DIRVINIŲ ASIŪKLIŲ (Equisetum arvense L.) AUGALŲ ANTIOKSIDACINIO IR ANTIMIKROBINIO AKTYVUMO TYRIMAS

(1)

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS

VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA

MIGLĖ ŠČERBINSKAITĖ

DIRVINIŲ ASIŪKLIŲ (Equisetum arvense L.) AUGALŲ

ANTIOKSIDACINIO IR ANTIMIKROBINIO AKTYVUMO

TYRIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas Doc. dr. Raimondas Benetis

Konsultantas Prof. dr. Alvydas Pavilonis

(2)

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS

VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanė

prof. dr. Ramunė Morkūnienė, parašas,

Data

DIRVINIŲ ASIŪKLIŲ (Equisetum arvense L.) AUGALŲ

ANTIOKSIDACINIO IR ANTIMIKROBINIO AKTYVUMO

TYRIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Konsultantas Darbo vadovas

Prof. dr. Alvydas Pavilonis, parašas Doc. dr. Raimondas Benetis, parašas Data Data

Recenzentas Darbą atliko Magistrantė

Miglė Ščerbinskaitė, parašas Data

(3)

TURINYS

SANTRAUKA ... 5

SUMMARY ... 7

SANTRUMPOS ... 9

ĮVADAS ... 10

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 11

1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 12

1.1. Dirvinių asiūklių (Equisetum arvense L.) bendra charakteristika ... 12

1.1.1. E. arvense morfologiniai požymiai ir paplitimas ... 12

1.1.2. E. arvense žolės fitocheminė sudėtis ... 13

1.2. E. arvense VAŽ biologinis poveikis ir panaudojimas ... 14

1.2.1. Antioksidacinis poveikis ... 14

1.2.2. Antimikrobinis poveikis ... 15

1.2.3. Kiti biologiniai poveikiai ... 17

1.3. Fenolinių junginių ekstrakcija, jų kiekio ir antioksidacinio aktyvumo įvertinimo metodai ... 19

1.4. Antimikrobinio aktyvumo tyrimui naudotos mikroorganizmų kultūros ... 21

2. TYRIMO METODIKA IR METODAI ... 23

2.1. Tyrimų objektas ... 23

2.2. Medžiagos ir reagentai ... 23

2.3. Naudota aparatūra ... 24

2.4. Tyrimų metodai ... 24

2.4.1. E. arvense žaliavų ekstraktų paruošimas ... 24

2.4.2. Naudotos medžiagos, reagentai ir mikroorganizmai ... 25

2.5. E. arvense žaliavų etanolinių ekstraktų spektrofotometrinė analizė ... 26

2.5.1. Bendrojo fenolinių junginių kiekio nustatymas ... 26

2.5.2. Bendrojo fenolio rūgščių kiekio nustatymas ... 27

(4)

2.5.4. Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas spektrofotometriniu Fe2+_{jonų sujungimo metodu . 28} 2.5.5. Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas spektrofotometriniu DPPH radikalų surišimo metodu

... 29

2.5.6. Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas ABTS ̇+ radikalų surišimo metodu ... 29

2.6. E. arvense žaliavų antimikrobinio aktyvumo tyrimas ... 30

2.7. Duomenų analizė ... 33

3.1. Ekstrakcijos są lygų parinkimas ... 34

3.1.1. Ekstrahento poliškumo įvertinimas ... 34

3.1.2. Ekstrakcijos ultragarsu trukmės nustatymas ... 35

3.1.3. Ekstrakcijos ultragarsu temperatūros nustatymas ... 36

3.2. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas E. arvense žaliavose ... 37

3.3. Bendro fenolio rūgščių kiekio nustatymas E. arvense žaliavose ... 39

3.4. Bendro flavonoidų kiekio nustatymas E. arvense žaliavose ... 40

3.5. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas Fe2+ jonų surišimo (FIC) metodu E. arvense žaliavų ekstraktuose ... 41

3.6. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas DPPH radikalų surišimo metodu E. arvense žaliavų ekstraktuose ... 42

3.7. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas ABTS surišimo metodu E. arvense žaliavų ekstraktuose ... 43

3.8. Koreliacinių ryšių įvertinimas tarp bendro flavonoidų ir fenolinių junginių kiekio bei antioksidacinio aktyvumo ... 44

3.9. E. arvense žolės ekstraktų antimikrobio aktyvumo įvertinimas ... 45

4. IŠVADOS ... 50

5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 51

6. LITERATŪROS SĄRAŠAS... 52

(5)

SANTRAUKA

Miglės Ščerbinskaitės magistro baigiamasis darbas „Dirvinių asiūklių (Equisetum arvense L.) augalų antioksidacinio ir antimikrobinio aktyvumo tyrimas“. Mokslinis vadovas – doc. dr. R. Benetis, konsultantas – prof. dr. A. Pavilonis. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmacijos fakulteto Vaistų chemijos katedra. Kaunas, 2019.

Darbo tikslas: Ištirti iš skirtingų cenopopuliacijų esančių Lietuvoje, Latvijoje, Airijoje ir Norvegijoje surinktų dirvinių asiūklių (Equisetum arvense L.) vaistinių augalinių žaliavų bendrąjį fenolinių junginių, fenolio rūgščių ir flavonoidų kiekį bei nustatyti jų ekstraktų antioksidacinį ir antimikrobinį aktyvumą.

Darbo uždaviniai: 1. Parinkti fenolinių junginių ekstrakcijos sąlygas iš dirvinių asiūklių (Equisetum arvense L.) vaistinių augalinių žaliavų. 2. Spektrofotometriniu metodu nustatyti bendrą fenolinių junginių, fenolio rūgščių ir flavonoidų kiekį dirvinių asiūklių žaliavose ir įvertinti jų įvairavimą skirtingose cenopopulicijose. 3. Taikant DPPH, ABTS, FIC ir FRAP metodus įvertinti E. arvense augalinių žaliavų ekstraktų antiradikalinį aktyvumą ir jo kitimo dėsningumus. 4. Nustatyti E. arvense augalinių žaliavų ekstraktų antimikrobinį aktyvumą. 5. Įvertinti dirvinių asiūklių augalinių žaliavų koreliacinius ryšius tarp bendro fenolinių junginių, flavonoidų bei fenolio rūgščių kiekio ir jų ekstraktų antioksidacinio aktyvumo.

Tyrimo objektas: Tyrimui atlikti buvo naudojamos dirvinių asiūklių (Equisetum arvense L.) vaistinės augalinės žaliavos, surinktos iš 15 skirtingų natūralių cenopopuliacijų, esančių Lietuvos, Latvijos, Airijos ir Norvegijos teritorijose.

Tyrimo metodika: Bandinių ekstrakcija vykdyta ultragarsu, ekstrahentu naudojant 80% (V/V) etanolį, ekstrakcijos laikas – 15 min, temperatūra – 40 °C. Bendras fenolinių junginių kiekis buvo nustatomas Folin-Ciocalteu metodu. Bendras fenolio rū gščių kiekis buvo nustatytas naudojant Arnow reagentą. Bendro flavonoidų kiekio nustatymui buvo taikoma reakcija su AlCl3. Antioksidacinis etanolinių ekstraktų aktyvumas buvo vertinamas DPPH, ABTS, FIC spektrofotometriniais metodais. Antimikrobinis aktyvumas vertinamas nustatant mažiausią E. arvense ekstrakto koncentraciją (mg/ml), kuri dar slopina etaloninių organizmų augimą.

Rezultatai ir išvados: Įvertinus E. arvense žaliavų fenolinių junginių, fenolio rūgščių ir flavonoidų kiekybinę sudėtį didžiausi biologiškai aktyvių medžiagų kiekiai nustatyti žaliavose, surinktose Lietuvoje (Trakų, Zarasų ir Molėtų apylinkėse). Bendras fenolinių junginių kiekis žaliavose įvairavo nuo 3,533 ± 0,328 mg/g iki 22,497 ± 0,130 mg/g, fenolio rūgščių – 1,728 ± 0,09 mg/g iki 14,810 ± 0,274 mg/g, flavonoidų – 4,540 ± 0,271 mg/g iki 20,436 ± 0,162 mg/g. Antioksidacinio akyvumo tyrimų (DPPH, ABTS, FIC) dėsningumai buvo panašūs į gautus fitocheminių rodiklių rezultatus. Chelatinis aktyvumas įvairavo nuo 7,486 ± 1,499 % iki 45,655 ± 0,682 %. DPPH surišimas įvairavo nuo 4,561 ± 0,131 % iki 61,097 ± 1,308 %, ABTS – nuo 21,358 ± 11,899 µmol/g iki 84,340 ± 3,373 µmol/g. Antimikrobinio

(6)

aktyvumo tyrimų rezultatai parodė, kad efektyviausiai E. arvense ekstraktai slopino gramteigiamų bakterijų augimą – Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Bacillus cereus. Atliekant statistinę analizę nustatyti stiprūs ir statistiškai reikšmingi (p<0,05) koreliaciniai ryšiai.

(7)

SUMMARY

Miglė Ščerbinskaitė Master Thesis „Evaluation of antioxidant and antimicrobial activity of field horsetail (Equisetum arvense L.) plants“. Scientific supervisor – Assoc. Prof. Dr. R. Benetis, advisor – Prof. Dr. A. Pavilonis. Department of Drug chemistry, Faculty of Pharmacy, Lithuanian University of Health Sciences. Kaunas, 2019.

The aim: to examine the quantitative composition of the phenolic compounds, phenolic acids and flavonoids of field horsetail, growing in natural habitats of Lithuania, Latvia, Ireland and Norway, in addition to evaluate the antioxidant and antimicrobial activity of their extracts.

Objectives: 1. To select the optimal extraction conditions for the extraction of the phenolic compounds from E. arvense raw materials; 2. Using spectrophotometric method to evaluate quantitative composition of total phenolic compounds, phenolic acids and flavonoids of E. arvense raw materials. 3. To determine the ability of E. arvense herbals extracts to scavenge free radicals and their variations by applying modelling systems (DPPH, FIC and ABTS). 5. To determine antimicrobial activity of E. arvense herbal extracts 6. To evaluate correlation among phenolic compounds, phenolic acids, flavonoids and the antioxidant activity of E. arvense herbal extracts.

The object: The samples of the research was stems of field horsetail (E. arvense) collected in 15 different natural habitats of Lithuania, Latvia, Ireland and Norway.

The methods: Extraction method – ultrasound agitation, extrahent – 80% (V/V) ethanol, extraction time – 15 min, extraction temperature – 40°C. The Folin – Ciocalteu method was used to determine the total amount of phenolic compounds. Arnow reagent was used to determine the total quantity of phenolic acids. The total content of flavonoids was evaluated by applying reaction with aluminium chloride (AlCl3). The spectrophotometric methods DPPH, FIC, ABTS were used to evaluate antioxidant activity of E. arvense herbal extracts. Antimicrobial activity of E. arvense plant extracts was evaluated as minimum inhibitory concentration (MIC) by using an agar dilution technique.

Results and conclusions: Evaluating the quantitative composition of phenol compounds, phenolic acids and flavonoids the highest amounts were found in E. arvense collected from Trakai, Zarasai and Molėtai natural habitats. Total phenolic content varied from 3,533 ± 0,328 mg/g to 22,497 ± 0,130 mg/g, total phenolic acid content varied from 1,728 ± 0,09 mg/g to 14,810 ± 0,274 mg/g, total flavonoid content varied from 4,540 ± 0,271 mg/g to 20,436 ± 0,162 mg/g. The results of antioxidant activity study (DPPH, ABTS, FIC) were similar to those of phenolic compounds, phenolic acids and flavonoids. Chelating activity in the extracts varied from 7,486 ± 1,499 % to 45,655 ± 0,682 %. DPPH radical scavenging activity varied from 4,561 ± 0,131 % to 61,097 ± 1,308 %, ABTS radical scavenging acitivy varied from 21,358 ± 11,899 µmol/g to 84,340 ± 3,373 µmol/g. It was found that

(8)

extracts of E. arvense raw materials has the strongest antimicrobial activity against Gram-positive microorganisms – Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Bacillus cereus. Strong and statistically significant (p<0,05) correlation was determined by statistical analysis.

(9)

SANTRUMPOS

ABTS – 2,2`-azino-bis-3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgštis

ATCC – Amerikos lą stelių kultū rų kolekcija (angl. American type culture collection)

B. cereus – Bacillus cereus ATCC 11778 B. subtilis – Bacillus subtilis ATCC 6633 C. albicans – Candida albicans ATCC 10231

DNR – dezoksiribonukleino rūgštis

DPPH – 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo radikalas

E. coli – Escherichia coli ATCC 25922

E. faecalis – Enterococcus faecalis ATCC 29212

GRE – galo rūgšties ekvivalentai

K. pneumoniae – Klebsiella pneumoniae ATCC 13883

MSK – mažiausioji slopinančioji tirto augalinio ekstrakto koncentracija, mg/ml

P. vulgaris – Proteus vulgaris ATCC 8427

P. aeruginosa – Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

RE – rutino ekvivalentai

S. aureus – Staphylococcus aureaus ATCC 25923

S. epidermidis – Staphylococcus epidermidis ATCC 12228

TE – trolokso ekvivalentai V/V – tūrio procentai

(10)

ĮVADAS

Pasaulio sveikatos organizacijos (PSO) duomenimis 74% augalinės kilmės vaistinių preparatų yra vartojami šiuolaikinėje medicinoje, o jų šiuolaikinis pritaikymas yra tiesiogiai susijęs su tradiciniu vaistinių augalinių žaliavų vartojimu.[11]

Šio darbo tiriamasis objektas - dirvinių asiūklių (Equisetum arvense L.) žolė. Dirviniai asiūkliai priklauso asiūklinių augalų (Equisetaceae) šeimai. Vaistinis augalas plačiai paplitęs Europoje, Kanadoje, Šiaurės Amerikoje ir Azijoje [7, 37]. Nustatyta, kad šio augalo žaliavos kaupia fenolinius junginius, fenolio rūgštis, flavonoidus, alkaloidus, fitosterolius, taninus ir lakiuosius junginius [6, 7, 28]. E. arvense farmakologinis aktyvumas yra susijęs su antriniais metabolitais – fenoliniais junginiais, flavonoidais, fenolio rūgštymis [25]. Tradicinėje medicinoje dirvinių asiūklių žaliavos naudojamos gydyti reumatinėms ligoms, podagrai, tuberkuliozei, sunkiai gyjančioms žaizdoms ir opoms, lūžiams, inkstų sutrikimams ir šlapimo pūslės ligoms, plaukams bei nagams stiprinti [5]. Dirvinių asiūklių terapinis poveikis remiasi ilgalaikiu tradiciniu žaliavos panaudojimu bei šiuolaikiniais tyrimais, atliekant fitocheminės sudėties, ikiklinikinius ir klinikinius tyrimus [37]. Ikiklinikinių ir klinikinių tyrimų metu įrodytas E. arvense diuretinis poveikis ir gydomasis poveikis paviršinėms žaizdoms. Vaistinė augalinė žaliava ir jos ekstraktai pasižymi antioksidaciniu, antimikrobiniu, priešuždegiminiu, priešvėžiniu ir analgetiniu poveikiais [5, 13].

Lietuvoje vartojamos dirvinių asiūklių arbatos, maisto papildai ir tradiciniai augaliniai preparatai, kurių sudėtyje yra E. arvense žolės. Atlikus išsamią analizę Europos vaistų agentūra (EMA) konstatuoja, kad E. arvense preparatų naudos ir rizikos santykis šlapimo takų susirgimų ir paviršinių žaizdų indikacijoms yra palankus. [13].

Darbo aktualumas: Moksliniai tyrimai patvirtina įvairų galimą E. arvense vaistinių augalinių žaliavų ir jų ekstraktų biologinį aktyvumą: antioksidacinį, antimikrobinį, diuretinį, hepatoprotekcinį, priešuždegiminį ir priešvėžinį poveikius. Iki šiol Lietuvoje nebuvo atlikti kompleksiniai E. arvense vegetatyvinių stiebų tyrimai. Šių tyrimų metu pirmą kartą įvertinti vaistinių augalinių žaliavų fitochemininiai rodikliai ir jų ekstraktų antioksidacinis ir antimikrobinis aktyvumas bei šių parametrų įvairavimas skirtingose Lietuvos, Latvijos, Airijos ir Norvegijos gamtinėse cenopopuliacijose.

Darbo tikslas: Ištirti iš skirtingų cenopopuliacijų esančių Lietuvoje, Latvijoje, Airijoje ir Norvegijoje surinktų dirvinių asiūklių (Equisetum arvense L.) vaistinių augalinių žaliavų bendrąjį fenolinių junginių, fenolio rūgščių ir flavonoidų kiekį bei nustatyti jų ekstraktų antioksidacinį ir antimikrobinį aktyvumą .

(11)

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas: Ištirti iš skirtingų cenopopuliacijų esančių Lietuvoje, Latvijoje, Airijoje ir Norvegijoje surinktų dirvinių asiūklių (Equisetum arvense L.) vaistinių augalinių žaliavų bendrąjį fenolinių junginių, fenolio rūgščių ir flavonoidų kiekį bei nustatyti jų ekstraktų antioksidacinį ir antimikrobinį aktyvumą .

Darbo uždaviniai:

1. Parinkti fenolinių junginių ekstrakcijos sąlygas iš dirvinių asiūklių (Equisetum arvense L.) vaistinių augalinių žaliavų.

2. Spektrofotometriniu metodu nustatyti bendrą fenolinių junginių, fenolio rūgščių ir flavonoidų kiekį dirvinių asiūklių vaistinėse augalinėse žaliavose ir įvertinti jų įvairavimą skirtingose cenopopulicijose.

3. Taikant DPPH, ABTS ir FIC metodus įvertinti E. arvense ekstraktų antioksidacinį aktyvumą ir jo kitimo dėsningumus.

4. Nustatyti E. arvense vaistinių augalinių žaliavų ekstraktų antimikrobinį aktyvumą.

5. Įvertinti dirvinių asiūklių augalinių žaliavų koreliacinius ryšius tarp bendro fenolinių junginių, flavonoidų bei fenolio rūgščių kiekio ir jų ekstraktų antioksidacinio aktyvumo.

(12)

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. Dirvinių asiūklių (Equisetum arvense L.) bendra charakteristika

1.1.1. E. arvense morfologiniai požymiai ir paplitimas

Dirviniai asiūkliai (Equisetum arvense L.) yra daugiamečiai žoliniai augalai, kurie priklauso asiūklinių (Equisetaceae) šeimai (1 pav.) [5, 8]. Iš dirvinių asiūklių šakniastiebio išauga tuščiaviduriai stiebai, kurie yra dviejų tipų: vaisingi (sporifikuojantieji) ir nevaisingi (vegetatyviniai). Sporifikuojantieji stiebai išauga ankstyvą pavasarį ir yra rusvai ar rausvai blyškios spalvos. Sporifikuojantieji stiebai yra nešakoti, stori ir trumpesni už vegetatyvinius stiebus, dažniausiai užauga iki 10 – 30 cm aukščio. Vaisingo stiebo viršūnėje yra sporangės su sporomis. Augalai sporifikuoja balandžio – gegužės mėnesiais [5, 7]. Išbyrėjus sporoms, išauga žali, šakoti ūgliai – vegetatyviniai stiebai, kurie gali siekti iki 50 cm aukščio [1, 5]. Nevaisingi stiebai yra apie 1 – 4,5 mm skersmens, tuščiaviduriai, nariuoti, sudaryti iš bamblių ir tarpubamblių, kurie išsidėstę maždaug 1,5 – 4,5 cm intervalais. Augalo šakos išsidėsčiusios stačiai, dažniausiai yra keturbriaunės arba penkiabriaunės, kiekviena iš jų apie 1 mm storio. Dirvinių asiūklių lapai yra redukuoti – rusvi žvyneliai [2, 4].

1 pav. Sporafikuojantieji ir vegetatyviniai dirvinių asiūklių stiebai [5]

Dirviniai asiūkliai yra plačiai paplitę visoje Lietuvoje ir dažniausiai aptinkami pakelėse, grioviuose, atviruose laukuose ir miško vietovėse, pelkėse bei prie upių krantų [37]. Augalas paplitęs beveik visuose žemynuose, auga drėgnose, vidutinio klimato srityse [2, 8]. Daugiausia aptinkamas Jungtinėse Amerikos Valstijose (išskyrūs pietryčių dalį) ir Kanadoje, taip pat visoje Europoje, Azijoje

(13)

– Korėjoje, Japonijoje, Kinijoje (išskyrūs pietryčių dalį), Irane, Indijoje, Nepale, Rusijos Federacijoje ir pietinėje Turkijos dalyje [5, 6, 37].

1.1.2. E. arvense žolės fitocheminė sudėtis

Europos farmakopėjoje (Ph. Eur.) aprašoma, kad vaistinė augalinė žaliava (VAŽ) yra dirvinių asiūklių žolė (Equiseti herba). VAŽ kokybė išreiškiama pagal flavonoidų kiekį, kuris turi būti ne mažesnis, nei 0,3 % [4].

Nustatyta, kad egzistuoja du E. arvense chemotipai, kuriuos lemia flavonoidų sudėties skirtumai. Vienas iš chemotipų auga Azijoje ir Šiaurės Amerikoje, kitas – Europoje. Azijoje ir Šiaurės Amerikoje augančių dirvinių asiūklių sudėtyje randama luteolino 5-O-gliukozido ir jo malonilo esterio junginių, tačiau Europoje augančiuose E. arvense augaluose šie junginiai neaptinkami. Europoje augančiuose E. arvense augaluose randami pagrindiniai junginiai yra kvercetino 3-O-gliukozidas, apigenino 5-O-gliukozidas ir dikafeil-mezo-vyno rūgštis. Abiejų chemotipų VAŽ randama di-E-kafeoil-mezo-vyno rūgštis [7, 9].

Vegetatyviniuose E. arvense stiebuose flavonoidų yra aptinkama 0,3–0,9 %. Dažniausiai identifikuojami flavonoidai yra kemferolio-3-osoforozido-7-O-gliukozidas, kemferolio 3-O-(6”-O-malonil-gliukozidas)-7-O-gliukozidas, kemferolio 3-O-soforozidas, kvercetino 3-O-gliukozidas, apigeninas, apigenino gliukozidas, liuteolinas, liuteolino gliukozidas, genkvanino 5-O-gliukozidas. Pagrindinės aptinkamos fenolio rūgštys – di-E-kafeoil-mezo-vyno rūgštis, mono-O-kafeoil-mezo-tartrato metilo esteriai [5, 37].

Taip pat vegetatyviniuose stiebuose nustatomos medžiagos: fenoliniai petrosinai (onitinas ir onitino-9-O-gliukozidas), triterpenoidai (tarakserolis, germanikolis, izoborneolis, ursolo rūgštis, oleanolio rūgštis, betulino rūgštis), saponinai (ekvisetoninas), alkaloidai (nikotinas, palustrinas, palustrininas), fitosteroliai (cholesterolis, epicholestanolis, 24-metilencholesterolis, β-sitosterolis (60 %), kampesterolis (32,9 %), izofukosterolis (5,9 %), mineralai (silicio rūgštis ir silikatai (5-8 %), kalis (1,8 %), kalcis (1,3 %), aliuminis, siera, manganas, magnis) bei kitos medžiagos (baltymai, fermentai – daugiausia tiaminazės) [6, 37]. Fenoliniai gliukozidai ekvisetumozidas A, ekvisetumozidas B, ekvisetumozidas C randami tik vaisinguose stiebuose [37].

Stirilpironai – pagrindiniai metabolitai, kurie kaupiasi dirvinių asiūklių sporofitų ir gametofitų šakniastiebiuose. Žaliuose dirvinių asiūklių ūgliuose stirilpironų kaupimasis nustatomas, kaip atsakas į mechaninį ar mikrobinį pažeidimą [5]. Pagrindiniai stirilpirono gliukozidai randami dirvinių asiūklių šakniastiebiuose yra: 3’-deoksiekvisetumpironas ir 4’-O-metilekvisetumpironas. Vegetatyviniuose stiebuose randamas ekvisetumpironas [7, 37].

(14)

Nustatyta, kad E. arvense vegetatyviniuose stiebuose randamos lakiosios medžiagos. Tiriant dujų chromatografijos–masių spektrometrijos metodu identifikuoti 25 junginiai, pagrindiniai iš jų: heksahidrofarnesil acetonas (18,34 %), cis-geranilo acetonas (13,74 %), timolis (12,09 %) ir transfitolis (10,06 %) [6].

Navdeep Singh Sandhu et al. (2010) atlikto fitocheminio tyrimo metu tirti dirvinių asiūklių chloroformo, etanoliniai ir vandeniniai ekstraktai. Nustatyta, kad daugiausia biologiškai aktyvių medžiagų randama etanoliniame ekstrakte – flavonoidai, triterpenoidai, fitosteroliai, saponinai, alkaloidai, angliavandeniai, baltymai ir amino rūgštys. Vandeniniuose ekstraktuose buvo identifikuoti alkaloidai, angliavandeniai, baltymai ir amino rūgštys, o chloroformo ekstraktuose tik angliavandeniai [12].

Remiantis moksline literatūra galima teigti, kad pagrindiniai E. arvense aptinkami junginiai yra fenoliniai junginiai ir flavonoidai.

1.2. E. arvense VAŽ biologinis poveikis ir panaudojimas

1.2.1. Antioksidacinis poveikis

Oksidacinį stresą sukelia disbalansas tarp laisvųjų radikalų ir reaktyvių metabolitų susidarymo bei jų neutralizavimo antioksidantais. Oksidacinis stresas siejamas su lėtinėmis ligomis, širdies ir kraujagyslių ligomis, įskaitant aterosklerozę, neurodegeneracinėmis ligomis, tokiomis kaip Alzheimerio ir Parkinsono ligos, cukriniu diabetu, navikinėmis ligomis, taip pat gali lemti psichikos sutrikimus – šizofreniją bei dėmesio ir aktyvumo sutrikimą [52, 53]. Antioksidantai padeda apsaugoti organizmą nuo pažeidimų, kuriuos sukelia laisvieji radikalai [5]. Nefermentiniai antioksidantai yra skirstomi į egzogeninius ir endogeninius. Endogeniniams antioksidantams priklauso lipoinė rūgštis, glutationas, L-argininas, kofermentas Q10, melatoninas, šlapimo rūgštis, bilirubinas, metalus chelatuojantys baltymai ir transferinas. Egzogeniniai antioksidantai yra gaunami su maistu ir jiems priskiriama askorbo rūgštis (vitaminas C), tokoferolis (vitaminas E), omega-3 ir omega-6 riebalų rūgštys, augaluose sintetinami polifenolinės struktūros junginiai, įskaitant flavonoidus [52, 54]. Fenolio rūgštys ir flavonoidai yra dažnas mokslinių tyrimų objektas dėl jų gebėjimo neutralizuoti laisvuosius radikalus ir veikti kaip metalų chelatoriais [31]. E. arvense antioksidacinis aktyvumas įvertintas elektronų sukimosi rezonanso (ESR) spektroskopijos metodu. Rezultatai patvirtino, kad dirvinių asiūklių n-butanolio, metanolio, etilacetato ir vandeniniai ekstraktai slopina lipidų peroksilo radikalų (LOO·_{) susidarymą, kuris korialiuoja su nustatytu fenolinių junginių kiekiu [5, 25].} Mokslininkai nustatė E. arvense ekstraktų antioksidacinį aktyvumą vertinant jų gebėjimą surišti stabilų

(15)

2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo (DPPH) radikalą ir hidroksilo radikalus (OH·), naudojant elektronų sukimosi rezonanso spektroskopijos metodą. Didžiausias DPPH ir hidroksilo (OH·) radikalų surišimas buvo gautas tiriant E. arvense n-butanolio ir etanolinius ekstraktus. Mažiausias antiradikalinis aktyvumas buvo nustatytas tiriant vandeninius dirvinių asiūklių ekstraktus. Radikalų surišimas reikšmingai koreliavo su bendru fenolinių junginių kiekiu. Atlikto eksperimentinio tyrimo rezultatai parodė, kad laisvųjų radikalų surišimo aktyvumas priklauso nuo ekstraktų ir koncentracijos. Mokslininkams ištyrus E. arvense žolės ir šaknų antiradikalinį aktyvumą DPPH metodu, rezultatai nepasižymėjo įvairavimu (atitinkamai 96,2% ir 94,7%) [6].

Remiantis apžvelgta moksline literatūra galima teigti, kad dirvinių asiūklių ekstaktai pasižymi gebėjimu surišti radikalus ir turi antioksidacinį poveikį, kurį lemia fenoliniai junginiai ir flavonoidai.

1.2.2. Antimikrobinis poveikis

Dėl paplitusio mikroorganizmų atsparumo antimikrobiniams vaistams, svarbu atlikti tyrimus ir rasti alternatyvius metodus, kurie leistų kontroliuoti mikroorganizmų atsparumą vaistams ir padėtų išvengti galimų infekcijų. Įrodyta, kad E. arvense VAŽ antimikrobinis aktyvumas yra tiesiogiai susijęs su fenolinių junginių kiekiu ir ypatingai saponinais, kurie gali slopinti struktūrinius fermentus ląstelės sienelėje [27, 28, 33].

E. arvense propilenglikolio ekstrakto (200 mg/ml) antimikrobinis aktyvumas buvo nustatytas prieš odontologijoje pasitaikančius mikroorganizmus – Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus mutans, Candida albicans, Candida tropicalis ir Candida glabrata. Mikroorganizmų S. aureus, S. epidermidis, C. albicans, C. tropicalis ir C. glabrata minimali slopinamoji koncentracija (MSK) buvo 50 mg/ml. Esant 25 mg/ml koncentracijai ekstraktas slopino S. mutans augimą [27].

Ceyhan et. al (2012) atliko tyrimą siekiant nustatyti antimikrobinį aktyvumą prieš Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus cereus, Klebsiella pneumoniae, Candida albicans. Tyrimui naudoti E. arvense vandeniniai, etanoliniai, etilacetato ir heksano skirtingų koncentracijų (400, 200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,12, 1,56, 0,78 mg/ml) ekstraktai. Etilacetato ekstraktas neparodė antimikrobinio aktyvumo pieš tirtus mikroorganizmus. Vandeninis augalinės žaliavos ekstraktas turėjo silpną mikroorganizmų augimą slopinantį poveikį. Dirvinių asiūklių heksano ekstraktas slopino E. coli (MSK = 12,5 mg/ml), K. pneumoniae (MSK = 12,5 mg/ml) ir C. albicans (MSK = 100 mg/ml) mikroorganizmų augimą. Etanolinis ekstraktas slopino visus tiriamus mikroorganizmus, geriausiai iš jų – S.aureus ir B. cereus (MSK = 0,78 mg/ml) [30].

(16)

Kito eksperimentinio tyrimo metu buvo nustatomas petrolio eterio, chloroformo, etilacetato, n-butanolio ir vandens ekstraktų antimikrobinio aktyvumas prieš Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Staphylococcus aureus and Bacillus cereus, Saccharomyces cerevisiae, Candida pseudotropicalis. Gauti rezultatai parodė, kad etilacetatas ir n-butanolio ekstraktai slopino visų tiriamųjų bakterijų, išskyrus E. coli, augimą. Abu ekstraktai pasižymėjo panašiu antimikrobiniu poveikiu prieš gramteigiamas ir gramneigiamas bakterijas. Priešingai, nei anksčiau apžvelgtame Ceyhan et. al (2012) tyrime, etilacetato ekstraktai parodė antimikrobinį poveikį ir reikšmingai slopino S. aureus augimą (MSK = 25 mg/ml). Nustatytas silpnas antimikrobinis vandeninio ekstrakto aktyvumas prieš tiriamas bakterijas (MSK ≥ 100 mg/ml). Tyrimo metu nustatyta, kad petrolio eterio ir chloroformo ekstraktai neturėjo antimikrobinio aktyvumo prieš tiriamus mikroorganizmus. Nei vienas ekstraktas neturėjo E. coli augimą slopinančio poveikio (MSK > 100 mg/ml). Taip pat, nei vienas ekstraktas neparodė antimikrobinio aktyvumo prieš Saccharomyces cerevisiae ir Candida pseudotropicalis [31].

Mokslinių tyrimų metu dirvinių asiūklių eteriniame aliejuje identifikuoti 25 junginiai, kurie gali turėti antimikrobinį aktyvumą. Eterinio aliejaus antimikrobinis aktyvumas gali būti siejamas su sudėtyje identifikuotu monoterpeno fenoliu – timoliu. Be to, timolio ir 1,8-cineolio derinys turi reikšmingą priešgrybelinį poveikį [29, 36]. Tyrimo metu nustatyta, kad E. arvense eterinis aliejus pasižymi plačiu antimikrobiniu aktyvumo spektru prieš tirtas padermes - Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enteritidis, Escherichia coli, Aspergillus niger ir Candida albicans. Diskų difuzijos metodu vertinamos mikroorganizmų augimo

inhibavimo zonos, kurios buvo nuo 23 mm iki 37 mm esant 50 μL eterinio aliejaus/diske. Didžiausios augimo inhibavimo zonos reikšmės buvo nustatytos prieš gramneigiamas S. enteritidis (35 mm) ir K. pneumoniae (37 mm). Taip pat, reikšminga augimo inhibavimo zona buvo nustatyta prieš gramteigiamą bakteriją S. aureus (28 mm) [36].

Tyrimais įrodyta, kad E. arvense ekstraktų įtaka bakterijų kultūroms ir grybeliams priklauso nuo koncentracijos ir poveikio laiko. Didesnės ekstraktų koncentracijos lėtina mikroorganizmų kultūrų augimą ir mažina jų bendrą skaičių [28].

Eskperimentiniais tyrimais įrodyta dirvinių asiūklių ekstraktų antimikrobinio veikimo priklausomybė nuo žaliavos rinkimo laikotarpio. Vasaros sezono metu surinktos augalinės žaliavos efektyviau slopina mikroorganizmų augimą, nei surinktos vėlyvo rudens, lietingu laikotarpiu [35].

Remiantis literatūra galima teigti, kad E. arvense ekstraktas veikia prieš gramneigiamus ir gramteigiamus mikroorganizmus. Šį biologinį poveikį lemia ekstraktų sudėtyje esantys fenoliniai junginiai.

(17)

1.2.3. Kiti biologiniai poveikiai

Diuretinis poveikis. Dirvinių asiūklių augalų kaupiami flavonoidai ir fenoliniai junginiai gali lemti augalo diuretinį poveikį. Carneiro D. et al (2014) atliko dvigubai aklą, atsitiktinių imčių klinikinį tyrimą ir nustatė, kad E. arvense (900 mg/dieną) turi stipresnį poveikį lyginant su neigiama kontrole ir yra lygiavertis diuretiko hidrochlorotiazido poveikiui ir nesukelia reikšmingų elektrolitų eliminacijos pokyčių [6, 13, 14].

Hepatoprotekcinis poveikis. Moksliniais tyrimais įrodyta, kad E. arvense metanoliniame ekstrakte esantys fenoliniai pertrosinai – onitinas, onitino-9-O gliukozidas, ir flavonoidai - apigeninas, liuteolinas, kempferolio-3-O-gliukozidas ir kvercetino-3-O-gliukozidas pasižymi hepatoprotekciniu poveikiu [15, 16]. Nustatyta, kad onitinas ir liuteolinas turi stipriausią kepenis apsaugantį poveikį gydant takrino sukeltą citotoksiškumą žmogaus kepenų Hep G2 ląstelėse [6, 15].

Poveikis kaulams ir kaulų ligoms. Įrodyta, kad E. arvense veikia kaulų apykaitą ir gali turėti teigiamą poveikį gydant kaulų ligas, kurioms būdinga osteoklastinių ląstelių hiperaktyvacija – osteoporozė, osteoartritas. Costa-Rodrigues et al. (2012) atliktame tyrime nustatyta, kad metanolinis E. arvense ekstraktas slopina žmogaus osteoklastų vystymąsi ir funkciją osteoklastų pirmatakų ląstelių kultūrose bei osteoklastinių ir osteoblastinių ląstelių kultūrose [19, 20]. Kaulų metabolizmą veikia E. arvense žaliavoje esantys flavonoidai. Kvercetinas ir kempferolis in vitro pasižymi anaboliniu poveikiu osteoblastų proliferacijai ir diferenciacijai. Šie flavonoidai stimuliuoja osteoblastų diferenciaciją per ekstraląstelinio signalo reguliuojamos kinazės (ERK) ir estrogenų receptorių (ER) tarpinius kelius. Triterpenoidai (ursolo rūgštis, oleanolio rūgštis ir betulino rūgštis) stimuliuoja osteoblastus, kurie yra svarbūs kaulų formavimuisi [7, 19]. E. arvense vaistinėje augalinėje žaliavoje esanti didelė koncentracija silicio junginių yra svarbi kaulų vystymuisi ir ligų gydymui [19]. Silicio dioksidas padeda absorbuoti kalcį, taip pat įrodyta teigiama koreliacija tarp silicio dioksido ir kaulų mineralinio tankio. Tyrimai atlikti su viščiukais ir žiurkėmis, kuriems buvo sudaryta dieta su silicio trūkumu parodė skeleto deformacijas, tai patvirtina silicio svarbą tinkamam kaulų vystymuisi [7]. Priešuždegiminis veikimas ir poveikis žaizdoms. Nors vaistinių preparatų veiksmingumu nėra abejojama, maždaug 60 – 90 % pacientų, kuriems pasireiškia uždegiminiai imuniniai sutrikimai, naudoja alternatyvius ar papildomus gydymo būdus [17]. Dėl uždegimą slopinančių savybių dirvinių asiūklių žaliava skiriama esant artritui, cistitui, podagrai ir apatinių šlapimo takų uždegimui. Dirvinių asiūklių nuoviru plaunamos žaizdos, opos, problematiškos odos vietos, skalaujant gydomos burnos žaizdos ir dantenų uždegimai [37]. Remiantis eksperimentiniais duomenimis įrodyta, kad E. arvense ekstraktas slopina imunokompetentinių ląstelių proliferaciją ir taip užtikrina priešuždegiminį veikimą [17]. Pallag et al. (2018) atlikto tyrimo metu nustatyta, kad didelės E. arvense ekstrakto koncentracijos sukelia apoptozę ir mažina interleukino-6 sekreciją [18]. E. arvense fitocheminėje sudėtyje esantys

(18)

silicio junginiai turi gydomąjį poveikį odos žaizdoms. Silicio dioksidas ir silicio rūgštis stiprina jungiamuosius audinius. Silicis skatina kolageno gamybą, kuris suteikia odai elastingumo. Saponinai stimuliuoja metabolizmą ir turi priešuždegiminių savybių [22]. Buvo atliktas randomizuotas dvigubai aklas klinikinis tyrimas, kurio metu tirtas dirvinių asiūklių 3 % tepalo efektyvumas. Pacientams preparatas buvo skiriamas po epiziotomijos. Gauti rezultatai parodė, kad E. arvense tepalas skatina žaizdų gijimą, mažina skausmą ir uždegimą [21]. Hayat et al. (2011) atliko tyrimus su triušiais, siekiant išsiaiškinti dirvinių asiūklių 5 % tepalo efektyvumą, kurio poveikis buvo lyginamas su povidono jodo 10 % ir natrio chlorido 0,9 % tirpalais. Buvo padarytos išvados, kad E. arvense 5 % tepalas yra efektyvesnis lyginant su minėtais tirpalais [22].

Antidiabetinis poveikis. Tyrimais įrodytas dirvinių asiūklių žolės metanolinio ekstrakto antidiabetinis poveikis. Ekstraktas skiriamas pelėms, sergančioms streptozotocino sukeltu diabetu, parodė glikemiją mažinantį poveikį. Atlikti histologinių tyrimų rezultatai parodė pelių kasos beta ląstelių regeneraciją po streptozotocino sukeltų pažeidimų [6, 10].

Poveikis centrinei nervų sistemai. E. arvense yra vienas iš augalų, kurio etanolinis ekstraktas pasižymi sedaciniu, nerimą slopinančiu ir prieštraukuliniu poveikiais [5, 24]. Moksliniais tyrimais įrodyta, kad E. arvense etanolinis ekstraktas turi anksiolitinį poveikį terapiškai priimtinomis dozėmis ir mažesnį sedatyvinį poveikį lyginant su diazepamu. Šis poveikis galimas, dėl E. arvense ekstrakto sąveikos su nervų sistemos substratais arba cheminiais mediatoriais – noradrenalinu, serotoninu. Manoma, kad E. arvense anksiolitinis poveikis yra susijęs su ekstrakte esančiais flavonoidais, ypatingai apigeninu. Apigeninas veikia kaip centrinis benzodiazepino receptorių ligandas [23]. Tyrimų su pelėmis metu nustatyta, kad E. arvense etanolinis ekstraktas (100 mg/kg) reikšmingai ilgina ketamino sukeltą bendrą miego laiką (32%), o didesnės dozės (200 – 400 mg/kg) turi sedatyvinį ir antikonvulsinį poveikius [10, 23].

Citotoksinis poveikis. Vėžinių ląstelių augimo slopinimas priklauso nuo ląstelių linijos, ekstrakto ir koncentracijos. E. arvense ekstraktų antiproliferacinis aktyvumas buvo vertinamas trijose histologiškai skirtingose žmogaus vėžio ląstelių linijose – HeLa (gimdos kaklelio adenokarcinoma), HT–29 (storosios žarnos adenokarcinoma) ir MCF7 (krūties adenokarcinoma). Nustatyta, kad E. arvense etilacetato ekstraktas pasižymi antiproliferaciniu poveikiu ir nesukelia augimo stimuliacijos žmogaus vėžinių ląstelių linijose. Mažomis koncentracijomis natūralūs izoflavono fitoestrogenai, esantys dirvinių asiūklių ekstraktuose, skatina nuo estrogenų priklausomų ląstelių augimą, tačiau turi priešingą poveikį naudojant dideles ekstraktų koncentracijas [25]. Mokslininkai Al Mohammed et al. (2017) atliko tyrimą siekiant išsiaiškinti E. arvense etanolinio ekstrakto poveikį A549 plaučių karcinomos ląstelėms. A549 ląstelės 24 val. buvo veikiamos skirtingomis E. arvense ekstrakto koncentracijomis (100 μg/ml ir 150 μg/ml). Rezultatai parodė, kad dirvinių asiūklių augalų etanolinis ekstraktas slopina A549 plaučių karcinomos ląstelių gyvybingumą, turi apoptozinį ir citotoksinį aktyvumą [26]. E.

(19)

arvense vandeninis ekstraktas priklausomai nuo dozės turi citotoksinį poveikį žmogaus leukemijos U937 ląstelėms. Ląstelėse, kurios buvo kultivuojamos 48 val. dirvinių asiūklių žolės ekstrakte, buvo pastebėta DNR fragmentacija ir mitochondrijų membranų irimas. Teigiama, kad pokyčius sukėlė apoptozė. Nustatyta, kad E. arvense žaliavoje esantys neapdoroti baltymai slopina vėžinių ląstelių proliferaciją [5].

Vartojant E. arvense preparatus ilgą laika galimas toksinis poveikis organizmui. Augalo fitocheminėje sudėtyje esantys silikatai gali sukelti virškinimo sutrikimus, kai jie naudojami ilgą laiką. Vartojant E. arvense preparatus alkaloidai organizme didelėmis koncentracijomis nesikaupia, tačiau ilgalaikis vartojimas gali sukelti priešlaikinį gimdymą, nervų sutrikimus, galvos skausmą, apetito praradimą, rijimo problemas [5]. Dėl E. arvense žaliavoje esančio nikotino patariama vengti vartoti augalinę žaliavą nėščioms ir žindančioms moterims, taip pat nerekomenduojama derinti su kitomis medžiagomis, kurių sudėtyje yra nikotino. Ilgalaikis VAŽ naudojimas sukelia vitamino B1 trūkumą, dėl augalo kaupiamo fermento tiaminazės aktyvumo. Nustatyta, kad dirvinių asiūklių vartojimas kartu su kitais diuretikais sukelia hipokalemiją. Augalinės žaliavos vartojimas su vaistiniais preparatais, kurių sudėtyje yra ličio, sukelia jo kaupimąsi organizme. Retais atvejais, pacientams, kurie yra jautrūs dirvinių asiūklių žaliavoje esančioms medžiagoms, gali pasireikšti alergija [7, 10].

1.3. Fenolinių junginių ekstrakcija, jų kiekio ir antioksidacinio aktyvumo

įvertinimo metodai

Fenoliniai junginiai yra augalų antriniai metabolitai, kurie savo struktūroje turi benzeno žiedą su vienu ar daugiau hidroksilo (-OH) pakaitų [62]. Fenoliniai junginiai padeda sumažinti daugelio lėtinių ligų riziką. Tyrimais įrodyta, kad šie junginiai turi platų biologinį poveikį ir pasižymi antioksidacinėmis, antimikrobinėmis, piešvėžinėmis ir priešuždegiminėmis savybėmis. Teigiama, kad fenolinių junginių vartojimas mažina širdies ir kraujagyslių ligų, diabeto ir kitų, su oksidaciniu stresu susijusių ligų riziką [57].

Fenolinių junginių ekstrakcijai iš augalinių žaliavų gali būti naudojami pažangūs ir efektyvūs metodai – ekstrakcija ultragarsu, mikrobangomis, superkritinė skysčių ekstrakcija, pagreitinta ekstrakcija tirpikliais. Ekstrakcija ultragarsu grindžiama kavitaciniu reiškiniu. Ultragarso bangų sukurti kavitacinių burbuliukų sprogimai suardo augalo ląstelių sieneles ir taip padidiną fenolinių junginių ekstrakcijos išeigą. Ekstrakcijos efektyvumas priklauso nuo veikimo ultragarsu laiko, temperatūros, ultragarso bangų dažnio bei tirpiklio ir mėginio savybių. Ilgas ekstrakcijos laikas ir aukšta temperatūra lemia augalų fenolinių junginių suskaidymą arba pasireiškia kitos reakcijos, pavyzdžiui, fermentinis oksidavimas. Ekstrakcija ultragarsu gali būti atliekama žemesnėje temperatūroje, kuri yra palanki termiškai nestabiliems junginiams [55, 56, 57].

(20)

Fenolinių junginių analizei dažnai naudojami UV spektrofotometrijos metodai. Spektrofotometrija yra paprastas ir greitas fenolinių junginių kiekybiniam nustatymui iš augalinės žaliavos. Folin – Ciocalteu metodas yra plačiai naudojamas siekiant nustatyti bendrą fenolinių junginių kiekį augalinėje žaliavoje. Metodas yra pagrįstas elektronų perdavimo reakcijomis. Ekstrakte esantys fenoliniai junginiai su reagentu sudaro mėlynos spalvos kompleksus, kurių absorbcija matuojama spektrofotometriniu metodu esant bangos ilgiui 760–765 nm. Rezultatai išreiškiami galo rūgšties ekvivalentais [56, 57].

Bendro fenolio rūgščių kiekio vertinimui atliekama spektrofotometrinė analizė panaudojant Arnow reagentą, kuris gaminamas natrio molibdatą ir natrio nitritą tirpinant išgrynintame vandenyje. Vykstant reakcijai tarp fenolio rūgščių ir reagento gaunamas spalvotas tirpalas. Tiriamojo tirpalo absorbcija matuojama esant 525 nm bangos ilgiui [58].

Bendras flavonoidų kiekis nustatomas naudojant aliuminio chloridą (AlCl3). Reakcija pagrįsta flavonoidų ir aliuminio jonų komplekso sudarymu. Absorbcija matuojama spektrofotometru esant bangos ilgiui 410–423 nm. Bendras flavonoidų kiekis išreiškiamas rutino ekvivalentais [57, 59].

FIC - tai metodas, kuriuo vertinama ekstraktų geba chelatuoti metalų jonus. Reagentas ferozinas sudaro kompleksus su Fe2+_{. Pridėjus chelatuojančių medžiagų kompleksų susidarymas} sutrinka ir blunka tirpalo raudona spalva. Antioksidacinis aktyvumas vertinamas spektrofotometru esant bangos ilgiui 562 nm [60].

DPPH metodas dažnai naudojamas vertinant antioksidacinį augalinių ekstraktų aktyvumą. DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazilas) – tai stabilus laisvasis radikalas. DPPH radikalas geba prisijungti vandenilio atomą iš antioksidanto donorinės molekulės ir tirpalo spalva iš tamsiai violetinės pereina į šviesiai geltoną. Siekiant įvertinti ekstraktų antioksidacinį aktyvumą stebimas DPPH radikalų optinio tankio pokytis. Tirpalo absorbcija matuojama spektrofotometru esant 515-528 nm bangos ilgiui [49, 61].

ABTS (2,2`-azino-bis-(3-etilbenzotiazolin-6-sulfono rū gštis)) metodu atliekamas augalinių ekstraktų antiradikalinio aktyvumo vertinimas. ABTS katijoninis radikalas (ABTS•+) gaunamas pridedant į tirpalą kalio persulfato (K2S2O8). Stabilus laisvasis radikalas yra mėlynai žalios spalvos,

tačiau sąveikos su antioksidantu metu spalva pasikeičia į žalsvą arba spalva išnyksta. Absorbcija matuojama spektrofotometru esant bangos ilgiui 734 nm. Rezultatai išreiškiami trolokso ekvivalentais [46, 61].

(21)

1.4. Antimikrobinio aktyvumo tyrimui naudotos mikroorganizmų kultūros

Staphylococcaceae šeima. Šiai gramteigiamų mikroorganizmų šeimai priklauso Staphylococcus

aureus ir Staphylococcus epidermidis, kurios yra normali žmogaus flora. S. aureus yra žmogaus šnervių mikrobiota. S. aureus gali sukelti infekcinį artritą, septicemiją, endokarditą, osteomielitą, gali būti pacientų mirties priežastis, kuriems atliekama hemodializė, taip pat galimos lokalizuotos odos infekcijos – impetiga, folikulitas, pioderma ir žaizdų infekcijos [3, 33]. S. epidermidis yra žmogaus odos mikrobiota, sukelia infekcijas po operacijų ir yra jų komplikacijų priežastis [3, 38]. Taip pat šios bakterijos dažnai pasitaiko odontologijoje ir gali sukelti endodontines infekcijas, parotidinių liaukų infekcijas, mandibulinį osteomielitą, mukozitą bei pooperacines komplikacijas po dantų implantacijos [27].

Streptococcaceae šeima. Šiai šeimai priklauso gramteigiamos bakterijos Enterococcus faecalis, kurios

yra žmogaus žarnyno mikrobiota. E. faecalis sukelia šlapimo takų ir žaizdų infekcijas, infekcinį endokarditą, bakteriemiją ir retais atvejais meningitą [3, 39].

Enterobacteriaceae šeima. Šiai šeimai priklauso bakterijos Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae,

Proteus vulgaris ir kitos gramneigiamos bakterijos. E. coli bakterija priklauso Escherichia genčiai. Ši bakterija yra žmogaus žarnyno mikrobiota, kuri sukelia lėtines, pasikartojančias šlapimo takų infekcijas, viduriavimą, naujagimių meningitą, sepsį [3, 18]. Klebsiella pneumoniae bakterija priklauso Klebsiella genčiai. Bakterija yra normali žmogaus mikrobiota kvėpavimo takuose ir žarnyne, tačiau išmatos yra pagrindinis pacientų infekcijos šaltinis. K. pneumoniae sukelia pneumoniją, šlapimo takų infekcijas, bakteriemiją [3, 40]. Bakterija Proteus vulgaris priklauso Proteus genčiai, yra žmogaus žarnyno mikrobiota. Dažniausiai sukelia šlapimo takų infekcijas, žaizdų infekcijas, kvėpavimo takų infekcijas, bakteriemiją, meningitą, viduriavimą [41].

Pseudomonadaceae šeima. Šiai šeimai priklauso gramneigiama aerobinė bakterija Pseudomonas

aeruginosa. P. aeruginosa yra žmogaus žarnyno mikrobiota. Ši bakterija yra gerai prisitaikiusi ir atspari antibiotikams, tai leidžia bakterijai išgyventi natūraliuose ir ant dirbtinių paviršių, pavyzdžiui, medicinos įstaigose. P. aeruginosa dažniausiai sukeliamos infekcijos - minkštųjų audinių (rizikos faktoriai: nudegimai, atviros žaizdos, žaizdos po operacijų), šlapimo takų, bakteriemija, diabetinė pėda, pneumonija, išorinės ausies uždegimas, keratitas, lėtinė obstrukcinė plaučių ligų [3, 42].

Bacillaceae šeima. Priklauso gramteigiamos, sporas sudarančios bakterijos Bacillus cereus ir Bacillus

subtilis. Šie mikroorganizmai dažniausiai sukelia su maistu susijusias intoksikacijas, sistemines ir lokalizuotas infekcijas, kaip meningitas, endokarditas, bakteriemija, pneumonija ir endoftalmitas [3, 43].

Grybeliai. Candida albicans yra normali žmogaus mikrobiota. C. albicans gali sukelti paviršines odos infekcijas arba net gyvybei pavojingas sistemines infekcijas [44]. Candida albicans yra labiausiai

(22)

paplitęs grybelis ir yra pagrindinė burnos, virškinamojo trakto, ir makšties kandidozės priežastis. Nustatyta, kad makšties kandidozė pasireiškia apie 75 % moterų bent kartą vaisingame amžiuje. C. albicans taip pat sukelia gleivinės ligas, kaip stomatitą ir dažnai pasireiškia pacientams užsikrėtusiems ŽIV (žmogaus imunodeficito virusas). 50 % užsikrėtusių ŽIV pacientų ir 90 % AIDS sergančių pacientų serga burnos kandidoze. Teigiama, kad Candida albicans yra ketvirtas pagal dažnį hospitalinės kraujo infekcijos sukėlėjas [45].

(23)

2. TYRIMO METODIKA IR METODAI

2.1. Tyrimų objektas

Tyrimo objektas – iš natūralių augaviečių surinktos dirvinių asiūklių (Equisetum arvense L.) vaistinės augalinės žaliavos. Jos buvo surinktos iš 15 skirtingų Lietuvos, Latvijos, Airijos ir Norvegijos vietovių. Vaistinės augalinės žaliavos vegetatyviniai stiebai surinkti 2018 m. birželio-rugpjūčio mėnesiais. (1 lentelė)

1 lentelė. Dirvinių asiūklių žaliavų rinkimo vieta ir data

Eilės nr.

Žaliavos rinkimo vieta Šalis Rinkimo data

1. Anykščiai Lietuva 2018-06-16 2. Kirkilų k. Lietuva 2018-08-19 3. Kupiškis Lietuva 2018-08-19 4. Trakai Lietuva 2018-08-23 5. Zarasai Lietuva 2018-07-14 6. Marijampolė Lietuva 2018-08-19 7. Vilkabrukių k. Lietuva 2018-06-30 8. Šilalė Lietuva 2018-07-01 9. Molėtai Lietuva 2018-07-05 10. Palanga Lietuva 2018-08-30 11. Daugavpils Latvija 2018-07-14 12. Ashbourne Airija 2018-07-03 13. Kongsberg Norvegija 2018-07-17 14. Bardufoss Norvegija 2018-08-07 15. Glomfjord Norvegija 2018-08-09

Surinktos E. arvense žaliavos buvo džiovinamos kambario temperatūroje, paskleidus plonu sluoksniu ant popierinės medžiagos ir periodiškai vartant. Žaliava buvo apsaugota nuo tiesioginių saulės spindulių ir drėgmės. Išdžiovinta žaliava buvo sumalta elektriniu smulkintuvu ir laikoma popieriniuose maišeliuose.

2.2. Medžiagos ir reagentai

Tyrimai buvo atliekami naudojant analitinio švarumo tirpiklius ir reagentus: išgrynintas vanduo (Ph.Eur. 01/2009:0008), maistinis rektifikuotas etilo alkoholis 96% (UAB ,,Stumbras”, Kaunas, Lietuva), 2M Folin-Ciocalteu fenolinis reagentas (,,Sigma – Aldrich“, Šveicarija), ≥ 98% galo

(24)

rū gšties monohidratas (,,Sigma – Aldrich“, Kinija), 99,5-100,5% natrio karbonatas (,,Sigma – Aldrich“, Prancū zija), ≥ 99,5% metenaminas (,,Sigma – Aldrich“, Rusija), 100% acto rūgštis (,,Carl Roth“, Vokietija), ≥ 95% aliuminio chlorido heksahidratas (,,Carl Roth“, Vokietija), ≥ 94% rutino hidratas (,,Sigma – Aldrich“, Vokietija), ≥ 97% ferozinas (,,Sigma – Aldrich“, JAV), 99,5% bevandenis geležies (II) chloridas (,,Alfa Aesar“, Vokietija), analitinio švarumo natrio nitritas (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Vokietija), natrio molibdatas (≥ 99%) (Sigma-(Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Vokietija), vandenilio chlorido rū gštis (0,5 M) (Sigma - Aldrich Chemie GmbH, Vokietija), natrio šarmas (99%) (Sigma - Aldrich Chemie GmbH, Vokietija), 95% DPPH (2,2-deifenil-1-pikrilhidrazilas) (,,Alfa Aesar“, Vokietija), ABTS (2,2„-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono)) rū gštis (,,Sigma – Aldrich“, Kanada), kalio persulfatas (,,SIAL“, Kanada), troloksas (,,Sigma-Aldrich Chemie GmbH“, Danija), Miulerio – Hintono agaras (Mueller-Hinton II Agar, BBL, Cockeysville, JAV).

2.3. Naudota aparatūra

Atliekant tyrimus buvo naudota ultragarso vonelė „ElmaSonic S40H“ (U=230V) (Elma Schmidbauer, Vokietija), orbitalinė purtyklė „IKA®KS“ 130 Basic (IKA-WERKE, Vokietija). Spektrofotometras – „Agilent Technologies“ (Cary 60, JAV), šilumos cirkuliacinis termostatas („Binder”, Vokietija).

2.4. Tyrimų metodai

2.4.1. E. arvense žaliavų ekstraktų paruošimas

Tiksliai sveriama 0,100 g E. arvense žaliavos ir užpilama 10 ml 80% (V/V) etanoliu. Mėginiai veikiami ultragarso vonelėje 15 min., esant 40°C temperatūrai. Gauti etanoliniai ekstraktai filtruojami į matavimo cilindrus naudojant popierinius filtrus. Žaliavos likutis ant filtro plaunamas 80% (V/V) etanoliu iki 10 ml. Ekstraktai ruošiami tamsaus stiklo buteliukuose, iš kiekvienos žaliavos po du mėginius. Iš viso buvo paruošta 30 E. arvense etanolinių ekstraktų.

(25)

2.4.2. Naudotos medžiagos, reagentai ir mikroorganizmai

80% (V/V) etanolio – vandens mišinys ruošiamas remiantis alkoholimetrine lentele. 1 litrui pagaminti reikia 783 ml 96% (V/V) etanolio ir 217 ml išgryninto vandens.

30% (V/V) etanolio – vandens mišinys ruošiamas remiantis alkoholimetrine lentele. 1 litrui pagaminti reikia 262 ml 96% (V/V) etanolio ir 738 ml išgryninto vandens.

0,2 N Folin-Ciocalteu reagentas ruošiamas matavimo kolboje. 10 ml Folin-Ciocalteu fenolinio reagento (2M) skiedžiamas išgrynintu vandeniu iki 100 ml.

7,5% (W/V) natrio karbonato (Na2CO3) tirpalas ruošiamas 7,5 g bevandenio Na2CO3 tirpinant 100 ml išgryninto vandens.

Arnow reagentas gaminamas 10,000 g natrio molibdato (tikslus svėrinys) tirpinant 70-80 ml išgryninto vandens. Gautame tirpale tirpinama 10,000 g natrio nitrito (tikslus svėrinys) ir skiedžiama išgrynintu vandeniu iki 100 ml.

NaOH praskiestas tirpalas ruošiamas 8,500 g (tikslus svėrinys) natrio šarmo tirpinant išgrynintame vandenyje ir praskiedžiant iki 100 ml.

2 mM geležies (II) chlorido (FeCl2) tirpalas ruošiamas 0,0063g (tikslus svėrinys) bevandenio FeCl2

ištirpinant 25 ml išgryninto vandens. Kiekvieną kartą ruošiamas naujas tirpalas.

5 mM ferozino tirpalas ruošiamas 0,0616 g ferozino (tikslus svėrinys) tirpinant 25 ml išgryninto vandens.

6×10-5M DPPH (2,2-difenil-1-pikrikhidrazilas) tirpalas ruošiamas 0,00118g (tikslus svėrinys) DPPH reagento tirpinant 50 ml 96% (V/V) etanolyje. Kiekvieną dieną ruošiamas naujas DPPH tirpalas, kuris laikomas tamsaus stiklo butelyje, apsaugant nuo šviesos.

33% acto rū gšties tirpalas ruošiamas 33 ml 99,8% ledinės acto rūgšties skiedžiant išgrynintu vandeniu iki 100 ml.

5% metenamino tirpalas ruošiamas 2,5 g heksametilentetramino ištirpinant 50 ml išgryninto vandens. 10% aliuminio chlorido (AlCl3) tirpalas ruošiamas 5,0 g aliuminio chlorido ištirpinant 50 ml išgryninto vandens.

Rutino etanolinis tirpalas ruošiamas 0,025 g (tikslus svėrinys) 99% grynumo rutino tirpinant 25 ml 80 % (V/V) etanolio.

ABTS tirpalas ruošiamas 0,0548 g (tikslus svėrinys) ABTS miltelių tirpinant 50 ml išgryninto vandens, pridedant 70 mM kalio persulfato tirpalo. Mišinys laikomas 15 – 16 val. tamsaus stiklo butelyje, nuo šviesos apsaugotoje vietoje, kambario temperatūroje. Gaminant darbtinį ABTS•+ tirpalą , motininis ABTS tirpalas skiedžiamas išgrynintu vandeniu.

(26)

Antimikrobiniam tyrimui naudotos mikroorganizmų kultūros:

● Staphylococcus aureus ATCC 25923; ● Staphylococcus epidermidis ATCC 12228; ● Enterococcus faecalis ATCC 29212; ● Escherichia coli ATCC 25922; ● Klebsiella pneumoniae ATCC 13883; ● Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853; ● Bacillus cereus ATCC 11778;

● Bacillus subtilis ATCC 6633; ● Proteus vulgaris ATCC 8427; ● Candida albicans ATCC 10231.

2.5. E. arvense žaliavų etanolinių ekstraktų spektrofotometrinė analizė

2.5.1. Bendrojo fenolinių junginių kiekio nustatymas

Spektrofotometriniu metodu nustatomas bendrasis fenolinių junginių kiekis dirvinių asiūklių (E. arvense L.) ekstraktuose naudojant Folin-Ciocalteu reagentą. Analizei atlikti imamas 1 ml etanolinio E. arvense ekstrakto (1:100), kuris sumaišomas su 5 ml 0,2 N Folin-Ciocalteu reagentu. Po 3 min. pilama 4 ml 7,5 % (W/V) Na2CO3 tirpalo, sumaišoma ir laikoma 60 min. tamsoje. Tirpalo optinis tankis matuojamas esant 765 nm šviesos bangos ilgiui. Palyginamasis tirpalas – išgrynintas vanduo.

Bendras fenolinių junginių kiekis išreiškiamas galo rū gšties ekvivalentais (GRE) remiantis kalibracine kreive (2 pav.) ir naudojant formulę:

GRE

=

c ×

c – galo rū gšties koncentracija (mg/ml); V - pagaminto ekstrakto kiekis (ml); m - atsvertas žaliavos kiekis (g).

(27)

2 pav. Galo rūgšties kalibracinė kreivė (n=3)

2.5.2. Bendrojo fenolio rūgščių kiekio nustatymas

Analizei atlikti iš kiekvieno ekstrakto gaminama po du tirpalus – tiriamasis ir palyginamasis. Tiriamasis tirpalas gaminamas 1 ml etanolinio ekstrakto kolbutėje maišant su 2 ml 0,5 M vandenilio chlorido rū gšties, 2 ml Arnow reagento, 2 ml praskiesto natrio šarmo. Tiriamasis tirpalas skiedžiamas išgrynintu vandeniu iki 10 ml ir gerai sumaišomas. Tirpalo absorbcija matuojama esant 525 nm bangos ilgiui.

Lyginamasis tirpalas gaminamas kolbutėje imant 1 ml etanolinio ekstrakto ir sumaišant su 2 ml 0,5 M vandenilio chlorido rū gšties ir 2 ml praskiesto natrio šarmo. Tirpalas skiedžiamas išgrynintu vandeniu iki 10 ml ir sumaišomas.

Bendras fenolio rūgščių kiekis E. arvense ekstrakte skaičiuojamas chlorogeno rūgštimi remiantis formule:

X =

A – tiriamojo tirpalo absorbcijos dydis; m – atsvertas žaliavos kiekis (g).

2.5.3. Bendrojo flavonoidų kiekio nustatymas

Bendras flavonoidų kiekis E. arvense etanoliniuose ekstraktuose nustatomas veikiant aliuminio chlorido (AlCl3) ir metenamino tirpalais, acto rūgštimi (CH3COOH) parū gštintoje aplinkoje.

(28)

Iš kiekvieno ekstrakto gaminami tiriamasis ir palyginamasis tirpalai. Tiriamasis tirpalas ruošiamas į 25 ml matavimo kolbutę pilant 1 ml etanolinio dirvinių asiūklių ekstrakto (1:100), 10 ml 96 % etanolio, 0,5 ml 33% CH3COOH, 1,5 ml 10 % AlCl3 ir 2 ml 5 % metenamino tirpalo. Gautas mišinys skiedžiamas distiliuotu vandeniu iki 25 ml žymės ir gerai sumaišomas. Tirpalas paliekamas stovėti 30 min.

Palyginamasis tirpalas ruošiamas į kolbutę pilant 1 ml tiriamojo etanolinio ekstrakto (1:100), 10 ml 96 % etanolio ir 0,5 ml 33 % CH3COOH tirpalo. Gautas mišinys skiedžiamas distiliuotu vandeniu iki 25 ml žymės ir gerai sumaišomas. Spektrofotometru matuojamas tiriamojo tirpalo optinis tankis esant 475 nm šviesos bangos ilgiui ir lyginamas su palyginamuoju tirpalu.

Bendras flavonoidų kiekis vertinamas absorbcijos dydį lyginant su etaloninio tirpalo absorbcijos dydžiu. Etaloninis ir palyginamasis rutino tirpalai gaminami vietoj 1 ml ekstrakto pilant 1 ml etaloninio rutino tirpalo. Suminis flavonoidų kiekis išreiškiamas rutino ekvivalentais (RE) (mgrutino/ml ekstrakto) remiantis formule:

X

=

mR – rutino masė (g), sunaudota etaloniniam rutino tirpalui gaminti; A – tiriamojo tirpalo absorbcijos dydis;

V – ekstrakto tū ris (ml);

m – atsvertas ţ aliavos kiekis (g);

AR – etaloninio rutino tirpalo absorbcijos dydis; VR – etaloninio rutino tirpalo tūris, ml.

2.5.4. Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas spektrofotometriniu Fe

2+

jonų

sujungimo metodu

Chelatinis fenolinių junginių aktyvumas E. arvense ekstraktuose vertinamas spektrofotometriniu metodu matuojant Fe2+ ir ferozino komplekso absorbcijos sumažėjimą , esant 562 nm šviesos bangos ilgiui. Analizei atlikti imama 1 ml tiriamojo etanolinio ekstrakto ir sumaišoma su 50 μl 2mM FeCl2. Reakcija inicijuojama po 5 min. pridedant 0,2 ml 5mM ferozino tirpalo. Gautas tiriamasis tirpalas sumaišomas ir paliekamas 10 min. kambario temperatūroje. Tuščias bandinys ruošiamas 1 ml 80 % (V/V) etanolio sumaišant su 50 μl 2mM FeCl2 ir 0,2 5mM ferozino tirpalais. Palyginamasis tirpalas - 80 % (V/V) etanolis.

(29)

Tiriamojo ekstrakto chelatinės savybės išreiškiamos procentais ir apskaičiuojamos naudojant formulę:

Fe2+ ₌ _{× 100%}

Aa – tiriamojo bandinio absorbcijos dydis;

Ab – tuščiojo bandinio absorbcijos dydis (t = 0 min).

2.5.5. Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas spektrofotometriniu DPPH radikalų

surišimo metodu

Antioksidacinis aktyvumas vertinamas atliekant DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazil) radikalų surišimo metodą, kuris pagrįstas elektronų perdavimo reakcijomis. Tiriamasis bandinys ruošiamas 50 μL ekstrakto sumaišant 1 cm kvarcinėje kiuvetėje su 2 ml 6×10-5_{M DPPH tirpalu. Tuščias bandinys} ruošiamas 50 μL 80 % (V/V) etanolio maišant su 2 ml 6×10-5_{M DPPH tirpalu. Tiriamųjų ekstraktų} absorbcijos dydžiai matuojami po 30 min. naudojant spektrofotometrą, esant 515 nm šviesos bangos ilgiui.

Antiradikalinis tiriamųjų ekstraktų aktyvumas išreiškiamas procentais naudojant formulę:

DPPH surišimas ×100%

Aa – tiriamojo bandinio absorbcijos dydis (t = 30 min); Ab – tuščio bandinio absorbcijos dydis (t = 0 min).

2.5.6. Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas ABTS ̇+ radikalų surišimo metodu

Antiradikalinis aktyvumas vertinamas taikant ABTS (2,2‘-azino-bis-(3-etilbenzotiazolino-6- sulfono) rū gšties) – radikalo sujungimo metodą. 2mM motininis ABTS tirpalas gaminamas sveriant 0,0548 g (tikslus svėrinys) ABTS reagento, kuris tirpinamas 50 ml išgryninto vandens, tamsaus stiklo butelyje. Motininis tirpalas aktyvuojamas 70 mM kalio persulfato tirpalu, gerai sumaišomas ir paliekamas tamsioje vietoje 15 – 16 val. Darbinis ABTS ̇+ tirpalas gaminamas skiedžiant motininį tirpalą išgrynintu vandeniu, kol pasiekiama tirpalo absorbcija (0,800 ± 0,03), esant 734 nm bangos ilgiui. Palyginamasis tirpalas - išgrynintas vanduo.

E. arvense etanolinių ekstraktų gantiradikalinis aktyvumas matuojamas į 3,0 ml darbinio ABTS ̇+ tirpalo įpilant 30 μL tiriamojo ekstrakto. Mišinys laikomas 60 min. kambario temperatū roje. Absorbcija matuojama esant 734 nm bangos ilgiui.

(30)

Antiradikalinis E. arvense ekstraktų aktyvumas skaičiuojamas išreiškiant trolokso ekvivalentais (TE) 1 gramui žaliavos:

TE (ABTS) = c V/m

3 pav. Trolokso kalibracinė kreivė ABTS radikalų – katijonų surišimo metodu (n=3)

c – trolokso koncentracija remiantis kalibracijos kreive (μmol/l); V – paruošto ekstrakto tū ris (ml);

m – tikslus atsvertos žaliavos kiekis (g).

Antioksidanto trolokso kalibracinė kreivė sudaroma ruošiant penkių skirtingų trolokso koncentracijų tirpalus. Motininis trolokso tirpalas ruošiamas sveriant tikslų trolokso svėrinį (g) ir tirpinant 80% etanolyje. Iš motininio tirpalo ruošiami 400-8000 μmol/l koncentracijų tirpalai ir atliekamas ABTS tyrimas. Matuojamos skirtingų koncentracijų tirpalų absorbcijos reikšmės ir sudaroma trolokso kalibracinė kreivė (3 pav.).

2.6. E. arvense žaliavų antimikrobinio aktyvumo tyrimas

Eksperimentuose in vitro nustatytas dirvinių asiūklių antimikrobinis poveikis tyrime naudojamų standartinių (etaloninių) bakterijų (Staphylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Proteus vulgaris ATCC 8427, Bacillus subtilis ATCC 6633, Bacillus cereus ATCC 11778) ir grybelio Candida albicans ATCC 10231 kultūrų atžvilgiu (Žr. Priedai Nr.1). Tyrimas buvo atliktas remiantis EARSS (European Antimicrobial Resistance

(31)

Surveillance System) ir EUCAST (The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing) reglamentuotomis metodikomis ir vertinimo kriterijais.

Dirvinių asiūklių augalinės žaliavos tirštojo ekstrakto paruošimas. Antimikrobinio aktyvumo tyrimui gaminamas dirvinių asiūklių augalinės žaliavos tirštasis ekstraktas. Tiksliai sveriama 10,000 g E. arvense žaliavos ir užpilama 100 ml 80% (V/V) etanoliu. Mėginiai veikiami ultragarso vonelėje 15 min., esant 40°C temperatūrai. Gauti etanoliniai ekstraktai filtruojami į matavimo cilindrus naudojant popierinius filtrus. Žaliavos likutis ant filtro plaunamas 80% (V/V) etanoliu iki 100 ml. Nufiltruoti etanoliniai ekstraktai garinami porceliano lėkštelėje virš vandens vonelės iki tirštojo ekstrakto, palaikant 40-50°C temperatūrą. Tirštieji ekstraktai laikomi sandariai uždaryti tamsaus stiklo buteliukuose.

Etaloninių mikroorganizmų kultūrų paruošimas tyrimui. Standartinės mikroorganizmų kultūros buvo kultivuojamos ir ruošiamos tyrimui remiantis nurodytų mikroorganizmų kultivavimo protokolais. Etaloninės nesporinių bakterijų Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris kultūros auginamos 20–24 val. 35–37 ºC temperatūroje ant Miulerio-Hintono agaro (Mueller-Hinton II Agar, BBL, Cockeysville, JAV). Bakterijų suspensija gaminama iš išaugintų bakterijų kultūrų steriliame fiziologiniame natrio chlorido (0,9 %) tirpale, standartizuojama McFarland’o standartiniu indikatoriumi (“Standart indikator McFarland”), kuris matuoja mėgintuvėlyje esančios suspensijos drumstumą. Bakterijų suspensija laikoma standartizuota, kai indikatoriaus reikšmė lygi 0,5 (tai reiškia, kad 1 ml bakterijų suspensijos yra 1,5 × 108 bakterijų ląstelių).

Etaloninės sporinės bakterijos Bacillus cereus ir Bacillus subtilis kultūros auginamos 7 dienas 35–37 C temperatūroje ant Miulerio-Hintono agaro. Užaugus sporinės bakterijos kultūrai, ji nuplaunama nuo terpės paviršiaus steriliu fiziologiniu tirpalu. Pagaminta suspensija kaitinama 30 min. 70 C temperatūroje ir skiedžiama fiziologiniu tirpalu, kol sporų koncentracija 1 ml yra ribose nuo 10 × 106_{iki 100}_{× 10}6_{. Tokią pagamintą sporų suspensiją galima laikyti ilgą laiką žemesnėje nei 4 C} temperatūroje.

Etaloninės grybų kultūros: Candida albicans auginamos 20–24 val. 30 ºC temperatūroje ant Miulerio-Hintono agaro. Grybų suspensija gaminama iš užaugintų grybų kultūrų fiziologiniame tirpale, standartizuojama McFarland’o standartiniu indikatoriumi.

Antimikrobinio aktyvumo nustatymo metodika. Miulerio – Hintono agaras sandariai uždarytoje stiklinėje kolboje tirpinamas vandens vonioje ir laikomas, kad nestingtų. Tirštojo ekstrakto mėginiai tirpinami 5 ml 30% etanolio (V/V). Daromi ekstraktų skiedimai agare:

1. 1 ml mėginio maišoma su 5 ml 45C temperatos skystu Miulerio – Hintono agaru ir visas turinys supilamas į 1-ą sterilią Petri lėkštelę.

(32)

2. 0,75 ml mėginio maišoma su 5 ml 45C temperatos skystu Miulerio – Hintono agaru ir visas turinys supilamas į 2-ą sterilią Petri lėkštelę.

Sustingus agarui Petri lėkštelėje, lėkštelės dugnas pažymimas segmentais – viso 10 (4 pav.).

1 segmentas – Staphylococcus aureus ATCC 25923;

2 segmentas – Staphylococcus epidermidis ATCC 12228;

3 segmentas – Enterococcus faecalis ATCC 29212;

4 segmentas – Escherichia coli ATCC 25922; 5 segmentas – Klebsiella pneumoniae ATCC 13883;

6 segmentas – Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853;

7 segmentas – Bacillus cereus ATCC 11778; 8 segmentas – Bacillus subtilis ATCC 6633; 9 segmentas – Proteus vulgaris ATCC 8427; 10 segmentas – Candida albicans ATCC 10231

4 pav. Etaloninių mikroorganizmų kultūrų sėjimo schema

Mikroorganizmų kultūros sėjamos kilpelėmis į kiekvieną segmentą. Teigiama kontrolė atlikta sėjant etalonines mikroorganizmų kultūras į Miulerio – Hintono agarą Petri lėkštelėje, kuriame yra su 5 % etanolio (V/V) (etaloniniai mikroorganizmai neauga). Neigiama kontrolė atlikta sėjant etalonines mikroorganizmų kultūras į Miulerio – Hintono agarą Petri lėkštelėje, kuriame yra 15 % etanolio (V/V) (etaloniniai mikroorganizmai auga). Pasėliai kultivuojami termostate 20 – 24 val., esant 35 – 37°C temperatū rai. Mikroorganizmų augimas vertinamas vizualiai, lyginant su neigiamos kontrolės Petri lėkštele. Nustatoma MSK – mažiausia tirto mėginio koncentracija (mg/ml), kuri dar slopina etaloninių mikroorganizmų augimą .

Vertinimas:

• Auga – rodo, kad etaloninė kultūra yra nejautri tiriamajam preparatui tirtoje jo koncentracijose Miulerio – Hintono agare.

• Neauga – rodo, kad etaloninė kultūra yra jautri tiriamojo preparato tam tikrai koncentracijai Miulerio – Hintono agare.

(33)

2.7. Duomenų analizė

Duomenų grafinis vaizdavimas ir statistinė duomenų analizė buvo atliekama „MS Excel 2016“ (Microsoft, JAV) ir SPSS 17 (SPSS Inc., JAV) kompiuterinėmis programomis. Tyrimai buvo atlikti juos pakartojant po tris kartus ir išvestas gautų duomenų matematinis vidurkis. Tiesinės regresijos modelio tinkamumui apskaičiuotas determinacijos koeficientas R2. Reikšmingumo lygmuo - 0,05. Rezultatai laikomi statistiškai reikšmingais, jei p<0,05. Duomenų statistiniam įvertinimui apskaičiuotas standartinis nuokrypis, standartinė paklaida, koreliacinių ryšių įvertinimas atliktas pagal Pirsono tiesinės koreliacijos koeficientą .