Introduzione alla
Parte
Negli ultimi anni il gruppo di ricerca presso il quale è stato svolto questo lavoro di tesi ha intrapreso lo studio di ligandi alla Proteina Traslocatrice (TSPO).
Come abbiamo già ampiamente descritto nella Parte Generale il TSPO, grazie alla sua primaria localizzazione mitocondriale, riveste un ruolo importante sia nella regolazione della proliferazione cellulare e dell’apoptosi, che nella biosintesi degli steroidi. Il TSPO risulta quindi essere un target promettente per lo sviluppo di nuovi strumenti terapeutici per il trattamento clinico di numerosi disordini quali tumori, malattie neurodegenerative, autoimmuni ed infettive, tutte patologie correlate ad un alterato equilibrio dei processi vita/morte cellulari. In p articolare, un incremento della morte cellulare caratterizza patologie acute quali l’infarto, l’AIDS, disturbi epatici, così come le patologie neurodegenerative. Al contrario, una ridotta capacità delle cellule di andare incontro ad apoptosi può portare all’accumulo di cellule anomale, caratteristico sia dei tumori che delle malattie autoimmuni.
Per quanto riguarda invece l’azione steroidogenica, le evidenze di una iperespressione del TSPO e delle proteine steroidogeniche associate in seguito ad un danno tr aumatico nel cervello e nel midollo spinale, insieme ad un aumento locale del livello di steroidi, suggerisce che tale recettore possa giocare un ruolo neuroprotettivo mediato dalla neurosteroidogenesi. Tra le patologie che implicano una alterazione dei livelli di alcuni specifici neurosteroidi possiamo ricordare i disturbi correlati allo stress, la depressione e le malattie neurodegenerative.
Di conseguenza, l’identificazione di nuovi specifici ligandi per il TSPO risulta di grande importanza al fine di
caratterizzare i potenziali ruoli farmacologici e terapeutici di tale recettore.
Negli ultimi anni, l’utilizzo di probes molecolari quali radioligandi e ligandi fluorescenti si è rivelato un valido metodo per lo studio delle interazioni ligando/recettore. Ta li probes forniscono infatti un’ampia varietà di informazioni sul meccanismo di legame del ligando al proprio recettore e sulla distribuzione subcellulare del recettore stesso.
In particolare, l’identificazione di nuovi probes molecolari capaci di marcare specificatamente il TSPO nelle cellule vive, riveste grande importanza per studiare meglio il ruolo di tale proteina in molte patologie ad essa correlate. L’espressione basale di questo recettore risulta infatti alterata in vari disturbi: una down-regulation si osserva in condizioni di stress cronico o ripetuto e in molti disturbi psichiatrici. Al contrario il TSPO è up-regolato in una serie di neuropatologie che includono i gliomi, i disturbi neurodegenerativi, quali l’Alzheimer, così come in varie forme d i danno cerebrale e di infiammazione. Una densità particolarmente elevata di tale recettore si osserva nei tessuti neoplastici. Il TSPO potrebbe così rappresentare un marker sensibile e specifico di alterazioni patologiche, oltre che un mezzo diagnostico d ello stato e progressione della patologia, incoraggiando le ricerche verso lo sviluppo di nuovi ligandi del TSPO quali strumenti adatti per tecniche di imaging molecolare.
Lo scopo di questo lavoro di tesi sperimentale è stata la progettazione e la sintesi di nuovi ligandi al TSPO, che possano rappresentare lead compounds utili per lo sviluppo di radioligandi quali specifici probes molecolari per il TSPO.
La caratteristica fondamentale che un probe deve possedere per essere definito un marker recettoriale è la capacità di legarsi con alta affinità al recettore in esame.
La progettazione di tali ligandi è stata realizzata sulla base della struttura delle 2-fenilindol-3-ilgliossilamidi I (Parte Generale), una nuova classe di ligandi per il TSPO descritti
recentemente da questo gruppo di ricerca.[ 6 ,9 ]
I
L’elevata affinità (Ki nell’ordine del nanomolare) e
selettività di questi derivati per il TSPO li rende degli ottimi leads per l’ottenimento di ligandi marcati.
E’ stata così analizzata in modo approfondito sia la struttura dei derivati I che il loro schema di interazione con il TSPO, per valutare quale modifica strutturale fosse la più opportuna al fine di inserire il gruppo radioatt ivo, perturbando al minimo la capacità di legame al TSPO.
Come abbiamo già descritto nella Parte Generale, il legame dei derivati 2-fenilindolgliossilamidici I con il recettore dovrebbe avvenire mediante quattro interazioni fondamentali:
(i) il fenile in posizione 2 che occupa l’area lipofila L1; (ii) i sostituenti alchilici R1 e R2 che interagiscono
rispettivamente con le aree lipofile L3 e L4; N R5 R6 O N O R1 R2 H R3
(iii) il carbonile amidico che funziona da accettore nella formazione di un legame ad idrogeno con il sito H1 [ 6 ] (Figura
6). HN O N R1 R2 R6 O H1 L1 L4 L3 R3
Figura 6. Interazione dei derivati 2 -fenilindolgliossilamidici con il modello di farmacoforo del TSPO.[ 6 ]
Considerando il modello farmacoforico e la fattibilità sintetica, sono stati progettati i derivati di formula II, portanti
un gruppo CH3 in posizione 1 del nucleo indolico (Figura 7).[ 9 ]
I risultati di questo studio hanno dimostrato che il gruppo metilico non influenza l’affinità del legame con il recettore, in accordo con il modello di farmacoforo proposto, in cui l’NH indolico non è un sito di interazione ligando/recettore. Inoltre, il gruppo metilico possiede caratteristiche steriche e elettroniche che sembrano non
interferire con il legame della molecola al TSPO [ 9 ].
Infine, ma non di minore importanza, l’introduzione di tale sostituente sull’NH dell’indolo è risultato essere di semplice fattibilità sintetica.
CH3N O N R1 R2 R6 O H1 L1 L4 L3 II R3 Figura 7. N,N’-dialchil-(1-metil-2-fenilindol-3-il-gliossil)amidici[9]
Sulla base di tali evidenze e degli incoraggianti risultati emersi negli ultimi studi, lo scopo di questa tesi è stato il
miglioramento delle proprietà farmacocinetiche e
farmacodinamiche dei derivati 2-fenilindolgliossilamidici di
formula II[9], al fine di ottenere nuovi ligandi, maggiormente
affini, per il TSPO.
La scelta dei sostituenti R1 , R2 ed R3 introdotti, è
stata razionalizzata, sull’esigenza di migliorare il bilancio idrofilia/lipofilia di tali derivati, necessario per una corretta distribuzione degli stessi a livello del tessuto nervoso senza influenzarne l’affinità di legame ai siti c atalitici del TSPO.
Da una parte abbiamo quindi modificato la densità elettronica dell’anello aromatico in posizione 2
dell’indolo tramite l’introduzione di sostituenti, come
p-OCH3 , m-OCH3, p-NO2, p-NH2 e p-OH, mantenendo costante la
catena n-Propilica. [9]
Dall’altra parteb abbiamo sostituito la catena n-Propilica con
diverse catene asimmetriche (R1=CH3, R2= CH2CH2CH3,
CH2CH2CH2CH3), mantenendo in R3 il gruppo NO2.
In questo lavoro di tesi sono stati quindi sintetizzati i derivati 22, 24, 26, 28 (Schema 1), 30 (Schema 2), 32 (schema
3), portanti un gruppo metilico freddo (non marcato) sull’azoto in posizione 1. N Cl O O ClCOCOCl Et2O an. 0°C + Toluene an. NEt3 48h, t.a N N O O R2 R1 N N O O R2 R1 CH3 NaH,CH3I DMF an. 0°C HN R1 R2 20,22,24,26,28 R1, R2 = CH3, n-propile, n-butile R3 = 3-OCH3, 4-OCH3, 4-NO2
H H N H COCH3 NHNH2 PPA 4h 75-120°C R3 R3 R3 R3 R3 SCHEMA 1 1v,21,23,25,27 35a-c 36a-c
Per la sintesi dei derivati 35a-c, abbiamo utilizzato una
di PPA per circa 4 ore ad una temperatura di 120°C per i composti 35b-c e 75°C per il derivato 35a. Successivamente il grezzo di reazione viene versato in ghiaccio per degradare il PPA residuo ed il solido formatosi viene infine raccolto ed
essiccato. I prodotti vengono infine purificati per
cristallizzazione dall’opportuno solvente. I derivati ottenuti vengono fatti reagire con cloruro di ossalile in Et2O anidro in
accordo con la procedura riportata in letteratura.[ 6 ] L’aggiunta
a 0°C del cloruro di ossalile porta alla formazione dei cloruri acilici 36a-c desiderati, che vengono recuperati per evaporazione del solvente a pressione ridotta ed utilizzati nella reazione successiva senza ulteriore purificazione.
La condensazione dei cloruri acidi 36a-c con le opportune amine è stata effettuata in toluene anidro ed in presenza di trietilamina in quantità equimolare per neutralizzare l’acido cloridrico che si forma nella reazione. La reazione è condotta in ambiente anidro, a 0ºC per un’ora e poi a temperatura ambiente per 48 ore, control landone l’andamento con TLC.
Al termine, il solido formatosi viene eliminato per filtrazione a p.r. e lavato con una soluzione al 5% di NaHCO3,
fitrato e seccato su P2O5 per recuperare una prima porzione di
prodotto grezzo. La soluzione toluenica viene ev aporata a p.r., il residuo ripreso con CHCl3, lavato con una una soluzione al
5% di NaHCO3 , con HCl diluito, e infine con acqua. Dopo
essiccamento su MgSO4, l’eliminazione del solvente a p.r.
fornisce un residuo che viene solidificato per triturazione a
0°C con Et20. Il composto 1v viene purificato mediante
cromatografia flash ( miscela eluente cloroformio= 10).
I derivati 1v, 21, 23, 25 e 27 vengono quindi trasformati nei corrispondenti analoghi N1-metilati 20, 22, 24, 26, e 28. La
sintesi di questi prodot ti prevede , inizialmente la preparazione di una soluzione del derivato 2-fenil-3-ilgliossilamidico 1v, 21, 23, 25 e 27 in DMF anidra e quindi l'aggiunta a piccole porzioni di idruro di sodio, in atmosfera di azoto, mantenendo la miscela di reazione in agi tazione a temperatura ambiente per 5 ore. Si aggiunge a questo punto rapidamente a 0°C lo ioduro di metile e si lascia in agitazione a temperatura ambiente per 12 ore, controllando ne l’andamento di reazione mediante TLC. Al termine le acque madri vengono gocciolate in ghiaccio, precipita un solido che viene filtrato a p. r. ed essicato su P2O5 .
I prodotti vengono purificati per cristallizzazione dall’opportuno solvente mentre il composto 20 si purifica
tramite cromatografia flash ( miscela eluente
cloroformio=10).[ 9 ]
La struttura di tutti i derivati 1 -metil-2-fenilindolo-3-ilgliossilamidici 20, 22, 24, 26 e 28 di nuova sintesi è stata confermata con dati analitici e spettroscopici ( Tabella 2).
N N O O (CH2)2CH3 (CH2)2CH3 CH3 NO2 N N O O (CH2)2CH3 (CH2)2CH3 CH3 NH2 N N O O (CH2)2CH3 (CH2)2CH3 H NO2 NaH, CH3I DMF an SCHEMA 2 H2 /Pd-C EtOH ass H2 /Pd-C EtOH ass N N O O (CH2)2CH3 (CH2)2CH3 H NH2 30 20 29 1v
La procedura sintetica riportata nello schema 2 prevede la trasformazione dei nitro composti 1v e 20 nei corrispondenti amino derivati 29 e 30. La reazione di riduzione viene effettuata con idrogeno gassoso a pressione e temperatura ordinarie in soluzione di etanolo assoluto ed utilizzando come catalizzatore Pd-C
La reazione è mantenuta in agitazione per circa 5 ore, controllandone l’andamento con TLC, dopodiché la soluzione etanolica viene filtrata per eliminare il catalizzatore ed evaporata a p.r.. Il residuo ottenuto vien e purificato mediante cristallizzazione da toluene.
La struttura dei derivati 30 e 29 è stata confermata con dati analitici e spettroscopici (tabella 2).
N N O O (CH2)2CH3 (CH2)2CH3 H OCH3 NaH, CH3I N N O O (CH2)2CH3 (CH2)2CH3 CH3 OCH3 SCHEMA 3 DMF 0°C N N O O (CH2)2CH3 (CH2)2CH3 CH3 OH BBr3 CH2Cl2 an N N O O (CH2)2CH3 (CH2)2CH3 H OH BBr3 CH2Cl2 an 32 31 28 27
I composti 31 e 32 sono ottenuti, come riportato nello schema 3, per demetilazione del gruppo metossi lico in para al fenile dei derivati 27 e 28.Ad una soluzione dei derivati 27 e 28 in CH2Cl2 anidro, raffreddata a -10 si aggiunge goccia a
goccia BBr3 . La miscela viene quindi lasciata in agitazione per
30 min. a -10°C e successivamente a t.a. per un ora controllando l’andamento di reazione mediante TLC. Al termine la miscela viene raffreddata nuovamente in ghiaccio e
La struttura dei derivati 31 e 32 è stata confermata con dati analitici e spettroscopici (tabella 2).
Inoltre per meglio valutare il bilancio idrofilia/lipofilia abbiamo sostituito l’anello feni lico in posizione 2 con un anello furanico.
Abbiamo cosi sintetizzato il composto 33 e il corrispettivo N-metilato 34 secondo la via sintetica riportata nello schema 4 [ 1 1 ]. N Cl O O ClCOCOCl Et2O an. 0°C + Toluene an. NEt3 48h, t.a N N O O CH2CH2CH3 CH2CH2CH3 N N O O CH2CH2CH3 CH2CH2CH3 CH3 NaH,CH3I DMF an. 0°C HN Pro Pro H H N H SCHEMA 4 CH3 NH2 O Cl O O O O O 34 33 37 38 Toluene an. NEt3 0° C
Per la sintesi del composto 37, abbiamo utilizzato una procedura riportata in letteratura [ 1 1 ]. L’ ortotoluidina e il
2-furolilcloruro vengono fatti reagire in toluene anidro in presenza di trietilamina in quantità equimolare ,la miscela di reazione viene mantenuta a 0°C per un’ora e poi a t.a. per 48 ore,controllandone l’andamento con TLC.
Al termine il solido formatosi viene eliminato per filtrazione a pressione ridotta. La soluzione toluenica viene evaporata a p.r., il residuo ripreso con CHCl3 e lavato con
H2O, dopo essiccamento su MgSO4 il solvente viene evaporato
a p.r. ottenendo un residuo semisolido che viene seccato su P2O5 .
Il derivato 37 ottenuto viene fatto reagire con cloruro di ossalile in Et2O[ 6 ]. L’aggiunta a 0°C del cloruro di ossalile
porta alla formazione del cloruro acilico 38 desiderato, che viene recuperato per evaporazione a pressione ridotta ed
utilizzato nella reazione successiva senza ulteriore
purificazione.
La condensazione del cloruro acido 38 con dipropilamina è stata effettuata in toluene anidro ed in presenza di trietilamina in quantità equimolari. La miscela viene mantenuta a 0ºC per un’ora e poi a temperatura ambiente per 48 ore, controllandone l’andamento con TLC.
Al termine, il solido formatosi viene recuperato per filtrazione a p.r. e lavato con una soluzione al 5% di NaHCO3,
fitrato e seccato su P2O5 per recuperare una prima porzione di
prodotto grezzo. Le a. m. tolueniche vengono evaporate a p.r., il residuo ripreso con CHCl3, lavato con una una soluzione al
0°C con Et20. Otteniamo cosi’ il derivato 33, il quale viene
convertito nel corrispondente analog o N1-metilato 34. Alla soluzione in D MF anidra del derivato 33 si aggiunge a 0°C e a piccole porzioni idruro di sodio. La miscela di reazione viene mantenuta in agitazione a t. a. per 5 ore . Terminato lo
sviluppo di H2 si aggiunge rapidamente a 0°C lo ioduro di
metile e la miscela di reazione viene lasciata agitazione a temperatura ambiente per 12 ore, controllando ne l’andamento mediante TLC. Le a. m. vengono gocciolate in ghiaccio, si ottiene un precipitato che viene filtrato a p.r. ed essiccato su P2O5 .
La struttura del derivato 1-metil-2-furanindolo-3-ilgliossilamidico 34 è stata confermata con dati analitici e spettroscopici (Tabella 3).
