LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
FARMACIJOS FAKULTETAS
VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA
GYTIS KATKAUSKAS
KRYPTINGA NAUJŲ 4-IMIDAZOLINONO JUNGINIŲ SINTEZĖ IR
JŲ PRIEŠVĖŽINIO AKTYVUMO NUSTATYMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
prof. dr. Hiliaras Rodovičius
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
FARMACIJOS FAKULTETAS
VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas
prof. dr. Vitalis Briedis ____________ 2015-___-___
KRYPTINGA NAUJŲ 4-IMIDAZOLINONO JUNGINIŲ SINTEZĖ IR
JŲ PRIEŠVĖŽINIO AKTYVUMO NUSTATYMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
prof. dr. Hiliaras Rodovičius ________ 2015-___-___ Darbo recenzentas _________________________ _________________________ 2015-___-___ Darbą atliko Magistrantas Gytis Katkauskas _________ 2015-___-___
KAUNAS, 2015
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SANTRUMPOS ... 9
SĄVOKOS ... 10
ĮVADAS ... 11
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 13
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 14
1.1 Vėžinių ląstelių savybės ... 14
1.2 Apoptozė ir jos mechanizmas ... 14
1.3 Bcl-2 slopikliai ... 15
1.4 ABT-737 ir ABT-263 ... 15
1.5 Naujų Bcl-2 slopiklių kūrimas taikant in silico metodus ... 16
1.6 Hidantoino junginiai bei jų priešvėžinis aktyvumas ... 18
2. TYRIMO METODIKA IR METODAI ... 19
2.1 Junginių molekulinis modeliavimas ... 19
2.2 Sintezės metodai ... 20
2.3 Junginių sintezė... 20
2.3.1 1-Acetil-2-tiohidantoino sintezė ... 21
2.3.2 2-Tiohidantoino sintezė ... 21
2.3.3 Pakaito įvedimas į 5-tą padėtį ... 22
2.3.4 Junginių metilinimas ... 23
2.3.5 Pakaito įvedimas į 2-trą padėtį ... 24
2.4 Susintetintų junginių fiziko-cheminė analizė ... 25
2.4.1 UV spektroskopija ... 25
2.4.2 IR spektroskopija ... 25
2.4.3 Lydimosi temperatūros nustatymas ... 25
2.4.4 Efektyvioji skysčių chromatografija ... 25
2.5 Junginių priešvėžinio aktyvumo nusatatymas ... 26
2.5.1 Ląstelių kultivavimas ... 26
2.5.2 Ląstelių skaičiaus ir gyvybingumo nustatymas ... 26
2.5.3 XTT ląstelių proliferacijos tyrimas ... 27
2.6 Statistinė analizė ... 27
3.REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 28
3.1 Junginių molekulinio modeliavimo tyrimo rezultatai ... 28
3.1.2 Susintetintų junginių prognozuojamas aktyvumas ... 28
3.1.3 Prognozuojamas sintetintų junginių struktūros-aktyvumo ryšys ... 29
3.2 Junginių sintezės rezultatai... 32
3.3 Fiziko-cheminės analizės rezultatai ... 34
3.3.1 Efektyviosios skysčių chromatografijos rezultatai ... 34
3.3.2 UV spektroskopijos rezultatai ... 35
3.3.3 IR spektroskopijos rezultatai ... 35
3.4 Junginių priešvėžinio aktyvumo tyrimo rezultatai... 37
3.5 In silico ir in vitro rezultatų palyginimas ... 38
4.IŠVADOS ... 40
5.PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 41
6.LITERATŪROS SĄRAŠAS... 42
SANTRAUKA
Lietuvos Sveikatos Mokslų Universiteto (LSMU), farmacijos fakulteto, V kurso 2-ros grupės studento, Gyčio Katkausko magistro baigiamasis darbas: „Kryptinga naujų 4-imidazolinono junginių sintezė ir jų priešvėžinio aktyvumo nustatymas“. Mokslinis vadovas: Prof. dr. Hiliaras Rodovičius LSMU, Farmacijos Fakulteto, Vaistų Chemijos Katedra – Kaunas.
Raktiniai žodžiai: 4-Imidazolinonas, sintezė, Bcl-2, vėžys, XTT.
Darbo tikslas: Remiantis in silico duomenimis atrinkti sumodeliuotus naujus
4-imidazolinono struktūrinį pagrindą turinčius junginius bei atlikti jų sintezę, fiziko-cheminę analizę ir priešvėžinio aktyvumo tyrimą.
Darbo uždaviniai: 1) Atlikti naujų junginių in silico modeliavimą ir atrinkti potencialiausius
junginius sintezei. 2) Atlikti kryptingą sumodeliuotų naujų 4-imidazolinono junginių sintezę, struktūros analizę ir grynumo tyrimus. 3) Atlikti susintetintų junginių pirminį priešvėžinio aktyvumo tyrimą. 4) Nustatyti koreliaciją tarp in silico ir in vitro ekspermentinių rezultatų.
Darbo metodai: Junginių modeliavimas ir in silico analizė atlikta naudojant „Schrӧdinger
2014-2: small molecule drug discovery suite“ programinę įrangą. Junginių grynumas įvertintas ESC ir plonasluoksnės chromatografijos metodais. Junginių tapatybė nustatyta atliekant IR ir UV spektroskopiją. Junginių priešvėžinis aktyvumas nustatytas naudojant XTT ląstelių proliferacijos tyrimą.
Tyrimo rezultatai: Atlikus molekulinio modeliavimo tyrimą sintezei atrinkti 45 junginiai
pasižymintys potencialaus vaisto farmakodinaminėmis savybėmis (pvz., logP nuo -0.4 iki +5.6, numatomas peroralinis pasisavinimas >60%) ir galimu priešvėžiniu aktyvumu. Prognozuojamam junginių aktyvumui didžiausią įtaką turėjo 5-(4-bromofenil)-2-furfurolo, 5-(4-chlorofenil)-2-furfurolo, 4-fluorbenzeno pakaitai 5-oje ir paraminobenzoinės r., 4-fenoksianilino pakaitai 2-oje 4-imidazolinono žiedo padėtyje. Susintetinta 14 junginių, iš kurių 11 buvo grynesni nei 90%, todėl atliktas jų pirminis priešvėžinio aktyvumo įvertinimas XTT ląstelių proliferacijos metodu. Atlikus pirminį priešvėžinio aktyvumo tyrimą nustatyta, jog aktyviausi junginiai turėjo fenoksianilino pakaitą 2-oje 4-imidazolinono žiedo padėtyje. Aktyviausias junginys HAM10-6 slopino 90,33±15,43% ląstelių metabolinį aktyvumą (p<0,01).
Išvados: Atlikus 5097 in silico sumodeliuotų junginių virtualią atranką, sėkmingai įvykdyta
kryptinga 14 naujų 4-imidazolinono stuktūrinį pagrindą turinčių junginių sintezė. Susintetintų junginių numatoma sąveikos energija E su Bcl-2 baltymu svyravo nuo -4,274 iki –6,725 kcal/mol. Susintetintų junginių grynumas siekė nuo 72,57% iki 98,97%. Atlikus pirminį priešvėžinio aktyvumo vertinimą nustatyti 8 junginiai, kurie slopina daugiau nei 50% NCI-H146 ląstelių (p<0,05) ir galimai pasižymi
priešvėžiniu aktyvumu. Tarp gautų in silico ir in vitro ekspermentinių rezultatų nustatytas 0,249 koreliacijos koeficientas. Rekomenduojama atlikti papildomus bandymus naudojant skirtingas mėginių koncentracijas ir apskaičiuoti šių junginių IC50 NCI-H146 ląstelių linijai. Rekomenduojama praplėsti
priešvėžinio aktyvumo tyrimus naudojant kito tipo vėžinių ląstelių linijas su padidėjusia Bcl-2 baltymo ekspresija, pavyzdžiui, ūminės mieloidinės leukemijos (ŪML) ląstelių liniją.
SUMMARY
Master thesis of Lithuanian University of Health Science (LHSU), Faculty of Pharmacy, 5th year, 2nd group student Gytis Katkauskas: “Targeted synthesis of new 4-imidazolinone derivatives and
evaluation of their anticancer activity”. Mentor: prof. dr. Hiliaras Rodovičius – LHSU, Faculty of Pharmacy, Department of Drug Chemistry– Kaunas
Keywords: 4-imidazolinone, synthesis, Bcl-2, cancer, XTT.
Aim: To perform new 4-imidazolinone compounds modeling and based on in silico results
select the most potential compounds for synthesis, physico-chemical analysis and anticancer activity evaluation.
Objectives: 1) To perform in silico modeling of new compounds and select the most potential
compounds for synthesis. 2) Perform targeted synthesis of new 4-imidazolinone derivatives, determine their structure and purity. 3) To perform preliminary anticancer activity evaluation of synthesized compounds. 4) To determine correlation of in silico and in vitro experimental results.
Methods: Ligand modeling and in silico evaluation was performed using “Schrӧdinger
2014-2: small molecule drug discovery suite” software. Purity of synthesized compounds was determined using HPLC and TLC methods. The identity of compounds was confirmed by UV and IR spectroscopy. Compounds anticancer activity evaluation was performed using XTT cell proliferation essay.
Results: After in silico molecule modeling and ligand evaluation 45 compounds with
favorable pharmacokinetic properties (e.g. logP between -0.4 and +5.6, predicted oral absorbtion >60%) and possible anticancer activity were selected for synthesis. Docking results analysis showed that predicted activity increases when ligand contains 4-fluorobenzaldehyde, 5-(substituted aryl)-2-furfuralaldehydes in 5th position and 4-phenoxyaniline, 4-aminosalicylic acid, 4-aminobenzoic acid in 2nd position of 4-imidazolinone ring. 14 new compounds were successfully sinthesized, their structure and purity were determined. HPLC analysis lead to identify 11 compounds with high purity level (>90%) that was suitable for anticancer activity evaluation using XTT cell proliferation assay.
Preliminary anticancer activity evaluation showed that the most active compounds contained 4-phenoxyaniline in 2nd position of 4-imidazolinone ring. The most active compound was HAM10-6 that inhibited metabolic activity of 90.33±15.43% cells in the sample (p<0.01).
Conclusions: After in silico virtual screening of 5097 ligands, 14 new 4-imidazolinone
compounds targeting Bcl-2 were successfully synthesized. Compound interaction energy ΔE varying between -4.274 and -6.725 kcal/mol towards Bcl-2 protein. Determined compound purity level varying between 72.57% and 98.97%. Preliminary anticancer activity evaluation showed 8 compounds with possible anticancer activity that inhibited metabolic activity of more than 50% cells (p<0.05) in the sample. Between in silico and in vitro experimental results correlation coefficient of 0.249 was determined. It is recommended that additional experiments using different compound concentrations would be performed to determine synthesized compounds IC50 on NCI-H146 cell line. It is also
recommended that anticancer activity evaluation would be expanded using other cancer cell type such as acute myeloid leukemia that has elevated Bcl-2 protein expression.
PADĖKA
Dėkoju darbo vadovui prof. dr. Hiliarui Rodovičiui už tinkamų sąlygų atlikti ir parengti magistro baigiamajį darbą sudarymą.
Dėkoju prof. dr. Liudui Ivanauskui ir doktorantui Mindaugui Marksai už pagalbą atliekant ESC ir UV analizę.
Dėkoju doktorantams Jonui Saliui ir Liudui Šlepikui už pagalbą atliekant junginių sintezę, analizę ir priešvėžinio aktyvumo tyrimus.
Dėkoju prof. Angelijai Valančiūtei už sudarytas sąlygas atlikti priešvėžinio aktyvumo tyrimus.
SANTRUMPOS
Bad – su Bcl-2 susijęs apoptozę inicijuojantis baltymas (angl. Bcl-2-associated death promoter)
Bcl-2 – B-ląstelių limfomos 2 baltymas (angl. B-cell lymphoma 2)
Bcl-w - į B-ląstelių limfomos 2 baltymą panašus baltymas 2 (angl. B-cell lymphoma-w) Bcl-xL – į B-ląstelių limfomos 2 baltymą panašus baltymas 1 (B-cell lymphoma extra-large) Bid – su Bcl-2 susijęs apoptozės signalo baltymas(angl. BH3 interacting-domain death agonist)
Bik – su Bcl-2 susijęs apoptozė skatinantis baltymas (angl. Bcl-2-interacting killer) DMSO – Dimetilsulfoksidas
ESC - Efektyvioji skysčių chromatografija
Noxa – forbolio-12-miristato-13-acetato aktyvuojamas baltymas 1 (angl. Phorbol-12-myristate-13-acetate-induced protein 1)
PSO - Pasaulio sveikatos organizacija
Puma - su p53 baltymu susijęs apoptozės reguliatorius (angl. p53 upregulated modulator of apoptosis)
SLPV - Smulkiųjų ląstelių plaučių vėžys TVTA - Tarptautinė vėžio tyrimų agentūra ŪML - Ūminė mieloidinė leukemija
SĄVOKOS
Antiapoptotinis – slopinantis apoptozę.
Apoptozė – genetiškai numatytas ląstelių žūties procesas, kuris aktyvuojamas esant tam tikriems organizmo signalams arba jų slopinimui.
Autokrininis signalas – ląstelės pagamintų molekulių perduodamas signalas veikiantis pačios ląstelės receptorius.
Konformeras – tos pačios struktūros junginys, kuris skiriasi savo išsidėstymu erdvėje. Metastazuoti – persikelti į kitus organizmo organus.
Proapoptotinis – skatinantis apoptozę.
ĮVADAS
Darbo aktualumas: Pasaulio sveikatos organizacija (PSO) paskelbė Tarptautinės vėžio
tyrimų agentūros (TVTA) atlikto GLOBOCAN2012 projekto duomenis, jog 2012 metais nuo vėžio mirė 8.2 milijono žmonių [1]. Numatoma, jog mirčių nuo vėžio vis daugės ir 2030 metais jų turėtų būti virš 13 milijonų. Ši problema skatina mokslininkus ieškoti naujų priemonių, kurios būtų efektyvesnės už dabartines ir padėtų kovoti su sparčiai plintančia liga bei sutaupytų sveikatos apsaugai išleidžiamus valstybės pinigus.
Vėžinės ląstelės pasižymi kitoms ląstelėms nebūdingomis savybėmis: nepertraukiamas ląstelių augimo ir dauginimosi signalo palaikymas, nejautrumas ląstelių augimo slopintojams, galimybė įsiskverbti į kitus audinius ir metastazuoti, sugebėjimas išvengti organizmo imuninio atsako, sugebėjimas sukelti genų mutacijas, begalinės ląstelių dauginimosi galimybės esant nepalankioms augimo sąlygoms, palaikomas naujų kraujagyslių formavimasis apie naviką, sugebėjimas išvengti apoptozės [2].
Apoptozė turi keletą veikimo mechanizmo kelių, tačiau vėžio gydymui vienas svarbiausių yra mitochondrinis kelias. Pagrindiniai mechanizmo reguliatoriai yra Bcl-2 šeimos proteinai susidedantys iš apoptozę skatinančių proapoptotinių (pvz., Bad, Bik, Bid, Noxa, Puma) bei apoptozę slopinančių antiapoptotinių (pvz., Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w) baltymų [3]. Proapoptotinį Bcl-2 baltymą koduojančio geno pažaida yra viena pagrindinių priežasčių, lemiančių vėžinių ląstelių atsiradimą bei astparumą chemoterapiniam gydymui [4]. Padidėjus Bcl-2 baltymo raiškai yra slopinamas mitochondrinis ląstelės apoptozės kelias, tai leidžia vėžinėms ląstelėms išgyventi ilgiau nei įprasta.
Sukurta nauja priešvėžinių vaistų grupė BH3 mimetikai, kurie veikia mitochondrinį apoptozės mechanizmo kelią ir panaikina vėžinių ląstelių atsparumą apoptozei. BH3 mimetikai yra mažos molekulės, Bcl-2 baltymo antagonistai, kurie konkurencingai slopina Bcl-2 baltymo jungimąsi su mitochondrijų receptoriais ir leidžia sukelti vėžinių ląstelių apoptozę [5]. Rinkoje šios grupės priešvėžinių vaistų dar nėra, tačiau šiuo metu atrasta keletas potencialių BH3 mimetikų, kurie yra klinikinių tyrimų stadijoje: ABT737 [6], ABT263 [7], ABT199 [8], Obatoclax [9].
Tyrimai rodo, jog hidantoino junginiai pasižymi priešvėžiniu aktyvumu slopindami antiapoptotinio baltymo Bcl-2 ekspresiją ir atkurdami normalią apoptozę [10,11]. Hidantoino junginiai taip pat dažnai naudojami medicinoje, nes pasižymi plačiu farmakologiniu poveikiu [12-16]. Dėl šių savybių molekulių modeliavimui pasirinktas hidantoino skeletas.
Remiantis Bcl-2 baltymo kristalografine struktūra racionaliai modeliuotos ligandų molekulės, virtualios atrankos metu išrinktos sintezei. Pagrindinis atrankos parametras buvo prognozuojama sąveikos energija su baltymo aktyviuoju centru, tap pat atsižvelgta į junginio savybes įtakojančias farmakodinaminį vaisto pasisavinimą [17,18].
Junginių modeliavimas ir in silico analizė atlikta naudojant „Schrӧdinger 2014-2: small molecule drug discovery suite“[19,20,21] programinę įrangą. Junginių grynumas įvertintas ESC ir plonasluoksnės chromatografijos metodais. Junginių tapatybė nustatyta atliekant IR ir UV spektroskopiją. Junginių priešvėžinio aktyvumo tyrimas atliktas naudojant XTT ląstelių proliferacijos tyrimą. Darbe in silico ir in vitro metodais įvertinama 4-imidazolinono žiedo 2-oje ir 5-oje padėtyje esančių pakaitų įtaka junginių priešvėžiniam aktyvumui.
Darbo tikslas: Remiantis in silico duomenimis atrinkti sumodeliuotus naujus
4-imidazolinono struktūrinį pagrindą turinčius junginius bei atlikti jų sintezę, fiziko-cheminę analizę ir priešvėžinio aktyvumo tyrimą.
Darbas pristatytas 10-oje tarptautinėje gamtos ir sveikatos mokslų .konferencijoje „The COINS2015“, Vilnius, Lietuva, 2015.
Darbas pristatytas 3-oje tarptautinėje konferencijoje „International Health Sciences Conference“ Kaunas, Lietuva, 2015.
Darbas pristatytas LSMU SMD organizuotoje 67-oje „Jaunųjų mokslininkų ir tyrėjų konferencijoje“ Kaunas, Lietuva, 2015.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas: Remiantis in silico duomenimis atrinkti sumodeliuotus naujus
4-imidazolinono struktūrinį pagrindą turinčius junginius bei atlikti jų sintezę, fiziko-cheminę analizę ir priešvėžinio aktyvumo tyrimą.
Uždaviniai:
1) Atlikti naujų junginių in silico modeliavimą ir atrinkti potencialiausius junginius sintezei.
2) Atlikti kryptingą sumodeliuotų naujų 4-imidazolinono junginių sintezę, struktūros analizę ir grynumo tyrimus.
3) Atlikti susintetintų junginių pirminį priešvėžinio aktyvumo tyrimą. 4) Nustatyti koreliaciją tarp in silico ir in vitro ekspermentinių rezultatų.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1 Vėžinių ląstelių savybės
Vėžinės ląstelės pasižymi kitoms ląstelėms nebūdingomis savybėmis, kurios leidžia joms nuolat daugintis ir išvengti apoptozės. Pirmoji ir viena svarbiausių vėžinių ląstelių savybių yra nepertraukiamas proliferacijos signalo palaikymas. Jos sugeba paveikti augimo faktorių išskyrimą ir tirozino kinazių receptorius, kurie atsakingi už ląstelės augimo signalų palaikymą [22]. Dažniausiai ląstelės pačios sugeba pasigaminti augimo hormono molekules ir aktyvuoti autokrininį proliferacijos signalą. Kitas kelias yra perduoti augimo signalą šalia esančioms normalioms organizmo ląstelęms, kurios aprūpina vėžines ląsteles augimo faktoriais [2]. Kita vėžinių ląstelių savybė yra proliferaciją slopinančių signalų išvengimas. Jos sugeba paveikti baltymų, pavyzdžiui retinoblastomos baltymo [23], raišką ir sutrikdyti proliferacijos slopinimą. Vėžinės ląstelės gali įsiskverbti į kitus audinius ir metastazuoti. Tai apsunkina vėžio gydymą, nes reikia taikyti skirtingas terapijas vienu metu [24]. Sugebėjimas įsiskverbti ir metastazuoti nėra pilnai suprastas, tačiau atrandami vis nauji mechanizmai padedantys suvokti šį procesą. Vienas iš mechanizmų yra ląstelių adheziją skatinančio baltymo raiškos slopinimas [25]. Dar viena savybė leidžianti vėžinėms ląstelėms išgyventi yra sugebėjimas išvengti organizmo imuninio atsako [2]. Savybė paveikti DNR replikaciją leidžia vėžinėms ląstelėms dalintis begalę kartų išvengiant senėjimo procesų. Tam turi įtakos padidėjusi telomerazės raiška ląstelėse [26]. Vėžio ląstelės turi savybę įtakoti naujų kraujagyslių formavimasis apie naviką reguliuodamos angiogenėzę aktyvuojančius ir slopinančius faktorius [27]. Tai leidžia augliui nuolat gauti deguonies ir pašalinti metabolinius produktus slopinančius ląstelių augimą [2].
1.2 Apoptozė ir jos mechanizmas
Apoptozė yra vienas pagrindinių ląstelių atsako į vėžio gydymą mechanizmų [28]. Sugebėjimas išvengti užprogramuotos ląstelių žūties yra viena pagrindinių savybių, kodėl vėžio gydymas yra neefektyvus [29]. Apoptozė turi keletą veikimo mechanizmo kelių, tačiau vėžio gydymui vienas iš svarbiausių yra mitochondrinis apoptozės mechanizmo kelias [30]. Pagrindiniai mechanizmo reguliatoriai yra Bcl-2 šeimos proteinai susidedantys iš apoptozę skatinančių proapoptotinių (pvz., Bad, Bik, Bid, Noxa, Puma) bei apoptozę slopinančių antiapoptotinių (pvz., Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w) baltymų [3]. Reguliacija vyksta esant baltymo – baltymo sąveikai. Kai antiapoptotinio Bcl-2 baltymo raiška vėžinėje ląstelėje yra aktyvinama, ji slopina proapoptotinių baltymų Bax/Bak oligomerizaciją. Esant normaliai apoptozei, susidaręs Bax/Bak dimeras leidžia depoliarizuoti mitochondrijas,
stimuliuojamas citochromų, o svarbiausia citochromo C, išskyrimas. Citochromas C kartu su apoptozės proteazės aktyvavimo faktoriumi-1 aktyvuoja prokaspazę-9. Aktyvuota kaspazė-9 pradeda kaspazių kaskadą, kuri baigiasi ląstelių mirtimi dėl biocheminių jos pokyčių [31].
1.3 Bcl-2 slopikliai
Bcl-2 baltymo molekulinis klonavimas prieš 20 metų buvo pagrindinė priežastis atsirasti šio baltymo slopikliams [32]. Trimatė kristalografinė Bcl-XL baltymo struktūra padėjo tiksliau nustatyti
baltymo aktyvųjį centrą, išsiaiškinti jo veikimo mechanizmą, atsirado galimybė modeliuoti Bcl-2 baltymo slopiklius [33]. Slopiklių molekulės veikia Bcl-2 baltymą, susidaro baltymo – baltymo sąveika hidrofobinėje jungimosi „kišenėje“, tada yra slopinamas antiapoptotinio Bcl-2 baltymo veikimas ir oligomerizuojamas Bax/Bak, įvyksta vėžinės ląstelės apoptozė [5]. Pirmoji medžiaga slopinanti Bcl-2 geno raišką pasiekusi klinikinius tyrimus buvo natrio oblimersenas. Jis, vartojamas kartu su kitais priešvėžiniais preparatais, gydant chronišką limfocitinę limfomą sustiprino terapinį poveikį ir padidino pacientų išgyveninamumą [34]. Pirmasis junginys slopinęs patį Bcl-2 baltymą buvo „Gossypol“. Tai fenolinis pigmentas randamas recemato pavidalu medvilnės sėklose, šaknyse, stiebe. Jis buvo atrastas Kinijoje ir naudotas kaip nevaisingumą sukelianti medžiaga [35]. Atskyrus iš recemato L-gosipolį gautas preparatas AT-101, kuris pasižymi dideliu giminingumu Bcl-2 baltymui. Preparatas AT-101 yra klinikinių tyrimų stadijoje gydant prostatos vėžį [36]. Preparato AT-101 analogas „Apogossypol“ pasižymėjo didesniu aktyvumu ir mažesniu toksiškumu tyrimo su pelėmis metu [37]. Preparatas „Obatoclax“ (GX15-070) ikiklinikinių tyrimų metu parodė citotoksinį aktyvumą prieš daugybinės mielomos [38] bei mantijos limfomos [39] vėžines ląsteles bei sustiprino kito priešvėžinio preparato poveikį. Dabar „Obatoclax“ preparatas yra klinikinių tyrimų stadijoje [40].
1.4 ABT-737 ir ABT-263
Potencialiausi Bcl-2 baltymo slopikliai šiuo metu yra ABT-737[41] ir ABT-263[42]. Tyrimai parodė, kad ABT-737 bei modifikuotos jo molekulės slopina Bcl-xL, Bcl-2 ir Bcl-w baltymus tam tikrose vėžinių kultūrų ląstelėse esant 1 nM koncentracijai [41]. Manoma, jog aktyvumą įtakoja acilsulfonamidinis molekulės fragmentas, sujungiantis dvi molekulės dalis, kurios geba sąveikauti su baltymo aktyviuoju centru. Junginių ABT-737 ir ABT-263 molekulės pavaizduotos 1 paveiksle.
1 Pav. Junginių ABT-737 ir ABT-263 struktūra Paveiksle acilsulfonamidinis molekulės fragmentas
pažymėtas raudonai, daugiausiai fizikines ir farmakodinamines savybes įtakojančios zonos pažymėtos mėlynai.
Nors ABT-737 molekulė yra labai veiksminga prieš vėžines ląsteles, o ypač lėtinės limfocitinės limfomos [43] bei SLPV ląsteles [6], jos panaudojimą riboja prastos fizikocheminės ir farmakodinamines savybės. Molekulės biopraeinamumas vartojant peroraliai yra 0%, o dėl mažo tirpumo vandenyje labai sunku dozuoti preparatą intraveniškai. Vienintelis būdas vartoti vaistą yra intraperitoninis, o tai daugumai pacientų sukelia nepatogumų. Dėl minėtų trūkumų buvo sugalvota patobulinti fizikines ir farmakodinamines molekulės savybes. Balansuojant tarp molekulės giminingumo baltymui, jos veiksmingumo ir absorbcijos per burną buvo gauta sumodeliuota ABT-263 molekulė. Jos biopraeinamumas siekė 20% vandeniniuose ir 50% lipidiniuose tirpikliuose, o efektyvios vaisto dozės in vitro ženkliai nepasikeitė nuo ABT-737. Krūvio balansą, metabolizmą ir absorbciją įtakoja trys pagrindinės vietos ABT-737 molekulėje (1 paveikslas). Modifikuojant molekulę ir įvedant naujus pakaitus į minėtas sritis pavyko išgauti reikiamas molekulės savybes. Patobulintas preparatas ABT-263 pateko į klinikinių tyrimų stadiją. Šiuo metu ABT-263 preparatas pavadinimu „Navitoclax“ yra II klinikinių tyrimų fazėje gydant SLPV[44]. Gauti priešvėžinio aktyvumo rezultatai leidžia manyti, jog šis Bcl-2 slopiklis pasieks III klinikinių tyrimų fazę.
1.5 Naujų Bcl-2 slopiklių kūrimas taikant in silico metodus
Bcl-2 slopikliai yra nauja biologiškai aktyvių junginių grupė palyginus su dabartinei vėžio terapijai naudojamais preparatais [5,45]. Šiuo metu nei vienas BH3 mimetikas dar nepasiekė IV klinikinių tyrimų fazės [6-9]. Tobulėjant kompiuterinėms technologijoms optimizuojami aktyvių junginių paieškos metodai, todėl atrandama vis daugiau potencialių priešvėžiniu aktyvumu pasižyminčių junginių [46]. Perspektyviausias paieškos metodas šio metu yra molekulinis in silico modeliavimas panaudojant virtualias ligandų bibliotekas. Remiantis Bcl-2 baltymo kristalografine struktūra racionaliai modeliuojamos ligandų molekulės, kurios sudaro ligandų biblioteką.
Modeliuojant naujus junginius remiamasi ir susintetintų junginių, kurių ekspermentiniai rezultatai parodė priešvėžinį aktyvumą, struktūros įpatumais. Vėliau virtualios atrankos metu potencialiausi ligandai išrinkami sintezei. Pagrindinis atrankos parametras yra prognozuojama sąveikos energija (XPGscore) su baltymo aktyviuoju centru. Kuo molekulė sudaro daugiau sąveikų su baltymo receptoriumi, tuo didesnis numatomas junginio aktyvumas. In silico modeliavimo ir kryptingos sintezės pavyzdys galėtų būti rodanino junginių sintezė, kuomet mokslininkai panaudojo anksčiau minėtas ABT-737 ir ABT-263 molekulių struktūras naujų junginių kūrime [47]. Jie pakeitė prie acilsulfonamido fragmento esantį benzeno žiedą į rodanino heterociklą ir gavo naujus aktyvumu pasižyminčius Bcl-2 inhibitorius. Bendrinė susintezuotų junginių struktūra pavaizduota 2 paveiksle.
2 Pav. Acilsulfonamido fragmentą turinčių rodanino junginių struktūra Raudonai pažymėtas
acilsulfonamido fragmentas. R1 žymi fenilo radikalus (pvz., 2-chlorfenilą, 4-metoksifenilą), R2 žymi
alifatinius izoalkanų radikalus (pvz., izopropilą, izobutilą).
Panašų tyrimą atliko ir kiti mokslininkai pakeitę benzeno žiedą prie acilsulfonamido fragmento ABT-737 molekulėje į N-heteroarilus [48]. Bendrinė susintezuotų junginių struktūra pavaizduota 3 paveiksle.
3 Pav. Modifikuota ABT-737 molekulė Skaičiais sužymėti N-heteroarilo fragmentai. Aktyviausi Bcl-2
slopikliai turėjo 1 ir 2 fragmentus bei atitinkamai inhibavo baltymą (IC50) esant 17 ir 25 nM junginio
koncentracijai.
1.6 Hidantoino junginiai bei jų priešvėžinis aktyvumas
Hidantoino junginiai dažnai naudojami medicinoje, nes pasižymi plačiu farmakologiniu poveikiu [12-16]. Šį heterociklą savo struktūroje turintys junginiai taip pat pasižymi plačiu priešvėžiniu aktyvumu [49-51]. Vienas iš hidantoino junginių veikimo mechanizmų yra antiapoptotinio baltymo Bcl-2 raiškos slopinimas [10,11].
2. TYRIMO METODIKA IR METODAI
2.1 Junginių molekulinis modeliavimas
Junginių modeliavimas ir in silico analizė atlikta naudojant „Schrӧdinger 2014-2: small molecule drug discovery suite“ programinę įrangą. Iš internetinės duomenų bazės parsiunčiamas Bcl-2 baltymo kristalografinės struktūros failas (baltymo kodas:4IEH). Nepatikrintas baltymas yra netinkamas modeliavimui, nes struktūroje gali būti nereikalingos informacijos apie vandens molekules, metalų jonus, gali trūkti informacijos apie baltymo jungtis, atomus. Baltymui paruošti naudojamas „Protein Preparation Wizard“ programos įrankis, kuris ištaiso struktūros klaidas, pašalina nereikalingus struktūros elementus, nurodyo reikiamus atomų krūvius ir parinka norimą baltymo konformaciją.
Toliau sugeneruojama hidrofobinė jungimosi „kišenę“ (aktyvusis centras), kur jungsis sumodeliuotos naujos molekulės – ligandai. Aktyviajam baltymo centrui nustatyti naudojamas „Receptor Grid Generation“ programos įrankis. Remiantis baltymo ligando standartu (Bcl-2 baltymo ligando standartas 1E9) yra apibrėžiama tam tikra baltymo molekulės receptoriaus vieta, kur baltymas sąveikauja su sumodeliuotais ligandais.
Tolimesnio etapo metu vykdomas ligando kūrimas ir paruošimas analizei. Remiantis išanalizuotais ekspermentiniais duomenimis sumodeliuojamos molekulės, turinčios hidantoino fragmentą bei įvairius pakaitus 2-oje ir 5-oje padėtyse. Remiantis literatūra patikrinama ar įmanoma gautų ligandų sintezė. Molekulės braižomos programoje naudojant „2D Sketcher“ įrankį. Molekulės gali turėti skirtingą konformaciją ir atomų krūvius kintant aplinkos parametrams, todėl atliekant analizę nurodomos norimos sąlygos (pvz., terpės pH nuo 5,6 iki 8,4). Tam naudojamas programoje esantis „LigPrep“ įrankis, kuris pateikia galimus modeliuojamos molekulės konformerus.
Galiausiai vertinama sumodeliuotos molekulės ir baltymo receptoriaus sąveika. Tai atliekama „Ligand Docking“ programos įrankiu. Pasirenkamas vertinimo tikslumas, baltymo receptoriaus prisitaikymas, ir programa pagal užprogramuotus algoritmus apskaičiuoja prognozuojamą sąveikos energiją (XPGscore). Kuo energija mažesnė, tuo didesnė tikimybė, kad junginys sąveikaus su Bcl-2 receptoriumi. Energija priklauso nuo junginio sąveikų su baltymo amino rūgštimis. Sąveikas galima vizualiai įvertinti naudojant „Ligand Interaction Diagram“ programos įrankį.
2.2 Sintezės metodai
Išanalizavus sintezės metodus aprašytus literatūroje [51;52] ir pakeitus tam tikras sintezės sąlygas (pvz., naudojamas kitas tirpiklis ar katalizatorius, keičiama temperatūra) gauta sintezės schema (4 paveikslas). Junginių sintezė atliekama 5 etapais: pirmo etapo metu sintetinamas 1-acetil-2-tiohidantoinas iš glicino ir amonio tiocianato. Antro etapo metu 1-acetil-2-1-acetil-2-tiohidantoinas reaguoja su 10% HCl tirpalu ir gaunamas 2-Tiohidantoinas. Trečio etapo metu vykdoma „Knoevenagel“ kondensacija su gautu 2-tiohidantoinu ir įvairiais aldehidais (pvz. benzaldehidu) taip įvedant norimus pakaitus į 5 padėtį. Ketvirto etapo metu junginiai metilinimi metiljodidu. Paskutinio etapo metu atlikta nukleofilinė substitucija su įvairiais aminais (pvz. 4-aminobenzoine r.) taip įvedant pakaitą į 2 padėtį.
4 Pav. Sintetintų junginių bendrinė reakcijos schema Schemoje pateikti naudoti reagentai ir reakcijos
sąlygos. Pirmiausiai sintetinamas hidantoino skeletas, tuomet įvedamas pakaitas į 5-tą heterociklo padėtį, atliekama metilinimo reakciją, vėliau įvedamas pakaitas į 2-trą padėtį.
2.3 Junginių sintezė
Šiame skyriuje aprašomi pasirinktų naujų 4-imidazolinono pagrindą turinčių junginių sintezės etapai, naudoti reagentai, jų kiekiai, gauti tarpiniai produktai, jų išeigos. Tarpinių produktų tapatybė įrodyta remiantis aprašyta literatūra bei darant prielaidą, jog negavus reikiamų tarpinių produktų nepavyktų galutinių produktų sintezė.
2.3.1 1-Acetil-2-tiohidantoino sintezė
Pirmasis sintezės etapas yra 1-acetil-2-tiohidantoino sintezė ciklizuojant amino rūgštį gliciną ir amonio tiocianatą acto anhidrido aplinkoje. Sintezės eiga: atsveriamas glicinas (0,4 mol) ir amonio tiocianatas (0,45 mol), reagentai supilami į konusinę kolbą ir atsargiai užpilamas acto anhidridas ir acto rūgštis santykiu 9:1 (300 ml). Įdedama magnetinė maišyklė, pajungiamas šaldytuvas, refliuksinama 130oC temperatūroje 1 val. Po 1 val. šaldytuvas atjungiamas ir toliau kaitinama tol, kol nudistiliuojama apie 1/3 tirpiklio. Tuomet tirpalas šaldomas, iškritę kristalai filtruojami Biuchnerio piltuvu praplaunant distiliuotu vandeniu. Kristalai džiovinami, sveriami, grynumas įvertinamas plonasluoksne chromatografija tirpiklių sistemoje Acetonas: Toluenas (1:1), bei nustatant lydimosi temperatūrą. Gauti sintezės rezultatai pateikiami 1 lentelėje.
1 lentelė. Pirmo etapo sintezės rezultatai
Molekulinė masė, g/mol 158,18
Išeiga, % 59,44
Tlyd, oC 208-211
2.3.2 2-Tiohidantoino sintezė
Antrojo etapo metu gautas 1-acetil-2-tiohidantoinas yra verčiamas į 2-tiohidantoiną, atskeliant acetil- grupę nuo heterociklo amino grupės. Sintezės eiga: atsveriame 1-acetil-2-tiohidantoiną, suberiame jį į konusinę kolbą, užpilama 10% druskos rūgštis (1 g gryninamos medžiagos naudojama 10 ml tirpiklio). Įdedama magnetinė maišyklė, kaitinama 1 val. 120oC temperatūroje. Po 1 val. atsargiai suberiama aktyvuota anglis (1 g gryninamos medžiagos naudojama 0,1g anglies) ir paliekama kaitinti dar 5 minutes. Po 5 min karštą tirpalą filtruojame, filtratą paliekame vėsti. Atvėsus gauti kristalai nufiltruojami Biuchnerio piltuvu, praplaunami distiliuotu vandeniu. Balkšvi kristalai džiovinami, sveriami, grynumas įvertinamas plonasluoksne chromatografija tirpiklių sistemoje Acetonas: Toluenas (1:1), bei nustatant lydimosi temperatūrą. Gauti sintezės rezultatai pateikiami 2 lentelėje.
2 lenetelė. Antrojo etapo sintezės rezultatai
Molekulinė masė, g/mol 116,14
Išeiga, % 78,33
2.3.3 Pakaito įvedimas į 5-tą padėtį
Trečiojo sintezės etapo metu, atliekant „Knoevenagel“ kondensaciją su gautu 2-Tiohidantoinu ir aldehidais, į heterociklo 5-tą padėtį įvedami norimi pakaitai. Gauti junginiai HA[X], kur X žymi pakaito numerį (5 paveikslas). Pakaito įvedimui naudoti aldehidai: bromofenil)-2-furfurolas, 5-(4-chlorofenil)-2-furfurolas, 4-Metilbenzaldehidas, 4-brombenzaldehidas, furfurolas, 4-fluorbenzaldehidas, 4-chlorbenzaldehidas, benzaldehidas. Sintezėje naudoti 5-(4-Bromofenil)-2-furfurolo, 5-(4-chlorofenil)-2-furfurolo aldehidai buvo sintetinami pagal literatūroje aprašytą Merveino arilinimo metodą [53]. Gauta junginių išeiga atitinkamai 38.22% ir 44.19%.
5 Pav. Įvesti 5-os padėties pakaitai R1
Sintezės eiga: atsveriame 2-tiohidantoiną (0.02 mol) ir aldehidą (0.02 mol), suberiame juos į konusinę kolbą, užpilame ledinę acto rūgštį (30 ml). Įdedame magnetinę maišyklę, kaitiname 120oC
temperatūroje, kol reagentai ištirps. Ištirpus reagentams palengva dedamas amonio acetatas (0.02 mol). Sudėjus amonio acetatą staiga iškrenta nuosėdos. Jei nuosėdos neiškrinta, reakcijos mišinys pakaitinamas dar 3-7 minutes ir šaldomas. Atvėsus nuosėdos nufiltruojamos Biuchnerio piltuvu, praplaunamos distiliuotu vandeniu ir džiovinamos. Medžiagų grynumas įvertinamas plonasluoksne chromatografija tirpiklių sistemoje Acetonas:Toluenas (1:1). Esant reikšmingam priemaišų kiekiui junginiai gryninami perkristalinimo metodu dažniausiai pasirenkant acetoną, rečiau izopropanolį ar acetonitrilą, kaip tirpiklį. Gauti sintezės rezultatai pateikiami 3 lentelėje.
3 lentelė. Trečio sintezės etapo rezultatai
Junginys HA0 HA1 HA2 HA3 HA5 HA7 HA8 HA10
Molekulinė
Išeiga, % 91,34 92,48 91,36 73,62 82,61 82,42 54,75 57,63
2.3.4 Junginių metilinimas
Ketvirtojo sintezės etapo metu vygdomas heterociklo 2 padėtyje esančios sieros metilinimas, gaunami junginiai HAM[X]. Sintezės eiga: atsvertas junginys HA[X] (0.02 mol) beriamas į konusinę kolbą, ištraukus ir nusausinus metalinį natrį, jis sveriamas (0.02 mol) ir mažais gabalėliais dedamas į stiklinėlę. Įsipilame metanolį (80 ml), dalis metanolio panaudojama natriui tirpinti. Natriui ištirpus, gautas tirpalas ir likęs metanolis supilami į kolbą su junginiu HA[X]. Įdedama magnetinė maišyklė, mišinys kaitinamas 120oC temperatūroje, kol junginys HA[X] ištirpsta. Jei junginys netirpsta, ar
tirpiklio kiekis kaitinant nugaravo, papildomai įpilama metanolio. Kai junginys visiškai ištirpsta, į reakcijos mišinį lėtai sulašinamas metiljodidas (0.06 mol). Kaitinimas tęsiamas dar 10-20 minučių. Apie vykstančią reakciją sprendžiame iš pradedančių kristi nuosėdų arba tarpinių plonasluoksnės chromatografijos rezultatų. Atvėsus susidariusios nuosėdos nufiltruojamos Biuchnerio piltuvu, praplaunamos distiliuotu vandeniu ir džiovinamos. Medžiagų grynumas įvertinamas plonasluoksne chromatografija tirpiklių sistemoje Acetonas:Toluenas (1:1). Esant reikšmingam priemaišų kiekiui junginiai gryninami perkristalinimo metodu dažniausiai kaip tirpiklį pasirenkant izopropanolį ar acetoną. Gauti sintezės rezultatai pateikiami 4 lentelėje.
4 lentelė. Junginių metilinimo rezultatai
Junginys HAM0 HAM1 HAM2 HAM3 HAM5 HAM7 HAM8 HAM10
Molekulinė
masė, g/mol 363,23 318,78 232,30 297,17 208,24 236,26 252,72 218,27 Išeiga, % 81,45 86,36 57,82 89,17 39,10 88,24 51,55 50,75
2.3.5 Pakaito įvedimas į 2-trą padėtį
Paskutiniojo sintezės etapo metu vygdoma nukleofilinės substitucijos reakcija su aminais, taip į heterociklo 5-tą padėtį įvedami norimi pakaitai ir gaunami junginiai HAM[X]-[Y], kur Y žymi pakaito numerį (6 paveikslas). Pakaito įvedimui naudoti aminai: 4-chloranilinas, 4-aminobenzoinė r., 4-metoksi-2-nitroanilinas, 4-fenoksianilinas, 1-naftilaminas, 4-bromanilinas.
6 Pav. Įvesti 2-tros padėties pakaitai R2
Atsveriamas junginys HAM[X] (0.002 mol), aminas (0.0022 mol) ir kalio acetatas (0.0022 mol), medžiagos suberiamos į mėgintuvėlį ir užpilama ledinė acto rūgštis (6 ml). Įdedama magnetinė maišyklė, prijungiamas šaldytuvas, refliuksinama 140oC temperatūroje 4-8 valandas. Apie vykstančią
reakciją sprendžiame iš pradedančių kristi junginio nuosėdų ar besiskiriančių metilmerkaptano dujų, kurios turi savitą nemalonų kvapą ir dažo švino (II) acetato popierėlį. Reakcijai vykstant lėtai, drėgnas švino (II) acetato popierėlis nusidažo geltonai, reakcijai intensyvėjant, spalva tamsėja ir popierėlis nusidažo juodai. Apie sėkmingai vykstančią reakciją bei jos pabaigą galima spręsti iš tarpinių plonasluoksnės chromatografijos rezultatų. Įvykus reakcijai, mėgintuvėlis šaldomas, susidariusios nuosėdos (junginių HAM5-6 ir HAM7-7 nuosėdos atšaldžius nesusidarė, todėl į tirpalą įpilta distiliuoto vandens iškristalinti medžiagą) nufiltruojamos Biuchnerio piltuvu, praplaunamos distiliuotu vandeniu ir džiovinamos. Gautų junginių grynumas įvertinamas plonasluoksnės chromatografijos metodu tirpiklių sistemose Acetonas:Toluenas (1:1) bei Etilacetatas:Heksanas (1:1). Medžiagos grynintos aktyvuota anglimi ir perkristalinimo metodu įvairiuose tirpikliuose priklausomai nuo junginio tirpumo.
2.4 Susintetintų junginių fiziko-cheminė analizė
2.4.1 UV spektroskopija
Junginių identifikavimas atliktas užrašant junginių UV spektrus. UV spektrai gauti naudojant fotodiodų matricos detektorių Waters 996 PDA (Waters Corporation, Milford, USA).
2.4.2 IR spektroskopija
Junginių identifikavimas atliktas užrašant IR spektrus spektrometru Thermo Nicolet Matson
300 KBr tabletėje.
2.4.3 Lydimosi temperatūros nustatymas
Medžiagų lydymosi temperatūros nustatomos Koflerio prietaisu. Ant objektyvinio stiklelio dedamas labai mažas medžiagos kiekis, tuomet ant viršaus dedamas dar vienas švarus stiklelis. Kristalai patrinami tarp stiklelių, kad susismulkintų ir tolygiai pasiskirstytų. Stikleliai padedami ant kaitinamo objektyvinio stalelio su įtaisytu termometru temperatūros fiksavimui. Pro okuliarą stebimi kristalų pokyčiai. Lydymosi pradžia laikomas pirmas medžiagos lašo susidarymas, o pabaiga fiksuojama, kai visi kristalai išsilydo.
2.4.4 Efektyvioji skysčių chromatografija
Junginių grynumas įvertintas išanalizavus chromatogramos pikus. Efektyvioji skysčių chromatografija (ESC) atlikta su Waters 2695 chromatografu (Waters Corporation, Milford, USA) ir fotodiodų matricos detektoriumi Waters 996 PDA (Waters Corporation, Milford, USA). Analizės metu injekuota 10 μl tiriamojo junginio dimetilformamido tirpalo. Naudotas gradientinis eliuavimas: 0,1% trifluoracto rūgšties vandeninis tirpalas (A) ir acetonitrilas (B). Eliucija: 0 min – 80% A ir 20% B, 15
min – 20% A ir 80% B, 20 min – 10% A ir 90% B, 21 min – 80% A ir 20% B. Junginių aptikimas vygdomas 200-600 nm bangų intervale.
2.5 Junginių priešvėžinio aktyvumo nusatatymas
Pirminis junginių priešvėžinio aktyvumo nustatymas atliktas naudojant SLPV NCI-H146 ląstelių liniją. Junginių poveikis ląstelėms įvertintas XTT ląstelių proliferacijos tyrimu.
2.5.1 Ląstelių kultivavimas
Ląstelės auginamos paruoštoje terpėje, kuri susideda iš 88 dalių mitybinės rpmi-1640 terpės su gliukoze ir natrio bikarbonato buferine sistema, 1 dalies natrio piruvato, 1 dalies antibiotikų, 10 dalių fetalinio veršiuko serumo. Inkubacija vygdoma 37oC esant 5% CO
2 koncentracijai. Didėjant
ląstelių koncentracijai terpėje, terpė drumsčiasi, keičiasi jos spalva. Norint palaikyti ląstelių gyvybingumą, jas reikia periodiškai persėti į naują terpę.
2.5.2 Ląstelių skaičiaus ir gyvybingumo nustatymas
Ląstelių skaičius terpėje įvertinamas pasitelkiant hemocitometrą. Hemocitometras padalintas į 9 didelius kvardratus, kurių plotas yra 1mm2. Hemocitometro gylis yra 0,1mm, todėl vieno didelio
kvadrato bandinio tūris yra 100 nl. Tuometląstelių skaičius 1ml terpės yra lygus suskaičiuotų ląstelių vidurkiui didžiuosiuose kvadratuose x 10000 (dažniausiai skaičiuojami 4 kampiniai kvadratai). Gyvų ir žuvusių ląstelių atskyrimui naudojamas tripano mėlio tirpalas. Žuvusių ląstelių membranos praleidžia dažą ir ląstelės nusidažo tamsiai mėlyna spalva, o gyvos ląstelės neabsorbuoja dažo, todėl lieka nepakitusios. Ląstelių suspensija sumaišoma su tripano mėliu lygiomis dalimis. Apskaičiuojamas gyvų ir mirusių ląstelių kiekis. Tuomet santykinis ląstelių gyvybingumas apskaičiuojamas gyvų ląstelių skaičių dalinant iš visų ląstelių skaičiaus.
2.5.3 XTT ląstelių proliferacijos tyrimas
Šis tyrimas paremtas antros kartos tetrazolo dažo XTT redukavimu. Gelsvas XTT dažas redukuojamas gyvų ląstelių metabolinių produktų virsta į ryškiai oranžinės spalvos formazano chromoforą. Kuo daugiau metaboliškai aktyvių ląstelių yra bandinyje, tuo spalva intensyvesnė. Atlikus bandymą lyginamos gautos bandinių absorbcijos 450nm ir 620nm bangų ilgiuose. Specifinė bandinio absorbcija gaunama iš absorbcijų skirtumo atimant terpės be ląstelių paveiktos XTT dažu absorbciją. Atlikus tyrimo optimizavimą nustatyta, jog plokštelės šulinėlyje turėtų būti 30 tūkst. ląstelių, o absorbcija tikrinama praėjus 6 valandoms po XTT dažo uždėjimo.
Tyrimas vygdomas į plokštelės šulinėlius užnešant 100 µl terpės su ląstelėmis (ląstelių koncentracija terpėje 300 tūkst. vnt./1ml). Į šulinėlius su ląstelėmis tripletais po 1µl uždedami HAM[X]-[Y] junginio mėginiai paruošti 5 µl 0,1mol/l koncentracijos junginio tirpalą DMSO praskiedus 495 µl 96,5% etanoliu. Galutinė tiriamo junginio koncentracija šulinėlyje yra 10 µM. Kontoliniai šulinėlių tripletai: mitybinė terpė rpmi-1640 be ląstelių, terpė su ląstelėmis, terpė su ląstelėmis, kurioje yra 1% etanolio, terpė su ląstelėmis, kuriose yra 10 µM doksorubicino koncentracija. Ląstelės inkubuojamos 48 valandas, tuomet į šulinėlius užnešama 50µl XTT dažo su aktyvatoriumi. Po 6 valandų matuojama absorbcija ir vertinamas junginių poveikis ląstelėms.
2.6 Statistinė analizė
Statistinė analizė atlikta naudojant „Microsoft Office Exel 2010“ programinę įrangą. Skaičiuotas Spirmeno ranginės koreliacijos koeficientas, rezultatų standartinis kvadratinis nuokrypis, Student‘o t-testas. Skirtumai laikomi statistiškai patikimais jei gauta p reikšmė ≤0.05 (n≥3).
3.REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1 Junginių molekulinio modeliavimo tyrimo rezultatai
Šiame skyriuje aptariami molekulinio modeliavimo in silico rezultatai gauti naudojant „Schrӧdinger 2014-2: small molecule drug discovery suite“ programinę įrangą. Gauti duomenys panaudoti junginių molekulių, turinčių galimą priešvėžinį aktyvumą, kryptingoje sintezėje.
3.1.1 Sumodeliuotų junginių atrankos rezultatai
Modeliuojant junginių molekules buvo sukurta 5097 ligandų biblioteka. Buvo nustatyti 808 ligandai pasižymintys vidutiniu ir dideliu prognozuojamu aktyvumu (sąveikos su Bcl-2 baltymu energija E >4 kcal/mol).Toliau buvo atlikta junginių atranka pagal tam tikrus parametrus (Lipinskio penketo taisyklė ir jos variacijos), kurie yra taikomi norint sukurti molekulę turinčią panašias į jau sukurtų vaistų farmakokinetines savybes ir biologinį aktyvumą vartojant peroraliai[17, 18]:
1) Numatomas junginio peroralinis pasisavinimas >60%; 2) Molekulinė junginio masė tarp 180-500;
3) Ne daugiau 5 vandenilinio ryšio donorai;
4) Ne daugiau nei 10 vandenilinio ryšio akceptorių;
5) N-oktanolio/vandens pasiskirstymo koeficientas (log P) nuo -0,4 iki +5,6; 6) Atomų skaičius molekulėje tarp 20-70;
7) Polinis molekulės paviršius ne didesnis nei 140 Ǻ2.
Sintezei iš 5097 ligandų buvo atrinkti 45, kurie pažeidė ne daugiau nei 1 nustatytą parametrą.
3.1.2 Susintetintų junginių prognozuojamas aktyvumas
Atlikus in silico junginių įvertinimą gautos prognozuojamos junginių HAM[X]-[Y] sąveikos su Bcl-2 baltymu energijos E. Rezultatai pateikiami 5. Susintetintų junginių sąveikos energija E svyravo nuo -4,274 iki –6,725 kcal/mol. Prognozuojamas aktyviausias junginys HAM10-6.
5 lentelė. Junginių HAM[X]-[Y] sąveikos su Bcl-2 energija (XPGscore) Pabrauktas skaičius
lentelėje žymi sėkmingai susintezuotus junginius.
3.1.3 Prognozuojamas sintetintų junginių struktūros-aktyvumo ryšys
Junginių sąveikos energija priklauso nuo to, kiek ryšių su baltymo Bcl-2 receptoriaus vietoje esančiomis amino rūgštimis sudarys junginys. Išanalizavus gautus sąveikos energijos E rezultatus (5 lentelė) pastebėta, jog aktyvesni tie junginiai, kurie 5-oje 4-imidazolinono žiedo padėtyje turi 5-(4-bromofenil)-2-furfurolo, 5-(4-chlorofenil)-2-furfurolo ir 4-fluorbenzeno pakaitus, o 2-oje padėtyje turi paraminobenzoinės r. ir 4-fenoksianilino pakaitus. Receptoriaus jungimosi vietos analizė panaudojus „Ligand Interaction Diagram“ programos įrankį parodė, kad pakaito aromatinis benzeno žiedas esantis 5-oje hidantoino žiedo padėtyje užima tą pačią poziciją kaip ir inhibitoriaus 1E9 4-chlorfenilo grupė kristalografinėje Bcl-2 baltymo struktūroje (8 paveikslas) bei sudaro su 63Fenilalaninu π-π ryšį (7 ir 9 paveikslai). Tačiau kai kuriais atvejais kai hidantoino žiedo 2-oje padėtyje yra 4-fenoksianilino pakaitas molekulė jungimosi „kišenėje“ apsiverčia (10 paveikslas) ir aromatinis benzeno žiedas esantis 5-oje hidantoino žiedo padėtyje sąveikauja su 161Tirozinu sudarydamas tarp žiedų π-π ryšį. Taip pat pastebėta, jog fenoksianilino pakaitas leidžia molekulei prisiartinti arčiau jungimosi kišenės, todėl imidazolinono žiede esanti –NH- grupė sudaro su 104Glicinu vandenilinį ryšį. Vienas arba abu 4-fenoksianilino žiedai tuo pačiu metu gali sudaryti π-π ryšius su 63Fenilalaninu ir 67Tirozinu (11 paveikslas).
7 Pav. Junginio 1E9 sąveikos Bcl-2 baltymo receptoriuje. Inhibitoriaus 1E9 molekulės chlorfenilo
fragmentas sąveikauja su 63Fenilalaninu sudarydamas π-π ryšį, Taip pat sudaromi vandeniliniai ryšiai su 66Argininu ir 62Aspartatu.
8 Pav. Junginio HAM0-4 ir 1E9 pozicija Bcl-2 baltymo receptoriuje. Junginio HAM0-4
5-(4-bromofenil)-2-furfurolo pakaito pozicija atitinka inhibitoriaus 1E9 chlorfenilo fragmento poziciją. Sudaroma ta pati sąveika su receptoriaus 63 amino rūgštimi.
9 Pav. Junginio HAM0-4 sąveikos Bcl-2 baltymo receptoriuje Junginys sąveikauja su 63Fenilalaninu
sudarydamas π-π ryšį.
10 Pav. Junginio HAM10-6 ir 1E9 pozicija Bcl-2 baltymo receptoriuje Junginio HAM10-6
4-fenoksianilino pakaito pozicija atitinka inhibitoriaus 1E9 chlorfenilo fragmento poziciją Sudaroma ta pati sąveika su receptoriaus 63 amino rūgštimi.
11 pav. JunginioHAM10-6 sąveikos Bcl-2 baltymo receptoriuje Junginys HAM10-6 sudaro π-π
ryšius su 63Fenilalaninu ir 67Tirozinu ir vandenilinį ryšį su 104Glicinu.
3.2 Junginių sintezės rezultatai
Susintetinta 14 naujų 4-imidazolinono pagrindą turinčių junginių HAM[X]-[Y]. Junginių autentiškumas patikrintas „PubChem“ duomenų bazėje. Sintezės rezultatai pateikiami 6 lentelėje.
6 Lentelė. 5-to sintezės etapo rezultatai
Junginys Formulė Molekulinė
masė, g/mol Išeiga, %
Tlyd., oC
HAM0-4 452,263 93,31 >300
HAM1-6 455,899 89,02 >300
HAM2-6 369,422 92,86 242-244 HAM3-6 434,291 78,09 280-282 HAM5-6 345,357 75,43 221-223 HAM7-1 315,734 69,48 206-209 HAM7-4 325,298 38,23 >280 HAM7-5 356,312 42,31 269-271 HAM7-6 373,386 81,78 250-252 HAM7-7 331,348 76,57 234-236 HAM8-6 389,840 74,71 >280 HAM10-6 355,395 77,91 227-229
HAM10-9 342,194 77,62 247-249
Sintetintų 5-(4-Bromofenil)-2-furfurolo, 5-(4-chlorofenil)-2-furfurolo aldehidų išeiga atitinkamai 38.22% ir 44.19%. Ukrainos mokslininkai atlikę arilinimo reakcijas gavo 45-60% junginių išeigas [54]. Mokslininkai, kurių darbo aprašu remtasi sintezėje [53], atliekant arilinimo reakcijas su furfurolu gavo 58-60% junginio išeigas. Palyginus turimus šio sintezės etapo duomenis galime daryti išvadą, jog arilinimo reakcija vyko ne optimaliomis sąlygomis (pvz., per greit lašinamas CuCl2,
nepalaikyta pastovitemperatūra), todėl gauta išeiga buvo mažesnė nei prognozuota.
Paskutiniojo sintezės etapo junginių sintezės išeiga buvo 23.30-93.31%. Mokslininkai, kurių aprašu remtasi atliekant šią reakciją [52], gavo 54-87% junginių išeigas. Sintezės sąlygos buvo šiek tiek modifikuotos , todėl kai kurių junginių išeigos buvo žymiai mažesnės nei prognozuota.
3.3 Fiziko-cheminės analizės rezultatai
3.3.1 Efektyviosios skysčių chromatografijos rezultatai
Junginių grynumas nustatytas skaičiuojant didžiausią plotą po kreive. Gauti ESC rezultatai pateikiami 7 lentelėje, gautos junginių chromatogramos pateikiamos 1 priede.
7 lentelė. Susintetintų junginių ESC analizės rezultatai Junginys Junginio sulaikymo laikas,
min
Didžiausias plotas po kreive (junginio grynumas), % HAM0-4 12,173 95,34 HAM1-6 15,657 93,82 HAM2-5 14,654 96,62 HAM2-6 14,628 98,97 HAM3-6 17,176 97,42 HAM5-6 10,830 98,77 HAM7-1 14,343 90,93 HAM7-4 10,124 72,57 HAM7-5 12,238 83,67 HAM7-6 14,800 98,53 HAM7-7 11,623 83,04 HAM8-6 16,702 96,23 HAM10-6 13,869 97,40 HAM10-9 14,021 96,42
Junginių HAM7-4, HAM7-5, HAM7-7 grynumas <90%, todėl tolesni bandymai su jais nebeatliekami.
3.3.2 UV spektroskopijos rezultatai
Junginiai identifikuoti užrašant jų UV spektrą. Rezultatai pateikiami 8 lentelėje, UV spektrai pateikiami 2 priede.
8 lentelė. Susintetintų junginių UV spektrų pikai Junginys Absorbcijos maksimumas
HAM0-4 203,1; 279,5; 423,4 HAM1-6 201,9; 274,7; 416,2 HAM2-5 201,9; 242,9; 351,8 HAM2-6 203,1; 235,9; 348,2 HAM3-6 201,9; 242,9; 351,8 HAM5-6 204,3; 356,6 HAM7-1 201,9; 250,0; 349,4 HAM7-6 201,9; 234,7; 344,7 HAM8-6 241,8; 350,6 HAM10-6 201,9; 234,7; 337,5 HAM10-9 203,1; 250,0; 348,2
3.3.3 IR spektroskopijos rezultatai
Junginių struktūra patvirtinta atlikus IR spektroskopiją. Gauti rezultatai pateikiami 9 lentelėje, užrašyti junginių IR spektrai pateikiami 3 priede.
9 lentelė. Susintetintų junginių IR spektrų pikai ir juos atitinkančios funkcinės grupės
Junginys Funkcinė grupė Pikai
HAM0-4 -C=C- (žiede) 1574; 1520 -C-N- 1296; 1262 -C=O 1699 -C=C- 1651 HAM1-6 -C=C- (žiede) 1528; 1505 -C-N- 1299; 1228 -C=O 1698 -C=C- 1654 -C-O- 1105 HAM2-5 -C=C- (žiede) 1579; 1522
-C-N- 1270; 1232 -C=O 1713 -C=C- 1652 -NO2 1512; 1351 HAM2-6 -C=C- (žiede) 1582; 1519 -C-N- 1296; 1230 -C=O 1698; 1660 -C=C- 1638 -C-O- 1124 HAM3-6 -C=C- (žiede) 1584; 1505 -C-N- 1291; 1236 -C=O 1698; 1663 -C=C- 1639 -C-O- 1129 HAM5-6 -C=C- (žiede) 1584; 1506 -C-N- 1292; 1233 -C=O 1701; 1667 -C=C- 1642 -C-O- 1122 HAM7-1 -C=C- (žiede) 1573; 1520; 1514; 1490 -C-N- 1291; 1232 -C=O 1696; 1659 -C=C- 1641 HAM7-6 -C=C- (žiede) 1587; 1537; 1497 -C-N- 1293; 1243 -C=O 1697; 1667 -C=C- 1650 -C-O- 1122 HAM8-6 -C=C- (žiede) 1582; 1525; 1505 -C-N- 1287; 1222 -C=O 1698 -C=C- 1654 -C-O- 1128; 1105 HAM10-6 -C=C- (žiede) 1531; 1515; 1493; 1484 -C-N- 1290; 1241 -C=O 1696; 1664 -C=C- 1654 -C-O- 1124 HAM10-9 -C=C- (žiede) 1572; 1528; 1508; 1490 -C-N- 1290; 1226 -C=O 1695; 1660 -C=C- 1650
3.4 Junginių priešvėžinio aktyvumo tyrimo rezultatai
Atlikus priešvėžinio aktyvumo tyrimą buvo nustatytas susintetintų junginių poveikis NCI-H146 SLPV ląstelėms. Ląstelių gyvybingumo įvertinims parodė, jog ląstelės tinkamos priešvėžinio aktyvumo tyrimams (93,75% gyvų ląstelių). Junginio HAM2-5 mėginio tirpumas ląstelių terpėjė pakito ir iškrito tiriamos medžiagos nuosėdos. Nebuvo galima įvertinti tikslaus medžiagos kiekio mėginyje, todėl gauti rezultatai nevertinti. Nustatytos junginių specifinės absorbcijos pateikiamos 12 paveiksle. Remiantis junginių absorbcijomis apskaičiuotas junginių poveikis NCI-H146 ląstelėms (13 paveikslas). Sumažėjusi absorbcija rodo sumažėjusį ląstelių mitochondrijų metabolinį aktyvumą ir slopinamą ląstelių proliferaciją [55]. Junginiai HAM10-9, HAM1-6, HAM3-6, HAM5-6, HAM7-6, HAM8-6, HAM10-6 slopino daugiau nei 50% vėžinių ląstelių (p<0,05). Mažiausiai metaboliškai aktyvių ląstelių (9,67±15,43%) liko terpėje su junginiu HAM10-6 (p<0,01). Pakartojus bandymą su junginiu HAM7-1 gauti rezultatai parodė, jog junginys slopino 67,18±12,82% (p<0,01) ląstelių, lyginant su kontroline 1% etanoline terpe. Teigiamai junginių kontrolei pasirinktas doksorubicinas slopino 89,69±1,51% ląstelių proliferaciją (p<0,01). Pakartojus bandymą antrą kartą rezultatai atsikartojo.
Gauti susintetintų junginių priešvėžinio aktyvumo tyrimo rezultatai palyginti su ABT-737 priešvėžinio aktyvumo tyrimais naudojant NCI-H146 ląstelių liniją [56]. Nustatyta, jog esant 10 µM koncentracijai mėginyje junginys ABT-737 nepalieka gyvybingų ląstelių, todėl yra žymiai aktyvesnis už visus susintetintus HAM[X]-[Y] junginius.
12 Pav. Apskaičiuotos junginių specifinės absorbcijos Absorbcijos matuotos po 6 val. nuo XTT dažo
suleidimo į terpę. Mažėjanti absorbcija rodo sumažėjusią ląstelių proliferaciją. 0,645 0,505 0,519 0,503 0,279 0,267 0,291 0,148 0,181 0,276 0,062 -0,1 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 Etanolis 1%
HAM2-4 HAM2-6 HAM0-4 HAM10-9 HAM1-6 HAM3-6 HAM5-6 HAM7-6 HAM8-6 HAM10-6
SPE CIF IN Ė A BS OR BCIJA
13 Pav. Susintetintų junginių poveikis NCI-H146 ląstelėms. Junginiai HAM2-4, HAM2-6 ir
HAM10-9 nepasižymėjo priešvėžiniu aktyvumu. Junginio HAM10-6 aktyvumas buvo panašus į doksorubicino aktyvumą (slopinta ~90% ląstelių).
3.5 In silico ir in vitro rezultatų palyginimas
Įvertinus statistinį patikimumą nustatyta, kad junginių HAM2-6 ir HAM0-4 rezultatai nėra statistiškai patikimi (p>0.05), todėl skaičiuojant koreliaciją tarp in vivo ir in vitro rezultatų jie nebuvo įtraukti. Rezultatai pateikiami 14 paveiksle.
14 Pav. Koreliacija tarp teorinio junginių aktyvumo ir in vitro tyrimų rezultatų Paveiksle sužymėti
statistiškai patikimų bandymų rezultatai (p<0.05). Gautas 0.249 koreliacijos koeficientas rodo silpną koreliaciją tarp in silico ir in vitro ekspermentinių rezultatų.
100,00 78,39 80,56 77,97 43,33 41,42 45,14 22,96 28,08 42,81 9,67 10,31 -10 10 30 50 70 90 110 130 N ep av eikt ų ląs teli ų k ie kis % R² = 0,249 -7 -6,5 -6 -5,5 -5 -4,5 0 10 20 30 40 50 60 Ju n gin ių są veik os en er gija Δ E
Galime teigti, jog junginiai turintys 4-fenoksianilino pakaitą pasižymėjo priešvėžiniu aktyvumu, nes visi junginiai, išskyrus HAM2-6, turintys šį pakaitą slopino daugiau nei 50% ląstelių. In
silico rezultatai taip pat prognozavo, jog šis pakaitas turės didžiausią įtaką 2-oje 4-imidazolinono žiedo
padėtyje. Silpnesniam junginio HAM2-6 poveikiui tikriausiai turėjo įtakos 4-metilbenzaldehido pakaitas 5-oje heterociklo padėtyje. Nors 4-bromanilino pakaitas pasižymėjo nedideliu, palyginus su kitais pakaitais, prognozuojamu aktyvumu, junginys HAM10-9 slopino 56,67% ląstelių. Tam tikriausiai turėjo įtakos 2-oje heterociklo padėtyje esantis benzeno pakaitas, nes ši pakaitą turintis junginys HAM10-6 remiantis ekspermentiniais in silico ir in vitro rezultatais buvo aktyviausias. Nors prognozuojama paraaminobenzoinės rūgšties pakaito 2-oje 4-imidazolinono žiedo padėtyje įtaka junginio sąveikai buvo viena iš didžiausių, junginiai HAM0-4 ir HAM2-4 turintys šį pakaitą buvo neaktyvūs.
4.IŠVADOS
1. Atlikus molekulinio modeliavimo in silico tyrimą sintezei atrinkti 45 junginiai pasižymintys palankiomis farmakodinaminėmis savybėmis bei prognozuojamu priešvėžiniu aktyvumu. 2. Prognozuojamam junginių aktyvumui didžiausią įtaką turėjo 5-(4-bromofenil)-2-furfurolo, 5-(4-chlorofenil)-2-furfurolo, 4-fluorbenzeno pakaitai 5-oje ir paraminobenzoinės r., 4-fenoksianilino pakaitai 2-oje 4-imidazolinono žiedo padėtyje.
3. Sėkmingai susintetinta 14 naujų 4-imidazolinono pagrindą turinčių junginių, kurių numatoma sąveikos energija su Bcl-2 baltymu svyravo nuo -4,274 iki -6,725.
4. Atlikus susintetintų junginių IR spektroskopiją ir ESC analizę sėkmingai nustatyta jų struktūra, o grynumas siekė nuo 72,57% iki 98,97%. 11 junginių grynumas buvo >90%, todėl jie pasirinkti pirminiam priešvėžinio aktyvumo įvertinimui.
5. Atlikus 11 junginių priešvėžinio aktyvumo tyrimą XTT ląstelių proliferacijos metodu nustatyti 8 junginiai, kurie turėjo žymų priešvėžinį aktyvumą ir slopino daugiau nei 50% vėžinių ląstelių (p<0,05).
6. Palyginus in silico ir in vitro rezultatus nustatytas 0,249 koreliacijos koeficientas. Junginys HAM10-6, kuris in silico duomenimis buvo aktyviausias tarp ekspermentiškai susintetintų junginių, atlikus pirminį priešvėžinio aktyvumo įvertinimą turėjo didžiausią aktyvumą slopinęs 90,33±15,43% NCI-H146 vėžinių ląstelių (p<0,01).
5.PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS
Magistriniame darbe junginių HAM2-6, HAM0-4, HAM10-9, HAM1-6, HAM3-6, HAM5-6, HAM7-6, HAM8-6, HAM10-6 poveikis SLPV NCI-H146 ląstelėms ištirtas esant 10 µM medžiagos koncentracijai mėginiuose. Rekomenduojama atlikti papildomus bandymus naudojant skirtingas mėginių koncentracijas ir apskaičiuoti šių junginių IC50 minėtai ląstelių linijai, taip patvirtinant galimą
priešvėžinį aktyvumą. Rekomenduojama praplėsti junginių priešvėžinio aktyvumo įvertinimą naudojant kito tipo priešvėžines ląsteles su padidėjusia Bcl-2 ekspresija (pvz., ŪML ląstelių liniją). Rekomenduojama patobulinti susintetintų junginių HAM7-4, HAM7-7, HAM7-5, turinčių 4-imidazolinono žiedo 5 padėtyje fluorbenzeno pakaitą, gryninimą, kad jie butų tinkami in vitro tyrimams ir priešvėžinio aktyvumo įvertinimui.
6.LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. GLOBOCAN2012 fact sheet. Prieiga per internetą:
http://www.globocan.iarc.fr/Pages/fact_sheets_cancer.aspx [Tikrinta 2015 Kovą].
2. Hanahan D, Weinberg RA. The hallmarks of cancer: The Next Generation. Cell 2011;144:646 – 67. 3. Youle RJ, Strasser A. The BCL-2 protein family: Opposing activities that mediate cell death. Nature Rev Mol Cell Biol 2008;9:47−59
4. Otake Y, Soundararajan S, Sengupta TK, Kio EA, Smith JC, Pineda-Roman M, Stuart RK, Spicer EK, Fernandes DJ. Overexpression of nucleolin in chronic lymphocytic leukemia cells induces stabilization of bcl2 mRNA. Blood 2007;109:3069–75.
5. Chonghaile TN, Letai A. Mimicking the BH3 domain to kill cancer cells. Oncogene 2009;27:149-157.
6. Hann CL, Daniel VC, Sugar EA, Dobromilskaya I, Murphy SC, Cope L, Lin X, Hierman JS, Wilburn DL., Watkins DN, Rudin CM. Therapeutic Efficacy of ABT-737, a Selective Inhibitor of BCL-2, in Small Cell Lung Cancer. Cancer Res 2008;68:2321–28.
7. Shoemaker AR, Mitten MJ, Adickes J, Ackler S, Refici M, Ferguson D, Oleksijew A, O'Connor JM, Wang B, Frost DJ, Bauch J, Marsh K, Tahir SK, Yang X, Tse C, Fesik SW, Rosenberg SH, Elmore SW. Activity of the Bcl-2 family inhibitor ABT-263 in a panel of small cell lung cancer xenograft models. Clin Cancer Res 2008;14:3268-77.
8. Souers AJ, Leverson JD, Boghaert ER, Ackler SL, Catron ND, Chen J, Dayton BD, Ding H, Enschede SH, Fairbrother WJ, Huang DC, Hymowitz SG, Jin S, Khaw SL, Kovar PJ, Lam LT, Lee J, Maecker HL, Marsh KC, Mason KD, Mitten MJ, Nimmer PM, Oleksijew A, Park CH, Park CM, Phillips DC, Roberts AW, Sampath D, Seymour JF, Smith ML, Sullivan GM, Tahir SK, Tse C, Wendt MD, Xiao Y, Xue JC, Zhang H, Humerickhouse RA, Rosenberg SH, Elmore SW. ABT-199, a potent and selective BCL-2 inhibitor, achieves antitumor activity while sparing platelets. Nat Med 2013;19:202-8.
9. Konopleva M, Watt J, Contractor R, Tsao T, Harris D, Estrov Z, Bornmann W, Kantarjian H, Viallet J, Samudio I, Andreeff M. Mechanisms of Antileukemic Activity of the Novel Bcl-2 Homology Domain-3 Mimetic GX15-070 (Obatoclax). Cancer Res 2008;68:3413-20.
10. Kavitha CV, Nambiar M, Ananda Kumar CS, Choudhary B, Muniyappa K, Rangappa KS, Raghavan SC. Novel derivatives of spirohydantoin induce growth inhibition followed by apoptosis in leukemia cells. Biochem Pharmacol 2009;77:348–63.
11. Kavitha CV, Nambiar M, Narayanaswamy PB, Thomas E, Rathore U, Ananda Kumar CS, Choudhary B, Rangappa KS, Raghavan SC. Propyl-2-(8-(3,4-Difluorobenzyl)-29,59-Dioxo-8-Azaspiro[Bicyclo[3.2.1] Octane-3,49-Imidazolidine]-19-yl) Acetate Induces Apoptosis in Human
Leukemia Cells through Mitochondrial Pathway following Cell Cycle Arrest. PLoS ONE 2013;8:e69103.
12. Thenmozhiyal JC, Wong PTH, Chui WK. Anticonvulsant activity of
phenylmethylene-hydantoins: A structure-activity relationship study. J Med Chem 2004;47:1527–35. 13. Bakalova A, Buyukliev R, Tcholakova I, Momekov G, Konstantinov S, Karaivanova M. Synthesis, physicochemical investigation and cytotoxic activity of new Pt(II) complexes with hydantoin ligands. Eur J Med Chem 2003;38:627-32.
14. Opacić N, Barbarić M, Zorc B, Cetina M, Nagl A, Frković D, Kralj M, Pavelić K, Balzarini J, Andrei G, Snoeck R, De Clercq E, Raić-Malić S, Mintas M. The novel L- and D-amino acid derivatives of hydroxyurea and hydantoins: synthesis, X-ray crystal structure study, and cytostatic and antiviral activity evaluations. J Med Chem 2005;48:475-82.
15. Carmi C, Cavazzoni A, Zuliani V, Lodola A, Bordi F, Plazzi PV, Alfieri RR, Petronini PG, Mor M. 5-Benzylidene-hydantoins as new EGFR inhibitors with antiproliferative activity. Bioorg Med Chem Lett 2006;16:4021-5.
16. McEvoy GK. AHFS drug information 2004. American Society of Health-System Pharmacists:2117–20.
17. Ghose AK, Viswanadhan VN, Wendoloski JJ. A knowledge-based approach in designing combinatorial or medicinal chemistry libraries for drug discovery. 1. A qualitative and quantitative characterization of known drug databases. J Comb Chem 1999;1:55-68.
18. Veber DF, Johnson SR, Cheng HY, Smith BR, Ward KW, Kopple KD. Molecular Properties That Influence the Oral Bioavailability of Drug Candidates. J Med Chem 2002;45:2615–23.
19. Friesner RA, Murphy RB, Repasky MP, Frye LL, Greenwood JR, Halgren TA, Sanschagrin PC, Mainz DT. Extra Precision Glide: Docking and Scoring Incorporating a Model of Hydrophobic Enclosure for Protein-Ligand Complexes. J Med Chem 2006;49:6177–96.
20. Halgren TA, Murphy RB, Friesner RA, Beard HS, Frye LL, Pollard WT, Banks JL. Glide: A New Approach for Rapid, Accurate Docking and Scoring. 2. Enrichment Factors in Database Screening. J Med Chem 2004;47:1750–59.
21. Friesner RA, Banks JL, Murphy RB, Halgren TA, Klicic JJ, Mainz DT, Repasky MP, Knoll EH, Shelley M, Perry JK, Shaw DE, Francis P, Shenkin PS. Glide: A New Approach for Rapid, Accurate Docking and Scoring. 1. Method and Assessment of Docking Accuracy. J Med Chem 2004;47:1739– 49.
22. Perona R. Cell signalling: growth factors and tyrosine kinase receptors. Clin Transl Oncol 2006;8:77–82.
23. Burkhart DL, Sage J. Cellular mechanisms of tumour suppression by the retinoblastoma gene. Nat Rev Cancer 2008;8:671–82.
24. Talmadge JE, Fidler IJ. AACR Centennial Series: The Biology of Cancer Metastasis: Historical Perspective. Cancer Res 2010;70:5649–69.
25. Berx G, Van Roy F. Involvement of members of the cadherin superfamily in cancer. Cold Spring Harb Perspect Biol 2009;1:a003129.
26. Blasco MA. Telomeres and human disease: ageing, cancer and beyond. Nat Rev Genet 2005;6:611–22.
27. Baeriswyl V, Christofori G. The angiogenic switch in carcinogenesis. Semin Cancer Biol 2009;19:329–37.
28. Danial NN, Korsmeyer SJ. Cell death: critical control points. Cell. 2004 Jan 23; 116(2):205-19. 29. Green DR, Reed JC. Mitochondria and apoptosis. Science. 1998 Aug 28; 281(5381):1309-12. 30. Adams JM, Cory S. The Bcl-2 apoptotic switch in cancer development and therapy. Oncogene 2007;26:1324–37.
31. Letai A, Bassik MC, Walensky LD, Sorcinelli MD, Weiler S, Korsmeyer SJ. Distinct BH3 domains either sensitize or activate mitochondrial apoptosis, serving as prototype cancer therapeutics. Cancer Cell 2002;2:183–92.
32. Korsmeyer SJ, Shutter JR, Veis DJ, Merry DE, Oltvai ZN. Bcl-2/Bax: a rheostat that regulates an anti-oxidant pathway and cell death. Semin Cancer Biol 1993;4:327-32.
33. Muchmore SW, Sattler M, Liang H, Meadows RP, Harlan JE, Yoon HS, Nettesheim D, Chang BS, Thompson CB, Wong SL, Ng SL, Fesik SW. X-ray and NMR structure of human Bcl-xL, an inhibitor of programmed cell death. Nature 1996;381:335–41.
34. Rai KR, Moore J, Wu J, Novick SC, O’Brien SM. Effect of the addition of oblimersen (Bcl-2 antisense) to fludarabine/cyclophosphamide for relapsed/refractory chronic lymphocytic leukemia (CLL) on survival in patients who achieve CR/nPR: Five-year follow-up from a randomized phase III study. J Clin Oncol 2008;26:7008.
35. Jones L. Gossypol and some other terpenoids, flavonoids, and phenols that affect quality of cottonseed protein. J Am Oil Chemists Soc 1979;56:727–30.
36. Liu G, Kelly WK, Wilding G, Leopold L, Brill K, Somer B. An Open-Label, Multicenter, Phase I/II Study of Single-Agent AT-101 in Men with Castrate-Resistant Prostate Cancer (CRPC) .Clin Cancer Res 2009;15:3172–6.
37. Kitada S, Kress CL, Krajewska M, Jia L, Pellecchia M, Reed JC. Bcl-2 antagonist apogossypol (NSC736630) displays single-agent activity in Bcl-2–transgenic mice and has superior efficacy with less toxicity compared with gossypol (NSC19048). Blood 2008;111:3211-19.
38. Trudel S, Li ZH, Rauw J, Tiedemann RE, Wen XY, Stewart AK. Preclinical studies of the pan-Bcl inhibitor obatoclax (GX015-070) in multiple myeloma. Blood 2007;109:5430–8.
