2,5-pakeistų-4-tiazolinono darinių sintezė ir antimikrobinio aktyvumo įvertinimas

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

FARMACIJOS FAKULTETAS

VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA

VYTAUTAS PETREIKIS

2,5-pakeistų-4-tiazolinono darinių sintezė ir

antimikrobinio aktyvumo įvertinimas

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas:

Prof. dr. Hiliaras Rodovičius

Konsultantas:

Prof. dr. Alvydas Pavilionis

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

FARMACIJOS FAKULTETAS

VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanas Prof. dr. Vitalis Briedis

Data

2,5-pakeistų-4-tiazolinono darinių sintezė ir antimikrobinio

aktyvumo įvertinimas

Magistro baigiamasis darbas

Konsultantas

Darbo vadovas

Prof. dr. Alvydas Pavilonis Prof. dr. Hiliaras Rodovičius

Data

Data

Recenzentas

Darbą atliko

Magistrantas Vytautas Petreikis

Data

Data

Turinys

DARBO TIKSLAI IR UŽDAVINIAI... 12

1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 13

1.1. Antimikrobinių vaistų poreikis ... 13

1.2. Natūraliais produktais paremtas vaistų kūrimas ... 14

1.3. Česnako ir jo aktyvių junginių panaudojimas medicinoje... 17

1.4. Rodaninas ir jo dariniai... 20

1.5. Apibendrinimas... 21

2. TYRIMO METODIKA... 22

2.1. Rodanino darinių sintezė... 22

2.1.1. 5-pakeistų rodanino darinių sintezė ... 22

2.1.2. 5-pakeistų-2-alil-rodanino darinių sintezė ... 22

2.2. Lydymosi temperatūros nustatymas... 25

2.3. Junginių strūktūros nustatymas IR spektroskopijos būdu... 26

2.4. Junginių grynumo nustatymas... 26

2.5. Junginių antimikrobinio poveikio tyrimas in silico ... 27

2.6. Junginių antimikrobinio poveikio tyrimas in vitro... 28

2.7. Apibendrinimas... 30

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS... 31

3.1. Rodanino junginių sintezė ... 31

3.1.1. 5-pakeistų-rodanino junginių sintezė ... 31

3.1.2. 2-alil-5-pakeistų-rodanino junginių sintezė... 32

3.1.3. 2-propil-5-nitrofurfuril-rodanino (VIP-48) sintezė... 34

3.2. Junginių strūktūros nustatymas IR spektroskopijos būdu... 35

3.4. Junginių antimikrobinio aktyvumo tyrimas in vitro... 37 3.5. Apibendrinimas... 42 4. IŠVADOS ... 43 5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS... 44 6. LITERATŪROS APŽVALGA ... 45 7. PRIEDAI ... 52

SANTRAUKA

2,5-pakeistų-4-tiazolinono darinių sintezė ir antimikrobinio aktyvumo įvertinimas. V. Petreikio magistro baigiamasis darbas/ mokslinis vadovas prof. dr. Hiliaras Rodovičius; Lietuvos Sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Vaistų chemijos katedra. – Kaunas.

Darbo tikslas. Susintetinti naujus 2,5-pakeistus-4-tiazolinono junginius ir ištirti jų antimikrobinį aktyvumą.

Darbo uždaviniai:

1. Susintetinti 2,5-pakeistus-4-tiazolinono junginius. 2. Ištirti gautų junginių poveikį tyrimais in silico ir in vitro. 3. Susieti gautų junginių struktūros ryšį su jų aktyvumu.

Metodai. Junginiai buvo sintezuoti mikrobangų metodu. Junginių aktyvumas buvo tiriamas in silico. Atliktas pirminis mikrobiologinis tyrimas in vitro užnuodytos lekštelės metodu.

Rezultatai. Buvo susintetinti 8-uoni 2,5-pakeisti-4-tiazolinono dariniai. Atlikus tyrimus in silico, buvo nustatytas preliminarus poveikis S. aureus esančiam baltymui fabI. Atlikus pirminius tyrimus in vitro buvo pastebėtas trijų junginių su 5-nitrofurano pakaitu (VIP-41), 5-para-brombenzaldehido pakaitu (VIP-42), 5-dimetilamino (VIP-47) galimas priešmikrobinis poveikis prieš tirtus mikroorganizmus.

Išvados. Atlikus tyrimus in vitro nustatyta, jog aktyviausi junginiai yra: VIP-41 ir VIP-47. Rodanino darinių propilo pakaitu 2-oje padėtyje priešmikrobinis aktyvumas mažesnis nei su alilo pakaitu. Taip pat nustatyta, kad rodanino darinių, su nitrofurolo pakaitu didesniam antimikrobiniam veikimui reikalinga nitro grupė. Pats alilo pakaitas junginiams reikšmingo aktyvumo nesuteikia, o svarbesnis aktyvumui aldehido pakaitas 5-oje padėtyje.

SUMMARY

Synthesis of 2,5-substituted-4-thiazolinone derivatives and evaluation of antimicrobial activity. V. Petreikis Master thesis/ Scientific supervisor prof. dr. Hiliaras Rodovičius, consultant – prof. dr. Alvydas Povilonis; Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, Department of Drug Chemistry. – Kaunas.

The aim of research. Synthesize new 2,5-substituted-4-thiazolinone derivatives and evaluate their antimicrobial activity.

Tasks of research:

1. Synthesize new 2,5-substituted-4-thiazolinone derivatives.

2. Evaluate antimicrobial activity of newly synthesized 2,5-substituted-4-thiazolinone derivatives.

3. Evaluate compounds structure-activity relationship.

Methods. Compounds were synthesized with microwave method. Their activity was evaluated in silico. Synoptic research in vivo was accomplished by a poisoned plate technique.

Results. 8 2,5-substituted-4-thiazolinone derivatives were synthesized. After in silico research was evaluated preliminary bactericidic compounds activity against S. aureus, acting on fabI protein. Synoptic research in vitro has shown antimicrobial activity of three compounds: 5-nitrofuran substituted (VIP-41), 5-para-brombenzaldehyde substituted (VIP-42), 5-dimethylaminebenzaldehyde substituted (VIP-47).

Conclusions. Research in vitro has shown that the most active compounds are: VIP-41 and VIP-47. Evaluated, that 4-thiazolinone derivatives with propyl substituent in a 2-nd position antimicrobial activity is less than with allyl substituent. For better anctimicrobial activity nitro group is necessary in 4-thiazolinone derivatives with nitrofurfural substituent. Allyl substituent does not provide significant antimicrobial activity itself, more important is aldehyde substituent in 5-th position.

SANTRUMPOS

ESC – efektyvioji skysčių chromatografija

fabI – už riebiųjų rūgščių sintezę S. aureus bakterijoje atsakingas baltymas LD50 - dozė, nuo kurios miršta 50% populiacijos narių

MRSA – meticilinui atsparus S. aureus (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus) MSK – minimalioji slopinamoji koncentracija

PBP – peniciliną prijungiantis baltymas (Penicillin-Binding Protein) PSO – Pasaulio sveikatos organizacija

MS - masių spektrometrija

UV-Vis – ultravioletinės spinduliuotės ir regimosios šviesos spektrofotometrija µg/ml – mikrogramai mililitre (koncentracijos reiškimo būdas)

mg/l – miligramai litre (koncentracijos reiškimo būdas) B. cereus – Bacillus cereus

B. subtilis – Bacillus subtilis C. albicans – Candida albicans E. coli – Escherichia coli

E. faecalis – Enterococcus faecalis E. faecium – Enterococcus faecium H. pylori – Helicobacter pylori

K. pneumoniae – Klebsiella pneumoniae M. tuberculosis – Mycobacterium tuberculosis P. aeruginosa – Pseudomonas aeruginosa P. mirabilis – Proteus mirabilis

S. aureus – Staphylococcus aureus S. pyogenes – Streptococcus pyogenes S. pneumoniae – Streptococcus pneumoniae

SĄVOKOS

in silico – bandymo metodas, panaudojant sudėtingus kompiuterinius modelius.

in vitro – procesas (bandymas, tyrimas), atliekamas arba stebimas ne organizme, bet dirbtinėje sistemoje.

Nitrofuranai – antibakterinių vaistinių preparatų grupė, kurių struktūroje yra 5-nitrofurano žiedas. Rodaninas – cheminis junginys 2-tiokso-1,3-tiazolidin-4-onas.

Softdent – kompiuterinė programa, kurioje fiksuojamas prekių pardavimas iš didmenininko į vaistines.

PADĖKA

Dėkoju darbo vadovui prof. dr. H. Rodovičiui, konsultantui prof. dr. A. Povilioniui už pagalbą ir konsultacijas vykdant tyrimus ir rašant magistrinį darbą.

Dėkoju prof. habil. dr. E. Tarasevičiui už sudominimą vaistų sinteze ir patarimus sintezuojant junginius.

Doktorantui L. Šlepikui už pagalbą laboratorijoje, atliekant tyrimus ir rašant magistrinį darbą.

Doktorantui J. Saliui už pasiūlytą idėją darbo temai ir pagalbą sintezuojant junginius. L. Akramui už suteiktą galimybę atlikti IR spektroskopijos tyrimus.

ĮVADAS

Temos aktualumas. Antimikrobinių vaistų sukūrimas buvo vienas svarbiausių XX a. pasiekimų medicinoje. Antimikrobiniai vaistai žymiai sumažino mirtingumą nuo infekcijų, palengvino infekcijų gydymą [3]. Tačiau bakterijos turi savybę greitai prisitaikyti prie naujų aplinkos sąlygų, todėl dėl netinkamo antibiotikų vartojimo ir gydytojų neracionalaus antibiotikų išrašymo pacientams, sparčiai didėja mikroorganizmų atsparumas jiems [31, 76, 2]. Dėl atsparumo didėja ne tik mirtingumas nuo infekcijų, bet ir patiriami dideli piniginiai nuostoliai. Paskaičiuota, kad Jungtinėse Amerikos Valstijose nuostoliai siekia nuo 21 mlrd. iki 34 mlrd. dolerių ir apie 1,5 mlrd. eurų Europoje. [77] Mirštamumas nuo rezistentiškų mikroorganizmų padermių sukeltų infekcijų yra dvigubai didesnis nei nuo sukeltų ne rezistentiškų mikroorganizmų padermių [76].

Pagal softdent duomenis [75] 2006 metais kiekvienam Lietuvoje gyvenančiam žmogui vidutiniškai teko po vieną antibiotikų gydymo kursą, o tai yra gana daug. Buvo nustatyta, kad 2005 – 2007 peroralinių rezervinių antibiotikų suvartojimas padidėjo 13 %, palyginus įprastinių- sumažėjo 15 %. Parenterinių įprastinių antibiotikų suvartojamas kiekis taip pat mažėjo – 17,5 %, rezervinių didėjo 37,9 % [75]. Tai rodo mažesnį įprastinių antibiotikų veiksmingumą.

Tyrimu Lietuvoje taip pat nustatyta, jog neracionalus antibiotikų vartojimas Lietuvoje vyksta dideliais mastais ir kas blogiausia, nustatyta, kad gydytojai dažnai neracionaliai parenka gydymą antibiotikais. Šeimos gydytojai net 9,5 % atvejų paskiria netinkamus antibiotikus. Tik 42,9 % atvejų antibiotikai skiriami pagal tinkamas indikacijas. Dažniausiai netinkami antibiotikai skiriami gydant šlapimo takų ir akių infekcijas [2].

Norint išvengti mikroorganizmų rezistentiškumo augimo, reikia tinkamai vartoti antibiotikus. Taip pat gali padėti naujų antimikrobinių vaistų kūrimas.

Daug naujų vaistų yra gaunama ar sintezuojama iš natūralių produktų: iš augalų, gyvūnų, mikroorganizmų. Augalai jau tūkstančius metų naudojami kaip vaistai. Dažniausiai buvo naudojamos tinktūros, arbatos, milteliai ar kitos formos, o ne iš augalo išskirtos švarios medžiagų frakcijos. Medicinai ir technologijoms žengiant pirmyn atsirado galimybės išskirti junginius iš augalų, ištirti jų cheminę struktūrą ir poveikį.

Pirmoji iš augalo izoliuota medžiaga buvo morfinas - XIX a. pradžioje. Jis buvo išskirtas iš opiumo, gaunamo iš aguonos. Vaistų paieška natūraliuose produktuose vedė prie kitų vaistinių

medžiagų izoliavimo, tokių kaip: kokaino, kodeino, digoksino - visi jie naudojami iki šiol [17]. Vaistų paieška ir gamyba iš natūraliose produktuose esančių medžiagų tęsiasi iki šiol [70].

Vienas iš daugiausiai gydymui naudojamų augalų – česnakas - nuo seno naudojamas tradicinėje medicinoje. Česnakas pasižymi įvairiu gydomuoju poveikiu [30,57,32], tarp jų ir antimikrobiniu poveikiu prieš įvairias Gram - teigiamas ir Gram - neigiamas bakterijas ir grybelius [56].

Rodanino dariniai turi platų antimikrobinį veikimą. Buvo susintetinta ir tirta daug rodanino darinių. Pastebėtas jų poveikis prieš daug įvairių infekcijų sukėlėjų, nustatytas jų inhibicinis poveikis biologiniam taikiniam, tokiem kaip: hepatito C viruso NS3 proteazei [59], aldozės reduktazei [16,27], Beta-laktamazei [28], UDP-N-acetylmuramato/L-alanino lipazei [58], peniciliną prijungiančiam baltymui [70], katepsinui D [42], ir histidino dekarboksilazei [25]. Pastebėtas rodanino darinių poveikis atspariom S. aureus padermėm [30, 63].

Rodanino junginių sintezė jau daugelį metų vykdoma Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Vaistų chemijos katedroje. Mokslininkai Eduardas Tarasevičius [8], Raimondas Radžiūnas [7], Vilma Petrikaitė [5] sintetino ir tyrė rodanino junginius.

Teorinė ir praktinė tyrimo reikšmė. Didėjant žmonių sergamumui ir mirštamumui nuo antibiotikams atsparių mikroorganizmų sukeltų ligų, didėja poreikis naujų antimikrobinių junginių sintezei. Dėl literatūroje aprašytų rodanino junginių ir česnako ekstraktų antimikrobinių poveikių, rodanino ir alicino deriniai gali turėti antimikrobinį poveikį.

Temos ryšys su tyrimo metodika ir rezultatais. Pasirinkus tyrimo metodiką buvo susintezuoti 2,5-pakeisti-4-tiazolinono junginiai. Junginių struktūrai patvirtinti buvo nustatyti jų IR spektrai. Antimikrobiniam poveikiui nustatyti buvo atlikti tyrimai in silico ir in vitro. Rezultatuose aptariami mikrobiologinių tyrimų rezultatai ir struktūros - aktyvumo ryšys.

Darbo tikslas. Susintetinti naujus 2,5-pakeistus-4-tiazolinono junginius ir ištirti jų antimikrobinį aktyvumą.

DARBO TIKSLAI IR UŽDAVINIAI

Tyrimo problema. Mikrobų rezistentiškumo antibiotikams didėjimas.

Tyrimo eiga.

1. Mokslinės literatūros apžvalga

2. Susintetinti naujus 2,5-pakeistus-4-tiazolinono junginius. 3. Susintetintų junginių struktūros nustatymas.

4. Susintetintų junginių aktyvumo įvertinimas tyrimais in silico ir in vitro. 5. Gautų rezultatų analizė.

Tyrimo instrumentai. SYBYL-X molekulinio modeliavimo programa (bandomoji versija). Mikrobiologiniai tyrimai užnuodytos lekštelės standžioje terpėje metodu.

Darbo tikslas. Susintetinti naujus 2,5-pakeistus-4-tiazolinono junginius ir ištirti jų antimikrobinį aktyvumą.

Darbo uždaviniai

1. Susintetinti 2,5-pakeistus-4-tiazolinono junginius.

2. Ištirti gautų junginių poveikį tyrimais in silico ir in vitro (užnuodytos lėkštelės standžioje terpėje metodas).

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1.

Antimikrobinių vaistų poreikis

Antimikrobiniai vaistai – antibiotikai - tai medžiagos žudančios mikroorganizmus, ar stabdančios jų augimą [74]. Antimikrobiniai vaistai naudojami gydyti bakterijų, grybelių, virusų, parazitų sukeltas infekcijas. Pirmasis antimikrobinis preparatas buvo išskirtas 1928 metais iš grybelio Penicillium rubens. Jį išskyręs Aleksandras Flemingas pavadino medžiagą penicilinu Penicilinas 1942 metais buvo sėkmingai panaudotas streptokoko sukeltai infekcijai gydyti [60].

PSO duomenimis [78] labai opi problema XXI a. tapo bakterijų rezistentiškumas antimikrobinėms medžiagoms. Bakterijų tapimas rezistentiškomis antibiotikams yra natūralus fenomenas, kai naudojant antibiotikus įvyksta bakterijos genų mutacija. Rezistentiškumo atsiradimą pagreitina:

 mažai arba jokių antimikrobinio rezistentiškumo priežiūros ir monitoravimo sistemų,  netinkamas antibiotikų vartojimas, įskaitant jų naudojimą gyvulininkystėje,

 mažai prevencijos ir kontrolės nuo infekcijų priemonių,  nebaigiamas gydymo antibiotikais kursas,

 rezistentiškumas plinta, nes kai kurie mikroorganizmai gali vieni kitiem perduoti rezistentiškumo bruožus.

Dėl rezistentiškų mikroorganizmų infekcijų:

 įprastas gydymas tampa neveiksmingas, dėl ko prailgėja pacientų gyjimas ir padidėja mirties rizika. Tokių pacientų mirštamumas yra dvigubai dažnesnis,

 ilgesnis gyjimas padidina riziką rezistentiškoms infekcijoms plisti,

 infekcijos tampa rezistentiškos įprastiems antibiotikams, todėl naudojami kiti, brangesni, antibiotikai. Taip pat pailgėja žmonių sveikimas, gydymas ligoninėse, dėl to išauga gydymo kaina – kiekvienam asmeniškai ir valstybei.

 joms išplitus taptų pavojinga atlikti chemoterapiją vėžio gydymui, organų transplantaciją, chirurgines operacijas.

Meticilinui-rezistentiškas Staphylococcus aureus (MRSA) yra viena dažniausiai pasitaikančių infekcijų, įgautų sveikatos priežiūros įstaigose. MRSA plitimas Europoje dabar stabilizavosi ir netgi pradėjo mažėti. Šešiose Europos valstybėse pastebėtas ženklus MRSA padermių mažėjimas (Belgijoje, Prancūzijoje, Vokietijoje, Airijoje, Ispanijoje ir Jungtinėje Karalystėje), ir tik

keturiose valstybėse jų skaičius augo (Vengrijoje, Liuksemburge, Lenkijoje ir Rumunijoje). Nors šie duomenys suteikia optimizmo, MRSA infekcijos vis tiek išlieka gydymo įstaigų prioritetas, nes MRSA vis tiek sukelia daugiau nei 25% visų infekcijų aštuoniose iš dvidešimt aštuonių tikrintų šalių, labiausiai pietų ir rytų Europoje [73] (1 pav.).

1 pav. MRSA paplitimas Europoje 2011 metais [73]

1.2.

Natūraliais produktais paremtas vaistų kūrimas

Natūralūs produktai, kaip augalai, gyvūnai ir mineralai, yra vaistų gamybos pagrindas [36, 46]. Istoriškai dauguma naujų vaistų buvo sukurti iš natūralių produktų ar gauti iš medžiagų, išskirtų iš natūralių produktų [22].

Prieš XX - ajį amžių, neapdirbti ar beveik gryni ekstraktai iš augalų, gyvūnų ar mineralų buvo vieninteliai galimi vaistai gydyti žmonių ir gyvūnų ligas. Idėja, kad vaistai organizmuose veikia dėl specifinių sąveikų tarp vaistų molekulių ir biologinių makromolekulių (dažniausiai baltymų ar nukleorūgščių), o ne tiesiog dėl menamos „gyvenimo galios“, leido mokslininkams padaryti išvadą, kad augalų ekstraktuose veiksmingi individualūs cheminiai dariniai. Nuo to prasidėjo nauja farmakologijos era, kai buvo pradėti kurti ir naudoti gryni, izoliuoti cheminiai dariniai, kurie pakeitė ekstraktus.

Klasikinis taip atrasto vaisto pavyzdys yra morfinas, opiumo aktyvusis ingredientas, ir digoksinas, širdį stimuliuojantis vaistas iš augalo Digitalis lanata. Natūralių produktų paieškos padeda atrasti naujų veiksmingų struktūrų, kurios vėliau naudojamos kaip modelis, naujų vaistų kūrimui.

Antibiotikams rezistentiškų mikroorganizmų rūšių plitimas pastūmėjo mokslininkus ieškoti naujų antimikrobinių medžiagų. Nuo 2000 iki 2008 - ųjų metų buvo užregistruota daugiau nei 300 natūralių, antimikrobinių savybių turinčių, metabolitų [39]. Tarp jų:

 Alkaloidai (pvz.: ksantin-6-onas)

2 pav. Alkaloidas ksantin-6-onas

 Acetilenai (pvz.: 6-acetileninės rūgštys)  Kumarinai (pvz.: 7- amino-4-metilkumarinas)  Flavonoidai ir isoflavonoidai (pvz.: apigeninas)  Iridoidai

 Lignanai (pvz.: (+)-lyoniresinol-3a-O-b-D-glucopiranozidas)  Makrolidai

 Fenoliai (other than flavonoids and lignans) (pvz.: eupomatenoidas-6)  Polipeptidai (pvz.: tripropeptinai)

 Chinonai (pvz.: 3,4-Dihidroksi-1-methoxiantrachinon-2-carboksaldehidas)  Steroidiniai saponinai

 Terpenoidai (pvz.: seskviterpenas ksantorizolis)  Ksantonai (pvz.: mangostaninas) [52].

Taip pat ir pirmasis antibiotikas penicilinas yra natūralus produktas, išskirtas iš grybelio Penicillium rubens. Penicilino molekulė buvo chemiškai modifikuojama, norint pagerinti antibiotiko veikimą, koreguoti poveikio trukmę, stabilumą, sumažinti toksiškumą. Taip sukurta visa grupė penicilino antibiotikų:

1. Benzilpenicilinai 2. Fenoksipenicilinai

Fenoksimetilpenicilinas

3. Izooksazolilpenicilinai (oksacilino grupė) Oksacilinas Kloksacilinas Dikloksacilinas Flukloksacilinas 4. Aminobenzilpenicilinai Ampicilinas Amoksicilinas 5. Karboksipenicilinai Karbenicilinas Tikarcilinas 6. Acilaminopenicilinai Azlocilinas Mezlocilinas Piperacilinas

3 pav. Karbenicilinas 4 pav. Ampicilinas

Medžiagų, išskirtų iš natūralių šaltinių, struktūros dažniausiai nustatomos masių spektrometrijos (MS) ir branduolių magnetinio rezonanso spektroskopijos (NMR) būdais. Kartais, norint gauti papildomą informaciją, reikalingą patvirtinti nustatytą struktūrą, naudojami kiti metodai, kaip infraraudonųjų spindulių spektroskopija, UV spektroskopija, radio spindulių kristalografija.

1.3.

Česnako ir jo aktyvių junginių panaudojimas medicinoje

Česnakas priklauso česnakinių augalų šeimai Allium. Šiai šeimai priklauso tokie augalai, kaip svogūnas, poras. Randama įrodymų, kad žmonės česnaką naudoja jau apie 7000 metų, jis kilęs iš centrinės Azijos [24] ir ilgai buvo svarbus Viduržemio regione. Česnaką taip pat naudojo ir Senovės Egiptiečiai – kulinarijai ir medicinai [66].

Senovėje česnakas buvo naudojamas nuo daug sutrikimų: nuo parazitų, kvėpavimo problemų, blogo virškinimo, silpnumo [14].

Šiais laikais, norint įrodyti medicininį česnako veikimą, buvo atlikti tyrimai, jais nustatyta:

 nauda kardiovaskuliarinei sistemai [50, 38],  cholesterolio akumuliaciją ant kraujagyslių

sienelių stabdantis poveikis gyvūnams [64] ir žmonėms [10, 11, 43, 22, 65, 68, 40, 42],

 vazodilataciją sukeliančios savybės [13],

 trombocitų agregaciją slopinančios savybės [49, 18, 15, 50],

 peršalimo prevencijos [39, 48, 44, 55, 45] ir gydomosios savybės [69, 44],

 cukraus kiekį reguliuojančios savybės [11, 47],  priešvėžinės savybės [51].

Taip pat česnakas buvo naudojamas kaip antibiotikas. Pirmojo ir antrojo pasaulinio karo metais

česnakas buvo naudojamas kaip antiseptikas, norint išvengti gangrenos [68]. Pastaraisiais metais buvo

buvo atliktas tyrimas, kur burnos skalavimo skystis,

5 pav. Česnakas turintis 2,5% česnako ekstrakto, veikė antimikrobiškai [29]. Česnakas gali būti naudojamas ir kaip vaistas nuo infekcijų, taip pat ir grybelinių ligų, tokių kaip pienligė [57].

Česnako galvutėse yra nuo 6 iki 14 mg/g bekvapės cheminės medžiagos aliino (S-alilcysteino sulfoxidas) [37].

Sutraiškius česnaką, fermentas aliinazė, kuris paprastai yra kaupiamas atskiruose ląstelės dariniuose, yra paskleidžiamas ir susimaišo su aliinu. Dėl jų tarpusavio reakcijos susidaro alicinas (dialiltiosulfonatas, česnakui kvapą suteikianti medžiaga) [34].

Anksčiau buvo manoma, kad alicinas yra aktyvusis česnako ingredientas, bet nustačius, jog gyvame organizme jo skilimo pusperiodis yra per trumpas reikšmingai paveikti grybelius, buvo nustatyta, kad tik alicino skilimo produktams būdingos priešgrybelinės savybes in vivo [26]. Taip pat buvo nustatyta, kad kepenyse dialilo disulfidas, vienas iš aktyvių alicino skilimo produktų, gali būti metabolizuotas atgal į aliciną [67].

6 pav. Aktyvūs česnako komponentai ir jų skilimo produktai [101]

Kaip jau buvo aptarta, alicinas ir/ar jo skilimo produktai yra pagrindiniai biologiškai aktyvūs česnako ingredientai, veiksmingi prieš bakterijas, virusus, grybelius, parazitus [9]. Jų veikimas aiškinamas kaip reakcija tarp junginių sulfido molekulių ir mikroorganizmų sulfhidrilinių (SH) grupių aminorūgštyse ir ląstelių baltymuose [51].

Buvo tiriamas alicino gebėjimas pereiti pro ląstelių membranas. Gauti rezultatai rodė, kad fosfolipidų dvisluoksnis nesudaro barjero alicino skverbimuisi į ląstelę, taip pat į ląstelę jis patenka nepakitęs. Buvo padaryta išvada, kad didelis alicino biologinis aktyvumas yra dėl reakcingumo su mažos ir didelės molekulinės masės tioliais (CSH grupėmis) ir dėl gero praeinamumo į ląsteles [41].

Buvo tiriamas ir alicino veikimas prieš MRSA bakterijas. Alicino tyrimas prieš 30 MRSA padermių parodė didelį aktyvumą prieš jas, įskaitant ir kitoms cheminėms antimikrobėms

medžiagoms atsparias MRSA padermes. 88 % ištirtų padermių minimali inhibuojanti alicino koncentracija buvo 16 mg/l, o visų padermių dauginimasis inibuotas pasiekus 32mg/l koncentraciją. 88 % MRSA padermių minimali baktericidinė alicino dozė buvo 128 mg/l, ir visos buvo nužudytos pasiekus 256 mg/l. 82 % šių padermių buvo rezistentiškos mupirocinui. Taip pat šiame tyrime buvo ištirta, jog stabilesni yra vandeniniai alicino dariniai, spėjama dėl vandenilinių jungčių [20].

Kaip matome lentelėje (1 lentelė), alicinas pasižymi plačiu antimikrobiniu poveikiu. Daugumoje atvejų LD50 buvo didesnė, nei įprasta šiuolaikiškiem antibiotikam.

1 lentelė. Alicino antibakterinis aktyvumas [76]

Bakterijų padermė Alicino koncentracija

(LD50 µg/ml) Komentaras

Escherichia coli 15 Jautri antibiotikams

Escherichia coli 15 Rezistentiška antibiotikams

Staphylococcus aureus 12 Jautri

Staphylococcus aureus 12 Rezistentiška meticilinui

Streptococcus pyogenes 3 Jautri

Streptococcus β hemolyticus >100 Rezistentiška antibiotikams

Proteus mirabilis 15 Jautri

Proteus mirabilis >30 Rezistentiška antibiotikams

Pseudomonas aeruginosa 15 Jautri cefproziliui

Pseudomonas aeruginosa >100 Rezistentiška antibiotikams Enterococcus faecalis >100 Rezistentiška antibiotikams

Alicinui ir jo skilimo produktams būdingas

S CH₂

R _{radikalas. Alicinas}

sudarytas iš dviejų tokių radikalų, o jo skilimo produktuose šis radikalas išlikęs, tik sujungtas su kitais radikalais. Dėl šio S-alyl radikalo pasikartojimo visose molekulėse galima spręsti, kad jis yra atsakingas už alicino ir jo skilimo produktų antimikrobinį aktyvumą, nes jis padidina molekulės lipofiliškumą, taip pagerindamas patekimą į bakterijas, o siera sudaro vandenilinius ryšius su baltymų SH grupėmis. Prijungus alilo radikalą prie rodanino molekulės susidaro

S CH₂

S R

šaltiniais alicino dariniai turintys kelis sieros atomus turi stipresnį antimikrobinį veikimą, dėl stipresnio jungimosi su bakterijų baltymais [21].

1.4.

Rodaninas ir jo dariniai

Rodaninas - penkianarė heterociklinė molekulė, susidedanti iš tiazolo su karbonilo grupe ant ketvirto anglies atomo - turi platų farmakologinį veikimo spektrą: antigrybelinį, antivirusinį, antibakterinį, antinavikinį ir antidiabetinį potencialą [71]. Rodanino dariniai veikia inhibuojančiai daug taikinių, kaip hepatito C viruso NS3 proteazę [60], aldozės reduktazę [16, 27], beta- laktamazę [28],

UDP-N-acetilmuramoil-L-alanino ligazę [59], 8 pav. Rodaninas

antidiabetinius agentus [23], katepsiną D [42], histidino dekarboksilazę [25]. Panašūs į rodaniną fragmentai aptikti beta - laktaminių antibiotikų struktūrose:

9 pav. Aztreonamas 10 pav. Cefeksimas

Rodanino molekulės poveikis koreguojamas įvairiais pakaitais. Daugelis aprašytų rodanino junginių turi pakaitus 5-oje žiedo padėtyje. Į penktąją padėtį pakaitai įvedami vykdant aldolinę (Knoevenagel‘io) kondensaciją. Jos metu, vykdant reakciją skirtinguose tirpikliuose, naudojami katalizatoriai: natrio acetatas, amonio acetatas ar kt. Pagal Lietuvoje atliktus mokslininkų ir studentų tyrimus stipriausiu antimikrobiniu poveikiu pasižymėjo rodanino junginiai su į 5 padėtį įvestu 5-nitrofuranu [4, 1, 6, 8, 5].

Lietuvoje su rodanino molekule buvo susintetinta daug junginių [4, 1, 6, 8, 5], tačiau didžiausią pasisekimą turėjo prof. habil. dr. E. Tarasevičiaus susintezuota medžiaga – nifumezinas, turinti sulfanilamidinį pakaitą 2-oje padėtyje ir nitrofurano 5-oje padėtyje, kuriai buvo atlikti ikiklinikiniai tyrimai.

12 pav. Nifumezinas

1.5.

Apibendrinimas

Pasaulio sveikatos organizacijos duomenimis priešmikrobinių junginių poreikis yra didelis ir didėjantis dėl mikrobų rezistentiškumo antibiotikams. Dėl to būtina kurti naujus antibiotikus, o juos lengviau kurti tiriant ir mėgdžiojant gamtoje esančius ir antimikrobiškai veikiančius junginius.

Nuo seno naudojamas ir antimikrobiniu poveikiu pasižymi česnakas. Nustatyta, kad tai jame esantis alicinas ir jo metabolitai suteikią česnakui antimikrobinį poveikį, taip pat ir didelį susirūpinimą keliančias atsparias S. aureus bakterijas.

Rodanino antimikrobinis aktyvumas taip pat jau senai žinomas ir tirtas, dėl to tikimąsi, kad alicino ir rodanino junginiai veiks baktericidiškai.

2. TYRIMO METODIKA

2.1.

Rodanino darinių sintezė

2.1.1.

5-pakeistų rodanino darinių sintezė

Norint pagaminti 5 pakeistus rodanino darinius, reikia paimti 0,1 mol (13,3 g) rodanino, 0,1 mol norimo aldehido ir amonio acetato (ar natrio acetato, kai naudojamas aldehidas nitrofurfurolas). Įpilama 15 ml ledinės acto rūgšties. Kaitinama 100°C iki 10 min. Reakcijos su nitrofurfurolu metu kaitinama 30 min ne didesnėje nei 60°C temperatūroje. Reakcijos eigoje iškrenta nuosėdos. Tirpalas atšaldomas, nuosėdos filtruojamos pro stiklo filtrą vakumu ir perplaunamos ledine acto rūgštimi, etanoliu, eteriu. Tuomet gautos nuosėdos kristalizuojamos iš acetono arba izopropanolio.

Taip gauti junginiai: 2-5-(5-nitrofuran-2-ilmetilen)-1,3-tiazol-4-onas, 2-5-(p-brombenziliden-2-ilmetilen)-1,3-thiazol-4-onas, 2-5-(p-chlorbenziliden-2-ilmetilen)-1,3-thiazol-4-onas, 2-5-(furan-2-ilmetilen)-1,3-thiazol-4-2-5-(p-chlorbenziliden-2-ilmetilen)-1,3-thiazol-4-onas, 2-5-(4-hidroksi-3metoksi-2-ilmetilen)-1,3-thiazol-4-onas, 2-5-(p-nitrobenziliden -2-ilmetilen)-1,3-thiazol-2-5-(4-hidroksi-3metoksi-2-ilmetilen)-1,3-thiazol-4-onas, 2-5-(p-dimentilaminobenziliden-2-ilmetilen)-1,3-thiazol-4-onas.

2.1.2.

5-pakeistų-2-alil-rodanino darinių sintezė

Šiems junginiams gaminti naudojami pakeisti rodanino dariniai. Imama 5 mmol 5-pakeisto rodanino junginio, pilama 7ml benzeno ir 5 mmol N,N-diizopropiletilamino. Mišinys šildomas mikrobangų krosnelėje 200W 20 min, kol nuosėdos ištirpsta. Vėliau į mišinį pilama 4 ml alilbromido tirpalo ir šildoma mikrobangų krosnelėje 400W 20 min, kol susidaro bespalviai kristalai. Vykdant reakcija su rodanino junginiais, turinčiais nutrofurfurilo pakaitą 5-oje padėtyje, nuosėdos susidaro mišinį ištraukus iš mikrobangės ir palikus kambario temperatūroje, kitų reakcijų metu nuosėdos iškrenta vykdant reakciją. Reakcijos mišinys su nuosėdom plaunamas vandeniu ir filtruojamos pro stiklo filtrą vakumu, plaunama etanoliu ir eteriu. Gautos nuosėdos kristalinamos, kristalizacija pirmu tirpikliu vyksta su anglimi. prop-enilsulfanil-5-(5-nitrofuran-ilmetilen)-1,3-tiazol-4-onas (VIP-41) kristalinta iš etilo acetato ir izopropanolio, gauta 0,49 g;

2-prop-2-enilsulfanil-5-(p-brombenziliden-2-ilmetilen)-1,3-thiazol-4-onas (VIP-42) kristalinta iš acetonitrilo, izopropanolio, etilo acetato, gauta 0,48 g; 2-prop-2-enilsulfanil-5-(p-chlorbenziliden-2-ilmetilen)-1,3-thiazol-4-onas (VIP-43) kristalinta iš acetonitrilo, etanolio, etiloacetato, gauta 0,43 g; 2-prop-2-enilsulfanil-5-(furan-2-ilmetilen)-1,3-thiazol-4-onas (VIP-44) kristalinta iš cikloheksano, gauta 0,27 g; 2-prop-2-enilsulfanil-5-(4-hidroksi-3-metoksibenziliden-2-ilmetilen)-1,3-thiazol-4-onas (VIP-45) kristalinta iš acetonitrilo, izopropanolio, acetonitrilo, benzeno, gauta 0,323 g; 2-prop-2-enilsulfanil-5-(p-nitrobenziliden-2-ilmetilen)-1,3-thiazol-4-onas (VIP-46) kristalinta iš izopropanolio gauta 0,85 g; 2-propilsulfanil-5-(p-dimentilaminobenziliden-2-ilmetilen)-1,3-thiazol-4-onas (VIP-47) kristalinta iš izopropanolio, gauta 0,61 g. Gautų junginių tirpalai pasižymi specifiniu, česnaką primenančiu kvapu.

Šiomis reakcijomis gauti šie junginiai: 2-prop-2-enilsulfanil-5-(5-nitrofuran-2-ilmetilen)-1,3-tiazol-4-onas (VIP-41), 2-prop-2-enilsulfanil-5-(p-brombenziliden-2-ilmetilen)-1,3-thiazol-4-onas (VIP-42), prop-enilsulfanil-5-(p-chlorbenziliden-ilmetilen)-1,3-thiazol-4-onas (VIP-43), 2-prop-2-enilsulfanil-5-(furan-2-ilmetilen)-1,3-thiazol-4-onas (VIP-44), 2-prop-2-enilsulfanil-5-(4-hidroksi-3-metoksibenziliden-2-ilmetilen)-1,3-thiazol-4-onas (VIP-45), 2-prop-2-enilsulfanil-5-(p-nitrobenziliden-2-ilmetilen)-1,3-thiazol-4-onas (VIP-46), 2-propilsulfanil-5-(p-dimentilaminobenziliden-2-ilmetilen)-1,3-thiazol-4-onas (VIP-47).

Reakcijos eiga ir rezultatai tikrinami plonasluoksnės chromatografijos būdu, sistema acetonas:toluenas (4:1), matomas gelsvai fluorescuojantis taškas. Gautiems VIP-41-47 junginiams nustatyti UV ir IR spektrai.

2 lentelė. 5-pakeisti-2-alil-rodanino junginiai

Jung. Nr R Išeiga (%)/ reakcijos laikas (min.) Lyd. Temp. °C Mol. Formulė (Mr) Grynumas pagal ESC % VIP-41 56/70 141-144 C11H8N2O4S2 296 79,56

VIP-42 90/50 156-158 C13H10BrNOS2 340 99,05 VIP-43 78/50 137-138 C13H10BrNOS2 295 98,76 VIP-44 62/50 77-78 C11H9N2O2S2 251 99,45 VIP-45 84/50 141-142 C14H13NO3S2 307 98,52 VIP-46 77/50 135-137 C13H10N2O3S2 306 60,05 VIP-47 81/50 128-130 C16H17NOS2 303 99,31

2.1.3.

5-nitrofurfuril-2-propil-rodanino (VIP-48) sintezė

Šiam junginiui gaminti naudojamas 2-5-(5-nitrofuran-2-ilmetilen)-1,3-tiazol-4-onas. Imama 5 mmol 5-pakeisto-rodanino junginio, pilama 7ml benzeno ir 5 mmol N,N-diizopropiletilamino. Mišinys šildomas mikrobangų krosnelėje 200W 10 min, kol nuosėdos ištirpsta. Vėliau į mišinį pilama 4 ml propiliodidas tirpalo ir šildoma mikrobangų krosnelėje 400W 10 min, kol susidaro bespalviai kristalai. Nuosėdos susidaro ištraukus iš mikrobangės ir palikus kambario temperatūroje. Reakcijos mišinys su nuosėdomis plaunamas vandeniu ir filtruojamos pro stiklo filtrą vakumu, plaunama etanoliu ir eteriu. Gautos nuosėdos kristalinamos iš izopropanolio su anglimi ir etilo acetato.

Reakcijos eiga ir rezultatai tikrinami plonasluoksnės chromatografijos būdu, sistema acetonas:toluenas (4:1). Junginiui nustatyti UV ir IR spektrai.

3 lentelė. 5-nitrofurfuril-2-propil-rodaninas Jung. Nr R Išeiga (%)/ reakcijos laikas (min.)

Lyd. Temp. °C Mol. Formulė (Mr)

Grynumas pagal ESC

VIP-48 56/30 146-148 C11H10N2O4S2

298 100

2.2.

Lydymosi temperatūros nustatymas

Susintetintų junginių lydymosi temperatūra nustatoma Koflerio lydymosi temperatūros nustatymo aparatu. Jis susideda iš mikroskopo, kaitinimo elemento, termometro.

Ant objektinio stiklelio uždedamas mažas kiekis medžiagos ir ant viršaus uždedamas kitas objektinis stiklelis. Medžiaga sutrinama tarp abiejų stiklelių. Vėliau objektiniai stikleliai dedami ant kaitinimo elemento ir pro mikroskopą stebimi junginio struktūros pokyčiai.

Lydymosi pradžia laikoma pirmo lašelio atsiradimas, o pabaiga – kai visas junginys virsta skysčiu ir nebėra kristaliukų.

2.3.

Junginių strūktūros nustatymas IR spektroskopijos būdu

Junginių spektrai buvo užrašyti Perken Elmer Spektrum – 100 spektrometru naudojant ATR (angl. Attenuated total reflection) priedą, užnešant mažą tiriamo junginio kiekį ant cinko selenido kristalo.

Tirtų junginių IR spektrai pateikiami 1 priede.

2.4.

Junginių grynumo nustatymas

Junginių grynumas nustatomas efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodu. Analizei buvo naudojamas Waters 2695 chromatografas (Waters Corporation, Milford, USA) bei fotodiodų matricos detektorius Waters 996 PDA (Waters Corporation, Milford, USA). Kolonėlė junginių atskyrimui C 18 4,6x250 mm, 5 µm ACE kolonėlė, kuri buvo laikoma išoriniame termostate, 25°C temperatūroje. Prieš atliekant analizę buvo paruošiami tiriamųjų medžiagų tirpalai tirpinant 1 mg medžiagos 10 ml acetonitrile. Chromatografijai buvo naudojama 10 µl tirpalo. Mobiliosios fazės greitis 1,2 ml/min. Buvo naudota tokia gradiento sistema: tirpalas A – 0,1% trifluoracto rūgštis vandenyje, tirpalas B – acetonitrilas; 0 min. – 80% A ir 20% B, 15 min. – 20% A ir 80 % B, 20 min. – 10% A ir 90% B, 21 min. – 80% A ir 20% B. Veikliųjų junginių detekcija atlikta 200-600nm bangų intervale. Rezultatai pateikiami antroje ir trečioje lentelėse.

4 lentelė. Junginių UV-vis pikai

Junginys UV-vis pikai

VIP-1 244; 299; 407 VIP-2 268; 311; 371 VIP-3 267; 311; 370 VIP-4 281; 317; 399 VIP-5 200; 286; 407 VIP-6 316; 375 VIP-7 231; 318; 412 VIP-8 293; 469

2.5.

Junginių antimikrobinio poveikio tyrimas in silico

Junginių antimikrobiniui poveikiui in silico nustatyti buvo naudojama speciali kompiuterinė programa TRIPOS SYBYL-X (bandomoji versija).

TRIPOS SYBYL-X yra molekulinio modeliavimo programa. Ji sukurta norint palengvinti ir pagreitinti aktyvių junginių paiešką vaistų paieškoje. Molekulinis modeliavimas apima daugeli teorinius ir skaičiavimo metodus, naudojamus modeliuoti ar imituoti molekulės elgseną. Viena iš svarbiausių molekulinio modeliavimo savybių, tai, kad molekulinės sistemos yra atomistiniame lygyje. Molekulinio modeliavimo metu skaičiavimai gali būti atliekami dideliam kiekiui medžiagų vienu metu. Molekulinis modeliavimas suteikia galimybę ištirti gyvame organizme vykstančius reiškinius: baltymų susilankstymą, fermentų katalizę, konformacinius pokyčius, baltymų stabilumą, atpažinimo procesus DNR ir membranose.

Atlikus molekulinį modeliavimą programa matematiniais metodais suskaičiuoją apytikrį rezultatą, kuris parodo intramolekulinių, ne kovalentinių, jungčių, tokių kaip vandenilinės jungtys, sąveikos stiprumą tarp pasirinktos molekulės ir tiriamos medžiagos atomų. Kuo rezultatas didesnis, tuo junginio sąveika su mikroorganizmo baltymais stipresnė, ir tiriamasis junginys galimai aktyvesnis. Taip pat matuojami atstumai tarp tiriamojo junginio vandenilinį ryšį sudarančios molekulės ir baltyme esančio NADH+ vandenilio atomų. Atstumas matuojamas Angstremais (Å).

Eiga. Visų pirma internetinėje duomenų bazėje [http://pdb.org] surandama jau iškristalizuota 4BNF baltymo struktūra. Tuomet baltymas paruošiamas darbui. Pirmiausia iš baltymo polimerinės struktūros išskiriamas jo monomeras. Iš baltymo turi būti pašalinama kristalografijos būdu nustatyta triklozano molekulė, kuri išsaugojama atskirai vėlesniems palyginimams. Baltymas yra paruoštas, kai jis rodomas kaip monomeras, nebeturintis prijungtos triklozano molekulės.

Paruošus baltymą atliekamas jo validavimas, norint patikrinti programos ir kompiuterinės informacijos tikslumą. Validavimo metu tyrimam išsaugotą triklozano molekulę bandoma prijungti prie baltymo, taip pat, kaip ji buvo prisitvirtinusi prieš ją pašalinant iš monomero struktūros. Validavimo metu keičiami molekuliniai ir programos parametrai, priklausomai nuo to, į kokius parametrus norėtume, kad programa atsižvelgtų, kaip: tiriamų junginių molekulių vidinį judėjimą, išsilanktymą prisijungimo metu, 20 faktorių prisijungimo būdų ir kt. Suradus tinkamus parametrus jie išsaugomi tirti kitus junginius (17 pav.).

In silico tyrimo rezultatai pateikiami penktoje lentelėje.

5 lentelė. Tyrimo in silico rezultatai

Junginys Rezultatas Vandenilinių ryšių

skaičius VIP-41 5,96 2 VIP-42 5,17 3 VIP-43 5,44 2 VIP-44 6,34 4 VIP-45 4,87 4 VIP-46 5,01 2 VIP-47 6,28 4 VIP-48 5,39 1

2.6.

Junginių antimikrobinio poveikio tyrimas in vitro

Susintetinti junginiai buvo tiriami mikrobiologiškai in vitro. Aktyvumas buvo tiriamas prieš šias bakterijų ir grybelių kultūras:

1. Staphylococcus aureus ATCC 25923 2. Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 3. Enterococcus faecalis ATCC 29212 4. Escherichia coli ATCC 25922

5. Klebsiella pneumoniae ATCC 33499 6. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 7. Proteus mirabilis ATCC 12459

8. Bacillus cereus ATCC 8035 9. Bacillus subtillis ATCC 6633 10. Candida albicans ATCC 60193

Bakterijų ir grybelių pasirinkimą lėmė jų skirtingi struktūriniai ypatumai: gramteigiamos bakterijos: S. aureus, Staphylococcus epidermidis; gramneigiama E. coli, sudarančios sporas B. subtilis ir B. cereus, sudaranti kapsulę K. pneumoniae, šliaužianti P. Mirabilis. Taip pat jie

dažnai pasirenkami kaip standartiniai mikrobai priešmikrobiniams tyrimams. P. aeruginosa yra atspari daugeliui antimikrobinių vaistų, o E. faecalis – vienas dažniausių hospitalinių infekcijų sukėlėjų, be to, jis labai jautrus nitrofurantoino poveikiui [103], todėl naudinga nustatyti, ar susintetinti nauji nitrofurano dariniai yra aktyvūs prieš šias bakterijas. C. albicans – vienas iš dažniausiai grybelines infekcijas sukeliančių bakterijų, dėl to dažnai naudojamas kaip standartinis grybelis tyrimams.

Bakteriostatinės (fungistatinės) junginių koncentracijos nustatytos serijinio skiedimo būdu standžioje terpėje (Mueller-Hinton broth II, BBL, Cockeysville, JAV).

Etaloninių mikroorganizmų kultūrų paruošimas. Etaloninės bakterijų ir grybelio C. albicans kultūros buvo auginamos 1 parą prieš tyrimą, termostate, 5 ml mėgintuvėliuose ant nuožulnaus Miulerio-Hintono agaro. Termostate kultūros laikomos ~24 valandas 35°C. Mikrobų suspensija gaminama iš išaugintų mikrobų kultūrų fiziologiniame natrio chlorido (0,9 %) tirpale, standartizuojama McFarland standartiniu indikatoriumi, kuris matuoja mėgintuvėlyje esančios suspensijos drumstumą. Mikrobų suspensija laikoma standartizuota, kai indikatoriaus reikšmė lygi 0,5 (tai reiškia, kad 1 ml mikrobų suspensijos yra 1,5 × 108 mikrobų ląstelių).

Tiriamųjų junginių paruošimas mikrobiologiniam tyrimui. Tiriamiamieji junginiai tirpinami dimetilsulfokside (DMSO), kadangi jų tirpumas vandenyje prastas. Buvo paruošti 1000 µg/ml koncentracijos tirpalai. DMSO taip pat būdingas priešmikrobinis veikimas, todėl kartu buvo atliekamas kontrolinis tyrimas. Vėliau tiriamųjų junginių tirpalai buvo perkelti į Petri lėkšteles, kartu dedamas agaras ir sumaišoma sterilia kilpele, taip paruošiami 500 µg/ml koncentracijos tirpalai. Standartizuotos mikrobų kultūrų suspensijos kilpele po 0,1 ml buvo sėjamos ant sustingusios standžios terpės su atitinkama junginių koncentracija. Pasėtai mikrobų kultūrų suspensijai išdžiūvus, Petri lėkštelės dedamos į termokamerą parai laiko.

Kontrolei ant standžiosios Miulerio–Hintono terpės buvo sėjamos etalonines bakterijų ir grybelio C. albicans kultūros be tiriamosios medžiagos. Kitą dieną vertinamas mikrobų augimas ir lyginamas su kontrole.

6 lentelė. Antimikrobinio aktyvumo tyrimų rezultatai esant 500 µg/ml koncentracijai Junginys MSK, µg/ml S. a u reu s A TCC 2 5 9 2 3 S. e p id erm idi s ATCC 1 2 2 2 8 E. fa ecalis AT CC 2 9 2 1 2 E. c o li ATCC 25 922 K. pneu mon iae ATCC 3 3 4 9 9 3 P. a erug ino s a AT CC 2 7 8 5 P. m ir ab ilis AT C C 1 2 4 5 9 B. c ereu s AT CC 8 0 3 5 B.s su b ti lis ATCC 6 633 C. a lbic ans ATC C 6 0193 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 VIP-41 500 500 500 500 500 >500 >500 500 >500 500 VIP-42 >500 >500 >500 >500 >500 >500 500 >500 >500 >500 VIP-43 >500 >500 >500 >500 >500 >500 >500 >500 >500 >500 VIP-44 >500 >500 >500 >500 >500 >500 >500 >500 >500 >500 VIP-45 >500 >500 >500 >500 >500 >500 >500 >500 >500 >500 VIP-46 >500 >500 >500 >500 >500 >500 >500 >500 >500 >500 VIP-47 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 VIP-48 >500 >500 >500 >500 >500 >500 >500 >500 >500 >500

2.7.

Apibendrinimas

Šiame skyriuje pateikiami junginių sintezės aprašymai, junginiams atliktų tyrimų

aprašymai ir rezultatai, kaip: lydymosi temperatūros nustatymas, UV ir IR spektrų nustatymas, grynumo įvertinimas, junginių priešmikrobinis aktyvumo nustatymas in silico ir in vitro.

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1.

Rodanino darinių sintezė

2-alil-rodanino junginiai buvo sintetinami dėl panašios struktūros česnako junginiui aliinui ir iš jo išskirtam junginiui alicinui. Česnako junginiai yra nuo seno naudojami, nuo įvairių infekcijų ir jų aktyvumas yra ištirtas įvairiais tyrimais. Tad manyta, kad rodaninas dar labiau pastiprins aliino veiksmingumą. Įdomu, kad rodanino alilo junginiai turi česnakui būdingą kvapą.

Prieš pradedant sintezę buvo atlikta jau susintetintų junginių duomenų bazių analizė. Buvo rasta nedaug susintetintų S-alil rodanino darinių su pakaitais 5 – oje padėtyje, bet nei vienam jų nebuvo atlikti priešmikrobiniai tyrimai.

Elektroninėje duomenų bazėje rastas vienas jau susintezuotas junginys – VIP–44, tačiau jam nebuvo atlikta panašių tyrimų.

Pagal turimus duomenis galima palyginti skirtingų aldehidų pakaitų 5 – oje rodanino žiedo padėtyje antimikrobinį poveikį. Taip pat remiantis jau atliktais magistriniais darbais su panašiais aldehidais, įvertinti alicino darinio 2 – oje rodanino žiedo padėtyje poveikį mikroorganizmams.

3.1.1.

5-pakeistų-rodanino darinių sintezė

Rodanino-5-pakeistiems junginiams buvo naudojamas jau pagamintas rodaninas. Jis buvo kristalintas iš butanolio tirpalo. Reakcija buvo vykdoma atliekant Knoevangel‘io kondensaciją. Šiuo metodu į 5 – ają rodanino žiedo padėtį buvo jungiami aldehidai. Šiai reakcijai kaip katalizatorius buvo naudojamas amonio acetatas ar natrio acetatas (vykdant reakciją su nitrofurfurolu). Lietuvoje atliktų tyrimų duomenimis, reakcijos su amonio acetatu vykdavo geriau, jų išeiga geresnė [80].

Kaip reakcijos tirpiklis buvo naudojama acto rūgštis. Iš pradžių acto rūgštyje, kaitinant, yra ištirpinami rodaninas ir aldehidas, o vėliau įdedamas katalizatorius. Maišant iškrenta nuosėdos. Reakcija su nitrofurfurolu vyksta apie 10 minučių, taip pat iškrentant nuosėdoms. Gautos medžiagos kristalizuojamos acetonu.

13 pav. 5-pakeistų-rodanino junginių sintezė

3.1.2.

2-alil-5-pakeistų-rodanino darinių sintezė

Norint gauti 2-alil-5-pakeistus-rodanino junginius vykdoma rodanino-5-pakeistų junginių alkilizacija. Ji susideda iš dviejų etapų. Pirmasis žingsnis yra rodanino druskų formavimas. Rodanino-5-acetilo junginiai alkilinami naudojant N,N-diisopropiletilaminą ir nepolinį tirpiklį – benzeną. Mišinys maišomas, kol susidaro rodanino. Vėliau vykdoma alkilizacija, naudojant alilbromidą. Reakcijos laikas yra gana ilgas, nes negalima šildyti reakcijos mišinio. Eksperimentiškai matoma, jog šildant reakcijos mišinį susidaro daugiau šalutinio produkto – rodanino-N-alilo. Norint pagreitinti reakciją buvo naudojama mikrobangų krosnelė. Tai žymiai pagreitino reakcijos laiką, o reakcijos mišinys likdavo neįkaitęs. Reakcijos metu susidarydavo permatomi amonio druskos kristalai, o reakcijos eigai sekti buvo naudojama plonasluoksnė aliuminio plokštelių chromatografija (PLC), naudojant tirpiklių sistemą toluenas:acetonas (4:1). Įvykus reakcijai ant aliuminio plokštelės buvo matomi geltonai fluorescuojantys

acetilo dariniai ir melsvi N-alil-rodanino-acetilo junginiai. Norint išgryninti 2-alil-rodanino-5-acetilo darinius buvo atliekama kristalizacija. Pirmoji kristalizaciją buvo vykdoma su anglimi, vykdant karštą filtraciją iš skirtingų tirpiklių. Buvo matomas akivaizdus kristalų šviesėjimas. Vėliau, dėl skirtingų susidariusių junginių tirpumų, kristalizacijai buvo pasirenkami skirtinngi tirpikliai. Remiantis PLC rezultatais medžiagos buvo kristalinamos nuo 1 iki 4 kartų, skirtingais tirpikliais. Taip gaunami: Šiomis reakcijomis gauti šie junginiai: 2-prop-2-enilsulfanil-5-(5-nitrofuran-2-ilmetilen)-1,3-tiazol-4-onas (VIP-41), 2-prop-2-enilsulfanil-5-(p-brombenziliden-2-ilmetilen)-1,3-thiazol-4-onas (VIP-42), prop-enilsulfanil-5-(p-chlorbenziliden-ilmetilen)-1,3-thiazol-4-onas (VIP-43), prop-enilsulfanil-5-(furan-ilmetilen)-1,3-prop-enilsulfanil-5-(p-chlorbenziliden-ilmetilen)-1,3-thiazol-4-onas (VIP-44), prop-enilsulfanil-5-(4-hidroksi-3-metoksibenziliden-ilmetilen)-1,3-thiazol-4-onas (VIP-45), 2-prop-2-enilsulfanil-5-(p-nitrobenziliden -2-ilmetilen)-1,3-thiazol-4-onas (VIP-46), 2-propilsulfanil-5-(p-dimentilaminobenziliden-2-ilmetilen)-1,3-thiazol-4-onas (VIP-47). S N H S O R S N S O R CH2 Br CH₂ N C H₃ CH₃ CH₃ C H₃ CH₃

15 pav. 2-alil-5-vanilin-rodanino kristalai

3.1.3.

2-propil-5-nitrofurfuril-rodanino (VIP-48) sintezė

Šiai sintezei naudojamas jau pagamintas 5-nitrofurfuril-rodaninas. 2-propil-5-pakeisti rodanino dariniai sintetinami panašiai, kaip ir 2-alil-5-pakeisti-rodanino junginiai, tik vietoj alilbromido naudojamas propil-jodidas. Gautas 2-propil-5-nitrofurfulil-rodaninas kristalinamas iš izopropanolio, naudojant anglį, ir iš etilo acetato.

S N H S O R S N S O R CH3 I CH₃ N C H₃ CH₃ CH₃ C H₃ CH₃

16 pav. 2-propil-5-nitrofurfuril-rodanino junginių sintezė

3.2.

Junginių struktūros nustatymas IR spektroskopijos būdu

Junginių strūktūra buvo nustatyta IR spektroskopijos būdu. Spektrai buvo analizuojami pasinaudojant internete rastomis lentelėmis, su organinių junginių funkcinių grupių IR absorbcijos dažniais [105, 106]. Rezultatai pateikiami septintoje lentelėje.

7 lentelė. Junginių strūktūros nustatymas IR spektroskopijos būdu

Junginys Dažnis Grupė

1705 Keto VIP-41 1475, 1340 Nitro 1690 Keto VIP-42 660 Br 1690 Keto VIP-43 751 Cl VIP-44 1680 Keto VIP-45 1665 Keto 1700 Keto VIP-46 1510, 1340 Nitro VIP-47 1660 Keto VIP-48 1665 Keto

3.3.

Junginių antimikrobinio aktyvumo tyrimas in silico

Junginių tyrimui in silico reikėjo pasirinkti taikinį. Juo pasirinkau bakterijoje S. aureus esanti baltymą 4BNF. Taikiniu pasirinkau S. aureus, dėl šios bakterijos infekcijų gausėjimo ir rezistentiškumo antibiotikams didėjimo [73], Susintezuotų junginių priešmikrobinis tyrimas in

silico atliktas panaudojant kompiuterinio modeliavimo programą “SYBYL-X”. Gauti rezultatai buvo lyginami su triklozano junginio molekulinio modeliavimo rezultatais. Triklozano aktyvumas prieš skirtingas MRSA padermes svyruoja MSK (minimali slopinati koncentracija) nuo 0,12 mg/l iki 4 mg/l ir MBK (minimali baktericidinė koncetracija) nuo 0,25 mg/l iki 32 mg/l [19]. Jo molekulinio modeliavimo rezultatas 3,99, o atstumas tarp vendenilinius ryšius sudarančių molekulių – 2,88 Å.

17 pav. 2-alil-5-vanilin-rodanino molekulė prisijungusi prie 4BNF baltymo

Iš rezultatų matome, kad visų gautų junginių molekulinio modeliavimo rezultatai, jungiantis su 4BNF baltymu, yra geresni nei lyginamojo triklozano.

Tik vieno junginio (VIP-45) rezultatas yra mažesnis nei 5, keturių junginių rezultatas yra lygus, arba didesnis nei 5, ir dviejų junginių aktyvumas didesnis nei 6. Pats didžiausias

rezultatas nustatytas junginio 5-furfuril-2-alil-rodanino (VIP-44) (16 pav.).

Pastebėta, kad vieni iš aktyviausių junginių yra su furano žiedais. Remiantis LSMU atliktais tyrimais, junginiai su nitrofurfurolo pakaitu turi didžiausią aktyvumą prieš S. aureus [1, 4, 6], todėl stebina, kad furano junginio su nitro grupe 5-oje padėtyje rezultatas mažesnis, nei tiesiog su furano grupe. Junginio VIP-41, kurio antroje padėtyje yra propeno radikalas, rezultatas didesnis nei junginio VIP-48 su propano radikalu.

Taip pat iš visų rodanino junginių su benzeno pakaitu 5-oje padėtyje, pats aktyviausias para padėtyje, turintis dimetilamino pakaitą.

18 pav. Junginių molekulinio modeliavimo sąveikos su 4BNF baltymu rezultatas

3.4.

Junginių antimikrobinio aktyvumo tyrimas in vitro

Norint įvertinti junginio antimikrobinio aktyvumo rezultatų teisingumą in silico, buvo atliktas pirminis antimikrobinis tyrimas in vitro užnuodytos lėkštelės standžioje terpėje metodu prieš S. aureus. Taip norint praplėsti tyrimą buvo atliktas tyrimas in vitro ir prieš kitas bakterijų padermes.

Mikroorganizmai pasirinkti dėl jų skirtingų struktūrinių ypatumų. Bakterijos Staphylococcus aureus (gramteigiama), Staphylococcus epidermidis (gramteigiama), E. coli (gramneigiama), B. subtilis ir B. cereus (sudarančios sporas), K. pneumoniae (sudaranti kapsulę), P. mirabilis (šliaužianti). P. aeruginosa atspari daugumai antimikrobinių vaistų, o E. faecalis – vienas dažniausių hospitalinių infekcijų sukėlėjų [17]. C. albicans – vienas pagrindiniu grybelinių infekcijų sukėlėjų.

Junginiai tyrimui buvo tirpinami DMSO, nes jie turi būti visai ištirpę ir nesikristalizuoti maišant su vandeniniu agaro tirpalu, o DMSO yra itin geras tirpiklis. Tačiau DMSO pasižymi

0

1

2

3

4

5

6

7

VIP-41

VIP-42

VIP-43

VIP-44

VIP-45

VIP-46

VIP-47

VIP-48

Triklozanas

antimikrobinėmis savybėmis, todėl buvo daromas kontrolinis mėginys nustatyti, ar junginių tirpinimui naudojamas DMSO tūris pasižymi antimikrobiniu aktyvumu. Gauta, kad 5 % DMSO tirpalas įtakos mikroorganizmų augimai neturi.

19 pav. Kontrolinis antimikrobinio tyrimo in vitro mėginys

Atlikus ažvalginį tyrimą gauti rezultatai, jog tik trys susintezuoti junginiai turi antimikrobinį veikimą (VIP-41;VIP-42; VIP-47). VIP-41 antimikrobiškai veikia septynias iš dešimties mikroorganizmų padermes (B. cerius, C. albicans, S. aureus, S. epidermidis, E. faecalis, E. coli, K. Pneumonine). VIP-42 veikia tik vienintelę P. Mirabilis. Daugiausiai mikroorganizmų veikia junginys VIP-47, 5-oje rodanino padėtyje turintis p-dimetilaminobenzaldehido pakaitą, jis pasižymi priešmikrobiniu veikimu prieš visų bakterijų ir grybelio C. albicans kultūras.

20 pav. 2-alil-rodanino su dimedilamino benzaldehido pakaitu 5-oje padėtyje antimikrobinio tyrimo in vitro rezultatai

8 lentelė. Pirminio mikrobiologinio tyrimo rezultatai esant 500 µg/ml tiriamojo junginio koncentracijai Junginys S. a u reu s ATC C 2 5 9 2 3 S. e p id erm idi s ATCC 1 2 2 2 8 E. fa ecalis AT CC 2 9 2 1 2 E. c o li ATCC 25 922 K. pneu mon iae AT C C 3 3 4 9 9 3 P. a erug ino s a AT CC 2 7 8 5 P. m ir ab ilis AT CC 1 2 4 5 9 B. c ereu s AT CC 8 0 3 5 B.s su b ti lis ATCC 6 633 C. a lbic ans ATC C 601 9 3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 VIP-41

₊

₊

₊

₊

₊

_-

_-

₊

_-

₊

_-

_-

_-

_-

_-

_-

₊

_-

_-

_-

_-

_-

_-

_-

_-

_-

_-

_-

_-

_-

_-

_-

_-

_-

_-

_-

_-

_-

_-

_-

_-

_-

_-

_-

_-

_-

_-

_-

_-

_-

_-

_-

_-

_-

_-

_-

_-

_-

_-

_-

₊

₊

₊

₊

₊

₊

₊

₊

₊

₊

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

Tyrimo in silico rezultatai ne visai atitiko tyrimo in vitro rezultatus. Daugumos junginių kurių molekulinio modeliavimo rezultatas buvo didesnis už triklozano, S. aureus baktericidiškai veikianti koncentracija buvo didesnė nei 500 µg/ml, o triklozano nuo 0,25 mg/l iki 32 mg/l. Du junginiai (VIP-41, VIP-47), kurių molekulinio modeliavimo rezultatai buvo didžiausi taip pat, vieninteliai iš visų junginių, pasižymėjo ir didesniu nei 500 µg/ml aktyvumu prieš S. aureus.

Nors VIP-44 su furano pakaitu 5-oje rodanino molekulės padėtyje rezultatai in silico žadėjo didesnį aktyvumą nei junginiui VIP-41 su nitro grupe 5-oje furano padėtyje, tačiau tyrimai in vitro parodė atvirkščius rezultatus.

Sintezuojant junginius, iškėliau hipotezę, jog antimikrobinis aktyvumas stipresnis, jei pakaitas 2-oje rodanino molekulės padėtyje turės dvigubą jungtį, kaip alicino molekulėje (17 pav.). Norint patikrinti šią hipotezę, buvo susintezuotas junginys su vienguba jungtimi pakaite (18 pav.).

S

N

S

O

O

N

O

-O

CH

S

N

S

O

O

N

O

-O

CH

Šią hipotezę patvirtino ir tyrimai in silico ir in vitro. VIP-41 molekulinio modeliavimo rezultatas 5,96, o VIP-48 5,39. Tiesa, skirtumas nėra labai didelis. Atlikus apžvalginius antimikrobinius tyrimus in vitro, matoma, kad junginys VIP-41 (17 pav.) veikia net 7 bakterijų padermes esant 500 µg/ml, o VIP-48 (18 pav.) esant tokiai koncentracijai neveikia nei vienos. Tad aktyvumas tikrai priklauso nuo dvigubo ryšio 2-alil-5-nitrofurfurol-rodanine.

22 pav. 2-alil-rodanino su nitrofurfurilo pakaitu 5-oje padėtyje antimikrobinio

tyrimo in vitro rezultatai

23 pav. 2-propil-rodanino su nitrofurfurilo pakaitu 5-oje padėtyje antimikrobinio

tyrimo in vitro rezultatai

Kita hipotezė buvo, kad junginių su nitrofurfurilo pakaitu aktyvumas didesnis nei junginio VIP-44, kurio furfurolo žiedo 5-oje padėtyje nėra nitro grupės. Kaip jau nurodyta anksčiau, junginys VIP-41 esant 500 µg/ml koncentracijai veikia net 7 bakterijų padermes, o VIP-44 (19 pav.) esant šiai koncentracijai neveikia nei vienos. Tai patvirtina šią hipotezę.

24 pav. 2-alil-rodanino su furfurilo pakaitu 5-oje padėtyje antimikrobinio

S

N

S

O

O

_CH

2

Taip pat įsprendžiant iš tyrimo rezultatų, kad 2-alil-rodanino junginiai su para-brom ar para-chlor benzaldehidų pakaitais 5-oje padėtyje yra mažiau aktyvūs nei su nitrofurfurilo pakaitu, galima teigti, kad alilo pakaitas pats nesuteikia rodaninui aktyvumo, o suteikia pakaitas 5-oje padėtyje - nitrofurfurilas.

3.5.

Apibendrinimas

Buvo tirti gautų junginių antimikrobiniai aktyvumai in silico ir in vitro. Gauti rezultatai in silico nėra visai tikslūs, palyginus su in vitro. Patys aktyviausi junginiai nustatyti VIP-41 ir VIP-47. Tai taip pat įrodo rodanino darinio su dvigubuoju ryšiu 2-oje rodanino molekulės padėtyje esančiame pakaite didesnis antimikrobinis aktyvumas nei identiško su propilo pakaitu.

Buvo pastebėtas ir rodaninio darinio su nitrofurfurolo pakaitu 5-oje padetyje didesnis antimikrobinis aktyvumas nei rodanino darinio su furfurolu. Tai įrodo nitro grupės svarbą.

4. IŠVADOS

1. Tyrimui susintetinti 8 nauji 4-tiazolinono dariniai: 7 su alilo pakaitu 2-oje padėtyje ir skirtingais aldehidais 5-oje padėtyje; taip pat vienas lyginamasis junginys su propilo pakaitu 2-oje padėtyje ir nitrofurfurilo 5-oje.

2. Atliktas tyrimas in silico programa SYBYL-X ir pirminis tyrimas in vitro užnuodytos lėkštelės standžioje terpėje metodu. Vieni aktyviausų in silico nustatyti junginiai VIP-41 ir VIP-47 taip pat buvo vieninteliai aktyvūs prieš S. aureus ir in vitro.

3. Geram 2,5-pakeistų-4-tiazolinono junginių antimikrobiniam veikimui būtinas dvigubas ryšys 2-oje molekulės padėtyje esančiame pakaite. Taip pat junginių aktyvumas didėja į penktoje rodanino molekulės padėtyje esančio furfurolo 5-tą padėtį įvedus nitro grupę. Pats alilo pakaitas junginiams reikšmingo aktyvumo nesuteikia, o svarbesnis aktyvumui aldehido pakaitas 5-oje padėtyje.

5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS

Susintezavus 4-tiazolinono darinius su alilo pakaitu, atlikus jų antimikrobinius tyrimus in silico ir apžvalginius tyrimus in vitro, pastebėtas jų antimikrobinis potencialas. Dėl šių rezultatų rekomenduojamas detalesnis nustatytų aktyvių junginių tyrimas in vitro.

6. LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. Kelmelytė E. 3-amino rodanino 3-, 5-, 3, 5-pakeistų darinių sintezė ir jų antibakterinio bei priešgrybelinio aktyvumo įvertinimas.Kaunas 2013 [magistro darbas].

2. Mačiulaitis R., Petrikaitė V., Aukštakalnienė A., Janušonis T. Antimikrobinių vaistų vartojimo įvertinimas ir palyginimas su jų racionalaus vartojimo rekomendacijomis. Medicina (Kaunas) 2006; 42(12); 999-1005.

3. Mačiulaitis R., Miciulevičiūtė J., Stirbienė I. Racionalus antimikrobinių vaistų vartojimas. Vilnius, 2004.

4. Pelakauskas V. Rodanino-3-acto ir 3-propano rūgščių darinių sintezė ir jų antibakterinio bei priešgrybelinio aktyvumo įvertinimas. Kaunas 2013 [magistro darbas].

5. Petrikaitė V. 2,5-pakeistų tiazolidinono darinių sintezė ir jų priešgrybelinio bei antibakterinio aktyvumo įvertinimas. Kaunas, 2007 [daktaro disertacija].

6. Remeikis L. Naujų 3, 5-pakeistų 3-amino-2-tiokso-4-tiazolidinono darinių su cikloheksanono ir ciklopentanono pakaitais sintezė ir antibakterinio ir priešgrybelinio aktyvumo tyrimas. Kaunas 2013 [magistro darbas].

7. Radžiūnas R. Синтез и изучение биологической активности производных тиазолинона-4 на основе аминогуанидинов. Харьков, 1988 [daktaro disertacijos santrauka].

8. Tarasevičius E. Синтез, свойства и биологическая активность 2-амино(гидразино-аминогуанидино)-4-оксотиазолинов с ароматическими и гетероциклическими заместителями. Москва, 1990 [habilituoto daktaro disertacijos santrauka].

9. Ankri S, Mirelman D. Antimicrobial properties of allicin from garlic. Microbes Infect 1999;2:125–9.

10. Ashraf R., Aamir K., Shaikh A. R., Ahmed T. Effects of garlic on dyslipidemia in patients with type 2 diabetes mellitus. J Ayub Med Coll Abbottabad 2005;17:60-4.

11. Ashraf R., Khan R. A., Ashraf I. Garlic (Allium sativum) supplementation with standard antidiabetic agent provides better diabetic control in type 2 diabetes patients. Pakistan journal of pharmaceutical sciences, 2011;24:565-70.

12. Balunas M. J., Kinghorn A. D. Drug discovery from medicinal plants.Life sciences, 2005;78:431-44.