LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS
VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA
LINA SAVUKYNAITĖ
2,5-PAKEISTŲ TIAZOLIDINONO DARINIŲ PRIEŠVĖŽINIO
AKTYVUMO IR JŲ TOKSIŠKUMO, FARMAKOKINETINIŲ
SAVYBIŲ BEI STRUKTŪROS – AKTYVUMO RYŠIO
ĮVERTINIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovė Doc. dr. Vilma Petrikaitė
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS
VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis Data
2,5-PAKEISTŲ TIAZOLIDINONO DARINIŲ PRIEŠVĖŽINIO AKTYVUMO IR
JŲ TOKSIŠKUMO, FARMAKOKINETINIŲ SAVYBIŲ BEI STRUKTŪROS –
AKTYVUMO RYŠIO ĮVERTINIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovė
Doc. dr. Vilma Petrikaitė Data
Recenzentas Darbą atliko
Magistrantė Lina Savukynaitė
Data Data
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 6
SANTRUMPOS ... 7
ĮVADAS ... 8
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 9
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10
1.1. Naujų vaistų nuo vėžio kūrimo tendencijos ... 10
1.2. Tiazolidinono dariniai ir jų priešvėžinis aktyvumas ... 11
1.3. Navikų ir vėžio ląstelių sferoidų palyginimas ... 15
1.4. Pasirinktų vėžinių ląstelių savybių apžvalga ... 16
1.5. Ląstelių žūties būdo nustatymo reikšmė ... 17
1.6. Junginių farmakokinetikos ir toksiškumo vertinimo reikšmė ... 18
2. TYRIMO METODIKA IR METODAI ... 21
2.1. Tyrimo objektas ... 21
2.2. Reagentai, priemonės ir aparatūra ... 22
2.3. Poveikio žmogaus vėžinių ląstelių gyvybingumui tyrimas ... 23
2.4. Ląstelių žūties būdo nustatymas ... 24
2.5. Poveikio vėžio ląstelių sferoiduose tyrimas ... 24
2.6. Junginių toksiškumo ir farmakokinetinių savybių įvertinimas... 25
2.7. Statistinis duomenų apdorojimas ... 25
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 26
3.1. Poveikis vėžio ląstelių gyvybingumui ... 26
3.2. Poveikis ląstelių sferoiduose ... 28
3.3. Vėžio ląstelių žūties būdo nustatymas ... 32
3.4. 2,5-pakeistų tiazolidinono darinių farmakokinetinės savybės ir toksiškumas ... 35
4. IŠVADOS ... 41
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 42
6. DARBO REZULTATŲ PRISTATYMAS... 43
SANTRAUKA
L. Savukynaitės magistro baigiamasis darbas „2,5-pakeistų tiazolidinono darinių priešvėžinio aktyvumo ir jų toksiškumo, farmakokinetinių savybių bei struktūros – aktyvumo ryšio įvertinimas“. Mokslinė vadovė – doc. dr. V. Petrikaitė. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmacijos fakulteto Vaistų chemijos katedra. Kaunas, 2016.
Darbo tikslas – įvertinti 2,5-pakeistų tiazolidinono darinių struktūros įtaką jų priešvėžiniam aktyvumui ir atrinkti perspektyviausius junginius tolimesniems tyrimams.
Darbo uždaviniai:
1. Ištirti 2,5-pakeistų tiazolidinono darinių poveikį žmogaus vėžio ląstelių gyvybingumui 2D ir 3D kultūrose in vitro.
2. Nustatyti 2,5-pakeistų tiazolidinono darinių sukeliamą žūties būdą žmogaus vėžio ląstelėms. 3. Remiantis eksperimentinių duomenų rezultatais, nustatyti 2,5-pakeistų tiazolidinono darinių
priešvėžinio aktyvumo ir cheminės struktūros ryšio dėsningumus.
4. Įvertinti 2,5-pakeistų tiazolidinono darinių toksiškumą ir farmakokinetines savybes in silico. 5. Atrinkti perspektyviausius 2,5-pakeistus tiazolidinono darinius tolimesniems vystymo etapams.
Tyrimo metodai. Poveikis žmogaus melanomos, glioblastomos ir plaučių vėžio ląstelių gyvybingumui įvertintas MTT metodu. Junginių aktyvumas vėžio 3D kultūrose nustatytas vertinant jų poveikį ląstelių sferoidų augimui (dydžio kitimui). Ląstelių žūties būdas nustatytas ląsteles dažant fluorescenciniais dažais Hoechst 33342 ir propidžio jodidu. Junginių toksiškumas ir farmakokinetinės savybės įvertintos in silico naudojant „ACD/I-Lab“ programą.
Rezultatai. Nustatytas skirtingas 2,5-pakeistų tiazolidinono darinių priešvėžinis aktyvumas. Dauguma junginių vėžio ląstelių gyvybingumą slopino 10–50 µM koncentracijomis. Nustatytas efektyvus morfolino fragmentą turinčių junginių bei 5-pakeistų 2-(metiltio)tiazol-4(5H)-onų vėžio sferoidų augimą slopinantis poveikis. Junginiai vėžio ląstelių apoptozę sukėlė mažomis koncentracijomis, tuo tarpu nekrozės būdu ląstelės žuvo veikiamos didesnėmis junginių koncentracijomis. Priešvėžiniam aktyvumui reikšmingas prie heterociklo prijungtas 4-nitro-1-naftilamino, morfolino ar difluoranilino fragmentas. Beveik visiems tirtiems 2,5-pakeistiems tiazolidinono dariniams prognozuojamas vidutinis ar geras pasisavinamas per os, visiems junginiams būdingas stiprus jungimasis su kraujo plazmos baltymais, mažas ar vidutinis toksiškumas.
Išvados. 2,5-pakeisti tiazolidinono dariniai gali būti vertinami kaip perspektyvūs priešvėžiniai junginiai, kuriems būdingas mažas toksiškumas ir optimalios farmakokinetinės savybės.
SUMMARY
L. Savukynaitė Master Thesis: Analysis of anticancer activity of 2,5-substituted thiazolidinone derivatives, evaluation of their toxicity, pharmacokinetic properties and structure – activity relationship. Scientific supervisor – Assoc. Prof. V. Petrikaitė. Department of Drug Chemistry, Faculty of Pharmacy, Lithuanian University of Health Sciences. Kaunas, 2016.
The aim of the research was to evaluate the 2,5-substituted thiazolidinone derivatives structure influence on their anticancer activity and identify the lead compounds for their development.
Objectives:
1. To test the effect of 2,5-substituted thiazolidinones on the viability of human cancer cells in 2D and 3D cultures in vitro.
2. To identify the type of human cancer cell death induced by 2,5-substituted thiazolidinones. 3. To identify the relationship between the anticancer activity of 2,5-substituted thiazolidinone
derivatives and their chemical structure based on the experimental results.
4. To evaluate the toxicity and pharmacokinetic properties of 2,5-substituted thiazolidinones in silico.
5. To identify the lead 2,5-substituted thiazolidinones for further development.
Methods. The anticancer activity of compounds on human melanoma, glioblastoma and lung cancer cells was evaluated by using MTT assay. The activity of compounds in 3D cell cultures was evaluated by measuring changes of cancer spheroid size. The type of cancer cell death was identified by staining cells with Hoechst 33342 and propidium iodide. The toxicity of compounds and pharmacokinetic properties were evaluated in silico using ACD/I-Lab software.
Results. The anticancer activity of 2,5-substituted thiazolidinones was different. Most of the compounds inhibited the growth of cancer cells at concentrations of 10–50 µM. Compounds containing morpholine fragment and 5-substituted 2-(methylthio)thiazol-4(5H)-one effectively inhibited the growth of cancer spheroids. The compounds induced the apoptosis of cancer cell at low concentrations, meanwhile higher concentration of compounds was required to induce necrotic death in cancer cells. It is important for the anticancer activity of 2,5-substituted thiazolidinones to have 4-nitro-1-naphthylamine, morpholine or difluoroaniline substituent. Almost all tested 2,5-substituted thiazolidinones are expected to have medium or high bioavailability per os, all of them bind strongly to plasma proteins and should possess low or medium toxicity.
Conclusions. 2,5-substituted thiazolidinone derivatives could be viewed as promising anticancer compounds with low toxicity and good pharmacokinetic properties.
SANTRUMPOS
A549 žmogaus plaučių adenokarcinomos ląstelės
ADME absorbcija, pasiskirstymas, metabolizmas, šalinimas (angl. absorption, distribution, metabolism, excretion)
ATCC Amerikos ląstelių kultūrų kolekcija (angl. American type culture collection)
DMEM Dulbecc'o modifikuota Eagle ląstelių mitybinė terpė (angl. Dulbecco's Modified Eagle Medium)
DMSO dimetilsulfoksidas
FBS fetalinis veršelio serumas (angl. fetal bovine serum)
FDA Maisto ir Vaistų Agentūra (Food and Drugs Administration)
EC50 koncentracija, sukelianti 50 proc. biologinių arba biocheminių funkcijų praradimą (angl. effective concentration)
IGR39 žmogaus melanomos ląstelės
JNK c-Jun N-galo kinazė (angl. c-Jun N-terminal kinase)
LD50 medžiagos dozė, sukelianti 50 proc. laboratorinių gyvūnų mirtį (angl. lethal dose) Log BB junginio skverbimosi į smegenis laipsnio logaritmas
LogP pasiskirstymo koeficiento tarp vandens ir 1-oktanolio logaritmas MTT 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromidas
PARP poli-ADP-ribozės polimerazė
PBS fosfatinis druskų tirpalas (angl. phosphate-buffered saline)
PhRMA Amerikos vaistų tyrėjų ir gamintojų asociacija (angl. Pharmaceutical Research and Manufacturers of America)
TPSA topologinis polinis paviršiaus plotas (angl. topological polar surface area) U87 žmogaus glioblastomos ląstelės
ĮVADAS
Visame pasaulyje registruojamas didelis sergamumas onkologinėmis ligomis. PSO duomenimis, vėžiniai susirgimai yra viena pagrindinių mirtingumo priežasčių ekonomiškai išsivysčiusiose ir besivystančiose šalyse. 2012 m. pasaulyje registruota 14 mln. naujų vėžio atvejų, nuo vėžio mirė 8,2 mln. žmonių. Daugiausia mirčių sukėlė plaučių, kepenų, storosios žarnos, stemplės, krūties ir skandžio vėžys [1]. Nustatomas didėjantis naujų sergamumo atvejų skaičius vis jaunesnio amžiaus žmonių populiacijoje. 2015 m. JAV tarp jaunesnių nei 14 m. amžiaus vaikų vėžys buvo antra daugiausia mirčių sukelianti priežastis. Šioje amžiaus grupėje nuo 2007 m. iki 2011 m. sergamumas kasmet didėjo [2]. Ateities prognozės dėl vėžio sergamumo ir mirtingumo rodiklių taip pat pesimistinės. Prognozuojama, kad nuo 2050 m. naujų susirgimų onkologinėmis ligomis skaičius pasaulyje išaugs iki 27 mln., tuo tarpu mirčių nuo vėžio skaičius sieks 17,5 mln. [3]
Vėžio gydymas apima chemoterapiją, chirurginę intervenciją, spindulinę terapiją, hormonų terapiją, imunoterapiją. Vaistai nuo vėžio parenkami atsižvelgiant į vėžio tipą ir ligos stadiją [4]. Visgi tokio gydymo efektyvumą apriboja vėžio ląstelių rezistentiškumo chemoterapijai išsivystymas, kurį sukelia chemoterapiniai vaistai. Be to, priešvėžiniai vaistai, slopindami vėžio ląstelių proliferaciją, kartu veikia ir greitai besidalijančias sveikas organizmo ląsteles, o tai sukelia rimtus nepageidaujamus poveikius [5]. Šios priežastys skatina ieškoti naujų vaistų nuo vėžio.
Remiantis Maisto ir vaistų agentūros (FDA) duomenimis, per paskutiniuosius penkerius metus pastebimas naujai registruotų vaistų nuo vėžio skaičiaus didėjimas. Junginių tikimybę tapti vaistais dažnai riboja netinkamos farmakokinetinės savybės (pvz., mažas biologinis pasisavinimas) bei jų toksiškumas, todėl svarbu šiuos parametrus detaliai išanalizuoti ir įvertinti. Net 65 proc. 2010–2015 metais patvirtintų vaistų nuo vėžio yra heterociklinės struktūros junginiai. Yra žinoma, kad heterocikliniai fragmentai vaistų struktūroje turi reikšmingos įtakos jų farmakokinetinėms savybėms – keičia jų poliškumą, lipofiliškumą, kitus fizikocheminius parametrus [6].
Tiazolo ciklą turintys dariniai pasižymi įvairiu biologiniu aktyvumu, įskaitant priešvėžinį [7]. Įvairūs tiazolidinono dariniai yra aktyvūs prieš žmogaus nesmulkialąstelinio plaučių vėžio [8,9, 10,11], storosios žarnos [9,10,11], krūties vėžio [12], leukemijos ląsteles [13].
Dėl to nutarėme ištirti 2,5-pakeistų tiazolidinono darinių priešvėžinį aktyvumą ir įvertinti jų farmakokinetines savybes bei toksiškumą. Remiantis jų struktūros įtaka aktyvumui būtų vertinga atrinkti perspektyviausius junginius tolimesniems tyrimams.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas – įvertinti 2,5-pakeistų tiazolidinono darinių struktūros įtaką jų priešvėžiniam aktyvumui ir atrinkti perspektyviausius junginius tolimesniems tyrimams.
Darbo uždaviniai:
1. Ištirti 2,5-pakeistų tiazolidinono darinių poveikį žmogaus vėžio ląstelių gyvybingumui 2D ir 3D kultūrose in vitro.
2. Nustatyti 2,5-pakeistų tiazolidinono darinių sukeliamą žūties būdą žmogaus vėžio ląstelėms. 3. Remiantis eksperimentinių duomenų rezultatais, nustatyti 2,5-pakeistų tiazolidinono darinių
priešvėžinio aktyvumo ir cheminės struktūros ryšio dėsningumus.
4. Įvertinti 2,5-pakeistų tiazolidinono darinių toksiškumą ir farmakokinetines savybes in silico. 5. Atrinkti perspektyviausius 2,5-pakeistus tiazolidinono darinius tolimesniems vystymo etapams.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Naujų vaistų nuo vėžio kūrimo tendencijos
Chemoterapija vėžio gydymui pradėta taikyti 20 a. pradžioje [14]. Iki pat 2000 m. didžiąją dalį kuriamų vaistų nuo vėžio sudarė klasikiniai chemoterapiniai vaistai [15].
Pastebima, kad daugiausia vaistų nuo vėžio kuriama atsižvelgiant į sergamumo rodiklius. 1990–2014 m. daugiausia naujų vaistų sukurta prostatos, krūties ir storosios žarnos vėžio gydymui. PSO sergamumą šiomis vėžio formomis įvardija kaip vieną dažniausių. Tuo tarpu Amerikos vaistų tyrėjų ir gamintojų asociacijos (PhRMA) duomenimis, 2014 m. JAV buvo kuriama beveik 800 vaistų bei vakcinų nuo vėžio. Daugiausia iš jų skirta plaučių, leukemijos, limfomos, odos ir kiaušidžių vėžio gydymui ir prevencijai [16,17].
Visgi per paskutiniuosius 15 metų situacija naujų vaistų nuo vėžio kūrimo srityje gerokai pasikeitė (1 pav.).
1 pav. Naujų priešvėžinių vaistų kitimo tendencijos (sudaryta pagal [15])
2000–2014 m. Jungtinėje Karalystėje vėžio gydymui patvirtinti 63 nauji vaistai, iš kurių didžiausią dalį sudaro kinazių slopikliai (32 proc.), o nauji chemoterapiniai vaistai, turintys klasikinį veikimo mechanizmą, sudaro mažiau nei ketvirtadalį [15]. Tuo tarpu iš 2014 m. FDA registruotų 9 naujų vaistų nuo vėžio net 4 yra biologiniai [16].
0 5 10 15 20 25 30 Naujų vaistų n u o vė žio sk aičiu s Metai Klasikiniai chemoterapiniai Monokloniniai antikūnai Kinazių inhibitoriai
Selektyviai veikiantys priešvėžiniai vaistai nuo klasikinių chemoterapinių skiriasi tuo, kad veikia tikslinius vėžinių ląstelių taikinius, tokiu būdu selektyviai slopina šių ląstelių proliferaciją. Pavyzdžiui, kinazių slopikliams būdingas nuo ciklinų priklausančių kinazių inhibavimas [18].
Alternatyvų klasikiniams chemoterapiniams vaistams pradėta ieškoti siekiant sumažinti vaistų nuo vėžio poveikį sveikoms organizmo ląstelėms. Dėl šios priežasties kuriant naujos kartos cheminius (pvz., kinazių slopiklius) ir biologinius priešvėžinius vaistus, orientuojamasi į konkrečius taikinius. Biologiniai vaistai selektyviau veikia taikinius ir sukelia mažiau nepageidaujamų poveikių nei cheminiai vaistai, todėl jų sukuriama vis daugiau [19]. Visgi biologinė taikinių terapija dažnai derinama su chemoterapija, todėl išlieka naujų citotoksinių vaistų poreikis [20].
Kalbant apie cheminių vaistų vystymo tendencijas, reiktų paminėti, kad perspektyviausiais priešvėžiniais vaistais laikomi heterocikliniai junginiai. Būtent jų registruojama daugiausiai cheminių vaistų nuo vėžio grupėje. Iš 2010–2015 m. FDA registruotų mažos molekulinės masės vaistų nuo vėžio, dažniausiai struktūrose aptinkami heterociklai, turintys azoto heteroatomus (73 proc.). Piridino ir piperidino fragmentai yra vieni dažniausių šioje grupėje. Junginiai, turintys azoto ir sieros heteroatomus, sudarė 4 proc. visų heterociklinių vaistų. 2013 m. buvo registruotas vaistas dabrafenibas (Tafinlar®), struktūroje turintis tiazolo fragmentą. Šis vaistas skirtas melanomos, turinčios pakitusį geną BRAF V600, gydymui [6]. Taigi, stebint dabartines tendencijas, galima prognozuoti, kad naujų vaistų nuo vėžio kūrime ir toliau bus populiarūs heterocikliniai junginiai.
1.2. Tiazolidinono dariniai ir jų priešvėžinis aktyvumas
Tiazolidinonai yra heterocikliniai junginiai, kurių penkianario žiedo pirmoje padėtyje yra sieros atomas, trečioje – azoto atomas, tuo tarpu karbonilo grupė gali būti antroje, ketvirtoje ar penktoje padėtyse (2 pav.). Į struktūrą įvesti pakaitai lemia skirtingas junginių savybes ir jų biologinį poveikį [21].
2 pav. 4-tiazolidinono struktūra
Imidazolilo liekaną turinčių tiazolidin-4-onų (3 pav.) priešvėžinis aktyvumas buvo tirtas naudojant pelių ir žmogaus leukemijos ląstelių linijas in vitro. Labiausiai ląstelių proliferaciją slopino junginiai 4h, 4j, 4m, 4o (EC50 reikšmės 8,6–19 µM). Šios grupės junginiai, į kurių fenilo ciklą įjungti
du halogeno pakaitai, pasižymėjo didesniu priešvėžiniu aktyvumu, nei junginiai su metoksi ar metiltio grupėmis. Fluoro pakeitimas chloru junginių aktyvumo reikšmingai nepakeitė [13].
3 pav. Imidazolilo fragmentą turintys 4-tiazolidinono dariniai
5-benzilideno ir 2-fenilimino pakaitus turintys 4-tiazolidinonai 5a ir 5b (4 pav.) efektyviai slopino žmogaus nesmulkialąstelinio plaučių vėžio ir storosios žarnos vėžio ląstelių proliferaciją. Šie junginiai sukėlė vėžio ląstelių apoptozę, lemiamą c-Jun N-galo kinazė (JNK) aktyvacijos. Tyrimas parodė, kad net ir nedidelės junginių struktūrų modifikacijos turi reikšmingą įtaką jų priešvėžiniam aktyvumui. Junginių 5a ir 5b struktūros skiriasi tik 5-benzilideno žiedo pakaitais, tačiau būtent šis skirtumas lėmė jų aktyvumą prieš skirtingas vėžio ląstelių linijas. Junginys 5a labiau slopino plaučių vėžio (EC50 = 4,9–8,0 μM), o junginys 5b – žarnos vėžio ląstelių augimą (EC50 = 1,6–5,9 μM) [9,10,11].
4 pav. Benzilideno ir fenilimino fragmentus turintys 4-tiazolidinono dariniai, aktyvūs prieš plaučių (5a) ir storosios žarnos (5b) vėžio ląsteles
Nustatytas 4-tiazolidinono darinių, turinčių pirazolino ar benzotiazolo fragmentą, bei 4iminotiazolidinono darinio (5 pav.) sukeliamas ląstelių žūties būdas fluorescencinės mikroskopijos būdu. Nudažius žiurkėno T-leukemijos ląsteles fluorescenciniais dažais aneksinu V ir propidžio jodidu, nustatyta, kad 4-iminotiazolidinono darinys (Les-3372), bei tiazolidinono dariniai, struktūroje turintys pirazolino (Les-3120) ir benztiazolo (Les-3166) fragmentus, sukėlė ląstelių žūtį apoptozės būdu (5 μM koncentracijomis) [22]. Kadangi tyrimas atliktas tik su 5 μM koncentracijų tirpalais, nėra aišku, ar ląstelių žūties būdas priklauso nuo junginio koncentracijos.
5 pav. 4-iminotiazolidinono darinys (Les-3372); 4-tiazolidinono dariniai, turintys pirazolino (Les3120) ir benzotiazolo (Les-3166) fragmentą
Tiriant 2-heteroarilimino-1,3-tiazolidi-4-nonų (6 pav.) priešvėžinį aktyvumą nustatyta, kad junginių aktyvumui reikšmingi penktoje 4-tiazolidinono padėtyje prijungti pakaitai. Didžiausiu žmogaus storosios žarnos vėžio adenokarcinomos HT-29 ląstelių proliferaciją slopinančiu poveikiu pasižymėjo junginiai, šioje padėtyje turintys benzilideno pakaitus (EC50 vertės yra mažesnės nei 12 µM). Junginiai, benzilideno para padėtyje turintys halogeno ar metoksigrupes, buvo žymiai aktyvesni nei junginys, šioje padėtyje turintis hidroksilo grupę [8].
Viena iš priešvėžinių vaistų kūrimo strategijų yra apoptozės vėžio ląstelėms sukėlimas veikiant ląstelės ciklo G2/M fazę. Nustatyta, kad minėti junginiai, aktyviai slopinantys vėžio ląstelių proliferaciją, sukėlė ląstelių žūtį apoptozės būdu, veikdami ląstelės dauginimąsi būtent šioje ląstelės ciklo fazėje (junginių koncentracijos pasirinktos, atsižvelgiant į nustatytas EC50 vertes) [8].
6 pav. Tiazolidinono darinių, veikiančių žmogaus storosios žarnos vėžio ląsteles, bendroji formulė
4-tiazolidinono dariniams nustatytas aktyvumas prieš žmogaus krūties vėžio MCF7 ląsteles. Isloor A. ir kt. atliktas tyrimas parodė, kad junginiai 6a, 6b ir 6c (7 pav.) efektyviai slopino MCF7 ląstelių proliferaciją (EC50 vertės buvo atitinkamai 64, 44 ir 58,7 µM). Junginiai 6b ir 6c struktūrose turi metilo grupes, prijungtas prie benzeno žiedo, jos siejamos su junginių aktyvumu. Visgi autoriai pažymi, kad į struktūrą įjungtos metilo grupės padidina junginių lipofiliškumą, gali pabloginti tokių junginių farmakokinetines savybes. Taip pat pastebėta, kad mažus pakaitus struktūrose turintys junginiai yra aktyvesni nei turintys didesnes grupes [12].
7 pav. 4-tiazolidinono dariniai, aktyviai slopinantys krūties vėžio ląstelių proliferaciją
Nustatytas 2,3-diaril-4-tiazolidinonų (8 pav.) struktūros ir priešvėžinio aktyvumo ryšys. Reikšmingą įtaką junginių, įjungtų į benzeno žiedą (A), aktyvumui turi pakaitų pobūdis ir padėtis.
Pastebėta, kad pakaitus orto padėtyje turintys junginiai pasižymi didesniu aktyvumu nei meta ar para. Elektronų donoriniai pakaitai, įjungti į A žiedą, lemia stipresnį vėžio ląstelių proliferaciją slopinantį poveikį, nei elektronų akceptoriai. Remiantis junginių poveikio nesmulkialąstelinio plaučių vėžio A549 ir žmogaus krūties vėžio MDA MB-231 ląstelių gyvybingumui tyrimo rezultatais, nustatyta C žiedo reikšmė junginių aktyvumui. Junginiai, turintys į C žiedo meta padėtį įjungtą bromo pakaitą, yra aktyvesni nei junginiai, šį pakaitą turintys para padėtyje. Bromo pakeitimas kitais halogenų pakaitais, elektronų donorinėmis grupėmis ar nitro grupės įjungimas į C žiedą taip pat reikšmingai sumažina junginių aktyvumą, tačiau amino karbonilo grupę šio žiedo trečioje padėtyje turintys junginiai pasižymėjo didžiausiu aktyvumu. Autoriai pastebėjo, kad 3-bromfenilo žiedo pašalinimas ar heterociklų prijungimas sumažina 2,3-diaril-4-tiazolidinonų aktyvumą [23].
8 pav. 2,3-diaril-4-tiazolidinonų struktūra
Aptarti tyrimai in vitro sąlygomis parodė, kad 4-tiazolidinono dariniai gali būti vertinami kaip perspektyvūs priešvėžiniai vaistai. Daugelyje tyrimų buvo nustatytas tiazolidinono darinių poveikis ląstelių proliferacijai, tuo tarpu nepavyko rasti atliktų tiazolidinono darinių aktyvumo tyrimų ląstelių sferoiduose (3D ląstelių kultūrose). Todėl buvo nutarta įvertinti junginių aktyvumą 3D kultūrose (sferoiduose), kadangi šie tyrimai tiksliau atkartoja realias sąlygas organizme nei 2D kultūrose (ląstelių monosluoksnyje).
1.3. Navikų ir vėžio ląstelių sferoidų palyginimas
Junginių priešvėžinis aktyvumas dažnai atliekamas klasikiniu būdu ląstelių monosluoksnyje, tačiau tikslesnių sąlygų atkarojimui in vivo labiau tinkamas sferoidų (ląstelių darinių) formavimas in vitro. Sferoidus (3D modelį) galima laikyti solidinių navikų analogu [24]. Sferoido ir naviko panašumai ir skirtumai pateikti 9 paveiksle. Sferoido, kurio diametras ne mažesnis nei 200 µm, paviršiuje esančios ląstelės pakankamai aprūpinamos maisto medžiagomis ir deguonimi, todėl vyksta aktyvi šių ląstelių proliferacija. Tuo tarpu ląstelių, esančių sferoido viduje, aprūpinimas maisto medžiagomis ir deguonimi yra menkas, todėl šios ląstelės išlieka ramybės būsenoje [25,26]. Nustatyta,
kad vėžio ląstelių sferoiduose, kurių skersmuo didesnis nei 0,5 mm, sumažėja aprūpinimas deguonimi, mitybinėmis medžiagomis. Metabolitų, citokinų, chemokinų ir augimo faktorių difuzija yra panaši kaip ir navike. Didesnio skersmens sferoiduose, kaip ir navikuose, susidaro nekrozė, o atsiradusios hipoksijos sąlygos dažnai tampa vėžio ląstelių rezistentiškumo vaistams priežastimi. Esant hipoksijos sąlygoms pakinta genų ekspresija, sutrikdomas glikolizės procesas, sumažėja pH. 3D modelyje, skirtingai nuo 2D, susiformuoja ryšiai tarp ląstelių, kurios būdingos ir navikui in vivo. Taip pat nustatyta, genų ekspresija 3D modeliuose ir navike yra panaši, o 2D modelyje skiriasi [27]. Dėl šių priežasčių tiriamų junginių aktyvumas 2D ir 3D modeliuose dažnai skiriasi. Nors vaistų patekimas į sferoidą ir naviką yra panašus, tačiau 3D modelyje nėra įvertinama fiziologinių barjerų įtaka tiriamų junginių patekimui į naviką [25].
9 pav. Naviko ir vėžio ląstelių sferoido skirtumai (paveikslas modifikuotas pagal [28])
Apibendrinant galima pasakyti, kad tyrimai sferoiduose tiksliau atkartoja natūralias sąlygas organizme, todėl yra labiau patikimi lyginant su tyrimais ląstelių monosluoksnyje in vitro.
1.4. Pasirinktų vėžinių ląstelių savybių apžvalga
Tyrimams pasirinkome tris skirtingas ląstelių linijas: žmogaus nesmulkialąstelinio plaučių vėžio (A549), melanomos (IGR39) ir glioblastomos (U87). Tiriant naujus junginius, kurių taikiniai nėra žinomi, pasirenkamos skirtingos ląstelių linijos, kadangi galimas selektyvus junginių veikimas konkrečioms ląstelėms. Ląstelių linijos pasirinktos atsižvelgiant į didelius sergamumo, mirtingumo rodiklius.
Plaučių vėžys įvardijama kaip viena dažniausių vėžio sukeltų mirčių priežasčių. Apie 70 proc. pacientų liga diagnozuojama tik III ar IV stadijos [29,30]. Pacientų, kuriems plaučių vėžys
diagnozuotas vėlyvose stadijose, prognozė yra bloga. IIIB stadijos nesmulkialąstelinio plaučių vėžio forma sudaro 17,6 proc. visų vėžio formų [30,31], 5 metų išgyvenamumas siekia 3–7 proc. [30,32] Tyrimams pasirinkome A549 žmogaus plaučių adenokarcinomos ląsteles. A549 ląstelių linija plačiai naudojama citototoksiškumo ir vaistų metabolizmo tyrimuose in vitro sąlygomis [33].
Melanoma yra viena agresyviausių odos vėžio formų. Sergamumas melanoma sudaro apie 1 proc. visų odos vėžio formų [34], tačiau mirtingumas siekia apie 90 proc. visų odos vėžio formų sukeltų mirčių [35]. Naujų efektyvesnių gydymo būdų vystyme didesnis dėmesys skiriamas išplitusios ir metastazavusios melanomos atvejamas. Nustatyta, kad išplitusios melanomos gydymui taikant tik monoterapiją dakarbazinu naviko sumažėjimo dažnis (objektyvaus atsako dažnis) siekia 5–25 proc., tuo tarpu polichemoterapijos atveju – iki 45 proc. Vis dėto, nei vienas iš šių atvejų nepagerina bendrojo išgyvento laikotarpio rodiklio [34,35,36]. Nors taikinių terapija ir imunoterapija vertinamos kaip perspektyvios strategijos gydant melanomą [36], tačiau dideli sergamumo rodikliai nesumažina naujų gydymo būdų poreikio. Tyrimams pasirinktos IGR39 yra pirminės žmogaus odos vėžio ląstelės, kurioms būdingas greitas metastazavimas.
Glioblastoma yra viena dažniausiai pasitaikančių smegenų vėžio formų. Glioblastoma sergančių pacientų išgyvenamumo prognozė vidutiniškai siekia 14,6 mėnesio [38,39,40]. Dažniausiai taikoma gydymo terapija apima chirurginę intervenciją, radioterapiją, chemoterapiją temozolomidu, tačiau ne visada pavyksta pasiekti laukiamų rezultatų. Gydymą apsunkina glioblastomai būdingas rezistentiškumas chemoterapijai [38]. Glioblastomai būdingas ir heterogeniškumas [38]. Ieškant efektyvesnių gydymo būdų orientuojamasi į taikinių terapijos taikymo galimybes. Iki šiol atlikti tyrimai su tirozinkinazių inhibitoriais ir signaliniai transdukcijos inhibitoriais neparodė laukiamų rezultatų. Šios priežastys lemia naujų efektyvesnių gydymo būdų poreikį [41,42]. Tyrimams pasirinktos U87 yra pirminės žmogaus glioblastomos ląstelės.
Tyrime naudotos ląstelės skiriasi lokalizacijos vieta, fenotipu ir pasižymi skirtingu atsparumu.
1.5. Ląstelių žūties būdo nustatymo reikšmė
Priešvėžiniai vaistai sukelia vėžinių ląstelių žūtį apoptozės ir (ar) nekrozės būdu [43]. Apoptozės (dar vadinama pirmo tipo programuota ląstelių žūtimi) būdu sveikame organizme pašalinamos pasenusios, nereikalingos ląstelės. Pakitimai apoptozės procese sutrikdo balansą tarp ląstelės proliferacijos ir jos žūties, o tai gali sąlygoti vėžio atsiradimą. Daugelyje vėžinių ląstelių apoptozės mechanizmas yra sutrikęs, ląstelėse dėl mutacijų pro-apoptotiniai baltymai tampa neaktyvūs arba anti-apoptotinių baltymų ekspresija yra nekontroliuojama. Šios priežastys lemia nekontroliuojamą vėžio augimą ir rezistentiškumą gydymui [44]. Daugumos naujų priešvėžinių vaistų
kūrime orientuojamasi į molekulinius taikinius siekiant atstatyti vėžio ląstelių apoptozės mechanizmą [19,44,45].
Sprendžiant vėžinių ląstelių rezistentiškumo apoptozei problemą pradėta domėtis kitų ląstelių žūties būdų reikšme vėžio terapijoje. Atliktų tyrimų in vitro ir in vivo sąlygomis rezultatai parodė, kad kartu su chemoterapiniais vaistais vartojami autofagijos inhibitoriai efektyviau slopino vėžinių ląstelių proliferaciją nei taikant tik chemoterapiją. Nustatyta, kad autofagija apsaugo vėžio ląsteles nuo pažaidų esant stresinėms sąlygoms, o tai gali paskatinti vėžio vystymąsi. Tuo tarpu autofagijos indukcija gali būti vertinama kaip perspektyvi strategija chemoprevencijoje [46].
Nekrozė yra nekontroliuojamas ląstelių žūties būdas. Teoriškai nekrozės sukėlimas vėžinėms ląstelėms galėtų būti laikomas kaip alternatyva, kai nepavyksta pasiekti vėžinių ląstelių žūties apoptozės būdu [43]. Praktikoje į klinikinius tyrimus įtraukti poli-ADP-ribozės polimerazės (PARP) slopikliai, kurie blokuoja ląstelių žūtį nekrozės būdu. Nustatyta, kad PARP slopiklių derinimas kartu su chemoterapija gali padidinti vėžinių ląstelių žūtį apoptozės būdu, kurį paskatina nuo PARP priklausomo vėžinių ląstelių DNR trūkių atstatymo slopinimas [44,47]. Nekrozė susijusi su uždegiminiais procesais, kurie pasunkina gydymą, todėl vėžio terapijoje nekrozės dažnai stengiamasi išvengti [22].
Vystant priešvėžinius vaistus, orientuojamasi į vėžio ląstelių žūties sukėlimą apoptozės būdu. Kitų priešvėžiniais vaistais sukeliamų žūties būdų nustatymas ir jų valdymas gali reikšmingai prisidėti prie efektyvesnio onkologinių ligų gydymo.
1.6. Junginių farmakokinetikos ir toksiškumo vertinimo reikšmė
20 a. pabaigoje buvo vykdomi intensyvūs junginių struktūros ir farmakokinetinių savybių ryšio tyrimai, po to kai buvo pastebėta, jog dauguma naujų vaistų atkrenta pradinėje klinikinių tyrimų fazėje dėl netinkamų farmakokinetinių savybių [48,49]. Autoriai teigia, kad 2000 metais tokių junginių buvo apie 10 proc. Biologinis pasisavinimas yra svarbus veiksnys vykdant perspektyviausių junginių atranką [49]. Junginių tyrimai in silico prognozuoja junginių absorbciją ir biopasisavinimą pavartojus per os.
Junginių absorbciją ir biologinį pasisavinimą galima įvertinti remiantis Lipinskio penketo taisykle, kuri atsižvelgia į šiuos fizikocheminius parametrus: junginio molekulinė masė, vandenilinio ryšio akceptorių ir donorų skaičius junginio molekulėje, logP vertė. Ši taisyklė taikoma junginių, pavartotų per os, absorbcijos pasyviuoju difuzijos būdu vertinimui. Junginiams prognozuojam gera absorbcija, jei:
molekulėje yra mažiau nei 10 vandenilinio ryšio akceptorių;
junginio molekulinė masė yra mažesnė nei 500;
logP vertė yra mažesnė nei 5 [50].
Veberis ir kt. prie šių penketo taisyklės reikalavimų papildomai pridėjo dar du (Veberio taisyklė):
topologinis polinis paviršiaus plotas (TPSA) ne didesnis nei 140 Å2
, arba vandenilinio ryšio donorų bei akceptorių suma turi būti ne didesnė nei 12;
lanksčiųjų jungčių skaičius molekulėje turi būti ne didesnis nei 10 [51,52].
Tyrimų metu nustatyta, kad pelėms per os pavartojus junginių, kurių molekulėje yra daugiau nei 10 lanksčiųjų jungčių, biologinis pasisavinimas buvo mažesnis nei junginių, molekulėje turinčių mažiau nei 10 lanksčiųjų jungčių. Kito atlikto tyrimo duomenimis, 47 proc. analizuotų junginių, turėjusių neatitikimų Lipinskio penketo taisyklės reikalavimais, buvo atmesti ikiklinikinių tyrimų fazėje dėl netinkamų farmakokinetinių savybių [50].
LogP laikomas svarbiu parametru vertinant junginių lipofiliškumą ir tuo pačiu prognozuojant junginių gebėjimą pereiti iš vandeninės terpės pro ląstelių membranas in vivo. Esant mažam lipofiliškumui nukenčia ADME (absorbcija, pasiskirstymas, metabolizmas ir pašalinimas) savybės, tačiau taip pat netinkamas ir per didelis junginių lipofiliškumas, nes padidėja junginio toksiškumas ir mažėja metabolinis klirensas. Pagal Lipinskio penketo taisyklę logP vertė turi būti mažesnė nei 5, tuo tarpu kai kurių autorių teigimu junginio savybės yra optimaliausios, kai logP vertė yra 1–3 intervale. Eksperimentiniu būdu logP vertė nustatoma apskaičiavus junginio pasiskirstymą tarp vandeninės ir nevandeninės fazių (pvz., vandens/ n-okanolio sistemoje) [52,53].
Nustatyta, kad didelis vandenilinio ryšio donorų bei akceptorių skaičius molekulėje sumažina junginio gebėjimą pereiti pro ląstelių membranų lipidų bisluoksnį. Lanksčiųjų jungčių skaičius molekulėje susijęs su junginio molekuline mase. Autoriai teigia, kad sumažėjęs biopasisavinimas koreliuoja su didele junginio molekuline mase, kuri susijusi su didesniu molekulės lankstumu, dideliu molekulės TPSA ir vandenilinių jungčių skaičiumi. Dažniausiai didelis vandenilinių jungčių skaičius ir TPSA susijęs su didesne molekuline mase [51,53,54]. Veberis ir kt. atliko tyrimą su žiurkėmis siekdami išsiaiškinti junginio molekulinės masės ir lanksčiųjų jungčių skaičiaus molekulėje ryšį biologiniam pasisavinimui. Tyrimui atrinkti junginiai buvo suskirstyti į tris grupes pagal lanksčiųjų jungčių skaičių: turintys ≤ 7, turintys 8–10, turintys > 10 lanksčiųjų jungčių molekulėje. Kiekvienos grupės junginiai suskirstyti į du pogrupius: junginiai, kurių molekulinė masė < 500, ir junginiai, kurių molekulinė masė ≥ 500. Nustatyta, kad apie 65 proc. junginių, kurių lanksčiųjų jungčių skaičius ne didesnis nei 7, nepriklausomai nuo molekulinės masės turi didesnį nei 20 proc. biologinį pasisavinimą. Tuo tarpu daugiau nei 75 proc. junginių, turinčių daugiau nei 10 lanksčiųjų jungčių,
nepriklausomai nuo molekulinės masės turėjo mažesnį nei 20 proc. biopasisavinimą ir buvo eliminuoti iš tolimesnių tyrimų [51].
TPSA laikomas svarbiu parametru vertinant junginių gebėjimą pereiti pro hematoencefalinį barjerą ir absorbciją pasyviosios difuzijos būdu. Vertinant TPSA reikšmę junginių biologiniam pasisavinimui nustatyta, kad junginiai, kurių TPSA vertė didesnė už 140 Å2
, absorbuojasi blogai (<10 proc.). Jei TPSA vertė ≤60 Å2
, junginio absorbcija gali siekti daugiau nei 90 proc. [51]
Junginių perėjimas pro hematoencefalinį barjerą dažnai tampa pagrindine problema naujų CNS veikiančių vaistų kūrime. Kraujagyslių tinklas smegenyse yra labai tankus, mažos molekulės lengvai prasiskverbia pro hematoencefalinį barjerą ir greitai pasiskirsto smegenų audinyje. Riebaluose tirpios, mažos molekulės (molekulinė masė < 400 Da) patenka į smegenis pasyviosios difuzijos būdu. Pastebėta, kad vykdant chemines modifikacijas, padidinančias junginių lipofiliškumą, kartu padidėja ir junginių pasiskirstymas audiniuose. Dauguma dabartinių vaistų smegenų vėžiui gydyti yra didelės hidrofobinės molekulės, kurios nepereina hematoencefalinio barjero ir yra pašalinamos. Iš priešvėžinių vaistų hematoencefalinį barjerą pereina tik irinotekanas, melfalanas ir temozolomidas. Dėl šios priežasties naujai diagnozuotų gliomų gydymui dažnai derinama spindulinė terapija kartu su chemoterapija temozolomidu [55].
Toksikologiniai tyrimai svarbūs vykdant junginių atranką. 2006–2010 metais dėl toksiškumo į klinikinius tyrimus nepateko 22 proc. tirtų junginių [56]. In silico programos plačiai taikomos prognozuoti junginių toksiškumą. Rezultatų tikslumui derinami in vivo, in vitro bei in silico metodai. Toksiškumui vertinti naudojamas LD50 rodiklis, nurodantis dozę, nuo kurios miršta 50 proc. populiacijos. Pagal LD50 vertes (pavartojus per os), toksiškumas klasifikuojamas [57]:
labai didelis toksiškumas: < 1 mg/kg;
didelis toksiškumas: 1–50 mg/kg;
vidutinis toksiškumas: 50–500 mg/kg;
mažas toksiškumas: 500–5000 mg/kg;
labai mažas toksiškumas: 5000–15000 mg/kg;
medžiaga netoksiška: > 15000 mg/kg.Dėl nepalankių farmakokinetinių savybių ir toksiškumo didelė dalis junginių nepatenka į tolimesnius tyrimus, kadangi junginiai nepasižymi reikiamomis savybėmis ar dėl didelio toksiškumo rodiklių. In silico metodais galima paprastai ir gana tiksliai prognozuoti junginių farmakokinetines savybes bei toksiškumą. Taigi, junginių farmakokinetinių savybių ir toksiškumo tyrimai reikšmingi atliekant perspektyviausių junginių atranką.
2. TYRIMO METODIKA IR METODAI
2.1. Tyrimo objektas
Tyrimo objektas – 2,5-pakeisti tiazolidinono dariniai (10 ir 11 pav.), susintetinti dr. Vilmos Petrikaitės (LSMU Vaistų chemijos katedra).
11 pav. 2,5-pakeisti tiazolidinono dariniai, antroje padėtyje turintys morfolino (VIL2-3, VIL2-13, VIL2-15, VIL216), sulfametizolio (VIL3-13, VIL3-14), 4-nitro-1-naftilamino (VIL10-2) ir
2,4-difluoranilino (VIL15-1) fragmentus
Šių junginių struktūra patvirtinta infraraudonųjų spindulių (IR), branduolių magnetinio rezonanso (BMR) spektroskopijos metodais, grynumas įvertintas efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodu. Junginių grynumas yra 95–99,7 proc.
2.2. Reagentai, priemonės ir aparatūra
Reagentai:
Dulbecc'o modifikuota Eagle ląstelių mitybinė terpė (DMEM, Gibco);
Fetalinis veršiukų serumas (FBS, Gibco);
Fosfatinis druskų tirpalas (PBS) pH 7,4 (Gibco);
3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromidas (MTT) (Sigma-Aldrich, ≥97);
Tripsino tirpalas TrypLE™ Express (Gibco);
1 proc. antibiotikų tirpalas (10000 vienetų/ml penicilino ir 10 mg/ml streptomicino, Gibco);
Propidžio jodidas (1 mg/ml vandeninis tirpalas, Thermo Fisher Scientific);
Hoechst 33342 (10 mg/ml vandeninis tirpalas, Thermo Fisher Scientific);
Nanodalelės Nanoshuttle (Nano3D Biosciences).
Žmogaus vėžinės ląstelės:
nesmulkialąstelinio plaučių vėžio (A549, ATCC);
melanomos (IGR39, ATCC);
glioblastomos (U87, ATCC).
Aparatūra:
Mikroplokštelių spektrofotometras Multiskan go (Thermo Fisher Scientific);
Fluorescencinis mikroskopas Olympus TH4-200 (Olympus);
Automatizuotas fazinio kontrasto mikroskopas EVOS FL Auto (Thermo Fisher Scientific);
Centrifuga Eppendorf Centrifuge 5424 (Eppendorf).
2.3. Poveikio žmogaus vėžinių ląstelių gyvybingumui tyrimas
Žmogaus vėžinių ląstelių linijos A549, U87, IGR39 auginamos monosluoksniu DMEM mitybinėje terpėje, papildytoje 10 proc. FBS ir 1 proc. antibiotikų. Ląstelės inkubuojamos 37 o
C temperatūroje, 5 proc. CO2 turinčioje aplinkoje.
Ląstelių suspensija ruošiama jas perplovus 1 ml PBS ir painkubavus su 1 ml tripsino 5–6 min. 37°C temperatūroje. Į ląsteles pilama 9 ml mitybinės terpės, centrifuguojama 5 min. 1000 aps./min greičiu. Supernatantas nupilamas, ląstelės suspenduojamos 1 ml terpės ir suskaičiuojamos hemocitometru.
Į 96 šulinėlių plokšteles pilama po 100 µl suspensijos taip, kad kiekviename šulinėlyje būtų 3000 (U87) arba 2000 (A549, IGR39) ląstelių. Ląstelės inkubuojamos 24 val. 37 oC temperatūroje, 5 proc. CO2 turinčioje aplinkoje.
Tiriamųjų junginių tirpalai ruošiami DMSO. Šie tirpalai skiedžiami mitybine terpe gaminat serijinius praskiedimus ir pilami po 100 μl į 96 šulinėlių plokšteles su ląstelėmis. Junginių koncentracijos šulinėliuose yra nuo 0,2 μM iki 50 μM. Neigiama kontrolė buvo mitybinė terpė su 0,5 proc. DMSO, o teigiama kontrolė – mitybinė terpė su 50 proc. DMSO (tokia koncentracija nužudo visas ląsteles). Ląstelės, paveiktos junginiais, inkubuojamos 72 val. 37 oC temperatūroje, 5 proc. CO
2 turinčioje aplinkoje. Po 72 val. į kiekvieną šulinėlį įpilama po 20 μl MTT dažo (5 mg/ml koncentracijos) ir inkubuojama 2 val. Tuomet skystis nupilamas nuo ląstelių, susidarę kristalai tirpinami 100 μl DMSO. Susidariusių formazano kristalų koncentracija, kuri atitinka gyvybingų ląstelių skaičių, nustatoma spektrofotometriškai, absorbciją matuojant 560 nm ir 630 nm bangos ilgiuose.
2.4. Ląstelių žūties būdo nustatymas
Ląstelių suspensijos paruošiamos anksčiau aprašytu būdu (žr. 2.3. skirsnį). Į 24 šulinėlių plokšteles ląstelės sėjamos po 500 μl taip, kad kiekviename šulinėlyje būtų po 20000 ląstelių. Ląstelės inkubuojamos 24 val. 37 oC temperatūroje, 5 proc. CO2 turinčioje aplinkoje.
Reikiamos tiriamųjų junginių koncentracijos gaunamos skiedžiant tiriamųjų junginių tirpalus mitybine terpe. Po 24 val. į kiekvieną šulinėlį įpilama po 100 μl paruoštų skiedinių. Junginių koncentracijos šulinėliuose: 12,5 μM, 25 μM ir 50 μM. Po 48 val. inkubacijos su junginiais 37 o
C temperatūroje, 5 proc. CO2 turinčioje aplinkoje. terpė nusiurbiama, perplaunama PBS ir įpilama po 500 μl šviežios terpės. Į kiekvieną šulinėlį įpilama po 3 μl fluorescencinio dažo Hoechst 33342 (1 mg/ml koncentracijos) ir 1 μl propidžio jodido (1 mg/ml koncentracijos). Ląstelės su dažais inkubuojamos 10 min. Po 10 min. ląstelių žūties būdas nustatomas fluorescencinės mikroskopijos būdu. Gyvybingų ląstelių branduoliai švyti ryškiai mėlyna spalva. Nekrotinių ląstelių branduoliai nusidažo raudonai, o apoptotinių ląstelių branduoliai švyti šviesiai mėlyna spalva, yra kondensuoti, fragmentuoti. Daromos nuotraukos 4× didinimu. Pagal turimus duomenis apskaičiuotos apoptotinių ir nekrotinių ląstelių procentinis kiekis. Procentinės dalys skaičiuojamos vizualiniu būdu nuo bendro pasirinkto ląstelių skaičiaus (100 ląstelių).
2.5. Poveikio vėžio ląstelių sferoiduose tyrimas
Vėžio ląstelių sferoidai formuojami 3D Bioprinting metodu iš U87 ir A549 ląstelių. Ląstelės inkubuojamos 8–10 val. su 20 µl nanodalelių „Nanoshuttle“ 37 oC temperatūroje, 5 proc. CO2 atmosferoje 6 šulinėlių plokštelėje. Tada ruošiama ląstelių suspensija mitybinėje terpėje ir išpilstoma į
labai mažo prilipimo 96 šulinėlių plokšteles po 100 µl taip, kad kiekviename šulinėlyje būtų po 800 U87 ir 1000 A549 ląstelių. Plokštelė uždedama ant specialios magnetinės plokštelės ir inkubuojama 37 oC temperatūroje, 5 proc. CO2 atmosferoje.
Po 48-82 val. į kiekvieną šulinėlį su susidariusiu šulinėlio centre vėžio ląstelių sferoidu pilami mitybinėje terpėje paruošti 50 µM tiriamųjų junginių tirpalai. Sferoidų terpė su junginiais keičiama kas 2-3 dienas, prieš terpės pakeitimą sferoidai fotografuojami fazių kontrastiniu mikroskopu 4× didinimu.
Junginių poveikis sferoidams vertinamas pagal sferoidų dydžio pokytį, apskaičiuojant jų skersmens kitimą ImageJ programa.
2.6. Junginių toksiškumo ir farmakokinetinių savybių įvertinimas
Junginių farmakokinetiniai parametrai ir toksiškumas įvertinti in silico naudojant programą „ACD/I-Lab“. Programa pagal struktūrinę junginio formulę apskaičiuoja įvairius parametrus. Naudoti programos moduliai nustatantys junginių fizikines-chemines savybes, toksiškumą, biopasisavinimą, pasiskirstymo tūrį (VD), jungimąsi su kraujo plazmos baltymais ir perėjimą pro hematoencefalinį barjerą. Pagal programos „ACD/I-Lab“ nustatytus fizikinius-cheminius parametrus (molekulinę masę, logP reikšmę, vandenilinį ryšį donuojančių ir akceptuojančių grupių bei lanksčiųjų jungčių skaičių junginio molekulėje) vertintas junginių atitikimas Lipinskio penketo taisyklei.
2.7. Statistinis duomenų apdorojimas
Duomenys apdoroti naudojant paketą „MS Excel 2010“ įvertinant mažiausiai trijų matavimų vidurkius ir santykinius standartinius nuokrypius. Vidurkiai buvo palyginti naudojant Student'o t kriterijų, o skirtumai laikomi statistiškai patikimais, kai reikšmingumo lygmuo p < 0,05.
Poveikio ląstelių proliferacijai tyrimo duomenys normalizuojami nuo 0 iki 1 (0 atitinka neigiamą kontrolę, o 1 – teigiamą kontrolę). Apskaičiuojama efektyvioji koncentracija (EC50), kuri nurodo junginio koncentraciją, slopinančią 50 proc. vėžinių ląstelių augimą.
Koreliacija tarp tyrimų rezultatų 2D ir 3D ląstelių kultūrose įvertinta apskaičiavus Pearson‘o koreliacijos koeficientą (r) ir įvertinus ryšio stiprumą ir patikrinus koreliacijos koeficiento patikimumą. Koreliacija laikoma stipria, kai koreliacijos koeficientas yra nuo 0,7 iki 1 (arba nuo -1 iki -0,7), vidutinė, kai koreliacijos koeficientas yra tarp 0,5 iki 0,7 (arba nuo -0,7 iki -0,5), silpna, kuomet r yra tarp 0,2 ir 0,5 (arba nuo -0,5 iki -0,2).
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1. Poveikis vėžio ląstelių gyvybingumui
Dauguma tirtų junginių turėjo skirtingą poveikį gyvybingumui. Junginių poveikis pavaizduotas 12 paveiksle.
12 pav. Aktyviausių 2,5-pakeistų tiazolidinono darinių EC50 vertės IGR39, A549 ir U87 ląstelėms.
Daugiau nei pusė tirtų junginių (vienuolika iš šešiolikos) veikė bent vieną ląstelių liniją. Nei vienos ląstelių linijos neveikė junginiai VIL1-19, VIL1-21, VIL2-13, VIL15-1, VIL3-13. Junginiai turėjo skirtingą poveikį skirtingoms ląstelių linijoms. Verta paminėti, kad U87 ląsteles veikė tik 5 junginiai: VIL1-4, VIL1-8, VIL1-11, VIL3-14, VIL10-2. Tai gali lemti mažas glioblastomos ląstelių jautrumas. Ši tendencija pastebėta ir atliekant kitus eksperimentus su smegenų vėžio ląstelėmis. Pavyzdžiui, ištyrus benzo[d]pirol[2,1-b]tiazolo darinių priešvėžinį aktyvumą, nustatyta, kad daugelis junginių U87 ląstelių proliferaciją slopino didesnėmis koncentracijomis nei burnos ertmės (OECM-1), plaučių (H1299) ar prostatos (PC-3) vėžio ląsteles [58]. Tai atskleidžia ir problemą, kodėl sukuriama gana mažai naujų vaistų smegenų vėžio gydymui: 1998–2014 m. FDA registruota dešimt naujų vaistų plaučių vėžio, septyni melanomos ir vos trys smegenų vėžio gydymui [59]. Visi junginiai, išskyrus VIL10-2, glioblastomos ląsteles veikė didesnėmis nei 10 µM koncentracijomis. Temozolomidas (vienas dažniausiai skiriamų vaistų smegenų vėžio gydymui) glioblastomos ląsteles taip pat veikia didesnėmis nei 10 µM koncentracijomis. Nustatytos temozolamido EC50 vertės U87 ląstelėms yra 23 µM [60]. 0 10 20 30 40 50 60 E C50 ( µM ) Junginys IGR39 A549 U87
Poveikis kitoms dviems ląstelių linijoms (IGR39 ir A549) yra panašus, junginių aktyvumas statistiškai reikšmingai nesiskiria (p > 0,05).
Junginių aktyvumas skyrėsi tarpusavyje, priklausomai nuo jų struktūros. Iš tirtų junginių visas tris ląstelių linijas mažesnėmis nei 10 μM koncentracijomis veikė junginys VIL10-2, kuris struktūroje turi 4-nitro-1-naftilamino fragmentą. Isloor A. M. ir kt. nustatė priešingą tendenciją – 4-tiazolidinono dariniai, turintys naftilo grupę, buvo mažai aktyvūs prieš krūties vėžio MCF7 ląsteles [12]. Tai leidžia manyti, kad junginio VIL10-2 aktyvumui įtakos turi prie naftilo fragmento prijungta amino ar nitro grupė. Nitro grupės reikšmę tiazolidinono aktyvumui patvirtina Joseph A. ir kitų atliktas tyrimas, kuris parodė, kad tiazolidinono dariniai, antroje padėtyje turintys prijungtą 2-nitrofenilo grupę, mažomis koncentracijomis slopina krūties vėžio ląstelių proliferaciją [61]. Taip pat verta paminėti, kad junginio VIL10-2 aktyvumą galėjo lemti ir 5-nitrofurilideno fragmentas. Nustatytas 5-nitrofurano darinių aktyvumas prieš melanomos ląsteles ir šis aktyvumas taip pat siejamas su nitro grupe [62]. Šiame tyrime buvo naudojamas tik vienas junginys, turintis 4-nitro-1-naftilamino ir 5-nitrofurilideno fragmentą, todėl sudėtinga daryti išvadas apie jo struktūros įtaką aktyvumui. Būtų naudinga atlikti tyrimus su daugiau panašių junginių. Lyginant su kitais junginiais, VIL10-2 visas ląstelių linijas veikė apie 4-5 kartus mažesnėmis koncentracijomis.
5-pakeisti dariniai buvo aktyvesni nei 2,5–pakeisti tiazolidinono darinių. Tirti 5-pakeisti 2(metiltio)tiazol-4(5H)-onai visas tris ląstelių linijas veikė didesnėmis nei 10 μM koncentracijomis (VIL1-3, VIL1-4, VIL1-5, VIL1-6, VIL1-8, VIL1-11) arba buvo neaktyvūs (VIL1-19, VIL1-21). Tiriant pakaitų įtaką priešvėžiniam aktyvumui aiškios tendencijos nenustatyta. Junginiai VIL1-4, VIL1-5 ir VIL1-6 struktūroje atitinkamai turi atitinkamai Cl, Br arba F pakaitus para padėtyse, ląstelių proliferaciją slopino panašiai (statistiškai reikšmingo skirtumo nenustatyta, p > 0,05). Jau minėtas Isloor A. M. ir kt. tyrimas taip pat parodė, kad į junginių struktūrą įtraukti 3-fluorfenilo ar 4chlorfenilo pakaitai aktyviai slopina ląstelių proliferaciją [12].
Iš visų morfolino fragmentą turinčių junginių, nei vienos ląstelių linijos neveikė junginys VIL2-13. Kiti junginiai IGR39 ir A549 ląstelių proliferaciją slopino didesnėmis nei 10 µM koncentracijomis, tačiau nebuvo aktyvūs prieš U87 ląsteles. Reikšminga morfolino fragmento įtaka A549 ląstelių proliferacijai nustatyta tiriant 1,2,3-triazolo darinius, struktūroje turinčius šį fragmentą. Aktyviausių junginių EC50 vertės A549 ląstelėms buvo 1,87–4,36 µM. Aktyvumas prieš A549 ląsteles taip pat nustatytas indolin-2-onų dariniui, turinčiam morfolino fragmentą (EC50 yra 1,47) [63].
Junginiai su sulfametizolio fragmentu (VIL3-13 ir VIL3-14) aktyvumas skiriasi. Junginys VIL3-14 visas tris ląstelių linijas veikė didesnėmis nei 10 µM koncentracijomis, o VIL3-13 buvo neaktyvus. Pagal gautus rezultatus galima spręsti, kad lipofiliniai pakaitai padidina šių junginių aktyvumą. Panaši tendencija nustatyta junginiams 5a ir 5b jau aptartame pavyzdyje (žr. 1.1. skirsnį).
2,4-difluoranilino pakaitą struktūroje turinčiam junginiui VIL15-1 vėžio ląstelių proliferaciją slopinantis poveikis taip pat nenustatytas.
Apibendrinus tyrimą, galima pasakyti, kad junginių aktyvumui svarbus į penktą 4-tiazolidinono darinių padėtį įjungto pakaito pobūdis. Vėžio ląstelių proliferaciją slopinančiam poveikiui taip pat gali būti reikšmingi morfolino, 4-nitro-1-naftilamino ir 5-nitrofurilideno fragmentai.
3.2. Poveikis ląstelių sferoiduose
Tiazolidinono darinių aktyvumas buvo tiriamas A549 ir U87 sferoiduose. Melanoma nėra solidinis vėžys, todėl iš IGR39 ląstelių linijos sferoidai nebuvo formuojami.
Junginių akyvumas A549 ir U87 ląstelių sferoidams buvo skirtingas, tačiau dauguma junginių efektyviai slopino abiejų ląstelių sferoidų augimą.
Aktyviausias junginys buvo VIL10-2. Inkubuojant su 50 µM šio junginio U87 sferoidus po 2 dienų sferoidai pradėjo irti (13A pav.). A549 sferoidai po 2 dienų inkubacijos su junginiu VIL10-2 prarado formą, o po 5 dienų pradėjo irti (13B pav.). Būtų verta ištirti, kaip šio junginio mažesnės koncentracijos veiktų sferoidų augimą.
0 d. 2 d. 0 d. 2 d. 5 d.
VIL10-2
Kontrolė
A. U87 sferoidų pokyčiai B. A549 sferoidų pokyčiai
13 pav. Sferoidų pokyčiai po inkubacijos su junginiu VIL10-2
A549 ląstelių sferoidų augimą aktyviausiai slopino junginiai VIL2-3, VIL2-15, VIL2-14, VIL15-1 ir VIL2-13 (14 ir 15 pav.). Sferoidai, inkubuoti su junginiais VIL15-1 ir VIL2-13, buvo beveik du kartus buvo mažesni, jų diametras eksperimento eigoje praktiškai nesikeitė. Verta paminėti, kad sferoidų, inkubuotų su junginiais VIL1-4, VIL1-8 ir VIL3-13, diametrai didėjo labiau nei kontrolės, tačiau šis skirtumas statistiškai nereikšmingas (p > 0,05). 2D modelyje junginiai VIL1-4 ir VIL1-8 pasižymėjo vidutiniu A549 ląstelių proliferaciją slopinančių aktyvumu. Gali būti, kad junginių
aktyvumo sferoiduose ir ląstelių monosluoksnyje skirtumai atsirado dėl skirtingų veikimo mechanizmų ar poveikio tarp ląstelių 3D modelyje.
14 pav. A549 ląstelių sferoidų dydžio kitimas, inkubuojant su aktyviausiais junginiais (n = 5-8)
15 pav. A549 ląstelių sferoidų, paveiktų aktyviausiais junginiais, ploto kitimas
Junginių poveikis U87 ląstelių sferoidams bendrai buvo mažesnis. Dauguma junginių U87 ląstelių sferoidų augimą slopino silpniau nei A549, tai reiškia, kad sferoidų, suformuotų iš A549 ląstelių, diametras eksperimento metu kito mažiau. Per vienuolika dienų nuo sferoidų suformavimo daugeliu junginių paveikti U87 ląstelių sferoidų skersmuo padidėjo beveik du kartus, tuo tarpu A549 – apie 1,5 karto. 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Sk er sm uo ( µM ) Laikas (dienos)
Kontrolė VIL2-13 VIL15-1
VIL2-16 VIL2-15 VIL2-3
0 d. 3 d. 5 d. 7 d. 9 d. 11 d. Kontrolė VIL2-16 VIL2-3 VIL2-15 0 d. 3 d. 5 d. 7 d. 9 d. 11 d. Kontrolė VIL2-16 VIL2-3 VIL2-15
U87 ląstelių sferoiduose didžiausiu aktyvumu pasižymėjo junginiai VIL1-3, 15, VIL2-3, VIL1-19, VIL1-11 (16 ir 17 pav.). Šie junginiai, išskyrus VIL1-19, taip pat buvo labiausiai aktyvūs 2D kultūrose – labiausiai mažino ląstelių gyvybingumą.
16 pav. U87 ląstelių sferoidų dydžio kitimas, inkubuojant su aktyviausiais junginiais (n = 5-8)
17 pav. U87 ląstelių sferoidų, paveiktų aktyviausiais junginiais, ploto kitimas
Junginiais VIL1-4, VIL1-5 ir VIL3-13 paveiktų U87 sferoidų diametrai eksperimento eigoje padidėjo labiau nei kontrolės. Iš šių junginių, VIL3-13 paveiktų sferoidų diametrų skirtumas buvo didžiausias lyginant su kontrole (18 pav.), tačiau skirtumas statistiškai nereikšmingas (p > 0,05).
250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Sk er sm uo ( µm ) Laikas (dienos)
Kontrolė VIL1-11 VIL1-19
VIL2-3 VIL2-15 VIL1-3
0 d. 2 d. 5 d. 7 d. 9 d. 11 d. Kontrolė
VIL1-19
VIL2-15
18 pav. Junginio VIL3-13 poveikis iš U87 ląstelių suformuotiems sferoidams
Junginiais VIL1-4 ir VIL3-13 paveiktų A549 sferoidų diametras taip pat eksperimento metu padidėjo. Būtų galima daryti prielaidą, kad šie du junginiai gali turėti skirtingą veikimo mechanizmą nei kiti tirti tiazolidinono dariniai, ir jie gali turėti skirtingą poveikį tarp ląstelių.
Lyginant junginių aktyvumą 2D ir 3D kultūrose, nustatytas silpnas koreliacijos ryšys (A549 ląstelių kultūrose r = 0,24, o U87 kultūrose r = 0,29). Pvz., aktyviausias junginys 2D kultūrose VIL10-2 labiausiai slopino ir sferoidų augimą, tačiau 2D kultūrose neaktyvus junginys VIL15-1 taip pat gana stipriai slopino A549 sferoidų augimą. Aktyviausi junginiai A549 ląstelių sferoiduose nebuvo aktyvūs ląstelių monosluoksnyje (VIL15-1, VIL2-13) arba buvo mažai aktyvūs (VIL2-3, VIL2-15, VIL2-14). Aktyvumo šiuose modeliuose skirtumai nustatyti ir chemoterapiniams vaistams. Tarp antimikrotubulinių vaistų aktyvumo plaučių vėžio (H292) ląstelių 3D ir 2D modeliuose nustatytas silpnas ryšys (r = 0,35) [64].
Dažnai nustatomas didesnis ląstelių jautrumas 2D nei 3D ląstelių kultūrose. Pavyzdžiui, paklitakselis ir doksorubicinas veikia silpniau krūties vėžio ląstelių linijas BT-549, BT-474 ir T-47D sferoiduose nei ląstelių monosluoksnyje [65]. Mūsų atveju pastebėta panaši tendencija. Junginiai VIL1-4, VIL1-8, VIL3-14 buvo tarp labiausiai mažinančių abiejų ląstelių linijų gyvybingumą, tačiau nei vienas iš jų nebuvo aktyviausias 3D modelyje. Skirtumai tarp junginių aktyvumo sferoiduose ir ląstelių monosluoksnyje gali atsirasti dėl skirtingos ląstelių genų bei baltymų ekspresijos šiose modeliuose. Be to junginiai lengviau sąveikauja su 2D ląstelėmis, tuo tarpu sferoiduose labiau veikiamos jų paviršiuje esančios ląstelės [66]. Didesnis aktyvumas 3D ląstelių kultūrose gali atsirasti ir dėl skirtingo inkubavimo su junginiais laiko šiuose modeliuose (2D modelyje inkubavimo trukmė buvo 72 val., o 3D –11 dienų) [65].
Kalbant apie struktūrą, reiktų paminėti reikšmingą morfolino fragmento ir penktoje padėtyje įjungtų pakaitų įtaką junginių aktyvumui. Tyrimas sferoiduose parodė, kad junginiai su morfolino pakaitais selektyviau veikė A549 ląstelių liniją, o 5-pakeisti tiazolidinono dariniai – U87.
0 d. 2 d. 5 d. 7 d. 9 d. 11 d.
VIL3-13
3.3. Vėžio ląstelių žūties būdo nustatymas
Tirti tiazolidinono dariniai dažniausiai mažomis koncentracijomis sukėlė ląstelių apoptozę, o didelėmis – nekrozę. Dalyje literatūroje aprašytų tyrimų vėžio ląstelių žūties nustatymas atliekamas tik su viena junginio koncentracija, todėl nėra įvertinama žūties būdo priklausomybė nuo junginių koncentracijos [8,22].
Šiame tyrime naudojant 12,5 µM koncentracijos junginių tirpalus, A549 ir IGR39 ląstelių nekrozę sukėlė junginiai VIL3-14 ir VIL10-2. Aktyviausias junginys VIL10-2 sukėlė ląstelių žūtį daugiausia nekrozės būdu A549 ir IGR39 ląstelėms. Tuo tarpu šiomis koncentracijomis paveikus U87 ląsteles sukeliama apoptozė (19 pav.).
19 pav. Junginio VIL10-2 sukeliama ląstelių žūtis (1 – gyvos ląstelės, 2 – apoptotinės ląstelės, 3 nekrotinės ląstelės)
Tiriant tiazolidino darinius buvo nustatyta priklausomybė tarp junginių koncentracijos ir veikimo į skirtingas ląstelės ciklo fazes [67]. Ląstelių žūties sukėlimas priklausomas nuo EC50 reikšmių. Šiame tyrime nustatyta, kad junginiai, kurių EC50 reikšmės buvo didelės (pvz., VIL3-13, VIL15-1) apoptozę sukėlė mažam ląstelių skaičiui.
12,5 µM 25 µM 50 µM U87 IGR39 A549 1 2 3 1 2 3 3
Apoptozę ir nekrozę didžiausiam skaičiui sukėlė junginiai, aktyviai slopinę ląstelių proliferaciją (VIL1-3, VIL1-4, VIL1-5, VIL1-8, VIL1-11, VIL3-14 ir VIL10-2). Ši tendencija nustatyta A549 ir IGR39 ląstelėms.
20 pav. Junginiai, sukėlę apoptozę didžiausiam A549 ląstelių skaičiui (proc.)
Daugeliu atvejų apoptozės būdu žuvusių A549 ląstelių skaičius priklauso nuo junginių koncentracijų. Tik junginiui VIL10-2 apoptozės būdu žuvusių ląstelių skaičiaus priklausomybė nuo šio junginio koncentracijos nenustatyta.
21 pav. Junginiai, sukėlę apoptozę didžiausiam IGR39 ląstelių skaičiui (proc.)
Vertinant junginių sukeliamą žūties būdą IGR39 ląstelėms pastebėta analogiška situacija kaip ir A549 ląstelėms. Šiuo atveju apoptozės būdu žuvusių ląstelių skaičius taip pat priklausomas nuo
0 10 20 30 40
VIL1-3 VIL1-4 VIL1-5 VIL1-8 VIL1-11 VIL3-14 VIL10-2
Apo pto tini ų lą st elių sk aičius ( pro c. ) Junginys 12,5 µM 25 µM 50 µM 0 10 20 30 40
VIL1-3 VIL1-4 VIL1-5 VIL1-8 VIL1-11 VIL3-14 VIL10-2
Apo to tini ų lą st elių sk aičius ( pro c. ) Junginys 12,5 µM 25 µM 50 µM
junginių koncentracijų, išskyrus junginį VIL10-2. Junginys VIL10-2 sukelia apoptozę panašiam IGR39 ląstelių skaičiui nepriklausomai nuo koncentracijos.
Nekrozės būdu žuvusių A549 ir IGR39 ląstelių skaičius priklausomas nuo junginių koncentracijų. Ši tendencija pastebėta tiek A549, tiek IGR39 ląstelėms.
22 pav. Junginiai, sukėlę nekrozę didžiausiam A549 ląstelių skaičiui
23 pav. Junginiai, sukėlę nekrozę didžiausiam IGR39 ląstelių skaičiui
Verta paminėti, kad junginys VIL2-15 gana aktyviai slopino ląstelių proliferaciją, tačiau tarp junginių, kurie sukėlė apoptozę/nekrozę didžiausiam ląstelių skaičiui, nepateko.
Šių junginių mažiausiomis koncentracijomis paveikus U87 ląsteles apoptozės būdu žuvo nuo 3 iki 8 proc. ląstelių, 25 µM koncentracijomis – nuo 7 iki 13 proc., o didžiausiomis – nuo 10 iki 21 proc. Tuo tarpu nekrozę U87 ląstelėms sukėlė tik junginys VIL10-2. Šis junginys apoptozę ląstelėms
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
VIL1-3 VIL1-4 VIL1-5 VIL1-8 VIL1-11 VIL3-14 VIL10-2
Nek ro tini ų lą st elių sk aičius ( pro c. ) Junginys 12,5 µM 25 µM 50 µM 0 10 20 30 40 50 60 70
VIL1-3 VIL1-4 VIL1-5 VIL1-8 VIL1-11 VIL3-14 VIL10-2
Nek ro tini ų lą st elių sk aičius ( pro c. ) Junginys 12,5 µM 25 µM 50 µM
sukėlė paveikus jas mažiausiomis koncentracijomis, o nekrozės būdu – 25 µM ir 50 µM koncentracijomis.
24 pav. Junginiai, sukėlę apoptozę didžiausiam ląstelių skaičiui
Rezultatai parodė koreliaciją tarp junginių aktyvumo ląstelėse, nustatyto MTT testu ir apoptotinių ar nekrotinių ląstelių skaičiaus (r = 0,6). Taip pat būtų tikslinga nustatyti, kurią ląstelės ciklo fazę veikia tirti junginiai. Toks tyrimas padėtų išsiaiškinti junginių veikimo mechanizmą.
3.4. 2,5-pakeistų tiazolidinono darinių farmakokinetinės savybės ir toksiškumas
Pagal ACD/I-Lab programos nustatytus fizikinius-cheminius parametrus (molekulinę masę, logP reikšmę, vandenilinį ryšį donuojančių ir akceptuojančių grupių bei lanksčiųjų jungčių skaičių junginio molekulėje) vertintas junginių atitikimas Lipinskio penketo taisyklei. Gauti rezultatai parodė, kad visi analizuoti junginiai atitinka Lipinskio penketo taisyklės reikalavimus (1 lentelė).
Turimi rezultatai leidžia prognozuoti, kad junginių biopasisavinimas yra pakankamas, kad šiuos junginius teoriškai būtų galima vartoti per os. Visų junginių reikšmės, kaip reikalauja Lipinskio penketo taisyklė, yra mažesnės už 5, taip pat daugelis junginių turi optimaliausias absorbcijai 0–3 reikšmes. Tai reiškia, kad didesnė dalis tirtų junginių galėtų gerai absorbuotis pasyviosios difuzijos būdu.
0 5 10 15 20 25 30
VIL1-3 VIL1-4 VIL1-5 VIL1-8 VIL1-11 VIL3-14 VIL10-2
Apo pto tini ų lą st elių sk aičius ( pro c. ) Junginys 12,5 µM 25 µM 50 µM
1 lentelė. Junginių fizikocheminės savybės Junginys Molekulinė masė logP Vandenilį donuojančių grupių skaičius Vandenilį akceptuojančių grupių skaičius TPSA Lanksčiųjų jungčių skaičius VIL1-3 251,33 2,27 1 3 100,26 2 VIL1-4 269,77 3,13 0 2 80,03 2 VIL1-5 314,22 3,25 0 2 80,03 2 VIL1-6 253,32 2,56 0 2 80,03 2 VIL1-8 280,32 2,24 0 5 142,36 3 VIL1-11 270,29 1,96 0 6 142 2 VIL1-19 278,39 2,84 0 3 83,27 3 VIL1-21 296.32 2,68 1 6 149,09 3 VIL2-3 290,34 1,43 1 5 87,43 2 VIL2-13 306,34 0,77 2 6 107,66 2 VIL2-15 320,36 1,61 1 6 96,66 3 VIL2-16 334,39 2,11 0 6 85,66 4 VIL3-13 489,55 1,73 4 10 215,79 6 VIL3-14 517.6 3,48 2 10 193,79 8 VIL10-2 436,4 4,61 1 10 177,58 6 VIL15-1 385,22 4,71 1 3 66,76 3
ACD/I-Lab programos modulio apskaičiuoti biologinio pasisavinimo duomenys pateikti 25 paveiksle. Biopasisavinimas vertintas šiose ribose: < 30 proc., 30 – 70 proc., > 70 proc. Dauguma junginių vertinami kaip turintys vidutinį ar geresnį biopasisavinimą.
25 pav. Prognozuojamas junginių biologinis pasisavinimas
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 T ik im ybė Junginys > 30 proc. > 70 proc.
Net keturių junginių biopasisavinimas galėtų būti didesnis 70 proc., juos vartojant per os: VIL1-3, VIL1-6, VIL1-8, VIL1-11. Penkiems junginiams prognozuojamas biopasisavinimas > 30 proc. su mažesne kaip 0,7 tikimybe, todėl juos būtų racionaliau vartoti ne geriamosiomis vaisto formomis. Per paskutiniuosius dešimt metų patvirtinta daugiau per os vartojamų vaistų nuo vėžio. Vaistų nuo vėžio vartojimą per os būdu riboja mažas biopasisavinimas, todėl ieškoma būdų, kurie jį padidintų (pvz., vykdant chemines modifikacijas, ar kuriant provaistų formomis). Vartojimas geriamosiomis formomis sumažintų infekcijos tikimybę, mažiau pažeistų audinius nei vartojimas intraveniniu būdu. Taip pat vartojimas per os yra paprastesnis ir priimtinesnis pacientui [68].
Naudojantis ACD/I-Lab programa taip pat įvertintas junginių jungimasis su kraujo plazmos baltymais (26 pav.). Visiems junginiams prognozuojamas > 80 proc. jungimasis su kraujo plazmos baltymais. Junginiams VIL1-4, VIL1-5, VIL1-6, VIL1-8, VIL1-11, VIL1-19 prognozuojamas jungimasis su kraujo plazmos albuminais ir α1-glikoproteinais. Tai reiškia, kad junginiai, nesijungę su kraujo plazmos baltymais, plačiau pasiskirstytų audiniuose.
26 pav. Programos ACD/Lab nustatytas jungimasis su kraujo plazmos baltymais
Tai pat ACD/Lab programa apskaičiuotas junginių pasiskirstymo tūris VD (27 pav.). Daugiausia junginių pasiskirstymo tūris yra apie 2 l/kg. Mažiausias reikšmes turi junginiai VIL3-12 ir VIL3-13. Tuo tarpu didžiausias pasiskirstymo tūris nustatytas junginiams VIL10-2 ir VIL15-1. Šių junginių nustatytos reikšmės atitinkamai yra 5,3 l/kg ir 3 l/kg.
0 20 40 60 80 100 Jun gi m asi s su kraujo plaz m os balt ym ai s (proc.) Junginys
27 pav. Junginių pasiskirstymo tūris (l/kg) apskaičiuotas ACD/Lab programa
ACD/Lab programa apskaičiuotas junginių skverbimosi į smegenis laipsnio logaritmas (logBB) (28 pav.). Nei vienam junginiui nėra prognozuojamas geras perėjimas pro hematoencefalinį barjerą. Vertinant perėjimą per šį barjerą taip pat reikia atsižvelgti į junginių TPSA. Visiems tirtiems junginiams prognozuojamos TPSA vertės yra didesnės nei 60 Å2, todėl šis parametras taip pat patvirtina prognozę dėl mažo junginių prasiskverbimo pro hematoencefalinį barjerą. Didžiausios logBB vertės nustatytos junginiams VIL1-5 ir VIL15-1. LogBB reikšmės šiems junginiams yra atitinkami 0,06 ir 0,07, todėl šiems junginiams galima prognozuoti vidutinį prasiskverbimą pro hematoencefalinį barjerą.
28 pav. Junginių skverbimosi į smegenis laipsnis.
0 1 2 3 4 5 6 VD ( l/k g) Junginys -1,4 -1,2 -1 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0 log BB
