patikrinamas PSC. Sintezė pavaizduota 5 pav.

4.1.9. 3-amino rodanino sintezė

Tyrimui naudotas 3-amino rodaninas buvo sintezuotas remiantis E. Tarasevičiaus pasiūlyta metodika:

10 g hidrazinhidrato yra ištirpinami 30 ml metanolio. Gautas tirpalas yra atšaldomas ledinėje acto rūgštyje iki 0°C. Į atšaldytą tirpalą maišant magnetinei maišyklei įpilamas tirpalas pagamintas iš anglies disulfido 6 ml ir 20 ml etileterio. Lašinant yra pastoviai stebima temperatūra, tirpalui leidžiama pasiekti 8°C, pilnai sulašinus tirpalą išsiskiria baltos spalvos nuosėdos, kurios maišomos magnetine maišykle 20 min esant 5°C. Gautos nuosėdos yra filtruojamos vakuuminiu filtru, praplaunamos eteriu ir džiovinamos. Gautos druskos lydymosi temperatūra yra 120-122°C, išeiga – 12,2 g. 8,5 g monochloracto rūgšties yra ištirpinama 25 ml destiliuoto vandens ir neutralizuojamas su natrio karbonatu. pH tikrinamas naudojant universalų lakmuso indikatorių. Gautas tirpalas atšaldomas ledo vonioje iki 0°C. Maišant magnetinei maišyklei, mažais kiekiais dedama gauta druska. Turi būti stebima tirpalo temperatūra, jai leidžiama pasiekti 4°C. Tirpalas paliekamas maišytis 20 min., gautas tirpalas praskiedžiamas 2 kartus po 25 ml, paliekamas stovėti kambario temperatūroje. 6N vandenilio chlorido rūgštis yra šildoma iki virimo ir į ją lėtai pilamas išlaikytas tirpalas. Gautas tirpalas yra kaitinamas iki 90-95°C, tirpalui atšalus iškrenta 3-amonorodanino kristalai. Gauti kristalai yra nufiltruojami vakuuminiu filtru ir perkristalinami etanolyje arba ledynėje acto rūgštyje. 1 g kristalų atitinka 5 ml tirpiklio. 3-amino rodaninas identifikuojamas pagal lydymosi temperatūrą. Sintezė pavaizduota 6 pav.

4.2. Lydymosi temperatūros nustatymas

Gautų junginių lydymosi temperatūra yra nustatoma naudojant Koflerio aparatą, kuris yra sudarytas iš mikroskopo, termometro ir kaitinimo elemento.

Apytiksliai 1 mg medžiagos yra sutrinama tarp 2 švarių mikroskopavimo stiklelių. Šie stikleliai dedami ant objektyvinio stalelio, kuris yra šildomas kaitinimo elementu. Kaitinimas yra stebimas elektroninio termometro pagalba. Junginio agregatinės būsenos kitimai stebimi mikroskopu. Lydymosi temperatūros nustatymo metu yra stebimi 2 taškai – lydymosi pradžios ir pabaigos. Lydymosi pradžia nustatoma tada, kai pasirodo pirmas lašas, o pabaiga – kai išsilydo visi kristalai ir nebematoma kietų dalelių. Bandymas yra daromas 3 kartus ir iš rezultatų yra vedamas vidurkis. Lydymosi temperatūros pateikiamos 1 lentelėje.

1 lentelė. 3-amino-rodanino junginių lydymosi temperatūra ir molekulinės formulės

Junginys Lydymosi

temperatūra Molekulinė formulė Molekuline masė

VS-1 205-208°C C 10H7FN2OS2 253,99 VS-2 146-149°C C 10H7BrN2OS2 313,91 VS-3 147-150°C C 10H7ClN2OS2 269,96 VS-4 92-95°C C 12H12N2OS2 264,03 VS-5 94-96°C C 11H10N2OS2 250,02 VS-6 228-230°C C 18H11ClN2OS2 370,00 VS-7 160-163°C C 14H15Cl2N3OS2 375,00 VS-8 Vyksta sublimacija: 155-222°C C 12H8ClFN2O2S2 329,96

4.3. Junginių grynumo nustatymas naudojant ESC

Analizė atlikta su Waters 2695 chromatografu (Waters Corporation, Milford, USA) bei fotodiodų matricos detektoriumi Waters 996 PDA (Waters Corporation, Milford, USA). Veikliųjų junginių atskyrimui naudota 250 × 4,6 mm, 5 µm ACE kolonėlė, kuri visos analizės metu laikyta išoriniame termostate, palaikant pastovią 25ºC temperatūrą. Analizės metu injekuota 10 µl tiriamo tirpalo, mobilios fazės tėkmės greitis 1,2 ml/min. Taikyta gradientinė sistema: 0,1 % trifluoracto rūgštis vandenyje (A) ir acetonitrilas (B). Eliucija: 0 min – 80 % A ir 20 % B, 15 min – 20 % A ir 80% B, 20 min – 10 % A ir 90 % B, 21 min – 80 % A ir 20 % B. Veikliųjų junginių detekcija atlikta 200-600 nm bangų intervale.

Junginių tirpalai buvo paruošti tirpinant labai mažą kiekį medžiagos (apytiksliai 1 mg) 25 ml kalbutėje. Panaudotas tirpiklis – etanolis. Mažiau tirpų junginių tirpinimui buvo pasinaudota ultragarso vonele ir kaitinimu. Junginiui ištirpus reikiamas kiekis tirpalo yra perkeliamas į chromotografavimo indelį.Grynumo nustatymo rezultatai yra pateikti 2 lentelėje.

2 lentelė. 3-amono-rodanino junginių grynumo nustatymo rezultatai Junginys Grynumas VS-1 ~90% VS-2 93,46% VS-3 97,48% VS-4 99,85% VS-5 83,99% VS-6 94,59% VS-7 54,78% VS-8 97,59%

Junginio VS-1 tikslus grynumas nėra pateiktas dėl ESC analizės metu atsiradusių techninių sunkumų. Tačiau remiantis sintezes ir gryninimo metu darytais PSC patikrinimais yra daroma prielaida, kad junginys yra jei ne didžiausio tai bent jau didelio grynumo.

4.4. Junginių UV-Vis absorbcijos maksimumų nustatymas

Junginių UV-Vis absorbcijos maksimumai buvo nustatomi naudojant „Thermo Spectronic Genesys 2 UV-visible spectrophotometer model no. 336002“. Junginiai buvo paruošiami naudojant sekančia metodiką: minimalus kiekis junginio (apytiksliai 1 mg) yra tirpinamas 25 ml 96% etanolio. Esant poreikiui tirpalas yra šildomas ir veikiamas ultragarso, tam kad užtikrinti maksimalų tiriamo junginio ištirpimą. Gautas tirpalas yra atsargiai pernešamas į 2 ml kiuvetę ir analizuojamas. Kaip palyginamasis tirpalas buvo naudojamas etanolis. Tyrimo rezultatai pateikti 3 lentelėje.

3 lentelėje. UV-Vis maksimumai

Junginys UV maksimumas VS-1 235, 271, 373 VS-2 235, 289, 337 VS-3 226, 377 VS-4 235, 289, 385 VS-5 238, 295, 346 VS-6 262, 385 VS-7 250, 298, 352, 409, 460 VS-8 238, 271, 373

4.5. Junginių struktūros nustatymas naudojant FT-IR

FT-IR (angl. Fourier Transform InfraRed) yra metodika leidžianti greitai ir tiksliai nustatyti junginių IR spektrą. Jis yra naudojamas nežinomų junginių identifikavimui, mėginio kokybiniam įvertinimui ir junginių kiekio tiriamame mišinyje nustatymui. IR spektras atvaizduoja kiekvienam junginiui unikalų derinį absorbcijos ir transmisijos pikų. Dėl to kad kiekvienas junginys yra unikalus atomų derinys, 2 skirtingi dariniai niekuomet neturės identiško IR spektro. Remiantis šiuo faktu, IR spektroskopija gali būti taikoma kokybinei analizei [7].

Junginių spektrai užrašyti Perkin Elmer Spektrum-100 spektrometru naudojant ATR ( angl. Attenuated total reflection) priedą, užnešant mažą tiriamo junginio kiekį ant cinko selenido kristalo. Junginių spektrų analizės rezultatai pateikti 4 lentelėje. Patys spektrai pateikti priedų skyriuje.

4 lentelė. 3amono-rodanino junginių FT-IR struktūros patikrinimo rezultatai

Junginys Junginio formulė Spektro dalis arba pikas,

atitinkantis struktūrą. VS-1 1720 – C=O 1250 – C=S 1250 – N-C 1450-1600 – aromatinė sistema VS-2 1720 – C=O 1200 – C=S 1250 – N-C 1500-1630 – aromatinė sistema VS-3 1720 – C=O 1080 – C=S 1450-1600 – aromatinė Sistema VS-4 1720 – C=O 1200 – C=S 1250 N-C 1450-1600 – aromatinė sistema 2850-3000 – C-H3 VS-6 1720 – C=O 1200 – C=S 750 – pikas būdingas naftaleno struktūrai[8] 1250 – C-N 1450-1600 – aromatinė sistema

VS-7 1720 – C=O 1170 – C=S 1200 - 1250 – C-N 1450-1600 – aromatinė Sistema 2850-3000 – C-H2 VS-8 1700-1750 – C=O 1250 – C=S 2850-3000 – C-H 1450-1600 – aromatinė sistema

4.6. PASS online junginių antimikrobinio aktyvumo įvertinimas

PASS (Prediction of Activity Spectra for Substances) Online gali nuspėti daugiau negu 3500 rūšių biologinio aktyvumą, įskaitant farmakologinį poveikį, poveikio mechanizmus, toksiškumą, nepageidaujamus reiškinius, sąveikos su fermentais ir transportiniais baltymais, poveikį genų pasireiškimui ir kiti. Spėjimai dėl aktyvumo yra pagrįsti daugiau negu 250000 biologiškai aktyvių junginių struktūros ir aktyvumo ryšio analize, įskaitant vaistus šiuo metu tiriamus potencialius vaistus, nuodingas medžiagas [13].

Junginio tam tikro biologinio aktyvumo tikimybės apskaičiavimo metu yra naudojamos 2 reikšmės: Pa ir Pi. Pa yra tikimybė, kad junginys pasižymi tiriamu biologiniu poveikiu, tuo tarpu Pi paroda tikimybė kad junginys juo nepasižymi.

PASS online programos antimikrobinio aktyvumo analizės rezultatai yra pateikti 5 lentelėje, toksinio poveikio analizė pateikta 6 lentelėje. Taip pat toksiškumo analizės metu buvo pastebėta kad kai kurie nepageidaujami poveikiai yra būdingi didžiajai daliai junginių, jų tikimybės pateiktos 7 lentelėje.

5 lentelė. Antimikrobinio poveikio analizė

Junginys

Priešbakterinio aktyvumo Pa/Pi reikšmės

Priešgrybelinio aktyvumo Pa/Pi reikšmės Pa Pi Pa Pi VS-1 0,232 0,093 0,298 0,082 VS-2 0,265 0,075 0,327 0,071 VS-3 0,218 0,102 0,332 0,069 VS-4 0,259 0,078 0,191 0,143 VS-5 - - 0,191 0,143 VS-6 - - 0,245 0,109 VS-7 - - - - VS-8 0,192 0,125 - -

6 lentelė. Tokiškumo analizė

Junginys Karcinogeniškumo Pa/Pi reikšmės Embriotoksiškumo Pa/Pi reikšmės Mutageninio poveikio Pa/Pi reikšmės Pa Pi Pa Pi Pa Pi VS-1 - - - - VS-2 - - - - VS-3 - - - - VS-4 0,259 0,078 0,191 0,143 - -

VS-5 - - - -

VS-6 0,199 0,078 - - 0,111 0,060

VS-7 0,301 0,043 0,355 0,075 0,233 0,024

VS-8 - - - -

Lentelė 7. Nepageidaujami reiškiniai.

Junginis

Neutrofilinis

dermatitas Žarnyno fibrozė

Nagų spalvos pokytis Trombocitopoezijos slopinimas Pa Pi Pa Pi Pa Pi Pa Pi VS-1 0,686 0,056 0,399 0,103 0,701 0,031 0,342 0,077 VS-2 0,632 0,075 0,399 0,103 0,386 0,183 - - VS-3 0,851 0,011 0,459 0,075 0,386 0,183 - - VS-4 0,571 0,040 0,572 0,098 0,367 0,200 - - VS-5 0,577 0,096 0,485 0,066 - - 0,333 0,083 VS-6 0,756 0,035 0,398 0,103 0,326 0,241 0,239 0,197 VS-7 - - 0,817 0,004 - - 0,573 0,018 VS-8 0,332 0,240 - - 0,431 0,148 0,259 0,162

Antimikrobinių savybių nustatymui in vitro buvo panaudotos šios bakterijų ir grybelių kultūros:

 Staphylococcus aureus ATCC 25923

 Staphylococcus epidermidis ATCC 12228

 Enterococcus faecalis ATCC 29212

 Escherichia coli ATCC 25922

 Klebsiella pneumoniae ATCC 33499

 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

 Proteus mirabilis ATCC 12459

 Bacillus cereus ATCC 8035

 Bacillus subtillis ATCC 6633

 Candida albicans ATCC 60193

Šios kultūros sintezuotų junginių biologinio aktyvumo tyrimui buvo pasirinktos dėl savo skirtingos struktūrinės sandaros. Iš jų: gramteigiamos - S. aureus, B.subtillis, B.cereus, E.faecalis, gramneigiamos - E.coli, P.mirabilis, P.aeruginosa, K.pneumoniae bakterijos ir mielinis grybelis

C.albicans. Iš jų sudarančios sporas yra B.subtilis ir B.cereus, sudaranti kapsulę - K.pneumoniae,

šliaužianti - P.mirabilis.

Etaloninės bakterijų ir grybelio C.albicans kultūros buvo auginamos 20–24 val. 35–37ºC temperatūroje ant Miulerio-Hintono agaro. Mikrobų suspensija gaminama iš išaugintų mikrobų kultūrų fiziologiniame natrio chlorido (0,9 proc.) tirpale, standartizuojama McFarland standartiniu indikatoriumi, kuris matuoja mėgintuvėlyje esančios suspensijos drumstumą. Mikrobų suspensija laikoma standartizuota, kai indikatoriaus reikšmė lygi 0,5 (tai reiškia, kad 1 ml mikrobų suspensijos yra 1,5 × 108

mikrobų ląstelių).

Gaminant tirpalus analizei buvo atsižvelgta į jų grynumą, reikiamos medžiagos kiekis buvo apskaičiuotas pagal formulę:

Masė (mg) = gaminamo tirpalo tūris (ml) x reikiama koncentracija mg/ml / grynumas

8 lentelė. Junginio kiekio apskaičiavimas atsižvelgiant į jo grynumą

Junginys Gynumas (%) Masė (mg)

VS-1 ~90% 12,22 VS-2 93,46% 11,76 VS-3 97,48% 11,28 VS-4 99,85% 11,01 VS-5 83,99% 13,0 VS-6 94,59% 11,62 VS-7 54,78% 20,08 VS-8 97,59% 11,27

Pagrindiniai susintetintų junginių tirpalai (11000 μg/ml) paruošti junginius tirpinant dimetilsulfokside (DMSO). DMSO yra pasirinktas dėl to, kad junginiai skiriasi savo tirpumu, todėl šio tirpiklio universalumas užtikrina paklaidų dėl skirtingų koncentracijų išvengimą. DMSO pasižymi antimikrobiniu veikimu, todėl buvo atliekamas kontrolinis bandymas. 0,5 ml pagrindinio tiriamojo junginio tirpalo aseptinėmis sąlygomis buvo perkeliamas sterilia pipete į sterilų matavimo cilindrą, kuriame sumaišomas su išlydytos standžios Miulerio–Hintono terpės 10,5 ml ir perkeliamas į Petri lėkštelę. Prieš tai Petri lėkštės išorinėje dalyje yra pažymimos zonos iš kurių kiekvienai atitinka tam tikra mikroorganizmų kultūra. Standartizuotos mikrobų kultūrų suspensijos kilpele po 0,1 ml buvo sėjamos ant sustingusios standžios terpės. Pasėtai mikrobų kultūrų suspensijai išdžiuvus, Petri lėkštelės dedamos į termokamerą parai.

Šio tyrimo tikslas nebuvo nustatyti tikslias inhibavimo koncentracijas, bet ištirti gautų junginių poveikio spektrą. Dėl to buvo naudojama tik vienos, santykinai aukštos, koncentracijos terpė (500 μg/ml). Tyrimo rezultatai pateikti 9 lentelėje.

9 lentelė. Antimikrobinio tyrimo in vitro rezuatai Junginys Mikroorganizmų kultūros S . au re u s A TC C 25923 S . e pi de rm idi s A TC C 12228 E. fae cal is A TC C 29212 E. c ol i A TC C 25922 K. pn eu m on iae A TC C 3499 P . ae ru gi n os a A TC C 27853 P . m ir abi li s A TC C 12459 B. c er eu s A TC C 8035 B. s u bt il li s A TC C 6633 C. al bi can s A TC C 60193 VS-1 + + + + + + + + + + VS-2 - - - - VS-3 - - + + p.k. p.k. - p.k. p.k. p.k. VS-4 + + + + + + + + + + VS-5 + + + + + + + p.k. p.k. p.k. VS-6 + + + + + + + + + + VS-7 + +/- + + + + + + + - VS-8 + + + + + + + + + - DMSO + + + + + + + + + + Žymenys:

„+“ mikroorganizmų augimas nebuvo nuslopintas „-“ mikroorganizmo augimas buvo nuslopintas

„p.k.“ –susidarė pavienės kolonijos, dalinai slopinamas augimas su rezistentiškų padermių atsiradimu

5. REZULTATŲ APTARIMAS

5.1.In silico antimikrobinių tyrimų rezultatai

PASS online programa parodė kad 6 iš 8 junginių gali turėti priešgrybelinį poveikį, 5 iš 8 – antimikrobinį. Didžiausią tikimybę pasižymėti priešgrybeliniu poveikiu turėjo junginys VS-3, didžiausią tikimybę pasižymėti antibakteriniu poveikiu – junginys VS-2. 8 pav.

Visų junginių, kuriems antimikrobinis aktyvumas yra prognozuojamas Pa reikšmės vyrauja tarp 0,15 ir 0,4, tik 2 junginiai turi Pa>0,3. 9 pav.

8 pav. Priešgybelinio ir antimikrobinio poveikio prognozė in silico

9 pav. Priešgybelinio ir antimikrobinio poveikio prognozė in silico 2

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 VS-1 VS-2 VS-3 VS-4 VS-5 VS-6 VS-7 VS-8 Prognozuojama antibaketerinio poveikio tikimybė Prognozuojama priešgrybelinio poveikio tikimybė 0 1 2 3 4 5 6 7 Pa>Pi 0,2 0,3 0,4 priešgrybelinis antibakterinis

Iš junginių, kuriems buvo prognozuojamas antimikrobinis poveikis, 5 turėjo Pa>Pi, 4 turėjo

Pa>0,2. Iš junginių, kuriems buvo prognozuojamas priešgrybelinis poveikis 6 turėjo Pa>Pi, 4 turėjo Pa>0,2, 2 turėjo Pa>0,3.

Remiantis PASS online tinklalapyje išdėstyta metodika:

Pa>0,7 reiškia kad preparatas turi didelę tikimybę būti aktyviam, tačiau kartu tai reiškia kad

jo struktūra yra beveik analogiška jau esančiam rinkoje preparatui.

0,5<Pa<0,7 tikimybė reiškia, kad junginys turės mažesnę tikimybę būti aktyvus, bet kartu ir

tai, kad didėja tikimybė, kad jis bus naujas, dar nežinomas farmacinis preparatas.

0,5<Pa reiškia, kad junginys turi mažesnę tikimybę būti aktyviu. Taip pat tai reiškia, kad jei

junginys visgi yra aktyvus, jis tikriausiai bus naujas, dar iki šiol neatrastas. 5.2.In vitro antimikrobinio tyrimo rezultatai

Iš 8 junginių 4 turėjo antibakterinių savybių ir 5 turėjo priešgrybelinių savybių. 3 junginiai neparodė jokių antimikrobinių savybių. Sintezuotiems junginiams labiausiai jautri pasirodė C.

ablicans, mažiausai E. faecalis ir E. coli.

10 pav. Junginių turėjusių poveikį į mikroorganizmą skaičius nustatytas in vitro tyrimometu

Plačiausia antimikrobinį poveikį iš sintezuotų junginių turėjo VS-2, sekantis – VS-3.Junginiai VS-3 ir VS-5 skatina rezistentiškumo susidarymą kas yra sprendžiama iš pavienių kolonijų

0 1 2 3 4 5 6

Junginių turėjusių poveikį į

mikroorganizmą skaičius

susidarymo. Įdomu pastebėti, kad junginiai VS-7 ir VS-8 pasižymėjo antimikrobiniu aktyvumu, nors PASS online analizė parodė, kad jie neturėtų jų turėti. Junginio VS-7 priešgrybelinės savybės gali būti

jo menko grynumo pasekmė, tačiau junginio VS-8 rezultatas neginčijamas. Junginys S-5 irgi parodė neprognozuotąntibakterinį poveikį.

Svarbu pastebėti kad junginys VS-1 nepasižymėjo priešgrybeliniu poveikiu, tuo tarpu VS-8, kurio struktūra skiriasi tik Šifo bazės struktūros pakeitimais į 4-okso-azetidino, buvo veiksmingas prieš

C.ablicans. Iš to galima teigti kad azetidino struktūros įvedimas junginiui suteikė priešgrybelinių

savybių.

11 pav. Junginių antimikrobinio poveikio spektras nustatytas in vitro tyrimo metu

5.3.In silico junginių žalingumo analizė

12 pav. Toksiško poveikio analizė in silico

0 2 4 6 8 10 12 VS-1 VS-2 VS-3 VS-4 VS-5 VS-6 VS-7 VS-8

Jautrių junginiui mikroorganizmų

skaičius

Iš 8 sintezuotų junginių tik 3, remiantis PASS online analize, gali būti toksiški. Junginiui VS-7 yra didžiausia tikimybė pasireikšti toksiškumui visais 3 tirtais atvejais. Iš kitos pusės – kitų nepageidaujamų reiškinių analizės metu buvo nustatyta kad beveik visi junginiai turi didelę tikimybę sukelti žarnyno fibrozę, neutrofilinį dermatitą, nagų spalvos pokyčius, trombocitopoezijos lopinimą. Taip pat buvo pastebėta kad junginiai į kurių struktūrą įeina chloro atomas turi žymiai platesnį galimų nepageidaujamų poveikių spektrą: VS-3, VS-6 ir VS-7 visi turėjo >25 galimų nepageidaujamų reiškinių (esant>0,3), kiti junginiai - <15 (esant Pa>0,3).

6.

IŠVADOS

1) Darbo metu buvo susitetinti 8 3-amino rodanino dariniai, iš jų - 7 Šifo bazės: a) 3-[(E)-(4-fluorofenil)metilenamino]-2-tiokso-tiazolidin-4-onas b) 3-[(E)-(4-bromofenil)metilenamino]-2-tiokso-tiazolidin-4-onas c) 3-[(E)-(4-chlorofenil)metilenamino]-2-tiokso-tiazolidin-4-onas d) 3-[(E)-(4-etilfenil)metilenamino]-2-tiokso-tiazolidin-4-onas e) 3-[(E)-2-feniletilideneamino]-2-tiokso-tiazolidin-4-onas f) 3-[(E)-(10-chloro-9-antril)metilenamino]-2-tiokso-tiazolidin-4-onas g) 3-[(E)-[4-[bis(2-chloretil)amino]fenil]metilenamino]-2-tiokso-tiazolidin-4-onas ir 1 azetidino darinys: h) 3-[3-chlor-2-(4-fluorofenil)-4-okso-azetidin-1-il]-2-tiokso-tiazolidin-4-onas

2) Ištyrus sintezuotus junginius in vitro ir in silico buvo nustatyta, kad plačiausiu antimikrobiniu poveikiu pasižymėjo junginysS-2.

3) Lyginant rezultatus tarp in vitro ir PASS online buvo pastebėta kad in silico metodika nėra visiškai patikima.

4) Azetidino struktūros įvedimas į VS-1, junginiui suteikė priešgybelinių savybių.

1) In vitroantimikrobinio poveikio analizės metu junginiai buvo ištirti tik poveikio platumo požiūriu. Ateityje būtų tikslinga padaryti tolimesnius tyrimus minimaliai inhibicinei koncentracijai nustatyti.

2) Atsižvelgiant į tai, kad junginys S-8, lyginant su pirmtakų VS-1, įgijo priešgrybelinį poveikį į struktūrą įterpus azetidino funkcinę grupę, būtų patartina toliau ištirti kaip ši grupė įtakoja antimikrobinį poveikį ir jo stiprumą kiteims junginiams

8. LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. Verma A, Saraf SK. 4-Thiazolidinone - A biologically active scaffold. Europ J Med Chem 2008;43:897-905

2. Jain AK, Vaidy A, Ravichandran V, Kashaw SK, Agrawal RK. Recent developments and biological activities of thiazolidinone derivatives: A review. Bioorg Med Chem 2012;20(11):3378–95

3. Anbinit M, Ghodke M, Pratima NA. Exploring the potential of 4-tiazolidinone: a brief review. Int J Pharm Pharmac Sci 2009;1(1):47-63

4. Arulmurugan S, Kavitha HP and Venkatraman BR

.

5. Tomasic T, Masic LP. Rhodanine as a Privileged Scaffold in Drug Disc. Curr Med Chem 2009;16(13):1596-629

6. Mariner KR, Trowbridge R, Agarwal AK, Miller K, O’Neill AJ, Fishwick CWG, and Chopra I. Furanyl-Rhodanines Are Unattractive Drug Candidates for Development as Inhibitors of Bacterial RNA Polymerase. Antimicrob agents ch 2010;54(10):4506–9 7. Thermo Nicolet „Introduction to Fourier Transform Infrared Spectrometry“ 2001 [cited

2014 04 15] Available from http://mmrc.caltech.edu

8. Antraldehido IR spektras. Prieiga per internetą:

http://www.chemicalbook.com/SpectrumEN_642-31-9_IR1.htm

9. World health organisation. Antimicrobial resistance: Global Report on surveillance” 2014 [cited on 2014 04 15] Prieiga per internetą:http://apps.who.int

10. Bhatti RS, Suresh SS, Krishan P and Sandhu JS. Recent Pharmacological Developments on Rhodanines and 2,4-Thiazolidinediones. In J Med Chem 2013;2013:793-9

11. Antibiotic resistance threats in the United States 2013. 2013 [cited on 2014 04 15] available from http://www.cdc.gov/drugresistance/threat-report-2013/

12. Wolfea CM, Cohena B, Larson E. Prevalence and risk factors for antibiotic-resistant community-associated bloodstream infections. J Infect Public Health 2014;7(3):224-32 13. Parasuraman S. Prediction of activity spectra for substances. J Pharmacol Pharmacother

2011;2:52–3.

14. Powers H. Antimicrobial drug development – the past, the present, and the future. Clin microbiol infect 2004;10:23–31

15. Aminov RI. A Brief History of the Antibiotic Era: Lessons Learned and Challenges for the Future. Front microbiol 2010;1:134

16. Bisht R, Katiar L, Singh R, Mittal P. Antibiotic resistance – a global issue ofconcern. Asian J Pharm Clin Res 2009;2(2):189-95

17. Guo M, Zheng C-J, Song M-X, Wu Y, Sun L-P, Li Y-J, Liu Y, Piao H-R. Synthesis and antimicrobial evaluation of L-phenylalanine-derived C5-substituted rhodanine and chalcone derivatives containing thiobarbituric acid or 2-thioxo-4-thiazolidinone. Europ J Med Chem 2012;56:203-9

18. Guo M, Zheng C-J, Song M-X, Wu Y, Sun L-P, Li Y-J, Liu Y, Piao H-R. Synthesis and biological evaluation of rhodanine derivatives bearing a quinoline moiety as potent antimicrobial agents. Bioorg Med Chem Lett 2013;15(1):4358–61

19. Levy SB, Marshall B. Antibacterial resistance worldwide: causes, challenges and responses. Nat med .2004;10(12):122-9

20. Barbosaa TM, Levy SB. The impact of antibiotic use on resistance development and persistence. Drug Resist Update 2000;3(5):303-11

21. Tomašić T, Peterlin Mašič L. Rhodanine as a scaffold in drug discovery: a critical review of its biological activities and mechanisms of target modulation. Expert Opin Drug Discov 2012;7(7):549-60

22. Pfaller MA, Diekema DJ. Epidemiology of invasive candidiasis: a persistent public health problem Clin Microbiol Rev 2007;20(1):133–63

23. Eggimann P, Garbino J, Pittet D. Epidemiology of Candida species infections in critically ill non-immunosuppressed patients. Lancet Infect Dis 2003;3(11):685–702

24. Sim MM, Naga SB, Buss AD, Crasta SC, Goh KL, Lee SK. Benzylidene rhodanines as novel inhibitors of UDP-N-acetylmuramate/L-alanine ligase. Bioorg Med Chem Lett 2002;12(4):697–9

25. Rodloff AC, Koch D, Schaumann R. Epidemiology and antifungal resistance in invasive candidiasis. Europ J M Res 2011;16:187-95

26. Prieiga per internetą: http://www.pharmaexpert.ru/passonline

27. Barboiu CT, Luca M, Pop C, Brewsterand EE. M. Dinculescu, Eur J Med Chem 1996;31:597

28. Lewis K. Platforms for antibiotic discovery. Nat Rev Drug Disc 2013;12:371–87

29. Glass-Kaastra SK, Finley R, Hutchinson J, Patrick DM, Weiss K, Conly J. Longitudinal surveillance of outpatient β-lactam antimicrobial use in Canada, 1995 to 2010. Can J Infect Dis Med Microbiol 2014;25:107-12

30. Drawz1 SM and Bonomo RA. Three Decades of β-Lactamase Inhibitors. Clin. Microbiol 2010;23:160-201

31. Tidwell TT. Hugo Schiff, Schiff Bases, and a Century of β-Lactam Synthesis. Angewandte Chemie International 2008;47:1016

32. Kong KF, Schneper L and Mathee K. Beta-lactam antibiotics: from antibiosis to resistance and bacteriology. APMIS 2009;118:1–36

33. O’Dowd JH, Lewis H, Trias J, Asano H, Blais J, Lopez SL, Park CK, Wu C, Wang W, Gordeev. Novel antibacterial azetidine lincosamides Bioorg Medi Chem Lett 2008;18.8:2645–8

34. Noolvi M, Agrawal S, Patel H, Badiger A, Gaba M, Zambre A. Synthesis, antimicrobial and cytotoxic activity of novel azetidine-2-one derivatives of 1H-benzimidazole. Arab J Chem 2014;7.2:219–26

35. Arumugam N, Periyasami G, Raghunathan R, Kamalraj S, Muthumary J. Synthesis and antimicrobial activity of highly functionalised novel β-lactam grafted spiropyrrolidines and pyrrolizidines. Eur J Med Chem 2011;46(2):600–7

36. Faust M, Höfner G, Pabel J, Wanner K. Azetidine derivatives as novel gamma-aminobutyric acid uptake inibitors: synthesis, biological evaluation, and structure-activity relationship. Eur J Med Chem 2010;45(6):2453-66

37. Metkar SD, Bhatia MS, Desai UV. Synthesis and biological evaluation of novel azetidine derivatives as dopamine antagonist. Med Chem Res 2013;22:5982-9

38. Bush K, Macielag M. New β-lactam antibiotics and β-lactamase inhibitors. Expert Opin Ther Pat 2010;20(10):1277-93

39. Dalhoff A, Janjic N, Echols R. Redefining penems. Biochem Pharm 2006;71(7):1085–95 40. Gurupadaya BM, Gopal M, Padmashali B, Manohara YN. Synthesis and Pharmacological

Evaluation of Azetidin-2-ones and Thiazolidin-4-ones Encompassing Benzothiazole. Indian J Pharm Sci 2008;70(5):572-7

41. Cohen M. Epidemiology of drug resistance: implications for a post-antimicrobial era. Science 1992;257(5073):1050-5

42. Naber CK. Staphylococcus aureus Bacteremia: Epidemiology, Pathophysiology, and Management Strategies. Clin Infect Dis 2009;48(4): 231-7

43. Chambers HF. The changing epidemiology of Staphylococcus aureus. Emerg Infect Dis 2001;7(2):178–82

44. Hawke PM, Jones AM. The changing epidemiology of resistance. J Antimicrob Chemother 2009;64(1):3-10