LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
Dr. L. Kriaučeliūno smulkiųjų gyvūnų klinika
Ingrida Jankauskaitė
Nustatymo metodų jautrumo palyginimas diagnozuojant
Fasciola hepatica pieninių galvijų ūkiuose
Comparison of the sensitivity of detection methods in the
diagnosis of Fasciola hepatica in dairy cattle farms
Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovas: Lekt. dr. Inga Stadalienė
2 DARBAS ATLIKTAS DR. L. KRIAUČELIŪNO SMULKIŲJŲ GYVŪNŲ KLINIKOJE
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Nustatymo metodų jautrumo palyginimas diagnozuojant Fasciola hepatica pieninių galvijų ūkiuose“:
1. yra atliktas mano paties/pačios;
2. nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje;
3. nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą panaudotos literatūros sąrašą. Ingrida Jankauskaitė
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe. Ingrida Jankauskaitė
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADOS DĖL DARBO GYNIMO
Lekt. dr. Inga Stadalienė
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE/KLINIKOJE Doc. dr. Birutė Karvelienė
(aprobacijos data) (katedros/klinikos vedėjo/jos vardas, pavardė)
(parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentas
(vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
(data) (gynimo komisijos sekretorės (-riaus) vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamasis darbas yra įdėtas į ETD IS
3
TURINYS
SANTRAUKA ... 4 SUMMARY ... 5 SANTRUMPOS ... 6 ĮVADAS ... 7 1. LITERATŪROS APŽVALGA... 9 1.1 Epidemiologiniai duomenys ... 9 1.1.1 Paplitimas. ... 9 1.1.2 Morfologija. ... 10 1.1.3 Vystymasis. ... 11 1.1.4 Ekonominiai nuostoliai. ... 13 1.1.5 Imunologinė reikšmė. ... 14 1.2 DIAGNOZAVIMAS ... 14 1.2.1 Koprologinis tyrimas. ... 15 1.2.2 Kraujo tyrimai. ... 15 1.2.3 Imunologiniai tyrimai. ... 16 1.2.4 Koproantigeno nustatymas. ... 17 1.2.5 Molekuliniai tyrimai. ... 182. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA ... 19
2.1 Tyrimo objektas ... 19
2.2 Koprologiniai tyrimai ... 20
2.3 Imunofermentinė analizė ... 21
2.4 Statistinė analizė... 22
3. TYRIMO REZULTATAI ... 23
3.1 Koprologinio tyrimo rezultatai ... 23
3.2 Imunofermentinio (IFA) tyrimo rezultatai ... 26
3.3 Metodų palyginimas ... 27
REZULTATŲ APTARIMAS ... 31
IŠVADOS ... 33
REKOMENDACIJOS ... 34
4 NUSTATYMO METODŲ JAUTRUMO PALYGINIMAS DIAGNOZUOJANT FASCIOLA
HEPATICA PIENINIŲ GALVIJŲ ŪKIUOSE Ingrida Jankauskaitė
Magistro baigiamasis darbas
SANTRAUKA
Darbo tikslas: nustatyti Fasciola hepatica paplitimą pieninių galvijų ūkiuose ir palyginti nustatymui naudojamų metodų jautrumą.
Darbo uždaviniai: nustatyti užsikrėtimo Fasciola hepatica pasiskirstymą pieninių galvijų bandose. Nustatyti užsikrėtimo Fasciola hepatica gausumą pieninių galvijų bandose. Įvertinti imunofermentinės analizės metodo pritaikymą diagnozuojant Fasciola hepatica iš bendro pieno mėginio. Palyginti visų naudotų tyrimo metodų rezultatus ir išsiaiškinti jų jautrumą nustatant užsikrėtimą Fasciola hepatica.
Tyrimai buvo atliekami nuo 2017 m. vasario mėn. iki 2018 m. vasario mėn. Buvo pasirinkta 16 pieninius galvijus laikančių ūkių, iš kurių surinkti išmatų (n=146) bei bendro pieno mėginiai (n=16). Rezultatai gauti atliekant koprologinį išmatų tyrimą dviem sedimentacijos metodais (standartiniu ir modifikuotu) bei atliekant bendro pieno mėginio IFA tyrimą.
Standartiniu sedimentacijos metodu nustatytas 50 proc. Faciola hepatica paplitimas pieninių galvijų ūkiuose, modifikuotu sedimentacijos metodu - 68,8 proc., imunofermentinės analizės iš bendro pieno mėginių - 62,5 proc. Vertinant užsikrėtimo gausumą, bandose modifikuotu sedimentacijos metodu, užsikrėtimo dažnumas buvo 34,9 proc. ir svyravo nuo 9,1 proc. iki 100 proc. karvių ūkyje. Modifikuoto sedimentacijos metodo teigiamų mėginių skaičiui svyruojant nuo 0 iki 9,1 proc., bendrajame pieno mėginyje nustatyta neigiama reakcija, užsikrėtimui padidėjus nuo 10 iki 42,9 proc. imunofermentine analize nustatyta silpna infekcija, o vidutinio stiprumo užsikrėtimas nustatytas teigiamų mėginių skaičiui siekiant 60-100 proc. Nustatyta, jog jautriausias Fasciola hepatica identifikavimo būdas buvo modifikuotas sedimentacijos metodas, kuris pasižymėjo 98,08 proc. jautrumu, mažiau jautrus imunofermentinės analizės iš bendro pieno mėginio, kurio jautrumas 90,9 proc., mažiausiai jautrus standartinis sedimentacijos metodas – 51,92 proc.
5 COMPARISON OF THE SENSITIVITY OF DETECTION METHODS IN THE DIAGNOSIS OF
FASCIOLA HEPATICA IN DAIRY CATTLE FARMS Ingrida Jankauskaitė
Master‘s Thesis
SUMMARY
The aim of this study: to determine the prevalence of Fasciola hepatica in dairy cattle farms and to compare the sensitivity of the methods used for detection.
Objectives of this study were: to determine the distribution of Fasciola hepatica infection in dairy cattle herds. Determine the abundance of Fasciola hepatica in dairy herds. To evaluate the application of the IFA method for the diagnosis of Fasciola hepatica from a bulk tank milk sample. Compare the results of all the test methods used to determine their sensitivity to Fasciola hepatica infection.
Studies have been conducted since 2017 February until 2018 February. 16 dairy farms were selected, of which faeces (n = 146) and bulk tank milk samples (n = 16) were collected. The results were obtained by performing a coprology faecal test using two sedimentation methods (standard and modified) as well as the IFA test of the bulk tank milk sample.
The prevalence of Fasciola hepatica in dairy cattle farms was determined to be 50 % by using standard sedimentation method, using modified sedimentation method - 68.8%, performing immunoassay from bulk tank milk samples - 62.5%. When assessing the abundance of infections in the herds by the modified sedimentation method, the rate of infection was 34.9% and ranged from 9.1 % up to 100 % in cow farms. The number of positive samples in the modified sedimentation method ranging from 0 % to 9.1% showed a negative reaction in the bulk tank milk sample, with an increase of positive samples from 10% to 42.9% immuno-enzyme analysis revealed a weak infection, and the average infection rate was found when 60 - 100 % of samples were positive. It was found that the most sensitive method for the detection of Fasciola hepatica was the modified sedimentation method, which was 98.08%. sensitivity, less sensitive is immunoassay from a bulk tank milk sample with a sensitivity of 90.9%, the least sensitive standard sedimentation method - 51.92%.
6
SANTRUMPOS
angl. – angliškai
F. hepatica - Fasciola hepatica IFA – imunofermentinė analizė igG - imunoglobulinas G liet. – lietuviškai
OP - optinis tankis
PGR - polimerazinė grandininė reakcija PSO – Pasaulio sveikatos organizacija vnt. - vienetai
7
ĮVADAS
Fasciola hepatica (liet. kepeninė siurbikė) - plokščiųjų kirmėlių tipui (lot. Platyhelminthes), siurbikių klasei (lot. Trematoda) ir Fasciolidea šeimai priklausantis parazitas (1). Šis trematodas randamas visame pasaulyje ir parazituojantis atrajotojų, arklių, laukinių gyvūnų (elnių, triušių ir kt.) organizme (2). Tai vienas iš svarbiausių ir geriausiai žinomų parazitų producijos gyvūnų tarpe, sukeliantis didelius ekonominius nuostolius – skerdyklose brokuojamos pažeistos kepenys, gyvuliai sunkiau priauga svorio, sumažėja pieno primilžis, sutrinka vaisingumas (3–5). Galvijų fascioliozė vyrauja daugelyje Europos valstybių ir jos paplitimas labai didelis kai kuriuose pieninių galvijų laikymo regionuose (6).
91 mln. žmonių rizika užsikrėsti ir globaliniai produkcijos nuostoliai, siekiantys 2-3 mlrd. JAV dolerių, suteikia būtinybę ieškoti Fasciola hepatica diagnostikos metodų, kurie būtų jautrūs, specifiški, tikslūs bei ekonomiškai naudingi ir tuo pačiu paprasti naudoti (6–9). Šios ligos tikslus diagnozavimas dažnai tampa apsunkintas dėl paplitusios slaptos parazitozės formos (5). Diagnozė dažniausiai remiasi kiaušinėlių nustatymu galvijų išmatose, tačiau kiaušinėlių išskyrimas yra nepastovus ir nereguliarus bei įvyksta tik praėjus 10-12 sav. po užsikrėtimo, todėl šis tyrimas kartais nepatikimas (10). Be to, tirti dideles bandas nepatogu, išnaudojama daug laiko resursų (11). F. hepatica infekcijos metu susidarę antikūniai išskiriami ne tik į kraują, bet ir į pieną, kas leidžia pritaikyti imunofermentinę analizę tiriant individualius ar visos bandos bendrą pieno mėginį, užtikrinant greitesnį ir pigesnį metodą pieninių bandų infekcijos stebėsenai – identifikuoti užsikrėtusias bandas (1,2).
Suaugusių galvijų parazitinių susirgimų stebėsena padeda įvertinti ūkyje laikomų karvių sveikatos būklę, užsikrėtimą kepeninėmis siurbikėmis, taikomų profilaktikos priemonių efektyvumą ar, jei reikia, antiparazitinio gydymo būtinybę (1). Šiuo metu, pagrindinė, paprasčiausiai pasiekiama ir dažnai atsainiai taikoma kontrolės priemonė – antihelmintikų naudojimas. Plačiau paskleista informacija apie atskirų bandų užsikrėtimo F. hepatica statusą, leistų tikslesnę, įrodymais pagrįstą šio parazito kontrolę ūkiuose (12). Šis žingsnis padėtų taikyti tinkamesnį ir tvarų gydymą flukicidais, tuo pačiu sumažinant bendrą antihelmintikų naudojimą bei atsparumą (13,14). Štai kodėl svarbu užtikrinti tinkamų diagnostinių priemonių naudojimą.
Dėl savo ekonominės reikšmės, F. hepatica yra tapusi daugybės mokslinių tyrimu subjektu (15), tačiau ligos pasiskirstymas pietų ir rytų Europoje bei Pabaltijo valstybėse (tame tarpe ir Lietuvoje) išlieka mažai ištirtas (2). Dėl šios priežasties nuspręsta ištirti šio parazito paplitimą Lietuvos pieninių galvijų ūkiuose bei palyginti nustatymui naudojamų tyrimo metodų jautrumą.
Tyrimo tikslas - nustatyti Fasciola hepatica paplitimą pieninių galvijų ūkiuose ir palyginti nustatymui naudojamų metodų jautrumą.
8 Tyrimo uždaviniai:
1. Nustatyti užsikrėtimo Fasciola hepatica pasiskirstymą pieninių galvijų bandose; 2. Nustatyti užsikrėtimo Fasciola hepatica gausumą pieninių galvijų bandose;
3. Įvertinti imunofermentinės analizės metodo pritaikymą diagnozuojant Fasciola hepatica iš bendro pieno mėginio;
9
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1 Epidemiologiniai duomenys
1.1.1 Paplitimas. Fasciola hepatica (kepeninė siurbikė) - Fasciolidae šeimos trematodas (16). Šis parazitas paplitęs visame pasaulyje, ypač šalyse, kur išplėtota galvijininkystė ir avininkystė (17). Prelimenariais skaičiavimais visame pasaulyje daugiau nei 600 mln. gyvūnų yra užsikrėtę F. hepatica trematodu (18,19). Žmonės dažniausiai tampa atsitiktiniais šio parazito šeimininkais (17). PSO ši parazitozė įvardinta kaip „užmiršta, tačiau vis atsirandanti liga susijusi su endemiškais ir epidemiškais ligos protrūkiais žmonių populiacijoje“ (2). Remiantis šios organizacijos skaičiavimais, 2,4 mln. žmonių visame pasaulyje yra užsikrėtę Fasciola spp. parazitais ir net 180 mln. gresia užsikrėtimo rizika (20). Šis trematodas aptinkamas visuose kontinentuose (Europoje, Azijoje, Okeanijoje, Amerikos žemynuose, Afrikoje), išskyrus Antarktidą (21). F. hepatica paplitimą smarkiai lemia jos tarpiniam šeimininkui – vandeninei sraigei – tinkamos aplinkos sąlygos (22).
Šio parazito paplitimas bandos mastu vakarų Europoje siekia 30 – 80 proc. (23–25). Didžiojoje Britanijoje F. hepatica paplitimas suaugusių pieninių galvijų tarpe pastaraisiais metais padidėjo nuo 48 proc. iki 76 proc. (26). 2012 m. duomenimis, kitose Europos šalyse kepeninės siurbikės paplitimas siekė: 37 proc. Belgijoje, Falnderso regione, 50 proc. Vokietijoje bei 61 proc. Ispanijoje (12,26–29). Teigiama, jog fascioliozė - viena iš pagrindinių hipereozinofilijos priežasčių Prancūzijoje (15). Specifinės apklausos šalių viduje parodė, jog sukėlėjo paplitimas bandos mastu siekia 4 proc. pietinėje Italijos dalyje, 7 proc. Švedijoje, 61.6 proc. Airijoje bei 97 proc. Alpinių aukštumų ūkiuose (23,30). Airijoje 2006 m. atlikti tyrimai parodė, jog F. hepatica aptikta 65-iuose proc. pieninių ir mėsinių galvijų kepenyse (31), o Selemento ir kt. autorių 2014 m. atliktame tyrime nustatytas 67 proc. paplitimas (32). Rytų regione (Afrikoje, Vidurio Rytuose, Azijoje bei pietryčių Azijoje) fascioliozės paplitimas nuo 1980 m. iki 2009 m. keitėsi nuo 25 proc. iki 100 proc. (33). Etiopijoje, kurioje laikomų galvijų populiacija siekia apie 52 mln. individų, atlikto poskerdiminio tyrimo metu nustatyta, jog užsikrėtimas F. hepatica arba mišria parazitoze kartu su F. gigantica siekė 31,8 proc. ir 22,6 proc. atitinkamai, o apskritai fascioliozės paplitimas įvairiuose šalies regionuose siekia 11,5 proc. – 87 proc. (20). Ligos pasiskirstymas pietų, centrinėje ir rytų Europoje išlieka mažai aprašytas (2). Prieinamos informacijos apie galvijų fascioliozės epidemiologinę padėtį Lietuvoje taip pat nėra daug. 2015 m. atliktas tyrimas, vertinantis F. hepatica paplitimą ekologiniuose ūkiuose – užsikrėtimas nustatytas 42 proc. ūkių, daugiausiai vidurio (30 proc.) ir vakarų (32 proc.) Lietuvos regionuose (34).
Fasciola hepatica protrūkiams būdingas sezoniškumas – įvyksta dvi infekcijų bangos vasarą bei žiemą (35). Didžiausi užsikrėtimo periodai priklauso nuo regiono, pvz. šiaurinėje Europos dalyje
10 dideli kiekiai metacerkarijų atsiranda rudenį, o pietinėse šalyse – rizika didesnė žiemą ir pavasarį (36).
Fasciola hepatica – svarbus trematodas galvijams, kurie auginami vidutinio klimato zonoje (15). Anksčiau atliktose studijose patvirtinta, jog facioliozės paplitimas labai priklauso nuo klimato sąlygų (27). Gyvūnų pervežimas ir judėjmas, klimato pokyčiai, gydymas antiparazitiniais vaistais be aiškios diagnozės, netinkamas medikamentų pasirinkimas – visa tai lemia didesnį fascioliozės paplitimą ir padidėjusį užkrečiamumą (24,37). Fascioliozės atvejų padažnėjimas siejamas su klimato atšilimu – vasaros tampa drėgnesnės ir žiemos darosi šiltesnės nei įprasta (26,38), todėl kepeninė siurbikė šiuo metu paplitusi daugiau dėl limnoidinių (angl. lymnaeid) sraigių prisitaikymo prie joms tinkamos drėgnesnės aplinkos (21). Pavyzdžiui, Didžiojoje Britanijoje įprastai facioliozė buvo paplitusi vakarų pakrantėje, tačiau geografiniai fasciolų pernešėjo Galba tranctula pokyčiai lėmė, kad fascioliozė tapo labiau paplitusi rytiniuose šalies regionuose, kur šiltesnis ir drėgnesnis klimatas (39). Taip pat, didesnį trematodo paplitimą lėmė kai kuriose šalyse taikomas rutininis flukicidų naudojimas (23) ir dėl to išsivystęs siurbikių atsparumas neteisingai skiriamiems antihelmintikams (40–44).
Skirtingą paplitimą įvairiose šalyse galima paaiškinti ne tik klimatiniais pokyčiais, bet ir egzistuojančiais regioniniais skirtumais tarp fascioliozės valdymo programų, dedamų pastangų kovai su šiuo parazitu. Žinios apie židininį trematodų paplitimą leidžia atitinkamoms institucijoms būti budrioms didelės rizikos vietose ir sutelkti dėmesį į kontrolės ir stebėsenos programas. Kai kuriose užsienio šalyse pradedamas geografinių informacinių sistemų naudojimas, kurio pagalba būtų galima sekti užsikrėtimo plitimą. Informacija apie užsikrėtimo plitimą padeda efektyviau panaudoti antihelmintikus, mažina išlaidas bei atsparumo antihelmintikams galimybę (27). Įprastai, parazitologai kalba apie konkretaus parazito atsparumą antihelmintikams, tačiau, užtikrintai parazitų kontrolei būtina išsiaiškinti visus galimus parazitus ir taikyti kombinuotą gydymą (26).
Rekomenduojama, jog didelės ir vidutinės rizikos vietovėse reguliariai būtų vykdoma fascioliozės stebėsena, atliekant koprologinius tyrimus ir pieno mėginių IFA. Mažos rizikos zonose diagnozė turėtų būti nustatoma tik prieš tai ūkyje buvus užsikrėtimui ar įtarus užsikrėtimą iš klinikinių požymių (27).
1.1.2 Morfologija. Fasciola hepatica - viena didžiausių siurbikių pasaulyje (15). Suaugusios siurbikės ilgis siekia 20-30 mm, plotis 14 mm. (45). Tai gelsvai rudos spalvos, mėsingos išvaizdos trematodas. Priekinis fasciolos kūno galas platesnis už užpakalinį. Kūgio formos praplatėjimas formuoja išraiškingus, lateraliai nusuktus pečius (3,46). Pečių reljefiškumas leidžia siurbikę identifikuoti kitų parazitų tarpe. Tegumentas padengtas dideliais, žvynus primenančiais dygliais, panašiais į echinostomų (fasciolos yra joms giminingi parazitai) (15). Šie atgal nukreipti paviršiniai dygliai padeda parazitui geriau fiksuotis ir įsitvirtinti parazituojant tulžies latakų gleivinėje (16,45).
11 Burninis siurbtukas mažas, bet galingas - jis yra priekiniame gale, prie kūgio formos struktūros pabaigos. Gūžduobė didesnė nei burninis siurbtukas ir randasi labiau priekiniame gale, pečių lygyje (15).
Vidinė morfologija mikroskopu sunkiai įžiūrima dėl šakotų vidinių organų struktūrų: sėklidžių, kiaušidės, trynio latakas (3). Žarnynas dalijasi į dvi dalis, kurios lateralinėje pusėje itin gausiai šakojasi, formuodamos vadinamąjį divertikulą (45). Žarna baigiasi užpakaliniame kūno gale (15). Didelę fasciolų kūno dalį užima sėklidės ir trynio audiniai. Įrodyta, jog spermatozoidų bei kiaušinėlių komponentų gamyba yra pagrindinė, daugiausia energijos reikalaujanti suaugėlių fasciolų veikla (47). Abi sėklidės didelės ir labai išsišakojusios, esančios viena už kitos užpakalinėje kūno pusėje. Mažesnė, šakota kiaušidė yra dešinėje kūno pusėje, šalia gimdos kairėje pusėje (žiūrint iš ventralinės pusės) (15,48). Gimda trumpa, susisukusi tarp kiaušidės ir ciruso kišenės (15). Trynio liaukos, išskiriančios pirminius apvalkalo baltymus ir glikogeno atsargas, reikalingus kiaušinėlių gamybai, išsivysčiusios ir lokalizuojasi šoninėje ir užpakalinėje dalyje nuo sėklidžių (48). Trynio folikulai platūs, užpildantys beveik visą šoninę kūno pusę ir susiliejantys už sėklidžių (15). Kiaušinėliai – gelsvai auksinės spalvos, ovalūs, turintys ploną sienelę, jų matmenys siekia 130-145 x 70-90 µm. Kai išskiriami iš šeimininko organizmo, viduje glūdi apvaisinta kiaušinėlio ląstelė ir didelis kiekis trynio ląstelų (45). Kiaušinėlio operkulas mažas (46). Per dieną subrendusi kepeninė siurbikė gali pagaminti iki 25,000 kiaušinėlių (48).
1.1.3 Vystymasis. Tai saprozoonozinis parazitas, kurio vystymosi stadijos apima stuburinį šeimininką ir abiotinę, išorinę aplinką (vandenį), t.y. galutinį (galvijai, avys ir kt.) bei tarpinį šeimininką (Galba truncatula sraigę) (12,49). Šis parazitas gali užkrėsti ne tik avis, galvijus, tačiau ir kitus gyvūnus, pvz., žiurkes, elnius ar žmones (45). Metacerkarija vandens vegetacijos periodu patenka su maistu/pašaru į žmonių, galvijų, avių ir kt. atsitiktinių gyvūnų virškinamąjį traktą, prasiskverbia pro virškinamojo trakto sienelę, migruoja į kepenis, slenka jų parenchima, kol patenka į priekinę tulžies pūslės dalį, kur tampa suaugusiomis siurbikėmis (17,46). Tarpinis F. hepatica šeimininkas - pilvakojų moliuskų (lot. Gastropoda) klasei ir kūdrinukinių šeimai (lot. Lymnaeidae) priklausančios gėlavandenės sraigės (46). Europoje pagrindinis tarpinis šeimininkas yra vandeninė sraigė Galba truncatula, tačiau yra įrodymų, jog kitos sraigių rūšys (Lymnaea palustris, Omphiscola glabra, Radix balthica, Succinea spp. ir Potamopyrgus antipodarum) gali tapti potencialiais F. hepatica šeimininkais (50–53). Parazitas į šių rūšių sraiges gali patekti atsitiktinai, tačiau cerkarijos ne visada išsivystys šių moliuskų organizme. Nepaisant to, šie bestuburiai gali būti įvardinti kaip papildomas F. hepatica rezervuaras (2). Kepeninės siurbikės yra hermafroditai ir savaime apsivaisinantys parazitai, atskiros siurbikės gali išskirti kiaušinėlius (17,47). Po kopuliacijos, šie digenetiniai parazitai išskiria kelis tūkstančius operkuluotų kiaušinėlių, kurie pašalinami su šeimininko išmatomis į aplinką arba gali būti kelias savaites laikomi tulžies pūslėje. Europos klimatu,
12 per 2-4 savaites iš kiaušinėlio bręsta nauja lervos stadija – miracidija (45). Šiam procesui įvykti reikalinga minimali 10 C° temperatūra (optimali temperatūra 22 – 26 C°) (54). Nustatyta, jog kiaušinėlių ritimąsi aktyvina mėlynų-violetinių bangų šviesa. Esant tokiam šviesos spektrui, miracidija išskiria proteolitinius fermentus, kurie ardo cementą, laikantį operkulą vietoje. Tuo metu, kiaušinėlio viduje esantis gelis tampa zolio pavidalo, taip padidindamas masę du kartus. Dėl padidėjusio spaudimo, fermentus praradęs operkulas atsidaro ir miracidija ištrūksta (55). Miracidija siekia 130 µm ilgį ir turi daug eilių blakstienėlių, kurios padeda jai judėti vandenyje, po to kai ši išsirita iš operkulo netekusio kiaušinėlio (45). Šaltas vanduo pristabdo miracidijų vystymąsi (15). Miracidijos šviesos receptorius (akutė) padeda jai rasti tarpinį šeimininką – Galba (Lymnea) sraiges (45). Naujai išskirti F. hepatica kiaušinėliai gali būti metus saugomi tamsoje, tačiau vos apšvietus tinkamo ilgio šviesos spinduliais – išsiristi per porą minučių (55). Miracidija tarpinį šeimininką turi surasti per 20-30 val. nuo išsiritimo iki kol baigsis jos glikogeno atsargos. Radus tarpinį šeimininką, veikiant proteolitiniams fermentams, įvyksta penetracija (prasiskverbimas) per sraigės odą. Sraigės organizme miracidija netenka blakstienėlių ir tampa ilgo, ištempto vamzdelio pavidalo, kuris gali siekti 0,5 mm ilgį. Ši stadija vadinama sporocista (55). Sraigės virškinimo liaukoje vyksta tolimesnis brendimas (15). Kitos sporocistos formuojasi iš gemalinių ląstelių, esančių pirmos kartos sporocistose (45), t.y. motininės sporocistos gamina pirmos kartos redijas, kurios savo ruožtu išskiria dukterines redijas (15). Išsivysto bent dvi kartos redijų. Jų ilgis siekia 1,5 -2 mm. Ši stadija turi burninį siurbtuką, ryklę ir nešakotą, cilindro formos žarnyną. Sraigėje dažnai išsivysto kelios kartos redijų. Galiausiai, redijos viduje susiformuoja cerkarijos kiaušinėlis (angl. ovoid cercaria). Jos ilgis 400 x 200 µm ir ji turi 1 mm ilgio uodegėlę, kuri leidžia plaukti vandenyje, kai cerkarija išsilaisvina iš sraigės organizmo, tai įvyksta po maždaug 5-8 savaičių nuo patekimo į sraigės organizmą (45). Cerkarijos plaukioja gėluose vandenyse ir prisitvirtina prie vandens augalų per kelias minutes, tuomet netenka savo uodegėlės (44). Jei vandens telkinys, kuriame gyvena infekuota sraigė, išdžiūsta, ji purve gali išgyventi kelis mėnesius ir kai vanduo vėl prisipildo, sraigė išleidžia daugybę cerkarijų į aplinką (15). Vandens sraigės yra tarpiniai šeimininkai ir cerkarija, ištrūkusi iš sraigės tampa cista (incistuojasi). Labai greit aplink ją susiformuoja mukoproteininė sienelė ir ši prisitvirtina ant augmenijos ar negyvų daiktų bei tampa metacerkarija (ilgis siekia 200-300 µm.) (55). Metacerkarijos gyvenimo trukmė gali siekti 48 savaites (56).
Parazitozės perdavimas yra oralinis – metacerkarijos praryjamos (45). Egzistuoja du užsikrėtimo keliai: atsigėrus metacerkarijomis užteršto vandens arba suėdus augmenijos, prie kurios prisitvirtinusi metacerkarija (57). Dažniausiai užsikrečiama ganymo metu, tačiau gyvūnas gali suėsti ir į tvartą atneštus užterštus pašarus (šieną, silosą) (25). Jei galutinis šeimininkas praryja metacerkariją, ji išsirita žarnyne ir per 24 val. įsiskverbia į žarnos sienelę bei per kitas 24 val. pasiekia pilvo ertmę (45). Kai metacerkarija yra praryjama gyvūnų, ji smulkiajame žarnyne yra veikiama
13 šeimininko virškinimo fermentų (55). Per kitas 4-7 dienas iš ten migruoja į kepenis (45). Kol lerva pasiekia tulžies latakus praeina dar savaitė (45). Parazitas migruoja per žarnyno sienelę į kūno ertmes, tuomet keliauja į kepenis ir galiausiai į tulžies latakus ir tulžies pūslę, kur subręsta lytiškai. (55) Jaunos siurbikės, pasiekusios kepenis būna lanceto formos ir apie 1.0-2.0 mm ilgio (16). Migracija kepenimis gali sukelti ūmius klinikinius simptomus ir svorio netekimą (55). Prireikia maždaug 2 mėn., kol jaunos kirmėlės subręsta ir pradeda dėti kiaušinėlius (45). Tačiau ne visos suvirškintos metacerkarijos patenka į kepenis – daugelis pasišalina su išmatomis arba žūva migracijos organizme metu. Galutinę parazitavimo vietą pasiekia apie 25 – 60 proc. (vid. 40 proc.) (25). Suaugėlių fasciolų gyvenimo trukmė siekia 8-12 mėn. (45). Suaugėlės tulžies latakuose deda kiaušinėlius, kurie su tulžimi nukeliauja į žarnyną ir galiausiai su gyvulio išmatomis pasišalina iš organizmo (15,55). Prepatentinis periodas galutiniame šeimininke trunka 8 - 13 savaičių (45).
1.1.4 Ekonominiai nuostoliai. Kepeninė siurbikė, parazituodama galvijų organizme, sukelia didžiulius ekonominius nuostolius – sumažėja pieno ir mėsos produkcija, padidėja gaištamumas bei antrinių infekcijų tikimybė, skerdyklose brokuojamos pažeistos kepenys (15). Šis parazitas sukelia ūmų, poūmį ir lėtinį galvijų užsikrėtimą, kuomet netenkama dalies produkcijos, sulėtėja gyvulių augimo procesas, iššaukiami vaisingumo sutrikimai (39).
Suaugusiems galvijams dažniausiai pasireiškia slapta Fasciola hepatica parazitozės forma, kuri ir sukelia daugiausiai žalos. Nustatyta, jog ši forma lemia sumažėjusią pieno produkciją. Naudojantis bandos valdymo programomis, dažnai neužfiksuojama sirgimas slapta forma ir nustatoma netiksli diagnozė (27). Deja, nors ir laiku nustačius šią parazitozę, susiduriama su ekonominiais rūpesčiais - antihelmintikų naudojimas taip pat gana brangus (15,27).
Galimos fascioliozės stadijos:
1. Ankstyvų (nesubrendusių) F. hepatica formų migracija iš žarnyno į pilvo ertmę (prasideda 7 d. po infekcijos ir sukelia mechaninį pažeidimą bei peritonitą);
2. Ankstyvų (nesubrendusių) formų migracija kepenų parenchimoje 6-7 savaitę po infekcijos (sukelia audinių mechaninį pažeidimą ir uždegimą, ardo parenchiminę struktūrą);
3. Parazitavimas tulžies latakuose (nuo 6-7 savaitės po užsikrėtimo). Sukelia tulžies latakų pažeidimą, fibrozę, cirozę, sumažėjusį apetitą ir svorio netekimą (45).
Priklausomai nuo fasciolų kiekio, simptomai gali būti įvairūs. Pagrindiniai fascioliozės simptomai: silpnumas, edema, apetito praradimas/sumažėjimas, kacheksija (išsekimas), svorio netekimas, anemija, eozinofilija, kailio netekimas (43). Būdingas nereguliarus karščiavimas, žarnyno skausmas, kepenų padidėjimas, diarėja, cholangitas, eozinofilija (17,46). Ligos simptomai pasireiškia dėl kepenų, tulžies pūslės ir tulžies latakų trauminio pažeidimo, audinių nekrozės, toksinų poveikio (17). Užsikrėtimas šiuo parazitu daro įtaką pieno primilžiui, skerdenos kokybei, gyvulių prieauglis sunkiau priauga svorio ir užsitęsia laikas iki jų skerdimo (23,26). 2015 m. atliktame tyrime buvo
14 nustatyta, jog esant vidutinio sunkumo užsikrėtimui F. hepatica, pieno bendras primilžis sumažėja net iki 15 proc. (26). Mokslininkas Charlie taip pat nustatė (58), jog esant ūmiam užsikrėtimui, pieno produkcija mažėja 0,7 kg vienai karvei per dieną, pieno riebumas sumažėja 0,06 proc. ir 4,7 dienomis prailgėja vidutinė periodo tarp veršiavimųsi trukmė. Tokie rezultatai yra savotiška priešprieša nematodų sukeltoms parazitozėms, nes jų metu pieno rodikliai (baltymų, riebalų kiekis) išlieka mažai ar visiškai nepakitę.
1.1.5 Imunologinė reikšmė. Neseniai buvo atliekamos studijos su vakcina nuo Faciola hepatica. Tiriamųjų grupes sudarė natūraliai F. hepatica užsikrėtusios karvės. Viena grupė karvių buvo vakcinuota rekombinantine CL1 vakcina. Tyrimo rezultatai parodė, jog net 48 proc. sumažėjo faciolos nešiotojų vakcinuotose grupėse negu injekcijos negavusiose. Vakcinuoti galvijai turėjo kur kas didesnį IgG kiekį, kurie veikė su rekombinantine CL1 ir šis poveikis išliko visas 13 savaičių, kol vyko tyrimai. Mažesnis parazito perdavimas tarp atskirų galvijų gali būti pasiektas dėl vakcinacijos, kuri lemia sumažėjusią kiaušinėlių gamybą ir gyvybingumą, taip sumažinant ir ganyklų užterštumą (39).
Fasciola hepatica savo šeimininko organizme sukelia priešuždegiminę būseną, padidindama jautrumą daugeliui patogenų įskaitant ir Salmonella dublin. Užsikrėtimas fasciolioze sąlygoja galimybę užsikrėsti ir Chlostridium spp. (39). Mokslininkas Claridge savo tyrime atskleidė neigiamą ryšį tarp užsikrėtimo fasciolioze ir galvijų tuberkuliozės diagnozavimo intraderminiu testu net 3000 pieno ūkių visoje D. Britanijoje (39). Fasciolos turi savitą mechanizmą apsisaugoti nuo imuninio atsako: kepeninė siurbikė sintetina savo glikokalikso apvalkalą, kurį atpažįstamas ir surišamas imuninės sistemos Cb3. Praradusios savo apvalkalą suaugusios fasciolos nebeatpažįstamos imuninės sistemos ląstelių (21).
1.2 Diagnozavimas
Diagnozuojant užsikrėtimą kepeninėmis siurbikėmis, remiamasi klinikiniais požymiais, sezoniškumu, vyraujančiomis orų tendencijomis, praeityje ūkyje nustatytu užsikrėtimu Fasciola hepatica (16). Kadangi infekcijos dažnai yra subklinikinės, daliai gyvulių suaugėlės kirmėlės kepenyse randamos tik skerdyklose poskerdiminio tyrimo metu (21,59). Diagnozuoti fascioliozę gana sunku dėl ilgo prepatentinio periodo, kol pažeidžiamos kepenys ir sumažėja gyvulio produktyvumas (39). Pastaruoju dešimtmečiu padaryta pažanga taikant alternatyvius F. hepatica diagnozavimo metodus, kurie pagrįsti specifinių antikūnų nustatymu serume arba piene bei F. hepatica specifinių antigenų ar DNR identifikavimu išmatose (23). Todėl patvirtinant diagnozę, individualiems gyvuliams gali būti taikomas koprologinis tyrimas ar pieno bei serumo imunofermentinė analizė, matuojamas kepenų fermentų kiekis. Pieninėms bandoms gali būti atliekamas bendro pieno mėginio IFA tyrimas. Šis tyrimas nustato užsikrėtimą bandos mastu, gali parodyti aukštą, vidutinę, žemą ar
15 visiškai jokios reakcijos (60). Naudojant skirtingus tyrimo metodus, dažnai nustatomas nevienodas facioliozės paplitimas. Pavyzdžiui, Šveicarijoje 2006 m. įvairių regionų skerdyklų duomenimis, fasciolioze buvo užsikrėtę 8-15 proc. galvijų, tačiau kiti tyrimai nustatė didesnį (18 proc.) paplitimą. Taip pat Belgijoje nenustatytas F. hepatica užsikrėtimo sumažėjimas tiek 2006-2008 m., tiek 2009-2011 m. laikotarpiu, nors buvo įdėta daug pastangų kovai su šiuo parazitu – manoma, jog tai įvyko naudojant jautresnes tyrimo priemones nei anksčiau (23). Žmonių medicinoje fascioliozės nustatymui naudojami įvairūs tyrimai: komplemento surišimo reakcija, hemagliutinacijos inhibicijos testas, netiesioginė imunofluorescencija, imunodifuzija, imunoelektroforezė, priešpriešinė elektroforezė,
koprologinis tyrimas (46).
1.2.1 Koprologinis tyrimas. Rutininis tyrimas dažnai apsiriboja sedimentacijos metodu, kurio metu išmatų mėginiuose ieškoma suaugėlių fasciolų išskirtų kiaušinėlių (57). Šio tyrimo jautrumas svyruoja nuo 30 iki 70 proc., priklausomai nuo naudojamų išmatų kiekio. Tiriant ne mažesnį nei 30 g išmatų mėginį, tyrimo jautrumas gali padidėti iki 90 proc. (60). Metodo jautrumui daro įtaką ir šeimininko amžius, išmatų vandeningumas bei tepinėlių skaičius paruoštas iš vieno išmatų mėginio (11). Šiuo metodu tirti tikslinga tik praėjus ne mažiau 8-12 savaičių nuo infekcijos pradžios, kol subręsta suaugėlės kirmėlės, be to, dėl chroninės infekcijos dažnai kiaušinėliai yra išskiriami neperiodiškai, kas irgi apsunkina jų aptikimą (8,57). Sedimentacijos metodu paruoštuose išmatų mėginiuose randami dideli, neembrionuoti kiaušinėliai (45). F. hepatica ir Paramphistomum spp. kiaušinėliai identifikuojami pagal apvalkalo spalvą (61), taigi nustatomi du parazitozių tipai.
Klaidingai neigiamas rezultatas nustatomas esant nesubrendusioms siurbikėms, kurios dar neišskiria kiaušinėlių (62). Kiaušinėlių skaičiavimas - palyginti nebrangus tyrimo metodas, reikalaujantis gana paprastos įrangos, tačiau užimantis daug laiko, ypač, jei reikia tirti didelį mėginių kiekį (7). Nėra tikslios koreliacijos tarp kiaušinėlių išskyrimo ir parazituojančių fasciolų kiekio organizme. Tiriami mėginiai reprezentuoja tik mažą gyvūno išskiriamų kiaušinėlių dalį, kuriuose kiaušinėliai gali būti susikaupę, taip iškreipiant jų pasiskirstymą (61). Antra, esant inkubaciniam periodui bus gaunami klaidingai neigiami rezultatai (63). Galiausiai, fasciolų kiaušinėliai, išlikę tulžies pūslėje po sėkmingo gydymo antihelmintikais bei išsiskyrę iš organizmo duoda klaidingai teigiamą rezultatą (40,63). Taip pat, klaidingai teigiamas rezultatas gali būti suėdus fasciolomis užkrėstų kepenų ir jų kiaušinėliams patekus į žarnyną bei išmatas (15). Taip pat, svarbu pripažinti, jog tradicinis koprologinis tyrimas nėra pati geriausia įvykdoma priemonė, tiriant gausų mėginių skaičių (64).
1.2.2 Kraujo tyrimai. Esant F. hepatica infekcijai, morfologiniai kraujo tyrimai dažnai parodo anemiją (normochrominę normocitinę) dėl hemoragijų, susidariusių tiesiogiai besimaitinant siurbikėms. PCV kiekis taip pat būna sumažėjęs, vystosi eozinofilija. Taip pat sumažėja albuminų/globulinų santykis. Hipoalbuminemija išsivysto dėl baltymų praradimo parenchiminės
16 infekcijos stadijos metu, parazituojant nesubrendusioms siurbikėms bei dėl suaugėlių siurbikių parazitavimo tulžies latakuose. Globulinų kiekis padidėja dėl suintensyvėjusios imunoglobulinų sintezės. Specifinių kepenų fermentų kiekis padidėja tik esant ūmiai parazitozės formai – slapto/chroniško susirgimo metu jie dažniausiai išlieka nepakitę (1).
Kaip papildomas hematologinis tyrimas naudojamas fermentų kiekio plazmoje nustatymas esant ląstelių pažeidimams. Pažeidus parenchimines ląsteles atpalaiduojama gliutamato dehidrogenazė (GLDH) ir jos kiekis išlieka padidėjęs pirmosiomis savaitėmis po užsikrėtimo. Taip pat, ieškomas fermentas gamagliutamiltranspeptidazė (GGT). Jis išskiriamas esant tulžies latakų epitelinių ląstelių pažeidimui. Pastaroji išsiskiria siurbikėms pasiekus tulžies latakus ir kraujyje jos kiekis išlieka pakilęs ilgesnį periodą (16). Deja, kraujo ėmimas hematologiniam tyrimui nėra ekonomiškai naudinga procedūra pačiam ūkiui (1).
1.2.3 Imunologiniai tyrimai. Kepeninės siurbikės išskiria proteinkinazes (vadinamuosius ekskrecinius/sekrecinius antigenus), kurios ne tik ardo ekstraląstelinę struktūrą, bet ir yra naudingos imunodiagnostikoje. (15) Imunofermentiniai aptikimo metodai pagrįsti antikūnų radimu prieš specifinius parazito antigenus ypač išpopuliarėjo, nes gaunami gana tikslūs rezultatai (57). Imunofermentinis tyrimas yra pagrįstas šeimininko antikūnų radimu kaip infekcijos patvirtinimu (65). Antikūnius nustatantys IFA tyrimai pagrįsti ekskrecinių – sekrecinių (E/S) medžiagų identifikavimu. Viena iš jų - katepsino L proteinazė (angl. CatLs), grupė endopeptidazių, sekretuojamų dideliais kiekiais nesubrendusių ir suaugėlių fasciolų epitelio ląstelių (2). IFA tyrimas leidžia ištirti didesnį kiekį mėginių vienu metu ir jis neapsiriboja tik viena tiriamąja medžiaga – galima tirti tiek kraują ar pieną (7). Šis tyrimas neinvazyvus, mėginiai surenkami netrukdant bendros ūkio tvarkos (66). IFA tyrimu antikūnus nustatyti galima gana anksti, 2-4 savaitės nuo užsikrėtimo (pikas pasiekiamas tarp 8 ir 10 savaitės po infekcijos), tačiau antikūnai, esantys serume, gali išlikti net 4-10 savaičių po gydymo, todėl galimas klaidingai teigiamas rezultatas (67,68). Daugumos IFA tyrimų (nustatančių antikūnus) jautrumas yra gana didelis, siekia 86-100 proc., o specifiškumas 83-96 proc. (23). IFA tyrimai parodė, jog dėl kiekvienos bendro pieno mėginio rezultato 0,1 reikšmės padidėjimo netenkama apie 0,11 kg/dieną produkcijos kiekvienai karvei. Taip pat, nustatyta, kad tyrimo rezultatų optinio tankio santykiui viršijus 0.8 reikšmę, bandos laikotarpis tarp veršiavimosi pailgėja vidutiniškai 4-5 dienomis (1). Pritaikant IFA, dažnai galima nustatyti tik vieną parazito rūšį, kas dažnai yra ekonomiškai nenaudinga ūkiui, nes pasitaiko daugiarūšiai parazitiniai susirgimai (1). Galimos kryžminės reakcijos tarp atskirų parazitų rūšių, taip nustatant klaidingus rezultatus ir apsunkinant diagnozės tikslumą (57). Antikūnus aptinkanti IFA įprastai sukurta aptinka užsikrėtimą vienos rūšies parazitu (2). Didelis F. hepatica and Paramphistomum spp. ekskrecinių/sekrecinių antigenų panašumas ir galima kryžimė-imuninė reakcija, reikalauja, jog atliekant IFA tyrimą, būtų atlikta tiksli duomenų analizė ir būtų galimybė išskirti šias dvi rūšis tarpusavyje, pavyzdžiui, atliekant
17 papildomus koprologinius tyrimus (57). Antikūnai kraujo serume pasirodo anksčiau negu piene ir antikūnų koncentracija serume maždaug 30 kartų didesnė nei piene (69). Šiuo metodu gali būti tiriami tiek individualūs, tiek bendras visos bandos pieno mėginys, tačiau vertinant rezultatus pastebimi skirtumai. Bendras pieno mėginys – tai jungtinis kiekvienos laktuojančios karvės bandoje pieno mėginys, todėl daug veiksnių gali paveikti antikūnų titrą (individų skaičius ir seroteigiamumas, parazitozės stadija, laktacijos tarpsnis, ligos dėl infekcijos, pieno išeiga) (66). Neigiamas pieno IFA rezultatas nereiškia, kad bandoje visiškai nėra F. hepatica užsikrėtusių karvių. Šis tyrimas turi slenkstinę antikūnų koncentraciją, kuri, jei nėra pasiekiama, nerodys teigiamo rezultato (67,70). Todėl reikalinga tam tikra užsikrėtusių bandos individų proporcija bendrame pieno mėginyje (66). Priklausomybė tarp užkrėstų gyvulių skaičiaus ir bendro pieno mėginio rezultato gali būti sudėtinga – šis matavimas dar žinomas kaip „paplitimas bandoje“ (angl. withinherd prevalence) ir jis suteikia apytikslę ribinę reikšmę teigiamam testo rezultatui (67,70). Bendro pieno mėginio tyrimas IFA metodu užtikrina visos bandos stebėseną ir statusą F. hepatica atžvilgiu, o individualių pieno mėginių tyrimas – nustato paplitimą bandos viduje (12). Dar vienas IFA tyrimo minusas – į tiriamą bendrą pieno mėginį nėra įtraukiami nelaktuojantys gyvūnai bei gyvūnai, kurie serga ar yra gydomi išlauką turinčiais medikamentais ir jų pienas nepatenka į bendrą rezervuarą (65). Komerciniai IFA testai gali nustatyti Faciola hepatica antigenus tiriant serumą ar pieną, o naujausi, skirti išmatų mėginiams, šiuo metu tobulinami, nes tirti kraujo serumą didelėms bandoms gana brangu. (15) IFA antikūnų testai pasižymi minimaliais apribojimais: negali nustatyti naujai patekusios infekcijos, atskirti šiuo metu esančios infekcijos nuo jau pasireiškusios (64). IFA testas leidžia nustatyti infekciją 5–iomis savaitėmis anksčiau negu kiaušinėlių skaičiavimas išmatose. (15) Paskelbta, jog F. hepatica ir D. viviparus testai pasižymi aukštu jautrumu ir specifiškumu. IFA gali būti naudojama nustatant svarbių helmintų infekciją, tai neinvazinis, nebrangus tyrimas, juo puikiai galima nustatyti užsikrėtimo židinius (64). Mezo 2010 metais vertino IFA efektyvumą, nustatant Fasciola hepatica užsikrėtimą ir tiriant individualius pieno mėginius ir kraujo serumo mėginius - įrodytas stiprus ryšys tarp pieno ir serumo tyrimo rezultatų (R2=0.84; p<0.001). Bendra IgG koncentracija suaugusių karvių piene yra
25-30 kartų mažesnė nei kraujo serume (6).
1.2.4 Koproantigeno nustatymas. Nustatyti užsikrėtimą fasciolioze galima naudojantis komerciniais monokloninių antikūnų testais, kurie nustato F. hepatica koproantigeną karvės išmatose (1,39). Koproantigeno radimu paremta IFA nustato ir išmatuoja antigenų kiekį, kurį sekretuoja siurbikės žarnynas nuo to laiko, kai fasciolos patenka į šeimininko tulžies latakus (10). Naudojant šį tyrimą, galima nustatyti infekciją 2 - 3 savaites prieš randant siurbikių kiaušinėlius išmatose (62). Koproantigeno IFA yra tinkama priemonė Fasciola hepatica gydymo veiksmingumui stebėti tik jei yra užsikrėtimas suaugusiomis siurbikėmis – organizme esant nesubrendusioms siurbikėms šis tyrimas ne toks patikimas (7). Neigiamas rezultatas gaunamas esant mažam parazituojančių fasciolų
18 skaičiui arba jei jos nesubrendusios ir labai mažos, kuomet sekrecijos produktai nepasiekia minimalios koncentracijos reikalingos teigiamam rezultatui (62). Kai kurie autoriai (Brockwell, Flanagan, Gordon) rekomenduoja koproantigeno IFA, kaip standartinį diagnostikos tyrimą, naudoti antiparazitinių vaistų efektyvumui nustatyti po gydymo kurso (71–73). Eksperimentų metu, testas parodė labai didelį jautrumą suaugėlėms fascioloms ir jų metacerkarijoms. Neseniai, atliekant koproantigeno IFA tyrimą, gauti skirtingi rezultatai naudojant testą lauko sąlygomis, kas leidžia daryti išvadą, jog reikia daugiau tyrimų, tačiau testo naudingumas ir jo gebėjimas greitai nustatyti flukicido gydymo efektyvumą pavertė jį kaip pageidautiną metodą tiriant užsikrėtimą fasciolomis (39).
1.2.5 Molekuliniai tyrimai. DNR tyrimai atliekami palyginti retai, ypač nustatant užsikrėtimą fasciolioze bandų mastu. Palyginus naujas molekulinis metodas naudojant LAMP (angl. Loop-mediated isothermal amplification) gali surasti siurbikių DNR medžiagą išmatose 1 savaitė po infekcijos (74). PGR metodas pasižymi dideliu jautrumu galvijų išmatų mėginiams su mažu kiaušinėlių skaičiumi (FEC) (<10 EPG) (75). Studijos parodė, jog realaus liko PGR ir koproantigeno IFA tyrimai yra patogesni ir leidžia didesnį mėginių našumą negu tradicinis sedimentacijos metodas, ypač, jei reikalingas pakartotinis kiaušinėlių skaičiavimas (7,75). Taip pat, buvo atlikti tyrimai su avimis ir nustatyta, jog PGR metodas geba nustatyti F. hepatica 2 savaitės nuo infekcijos pradžios, dar prieš susidarant specifiniams antikūnams kraujyje ir išsiskiriant F. hepatica kiaušinėliams su išmatomis (76). Atliekant DNR tyrimus, egzistuoja ilgesnis mėginių laikymo terminas, kuriuos galima panaudoti ir kitiems tyrimams (pvz. PGR tyrimas nematodams nustatyti) (77,78). Buvo atliktas tyrimas, kurio metu buvo lyginami trys fascioliozės nustatymo metodai. Nepaisant to, kad PGR metodas nesugebėjo nustatyti teigiamų mėginių 2 savaitę po infekcijos, ženklių diagnostikos našumo skirtumų tarp trijų taikytų metodų (PGR tyrimo, sedimentacijos ir koproantigeno IFA) 8 savaitę po infekcijos nenustatyta (8).
19
2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA
2.1 Tyrimo objektas
Tyrimai buvo atliekami nuo 2017 m. vasario mėn. iki 2018 m. vasario mėn. Pieninių galvijų ūkiai buvo atrenkami pagal bandos dydį, kuriame turėjo būti laikoma ne mažiau kaip 6 karvės, vyresnės nei 1 metų. Atrinkta 16 karvių bandų, kurios išsidėsčiusios Tauragės (n=10) ir Kauno (n=6) apskrityse. Šie rajonai pasirinkti pagal ankstesnio tyrimo metu skerdyklose atliktą poskerdiminę analizę, kuria buvo nustatytas didelis F. hepatica paplitimas šiose vietovėse.
Tyrimui išmatų mėginiai paimti iš bent 10 proc. ūkyje esančių karvių. Iš mažų ūkių, kuriuose buvo ne daugiau nei 10 vnt. karvių, imti visų karvių išmatų mėginiai. Iš tų pačių ūkių buvo paimti pieninių karvių bendrojo pieno mėginiai IFA tyrimui atlikti (iš viso 16 vnt.).
1 pav. Tyrimo eigos schema (sudaryta magistrinio darbo autorės)
Rezultatai gauti: 1) atliekant koprologinį karvių išmatų tyrimą standartiniu sedimentacijos metodu; 2) atliekant koprologinį karvių išmatų tyrimą modifikuotu sedimentacijos metodu; 3) atliekant bendro pieno mėginio IFA tyrimą (1 pav.).
Tyrimai buvo atlikti Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, veterinarijos akademijos, veterinarinės patobiologijos katedros laboratorijoje.
I etapas. Pieninių galvijų bandų atranka
II etapas. Išmatų ir pieno mėginių ėmimas pasirinktose bandose
III etapas. Bendro pieno mėginio IFA III etapas. Išmatų koprologinis tyrimas
Modifikuotas sedimentacijos metodas Standartinis sedimentacijos metodas
20
2.2 Koprologiniai tyrimai
Darbo metu buvo atliekami koprologiniai tyrimai: išmatų mėginiai paruošiami dviem sedimentacijos metodais (standartiniu ir modifikuotu) ir tepinėliai tiriami mikroskopu, ieškant Fasciola hepatica kiaušinėlių. Sedimentacijos metodu nustatomi ne tik F. hepatica, bet ir Paramphistomum spp., kiaušinėliai, kuriuos tarpusavyje reikia diferencijuoti, todėl nuspręsta į tyrimą įtraukti ir Paramphistomum spp. tyrimo rezultatus. Išmatų mėginiai buvo renkami tiesiogiai iš tiesiosios žarnos. Buvo užtikrinama, jog švari rektinė pirštinė būtų naudojama atskirai kiekvienai karvei. Gabenant mėginius bei laikant juos laboratorijoje palaikyta + 4 °C temperatūra. Maksimalus laikas tarp mėginio paėmimo fermoje iki jo paruošimo – ne ilgiau kaip 48 val. Standartiniam sedimentacijos metodui atlikti naudota: a) elektroninės svarstyklės; b) špatelis; c) vienkartinės plastmasinės stiklinės; d) stiklinė kolba; e) filtras/koštuvas (arbatinis tinklelis su 0,5 mm dydžio skylutėmis; f) konusinės taurės; g) metileno mėlio tirpalas (1 proc.); h) pipetė; i) mikroskopas; j) objektiniai ir dengiamieji stikleliai. Tyrimo eiga:
1) pasveriama 10 g išmatų (0,1 g tikslumu) ir įdedama į vienkartinę stiklinę;
2) homogenizavimas – į stiklinę su išmatomis įpilama 250 ml vandens ir maišoma 30 sekundžių;
3) per stambų filtrą (sietelį) suspensija perkošiama į konusinę taurę ir paliekama 10-30 min. stovėti (stambioms nuosėdoms nusėsti);
4) nuosėdoms nusistovėjus, nupilamas vanduo, pakartotinai užpilama 250 ml vandens ir viskas išmaišoma. Gauta suspensija laikoma 15 min., o po to nupilamas vanduo;
5) ant nuosėdų užpilama 100 ml vandens, įlašinami 5 lašai metileno mėlio (1 proc.) tirpalo. Šis tirpalas padeda lengviau pastebėti ir diferencijuoti parazitų kiaušinėlius nuo aplinkinių objektų matymo lauke;
6) po 5 min nupilamas vanduo (iki nuosėdų). Iš taurės dugno su pipete paimamas lašas suspensijos (kartu su nuosėdomis) ir užlašinamas ant 5 objektinių stiklelių. Tada uždedamas dengiamasis stiklelis ir paruošti tepinėliai tiriami mikroskopu (naudojant 40 kartų didinantį objektyvą) bei ieškoma F. hepatica bei Paramphistomum spp. kiaušinėlių.
Modifikuoto sedimentacijos tyrimo metodika pritaikyta pagal IJP: Drugs and Drug Resistance straipsnį „First report of closantel treatment failure against Fasciola hepatica in cattle“ (79). Naudotos tokios pat priemonės kaip ir aukščiau aprašytam tyrimui. Tyrimo eiga:
1) pasveriama 30 g išmatų (0,1 g tiklumu) ir įdedama į vienkartinę stiklinę;
2) homogenizavimas – į stiklinę su išmatomis įpilama 100 ml vandens ir turinys sumaišomas; 3) filtravimas – šis procesas atliekamas naudojant tris skirtingų akučių dydžių sietus: 500 µm, 250
µm ir 50 µm. Sietai uždedami vienas ant kito mažėjančia tvarka (500 µm akučių dydžio sietą dedant viršuje ir apačioje paliekant 50 µm akučių dydžio sietą). Homogenizuota suspensija
21 pilama į viršutinį (500 µm) sietą. Nukreipus silpną vandens srovę į sietus, tekantis vanduo filtruoja išmatas per sietus. F. hepatica ir Paramphistomum spp. kiaušinėliai sulaikomi ir nusėda apatiniame (50 µm) siete;
4) filtratas iš apatinio sieto nupilamas vandens srovele į konusinę taurę ir paliekamas nusistovėti 10-30 min.;
5) paviršiuje nusistovėjusios medžiagos kartu su vandeniu nupilamos. Pakartotinai užpilama 250 ml vandens ir viskas išmaišoma. Gauta suspensija laikoma 15 min., po to vėl nupilamas vanduo; 6) ant nuosėdų užpilama 100 ml vandens, į taurę įlašinama 5 lašai metileno mėlio (1 proc.) tirpalo; 7) po 5 min nupilamas vanduo (iki nuosėdų). Iš taurės dugno su pipete paimamas lašas suspensijos (kartu su nuosėdomis) ir užlašinamas ant 5 objektinių stiklelių. Tada uždedamas dengiamasis stiklelis ir paruošti tepinėliai mikroskopuojami (naudojant 40 kartų didinantį objektyvą) bei ieškoma F. hepatica bei Paramphistomum spp. kiaušinėlių.
2.3 Imunofermentinė analizė
Taip pat, buvo nustatomi specifiniai antikūnai pieno mėginiuose naudojant IFA testą. Visi reikalingi komponentai atšildomi iki 21°C +/- 3°C. Pieno mėginiai centrifuguojami 20 min. Naudojant stiklinę Pasteur‘o pipetę nuimamas vidurinysis skysčio sluoksnis, stengiantis neliesti apačioje nusėdusio ląstelių sedimento. Pieno mėginiai praskiedžiami santykiu 1:4 mikrolėkštelėse. Padalinta po 60 µl kiekvieno pieno mėginio į mikrošulinėlius (angl. microwells) praskiedimo lėštelėje. Pridėta po 180 µl skiedimo buferio ir švelniai sumaišoma 5 kartus. Išpilstoma po 100 µl gauto skysčio į rinkinio mikrolėkšteles, laikantis tokios tvarkos: teigiamas serumas: šulinėliai A1 ir A2, 1 mėginys: šulinėliai B1 ir B2, 2 mėginys: šulinėliai C1 ir C2 ir t.t. Lėkštelė inkubuojama 21 °C +/- 3°C temp. 1 val. Pridengiama dangteliu. Praėjus laikui, lėkštelė išplaunama su plovimo tirpalu – išpilamas mikrolėkštelės turinys, stipriai apverčiant ją virš kriauklės. Nusausinama pridėjus mikroplokštelę prie švaraus minkšto popieriaus. Šulinėliai užpildomi plovimo tirpalu spaudimo butelį, Plovimo procedūra kartojama dar 2 kartus. Konjugatas atskiedžiamas santykiu 1:50 su praskiedimo buferiu. Į kiekvieną šulinėlį įpilama po 100 µl konjuguoto skiediklio buferio. Inkubuojama 1 val. 21 °C +/- 3°C, uždengus plokštelę dangteliu. Vėliau išplaunama kaip aprašyta anksčiau. Įpilama po 100 µl chromogeninio tirpalo į kiekvieną šulinėlį. Inkubuojama 10 min. 21 °C +/- 3°C temp. apsaugant nuo šviesos, bet neuždengiant. Įpilama po 50 µl stop tirpalo į kiekvieną šulinėlį. Optinis tankis nustatomas mikrošulinėliuose naudojant skaitytuvą ir 450 nm filtrą.
Imunofermentinės analizės tyrimo rezultatai įvertinti ir apskaičiuoti pagal optinio tankio duomenis (tiriamojo mėginio OP dalinamas iš kontrolinio teigiamo OP ir padauginamas iš 100). Gautos vertės (V) priskiriamos atitinkamai užsikrėtimo grupei:
22
10 proc.≤ V < 15 proc. prilyginama „1“ arba abejotinam užsikrėtimui (tokiu atveju rekomenduojama pakartoti testą po mėnesio)
15 proc. ≤ V <45 proc. prilyginama „2‘ arba silpnam užsikrėtimui
45 proc. ≤ V < 75 proc. prilyginama „3“ arba vidutinio stiprumo užsikrėtimui
75 proc. ≤ V prilyginama „4“ arba labai gausiam užsikrėtimui.
2.4 Statistinė analizė
Koprologinių ir IFA tyrimų duomenys suvesti į Microsoft© Excel programą. Apskaičiuota aprašomoji statistika – aritmetiniai vidurkiai, vidutinis kvadratinis nuokrypis, vidurkio paklaida, mažiausia reikšmė, didžiausia reikšmė, mediana, pasikliautiniai intervalai (PI). Statistinė analizė atliekama naudojantis IBM SPSS® Statistics 24.0 (Niujorkas, JAV) programa. Kokybinių rodiklių tarpusavio sąsaja nustatyta naudojant Chi kvadrato (χ2) testą, logistinės regresijos modelį. Visi duomenys buvo koduojami: 1) koprologinio tyrimo rezultatai: mėginys, kuriame nerasta parazito kiaušinėlio – „0“, mėginys, kuriame rastas bent 1 kiaušinėlis – „1“; 2) IFA tyrimo rezultatai: a) bendros reikšmės - mėginys rodantis neigiamą reakciją – „0“, mėginys rodantis teigiamą reakciją – „1“; b) reakcijos stiprumas: „0“ – jokios reakcijos, „1“- abejotina reakcija, „2“ – silpna reakcija, „3“ – vidutinė reakcija, „4“ stipri reakcija. Statistinio patikimumo vertė pasirinkta p<0,05 (jei ši sąlyga buvo išpildoma, duomenys laikyti statistiškai patikimais). Skaičiuojant sedimentacijos metodų jautrumus, naudotas virtualus statistinių duomenų diagnostinis kalkuliatorius (http://araw.mede.uic.edu/cgi-bin/testcalc.pl). Naudojantis pavyzdine lentele (2 pav.), sudarytos 2x2 lentelės, nurodančios teigiamų/neigiamų mėginių skaičių, rastą ištyrus abiem sedimentacijos metodais.
23
3. TYRIMO REZULTATAI
3.1 Koprologinio tyrimo rezultatai
Tiriamąją imtį sudarė 16 ūkių, laikančių pienines karves. 75 proc. imties (n=12) sudarė ūkiai auginantys tik pieninio tipo galvijus, 18,8 proc. (n=3) sudarė laikantys pienines bei mėsines karves bei 1 ūkis (6,2 proc.) laikantis pienines karves ir avis. 2-juose ūkiuose (12,5 proc.) iki tyrimo buvo taikytas medikamentinis gydymas nuo F. hepatica – gydytas tik galvijų prieauglis.
Galvijų išmatų mėginius ištyrus standartiniu sedimentacijos metodu (n=146) nustatyta, jog iš viso 27 karvės yra užsikrėtusios F. hepatica (18,5 proc.; 95 proc., PI 12,6-25,8) (3 pav.). 4 karvių išmatose buvo rasta Paramphistomum spp. (2,7 proc.; 95 proc., PI 0,75-6,87). Analizuojant rezultatų duomenis pastebėta, jog dvigubas užsikrėtimas (F. hepatica ir Paramphistomum spp.) yra būdingas 1,4 proc. visų tirtų karvių (n=2; 95 proc., PI 0,17-4,86). Išmatas tiriant modifikuotu sedimentacijos metodu paaiškėjo, jog iš viso 51 individas buvo užsikrėtęs fasciolomis (34,9 proc.; 95 proc., PI 27,2-43,3). Šiuo metodu tirtose išmatose 6,2 proc. karvių (n=9; 95 proc., PI 2,8-11,4) rastas užsikrėtimas Paramphistomum spp. Dvigubas užsikrėtimas rastas 6 karvių išmatų mėginiuose (4,1 proc.; 95 proc., PI 1,5-8,73).
3 pav. Bendras užsikrėtimas Fasciola hepatica bei Paramphistomum spp.
Atsižvelgiant į geografinį ūkių pasiskirstymą, naudojant standartinį sedimentacijos metodą nustatyta, jog didžiausias F. hepatica paplitimas yra Tauragės rajone esančiose 7-iose bandose (95 proc., PI 19,75-70,12) (4 pav.). Modifikuotu sedimentacijos metodu didžiausias užsikrėtimas taip pat
18,5% 2,7% 34,9% 6,2% 0% 5% 10% 15% 20% 25% 30% 35% 40%
Fasciola hepatica Paramphistomum spp.
Užsi kr ėtu si ų kar vių s kai či u s (p ro c.)
24 nustatytas Tauragės rajono ūkiuose – 9-iuose iš 10 buvo rasta parazito kiaušinėlių (95 proc. PI 29,88-80,25).
4 pav. Fasciola hepatica paplitimas Kauno ir Tauragės rajonuose
Atlikus kiaušinėlių kiekio mėginiuose analizę, nustatyta, jog standartiniu sedimentacijos metodu 81,5 proc. (n=119; 95 proc., PI 74,3-87,4) mėginių F. hepatica kiaušinėlių nebuvo rasta. Suskirsčius rastų kiaušinėlių skaičių į grupes, paaiškėjo, jog daugiausiai (14-oje mėginių) buvo rasta po 1 kiaušinėlį (95 proc., PI 5,3-15,6) (5 pav.) Vienuolikoje mėginių nustatytas kiaušinėlių skaičius varijavo nuo 2 iki 7 vnt. Gausesnis užsikrėtimas (≥ 8 vnt.) F. hepatica kiaušinėliais užfiksuotas mažiausiame kiekyje mėginių - tik 2-uose išmatų mėginiuose.
5 pav. Fasciola hepatica kiaušinėlių kiekis mėginiuose, nustatytas standartiniu sedimentacijos metodu 6,3% 43,8% 12,5% 56,3% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60%
Kauno raj. Tauragės raj.
Pa p liti mas (p ro c.)
Standartinis sedimentacijos metodas Modifikuotas sedimentacijos metodas
9,6% 7,5% 1,4% 0% 2% 4% 6% 8% 10% 12% 1 2 - 7 ≥8 Mė gi n ių s kai či u s (p ro c.) Kiaušinėlių kiekis
25 Analizuojant modifikuoto sedimentacijos metodo rezultatus, nustatyta, jog 65,1 proc. mėginių buvo neigiami (n=95; 95 proc., PI 56,8-72,8). Daugiausiai mėginiuose buvo rasta negausi infekcija - 1 kiaušinėlis (95 proc., PI 3,3-12,24) (6 pav.). Didžiausiame kiekyje mėginių (27-iuose) nustatytas parazito kiaušinėlių skaičius nuo 2 iki 7 vnt. (95 proc., PI 12,56-25,75). 14-iolikoje mėginių nustatytas gausiausias kiaušinėlių skaičius (≥ 8 vnt.) (95 proc., PI 5,34-15,57).
6 pav. Fasciola hepatica kiaušinėlių kiekis mėginiuose, nustatytas modifikuotu sedimentacijos metodu
Lyginant mėginiuose rastų kiaušinėlių kiekį, pastebima, jog tiriant modifikuotu sedimentacijos metodu nustatytas didesnis užsikrėtimas nei naudojant standartinį sedimentacijos metodą ir yra didesnė tikimybė aptikti kiaušinėlius mėginyje. Nepaisant to, jog statistiniai skaičiavimai neparodė statistiškai patikimo ryšio (p>0,05), modifikuotas sedimentacijos metodas nustatė didesnį gausių infekcijų (≥ 8 vnt.) kiekį nei standartinis sedimentacijos metodas (9,6 proc. ir 1,4 proc. atitinkamai). Aiškinantis fascioliozės paplitimą ūkių lygmeniu, modifikuotu sedimentacijos metodu užfiksuotas 68,8 proc. šios parazitozės paplitimas - kiaušinėlių rasta 11-oje iš 16 ūkių (95 proc., PI 41,3-89,0), o pačiuose ūkiuose jis varijavo nuo 9,1 proc. iki 100 proc. (7 pav.). Tiriant standartiniu sedimentacijos metodu nustatytas 50 proc. paplitimas ūkių tarpe (n=8; 95 proc., PI 24,65-75,35), o bandose jis siekė nuo 10 proc. iki 50 proc.
Didžiausias užsikrėtimas nustatytas ūkyje Nr. 15 – standartiniu sedimentacijos metodu nustatytas 50 proc. (n=3, 95 proc., PI 11,8-88,2) užsikrėtimas bei 100 proc. (n=6, 95 proc., PI 54,1-100,0) užsikrėtimas tiriant modifikuotu sedimentacijos metodu. Mažiausias užsikrėtimas nustatytas modifikuotu sedimentacijos metodu, užfiksuotas ūkyje Nr.1 – siekė 9,1 proc. (n=1, 95 proc., PI 0,23-41,3). Tiriant standartiniu sedimentacijos metodu, mažiausiai užsikrėtusių karvių rasta ūkyje nr. 3 – jis siekė 10 proc. (n=1, 95 proc., PI 0,3-44,5).
6,9% 18,5% 9,6% 0% 2% 4% 6% 8% 10% 12% 14% 16% 18% 20% 1 2 - 7 ≥ 8 Mė gi n ių s kai či u s (p ro c.) KIaušinėlių kiekis
26 7 pav. Užsikrėtimo Fasciola hepatica gausumas ūkiuose
3.2 Imunofermentinio (IFA) tyrimo rezultatai
Ištyrus visų ūkių (n=16) bendro pieno mėginius, užsikrėtimas fasciolioze nustatytas 62,5 proc. visų ūkių (n=10; 95 proc., PI 35,4-84,8). Likusiuose 6-iuose ūkiuose (37,5 proc.; 95 proc., PI 15,2-64,6) IFA analizė parodė neigiamą reakciją (rezultatas „0“). Tyrimo nustatytų reakcijų stiprumas varijavo nuo „silpnos invazijos“ iki „vidutinės invazijos“. Daugiausiai nustatyta vidutinė invazija – 37,5 proc. visų tirtų ūkių (n=6, 95 proc. PI 15,2-64,6), likusią dalį sudarė nustatyta silpna invazija – 25 proc. visų tirtų ūkių (n=4, 95 proc. PI 7,3-52,4) (8 pav.). Gausiausias užsikrėtimas F. hepatica nustatytas Tauragės rajone esančiuose ūkiuose – iš viso 9-iose bandose (90 proc., 95 proc., PI 55,5-99,8) nustatyta teigiama reakcija (3-juose identifikuotas silpnas užsikrėtimas, 4-iuose – vidutinio laipsnio reakcija). 7 šio rajono ūkiai pasižymėjo šlapiomis ganyklomis (70 proc., 95 proc., PI 34,8 -93,3). Tik vienas bendro pieno mėginys, paimtas iš Kauno rajone esančios bandos, buvo teigiamas (16,7 proc.; 95 proc., PI 0,42-64,1). 10,0% 50,0% 50,0% 20,0% 50,0% 42,9% 28,6% 50,0% 9,1% 30,0% 10,0% 40,0% 60,0% 90,0% 60,0% 70,0% 42,9% 71,4% 100,0% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% 1 Nr. 2 Nr. 3 Nr. 4 Nr. 6 Nr. 7 Nr. 8 Nr. 10 Nr. 13 Nr. 14 Nr. 15 Nr. Užsi kr ėti u si ų kar vių s kai či u s (p ro c.) Ūkio numeris
27 8 pav. IFA reakcijų ryškumo pasiskirstymas
3.3 Metodų palyginimas
Ūkių lygmenyje, visi trys taikyti tyrimo metodai parodė skirtingą F. hepatica paplitimą: didžiausias užsikrėtusių bandų skaičius (n=11) nustatytas modifikuotu sedimentacijos metodu (p<0,05, PI 41,3-89,0), mažesnis užsikrėtimas 10-yje bandų nustatytas pritaikant imunofermentinę analizę iš bendro pieno mėginių (PI 35,4-84,8), o mažiausias užsikrėtimas F. hepatica užfiksuotas standartiniu sedimentacijos metodu – šiuo metodu parazitas nustatytas 8-iuose pieninių galvijų ūkiuose (95 proc., PI 24,7-75,4). (9 pav.).
9 pav. Tyrimo metodų palyginimas, nustatant Fasciola hepatica paplitimą ūkių mastu
37,5% 25,0% 37,5%
0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100%
Ūkių skč.
IFA reakcijos stiprumas
Neigiama reakcija Silpna reakcija Vidutinio stiprumo reakcija
50,0% 68,8% 62,5% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% Užsi kr ėti mas ū ki u o se ( p ro c.) Tyrimo metodai
28 Lyginant koprologinių tyrimų ir IFA analizės rezultatus ūkių lygmenyje, nustatyti statistiškai patikimi duomenys (p<0,01), jog imunofermentine analize ketvirtadalio bandų, kurių išmatų mėginiuose atliekant koprologinį tyrimą standartiniu sedimentacijos metodu F.hepatica kiaušinėlių nebuvo rasta, bendro pieno mėginiuose identifikuota teigiama reakcija (10 pav.).
10 pav. IFA analizės ir sedimentacijos metodų teigiamų/neigiamų rezultatų palyginimas
Išsiaiškinta, jog modifikuotu sedimentacijos metodu trečdalio ūkių (n=5) išmatų mėginiuose F. hepatica kiaušinėlių nenustatyta, tačiau naudojant IFA identifikuoti iš viso 6 ūkiai, kurių bendro pieno mėginiuose buvo nustatyta neigiama reakcija, t.y. viename bendro pieno mėginyje IFA nenustatyta antikūnų prieš kepeninę siurbikę, tačiau šio ūkio išmatų mėginyje, ruošiant jas modifikuotu sedimentacijos metodu, aptikta parazito kiaušinėlių.
Detaliau analizuojant užsikrėtimo pasireiškimą ūkių lygmenyje, buvo nustatytas ryšys tarp IFA reakcijos stiprumo ir teigiamų mėginių skaičiaus rastų abiem sedimentacijos metodais, pasireiškimo dažnių. Gauti statistiškai patikimi duomenys (p<0,05), jog modifikuoto sedimentacijos metodo teigiamų mėginių skaičiui svyruojant nuo 0 iki 9,1 proc. (n=6), bendrajame pieno mėginyje nustatyta neigiama reakcija (1 lentelė). Ūkyje užsikrėtusių individų skaičiui padidėjus nuo 10 iki 42,9 proc. (n=4), imunofermentinė analizė nustatė silpną infekciją, o vidutinio stiprumo užsikrėtimas nustatytas teigiamų mėginių skaičiui siekiant 60-100 proc. (n=6).
75,0% 100,0% 9,1% 25,0% 100,0% 90,9% 0% 20% 40% 60% 80% 100% 120%
Neigiamas Teigiamas Neigiamas Teigiamas
Standartinio sed. metodo rezultatas Modifikuoto sed. metodo rezultatas
Mė gi n ių s kai či u s (p ro c.) IFA reakcija teigiama IFA reakcija neigiama
29 1 lentelė. IFA reakcijos ir modifikuoto sedimentacijos metodo pasireiškimo dažniai
Teigiami mėginiai, nustatyti modifikuotu sedimentacijos metodu (vnt. ir proc.)
0 9 10 30 40 43 60 70 71 90 100 IFA re a k c ija neigiama 5 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 83,3% 16,7% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% silpna 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0,0% 0,0% 25,0% 25,0% 25,0% 25,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% vidutinė 0 0 0 0 0 0 2 1 1 1 1 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 33,3% 16,7% 16,7% 16,7% 16,7%
Tie patys skaičiavimai atlikti lyginant IFA duomenis su standartinio sedimentacijos metodo rezultatais (2 lentelė). Šiuo atveju irgi gauti statistiškai patikimi (p<0,05), tačiau ne tokie konkretūs rezultatai: koprologinio tyrimo metu 6 ūkių mėginiuose neradus kiaušinėlių (0 proc.), imunofermentinės analizės rezultatai taip pat parodė neigiamą reakciją, tačiau silpna reakcija buvo stebima esant tiek 0-10 proc. bandos užsikrėtimui (n=3), tiek radus 42 proc. teigiamų mėginių (n=1). Esant 20 – 28 proc. (n=2) bei 50 proc. (n=4) bandos užsikrėtimui, naudojant IFA identifikuota vidutinio stiprumo reakcija. Iš lentelės duomenų matyti, jog esant 20 proc. ir didesniam užsikrėtimui, imunofermentinės analizės rezultatai rodo silpną reakciją bendro pieno mėginiuose.
2 lentelė. IFA reakcijos ir standartinio sedimentacijos metodo pasireiškimo dažniai
Taip pat, gauti statistiškai patikimi duomenys (p<0,01), jog tiek standartinio sedimentacijos metodo, tiek modifikuoto sedimentacijos metodo rezultatai (kiaušinėlių skaičius) silpnai teigiamai koreliavo su imunofermentinės analizės stiprumu atitinkamai R2=0,304 ir R2=0,448. Tai reiškia, jog
radus didesnį kiaušinėlių skaičių mėginyje, didėja tikimybė, jog naudojant IFA bendro pieno mėginyje bus nustatyta stipresnė reakcija.
Sedimentacijos metodų jautrumas, atsižvelgiant į individualių mėginių tyrimus, paskaičiuotas pagal teigiamų/neigiamų mėginių pasiskirstymą (3 lentelė). Standartiniu sedimentacijos metodu nustatyti 27 teigiami mėginiai (turintys bent 1 kiaušinėlį), o 25 vnt. - nustatyti kaip neigiami, tačiau modifikuotu sedimentacijos metodu pastarieji mėginiai identifikuoti kaip teigiami. Tokie mėginiai laikomi „klaidingai neigiamais‘ (angl. false negative).
Teigiami mėginiai, nustatyti standartiniu sedimentacijos metodu (vnt. ir proc.)
0 10 20 28 42 50 IFA re a k c ija neigiama 6 0 0 0 0 0 100,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% silpna 2 1 0 0 1 0 50,0% 25,0% 0,0% 0,0% 25,0% 0,0% vidutinė 0 0 1 1 0 4 0,0% 0,0% 16,7% 16,7% 0,0% 66,7%
30 Tuo tarpu modifikuotu sedimentacijos metodu pavyko surasti 51 teigiamą mėginį. 1 mėginys, tirtas standartiniu sedimentacijos metodu, identifikuotas kaip teigiamas, tačiau jį ruošiant modifikuotu sedimentacijos metodu parazito kiaušinėlių nebuvo rasta.
3 lentelė. Sedimentacijos metodais nustatytų teigiamų/neigiamų mėginių pasiskirstymas
Standartinis sedimentacijos metodas Modifikuotas sedimentacijos metodas
Užsikrėtę Neužsikrėtę Iš viso Užsikrėtę Neužsikrėtę Iš viso
Teigiami 27 0 10 51 0 11
Neigiami 25 94 6 1 94 6
Iš viso 52 94 146 52 94 146
Naudojantis 4 lentelės duomenimis ir internetine skaičiuokle (žiūrėti skiltyje „Statistinė analizė“) nustatyta, jog standartinio sedimentacijos metodo jautrumas tiriant individualiai yra 51,9 proc., o modifikuoto sedimentacijos metodo jis siekia 98,1 proc. Šie duomenys apskaičiuoti atsižvelgiant į teigiamų mėginių skaičių, kurio vienu sedimentacijos metodu nepavyko identifikuoti, tačiau kitu – pavyko nustatyti. Taip pat nustatyta, jog abu metodai pasižymėjo vienodu specifiškumu.
4 lentelė. Sedimentacijos metodų statistiniai parametrai
Standartinis sedimentacijos metodas Modifikuotas sedimentacijos metodas
Jautrumas 51,92% Jautrumas 98,08%
Specifiškumas 100,00% Specifiškumas 100,00%
Vieno ūkio išmatų mėginyje buvo rasti F. hepatica kiaušinėliai, tačiau taikant imunofermentinę analizę šio ūkio bendrame pieno mėginyje nustatyta neigiama reakcija, todėl IFA tyrimu ūkių lygmenyje nenustatytas 1 iš 11 užkrėstų ūkių , t.y. 9,1 proc. mėginių (n=1).
