LIETUVOS VETERINARIJOS AKADEMIJA
GYVULININKYSTöS TECHNOLOGIJOS
FAKULTETAS
GYVŪNŲ VEISIMO IR GENETIKOS KATEDRA
K.Janušausko gyvūnų genetikos laboratorija
Kristina Amšiejūt÷
GALVIJŲ GENETINIŲ TIPŲ ĮVERTINIMAS MOLEKULINIŲ
METODŲ PAGALBA
Magistro darbas
Darbo vadovas:
lekt. dr.Lina Baltr÷nait÷
Magistro darbas atliktas 2007 – 2009 metais Lietuvos veterinarijos akademijoje, Gyvūnų veisimo ir genetikos katedroje, K.Janušausko gyvūnų genetikos laboratorijoje.
Magistro darbą paruoš÷: Kristina Amšiejūt÷
(v., pavard÷) (parašas)
Magistro darbo vadovas: lekt.dr. Lina Baltr÷nait÷ (LVA, Gyvūnų veisimo ir genetikos katedra)
(parašas)
Recenzentas:
TURINYS
Santrumpų sąrašas...4
Įvadas...6
1. LITERATŪROS APŽVALGA ...7
1.1. Biocheminis polimorfizmas ir jo panaudojimas galvijininkyst÷je...7
1.1.1. Kraujo grupių polimorfizmas...7
1.1.2. Baltymu polimorfizmas...10
1.2. Genetinis polimorfizmas...10
1.2.1.Genetinio polimorfizmo variantai...10
1.2.2. Genetinio polimorfizmo panaudojumas galvininkyst÷je...12
1.3. Tirtų galvijų veislių apibūdinimas...13
2. TYRIMŲ MEDŽIAGA IR METODAI...17
2.1. Tyrimų medžiaga………...17
2.2. Reikalavimai m÷ginių pa÷mimui ir pristatymui į laboratoriją kilm÷s patikslinimui bei gyvulio identifikavimui...17
2.3. Gyvulių kilm÷s patikslinimas pagal DNR metodika...18
2.3.1. DNR skyrimo metodai iš įvairių audinių...18
2.3.2. DNR švarumo ir koncentracijos nustatymas...21
2.3.3. Polimerazin÷ grandinin÷ reakcija...23
2.3.4. Genotipavimas...24
2.3.5. Statistin÷ duomenų analiz÷...24
3. TYRIMŲ REZULTATAI IR APTARIMAS...26
4. IŠVADOS...38
5. SUMMARY...39
6. LITERATŪROS SĄRAŠAS...40
SANTRUMPŲ SĄRAŠAS
AN – Anglerai bp – bazių pora DNR - dezoksiribonukleinin÷ rūgštis DŽ – Danijos žalieji H - Holšteinai HE - Herefordai LI - Limuzinai LJ – Lietuvos juodmargiai LŽ – Lietuvos žalieji PBS – PBS buferisPGR – polimeraz÷s grandinin÷ reakcija RNR – riboksiribonukleinin÷ rūgštis OD – optinis tankis ŠA - Šarole SI - Simentaliai ŠŽ – Švedijos žalmargiai VNP – nukleotido polimorfizmas VJ – Vokietijos juodmargiai VŽ – Vokietijos žalmargiai
Darbo tikslas
Mikrosatelitų, naudojamų galvijų kilm÷s patikslinimui, genetinių variantų įvairov÷s ir jų paplitimo ištyrimas.
Darbo uždaviniai
• Įsisavinti DNR skyrimo metodus iš kraujo, spermos, plaukų.
• Įsisavinti galvijų kilm÷s pasitikslinimo pagal DNR metodą ABI 310 kapiliariniu sekvenatoriumi.
• Nustatyti TGLA 227, BM 2113, TGLA 53, ETH 10, SPS 115, TGLA 126, TGLA 122, INRA 23, ETH 3, ETH 225, BM 1824 mikrosatelitų alelių variantus ir dažnius tirtoje galvijų grup÷je.
• Nustatyti TGLA 227, BM 2113, TGLA 53, ETH 10, SPS 115, TGLA 126, TGLA 122, INRA 23, ETH 3, ETH 225, BM 1824 mikrosatelitų alelių dažnius atskirose galvijų veisl÷se.
Praktinis pritaikymas
Nustatytas TGLA 227, BM 2113, TGLA 53, ETH 10, SPS 115, TGLA 126, TGLA 122, INRA 23, ETH 3, ETH 225, BM 1824 mikrosatelitų polimorfizmas Lietuvos galvijų tarpe leidžia juos s÷kmingai naudoti kaip genetinius žymenis kilm÷s patikslinimui.
ĮVADAS
Beveik tris dešimtmečius t÷vyst÷s nustatymo metodai buvo susiję su kraujo grup÷s nustatymu ir serumo baltymų polimorfizmo tyrimais. Sparčiai besivystant biologijos mokslams buvo atrasti nauji tobulesni metodai, pasižymintys eile privalumų – tai tyrimai su DNR žymenimis (mikrosatelitais). (Williams et al., 1997)
Gyvulininkyst÷s praktikoje, vykdant selekcijos procesą, perkant ir parduodant veislinius gyvulius ir sportinius žirgus yra privalomas gyvulių kilm÷s patvirtinimas, t.y. t÷vų patvirtinimas ir individo identifikavimas.
Pagal Tarptautin÷s Gyvūnų Genetikos Asociacijos (ISAG) rekomendacijas tiek Europos Sąjungos šalyse tiek Jungtin÷se Amerikos Valstijose gyvulių kilmei patvirtinti vietoje kraujo grupių nustatymo metodo įdiegtas DNR tyrimo metodas, kurio privalumai yra 99,98 proc. tikslumas, paprastas m÷ginio pa÷mimas, nes tyrimą galima atlikti ne tik iš kraujo, bet ir spermos, plauko svogūn÷lio ar audinio, automatiniu aparatu su minimaliom darbo sąnaudom. Kiekvienas gyvulys turi unikalų DNR kodą, tod÷l analizuodami DNR, mes nustatome unikalų gyvulio genotipą. Jis yra fiksuojamas tyrimo momentu ir nesikeičia per gyvulio gyvenimo laikotarpį. Tai reiškia, kad mes gyvulį galime identifikuoti ganykloje, skerdykloje ar parduotuv÷je esančioje skerdienoje. Šis gyvulio identifikavimo būdas papildo naują gyvulių pasų sistemą, nes genotipai negali pasikeisti, susimaišyti ar pasimesti kaip gyvulio ausies ženklas (Bendixen., 1992; Malevičiūt÷ ir kt. 2002).
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Biocheminis polimorfizmas ir jo panaudojimas galvijininkyst÷je 1.1.1. Kraujo grupių polimorfizmas
Kraujo grupe vadinamas antigenas, turintis vieną ar keletą antigeninių faktorių, kurie paveldimi kaip genetinis vienetas.
Gyvulių kraujo grup÷s atrastos beveik tuo pačiu metu kaip ir žmonių. Kai buvo nustatyta, kad gyvulių kraujo eritrocituose yra daugyb÷ antigeninių faktorių, sudarančių kraujo grupes, kurios yra paveldimos, jomis susidom÷jo gyvulininkyst÷s specialistai. Gyvulių kraujo grupių tyrimo metodu nustatoma ne tik kilm÷, bet jis reikalingas ir veterinarijai, taip pat nustatant gyvulių suderinamumą poruojant, apvaisinimui pagerinti, imunologiniam neatitikimui nustatyti. Kraujo grupių tyrimo metodu sudaromas gyvulių genofondas, nustatomas ryšys tarp skirtingų alelių ir gyvulių produktyvumo, tarp kraujo grupių ir gyvulių reprodukcinių savybių, sveikumo (Boveinien÷ B. ir kt. 2001).
1898m. J. Bordet atrado gyvulių eritrocitų imuninius hemolizinus ir hemagliutininus. Nustatyta, kad eritrocitai gali fiksuoti specifinio serumo antikūnus. Paskiepijus jūrų kiaulytes triušio eritrocitais, jūrų kiaulyčių kraujo serumas įgyja naujų savybių: jis agliutinuoja (suklijuoja), o v÷liau ir hemolizuoja (ištipdo) triušio eritrocitus (Vagonis Z. ir Meškauskas Č., 1975).
1900 m. P. Ehrlich, J. Morgenroth pirmieji surado izohemolizinius – antikūnus, kurie hemolizuoja tos pačios rūšies gyvulių eritrocitus, ir išsiaiškino, kad eritrocitai prijungia antikūnus. Jie taip pat įrod÷, kad specifinis serumas, sumaišytas su eritrocitais, praranda hemoliz÷s savybę, o eritrocitai, prid÷jus normalaus gyvulio serumo turinčio komplemento, įgyja hemoliz÷s savybę. Taip pat buvo įrodyta, kad eritrocitai gali fiksuoti specifinio serumo antikūnus (Vagonis Z. ir Meškauskas Č., 1975).
1911-1913 m. R. Ottenberg ir S. Fredmen paskelb÷ duomenis apie gyvulių kraujo grupių tyrimus. Jie nustat÷, kad kai kurių galvijų eritrocitus kraujo serumas agliutinuoja, o kitų neagliutinuoja. Tą patį nustat÷ ir su kiaulių bei arklių eritrocitais. Įrodyta, kad gyvulius galima diferencijuoti pagal kraujo grupes. Tyrin÷jant gyvulių kraujo grupes paaišk÷jo, kad, eritrocitų antigenai ir turi atitinkama kraujo serumo antikūnus, kuriais galima nustatyti nemažai antigenų, bet d÷l mažo jų titro ir dažnumo kraujo grupes daug patogiau tirti imuniniais antikūnais (Vagonis Z. ir Meškauskas Č., 1975).
Gyvulių antigeniniai faktoriai žymimi lotyniškomis raid÷mis. Įvairių rūšių gyvulių antigeniniai faktoriai žymimi kiek kitaip. Pvz; galvijų ir arklių antigeniniai faktoriai žymimi
didžiosiomis raid÷mis A, B, C ir t.t., o kiaulių antigeniniai faktoriai žymimi mažosiomis raid÷mis a, b, c, d. Žymint kiaulių antigeninį faktorių, kartu nurodoma ir sistema (Ka, Ba, Bb) (Vagonis Z. ir Meškauskas Č., 1975).
Duomenys apie eritrocitų antigenus kraujo grup÷se, baltymų ir fermentų polimorfin÷s sistemas esančias kraujyje ir piene yra naudojami: (Boveinien÷ B. ir kt., 2001)
1. Charakterizuojant populiacijos genetinę struktūrą (veisl÷s, viduveisl÷s tipai), išaiškinti juose vyraujančius antigenų rinkinius, alelių polimorfines sistemas, išskirti genotipus, skirtumus ir panašumus tarp populiacijų. Svarbu išsiaiškinti antigenų, alelių, genotipų pasireiškimo dažnumo dinaminį kintamumą, kad nuspręsti apie populiacijos genomo stabilumą, pusiausvyrą ir heterozigotiškumo laipsnį, taip pat nustatyti genų konsentracija, kad vykdyti kriptyngą tolimesnę atranką.
2. Kontroliuoti norimų palikuonių gavimą pasitelkus surinktus jų t÷vų. duomenis apie kraujo grupes ir polimorfines sistemas. Patikslinti giminyst÷s ryšius vertinant bulius reproduktorius.
3. Išsiaiškinti ryšį tarp kraujo grupių ir polimorfinių sistemų su jų produktyvumu ir atlikti išankstinį palikuonių įvertinimas pagal laukiamą produktyvumą. Tikslingai prognozuoti porų paranka su norimais genotipais.
4. Išsiaiškinti kraujo grupių ir polimorfinių sistemų įtaka gyvulio organizmo fiziologin÷ms funkcijoms ir tinkamų porų skaičių.
5. Išsiaiškinti, ryšius tarp kraujo grupių ir polimorfinių sistemų baltimų ir fermentų bei jų įtaka paveldimoms, letalin÷ms ligoms, tikslu eliminuoti iš populiacijos genotipos “nešiotojus”. Šios ligos diagnozuojamos ankstyvame periode.
Monospecifinio reagento atpažinta antigeno dalis determinantas yra vadinama kraujo grup÷s faktoriumi arba specifiškumu. Kiekvienas specifiškumas yra koduojamas atskiro geno. Grup÷ faktorių, koduojamų susijungusių (susijusių) genų, esančių kaip vienetas ir yra vadinamų kaip kraujo grupių sistema, atskiroje chromosomoje nurodo fenogrupę. Kraujo grupių fenotipas yra fenogrupių, paveld÷tų iš abiejų t÷vų kombinacija. Fenogrup÷s gali atsitiktinai kisti rekombinacijos metu.
Galvijų antigeniniai faktoriai žymimi didžiosiomis raidemis A, B, C ir t.t. arba su apostrofais A’, B’. Kraujo grupę vadinamas antigenas, turintis vieną ar keletą antigeninių faktorių, kurie paveldimi kaip genetinis vienetas. Šiuo metu žinoma per 100 galvijų antigeninių faktorių, suskirstytų į 12 genetinių sistemų (Vagonis Z. ir Meškauskas Č., 1975; Georges et. al., 1987; Grosclaude et. al., 1990; Larsen et. al., 1992).(1 lentel÷).
Galvijų B ir C kraujo grupių sistemos yra koduojamos artimai susijusių genų. Skirtingų kraujo grupių sistemų chromosomin÷ vieta yra nulemta. Buvo atpažinta dvylika galvijų grupių sistemų – vienos yra paprastos, sudarytos tik iš vieno antigeno, tuo tarpu kitos yra daug sud÷tingesn÷s. J sistema yra vienintel÷, susijusi su natūraliai pasitaikančiu antikūniu – antiJ – ir titras žymiai keičiasi priklausomai nuo metų sezono ir gyvulio amžiaus. M sistemos antigenas yra dviejų formų – M ir M‘ – iš kurių kiekvienas yra priklausomas nuo kito ir tai yra vadinama subtipu (Hines and Larsen, 1990).
1 lentel÷.Galvijų kraujo grupių genetin÷s sistemos ir labiausiai paplitę antigeniniai faktoriai
Sistema Antigeniniai faktoriai
A A1, A2, D1, D2, H, Z
B B, B1, B2, G, G1, G2, I, I1, I2, K, O2, O3, OX, P, P1,
, Y1, Y2, I’, Y’, A’, Q, T1, T2, O1, O’2, E’1, E’2, E’3,
, P’, B’, B’’, K’, G’, G’’, J’1, J’2, F’, O’, Q’, I’’ C C1, C2, X1, X2, XO, R1, R2, W, L’, E’1, E’2, C’ FV F’1, F’2, V’1, V’2, V’3 J J’1, J’2, OC L L M M1, M2, M’ N N R’S’ R’1, R’2, S’1, S’2 SU S1, S2, S’’, H’, H’’, U1, U2, U’, U’’ T T’ Z Z, Z2
B sistema yra labiausiai palitusi iš kraujo grupių sistemų, turinti apie 300 variantų. Ne visos fenogrup÷s yra vienodai pasireiškiančios skirtingose galvijų veisl÷se ar bandose. Kai kurios kraujo grup÷s yra būdingos tam tikrai veislei, o tuo tarpu kitos yra bendros visoms. Pavyzdžiui, R1 dažnai pasitaiko Herefordų veisl÷je ir retai kitose veisl÷se, o B fenogrup÷ OTE‘3K‘ yra dažna Džersi veisl÷je, bet neatpažįstama Fryzų veisl÷je. Taigi, kai kurios fenogrup÷s yra veisl÷s požymis. Kiekvienas gyvulys paveldi vieną fenogrupę iš kiekvieno t÷vo, taigi kraujo tipas yra dviejų veiksnių kombinacija. Gyvulys, turintis GY1D‘O3J‘K‘ kraujo tipą gali sudaryti dvi fenogrupes, kurios veršeliuose išsiskiria, pus÷ gali paveld÷ti kraujo tipą GY1D‘, kita pus÷ – O3J‘K‘. B sistema suteikia visą eilę skirtingų genetinių
žymenų, kurie žymiai padidina kraujo grupių metodo jautrumą, atskiriant skirtingas galvijų populiacijas (Georges et. al.,1990).
1.1.2. Baltymų polimorfizmas
Skirtingai nuo antigeno kitimo raudonosiose ląstel÷se skirtinguose individuose, dar yra kitimas tarp serumo baltymų. Šie variantai yra įprasti d÷l jų biologin÷s funkcijos ir skiriasi vienas nuo kito keliomis amino rūgštimis. Serumo baltymų kitimas gali būti nustatytas elektroforez÷s metodu. Baltymo molekul÷s elektrinis krūvis priklauso nuo jo amino rūgščių sud÷ties. Baltymo amino rūgščių pakitimai yra mutacijų rezultatas, pakeičiantis baltymo krūvį, kuris nulemia jo elektroferezinį jud÷jimą. Pirmas elektrofozezinis baltymas buvo pavadintas S hemoglobinu. Hemoglobinas ir transferinas yra dažnai naudojami naminių gyvulių t÷vyst÷s nustatyme. Transferinas yra baltymas, kuris organizme perneša geležį ir retikulocituose sujungia ją į hemoglobiną. Alelių skirtumai yra matomi transferino molekul÷s polipeptidin÷je grandin÷je, atsižvelgiant į prisijungusios sialo rūgšties kiekį. Keturi aleliai – A, D1, D2 ir E – yra apibūdinami transferimo baltymu Britų galvijuose. Kitose veisl÷se pasitaiko daugiau alelių, pavyzdžiui, zebu galvijuose - G ir F. Kiti dažniausiai tyrin÷jami baltymai yra albuminas, amilaz÷, ceruloplazminas, esteraz÷s ir šarmin÷ fosfataz÷. T÷vyst÷s nustatymo efektyvumas, pagrįstas kraujo grupių pagrindu padid÷ja 5 %, kai pridedama informacija apie transferino ir hemoglobino polimorfizmą. (Vagonis ir Meškauskas, 1975).
1.2. Genetinis polimorfizmas ir jo panaudojimas galvijininkyst÷je 1.2.1 Genetinio polimorfizmo variantai
Genetinis polimorfizmas atsiranda d÷l mutacijų. Tai DNR sekos skirtumai tarp individų, jų grupių ar populiacijų. Šie skirtumai atsiranda d÷l įvairių mutacijų, apimančių nuo vienos nukleotido baz÷s pakeitimo iki kelių šimtų bazių permainų. Formaliąja prasme, yra tik dvi polimorfizmo rūšys: polimorfizmas d÷l DNR bazių pakeitimo ir polimorfizmas d÷l bazių porų insercijos ar delecijos. Paprasčiausias genetinio polimorfizmo tipas yra vieno nukleotido polimorfizmas (VNP). Pakitimas laikomas VNP, kai egzistuoja mažiausiai du jo variantai ir retesnysis alelis pasitaiko dažniau nei 1% bendroje populiacijoje. Kitos genetinio polimorfizmo rūšys atsiranda d÷l DNR atkarpos, kurioje yra besikartojančios sekos (mini ir mikrosatelitai), insercijos ar delecijos bei d÷l didelių genetinių praradimų ir pertvarkų.
Dideli pakitimai yra mutacijos, d÷l kurių didel÷s DNR sekos dalys (>500 bp) yra ištrinamos, padvigub÷ja ar persitvarko. Šiuos genominių pakitimų tipus galima aptikti naudojant citogenetinius tyrimo metodus (tokius kaip chromosomų skaičiaus pakitimai ir chromosomų translokacijos) bei molekulin÷s citogenetikos metodus, naudojant southern‘o hibridizaciją, mikrosatelitus ir fluorescentinę in situ hidridizaciją .
Hipervariabilieji minisatelitai paprastai apibūdinami kaip kopijos kartu su trumpu (nuo 6 iki 100 bp) motyvu, apimančiu nuo 0,5 Kb iki kelių kilobazių. Dažniausiai jie yra lokalizuoti tarp genų ir yra netolygiai pasiskirstę genome, daugiausiai telomerų vietose (Smith J.C., et. al. 1990). D÷l jų ilgio polimorfizmo ir geb÷jimo kryžmiškai hibridizuotis su panašiais genomo lokusais, minisatelitai buvo panaudoti DNR pirštų atspaudų metode teisminei individo identifikacijai (Jeffreys et al., 1985).
Mikrosatelitai yra viena paskui kitą einančios kartotin÷s tos pačios sekos motyvo, sudaryto iš 1 – 4 bazių porų ilgumo vienetų, kopijos. Jie yra būdingi visiems prokariotams ir eukariotams ir jų yra net mažiausiuose bakterijų genomuose.. Šie polimorfizmai rodo didelius kiekius alelinių variacijų pagal pasikartojančių vienetų skaičių ir yra plačiai naudojami kaip žymenys ryšių tyrimuose (Bruford and Wayne, 1993; Bruford et. al., 1996).
Galvijų genotipe mikrosatelitų yra randamas didelis kiekis. Genome aptinkama DNR seka, kurios pasikartojantis fragmentas eina tendemiškai. Šiuo metu yra nustatyta, kad beveik kiekvienas genas turi mažiausiai po viena mikrosatelitą, kuris yra išsid÷stęs introne, ar koduojančios sekos 5’ ar 3’ gale (Martin-Burriel.et. al., 1999).
Mikrosatelitai naudingi yra tuo, kad pasikartojimų skaičius yra labai polimorfiškas ir tai atsiranda d÷l skirtigo pasikartojančių fragmentų skaičiaus pas individus. Kuo didesnis pasikartojimų skaičius (n) tuo daugiau alelių yra stebima. Polimorfizmas stebimas ir mikrosatelitai aptinkami PCR (polimerazin÷s grandin÷s reakcijos) pagalba naudojant atitinkamus pradmenis ir frakcionuojant juos elektroforez÷s metu poliakrilamidiniame gelyje (Mullis and Faloona, 1987; Saiki et. al., 1988; Sambrook et. al., 1989; Erlich,. 1990).
TG TG TG 3 ¾ ♀ TG TG TG TG 4 TG TG TG TG TG 5 5/4 ♂ TG TG TG TG 4 TG TG TG 3 3/5 TG TG TG TG TG 5 PALIKUONIS 1. pav. Mikrosatelitų paveld÷jimo schema.
Manoma, kad bet kurio gyvūno genome yra maždaug 100.000 mikrosatelitinių lokusų, o tai reiškia, kad bet kuri genomo pad÷tis nuo mikrosatelito bus nutolusi ne daugiau kaip per 25–50 kbp. D÷l tokio plataus genomo apr÷pimo ir galimyb÷s vienoje daugkartin÷je polimerazin÷je grandinin÷je reakcijoje naudoti iki penkių mikrosatelitinių lokusų vienu metu mikrosatelitinių sistemų analitin÷ geba priart÷ja prie minisatelitinių sistemų lygio ir yra patogesn÷s naudoti.
1.2.2. Genetinio polimorfizmo panaudojimas galvijininkyst÷je
Mikrosatelitai yra naudojami individo kilmei patikslinti arba individui indentifikuoti, su mikrosatelitais sukibusiems, bet dar neatrastiems genams tirti (Wiverio sindromas galvijams – progresuojanti digeneratyvi mieloencefalopatija) bei vidurūšinei, tarprūšinei populiacijų įvairovei tirti taip pat genetiniam atstumui įvertinti (Ashwell et. al., 1996; Eding. and Laval 1999; Hanslik et. al., 2000).
Mikrosatelitų DNR šiuo metu yra plačiai naudojamos kaip genetiniai žymenys ir yra labai naudingi sudarant genų žem÷lapius, nes kiekviena pradmenų pora atitinka specifinę vieta chromosomoje. Mikrosatelitų kaip genetinių žymenų genomo visumoje skaičiaus nustatymas yra būtinas ir šiuo metu jau žinomi genetiniai eil÷s naminių gyvulių žem÷lapiai (Bishop et. al.,1994; Ma et al., 1996).
Beveik tris tešimtmečius t÷vyst÷s nustatymo metodai buvo susiję su kraujo grup÷s nustatymu ir serumo baltymų polimorfizmo tyrimais t.y požymiais, kurie yra paveldimi. Bet dabar žinomi nauji tobulesni metodai, pasižymintys eile privalumų - tai tyrimai su DNR markeriais (mikrosatelitais). Norint atlikti bet kokius tyrimus ar manipuliacijas su DNR ji turi būti išskirta iš organizmo audinių ląstelių ir išvalyta nuo baltymų ir RNR. Genomin÷ DNR gali būti skiriama iš tiriamo individo kraujo, spermos, minkštojo audinio, pieno ar plauko šaknel÷s ir ji bus visais atvejais identiška tarpusavyje, bet skirsis nuo kito individo DNR .
Mikrosatelitin÷ DNR rodo platų praktinį pritaikymą t÷vyst÷s nustatyme. Mikrosatelitų panaudojimas kilm÷s nustatymui yra aprašytas žmonių, galvijų, šunų, kiaulių, arklių tarpe (Smith et.al. 1990; Marklund et. al., 1994; Williams et. al., 1997; Martin-Burrie et.al., 1999; StockMarks 2002).
2 lentel÷. Mikrosatelitų naudojamų gyvulių kilmei patikslinti skaičius
Gyvūno rūšis Mikrosatelitų skaičius
Galvijams 11
Avims 11
Šunim 17
Palyginus DNR ir serploginį kilm÷s patikslinimo metodus galime teigti, kad : a) Serologinis metodas - pagal kraujo grupių ir organizmo baltimų polimorfizmą:
• 78-80 proc. tikslumu;
• didelis kiekis imuninių serumų; • didel÷s darbo sąnaudos;
• tyrimas atliekamas tik iš šviežio kraujo;
b) Genetinis – pagal DNR mikrosatelitų polimorfizmą: • 99,98 proc. tikslumu;
• tyrimą galima atlikti ne tik iš kraujo, bet ir iš spermos, plauko svogūn÷lio ar audinio m÷ginio;
• automatinis aparatas įgalina tirima atlikti su minimaliom darbo sąnaudom ir kaupti rezultatus duomenų baz÷se;
• tie patys DNR m÷giniai gali būti panaudoti paveldimų genetinių ligų tyrimui; • tie patys DNR m÷giniai gali būti panaudoti selekcijai pagal genetinius markerius. Kilm÷s patikrinimas turi būti atliekamas - veisliniams buliukams ir telyčioms, buliukams, atrinktiems kontroliniam pen÷jimui, tikrinamų bulių dukterims, įrašant gyvulius į kilm÷s knygas, gyvuliams su įtartinais kilm÷s dokumentais, eksportuojant gyvulius, s÷klinant maišyta sperma, embrionų transplantavimo atvejais,pavogtiems ar pasiklydusiems gyvuliams.
1.3. Tirtų galvijų veislių apibūdinimas
Holšteinai. Šios veisl÷s suformavimui didel÷s įtakos tur÷jo Olandijos juodmargiai. Dabartiniai Holšteino fryzai palyginti su Olandijos juodmargiais yra ryškesnio pieninio tipo, pieningesni, stambesnių kaulų, gerokai aukštesni, ilgesnių galūnių, didesn÷s krūtin÷s apimties, ju tešmuo geriau išsivystęs ir pasižymi geresn÷mis fiziologin÷mis savyb÷mis. Holšteino fryzai – pieningiausia galvijų veisl÷ pasaulyje. Šios veisl÷s karv÷s vidutiniškai sveria 680 – 700 kg, buliai 1000 – 1200 kg, ką tik atvestas veršelis 40 – 41 kg. Iš karv÷s vidutiniškai per metus primelžiama po 7200 kg, 3,8 proc. riebumo ir 3,2 proc baltymingumo pieno. Holšteinai yra juodmargiai ir žalmargiai. Juodmargiai pasaulyje labiau paplitę nei žalmargiai, tačiau abi veisl÷s panašios savo kūno proporcijomis, tešmens savyb÷mis ir proguktyvumu. Lietuvoje Holšteinų fryzų galvijai naudojami Lietuvos juodmargių galvijų produktyvumui gerinti. Su holšteinais pagerintų Lietuvos juodmargių pieningumas apie 150 – 200 kg didesnis, tačiau
pieno riebumas ir baltymingumas mažesnis. Holšteinizuoti Lietuvos juodmargiai yra aukštesni, tvirtesnių kojų, netokie raumeningi, siauresnių klubų ir str÷nų ir daugiau sveria negu grynaveisliai ir olandizuoti Lietuvos juodmargiai. Pastaruoju metu Lietuvos žaliesiams galvijams gerinti pradedami naudoti ir žalmargiai holšteinai (Jukna Č., 1998.).
Vokietijos juodmargiai. Jie yra taisyklingo kūno sud÷jimo, stambūs, tvirtų ilgų kojų, labai pieningi. Suaugusių karvių vidutinis svoris 650 kg, bulių 900 – 1000 kg. Karvių aukštis ties ketera 138 – 139 cm, ties kryžmeniu 141 – 143 cm. Vidutinis karvių pieningumas per metus 6500 – 7000 kg, 4,1 proc. riebumo ir 3,4 proc. baltymingumo pieno. Vokietijos juodmargiai galvijai Lietuvoje naudojami Lietuvis juodmargiams gerinti. Palyginti su kitomis užsienio galvijų veisl÷mis, Vokietijos juodmargių šiuo metu Lietuvoje daugiausia – apie 1188 kontroluojamų karvių (Jukna Č., 1998).
Lietuvos juodmargiai. Lietuvos juodmargių galvijų veisl÷ oficialiai pripažinta 1951 metais. Dabar Lietuvos juodmargiai sudaro apie 60 proc. Lietuvos galvijų. Jie daugiausiai veisiami Vakarų ir Vidurio Lietuvoje. Olandijos juodmargiai šiek tiek sumažino Lietuvos juodmargių aukštį, pagerino tešmens morfologines ir fiziologines savybes. Pastaraisiais metais Lietuvos juodmargiams galvijams gerinti palčiai naudojant Holšteinų veisl÷s bulius padid÷jo jų svoris, pieningumas, tešmens savyb÷s. Dabar Lietuvos juodmargių veisl÷s karv÷s vidutiniškai sveria 550 – 600, buliai 900 – 1000 kg. Iš jų vidutiniškai per metus primelžiama apie 3700 kg, 4,1 proc. riebumo ir 3,3 proc. baltymingumo pieno, o geriausiose bandose vidutiniškai iš juodmargių karvių per metus primelžiama po 5000 kg ir daugiau riebesnio kaip 4 proc. ir 3,3 – 3,4 proc. baltymingumo pieno. Lietuvos juodmargiai yra stiprios konstitucijos, proporcingo kūno sud÷jimo. Karvių aukštis ties ketera – 130 cm, ties kryžmeniu 133 – 134 cm. Prieauglis auga greitai: intensyviai šeriami buliukai per parą priauga po 1000g ir daugiau, sunaudodami vidutiniškai apie šešis pašarinius vienetus. Normalaus įmitimo karvių skerdenos išeiga apie 50 proc. (Jukna Č., 1998.).
Lietuvos žalieji. 1951 metais Lietuvos žalieji galvijai pripažinti savarankiška veisle. Lietuvos žalieji galvijai yra žalos spalvos, įvairaus atspalvio. Karvių aukštis ties ketera 128 – 129 cm, ties kryžmeniu 130 – 133 cm, svoris 520 – 550 kg, bulių 820 – 900 kg. Ką tik atvesto veršelio svoris 32 – 35 kg. Buliukų pen÷jimosi savyb÷s geros, skerdenos išeiga 52 – 53 proc. Karvių pieningumas vidutiniškai 4000 kg. pieno, 4,2 proc. riebumo ir 3,4 proc. baltymingumo pieno (Jukna Č., 1998.).
Anglerai (Angelnai). Šios veisl÷s galvijai vieni iš populiariausių pieninių žalųjų galvijų. Jie panaudoti išvedant ir gerinant Danijos, Lenkijos, stepių žaluosius ir Latvijos dvyluosius galvijus. Anglerais gerinami ir Lietuvos žalieji galvijai. Jie pagerino Lietyvos
žalųjų tešmens morfologines ir fiziologines savybes, padid÷jo pieno riebumas, pieningumass, pager÷jo veisimosi savyb÷s. Anglerų veisl÷s galvijai yra šviesiai ir tamsiai žalos spalvos, vidutinio stambumo, galva liesa, kaklas vidutinio ilgio, ragai šviesiai pilki su tamsiais galais, krūtin÷ gili, vidutinio pločio, tešmuo gerai išsivystęs, vonios formos. Tai riebapieniai, gerų m÷sinių savybių, pieningų, stiprios konstitucijos, gero eksterjero anglerų veisl÷s galvijai. Karvių vidutinis svoris 500 kg, bulių 800 kg. Iš karv÷s vidutiniškai per metus primelžiama po 5500 – 6000 kg, 4,7 proc. riebumo ir 3,4 proc. baltymingumo pieno. Anglerai naudojami Lietuvos žaliesiams gerinti (Jukna Č., 1998).
Švedijos žalmargiai. Švedijos žalmargiai yra žalos spalvos arba žalmargiai, suaugusių karvių svoris 550 – 600 kg, bulių 850 – 1100 kg, atvestų veršelių 35 – 36 kg. Karv÷s aukštis ties ketera - 132 cm, ties kryžmeniu - 134 cm. Iš jų vidutiniškai primelžiama po 7562 kg, 4,35 proc. riebumo ir 3,44 proc. baltymingumo pieno. Lietuvoje Švedijos žalmargių grynaveislių karvių yra 55. Iš jų vidutiniškai per 305 laktacijos dienas primelžiama po 7088 kg, 4,25 proc. riebumo ir 3,46 proc. baltymingumo pieno.
(http://www.ansi.okstate.edu/breeds/cattle/swedishredandwhite/index.htm)
Herefordai.Tai viena seniausių ir labiausiai paplitusių m÷sinių galvijų veisl÷ pasaulyje. Veisl÷ išvesta Škotijoje. Tai greitai bręstantys, nereiklūs, labai gerai išnaudojantys ganyklą gyvuliai. Seno Škotiško tipo Herefordai žemų kojų, gilaus liemens, labai anksti ir greitai kaupiantys riebalus gyvuliai. Pereito šimtmečio viduryje Europos šalyse prad÷jo formuotis sustambinto tipo Herefordų populiacija. Šios populiacijos gyvuliai kaupia nežymiai mažiau riebalų ir yra stambesni. Kanadoje susiformavo sustambinto tipo Herefordų populiacija. Šio tipo gyvuliai yra ilgesnių kojų, grubesnio skeleto, gana stambūs. Visų tipų Herefordų spalva žala, balta galva, baltas pagurklis, balta papilv÷, balti kojų nagai ir balta uodegos šluotel÷. Ragai lenkti į šonus ir žemyn. Dabar formuojasi beragių Herefordų populiacija. Populiariausiais laikomi vidutinio stambumo Herefordai. Jų m÷sa skani, skerdenos išeiga sudaro apie 62–63 proc. Herefordai labai gerai prisitaiko įvairiose klimatin÷se sąlygose ir labai gerai išnaudoja ganyklas. Nereiklūs pašarams. Jų veršeliai gimsta neplačių kūno formų, tod÷l karv÷s lengvai veršiuojasi. Herefordai Lietuvoje veisiami grynuoju veisimu ir naudojami kryžminimui su smulkesn÷mis menkesn÷s veislin÷s vert÷s pienin÷mis karv÷mis bei telyčiomis. Jie priskiriami prie vidutinio intensyvumo gamybos veislių. (http://www.vetinfo.lt/44/sub-3.html )
Limuzinai.Veisl÷ išvesta Prancūzijos kalnuotoje vietov÷je. Pagal biologinius ypatumus gyvuliai panašūs į Šarol÷ veisl÷s galvijus, tik šios veisl÷s gyvuliai kiek smulkesni. Paskutiniais metais Limuzinai vis labiau plito pasaulyje. Tai gražaus kūno sud÷jimo, ilgo
gilaus liemens, švelnaus skeleto, gerai išvystytais raumenimis gyvuliai. Spalva žala į gelsvumą. Pilvo, aplink akis ir nosies veidrod÷lį plaukai šviesesn÷s spalvos. Pagal gausumą Prancūzijoje jie užima antrą vietą po Šarol÷. Laikymo sąlygoms nereiklūs, karv÷s veršiuojasi lengvai. Įmitusio prieauglio skerdenos išeiga apie 63–64 proc. Limuzinai Lietuvoje veisiami gyvuoju veisimu ir naudojami kryžminimui su pieniniais ir m÷siniais galvijais. Ūkiuose, kur yra geros ir vidutinio derlingumo ganyklos, ši veisl÷ yra perspektyvi. Nors Limuzinų kūno mas÷ kiek mažesn÷ negu Šarole galvijų, tačiau ir jie priskiriami prie intensyvios gamybos veislių. (http://www.vetinfo.lt/44/sub-3.html)
Simentaliai..Veisl÷ išvesta Šveicarijoje.Labiausiai pasaulyje paplites pieniniu – m÷siniu Simentaliu tipas.Greta šio tipo paskutiniais dešimtmeciais Vokietijoje ir kai kuriose kitose šalyse susiformavo m÷siniu Simentaliu tipas. Tai stambus, greitai augantys, nereiklus gyvuliai. Jie ypač populiarus Vokietijos rytin÷se žem÷se. Lietuvoje jie veisiami grynuoju veisimu ir naudojami kryžminimui su pieniniais galvijais, veisiami tik m÷sinio tipo Simentaliai. Simentaliu spalva žalmarga, geltmarga, arba žala. Galva dažnai balta. Liemuo ilgas, raumenys išvystyti gerai. Karv÷s pieningos, tod÷l veršeliai gerai auga. Skerdienos išeiga 57 – 60 proc. M÷sa geros kokyb÷s. Simentaliai kaip ir Šarole priskiriami prie intensyvios gamybos veisliu. Svoris nujunkant (7-8 m÷n.) 280-340 kg. Suaugusių svoris 700-1300 kg. (http://www.vetinfo.lt/44/sub-4.html)
Šarole. Tai prancūziška m÷sinių karvių veisl÷. Veisl÷ išvesta seniai ir pripažinta geriausia Prancūzijoje, tod÷l ji sudaro m÷sinių galvijų pagrindą šioje šalyje ir Europoje. Šarol÷ - stambios veisl÷s galvijai. Baltos spalvos, švelniu kailiu, šviesiais ragais ir rausvu vaškiniu nosies galiuku. Šarol÷ galvijų gerai išvystyti nugaros, juosmens ir užpakalin÷s kūno dalies raumenys. Suaugusi karv÷ vidutiniškai sveria 700 – 1100 kg, buliai užauga nuo 1000 iki 1600 kg. Galvijai ilgai augantys ir v÷liau bręstantys, tod÷l intensyviai auga iki 2 – 2.5 metų. Tuomet intensyviai vystosi raumenys ir mažai kaupiasi riebalai. Šarol÷ veisl÷s telyčios ir karv÷s dažniausia kergiamos su buliais, o nes÷klinamos. Šarol÷ veisl÷s buliai dažnai naudojami kergimui su kitomis veisl÷mis. Tą sąlygoja geros Šarol÷ veisl÷s m÷sin÷s savyb÷s. Šarol÷ karv÷s užtikrina greitą atsivestų veršelių augimą. Tai pati pieningiausia m÷sinių galvijų veisl÷. Per dieną ji duoda apie 8 kg pieno ir tai sudaro sąlygas intensyviam veršelių augimui pirmuosius 6 m÷nesius. Nuo gimimo iki 3 m÷n. veršeliai priauga iki 1100 gr. per dieną. (http://www.vetinfo.lt/44/sub-4.html)
Vokietijos žalmargiai. Vokietietijos žalmargių vystymasis vyko tuo pačiu laiku keliose Vokietijoje srityse apie 1800-uosius metus. 1934 ši veisl÷ buvo išvesta, nuo to laiko veisl÷ l÷tai pl÷t÷si. Šitie galvijai yra panašūs į Olandijos žalmargius, bet šiek tiek tvirtesni. Karvių
aukštis ties ketera 135 cm ir sveria 700 kg. Buliai yra 145 cm ir vidutinis 1 000 kg svoryje. (http://www.ansi.okstate.edu/breeds/cattle/)
2. TYRIMŲ METODAI IR MEDŽIAGA
2.1 Tyrimų medžiaga3 lentel÷. Veislių pavadinimai, sutrumpinimai, ištirtų karvių, bulių bei bendras individų skaičius kiekvienoje veisl÷je.
Veisl÷ Veisl÷s pavadinimo sutrumpinimas Ištirtų gyvulių skaičius Ištirtų karvių skaičius Ištirtų bulių skaičius Anglerai AN 5 5 Danijos žalieji DŽ 18 18 Holšteinai H 19 5 14 Herefordai HE 4 4 Limuzinai LI 9 9 Lietuvos juodmargiai LJ 36 21 15 Lietuvos žalieji LŽ 9 9 Simentaliai SI 3 3 Šarole ŠA 8 8 Švedijos žalmargiai ŠŽ 14 14 Voketijos juodmargiai VJ 13 1 12 Voketijos žalieji VŽ 4 4 Viso 142 27 115
2.2. Reikalavimai m÷ginių pa÷mimui ir pristatymui į laboratoriją kilm÷s patikslinimui bei gyvulio identifikavimui.
Reikalavimai kraujo m÷giniui:
1. kraujas paimamas iš jungo venos į 10 ml vienkartinius vakuminius m÷gintuv÷lius su konservantu – EDTA K3;
3. m÷ginys pristatomas į laboratoriją;
4. jeigu iškarto n÷ra galimybių pristatyti į laboratoriją – m÷ginys patalpinamas į šaldymo kamerą;
5. užpildomas m÷ginių pa÷mimo ir pristatymo lydraštis. Reikalavimai šerių (plaukų) meginiui :
1. šeriai ( plaukai ) išpešami iš bet kurios gyvulio kūno vietos taip, kad būtinai tur÷tų svogūn÷lius (išpešus, šerys ( palumas) gale tur÷tų sustor÷jimą);
2. tyrimui reikalingi 20-25 šeriai (plaukai);
3. patalpinami į švarų vienkartinį palstikinį maišelį; 4. ant m÷ginio užrašomas gyvulio numeris;
5. m÷ginys pristatomas į laboratoriją;
6. paimtą m÷ginį galima laikyti neribotą laiką;
7. užpildomas m÷ginių pa÷mimo ir pristatymo lydraštis. Reikalaviamai spermos m÷giniui:
1. sperma paimama į specialius šiaudelius; 2. tyrimui reikalingos 2 spermos doz÷s (0,5 ml); 3. m÷ginys užšaldomas;
4. m÷giniai, išimti iš gilaus šaldymo tą pačią dieną pristatomi į laboratoriją; 5. užpildomas m÷ginių pa÷mimo ir pristatymo lydraštis.
2.3. Gyvulių kilm÷s patikslinimo pagal DNR metodika 2.3.1. DNR skyrimo metodai iš įvairių audinių
DNR gali būti skiriama iš kraujo, spermos, audinio ląstelių ar plauko svogūn÷lio. Taikomi skyrimo metodai susideda is trijų pagrindinių etapų:
ląstelių lizavimo;
baltymų ir likusių priemaišų pašalinimo fenolio – chloroformo mišiniu; DNR nusodinimo alkoholiu.
Išskirta ir distiliuotame vandenyje ištirpinta DNR gali būti naudojama tyrimams iš karto, arba saugoma –20oC temperatūroje.
DNR skyrimas iš plauko svogūn÷lio (express metodu) 1. Nukerpami 4-5 plaukų svogūn÷liai ir patalpinami į m÷gintuv÷lius. 2. Paruošiamas lizavimo mišinys:
Proteinaz÷ K: lizavimo buferis = 1:5.
3. M÷gintuv÷lio turinys užpilamas lizavimo mišiniu:
Arkliams: vienam pavyzdžiui imama 60µl buferio ir 12µl proteimaz÷s K. Kitiems: vienam pavyzdžiui imama 50µl buferio ir 10µl proteinaz÷s K. 4. M÷gintuv÷liai 30s. maišomi maišykl÷s “Vortex” pagalba.
5. Centrifuguojami 10s. 13 500 aps./min. greičiu.
6. Pavyzdžiai per naktį inkubuojami 56oC temperatūroje.
7. Po naktin÷s inkubacijos pavyzdžiai 10min. pakaitinami 94oC temperatūroje ir atšaldomi iki kambario temperatūros.
8. Centrifuguojami 10s. 13 500 aps./min. greičiu.
DNR skyrimas iš plauko svogūn÷lio (su chelex)
1. Nukerpami 4-5 plaukų svogūn÷liai ir patalpinami į m÷gintuv÷lius. 2.Paruošiamas mišinys:
DTT - 7,5 µl
Chelex - 200 µl
Proteinaz÷ K(20mg/ml): - 10,7 µl
Viso - 218,2 µl (vienam m÷giniui)
3. M÷gintuv÷liai 30s. maišomi maišykl÷s “Vortex” pagalba. 4. Centrifuguojami 10s. 13 500 aps./min. greičiu.
5. Pavyzdžiai 30 minučių inkubuojami 56oC temperatūroje.
6. Po 30 min inkubacijos pavyzdžiai 10min. pakaitinami (inaktyvuojami – amplifikatoriuje) 94oC temperatūroje.
7. Centrifuguojami 10s. 13 500 aps./min. greičiu.
DNR skyrimas iš spermos
1. Į 1.5ml m÷gintuv÷lius supilama 0.5ml spermos (4-5 granul÷s). 2. Užpilama 100µl PBS buferiu ir trumpai sumaišoma.
3. Centrifuguojama 1min. 11000 aps./min. greičiu ir pipet÷s pagalba pašalinamas supernatantas.
4. Ant nuos÷dų užpilama 400µl lizavimo buferio, trumpai sumaišoma ir inkubuojama per naktį 37oC temperatūroje.
5. Į kiekvieną m÷gintuv÷lį užpilama 500µl fenolio ir m÷gintuv÷liai energingai purtomi rankomis 20s. Po to mažiausiai 10min. švelniau maišoma maišykl÷s pagalba. (M÷gintuv÷liai kartas nuo karto pavartomi).
6. Užpilama 500µl chloroformo-izoamilo alkoholiu (24:1) ir m÷gintuv÷liai energingai purtomi rankomis 20s. Po to mažiausiai 10min. švelniau maišoma maišykl÷s pagalba.
7. Centrifuguojama 3min. 11000 aps./min. greičiu.
8. 1ml pipet÷s pagalba atsargiai nusiurbiamas viršutinis sluoksnis ir pernešamas į naujus m÷gintuv÷lius. Svarbu nepaimti tarpiniame sluoksnyje susidariusių nuos÷dų!
9. Užpilami 2V (apytiksliai 1ml) –20oC temperatūroje laikyto 99% etilo alkoholio ir turinys sumaišomas greitai 5-6 kartus pavarčius m÷gintuv÷lį. DNR (ir RNR) iškrenta nuos÷domis.
10. Centrifuguojama 20-30s. 11000 aps./min. greičiu.
11. Per 15min. DNR atsargiai pernešama į m÷gintuv÷lius su 1ml atšaldytu 70% etilo alkoholiu ir plaunama švelniai maišant mažiausiai valandą. Arba paliekama nemaišant per naktį 4oC temperatūroje.
12. Centrifuguojama 20-30s. 11000 aps./min. greičiu.
13. Etilo alkoholis nupilamas, jo likučiai pašalinami mikropipet÷s pagalba. 14. DNR paliekama 30min. džiūti kambario temperatūroje.
15. DNR užpilama 500µl distiliuoto vandens arba TE buferio 16. DNR tirpinama 24h 4oC temperatūroje.
DNR skyrimas iš kraujo (Chloroforminis - fenolinis metodas) 1. Kraujas imamas į vakuuminius m÷gintuv÷lius su konservantu: 2. Įjungiama centrifuga ir atv÷sinama iki 4oC.
3. Į m÷gintuv÷lius įpilama po 10ml kraujo ir po 30ml buferio A. Megintuv÷lių turinys sumaišomas vartant.
4. M÷gintuv÷liai 30min. inkubuojami ledo vonioje. Kas 5-10 min. m÷gintuv÷lių turinys sumaišomas vartant.
5. Centrifuguojama 10min. 4oC temperatūroje 3000aps./min. greičiu. 6.Nupilamas skystis ir paliekamos tik nuos÷dos.
7. Ant nuos÷dų užpilama 10ml buferio A ir gerai išmaišoma pipete. 8. Centrifuguojama 10min. 4oC temperatūroje 3000 aps./min. greičiu. 9. Nupilamas paviršiuje esantis skystis.
10. Ant nuos÷dų užpilama 10ml 0.15M KCl ir gerai išmaišoma pipete. 11. Centrifuguojama 10min.4oC temperatūroje 3000 aps./min. greičiu.
12. Nupilamas paviršiuje esantis skystis.
13. Ant nuos÷dų užpilama 10ml 0.15M KCl ir gerai išmaišoma pipete. 14. Centrifuguojama 10min. 4oC temperatūroje 3000aps./min.greičiu. 15. Nupilamas paviršiuje esantis skystis.
16. Ant nuos÷dų užpilama 5ml buferio B, 500ml 10% SDS, 15ml proteinaz÷s K ir gerai išmaišoma pipete. (M÷ginys įgauna tąsią, kiaušinio baltymo konsistencija).
17. Inkubuojama per naktį 37oC (arba 2val 55oC) temperatūroje.
18. Po inkubacijos užpilama 1.4ml 6M NaCl tirpalo ir m÷giniai 15s. maišomi maišykl÷s “Vortex” pagalba arba stipriai supurtomi rankiniu būdu.
19. I m÷gintuv÷lius pilama 4ml chloroformo ir m÷giniai v÷l maišomi, kol susidaro balta vienalyt÷ mas÷.
20. Centrifuguojama 20min. 22oC temperatūroje 4000aps./min. greičiu. Iš centrifugos m÷giniai išimami atsargiai, kad nesusimaišytų susidarę sluoksniai.
21. Pipete atsargiai nusiurbiamas virštinis sluoksnis, (kuriame yra DNR), perpilamas į kitus m÷gintuv÷lius, ir užpilamas tokiu pat kiekiu 99 proc. etilo spirito.
22. M÷gintuv÷liai sandariai uždengiami ir turinys išmaišomas vartant. M÷ginius galima palikti nakčiai –20oC temperatūroje.
23. Iškritusi DNR išimama kilpel÷s pagalba, perplaunama 70% spirite ir perkeliama į m÷gintuv÷lius, kuriuose yra po 100ml dejonizuoto H2O.
24. M÷gintuv÷liai paliekami nakčiai šaldytuve arba purtykl÷je, kad DNR visiškai ištirptų.
2.3.2. DNR švarumo ir koncentracijos nustatymas
Genomin÷s DNR kiekis ir grynumas nustatomas spektrofotometrinio metodo pagalba. Tam tikslui paruošiama 100µl skiestos DNR tirpalo: imama 10µl koncentruotos DNR ir skiedžiama 90µl distiliuotu vandeniu. DNR kiekis nustatomas išmatuojant skiesto tirpalo optinį tankį (OD) prie 260nm bangos ilgio. Kai OD = 1, tai 1ml tirpalo yra 50µg dvigrand÷s DNR.
DNR kokyb÷ įvertinama išmatavus skiesto tirpalo optinius tankius prie 260 ir 280nm bangos ilgių. Švarumą rodo santykis OD260/OD280. Švarių DNR tirpalų santykis yra 1.8-2.0.
Jei tirpale yra baltymų ar fenolio priemaišų, šis santykis bus mažesnis nei nurodyta. Baltymų koncentracija neturi viršyti 0.5mg/ml ribos. Jei tirpale priemaišų yra daugiau, reikia atlikti pakartotinį genomin÷s DNR valymą.
Šiuo metu laboratorijose naudojami spektrofotometrai iš karto nustato ir apskaičiuoja tiek DNR, tiek baltymų koncentraciją tirpale.
1. Paimti 4 m÷gintuv÷lius: į pirmus du m÷gintuv÷lius įpilti po 10 µl DNR tirpalo ir po 3 ml dist. H2O (skiedžiama 30 kartų), į kitus du - po 20 µl DNR tirpalo ir po 3 ml dist.
H2O (skiedžiama 150 kartų).
2. Tirpalus gerai išmaišyti maišykle.
3. M÷ginius matuoti spektrofotometru, prie 260 nm bangos ilgio (kontrolei naudoti dist. H2O).
M÷ginių optinį tankį nustatyti ir prie 280 nm bangos ilgio. Optinių tankių santykis 260 nm/280 nm rodo DNR tirpalų švarumą. Jis turi būti lygus arba didesnis už 1,8.
Žinant praskiestų DNR tirpalų optinio tankio reikšmes (esant 260 nm), DNR kiekis (µg/ml) apskaičiuojamas pagal formulę:
CDNRVg/ml = D 260 * 50 * Praskiedimas.
Šiuo metu laboratorijose naudojami spektrofotometrai iš karto nustato ir apskaičiuoja tiek DNR, tiek baltymų koncentracija tirpale.
Pilnas pavyzdys DNR koncentracijos matavimui turi sudaryti 100µl. Tam tikslui mikropipete paimame 10 µl išskirtos DNR ir 90µl dejonizuoto vandens (dd H2O). DNR ir
vanduo supilami į 0,5 ml m÷gintuv÷lius ir lengvai sumaišoma kratytuvo pagalba. Tirpalas trumpai nucentrifuguojamas 13 tūkst. aps./min. greičiu. Mikropipet÷s pagalba visas m÷gintuv÷lio turinys perkeliamas į spektrofotometro kiuvetę. Atliekamas DNR švarumo ir koncentracijos matavimas.
Atliekant genetinius tyrimus, naudojama DNR turi būti atitinkamos koncentracijos, švarumo, absorbcijos laipsnio. Tiriamoje DNR neturi būti baltymų, leistina norma - 0,1-0,5 mg/ml. Jei yra daugiau nei 0,5 mg/ml, tokia DNR tyrimams netinkama, nes negali normaliai vykti polimerazin÷ grandinin÷ reakcija, restrikcija, elektroforez÷, ir gaunami netikslūs rezultatai. DNR švarumas tiesiogiai priklauso nuo skyrimo metodikos, medžiagos, iš kurios ji buvo išskirta. DNR švarumą nusako ir absorbcijos laipsnis. Jei šis rodiklis yra virš 3AU, galima teigti, kad DNR yra nešvari, ir joje yra daug baltymų.
2.3.3. Polimerazin÷ grandinin÷ reakcija
4 lentel÷. Galvijų mikrosatelitai naudojami kilm÷s patikslinimui
Markeris Chromoso
ma
Pradin÷s sekos ( 5’ – 3’ )
BM 1824 ( 178-190 b.p. ) 1 P1:GAG CAA GGT GTT TTT CCA ATC
P2:CAT TCT CCA ACT GCT TCC TTG
BM 2113 ( 125-143 b.p.) 2 P1:GCT GCC TTC TAC CAA ATA CCC
P2:CTT CCT GAG AGA AGC AAC ACC
SPS 115 ( 240-262 b.p. ) 15 P1:AAA GTG ACA CAA CAG CTT CTC
P2:AAC GAG TGT CCT AGT TTG GCT
ETH 3 ( 117-129 b.p. ) 19 P1:GAA CCT GCC TCT CCT GCA TTG
P2:ACT CTG CCT GTG GCC AAG TAG
ETH 10 ( 210-226 b.p. ) 5 P1:GTT CAG GAC TGG CCC TGC TAA
P2:CCT CCA GCC CAC TTT CTC TTC
ETH 225 ( 140-156 b.p.) 9 P1:GAT CAC CTT GCC ACT ATT TCC
P2:ACA TGA CAG CCA GCT GCT ACT
TGLA122(130-164 b.p.) 21 P1:CCC TCC TCC AGG TAA ATC AGC
P2:AAT CAC ATG GCA AAT AAG TAC
TGLA126(109-127 b.p.) 20 P1:CTA ATT TAG AAT GAG AGA GGC
P2:TTG GTC TCT ATT CTC TGA ATA
TGLA227( 78-104 b.p.) 18 P1:CGA ATT CCA AAT CTG TTA ATT
P2:ACA GAC AGA AAC TCA ATG AAA
5 lentel÷. PGR komponentai ir ampilfikatoriaus r÷žimas
Komponentai 1 pavyzdžiui kiekis(µl) 10 pavyzdžiui kiekis (µl) StockMarks PCR buferis 3,0 33,0 dNTP mišinys 4,0 44,0 AmpliTaqGold DNR polimeraz÷ 0,5 5,5 Amplifikacijos pradmenų mišinys 5,5 60,5 Dionizuotas vanduo 1,0 11,0 1. Bendras kiekis 14,0 140,0
2. Gautas mišinys sumaišomas (maišykl÷s “Vortex” pagalba)
4. Po to į kiekvieną m÷gintuv÷lį, kuriame yra 14 µl mišinio, įpilama 1,0 µl DNR. Galutinis PCR kiekis supylus visus reagentus ir DNR turi būti 15 µl.
5. Viskas trumpai sumaišoma (maišykl÷s “Vortex” pagalba) 6. Pavyzdžiai trumpai nucentrifuguojami
7. Ir sudedami į termociklerį PCR programa: • 95°C 15 min. • 94°C 45 sek. • 61°C 45 sek. • 72°C 60 sek. • 72°C 60 min. • 25°C 2 val. • 4°C
8. Po amplifikacijos: PGR produktas praskiedžiamas 90 µl – 80 µl vandeniu
9. Po to į m÷gintuv÷lį pilama 1,0 µl praskiesto produkto, 11,5 µl DI formamido ir 0,5 µl GS Rox 500 dydžio standartas
10. Pavyzdžiai nucentrifuguojami
11. Pašildomi 2 min. 94°C termocikleryje
12. Dedama į ledo vonelę ir palaikoma, kol atšąla ( apie 3 min. ) 13. Po to pavyzdžiai sudedami į ABI PRISM 310 analizatorių.
2.3.4. Genotipavimas
Genotipavimas atliekamas 310 ABI analizatoriumi Genotyper programa, kuri identifikuoja mikrosatelitų alelių dydžius po jų užfiksavimo lazeriu kapiliare POP4 genotipavimo gelyje.
2.3.5. Statistin÷ duomenų analiz÷
Alelių, genotipų, homozigotų ir heterozigotų analiz÷ atlikta su statistiniu R – paketu (Gentlemen R. ir kt., 1997).
Genotipų dažnis p apskaičiuojamas pagal formulę: p=
N n
p – genotipų dažnis
n – atskiro genotipo individų skaičius
Alelių dažnis apskaičiuojamas pagal formulę 2) p= N n n 2 2 1+ 2 3) q= N n n 2 2 3 + 2
n1 ir n3 – homozigotinių individų skaičius
n2 - heterozigotinių individų skaičius
N - tirtų individų skaičius
Faktinis heterozigotiškumas apskaičiuojamas pagal formulę: ho=
N n2
ho – faktinis heterozigotiškumas
n2 - heterozigotinių individų skaičius
N - tirtų individų skaičius
Numatomas heterozigotiškumas apskaičiuojamas pagal formulę: he=1-(p2+q2) he – numatomas heterozigotiškumas
p ir q – alelių dažniai
3. TYRIMŲ REZULTATAI IR APTARIMAS
Tyrimai atlikti 142 galvijų grup÷je ( 27 karv÷s ir 115 bulių), kurie priklauso 12 veislių. Mūsų vertinamuose 11 mikrosatelitiniuose lokusuose buvo aptikta 236 skirtingi aleliai (6. lentel÷).
6 lentel÷. Tirtų galvijų mikrosatelitų dydžio minimalios ir maksimalios rastos ribos bazių poromis
Mikrosatelitas Minimalios ir
maksimalios dydžio ribos bp
Bendras skirtingų alelių sk. kiekviename lokuse TGLA 227 81bp -134 bp 23 BM 2113 116bp – 159bp 22 TGLA 53 147bp – 221bp 29 ETH 10 209bp – 241bp 16 SPS 115 236bp – 260bp 20 TGLA 126 109bp – 150bp 14 TGLA 122 136bp – 205bp 30 ETH 3 105bp – 143bp 26 INRA 23 107bp – 217bp 22 ETH 225 133bp – 161bp 20 BM 1824 177bp – 289bp 14 Viso 236
Mažiausias skirtingų alelių skaičius buvo aptiktas lokusuose TGLA 126 ir BM1824, didžiausias TGLA 122. TGLA 227 mikrosatelito alelių dydžiai įvairavo ribose nuo 81bp iki 134 bp.. Šiame lokuse buvo rasti 23 skirtingi aleliai. BM 2113 mikrosatelito alelių dydžiai įvairavo ribose nuo 116bp iki 159bp. Šiame lokuse buvo rasti 22 skirtingi aleliai. TGLA 53 mikrosatelito alelių dydžiai įvairavo ribose nuo 147bp iki 221bp. Šiame lokuse buvo rasti 29 skirtingi aleliai. ETH 10 mikrosatelito alelių dydžiai įvairavo ribose nuo 209bp iki 241bp. Šiame lokuse buvo rasti 16 skirtingi aleliai. SPS 115 mikrosatelito alelių dydžiai įvairavo ribose nuo 236bp iki 260bp. Šiame lokuse buvo rasti 20 skirtingi aleliai. TGLA 126 mikrosatelito alelių dydžiai įvairavo ribose nuo 109bp iki 150bp. Šiame lokuse buvo rasti 14 skirtingi aleliai. TGLA 122 mikrosatelito alelių dydžiai įvairavo ribose nuo 136bp iki 205bp. Šiame lokuse buvo rasti 30 skirtingi aleliai. ETH 3 mikrosatelito alelių dydžiai įvairavo ribose nuo 105bp iki 143bp. Šiame lokuse buvo rasti 26 skirtingi aleliai. INRA 23 mikrosatelito
alelių dydžiai įvairavo ribose nuo 107bp iki 217bp. Šiame lokuse buvo rasti 22 skirtingi aleliai. ETH 225 mikrosatelito alelių dydžiai įvairavo ribose nuo 133bp iki 161bp. Šiame lokuse buvo rasti 20 skirtingi aleliai. BM 1824 mikrosatelito alelių dydžiai įvairavo ribose nuo 177bp iki 289bp. Šiame lokuse buvo rasti 14 skirtingi aleliai. Iš viso buvo aptikta 236 skirtingi aleliai 11 mikrosatelitinių lokusų. (6 lentel÷).
DAŽNIS TGLA 227 0 20 40 60 80 100 120 140 160 1 24 47 70 93 116 139 162 185 208 231 254 277 alelių skaičius alelių dažnis
2 pav. Mikrosatelito TGLA 227 alelių pasiskirstymas tirtoje galvijų grup÷je.
DAŽNIS BM 2113 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 1 24 47 70 93 116 139 162 185 208 231 254 277 alelių skaičius alelių dažnis
DAŽNIS TGLA 53 0 50 100 150 200 250 1 24 47 70 93 116 139 162 185 208 231 254 277 alelių skaičius alelių dažnis
4 pav. Mikrosatelito TGLA 53 alelių pasiskirstymas tirtoje galvijų grup÷je.
DAŽNIS ETH 10 190 200 210 220 230 240 250 1 24 47 70 93 116 139 162 185 208 231 254 277 alelių skaičius alelių dažnis
DAŽNIS SPS 115 0 50 100 150 200 250 300 1 24 47 70 93 116 139 162 185 208 231 254 277 alelių skaičius alelių dažnis
6 pav. Mikrosatelito SPS 115 alelių pasiskirstymas tirtoje galvijų grup÷je.
DAŽNIS TGLA 126 0 20 40 60 80 100 120 140 160 1 24 47 70 93 116 139 162 185 208 231 254 277 alelių skaičius alelių dažnis
DAŽNIS TGLA 122 0 50 100 150 200 250 1 24 47 70 93 116 139 162 185 208 231 254 277 alelių skaičius alelių dažnis
8 pav. Mikrosatelito TGLA 122 alelių pasiskirstymas tirtoje galvijų grup÷je.
DAŽNIS INRA 23 0 50 100 150 200 250 1 24 47 70 93 116 139 162 185 208 231 254 277 alelių skaičius alelių dažnis
DAŽNIS ETH 3 0 20 40 60 80 100 120 140 160 1 24 47 70 93 116 139 162 185 208 231 254 277 alelių skaičius alelių dažnis
10 pav. Mikrosatelito ETH 3 alelių pasiskirstymas tirtoje galvijų grup÷je.
DAŽNIS ETH 225 120 125 130 135 140 145 150 155 160 165 1 24 47 70 93 116 139 162 185 208 231 254 277 alelių skaičius alelių dažnis
DAŽNIS BM 1824 0 50 100 150 200 250 1 24 47 70 93 116 139 162 185 208 231 254 277 alelių skaičius alelių dažnis
12 pav. Mikrosatelito BM 1824 alelių pasiskirstymas tirtoje galvijų grup÷je.
Faktiškai nustatytų alelių skaičiaus pasisikirstymo tarp veislių ir tarp lokusų duomenys pateikiami 7 lentel÷je.
7 lentel÷. Faktiškai aptiktų skirtingų alelių bendras skaičius ir jų pasiskirstymas kiekviename lokuse bei kiekvienoje veisl÷je
Veisl÷ Mikrosatelitas AN DŽ H HE LI LJ LŽ ŠA SI ŠŽ VJ VŽ TGLA 227 6 10 12 4 11 11 7 7 4 15 9 5 BM 2113 5 10 11 6 9 6 4 7 5 9 6 3 TGLA 53 5 12 11 4 9 8 6 6 6 6 7 4 ETH 10 4 7 6 5 10 6 7 5 4 5 5 3 SPS 115 4 8 8 6 13 5 6 8 5 5 5 3 TGLA 126 4 7 6 5 7 7 6 5 4 8 5 7 TGLA 122 6 10 15 7 8 14 5 6 6 7 11 3 INRA 23 5 10 13 5 13 9 7 8 5 9 8 2 ETH 3 5 10 8 4 8 9 6 5 6 10 8 3 ETH 225 4 14 11 5 8 7 7 4 4 10 7 4 BM 1824 3 7 9 4 7 6 5 6 5 8 6 5 Viso 51 105 110 55 103 88 66 67 54 92 77 42
Ištirtose 12 galvijų veislių faktinis aptiktų skirtingų alelių skaičius visuose 11 lokusų svyravo nuo 42 (VŽ) iki 110 (H). Didžiausias skirtingų alelių skaičius – 15 - buvo nustatytas TGLA 122 lokuse. Holšteinų veisl÷je ir TGLA227 lokuse Švedijos žalmargių veisl÷je. Mažiausias skirtingų alelių skaičius - 2 - rastas INRA23 lokuse Vokiečių žalųjų veisl÷je.
8 lentel÷. Dominuojančių skirtingų alelių bendras skaičius ir jų pasiskirstymas kiekviename lokuse bei kiekvienoje veisl÷je.
Dominuojantys aleliai bp Mikrosatelitas AN DŽ H HE LI LJ LŽ ŠA SI ŠŽ VJ VŽ TGLA 227 81 83 97 91 81 99 81 93 79 82 99 75 99 91 99 83 89 85 95 91 97 BM 2113 136 136 125 132 132 132 136 130 122 123 132 130 135 138 TGLA 53 157 157 157 149 163 157 157 157 157 157 155 157 159 164 163 165 167 169 172 ETH 10 215 215 219 213 215 215 215 215 213 215 215 215 219 217 221 SPS 115 248 250 248 253 242 242 242 242 241 242 242 242 257 250 260 254 TGLA 126 117 117 117 215 117 117 117 117 115 117 117 117 125 217 121 119 117 219 125 TGLA 122 140 140 143 138 150 150 150 150 140 150 140 140 142 150 142 150 143 178 148 152 154 INRA 23 207 205 214 205 207 205 211 205 211 211 203 211 211 207 213 ETH 3 113 113 117 115 117 113 113 113 113 121 113 113 117 121 125 129 133 ETH 225 145 147 148 141 143 143 139 143 143 137 141 141
BM 1824 138 179 179 181 189 183 183 179 188 179 189 179
188 183
Viso 15 14 13 16 14 11 15 17 29 15 11 13
Dominuojančių alelių skaičius dažnai labai įvairavo tiek lokusų tiek veislių atžvilgiu, iš 11 ištirtų mikrosatelitinių lokusų viso buvo nustatyti 183 duominuojantys aleliai. Kai kuriuose veisl÷se skirtinguose lokusuose buvo aptikta netgi po kelis dominuojančius alelius. Daugiausia dominuojančių alelių yra SI galvijų veisl÷je net 29, bet šių gyvulių ištirtų yra vienas iš mažiausiai. Mažiausiai dominuojančių alelių LJ ir VJ galvijų veisl÷se po 11. Dominuojančių alelių skaičius kiekviename lokuse bei veisl÷je pateikiama priedų 1 Priede.
TGLA 227 lokuse iš 12 veislių duominuojančių buvo 21 alelis, iš jų dažniausiai dominavo 99bp alelis, kuris buvo aptiktas keturiose dominuojančiose veisl÷se, ir jo dažnis svyravo nuo 0.3 (AN veisl÷je) iki 0.328 (LJ veisl÷je). BM 2113 lokuse iš 12 veislių dominuojančių alelių buvo 14 iš kurių keturiose veisl÷se dominavo 132bp alelis, kurio dažnis svyravo nuo 0.222 (LI veisl÷je) iki 0.416 (VJ veisl÷je) dažniu. TGLA 53 lokuse dominuojantis alelis buvo 157bp, jis iš 12 veislių buvo aptiktas net 9 veisl÷se kaip dominuojantis alelis, jo dažnis svyravo nuo 0.166 (H ir SI veisl÷je) iki 0.6 (VŽ veisl÷je). ETH 10 lokuse deviniuose veisl÷se dominuojantis alelis buvo 215bp, šio alelio dažnis svyravo nuo 0.166 (LI veisl÷je) iki 0.5 (AN, ŠŽ, VŽ veisl÷se). SPS 115 lokuse septyniose iš dvylikos veislių dominuojantis alelis buvo 242bp, jų dažnis svyravo nuo 0.166 (LI veisl÷je) iki 0.578 (LJ veisl÷je). TGLA 126 lokuse vienuolikoje veislių dominuojantis alelis buvo 117bp ir jo dažnis svyravo nuo 0.128 (H veisl÷je) iki 0.625 (AN veisl÷je). TGLA 122 lokuse iš dvylikos veislių duominuojančių buvo 21 alelis, septyniose dominavo 150bp alelis, kurio dažnis svyravo nuo 0.2 (AN veisl÷je) iki 0.444 (LŽ veisl÷je). INRA 23 lokuse penkiose veisl÷se dominuojantis alelis 211bp, jo dažnis lokuse svyruoja nuo 0.25 (DŽ veisl÷j÷) iki 0.75 (VŽ veisl÷je). ETH 3 lokuse aštuoniuose veisl÷se dominuojantis alelis 113bp, o jo dažnis svyravo nuo 0.116 (SI veisl÷je) iki 0.461 (VJ veisl÷je). ETH 225 lokuse yra mažiausiai iš visų veislių dominuojančių alelių tik 12, o labiausiai dominuojantis alelis šiame lokuse yra 143bp kurio dažnis dominuojančiame lokuse svyruoja nuo 0.277 (LJ veisl÷je) iki 0.5 (ŠA, SI veisl÷se) . BM 1824 lokuse penkiose veisl÷se dominavo 179bp alelis, kurio dažnis svyravo šiame lokuse nuo 0.416 (DŽ veisl÷je) iki 0.312 (ŠA veisl÷je).
9 lentel÷. Retų aptiktų alelių skaičius ir jų pasiskirstymas kiekviename lokuse bei kiekvienoje veisl÷je.
Retų alelių skaičius veisl÷se Mikrosatelitas AN DŽ H HE LI LJ LŽ ŠA SI ŠŽ VJ VŽ TGLA 227 2 5 4 7 2 BM 2113 3 3 3 1 TGLA 53 5 2 3 3 1 ETH 10 2 2 1 1 SPS 115 2 2 2 1 TGLA 126 1 2 3 1 1 TGLA 122 6 8 5 4 5 INRA 23 5 5 2 4 2 ETH 3 4 3 4 3 3 ETH 225 5 2 3 3 2 BM 1824 3 1 2 2 VISO 35 37 26 33 20
Reti aleliai yra tokie aleliai, kurie sutinkami populiacijoje mažesniu nei 0,05 dažniu (1.Priedas). Iš tirtų 12 galvijų veislių retus alelius radome tik 5 veisl÷se. Mažiausia retų alelių rasta Vokiečių juodmargių veil÷s -20, daugiausia Holšteinų veisl÷je -37. Didžiausias retų alelių kiekis rastas Holšteinų veisl÷je TGLA122 mikrosatelite -8, mažiausias -1 alelis DŽ veisl÷je TGLA126 mkrosatelite. LJ veisl÷je ETH 10 ir BM 1824 mikrosatelituose, ŠŽ veisl÷je ETH 10 mikrosatelite ir VJ veisl÷je BM 2113, TGLA 53, SPS 115, TGLA 126 mikrosatelituose buvo aptikta po vieną retą alelį.
10 lentel÷. Aptikti unikalūs aleliai bp ir jų pasiskirstymas kiekviename lokuse bei kiekvienoje veisl÷je. Unikalių alelių bp Mikrosatelitas AN DŽ H HE LI LJ LŽ ŠA SI ŠŽ VJ VŽ TGLA 227 107 101 78 132 105 74 103 134 82 BM 2113 141 120 139 159 118 140 TGLA 53 179 153 176 152 164 158 147 173 184 219 169 186 221 ETH 10 123 125 241 122 120
243 SPS 115 244 255 257 215 236 219 245 TGLA 126 215 150 129 111 217 219 TGLA 122 178 149 205 167 141 159 174 163 184 173 183 INRA 23 210 113 107 215 212 115 217 ETH 3 109 114 107 118 124 122 137 133 143 ETH 225 153 152 134 159 138 BM 1824 190 184 185 Viso 5 10 16 4 18 3 1 3 6 11 4 1
Unikalių alelių radome visose dvylikoje tirtų veislių. Mažiausiai unikalių alelių po 1 buvo rasta LŽ veisl÷je ETH 10 lokuse ir VŽ veisl÷je TGLA 53 lokuse. Daugiausiai unikalių alelių buvo aptikta LI galvijų veisl÷je – 18. Didžiausias unikalių alelių kiekis rastas Holšteinų veisl÷je 5 – TGLA 122 lokusuose. AN veisl÷je unikalių alelių nebuvo aptikta ETH 10, TGLA 126, INRA 23, ETH 3, ETH 225, BM 1824 lokusuose. DŽ veisl÷je unikalių alelių nebuvo aptikta TGLA 126, TGLA 122, INRA 23, BM 1824 lokusuose. H veisl÷je unikalaus alelio nebuvo aptikta tik TGLA 126 lokuse. HE veisl÷je unikalaus aleliai nebuvo aptikta TGLA 227, BM 2113, TGLA 53, ETH 10, TGLA 122, INRA 23, ETH 3, ETH 225 ir BM 1824 lokusuose. LI veisl÷je unikalių alelių neaptikta TGLA 126, ETH 225, BM 1824 lokusuose. LJ veisl÷je unikalių alelių neaptikta TGLA 227, BM 2113, TGLA 53, ETH 10, SPS 115, TGLA 126, ETH 225, BM 1824. ŠA veisl÷je unikalių alelių nebuvo aptikta BM 2113, TGLA 53, SPS 115, TGLA 126, TGLA 122, ETH 3, ETH 225 ir BM 1824 lokusuose. SI veisl÷je unikalių alelių neaptikta TGLA 227, BM 2113, ETH 10, SPS 115, TGLA 122, ETH 225, BM 1824 lokusuose. ŠŽ veisl÷je unikalių alelių nebuvo aptikta TGLA 53, ETH 10, TGLA 122, INRA 23 lokusuose. VJ veisl÷je unikalių alelių nebuvo rasta TGLA 227, BM 2113, ETH 10, SPS 115, TGLA 126, INRA 126, INRA 23, ETH 3, ETH 225, BM 1824 lokusuose.
Norint mikrosatelitus pritaikyti kilm÷s tyrimui evoliucijos pagrindu būtina žinoti tikslią informaciją apie genetin÷s įvairov÷s kiekį skirtingose veisl÷se. Tod÷l šiame darbe mes ištyr÷me galvijų kilm÷s patikslinimui naudojamų 11 mikrosatelitų genetinę įvairovę Lietuvos veislinių galvijų tarpe – bulių ir rinktinių karvių, kurie priklaus÷ skirtingoms veisl÷ms.
Visos dvylika vertinamų galvijų veislių parod÷ panašų viduveislin÷s įvairov÷s lygį. Aptiktų skirtingų alelių skaičius visose veisl÷se buvo panašus. Kadangi unikalūs genai veisl÷se buvo atrasti labai mažu dažniu, galima sp÷ti, jog šie genai buvo paplitę veisl÷je heterozigotin÷je būkl÷je ir nebuvo selekcijos d÷ka eliminuoti iš veislių. Jeigu unikalūs aleliai būtų aptikti dideliu dažniu, gal÷tų būti panaudoti kaip veislę charakterizuojantis markeris. Didelis aptiktų retų alelių skaičius visose veisl÷se gal÷tų būti genų dreifas ar migracija iš populiacijos į populiaciją. Palyginus mūsų gautus duomenis su literatūros duomenmis, gauti panašūs tyrimų rezultatai (Machugh et. al., 1994; Bredbacka and Koskinen, 1998; Martin-Burriel et. al., 1999; Edwards et. al., 2000; Grigaliūnait÷ ir kt., 2004).
Paprastai reti aleliai didel÷se populiacijose atsiranda atsitiktinių mutacijų d÷ka ir paplinta jose heterozigotiniam pavidale. Mažose populiacijose retos alel÷s paplinta d÷l galimo poravimosi tarp giminingų individų, arba kryžminant tokių veislių galvijus su kitomis, kurios atsitiktinai perduoda tokius genus. Retų genų paplitimo veisl÷je intensyvumas priklauso pirmiausiai nuo lokuso, kuriame yra tas genas, polimorfiškumo. Jeigu lokusas yra labai polimorfiškas, retas genas turi mažą tikimybę sudaryti homozigotinį genotipą, o tuo pačiu mažesnę tikimybę būti perduotam palikuonims (Eding and Laval, 1999; Malevičiūt÷ J, 2003).
Dar viena retų alelių atsiradimo priežastis - tai genetin÷s įvairov÷s sumaž÷jimas, kurios pas÷koje genai, laikui b÷gant, ima nykti iš populiacijos, tod÷l aptinkami labai mažu dažniu. Toks reiškinys pastebimas tada, kai per trumpą laiką stipriai sumaž÷ja efektyvus populiacijos dydis, gyvuliai yra laikomi labai skirtingose vietose bei likę individai yra poruojami su kitų veislių individais. V÷liau, tokius gyvulius ar jų palikuonis laikant vienoje bandoje, fenotipiškai jie lieka panašūs, tačiau savo genotipe turi labai skirtingus genus (Eding and Laval, 1999;Malevičiūt÷, 2003).
4. IŠVADOS
• Tirtuose TGLA 227, BM 2113, TGLA 53, ETH 10, SPS 115, TGLA 126, TGLA 122, INRA 23, ETH 3, ETH 225, BM 1824 galvijų mikrosatelitiniuose lokusuose buvo aptikta 236 skirtingi aleliai.
• Mažiausias skirtingų alelių skaičius buvo aptiktas lokusuose TGLA 126 ir BM1824 (14) , didžiausias TGLA 122 (30).
• Mikrosatelitų alelių dydžiai įvairavo ribose nuo 81bp iki 289 bp.
• Ištirtose 12 galvijų veislių faktinis aptiktų skirtingų alelių skaičius visuose 11 mikrosatelitų svyravo nuo 42 Vokiečių žalųjų veisl÷je iki 110 Holšteinų veisl÷je.
• Dominuojančių alelių skaičius įvairavo tiek mikrosatelitų lokusų tiek veislių atžvilgiu. Iš 11 ištirtų mikrosatelitinių lokusų viso buvo nustatyti 183 duominuojantys aleliai.
• Retus alelius, sutinkamus populiacijoje mažesniu nei 0,05 dažniu, radome tik 5 veisl÷se. Didžiausias retų alelių kiekis rastas Holšteinų veisl÷je TGLA122 mikrosatelite -8.
• Unikalius alelius, kurie būdingi tik vienai iš tirtų veislių, radome visose veisl÷se ribose nuo 1 iki 18 Didžiausias unikalių alelių kiekis rastas Limuzinų veisl÷je -8 ir TGLA 53 mikrosatelito lokuse – 7.
• Visi 11 mikrosatelitų visose tirtose veisl÷se rasti labai polimorfiški, t.y. turintys daug alelių, tod÷l tinkami kaip žymenys galvijų kilm÷s patikslinimui.
5. SUMMARY
Master's work.Master: Kristina Amšiejūt÷.
Topic of Master degree thesis: Evaluation of cattle genetic types by molecular methods.
Tutor: Lina Baltr÷nait÷.
Lithuanian Veterinary Academy, Department of Animal Breeding and Genetics, K. Janušauskas Laboratory of Animal Genetics.
Master‘s work accomplished in the year 2007 – 2009, volume of Master work 53 pages original, 10 tables and 12 pictures.
Object and tasks of work.
Object- Investigation the genetic polymorphism of microsatellites, that are used for cattle parentage verification.
Task- to learn DNA extraction methods from blood, semen, hair roots; to learn parentage verification method by DNA analysis on ABI 310 capillary equipment; to investigate polymorphism of TGLA 227, BM 2113, TGLA 53, ETH 10, SPS 115, TGLA 126, TGLA 122, INRA 23, ETH 3, ETH 225, BM 1824 microsatellites, allelic frequencies and distribution in tested cattle group as well as between the breeds.
Research methodology. DNA extraction from hair roots; PGR to amplify microsatellites, genotyping by ABI 310; statistical analysis of data.
Results and conclusions. 236 different alleles were found in tested TGLA 227, BM 2113, TGLA 53, ETH 10, SPS 115, TGLA 126, TGLA 122, INRA 23, ETH 3, ETH 225, BM 1824 cattle microsatellites.The lowest number of different alleles were found in locuses TGLA 126 and BM1824 (14) , the largest in TGLA 12 (30). The microsatellites size ranged from 81 bp to 289 bp. The number of different alleles in all 11 tested microsatellites ranged from 42 in German Red breed to 110 in Holstein breed. The number of dominat alleles varied between microsatellites and between breeds. In total 183 dominat alleles were found in 11 tested microsatellites. Rare alelles that are found in population in less than 0,05 frequency were found only in 5 tested breeds. The largest number of rare alleles was found in Holstein breed TGLA122 microsatellite. Unique alleles that are specific to breed were found in all tested breeds ranging from 1 to 18. The largest number of unique allelles was found in Limusin breed – 8 and in TGLA 53 microsatellite -7. All 11 tested microsatellites were found very polymorphic - having a lot of alleles- therefore suitable for parentage verification.
6. LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Ashwell M.S., Rexroad C.E., Miller R.H. and VanRaden P.M. Mapping economic trait loci for somatic cell score in Holstein cattle using microsatellite markers and selective genotyping. Animal Genetics.1996. 27 235 – 242.
2. Bendixen C. Usefullness of microsatellites from the ISAG comparison test for parentage control in Danish Black – and White cattle. Department of Breeding and Genetics, Danish Institute of Animal Science, Research Centre Foulum, Denmark. 1992.
3. Bishop M. D. and Kappes S. M. et al. A genetic linkage map for cattle. Genetics. 1994. 136 619-639.
4. Boveinien÷ B., Jatkauskien÷ V., Juras R. „Gyvūnų kilm÷s patikrinimas – dabartis ir perspektyvos“ Lietuvos gyvulininkyst÷s institutas. Baisiogala. 2001, 43 psl.
5. Bredbacka P., Koskinen M.T. Polymorphism of microsatellite loci used in parentage testing in Finnish Ayrshire and Holstein populations . Animal Genetics. 1998. 29: 10 – 23.
6. Bruford M., Cheesman D., Coote T., Green H., Haines S., O’Ryan C. and Williams T. Microsatellites and their application to conservation in genetics. In: Molecular Genetic Approaches. In Conservation. (Eds. Smith T.B. and Wayne R.K.) Oxford University Press 1996. P. 287 – 297.
7. Bruford M.W. and Wayne R.K. Microsatellites and their application to population genetic studies. Current Opinion in Genetics and Development. 1993. 3: 939 – 934. 8. Eding J.H. and Laval G. Measuring genetic uniqueness in livestock. In Genebanks and
the conservation of farm animal genetic resources (Oldenbroek J.K ed.). ID-DLO, The Netherlands. 1999. P. 35 – 58.
9. Edwards C.J., and Dolf G., Looftus R.T. and Bradly D.G. Relationship between the endangered Pustertaler-Sprinzen and three related European cattle breeds as analysed with 20 microsatellite loci. Animal Genetics. 2000. 31: 329 – 332.
10.Erlich H.A. PCR Technology: Principles and applications for DNR amplification. Stocton Preess, New York, USA. 1990.
11.Georges M., Lathrop M., Bouquet Y et al. Linkage relationships among 20 genetic markers in cattle. Evidence for linkage between two pairs of blood group systems: B-Z and S-F/V respectively. Animal Genetics. 1990. 21 95-105.
12. Georges M., Swillens S., Bouquet Y., Leguarre A. S and Hanset R. Genetic linkage between the bovine plasma protease inhibitor Z (Pi-Z) and S blood group loci. Animal
