INHIBITORINIŲ MEDŽIAGŲ NUSTATYMO PIENE METODŲ PALYGINIMAS

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA

Veterinarijos Fakultetas

DIANA PETKEVIČIENĖ

INHIBITORINIŲ MEDŽIAGŲ NUSTATYMO PIENE

METODŲ PALYGINIMAS

COMPARISON OF DIFFERENT METHODS FOR

ESTIMATING INHIBITORY SUBSTANCES IN THE MILK

Darbo vadovas: doc. dr. M. Stankevičienė

2 PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ

Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Inhibitorinių medžiagų nustatymo piene metodų palyginimas“:

1. Yra atliktas mano pačios;

2. Nebuvo naudojamas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje;

3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą panaudotos literatūros sąrašą. 2014.05.05 Diana Petkevičienė

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE

Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe. 2014.05.05 Diana Petkevičienė

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADOS DĖL DARBO GYNIMO

2014.05.05 Marija Stankevičienė

(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS UŽKREČIAMŲJŲ LIGŲ KATEDROJE

(aprobacijos data) (katedros vedėjo vardas, pavardė) (parašas)

Magistro darbas yra įdėtas į ETD IS

(gynimo komisijos sekretorės parašas)

Magistro baigiamojo darbo recenzentas

(data) (vardas, pavardė) (parašas)

Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:

3

TURINYS

ĮVADAS ... 6

1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 7

1.1. Pienas, pieno sudėtis, savybės ... 7

1.2. Pieno kokybė ... 10

1.3. Pašalinės medžiagos piene ... 12

1.4. Inhibitorinių medžiagų patekimo į pieną priežastys ... 17

1.5. Tetraciklinų ir β-laktamų grupės antibiotikai ... 20

1.6. Inhibitorinių medžiagų nustatymo metodai ... 21

2. EKSPERIMENTINIŲ TYRIMŲ METODIKA ... 29

2.1. Imunofermetinės analizės ELISA metodo taikymas tetraciklino likučiams piene nustatyti .. 30

2.2. Tyrimo atlikimas naudojant COWSIDE® II tyrimo metodą ... 33

2.3. Tyrimo atlikimas naudojant DELVOTEST® ... 35

2.4. Tyrimo atlikimas naudojant CHARM BLUE-YELLOW II tyrimo metodą ... 37

2.5. Tyrimo atlikimas naudojant CHARM ROSA MRL BL/TETTM metodą ... 40

3. EKSPERIMENTINIŲ TYRIMŲ REZULTATAI IR REZULTATŲ APTARIMAS ... 45

IŠVADOS ... 52

REKOMENDACIJA ... 53

4

SUMMARY

Author: Diana Petkevičienė

Title: Comparison of different methods for estimating inhibitory substances in the milk Thesis administered by: Dr. doc. Marija Stankevičienė

Thesis accomplished at: Lithuanian University of Health Sciences Veterinary Academy Thesis consists of: 57 pages, 19 pictures, 18 tables.

Thesis goal: Perform a comparison of different methods for analyzing them in determining the change of inhibitory residues in milk.

Thesis tasks:

1. To review the raw cow milk quality indicators and their influencing factors, To examine the causes for inhibitory substances into milk.

2. Examine the different methods for estimating inhibitory substances in the milk. 3. Using different research methods to identify residues of inhibitory substances in milk. 4. Compare the cost of research methods.

Research articles discusses the concept of milk in a similar perspective: milk - a biological fluid, produced by the mammary glands in your baby's feeding and protection from infectious diseases during the first few days of life (Urbienė, 2006). Milk contains more than 200 components, but the main components of milk are water, fat, protein, carbohydrates, minerals.

Milk quality is determined not only by its composition, but it falls within the material. Milk can be contaminated with various chemicals falling into it through the blood, feed, air and medications. Of the substance concerned is - antibiotics, heavy metal salts, pesticides, toxins, neutralizing and preserving materials, pharmaceuticals, and other mycotoxins. These materials are not only harmful to health but often interferes with milk production, a deterioration of their quality.

Generally for investigation of antimicrobial residues in food of animal was developed many techniques which can be divided into the microbiological, enzymatic, immunoassay or receptor assays and chemical physics. However, the use of any one method for antimicrobials MRL is not possible (Šalomskienė, ir kt., 2013).

Lithuania is subject to the control of antibiotic enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method, microbiological methods, as well as the agar diffusion method using a special test cultures (Žvirdauskienė ir kt., 2004; Šarkinas, 2011; Urbienė, ir kt., 2009; Šalomskienė, 2005).

Master's thesis research used methods to determine for tetracycline and β-lactam antibiotics residues in milk: Immunosorbent assay ELISA; spectrometric analysis; COWSIDE ® II; DELVOTEST ®; CHARM BLUE YELLOW-II; ROSA. Quick techniques, such as: COWSIDE II;

5 DELVOTEST, CHARM BLUE YELLOW-II and ROSA are fairly cheap, but a lower sensitivity and does not the exact concentration. Slower methods, eg. ELISA and spectrometric analysis, is expensive enough, but precise enough to determine the exact concentration of antibiotics.

If the aim is to explore milk with content of inhibitors from 5 ppb to 30 ppb, it is recommended to use ROSA 2 test method (price for one sample 12 Lt).

If the aim is to explore the inhibitor content of milk is over 20 ppb, it is recommended to use YELLOW BLUE CHARM II test method (6 Lt / pcs.). ELISA method is the most expensive conversion of one sample (32.5 Lt / pcs.), but it is the most accurate and precise enough antibiotics content determined.

6

ĮVADAS

Lietuvoje pastaruoju metu vyksta sparti pieno ūkio plėtra. Tai skatina iš Europos Sąjungos gaunama parama žemės ūkiui bei palankios sąlygos galvijininkystei plėtoti, nes pienas sudaro apie 60 proc. visų žemės ūkio naudmenų (Gaidžiūnienė, 2007).

Pienas ir jo produktai išlieka vieni svarbiausių mūsų kasdienės mitybos raciono dalis. Vokietijos pieno pramonės asociacijos (MIV) duomenimis, vidutiniškai per metus ES gyventojai suvartoja apie 28 proc. daugiau pieno produktų nei naujųjų ES valstybių gyventojai, tarp kurių yra ir Lietuva. LR statistikos departamento duomenimis 2008 m. vienas Lietuvos gyventojas vidutiniškai suvartojo 268 kg pieno ir jo produktų per metus. Piene yra daugiau kaip 200 įvairių medžiagų, reikalingų žmogaus organizmo ląstelėms atsinaujinti ir energijai gauti. Viename litre pieno yra vitamino A paros norma, būtina mūsų akims, 58 proc. kasdien mūsų kraujo gamybai reikalingo vitamino B2. Pusėje litro pieno yra 50-70 proc. žmogaus organizmui per parą reikalingo kalcio kiekio.

Didelis dėmesys kreipiamas į antibiotikų likučių kiekį piene, bei jo gaminiuose. Antibiotikai į pieno produktus patenka gydant gyvulius ar naudojant prevencijos tikslais, siekiant išvengti galvijų bandose užkrečiamų ligų protrūkių. Vartojant pieno produktus su antibiotikų likučiais, galimas neigiamas poveikis žmogui. Ligos atveju, tos pačios grupės antibiotikai tampa neveiksmingi, nes bakterijos įgauna atsparumą. Tačiau vartojant pieną ir jo produktus gali atsirasti ir nepageidaujančių medžiagų. Didžiąją dalį šių medžiagų sudaro antibiotikai.

Antibiotikų didėjimas maisto produktuose pradėtas tirti maždaug nuo 1940 metų. Vienas pirmųjų pranešimų apie antibiotikų likučius gyvūniniame maiste pateikė Starr ir Reynolds 1951 metais po eksperimentinio kalakutų šėrimo su streptomicinu (Dibner ir kt., 2007).

Antibiotikai priskiriami inhibitorinių medžiagų grupei, todėl siekiant kuo tiksliau įvertinti pieną ar pieno produktus būtina parinkti tyrimo metodus, įvertinant tyrimo metodo tikslumą, savitumą, jautrumą.

Darbo tikslas. Atlikti skirtingų tyrimo metodų palyginimą nustatant inhibitorinių medžiagų likučius piene.

Darbo uždaviniai:

1. Išnagrinėti žaliavinio karvių pieno kokybinius rodiklius, juos sąlygojančius veiksnius ir inhibitorinių medžiagų patekimą į pieną.

2. Apibūdinti skirtingus inhibitorinių medžiagų piene nustatymo metodus.

3. Nustatyti inhibitorinių medžiagų likučius piene taikant skirtingus tyrimo metodus. 4. Palyginti taikomų tyrimų metodų kainą.

7

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. Pienas, pieno sudėtis, savybės

Lietuvoje pienininkystė turi gilias tradicijas: karvė nuo seno buvo viena svarbiausių šeimos maitintojų. Formuojantis kapitalistiniams santykiams, kuriantis pramonei ir augant miestams, Lietuvos stambieji ūkininkai ir dvarininkai XIX a. pabaigoje – XX a. pradžioje ėmė didinti karvių bandas, rūpintis jų produktyvumu, pradėjo gauti daugiau pieno (Gudonis, 2007).

Pienas – tai biologinis skystis, kurį gamina žinduolių pieno liaukos savo naujagimio maitinimui ir jo apsaugojimui nuo infekcinių ligų pirmosiomis gyvenimo dienomis (Urbienė, 2006). Pienas yra visais atžvilgiais visavertis, jei atitinka galiojančio standarto reikalavimus. Kitokiu atveju jis gali tapti žalingas žmogui (Šernienė ir Sekmokienė, 2006).

Kiti autoriai teigia, kad pienas tai toks produktas, kuris yra vartojamas kaip priešnuodis apsinuodijus sunkiųjų metalų druskomis, rūgštimis, šarmais, jodu, bromu. Vartojant pieną, išvengiama hipovitaminozių ar avitaminozių. Trūksta vitamino A, žmogus suserga vištakumu, vitamino D – rachitu, E – tampa nevaisingas, kai trūksta B grupės vitaminų (B1, B2, B6) – sutrinka nervų sistema, B12 – susergama piktybine anemija, vitamino C – skorbotu, vitamino H – seborėja, PP – podagra.

A. Gudonis (2009) teigia, kad pienas – tai daugiakomponentė nepastovios sudėties ir sudėtinga sistema, kurios dispersinėje terpėje, t.y. vandenyje, yra ištirpusi ir nevienodai pasiskirsčiusi dispersinė fazė. Technologiniu aspektu pienas – žaliava, iš kurios gaminami įvairūs produktai.

Yra išskiriamos trys pagrindinės pieno sąvokos: žalias karvių pienas, pramoninis pienas (pienas skirtas gamybai) ir geriamasis pienas. Žalias karvių pienas – tai natūralus karvių pienas, nepašildytas iki aukštesnės kaip 40ºC temperatūros ir neapdorotas bet kokiu kitu lygiaverčio efektyvumo metodu, be priedų, ir yra natūralios pirminės sudėties. Pramoninis pienas – žalias pienas, skystas arba sušaldytas, gautas iš žalio pieno, neapdoroto arba apdoroto leidžiamu būdu, (terminio apdorojimo arba terminizavimo), kurio sudėtis buvo pakeista arba ne, užtikrinant, kad keičiama tik įdedant arba pašalinant natūralias pieno sudedamąsias dalis. Geriamasis pienas – termiškai apdorotas gaminys, kuris skiriamas parduoti vartojimui daugiau neapdorotas (Gudonis, 2009).

Pienas susideda iš daugiau kaip 200 sudėtinių dalių, tačiau pagrindiniai pieno komponentai yra vanduo, riebalai, baltymai, angliavandeniai, mineralinės medžiagos (1.1 lentelė). Be to, visos pieno sudėtinės dalys nėra stabilios, jos priklauso nuo daugelio veiksnių (Urbienė, 2006): karvių veislės, pašarų, laktacijos periodo ir kt.

8 1.1 lentelė. Pieno pagrindinių sudėtinių dalių kiekiai (procentais) (Urbienė, 2006)

Sudėtinės dalys Svyravimų ribos (proc.) Vidurkis (proc.)

Vanduo 85,5 – 89,5 87,0 Sausosios medžiagos 10,5 – 14,5 13,0 Riebalai 2,5 – 6,0 4,0 Baltymai 2,9 – 3,85 3,3 Angliavandeniai 3,6 – 5,5 4,6 Mineralinės medžiagos 0,6 – 0,9 0,7

Jau nuo seno pasaulyje paplitęs yra karvių pienas, gryno suvartojama bei iš jo pagaminti produktai sudaro apie 91 proc. viso suvartojamo pieno kiekio.

Pienas – vienas iš svarbiausių būtinų kasdieninės subalansuotos mitybos produktų. Pagal sudėtį pienas užima išskirtinę vietą tarp gyvūninės kilmės maisto produktą, kaip idealiai subalansuotas produktas, kadangi į jo sudėtį įeina beveik visi mitybiniu požiūriu svarbūs komponentai, reikalingi organizmui augti, vystytis, atsinaujinti (Bartkevičiūtė ir kt., 2006).

Pieno baltymai. Pieno baltymai daug lengviau pasisavinami negu mėsos baltymai ir

pasižymi gana didele biologine verte. Baltymuose yra visos nepakeičiamos, gerai subalansuotos, gyvybiškai būtinos aminorūgštys, iš kurių lengvai ir greitai pasigamina žmogaus organizmo baltymai. Baltymai jauniems žmonėms skatina naujų ląstelių statybą, o vyresniems žmonėms skatina pasenusių ląstelių atsinaujinimą.

Pieno riebalai. Pieno riebalai pagal maistingumą ir biologines savybes priskiriami prie

pačių vertingiausių riebalų. Jie yra emulsijos pavidalo, todėl šias medžiagas organizmas lengvai pasisavina. Į pieno riebalų sudėtį įeina įvairios riebalų rūgštys: sočiosios ir nesočiosios (apie 60 proc. sočiųjų ir 40 proc. nesočiųjų rūgčių).

Pieno angliavandeniai. Svarbiausias pieno angliavandenis – laktozė (pieno cukrus). Piene

jis ištirpęs, o išskirtas iš pieno yra kristalo pavidalo. Laktozė yra 3-5 kartus mažiau saldesnė už sacharozę.

Mineralinės medžiagos, mikroelementai. Piene yra beveik visų būtiniausių organizmui

mineralinių medžiagų. Labai svarbūs - kalcis ir fosforas, kurie tarpusavyje sudaro idealų santykį, greitam pasisavinimui. Pienas yra pagrindinis pasisavinamo kalcio ir fosforo šaltinis.

Vitaminai. Piene yra praktiškai visų žinomų vitaminų, daugiausia – A, D, folio rūgšties, B grupės vitaminų, kad organizmo ląstelės galėtų tinkamai funkcionuoti – dalyvauti audinių sudarymo bei energijos gamyboje (Bartkevičiūtė ir kt., 2006).

9 Pieno stiklinėje yra nemaža dalis būtinų vitaminų ir mineralinių medžiagų (1.2 lentelė), rekomenduojamų suvartoti per parą (Ekotikslas, 2014):

 20 proc. vitamino B12,

 20 proc. fosforo,

 20 proc. kalcio,

 11 proc. reikalingos baltymų normos,

 7,5 proc. vitamino A,

 apie 5-6 proc. B1, B6 vitaminų,

 3,3 proc. vitamino C,

 mikroelementų: cinko, geležies, seleno.

1.2 lentelė. Vidutinis pieno mineralinių ir vitaminų kiekis 100 g valgomosios produkto dalies (Ekotikslas, 2014)

Gaminys Mineralinės medžiagos

Na mg Mg mg P mg K mg Ca mg Fe mg Zn mg Se μg J μg 3,5 proc. riebumo pienas 44 12 85 138 118 0,1 0,32 1,0 9,0 3,2 proc. riebumo pienas 44 12 85 139 118 0,1 0,32 1,0 9,0 2,5 proc. riebumo pienas 42 12 91 140 119 0,1 0,4 1,0 9,0 1 proc riebumo pienas 45 12 97 141 120 0,1 0,37 1,0 12,5 Nugriebtas pienas 38 12 91 158 113 0,2 0,4 1,0 9,0 Ožkos pienas 38 13 129 177 159 0,1 0,33 1,0 4,0 Vitaminai A mg D μg E mg B1 mg B2 mg PP mg Niacino ekv., mg Folio rūgštis mg B6 mg B12 mg C mg

3,5 proc. riebumo pienas 40 0,05 0,11 0,04 0,17 0,1 0,7 5,0 0,05 0,4 1,0 3,2 proc. riebumo pienas 36 0,00 0,10 0,04 0,17 0,1 0,7 7,0 0,05 0,4 1,0 2,5 proc. riebumo pienas 30 0,00 0,08

0,05

0,04 0,17 0,1 0,7 5,0 0,05 0,4 1,0

1 proc riebumo pienas 20 0,00 0,03 0,04 0,17 0,1 1,1 5,0 0,05 0,4 1,0 Nugriebtas pienas 15 0,40 0,10 0,04 0,14 0,1 0,7 5,0 0,04 0,4 1,8 Ožkos pienas 62 0,20 0,14 0,3 0,8 1,0 0,05 0,1 1,0

Autoriai B. Staniškienė ir kt. (2007) pieno sudėtį apibūdina taip: į pieną įeinančios medžiagos skirstomos į pagrindines, sudarančias didžiąją dalį (baltymai, riebalai, angliavandeniai ir vanduo), gretutines, aptinkamas nedideliais kiekiais (fermentai, mineralinės medžiagos, vitaminai) ir pašalines. Pašalinėms medžiagoms priskiriamos įvairiais būdais į pieną patekusios medžiagos (pvz., per orą, nuo pašarų, veterinarinių bei sanitarinių manipuliacijų ar pieno perdirbimo metu).

Vanduo yra pagrindinė į pieno sudėtį įeinanti dalis ir visų pieno sudėtinių dalių skiediklis. Jo piene yra apie 80-87 proc. Pagrindinę dalį piene vandens sudaro laisvasis vanduo (83-86 proc.), o likęs yra susijungęs su pieno sausosiomis medžiagomis (Šernienė, ir kt., 2007).

10 A. Gudonio (2009) teigimu, kad vanduo piene su kitomis sudedamosiomis dalimis yra įvairiai surištas. Vanduo suskirstomas į laisvąjį, surištąjį, brinkimo ir kristalizacinį vandenį. Tai natūralus pieno vanduo, kurio kiekis nurodomas įvairiuose literatūros šaltiniuose skirtingas ir gerokai svyruoja (83÷89 proc.). Laisvasis pieno vanduo yra nesusijęs su pieno sudedamosiomis dalimis. Tai pieno organinių ir neorganinių junginių tirpiklis. Apdorojant pieną mechaniniu, fizikiniu cheminiu ar šiluminiu būdu, laisvasis vanduo iš pieno lengvai pašalinamas. Laisvasis vanduo sudaro 95÷97 proc. piene esančio vandens. Surištas pieno vanduo yra susikaupęs koloidiniame būvyje esančių pieno sudedamųjų dalių (baltymų, fosfolipidų, polisacharidų) paviršiuje. Didžiausią jo dalį sudaro prisijungęs prie baltymų molekulių hidrofilinių grupių vanduo. Surištas vanduo sudaro 2,0÷3,5 proc. bendrojo pieno vandens. Jo kiekis priklauso nuo koloidiniame būvyje esančių pieno sudedamųjų dalių kiekio. Brinkimo vanduo – pieno koloidinių micelių vanduo. Didžiausią jo dalį sudaro pieno baltymų micelėse esantis vanduo. Pieno brinkimo vanduo taip pat lengvai pašalinamas apdorojant pieną mechaniniu, fizikiniu cheminiu ar šiluminiu būdu, t.y. didinant jo sausųjų medžiagų koncentraciją. Kristalinis vanduo – sujungtas su pieno sudedamųjų dalių kristalais. Didžiausią jo dalį sudaro laktozės kristalizacinis vanduo. Jis pašalinamas kaitinant pieną 125÷135°C temperatūroje (Gudonis, 2009).

Apžvelgus literatūrą pienas yra apibūdinamas keliais aspektais:

 Biologiniu aspektu pienas– išskiriamas laktacijos laikotarpiu iš žinduolių patelių pieno liaukos sekretas, kuris skirtas jaunikliams maitinti;

 Biocheminiu aspektu pienas – tai biologinės kilmės skystis, kuriame yra baltymai, riebalai, ištirpę angliavandeniai, mineralinės ir kt. medžiagos;

 Gyvulininkystėje pienas – vienas iš pagrindinių gyvulinių maisto produktų taip pat vienos arba daug karvių bei kitų pieną gaminančių gyvulių pieno liaukos sekretas.

 Technologiniu aspektu pienas – tai žaliava, iš kurios gaminama įvairi produkcija (Greičiuvienė ir kt., 2008; Skimundris 1997).

V. Skimundris (1993, 1997) teigia, kad vienas iš svarbiausių uždavinių pieno ir pieno gaminių gamybos sektoriuje yra užtikrinti primelžto pieno kokybę, nes pieno kokybė tai jo normalios sudėties ir būdingų savybių visumos rodiklis.

1.2. Pieno kokybė

Kaip teigia, D. Adamavičiūtė ir kt. (2006) visame pasaulyje su kiekviena diena vartotojų reikalavimai maisto produktų kokybei didėja, taip pat didėja poreikis ir sveikiems produktams. Maisto produktai turi būti sveiki, natūralūs, švieži, skanūs bei pasižymėti funkcinėmis savybėmis.

11 Pieno kokybės užtikrinimas ir gerinimas yra vienas iš svarbiausių užduočių tiek pieno gamintojams, tiek ir jo perdirbėjams (Adamavičiūtė ir kt. 2006).

Kokybės ir saugos reikalavimų užtikrinimas pienui ir pieno produktams tiesiogiai susijęs su pieno produktų rinkos plėtra tiek Lietuvoje, tiek kt. pasaulio valstybėse. Sėkminga konkurencija rinkoje priklauso nuo produktų kokybės, kurios pagrindą sudaro žaliavos kokybė – pirmiausia pieno sudėtis ir savybės. Pieno kokybei turi įtakos tiesioginiai ir netiesioginiai veiksniai (žr. 1.3 lentelė) kaip individualios gyvulio savybės, veislė, sveikata, klimatinės sąlygos, pašarai, laktacijos periodas bei kiti.

1.3 lentelė. Tiesioginiai ir netiesioginiai veiksniai įtakojantys pieno kokybę (Skimundris, 1997)

Tiesioginiai Netiesioginiai

1. Galvijų fiziologinė ir sveikatos būklė 1. Pieno fermos, karvidžių aplinkos sutvarkymas

2. Tešmens sanitarinio apdorojimo kokybė 2. Tipinės karvidės, jų zoohigienos ir veterinarinės sanitarijos būklė

3. Naudojamo vandens kokybė 3. Melžimo, pieno aušinimo, kitų įrenginių tinkamas eksploatavimas ir priežiūra

4. Pieno įrenginių ir pieno indų sanitarinė būklė

4. Aprūpinimas plovimo, dezinfekavimo ir kitomis būtinomis priemonėmis

5. Karvių melžimo sąlygos 5. Plovimo, dezinfekavimo tirpalų kokybė bei jų tinkamumas panaudojimas

6. Pieno košimo kokybė 6. Karvių aprūpinimas geros kokybės pašarais, jų priežiūros ir laikymo sąlygos

7. Pieno aušinimo kokybė 7. Tinkama karvių selekcija 8. Pieno mechaninio ir bakterinio užterštumo

šaltiniai

9. Nenatūralios medžiagos piene

10. Pieno laikymo ir transportavimo sąlygos 11. Melžėjų asmens higiena

12. Melžėjų kvalifikacija

Pastaruoju metu žymiai svyruoja vartotojų pasitikėjimas maisto produktų kokybe ir sauga, nes su maistu siejamas rizikos poveikis vis auga. Reaguodama Europos Sąjunga į rizikos su maistu problemą įgyvendina išsamią strategiją, kuria siekiama atkurti žmonių pasitikėjimą maisto sauga ir kokybe „nuo lauko iki stalo“ (Adamavičiūtė ir kt. 2006).

Jau 1960 m. pradėta kurti aplinkos ir maisto produktų stebėsenos sistema. Pieno ir pieno produktų gamintojai pradėjo vykdyti savikontrolės programas. Reikėjo, kad jų gaminama produkcija atitiktų eksporto reikalavimus ir būtų saugi vartotojams (Council directive 92/46/EEC) (Šalomskienė ir kt. 2013)

12 Didėjant globalizacijos tempui, didėja tarptautinių organizacijų ir jų parengtų dokumentų svarba. Lietuvoje pienas ir pieno produktai yra svarbus eksportuojamas objektas. Jie sudaro didžiausią eksportuojamų maisto produktų dalį (2005 m. sudarė 21 proc.). Daugiausia pieno ir pieno produktų buvo eksportuota į Rusiją (daugiau kaip 27 proc. viso pieno produktų eksporto) (Užsienio prekybos žemės ūkio ir maisto produktais tendencijos, 2005).

Dėl minimų priežasčių labai svarbu, kad pieno ir pieno produktų reglamentavimas atitiktų tarptautines normas. Maisto produktų gamybos ir prekybos srityje didžiausią svarbą turi Codex Alimentarius komisijos veikla. Pagrindinis Codex Alimentarius komisijos tikslas – saugoti visuomenės sveikatą ir užtikrinti sąžiningą prekybą maisto produktais taip pat teikti pagalbą rengiant maisto produktų standartus tiek vyriausybinėms tiek nevyriausybinėms organizacijoms. Codex Alimentarius komisijos dokumentai ne tik svarbūs tarptautinėje prekyboje, jie įgyja vis didesnę svarbą ES rinkoje, o tuo pačiu ir Lietuvoje (Paserpskienė, 2007)

Geros žemės ūkio praktikos tikslas - sumažinti maiste aptinkamus ir esančius teršalų likučius, taip pat reikalauti, kad ūkiuose būtų naudojami kuo mažesni vaistų, dezinfekcinių tirpalų ir kt. cheminių medžiagų kiekiai ir garantuojama jų naudojimo kontrolė. Vartotojui pienas su antimikrobinių medžiagų likučiais neturi patekti. Norvegijoje, Vokietijoje, Prancūzijoje, JAV ir Švedijoje buvo įkurta užteršto pieno kontrolės ir rūšiavimo sistema. Pasinaudojus šia sistema visas pienas prieš perdirbimą yra ištiriamas dėl β-laktaminių antibiotikų likučių. Jei randamas „teigiamas“ pienas (su β-laktaminių antibiotikų likučiais), jis perdirbimui nepriimamas. Tokiu atveju perdirbėjai garantuoja, kad jų produkcija yra neužteršta β-laktaminiais antibiotikais (Šalomskienė ir kt., 2013).

Pieno kokybę lemia ne tik jo sudėtis, bet ir į jį patenkančios medžiagos. Daugelio autorių teigimu pienas gali būti užterštas įvairiomis cheminėmis medžiagomis patenkančiomis į jį per kraują, pašarus, orą bei vaistus.

1.3. Pašalinės medžiagos piene

Natūraliame piene neturi būti pašalinių medžiagų. Pašalinėmis apibūdinamos tokios medžiagos, kurios nėra sudėtinės produktų dalys (Šernienė ir kt., 2007).

Prie pašalinių medžiagų galima priskirti – antibiotikus, sunkiųjų metalų druskas, pesticidus, toksinus, neutralizuojančias ir konservuojančias medžiagas, medikamentus, mikotoksinus ir kt. (1.1 pav.). Šios medžiagos ne tik kenksmingos sveikatai, bet dažnai sutrikdo pieno produktų gamybą, dėl ko pablogėja jų kokybė (Vaitkus, 1995).

13

Aplinka (oras, pašarai, vanduo, žemė): Radionuklidai Organiniai teršalai Mikotoksinai Agrochemikalai Metalai

Pieno teršalai

perdirbimas

fasavimas

1.1 pav. Pašalinės medžiagos (Špakauskas, 2011)

Tiek Lietuvoje, tiek visame pasaulyje žemės ūkyje vartojama daug įvairių cheminių medžiagų. Galvijai gydomi įvairiomis chemoterapinėmis priemonėmis, dėl to piene daugėja pašalinių medžiagų. Daugelis pašalinių medžiagų yra žalingos žmonėms ir gyvuliams (VETinfo, 2004).

Cheminėmis medžiagomis pienas yra užteršiamas: patenkant medžiagoms į pieną per orą, vandenį, su pašarais arba naudojant karvėms gydyti bei melžimo sanitarijai užtikrinti ir pan. Šios medžiagos turi įtakos pieno ir jo produktų kokybei, jų saugai, bei neigiamai veikia technologinius procesus (Urbienė, 2006).

Pesticidai. Daugelis yra nuodingi, į pieną dažniausiai patenka per pašarus. Išsaugant žemės ūkio produkciją yra naudojami įvairūs pesticidai (herbicidai, fungicidai ir kt.). Pesticidų net ir maži kiekiai piene yra nepageidaujami, nes yra ypatingai nesaugūs kūdikiams ir vaikams (Garmienė ir kt., 1995).

Vieni iš pesticidų greitai suyra, o kiti nepakitę išlieka labai ilgai. Jie praktiškai nepakinta veikiant šviesai, deguoniui, drėgmei, todėl jie daugelį metų išlieka dirvoje, pereina į augalus bei pašarus. Chloroorganiniai pesticidai pasižymi aukštu stabilumo laipsniu. Nors chloroorganinių pesticidų naudojimas yra uždraustas, tačiau jų dar randama dirvoje, pašaruose, piene. Pesticidai piene nustatomi biologiniais, biocheminiais bei fiziniais – cheminiais metodais. Iš pastarųjų dažniausiai naudojami chromatografijos, spektrometrijos, kolorimetrinis ir kiti metodai.

Sunkieji metalai. Ypatingai nuodingais sunkiaisiais metalais (švinu, gyvsidabriu, kadmiu) pienas dažniausiai užsiteršia endogeniškai. Pastebėta, kad karvių piene švino, kadmio ir gyvsidabrio būna net kelis kartus daugiau tose vietovėse, kuriose intensyvus automobilių eismas, kur yra

14 pramoninės įmonės taip pat iš naudojamų trąšų ir pesticidų patenkančių į dirvą, augalus į galvijų pašarus ir vėliau į galvijų organizmą. Organizme vyksta šių teršalų metabolizmas (Urbienė, 2006).

Piene sunkiųjų metalų koncentracija dažniausiai yra maža, išskyrus, kai gyvuliai šeriami užterštu pašaru. Tačiau pieno produktų suvartojimas yra didelis ir suvartojus net mažą teršalų kiekį gali sąlygoti nemenkas šių elementų koncentracijas organizme (Valiukėnaitė ir kt., 2005).

Laikoma, kad 1,0 kg pieno gali būti ne daugiau kaip 0,005 miligramo gyvsidabrio,– 0,1 miligramo švino, 0,03 miligramo kadmio, 5,0 miligramo cinko, 1,0 miligramo vario (Urbšienė, 2013).

Plovimo ir dezinfekavimo medžiagos. Plovimo priemonės turi gerai plauti, t.y. tirpdyti baltymus, emulguoti riebalus, pašalinti netirpias medžiagas. Plaunama švariu geriamuoju vandeniu ir šarminiais bei rūgščiais plovimo tirpalais. Plovimo priemonės neveikia baktericidiškai (Urbšienė, 2013).

Dezinfekavimo priemonės turi pasižymėti geromis baktericidinėmis savybėmis. Puiki pieno inventoriaus dezinfekavimo priemonė yra karšti vandens garai, jie pakeičia kenksmingas dezinfekuojančias medžiagas. Veikiant sausais prisotintais 100°_{C temperatūros garais, vegetaciniai} mikrobai žūva per keletą sekundžių. Dažnai dezinfekuojama chloro turinčių chemikalų tirpalais (Urbšienė, 2013).

Pieno inventorių patogiausia kartu plauti ir dezinfekuoti. Tam vartojamos įvairios Sveikatos apsaugos ministerijos leistos priemonės.

Nevykdant plovimo instrukcijų, kurios yra nurodytos reglamente dezinfekavimo medžiagų gali likti įrengimuose bei vamzdynuose ir užteršti pieną. Pieną valant ar termiškai apdorojant plovimo bei dezinfekavimo medžiagų kiekiai nesumažėja (Grinienė, 1992).

Nitratai ir nitritai. Piene šių junginių būna labai nedaug: – nitratų apie 0,2 – 0,8 g/kg ir nitritų – 2-3 µg/kg. 1970 m. JAV mokslininkai įrodė, kad nitritams jungiantis su baltymų skilimo produktais – aminais ar amidais, esant palankioms sąlygoms, susidaro nitrozoaminai ir nitrozoamidai. Daugelis nitrozojunginių yra ypač kancerogeniški. Visi nitrozoaminai yra laikomi kancerogenais, kurie ypač veikia neigiamai reprodukcines žinduolių ir žmonių, funkcijas. Nitratai pateka į pieną per pašarus bei gyvulio organizmą. Gyvulio organizmas gauna didesnį nitratų kiekį, kai karvės ganomos gausiai azotinėms trąšomis tręštose ganyklose. Gamybos metu nitratai iškreipia pieno produktų technologinius procesus, jie slopina pieno rūgšties bakterijų vystymąsi (Urbienė, 2006).

Mikotoksinai. Į pieną gali patekti įvairių toksinų, esančių pašaruose. Mikroskopinių grybų veiklos produktai – mikotoksinai sukelia staigius apsinuodijimus bei lėtinius žmonių ir gyvulių susirgimus (Bakutis, 2004). Kai karvės šeriamos supelijusiais pašarais, tai su pienu išskiriama įvairių mikotoksinų – aflatoksinų, achratoksino, patulino, penicilino rūgšties, sterigmatocistino ir kt.

15 Ypač yra pavojingi aflatoksinai. Piene dažniausiai aptinkamas vienas iš mikotoksinų - aflatoksinas M1. Jo kiekis nesumažėja terminio apdorojimo metu (Urbienė, 2006).

Aflatoksinai ir jų metabolitai piene ir pieno produktuose nustatomi chromatografijos metodu (Urbšienė, 2013).

Antibiotikai. Jų patenka į karvių pieną gydant jas ar šeriant pašarais su antibiotikų priedais, taip pat kai jų pridedama į pieną norint sumažinti jo bakterinį užterštumą (Urbšienė, 2013). Esant ir labai mažiems antibiotikų kiekiams piene jautriems vartotojams gali sukelti alergines reakcijas. Vartojant antibiotikais užterštą pieną ilgesnį laiką taip pat žmogui išsivysto antibiotikams atsparios bakterijos. Esant tokiam atvejui, gydymas antibiotikais gali būti ne toks efektyvus (Walstra ir kt., 1999).

Pasaulinė sveikatos organizacija atsargumo sumetimais rekomenduoja nacionalines vyriausybes pakeisti požiūrį bei siekti sumažinti antimikrobinių medžiagų gyvūnų poreikiams naudojimą ir nustatyti mikrobų stebėjimą bei jų atsparumą (Dibner, 2005).

Valstybinė maisto ir veterinarijos tarnyba kiekvienais metais norėdama sumažinti inhibitorinių medžiagų patekimą į pieną, vykdo medžiagų tokių kaip antibakterinių, hormoninių ir antihelmintinių preparatų, teršalų, sunkiųjų metalų, mikotoksinų ir kt. liekanų piene tyrimus. (Šernienė ir kt., 2007).

Yra svarbu žinoti, kad sūrių ir jogurtų gamybos metu nėra pašalinami antibiotikai, kurie įtakoja žmogaus organizmą ir sudaro sąlygas alerginėms reakcijoms (Adetunji, 2011; Ardiç ir kt., 2006).

W. Reybroeck (2010) pateikė schemą, kaip antibiotikai patenka į pieną (1.2 pav.)

Inhibitorinių medžiagų likučiams, kurie kelia grėsmę žmonių sveikatai yra nustatytas leistinas paros suvartojimo (LPS) dydis (EC European Community, 2001). LPS yra nustatytas atsižvelgiant į nepastebimą poveikio dydį (NPD), nustatytą tyrimuose su gyvūnais. LPS nustato visiškai saugią maksimalią ribą, nes ji yra nustatoma, atsižvelgiant į tai, kad cheminė medžiaga gali būti vartojama visą gyvenimą, nebijant, jog jis sukels vartotojo sveikatos sutrikimus (Šalomskienė ir kt., 2013).

16

ABSORBAVIMAS KRAUJO PLAZMA

Jungimas su baltymais Be vaistų PASKIRSTYMAS PAŠALINIMAS METABO-LIZMAS Kepenys IŠSKYROS Šlapimas Tulžis M E L Ž I M A S Be vaistų Sujungti vaistai

1.2 pav. Pateiktas pasiskirstymo modelis: kraujas yra pagrindinis antibiotikų per audinius ir medžiagų apykaitą bei per eksrecinius organus paskirstymo elementas (Reybroeck, 2010 )

Visai išvengti į pieną patenkančių teršalų neįmanoma, todėl daugumai jų nustatytos didžiausios leistinos koncentracijos (DLK) (1.4 lentelė). Itin nuodingoms medžiagoms nustatoma nulinė tolerancija, t.y. tokių medžiagų piene visai neturi būti (Šernienė ir kt., 2007).

1.4 lentelė. Antimikrobinių medžiagų DLK piene (Šalomskienė ir kt., 2013)

Antibiotikų grupė Antibiotikas DLK piene, mg/kg

β-laktaminiai antibiotikai Penicilinas G 4 Ampicilinas 4 Amoksicilinas 4 Kloksacilinas 30 Oksacilinas 30 Cefaleksinas 100 Aminoglikozidai Neomicinas 1500 Gentamicinas 100 Streptomicinas 200 Tetraciklinai Tetraciklinas 100 Doksiciklinas - Makrolidai Spiramicinas 200 Tilozinas 50 Eritromicinas 40

17 Pagal Europos Sąjungos Tarybos direktyvą 96/23/EB, valstybė Europos sąjungoje turi kontroliuoti tam tikrą dalį bendros metinės gaminamos produkcijos dėl antimikrobinių medžiagų likučių (žr. 1.4 lentelė). Ši direktyva nustato antimikrobinių medžiagų grupes, kurios turi būti kontroliuojamos kiekvienoje gyvūninės kilmės maisto produktų grupėje. Antimikrobinių medžiagų likučių ribos yra nustatytos daugelio šalių pieno pramonei. DLK (1.4 lent.) nustato Europos Parlamento ir Tarybos Reglamentas (EB) Nr. 470/2009 (Šalomskienė ir kt., 2013).

1.4. Inhibitorinių medžiagų patekimo į pieną priežastys

Inhibitoriai – įvairios biologinės ar cheminės prigimties medžiagos, slopinančios mikroorganizmų augimą (antibiotikai, formalinas, vandenilio peroksidas, plovimo, dezinfekavimo ir konservavimo medžiagos) (Liutkevičius, ir kt., 2002).

Antibiotikai į pieną dažniausiai patenka gydant karvių mastitus. Karvių, gydytų antibiotikais, pieno negalima vartoti nuo keliolikos valandų iki kelių parų po paskutinio antibiotikų panaudojimo. Tai priklauso nuo antibiotikų rūšies, dozės, naudojimo dažnumo ir būdo (leidžiant į raumenis arba į tešmenį).

Inhibitorių medžiagų piene atsiradimo priežastys (Šalomskienė ir kt., 2013):

 Neteisingas vaistų pasirinkimas;

 Netinkamai pasirinktas gydymas įsigyjant vaistus be naudojimosi instrukcijos;

 Neteisingas vaistų vartojimas arba ne pagal instrukciją (per didelė dozė);

 Nekokybiški, supeliję pašarai arba pašarai, duodami ne toms gyvulių grupės, kurioms jie skirti;

 Karvių ganymas šalia miškų, apdorotų cheminėmis medžiagomis nuo kenkėjų ir ligų, ar neseniai tręštose ganyklose;

 Gyvulių girdymas netinkamu vandeniu;

 Netinkamų tepalų naudojimas rankoms ir speniams gydyti;

 Nepakankamas melžimo ir pieno laikymo įrangos praplovimas geriamuoju vandeniu;

 Užtrūkimo ir laktacijos periodas;

 Slaptas ligos periodas;

 Bloga melžimo operatorių kvalifikacija;

 Gydomų karvių melžimas;

 Užkrėsto pieno maišymas su kitu;

18

 Netinkamas sausinimo, valymo priemonių naudojimas, kurios neskirtos pieno pramonėje arba naudojimas nesilaikant gamintojo instrukcijos .

Pasaulinė sveikatos organizacija 2011 metais paskelbė, kad Europoje nuolatos didėja atsparumas antibiotikams (1.3 pav.), kurie atsiranda maisto grandinėje. Apibrėžė, kad nedelsiant reikia imtis veiksmų siekiant sumažinti antibiotikų naudojimą maisto grandinėje. Pasaulinė sveikatos organizacija nustatė reguliavimo strategiją:

1) Reikia pašalinti antibiotikų naudojimą gyvūnų maiste siekiant augimo skatinimo; 2) Reikia pradėti kontroliuoti veterinarijos gydytojų išrašomus antibiotikus gyvūnams; 3) Reikia identifikuoti antibiotikų naudojimą žmonių medicinoje, ypač kalbama apie fluorokvinoloną (fluoroquinolones) ir trečios bei ketvirtos generacijos cefalosporiną (cephalosporins), kurie turi būti naudojami tik būtinu atveju gyvūnų maiste (WHO 2011.).

Antibiotikai

Terapinis naudojimas Ne terapinis naudojimas (pvz. profilaktika, augimo skatinimas) Žemės ūkis (pvz. paukštienoje,

jautienoje, kiaulienoje) Akvakultūra (pvz. žuvyse)

Ūkio gyvuliai: kontaktas su gyvūnų pašaru Naminiai gyvūnai Mėsa ir kasdieniniai produktai Tarša: fekalijų ir mėšlo paskleidimas Dirva Laukinė gyvūnija Vaisiai ir

daržovės Šuliniai/upės/upeliukai

Žuvies produktai

Žmonės

1.3 pav. Atsparių antibiotikams bakterijų kelias (WHO, 2011)

Pagal VĮ „Pieno tyrimai“ pateiktus statistinius duomenis, 2000-2003 m. su antimikrobinių medžiagų likučiais rasta net iki 2,0 proc. ištirtų pieno mėginių, 2004 m. - iki 1 proc. 2005- 2010 m.

19 duomenimis, vidutinis „teigiamų“ žalio pieno mėginių (kuriuose rasta inhibitorių) skaičius per metus buvo nuo 0,5 proc. iki 1,6 proc. nuo ištirtų mėginių skaičiaus (žr. 1.5 lentelė). Paprastai dažniau „teigiamų“ mėginių randama vasaros laikotarpiu (Šalomskienė ir kt., 2013).

1.5 lentelė. Inhibitorių likučiai karvių piene (procentais) (Šalomskienė ir kt., 2013)

Mėnesiai 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 Sausis 0,4 0,3 0,4 0,4 0,9 1,0 1,5 3,0 Vasaris 0,4 0,3 0,4 0,5 1,0 0,8 2,0 2,7 Kovas 0,3 0,4 0,4 0,4 1,2 1,4 2,3 0,3 Balandis 0,4 0,4 0,5 0,5 1,6 2,0 1,9 0,4 Gegužė 0,6 0,6 0,8 0,6 1,4 2,4 2,0 1,7 Birželis 0,7 0,9 0,8 0,7 1,3 1,9 2,3 0,8 Liepa 1,2 0,8 0,7 0,7 1,9 1,6 2,4 0,8 Rugpjūtis 0,7 0,7 1,0 0,7 1,8 1,7 1,7 0,6 Rugsėjis 0,5 0,5 0,5 1,2 1,5 1,6 1,7 0,3 Spalis 0,3 0,4 0,5 0,3 1,4 1,4 1,6 0,3 Lapkritis 0,3 0,4 0,5 0,7 1,5 1,4 1,9 0,3 Gruodis 0,4 0,4 0,4 0,4 1,1 2,0 1,6 0,2 Metinis 0,5 0,5 0,6 0,6 1,4 1,6 1,9 1,0

Antibiotikai į gyvūnų kūną patenka per injekcijas (pvz. intramuskuliarinė, intraveninė arba paodinė), oraliniu, lokaliniu arba intramaminiu būdu ar gimdos užpildymu (Dibner, ir kt., 2007).

Dėl nepakankamo sąmoningos išlaukos laiko nesilaikymo piene ar mėsoje yra aptinkama antimikrobinių medžiagų likučių (Dibner ir Richards 2005).

Tačiau apžvelgus literatūrą ir išanalizavus tyrimus rodo, kad rizika, susijusi su maisto produktų užteršimu antimikrobinių medžiagų likučiais, vis dar vertinama nepakankamai rimtai: pasitaiko, kad gyvulio gydymas yra nepakankamai kontroliuojamas, o kartais net neregistruojamas (Šalomskienė ir kt., 2013)

Vartotų 1950-1960 m. veterinarinių vaistų, vis dar yra populiarūs ir šiandien. Tai β-laktamai, sulfa vaistai, tetraciklinai, aminoglikozidai, chloramfenikolis, makrolidai ir kt. Dažniausiai didžiausią dalį piene randamų inhibitorių sudaro β-laktamai (penicilino grupės antibiotikai) (Šalomskienė ir kt., 2013).

Išanalizavus literatūros šaltinius, nustatytos pagrindinės tetraciklino patekimo į pieną priežastys: patekimas į pieną per orą, vandenį, su pašarais arba naudojant medžiagas karvėms gydyti bei melžimo sanitarijai užtikrinti. Šios medžiagos turi įtakos pieno ir jo produktų kokybei, jų saugai, bei neigiamai veikia technologinius procesus.

20 1.5. Tetraciklinų ir β-laktamų grupės antibiotikai

Tetraciklinų grupės antibiotikai apibūdinami kaip plataus spektro antimikrobiniu veikimu. Tetraciklinai veikia daugelį gramteigiamų ir gramneigiamų mikroorganizmų, riketsijas, stambius virusus ir kai kuriuos pirmuonis. Šių antibiotikų cheminės struktūros pagrindą sudaro naftaceno žiedų sistema. Tetraciklinų chemoterapinio veikimo spektras yra platesnis už penicilinų bei daugelio antibiotikų. Šios grupės antimikrobinio veikimo mechanizmas grindžiamas tuo, kad jie sulaiko patogeninių mikroorganizmų vystymąsi, sutrikdydami mikrobų baltymų sintezę ir oksidacinius procesus. Šiai grupei priklauso tetraciklinas, oksitetraciklinas, chlortetraciklinas, dimetiltetraciklinas, taip pat nauji pusiau sintetiniai metaciklinas, doksiciklinas, minociklinas. Pirmasis biosintetinis tetraciklinas - chlortetraciklinas - buvo išskirtas iš Streptomyces aureofaciens kultūros. Iš Streptomyces rimosus kultūros išskirtas oksitetraciklinas, o iš S. aureofaciens kultūros – tetraciklinas. Veterinarijoje tetraciklinas naudojamas hidrochlorido ir N-dibenziletilen-diamindimetiltetraciklino (ditetraciklino) pagrindo pavidalu. Tai geltonos spalvos milteliai, kurie blogai tirpsta vandenyje. Milteliai yra patvarūs, o jų vandeniniai tirpalai gerai tirpsta vandenyje. Tetracikliniai yra rūgštiniai higroskopiniai junginiai, lengvai sudaro druskas su rūgštimis ir šarmais. (Šalomskienė ir kt., 2013).

Tetraciklinai gerai rezorbuojasi ir palyginti pakankamai vienodai pasiskirsto organizme, o išsiskaido daugiausia pro inkstus (Černiakovas, 1988).

Su Ca, Mg, Al, mažiau – Fe, Cu tetraciklinai sudaro netirpius, nesirezorbuojančius ir antimikrobiškai neveikiančius chalatų kompleksus, todėl jie kaupiasi Ca daug turinčiuose kauluose, dantyse, naguose, augliuose (Budnikas, 2004).

Gyvuliams tetraciklinas nėra labai pavojingas, tačiau gaunant dideles dozes ir dažnai vartojant galimi šie sutrikimai: disbakteriozė, avitaminozė, prieskrandžių bei žarnyno sutrikimai ir galima bakterinė fermentacija atrajotojų prieskrandžiuose.

β-laktamų grupės antibiotikai. Veterinarijoje plačiausiai iš visų yra naudojami antibiotikai su beta laktamais, kuriuose yra penicilinas G (Ardiç, ir kt., 2006).

Pieninių galvijų mastito gydymui plačiausiai yra naudojama β-laktamų grupės antibiotikai (Andrew, 2001).

Šios grupės antibiotikams būdinga, kad jų cheminėje struktūroje yra β-laktaminis žiedas, labai svarbus antimikrobiniam poveikiui (jam suirus, antibiotikas tampa neveiksnus). β-laktaminių antibiotikų antimikrobinis veikimas pasireiškia tuo, kad jie slopina mikroorganizmų ląstelės sienelės sintezę. Jie veikia baktericidiškai aktyvaus bakterijos augimo periodo metu, dėl ko įvyksta ląstelės plazmolizė. Dažniausiai aptinkami ir daugiausia problemų sukeliantys β-laktaminės grupės antibiotikai yra penicilinai ir cefalosporinai (Šalomskienė ir kt., 2013).

21 Nepaisant to, kad šios grupės antibiotikų spektras yra labai įvairus, visame pasaulyje gydymui vis dar plačiausiai vartojamas benzilpenicilinas (penicilinas G).

Penicilinas - Penicilium notatum fermentavimo produktas, susidedantis iš šešių, panašių savo savybėmis penicilino rūšių. Labiausiai ištirtas ir praktinę vertę turintis yra benzilpenicilinas - pirmasis antibiotikas, įdiegtas medicinoje, o vėliau ir veterinarijoje. Pirmas visuomenei skirtas penicilinas pasirodė 1941 m (Šalomskienė ir kt., 2013).

Vėliau buvo sukurti nauji penicilinų su skirtingais radikalais (R) sintezės metodai. Tokios sintezės pradinis produktas yra 6-aminopenicilino rūgštis, iš kurios buvo gautas oksacilinas (Šalomskienė ir kt., 2013).

Cefalosporinas gautas 1945 m., aptikus aktinomicetą Cephalosporium acremonium, iš kurio buvo išskirtas pirmasis šios grupės antibiotikas — cefalosporinas C. Jam priklauso gamtiniai ir pusiau sintetiniai antibiotikai. Vėliau buvo gauti efektyvesni pusiau sintetiniai cefalosporinai (cefalotinas, cefazolinas, cefanonas ir kt.) (Šalomskienė ir kt., 2013).

Seniai žinoma ir labai plačiai vartojama inhibitorių grupė – -laktamai, kurios likučiai piene gali sukelti vartotojams alergines reakcijas. Europos direktyva EEB 2377/90 nustato didžiausią leidžiamą β-laktamų grupės likučių, nekenksmingų vartotojui, kiekį piene: penicilino G – 4 µg/l, ampicilino – 4 µg/l, oksacilino – 30 µg/l, amoksicilino – 4 µg/l, dikloksacilino – 30 µg/l, cefaleksino – 100 µg/l, cefapirino – 60 µg/l (Žvirdauskienė ir kt. 2004)

Kontroliuojant inhibitorines medžiagas būtina apsaugoti vartotojus nuo kenksmingo šių medžiagų poveikio. Šių medžiagų kiekiai gali būti nustatomi įvairiais metodais.

1.6. Inhibitorinių medžiagų nustatymo metodai

Lietuvai integruojantis į ES ir pasaulio rinką, reikia būtinai gerinti produktų kokybę ir taip pat – griežtinti reikalavimus žaliavoms. Lietuvoje didžiausi leistini veterinarinės medicinos preparatų likučių kiekiai gyvūniniuose maisto produktuose reglamentuojami (Dėl didžiausių leistinų veterinarinės medicinos preparatų likučių kiekių gyvūniniuose maisto produktuose. LR Valstybinės maisto ir veterinarijos tarnybos direktoriaus 2000 m. gruodžio 29 d. įsakymas Nr. 395 // Valstybės žinios. 2001. Nr. 13. P. 66–98).

Atsižvelgiant, kad antibiotikų bei kitų medžiagų su antibakterinėmis savybėmis, kurios yra vartojamos gyvulininkystėje, sąrašas yra labai ilgas ir jame daug skirtingos cheminės sudėties junginių grupių, nėra vienos visų galimų medžiagų radimo bei identifikavimo metodikos (Žvirdauskienė, 2004).

Bendrai antimikrobinių medžiagų likučių gyvūninės kilmės maisto produktuose tyrimui sukurta daug metodų, kuriuos galima suskirstyti į mikrobiologinius, fermentinius, imuninio tyrimo

22 arba receptorių tyrimo ir fizikinius cheminius. Tačiau visų antimikrobinių medžiagų DLK nustatyti kuriuo nors vienu metodu neįmanoma (Šalomskienė, ir kt., 2013).

Lietuvoje antibiotikų kontrolei yra taikomi ir imunofermentinės analizės (ELISA) (trukmė iki keleto val.) metodas, mikrobiologiniai metodai, taip pat difuzijos į agarą metodas panaudojant specialias testavimo kultūras (Žvirdauskienė ir kt., 2004; Šarkinas, 2011; Urbienė, ir kt., 2009; Šalomskienė, 2005).

Lietuvos rinkoje siūlomi tyrimo metodai inhibitoriams žaliame piene nustatyti: mikrobiologiniai, atitinkantys pamatinį ES metodą su Bacillus stearothermophilus var. calidolactis kultūros sporomis: DELVOTEST SP, COPAN, LPT (gaminamas ir naudojamas tik VĮ „Pieno tyrimai“); su Streptococcus thermophilus kultūra Valio T 101 ir greitieji – fermentinis PENZYM S, bei imuninio/receptorių tyrimo (β -STAR, SNAP, ROSA) metodai (Šalomskienė ir kt., 2013).

Siekiant vartotojų saugumo norint apsaugoti nuo patekimo antibiotikų į pieną ar pieno produktus jų nustatymui kuriami bei taikomi vis jautresni metodai. Įvairiose šalyse penicilino nustatymui taikomi skirtingi metodai: aukšto slėgio chromatografijos bei kolorimetriniai metodai. Panaudojant aukšto slėgio skysčio chromatografą penicilino nustatymui pasiekiamas jautrumas yra 0,02 μg/l. Labai didelio tikslumo pasiekiama nustatant penicilino likučius imunofermentinės analizės metodais. Pritaikius imunofermentinės analizės metodus (ELISA) penicilino nustatymo jautrumas siekia 0,005 TV/ml. Tačiau tokie tyrimai reikalauja labai didelio laboratorinio darbo imlumo, aukštos darbuotojų kvalifikacijos ir brangios įrangos (Šarkinas, 2011).

Mikrobiologiniai antibakterinių medžiagų likučių nustatymo metodai yra naudojami ištirti platų medžiagų spektrą, todėl be β-laktaminį žiedą turinčių antibiotikų jais galima nustatyti ir kitas medžiagas. Daugeliu imuninio/receptorių tyrimo metodų yra nustatoma β-laktaminė grupė, tačiau yra bent du komerciniai metodai, kuriais nustatomas penicilinas, bet nerandama cefalasporino. Nors yra gaminami imuninio/receptorių tyrimo metodai sulfonamidams ir tetraciklinui nustatyti, jie turi būti taikomi tyrimams atskirai, o tai yra nepatogu ir brangu (Šalomskienė ir kt., 2005).

Pastaruoju metu jau gaminami testai dviems antibiotikams nustatyti iš karto – penicilinui ir tetraciklinui (pvz., CHARM ROSA MRL BL/TET ir CHARM 3 MRL BL/TET2 (Charm Sciences Inc., JAV) (Šalomskienė, 2013).

Labai dažnai šiuo metu naudojami greitieji (ekspres) tyrimo metodai. Šiais tyrimo metodais pieną galima pripažinti netinkamu iki kol pienas yra superkamas ar perdirbamas ir taip sumažinti galimybę užterštam pienui pasiekti vartotojus. Šiems spartiesiems testams, vadinamiems konkurenciniais imunologiniais tyrimais, naudojami labai specifiniai antikūnai. Tokiais tyrimo metodais galima nustatyti labai mažą antibiotikų kiekį piene (apie 1 mg/kg). Poreikis sutrumpinti tyrimo laiką paspartino fermentinių, imuninio/receptorių tyrimo metodų vystymąsi, kurie iš esmės yra žinomo ELISA metodo analogai. Daugelio metodų veikimas pagrįstas konkurenciniu principu,

23 kai antibakterinė medžiaga mėginyje varžosi su standartine antibakterine medžiaga dėl imuninio receptoriaus (Šalomskienė ir kt., 2005; Šalomskienė, 2013).

Pavyzdžiui, Australijoje naudojamas standartas penicilino nustatymui piene ir pieno produktuose taikant mikrobiologinį difuzijos į agarą metodą (Bacillus stearothermophilus), matuojant susidariusias slopinimo zonas agaro terpėje (Standards Association of Australia, 1991). Teigiama, kad šio metodo tikslumas siekia 0,03 μg/l.

L. Kantiani ir kt. (2009) pateikė plačiausiai naudojamas imunochemines technikas (1.4 pav.). Pagrindines naudojamas technikas antibiotikų nustatymui piene ir maiste galima sugrupuoti:

 fermentų imunofermentinė analizė (EIA) (pvz. ELISA);

 fluorescencinės poliarizacijos imunofermentinė analizė (FPIA);

 imunosensorinė analizė remiantis skirtingais elementų perdavimais, įskaitant elektrocheminį perdavimą (pvz. emperometrija arba magnetinis elastingumas), optinį perdavimą (pvz. SPR ir nykstantis bangavimas) bei masių perdavimą.

F. Toldra ir kt. (2006) pateikė patikrinimo metodikos svarbiausius reikalavimus: paprasta naudoti; maži pasiruošimo kaštai; didelis našumas; tikrinimo veiksmo neilgas laikas ir maži kaštai; jautrumas (neprarasti teigiamų rezultatų); specifiškumas (minimalus klaidingų teigiamų rezultatų skaičius); pakartojamumas.

Imunocheminės technologijos

Imunofermentinė analizė (EIAs) Konkurencinė imunofermentinė analizė

(ELISA)

Fluorescencinė imuniteto poliarizacija (FPIA)

Imuniteto jutikliai Paviršiaus plazminis rezonansas (SPR)

Tiesioginė konkurencija Netiesioginė konkurencija Bekonkuren cinis (sumuštinis) Antikūnas Antrasis antikūnas Antigenas Terpė Prijungėjas Terpė Chromogeninis substratas Poliarizuota šviesa Atspindėjusi šviesa Detektorius Po susijungimo atsispindėjusi šviesa SPR schema remiantis Kretschmann konfigūracija Metalinis aukso sluoksnio lustas

Prizmė

1.4 pav. Plačiausiai naudojamos imunocheminės technologijos skirtos antibiotikų likučių nustatymui (Kantiani ir kt., 2009)

24 Autoriai nustatė, kad tiriant β-laktamų grupės antibiotikų likučius atskirų karvių pamelžtame piene, mažiausias patikimumas (0,72) buvo gautas atliekant tyrimus su „CITE PROBE“ testais. Visi kiti tyrimo metodai (1.6 lentelė) yra tinkami (patikimumas ≥0,9) greitajam β-laktamų grupės antibiotikų likučių nustatymui (Andrew ir kt. 1997).

1.6 lentelė. Antibiotikų likučių nustatymo metodai ir metodų veikimo principai (Andrew ir kt. 1997)

Tyrimų rinkinys Gamintojas Analizės principas

Charm Farms Charm Sciences, Inc. (Malden, MA)

Bakterijų augimo stabdymas

Charm Cowside Charm Sciences, Inc. Penicilino konkurencinio ryšio pasiskirstymas

Delvotest®P Gist-brocades Food Ingredients, Inc. (Menomonee Falls, WI)

Bakterijų augimo stabdymas

Penzym® SmithKline Becham Animal Health (West Chester, PA)

Enzimai CITE Probe® IDEXX Laboratories, Inc.

(Westbrook, ME)

Antibiotikų antigenų pagavimo sistema

LacTekTM Identek, Inc. (Sunnyvale, CA)

Konkurencinis enzimų imuninis metodas

Valio T101 Valio Finland, Research and Development Centre (Helsinki, Finland)

Bakterijų augimo stabdymas

Charm BsDA1 Charm Sciences, Inc. Bakterijų augimo stabdymas

Visi pavyzdžiai buvo tirti: 1) DELVOTEST P (2,5 h), mikrobų slopinimo mikrobiologinis testas skirtas surasti antimikrobines medžiagas; 2) DELVO X-PRESS β-L (Royal Gist-brocades NV), tyrimo metodas yra imunoreceptorinis tyrimo metodas skirtas nustatyti β-laktamų antibiotikus; 3) SNAP imunoreceptorinis tyrimo metodas skirtas nustatyti β-laktamų grupės antibiotikus (IDEXX Laboratories Ltd., Chalfont St. Peter, United Kingdom); 4) LACTEK β-laktamų imunoreceptorinis tyrimo metodas (IDEXX Laboratories Ltd.) (Hillerton ir kt. 1999).

Buvo tirtas DELVOTEST P jautrumas cefaloniumui (cephalonium) ir nustatyta, kad jautrumas atitinka gamintojo nustatytas ribas nuo 15 μg/kg iki 20 μg/kg (Hillerton ir kt. 1999).

Pagal E. D. Asselt ir kt. (2013) antibiotikų rizika buvo nustatoma: rizika = „sunkumas“ * „atsparumo tikimybė“. Pavojaus sunkumas nustatomas pagal toksiškumo pavojų (faktorius A). Atsparumo tikimybė nustatoma pagal žmogaus sveikatos priklausomybę antimikrobinio atsparumo

25 vystymuisi (faktorius B). Pagal faktorius kiekvienas elementas buvo suranguotas nuo 0 iki 3 balų, 0 balų reiškia labai silpnas faktorius, 3 balai reiškia labai stiprus faktorius. Faktoriaus A balai buvo apskaičiuoti pagal esančias metodikas, o faktoriaus B balai pagal generacijos naujumą buvo nustatyti ekspertų. Antibiotikų naudojimas yra susijęs ir su atitinkamomis šalimis, nes skirtingose šalyse labiau naudojami skirtingi antibiotikai Rangavimo metodu galima nustatyti į kuriuos antibiotikus reikia atkreipti didesnį dėmesį bei juos labiau kontroliuoti. Pagal šiuos požymius pats rizikingiausias yra Norfloksacinas (Norfloxacin) A fakorius 3 balai, B faktorius 3 balai. Sekantys mažiau rizikingi yra šie antibiotikai: Chloramphenicolis, Ampicillinas, Amoxicillinas, Gentamicinas, Marbofloxacinas, Enrofloxacinas, Cefquinomas, Cefoperazonas (Asselt ir kt. 2013).

Vienas greičiausių tyrimo metodų, atliekamų per 3 minutes yra CHARM ROSA MRL-3 and β-STAR 1+1 (STAR = Screening Test for Antimicrobial Residues). Gan greitai (per 4 minutes) yra atliekamas PARALLUX tyrimo metodas, kuriuo nustatomi šeši β-laktamai, tetraciklinas, spektinomicinas, neomicinas, streptomicinas, spiramicinas, sulfonamidas ir kvinolonas (Asselt ir kt. 2013).

Amerikietis S. M. Andrew (2001) β-laktamo grupės antibiotikų nustatymui naudojo 4 metodus: 1) CHARM COWSIDE (Charm Sciences, Inc., Malden, MA), metodas yra privalomasis metodas β-laktamų grupės antibiotikų nustatymui; 2) CITE SNAP (IDEXX Laboratories, Inc., Westbrook, ME) imonoreceptorinis tyrimas skirtas β-laktamų grupės antibiotikų nustatymui; 3) DELVOTEST SP (Gist Brocades Food Ingredients, Inc., Menominee Falls, WI) mikrobų slopinimo tyrimo metodas, skirtas β-laktamų grupės antibiotikų ir sieros antibiotikų (sulfur antibiotics) nustatymui; 4) PENZYME (Cultor Food Science, Milwaukee, WI) fermentinis tyrimo metodas skirtas β-laktamų grupės antibiotikų nustatymui.

Didžiausia IgG1 ir MP koncentracija buvo susijusi su padidėjusia klaidingų teigiamų rezultatų tikimybe trimis tyrimo metodais: PENZYME, CHARM COWSIDE ir CITE SNAP. Tik DELVOTEST SP ir PENZYME tyrimo metodai atitiko specifines normas (≥0,90) tiriant pieną iš penkto-septinto melžimo. Siekiant naudoti atrankos tyrimus nustatant likučius telyčios ar karvės piene neturėtų būti tikrinamas iki šešto melžimo po apsiveršiavimo tam, kad išvengti klaidingų teigiamų rezultatų (Andrew, 2001).

DELVOTEST® BLF - 5 ir 7 min. trukmės kokybinis testas, skirtas aptikti β-laktamo žiedo (penicilinų ir naujos generacijos cefalosporinų) antibiotikų likučius piene. DELVOTEST® BLF yra lengvai naudojamas, sertifikuotas nepriklausomų institucijų, tikslus ir patikimas. DELVOTEST® BLF atitinka rinkos poreikius, nes karvių gydymui plačiausiai (apie 95 proc.) naudojami yra β-laktamo žiedo antibiotikai.

26 M. Becker ir kt. (2004) tyrė penkiolika (1.7 lentelė) β-laktamų grupės antibiotikų (penicilinų ir sefalosporinų, kurių maksimalūs likučių kiekiai yra pateikti Europos komisijos reglamente (EEC 2377/90) nustatymą skystos chromatografijos spektrometrijos metodu (LC–MS–MS).

DELVOTEST® SP–NT - pamatiniai, universalūs plataus spektro mikrobiologiniai testai, kurie naudojami: pieno patikrinimui po karvių gydymo antibiotikais bei kitais vaistais; inhibitorių (antibiotikų ir kt. antimikrobinių medžiagų) likučių aptikimui pieno mėginiuose. DELVOTEST® aptinka visus antibiotikų likučius ir vaistus, kuriuos gali skirti veterinarijos gydytojas: β-laktamus, Aminoglikozidus, Makrolidus, Sulfonamidus, Tetraciklinus, Diamino piramidinų darinius. DELVOTESTS SP-NT yra didelio našumo, greitas ir nebrangus tyrimo metodas. Galutinis tyrimo metodo rezultatas gali būti nustatomas arba vizualiai lauko sąlygomis, arba su įranga naudojant DelvosScan sistemą laboratorinėmis sąlygomis (Steada, 2008).

Naudojant DelvosScan sistemą yra išvengiama subjektyvumo lyginant su vizualiniu vertinimu. DELVOTESTS SP-NT tyrimo metodas yra patikimas ir tinkamas įvertinant įvairius pieno tipus, skirtingą riebalų kiekį, skirtingą somatinių ląstelių skaičių, tačiau nėra tinkamas įvertinant mažo pH (sugedusio) pieną (Steada, 2008).

1.7 lentelė. Tirtų β-laktamų grupės antibiotikų kiekiai (Becker ir kt. 2004) β-laktamų grupės antibiotikai Pienas (n=9) Raumuo (n=6) Inkstai (n=9) Amoksicilinas 57 65 46 Ampicilinas 81 88 78 Cefaleksinas 83 81 75 Cefapirinas 100 A A Desacetylcefapirinas 84 82 77 Cefaloniumas 96 96 88 Cefkvinomas 93 98 86 Cefazolinas 85 99 87 Cefoperazonas 96 111 85 Penicilinas-G 95 99 85 Penicilinas-V 102 99 75

27 1.7 lentelės tęsinys Okacilinas 115 104 88 Clokacilinas 114 94 90 Diklokacilinas 112 94 76 Nafcilinas 114 101 86

F. Toldra ir kt. (2006) pateikė keleto metodų privalumus ir trūkumus (lentelės 1.8, 1.9, 1.10 ir 1.11).

Atlikus literatūros šaltinių analizę galima teigti, kad kiekvienas antibiotikų likučių piene taikomas metodas turi privalumų ir trūkumų.

1.8 lentelė. ELISA metodo privalumai ir trūkumai (Toldra ir kt., 2006)

Privalumai Trūkumai

Paprasta naudotis.

Yra rinkiniai labai dideliam medžiagų skaičiui (pvz. klenbuterol, zeranol ir kt.).

Yra rinkiniai medžiagų šeimai (pvz. agonistai, stilbenai, sulfonamidai ir kt.).

Didelis mėginių skaičius (42 vnt.) viename rinkinyje.

Sumažintas rezultato gavimo laikas (daugumai rinkinių apie 2-2,5 val.).

Didelis jautrumas. Didelis specifiškumas.

Galimybė naudoti maisto gamybos įrangoje

Gana didelė kaina (apie 650 US dolerių) už rinkinį.

Ribota laikymo trukmė (keletas mėnesių) šaldytuve.

Brangu nustatant DLK ir reikia šalinti likučius.

Trikdžiai gali duoti neteisingą teigiamą rezultatą.

Likę mėginiai naudojami su tuo pačiu rinkiniu.

1.9 lentelė. Biosensorinio biologinio lusto matricos metodo privalumai ir trūkumai (Toldra ir kt., 2006)

Privalumai Trūkumai

Paprasta naudotis.

Rezultatai gaunami per trumpą laiką.

Vienu kartu nustatoma keletas likučių (tiek daug, kiek yra lustų matricoje).

Pilnai automatizuota ir supilstoma iki 120 pavyzdžių per valandą.

Didelės investicijos (įranga). Didelės naudojimo išlaidos (lustai).

28 1.10 lentelė. HPTLC metodo privalumai ir trūkumai (Toldra ir kt., 2006)

Privalumai Trūkumai

Su viena analize galima gauti didelį skaičių mėginių. Sumažinta laiko trukmė iki rezultato gavimo (keletas valandų).

Yra galimybė automatizuoti siekiant gauti didelį našumą.

Jautrus.

Specifiškumas susijęs su aptikimo technika.

Atskirti mėginiai gali būti naudojami kitose analizėse.

Reikia eksperto išvados.

Reikia pavyzdžių paruošimui (išgavimas, filtravimas ir kt.).

Trikdžiai gali duoti neteisingą teigiamą rezultatą.

Tik viena plona plokštelė gali būti panaudojama likučių nustatymui.

1.11 lentelė. HPLC metodo privalumai ir trūkumai (Toldra ir kt., 2006)

Privalumai Trūkumai

Trumpa laiko trukmė (keletas minučių pavyzdžiui) rezultatų gavimui.

Jautrus.

Specifiškumas susijęs su aptikimo jutikliu. Yra galimybė automatizuoti siekiant gauti didelį našumą.

Yra galimybė gauti daugiau informacijos iš spektrinės analizės panaudojant diodinį detektorių.

Reikia eksperto išvados.

Reikia pavyzdžių paruošimui (išgavimas, filtravimas, vidinių standartų sudėjimas ir kt.). Didelės pradinės investicijos (įranga).

Didelės naudojimo išlaidos.

Literatūros apžvalgos išvados:

1. Pieno kokybę labai įtakoja pašalinės medžiagos, o ypač inhibitorinės medžiagos.

2. Plačiausiai pieninių gyvulių gydymui pasaulyje yra vartojami tetraciklinų ir β-laktamų grupės antibiotikai, kurie gali patekti į pieną ir pabloginti jo kokybę.

3. Antibakterinių medžiagų likučių nustatymui naudojami: imunofermentinė analizė, imunosensorinė analizė ir fluorascencinės poliarizacijos imunofermentinė analizė.

4. Greitieji tyrimo metodai atliekami per 3-4 minutes, o kiti tyrimų metodai trunka iki keleto valandų.

29

2. EKSPERIMENTINIŲ TYRIMŲ METODIKA

Eksperimentinių tyrimų eiga:

Eksperimentiniai tyrimai buvo atliekamai LSMU Užkrečiamųjų ligų katedroje ir Nacionaliniame maisto ir veterinarijos rizikos vertinimo institute.

Tetraciklino likučių piene tyrimams atlikti naudotas žalias (nekonservuotas) karvių pienas: - „Neigiama kontrolė“ – pienas, kurio sudėtyje nėra aptikta inhibitorinių medžiagų

likučių;

- „Teigiama kontrolė“ – pienas su žinoma antibiotiko tetraciklino likučių koncentracija (2,5 μg /l; 5 μg /l; 10 μg /l; 15 μg /l; 20 μg /l; 30 μg /l), paruoštas naudojant koncentruotą (tetraciklino koncentracija 100 μg /l) standartinį tirpalą. „Teigiama kontrolė“ ruošiama graduotoje matavimo kolboje įlašinant reikiamą kiekį (100 µg/ml koncentracijos) tetraciklino tirpalo ir įpilant pieno kuriame nėra antimikrobinių medžiagų („Neigiamos kontrolės“).

Tetraciklino likučių piene nustatymui (naudojant „neigiamą“ ir „teigiamą“ kontrolę) taikyti skirtingi tyrimo metodai:

- Imunofermentinės analizės ELISA;

- SPEKTROMETRIJOS (dujų skysčio chromotografijos) metodas; - COWSIDE® II;

- DELVOTEST®;

- CHARM BLUE-YELLOW II; - ROSA.

Tyrimams atlikti naudoti metodai, kurie taikomi tetraciklinų ir β-laktamų grupės (2.1 lentelė) antibiotikų likučiams piene nustatyti.

2.1 lentelė. β-laktamų ir tetraciklinų grupės antibiotikai β-laktamų grupės antibiotikai Amoksicilinas Ampicilinas Cefaleksinas Cefazolinas Cefkvinomas Ceftiofuras Cefapirinas

30 2.1 lentelės tęsinys Kloksacilinas

Dikloksacilinas Penicilinas-G

Tetraciklino grupės antibiotikai Chlortetraciklinas

Oksitetraciklinas Tetraciklinas

2.1. Imunofermetinės analizės ELISA metodo taikymas tetraciklino likučiams piene nustatyti Tetraciklinų grupės antibiotikų likučių piene nustatymui Imunofermentinės analizės ELISA metodu naudotas Vokietijos gamintojo R-Biopharm AG reagentų rinkinys „RIDASCREEN® Tetracyclin“ (2.1 pav.).

2.1 pav. Vokietijos gamintojo R-Biopharm AG reagentų rinkinys „RIDASCREEN® Tetracyclin“ tetraciklinų grupės antibiotikų likučių piene nustatymui ELISA metodu (Autorė, 2014)

Naudojant R-Biopharm AG reagentų rinkinį tetraciklinų grupės antibiotikų likučių piene nustatymui būtina paruošti pieno mėginius bei žinomos tetraciklino koncentracijos standartinius tirpalus.

Pieno mėginių paruošimas tyrimui

Vienam mėginiui paruošti naudota 30 ml tiriamojo pieno (t.y. „Neigiama kontrolė“ bei skirtingos tetraciklino koncentracijos „Teigiama kontrolė“). Tiriamas pienas išpilstytas į paženklintus (užrašant tetraciklino koncentraciją) centrifugavimui skirtus mėgintuvėlius ir

31 centrifuguojamas 15 min. 4°C temperatūroje.Po centrifugavimo nuimamas mėgintuvėlyje susidaręs paviršinis pieno riebalų sluoksnis (tyrimui naudojamas liesas pienas).

Po centrifugavimo, liesas pienas („Neigiama kontrolės“ bei skirtingos tetraciklino koncentracijos „Teigiamos kontrolė“) skiedžiama „RIDASCREEN® Tetracyclin“ reagentų rinkinyje pateiktu skiedikliu (mėginio praskiedimo buferiu) santykiu 1:10 (1+9), t.y. 50 µl pieno + 450 µl skiediklio, ir gerai sumaišoma maišykle.

Standartinių tirpalų paruošimas tyrimui.

Tyrimui paruošiant „RIDASCREEN® Tetracyclin“ reagentų rinkinyje pateiktus koncentruotus tetraciklino standartinius tirpalus (0 µg/kg; 1,5 µg/kg; 4,5 µg/kg; 13,5 µg/kg; 40,5 µg/kg; 121,5 µg/kg tetraciklino koncentracijos), po 50 µl koncentruoto standartinio tirpalo (0 µg/kg; 1,5 µg/kg; 4,5 µg/kg; 13,5 µg/kg; 40,5 µg/kg; 121,5 µg/kg tetraciklino koncentracijos) skiedžiama su 450 µl reagentų rinkinyje pateiktu standartinių tirpalų skiedikliu ir gerai sumaišoma maišykle. Paruošiami skirtingos tetraciklino koncentracijos standartiniai tirpalai:

1 Standartinis tirpalas – 50 µl tetraciklino koncentrato (0 µg/kg) + 450 µl standartinių

tirpalų skiediklio 0 µg/kg.

2 Standartinis tirpalas 50 µl tetraciklino koncentrato (1,5 µg/kg) + 450 µl standartinių

tirpalų skiediklio 0,150 µg/kg.

3 Standartinis tirpalas 50 µl tetraciklino koncentrato (4,5 µg/kg) + 450 µl standartinių

tirpalų skiediklio 0,450 µg/kg.

4 Standartinis tirpalas 50 µl tetraciklino koncentrato (13,5 µg/kg) + 450 µl standartinių

tirpalų skiediklio 1,350 µg/kg.

5 Standartinis tirpalas 50 µl tetraciklino koncentrato (40,5 µg/kg) + 450 µl standartinių

tirpalų skiediklio 4,050 µg/kg.

6 Standartinis tirpalas 50 µl tetraciklino koncentrato (121,5 µg/kg) + 450 µl standartinių

tirpalų skiediklio 12,15 µg/kg.

Tyrimo atlikimas ELISA metodu naudojant „RIDASCREEN® Tetracyclin“ reagentų rinkinį.

„RIDASCREEN® Tetracyclin“ reagentų rinkinyje pateikta plokštelė su atskirais grioveliais (viso 96 grioveliai) į kuriuos dozuojamas paruoštas pienas („Neigiama kontrolė“, skirtingos tetraciklino koncentracijos „Teigiama kontrolė“) bei standartiniai tirpalai.

Pieno mėginiai ir standartiniai tirpalai tiriami dviem pakartojimais. Į reagentų rinkinyje pateiktą plokštelės griovelių stovą įstatomas tyrimui atlikti reikiamas kiekis griovelių (standartiniams tirpalams ir pienui įpilti).