LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
VETERINARIJOS FAKULTETAS VETERINARINöS MEDICINOS PROGRAMA
UŽKREČIAMŲJŲ LIGŲ KATEDRA
AUDRONö REKEŠIŪTö
GALVIJŲ ŪKIUOSE PAPLITUSIŲ CAMPYLOBACTER
JEJUNI GENETINöS ĮVAIROVöS PALYGINIMAS
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovas: Doc. dr. Alvydas Malakauskas
2 PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas
Galvijų ūkiuose paplitusių Campylobacter jejuni genetin÷s įvairov÷s palyginimas 1. Yra atliktas mano paties/pačios;
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje;
3. Nenaudojau šaltinių, kurie n÷ra nurodyti darbe, ir pateikiu visą panaudotos literatūros sąrašą.
2013-01-25 Audron÷ Rekešiūt÷
(data) (parašas) (autoriaus vardas, pavard÷)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
2013-01-25 Audron÷ Rekešiūt÷
(data) (parašas) (autoriaus vardas, pavard÷)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADOS DöL DARBO GYNIMO
2013-01-25 Alvydas Malakauskas
(data) (parašas) (autoriaus vardas, pavard÷)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE
(aprobacijos data) (parašas) (Gynimo komisijos sekretor÷s/riaus vardas, pavard÷)
Magistro baigiamasis darbas yra patalpintas į ETD IS
(gynimo komisijos sekretor÷s/riaus parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentas
(vardas, pavard÷) (gynimo komisijos sekretor÷s/riaus parašas)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
3
Turinys
SANTRUMPOS ... 4
SUMMARY ... 5
ĮVADAS... 6
1.1.KAMPILOBAKTERIOZĖ IR JOS SUKĖLĖJAI... 8
1.2.PAPLITIMAS TARP GALVIJŲ... 10
1.3.KAMPILOBAKTERIJŲ IDENTIFIKAVIMAS... 11 1.3.1.FLAAGENOGENOTIPAVIMAS ... 11 1.3.2.PFGEMETODAS ... 12 1.3.3.RIBOSOMŲGENOTIPAVIMAS... 13 1.3.4.RAPDANALIZĖ ... 13 1.3.5.AFLPANALIZĖ ... 14 1.3.6.DAUGINĖPGR-RFLPANALIZĖ ... 14
1.3.7.NUKLEOTIDŲSEKOSNUSTATYMAS... 15
1.3.8.MLSTMETODAS ... 15
1.4.GALVIJŲ C. JEJUNI GENETINĖ ĮVAIROVĖ... 17
2. TYRIMO METODIKA IR ORGANIZAVIMAS ... 19
2.1.TYRIMO OBJEKTAS... 19
2.2.FLAA GENO AMPLIFIKAVIMAS... 19
2.3.AMPLIFIKUOTŲ PRODUKTŲ APTIKIMAS AGAROZĖS GELYJE... 19
2.4.FLAA GENO KIRPIMAS DDEI(HPYF31)... 21
2.5.FLAA FRAGMENTŲ APTIKIMAS AGAROZĖS GELYJE... 21
3. TYRIMO REZULTATAI... 23
3.1.C. JEJUNI PAPLITIMAS SKIRTINGUOSE GALVIJŲ ŪKIUOSE... 23
3.2.C. JEJUNI GENETINĖ ĮVAIROVĖ... 24
4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 29
IŠVADOS... 31
4
Santrumpos
AFLP – amplifikuotų fragmentų ilgio polimorfizmas
bp – bazių poros
CC – klounų kompleksas
DNR – deoksiribonukleorūgštis
kb - kilobazių poros
MEE- Daugin÷ fermentų elektroforez÷
MLST – daugybin÷s sekos tipavimas
PFGE – pulsuojančio-lauko gelio elektroforez÷
PGR – polimeraz÷s grandinin÷ reakcija
RAPD – atsitiktiniai amplifikuoti polimorfiniai DNR
RFLP – restrikcijos fragmentų ilgio polimorfizmas
rRNR – ribosomin÷ ribonukleorūgštis
ST – sekos tipai
5
SUMMARY
Audron÷ Rekešiūt÷
Comparison of Campylobacter jejuni genetic diversity in cattle farms Master thesis
Work instructor: Doc.dr. Alvydas Malakauskas
Lithuanian Veterinary Academy
Faculty of Veterinary Medicine
Department of Infectious Diseases
Kaunas, 2013
The coverage of the work 36 pages, 3 pictures, 5 tables and 2 diagrams.
The present study was designed to determine prevalence and strain genetic diversity of Campylobacter jejuni in bovine. Samples were collected from three different farms and from different ages groups animals – calves, young cattle and cows.
From 91 of C. jejuni positive samples, 49 isolates were genotyped by flaA PCR-RFLP.
Our findings showed that in 49 isolates are 19 different genotypes. Also more then twice prevalence are finding in calves and young cattle, then in cows. But in older animals we found more various genotypes, then in youngs.
Genotypes I and III were dominant with numbers of isolates. Three genotypes, III, VI and XVII were prevalent among all farms.
Campylobacters, like most zoonosis pathogens can mirgate between hosts and because of this reason differentiate strains are difficult. So why knowledge about genetic prevalence, spread dinamic between cattle and inside of farms in different age groups animals are important for understanding these microorganisms ecology and for applying better controls methods.
And most effective pattern of reducing humans infection are decrease prevalence of C. jejuni in cattle farms.
6
Įvadas
Kampilobakterijos lieka labai svarbiu zoonoz÷s suk÷l÷ju visame pasaulyje, kiekvienais metais infekuodamos maždaug apie 1% Vakarų Europos gyventojų (Humphrey ir kt., 2007). Dominuojanti ir dažniausiai iš žmonių išskirta rūšis yra C. jejuni, kuri sudaro 80-90% visų pranešamų kampilobakterioz÷s atvejų (Ragimbeau ir kt., 2008). Ligos protrūkiai pasitaiko retai, bet sporadiniai atvejai yra dažni, o infekcijos šaltiniai taip ir lieka neišaiškinti (Kwan, P.S.L., Birtles, A ir kt., 2008).
Campylobacter jejuni yra viena iš svarbiausių maisto saugos problemų ne tik Europos, bet ir besivystančiose pasaulio šalyse. 2008 metais iš 27 Europos sąjungos valstybių buvo gauti ir patvirtinti duomenys, apie žmonių kampilobakterioz÷s susirgimus, kurių skaičius siek÷ net 190 566 klinikinius atvejus, tai yra 40,7 susirgimai 100 000 žmonių populiacijai (Anoniminis, 2010). Tačiau skirtingose šalyse šie skaičiai skiriasi, pavyzdžiui, Norvegijoje užregistruoti 2 681 susirgimo atvejai per 2010 metus ir tai yra 55,1/100 000 (susirgimai/gyventojų skaičiui) (Mexia, 2011), tuo tarpu Jungtin÷se Amerikos Valstijose 2009 metais užregistruota 13,0/100 000 susirgimų (Weisent ir kt., 2011).
C. jejuni yra plačiai paplitusi aplinkoje, o rasta pas gyvūnus yra tipiška komensal÷ (Boer ir kt., 2002). Dažniausiai C. jejuni bakterija kolonizuoja tuščiąją, klubinę ir gaubiančiąją žarnas (Pond, 2005). Lyginant su kitais enteroorganizmais, kampilobakterijų išlikimo mechanizmas yra mažiau žinomas bei apsauginių streso reguliatorių, kaip dauguma kitų patogenų, jos neturi (Anoniminis, 2010). Mikro- ir makroorganizmo ryšio visuma nulemia ūmios ligos baigtį, o po ūminių žarnyno infekcijų gali vystytis įvairūs susirgimai (Narkevičiūt÷ ir kt., 2002).
Kaip ir daugumai kitų žarnyno patogenų, pagrindiniai užsikr÷timo keliai yra perdavimas per
užterštą maistą ar vandenį bei fekalinis – oralinis
(http://www.merckvetmanual.com/mvm/index.jsp?cfile=htm/bc/20700.htm&word=campylobacter iosis). Manoma, jog užkr÷stų ar nepakankamai termiškai apdorotų maisto produktų vartojimas yra
pagrindinis infekcijos plitimo kelias
(http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs255/en/index.html).
Naminiai paukščiai ir jų produktai dažniausiai laikomi pagrindiniu žmonių
kampilobakterioz÷s užsikr÷timo šaltiniu, bet neatmetama jog egzistuoja ir kiti galimi svarbūs užsikr÷timo keliai (Hannon ir kt., 2008).
Atrajotojai bakterijas nuolat išskiria į aplinką, kur jos tiesiogiai ar netiesiogiai veikia kaip galimas žmogaus infekcijos šaltinis (Sproston ir kt., 2011). Atlikti individualūs kampilobakterijų
7 paplitimo (teigiamų Campylobacter gyvūnų procentas vienoje bandoje) tarp galvijų tyrimai pateikia, jog užsikr÷timo skaičius galvijų bandose gali svyruoti nuo 1,6% iki 89%, kur C. jejuni dažniausiai išskiriama nuo 55,4% iki 100% (Sproston irk t., 2011). Taip pat, skirtingų tyrimų metu įrodyta, jog pas galvijus dažniausiai pasitaikantys ir dominuojantys klonų kompleksai yra ST-45 (French ir kt., 2005), ST-21, ST-61,( French ir kt., 2005; Rotariu ir kt., 2009; Sproston ir kt., 2011), ST-42 (Rotariu ir kt., 2009; Sproston irk t., 2011) ir ST-48 (Sproston ir kt., 2011).
Naudojant molekulinius biologijos metodus buvo nustatytas panašumas tarp galvijų ir žmonių kampilobakterijų izoliatų (Hannon ir kt., 2008). Didelis skaičius galvijų platinamų kampilobakterijų ir su galvijais susijusių padermių aptikimas pas žmones parodo, kad kampilobakterijos taip pat gali būti perduodamos nuo galvijų žmogui ir gali sukelti susirgimus (Ross, 2006). Tod÷l teigiama, jog galvijai taip pat vaidina svarbų vaidmenį kampilobakterioz÷s epidemiologijoje. Be to, galvijų paderm÷s gali užkr÷sti naminius paukščius, o tai rodo, jog galvijai gali būti potencialus rezervuaras tiek paukščių, tiek žmonių susirgimams (Hannon ir kt., 2008).
Tod÷l žinios apie C. jejuni genotipų paplitimą, jų paplitimo dinamiką tarp skirtingų galvijų ūkių ir taip pat ūkio viduje tarp skirtingo amžiaus galvijų yra svarbios siekiant suprasti šių mikroorganizmų ekologiją ir pritaikyti geresnius kontrol÷s metodus.
Darbo tikslas: Ištirti Campylobacter jejuni genetinę įvairovę galvijų ūkiuose Lietuvoje
Darbo uždaviniai:
Ištirti C. jejuni genotipų įvairovę skirtinguose Lietuvos galvijų ūkiuose Nustatyti C. jejuni genetinę įvairovę skirtingo amžiaus galvijų tarpe
8
1. Literatūros apžvalga
1.1. Kampilobakteriozė ir jos sukėlėjai
Kampilobakterijų sukeliamas susirgimas dar vadinamas kampilobakterioze.
Kampilobakterioz÷ yra zoonoz÷ – kuri gali būti tiesioginiai ar netiesioginiai perduodama gyvulių ir žmonių (www.efsa.europa.eu).
Kampilobakterioz÷ – žmonių ir gyvūnų infekcin÷ liga, kurią sukelia Campylobacter rūšiai priklausanti bakterija (http://www.nmvrvi.lt/lt/zoonozes/kampilobakterioze/). 1991 metais buvo pasiūlyta persvarstyti Campylobacter genties taksonomija ir nomenklatūrą (OIE Terrestrial Manual, 2009). Campylobacter gentį sudaro 17 rūšių ir 6 porūšiai, ir dažniausiai pranešama, jog susirgimus žmon÷ms sukelia C. jejuni bei C. coli. Kitos rūšys kaip C. lari ir C. upsaliensis taip pat išskiriamos iš diar÷ja sergančių pacientų, bet sutinkamos žymiai rečiau (www.who.int)
Tai termofilin÷ (OIE Terrestrial Manual, 2009), gramneigiama, spiral÷s formos, (www.nmvrvi.lt), sporų neformuojanti, oksidazei teigiama, turinti žiuželį viename (monotrichin÷) arba abiejuose (amfitrichin÷) poliuose, judri bakterija (WHO ir t., 2009).
Tinkamiausios sąlygos kampilobakterijoms daugintis yra tuomet, kai deguonies koncentracija aplinkoje sudaro 3-5 proc., o anglies dvideginio – 2-10 proc. Bakterijos yra neatsparios džiovinimui, kaitinimui, šaldymui, dezinfekantams, jų augimą slopina rūgštin÷ terp÷, žūva ten, kur yra pakankamas deguonies kiekis (www.nmvrvi.lt). Nustatyta, jog C.jejuni gamina enterotoksiną, kuris yra panašus į choleros (WHO ir t., 2005).
1 pav. Skenuojančiu mikroskopu daryta C. jejuni nuotrauka (http://en.wikipedia.org)
Pagrindinis patogenin÷s Campylobacter jejuni rezervuaras yra žmonių (Blaser, 1997), laukinių ir naminių žinduolių bei paukščių virškinamasis traktas (WHO ir t., 2009), kuriame kampilobakterioz÷s suk÷l÷jai gali gyventi ir daugintis (www.nmvrvi.lt). Kampilobakterijos dažniausiai randamos pas broilerius, galvijus, kiaules, avis, laukinius gyvūnus, paukščius, šunis, kates (WHO ir t., 2009).
9 Buvo įrodyta, jog kliniškai sveikų galvijų virškinamasis traktas yra rezervuaras daugeliui Campylobacter spp. rūšių, kur enteropatogenin÷s paderm÷s gali būti paplitusios nuo 0-80% (Moore ir kt., 2005).
Galvijų ir avių žarnyne dažniausiai kolonizuojasi C. jejuni, C. coli, C. hyointestinalis ir C. fetus. Pas jaunus gyvulius randamų bakterijų skaičius yra daug didesnis, nei pas vyresnius (OIE Terrestrial Manual. 2009). Kampilobakterijos į aplinką patenka su gyvūnų išmatomis.
Dažniausiai kampilobakterijomis galima užsikr÷sti, vartojant žalią arba nepakankamai termiškai apdorotą m÷są, ypač paukštieną ir jos produktus (www.nmvrvi.lt), nepasterizuotą pieną (C. jejuni karvių piene gali išgyventi nuo 2 iki 5 savaičių, laikant jį 4°C temperatūroje ir tai akcentuoja žalio pieno pasterizavimo būtinumo svarbą (Ross, 2006)), kampilobakterijomis užterštą vandenį (www.nmvrvi.lt), žuvį ir jos produktus, šviežias daržoves bei kai kuriuos tiesioginiam vartojimui skirtus ir jau supakuotus produktus, kaip pavyzdžiui, nerūkytas kumpis, daržovių rinkiniai salotoms (Hazard identification ir t., 2001).
Kampilobakterioze galima užsikr÷sti kontakto būdu nuo sergančių (www.nmvrvi.lt), atlikti tyrimai parod÷, jog sveiki šuniukai ir kačiukai, graužikai, vabalai ir mus÷s taip pat gal būti kampilobakterijų nešiotojai (WHO ir t.t., 2009).
Bo to, C. jejuni infekcija yra daug labiau paplitusi besivystančiose nei išsivysčiusiose pasaulio valstyb÷se (Blaser, 1997).
Campylobacter jejuni ir Campylobacter coli nesukelia klinikin÷s ligos suaugusiems gyvuliams, išskyrus pavieniais atvejais - atrajotojams abortą ir labai retai hepatitą stručiams. Didelis skaičius kampilobakterijų buvo išskirtas iš sergančių enteritu jaunų gyvulių (veršelių, paršelių, ÷riukų) žarnyno, bet bakterijos randamos ir sveikų gyvulių organizme (OIE Terrestrial Manual. 2009).
Dažniausiai sunkus viduriavimas pasireiškia jauniems gyvūnams. Tipiški
kampilobakterioz÷s simptomai būna: žarnų gleivin÷s pažeidimai, vandeningas ir/ar su tulžimi (su arba be kraujo) viduriavimas, kuris gali trukti nuo 3 iki 7 dienų, sumaž÷jęs apetitas, taip pat gali atsirasti karščiavimas ir leukocitoz÷. Išskirtinais atvejais, intermituojanti diar÷ja gali trukti iki dviejų savaičių. Veršelių susirgimas gali svyruoti nuo lengvo iki vidutinio sunkumo, viduriavimas būna gausus, su gleiv÷mis ar kraujo d÷m÷mis, kūno temperatūra gali nepakisti (www.merckvetmanual.com).
10
1.2. Paplitimas tarp galvijų
C. jejuni nežalinga naminių ir laukinių gyvūnų virškinimo trakto komensal÷ (Colles ir kt., 2003). Paprastai, vienu iš svarbiausių C. jejuni rezervuaru yra laikomi naminiai paukščiai (Hakkinen ir kt., 2007), tačiau galvijai užima reikšmingą vietą C. jejuni epidemiologijoje ir yra svarbus šaltinis sukeliantis žmonių susirgimus (Kwan, P.S.L., Birtles, A ir kt., 2008).
Kampilobakterijos taip pat sukelia susirgimus gyvūnams, ypač susijusius su reprodukcijos sistema ir kai kurias periodonto ligas. Patogenas randamas visur – tiek aplinkoje, tiek pas naminius gyvūnus, to pasekoje ir ant augalin÷s ar gyvūnin÷s kilm÷s žalio maisto, o randamų bakterijų skaičius būna pakankamai didelis. Yra manoma, jog kampilobakterijos yra daug jautresn÷s priešiškoms aplinkos sąlygoms nei Sallmonella ar Escherichia coli (Humphrey ir kt., 2007).
Atrajotojų virškinamasis traktas tarnauja kaip palanki aplinka įvykti genetiniams pokyčiams tarp Campylobacter spp. (ar galbūt su kitomis bakterijomis). Be to, tyrimais patvirtinta, jog izoliatai iš tų pačių šeimininkų ar m÷ginių yra labiau genetiškai panašūs, nei lyginant izoliatus išskirtus iš įvairių rūšių (French ir kt., 2005). Pas galvijus kampilobakterijų populiacija yra gana stabili ir dažniau išskiriami genotipai parod÷ nedideles variacijas. Atrajotojų, kaip pagrindinio Campylobacter rezervuaro vaidmenį pabr÷žia tiek kaime, tiek ir mieste randamų padermių asociacijos (Sproston ir kt., 2011).
Ūkiuose galvijai yra didžiausi Campylobacter šaltiniai, kur net iki 89% galvijų bandų būna užsikr÷tę kampilobakterijomis (Rotariu ir kt., 2009). Buvo įrodyta, jog pas galvijus kampilobakterijų išskyrimas padid÷ja po jų ilgesnio transportavimo ar tada, kai gyvuliai patiria stresą, pavyzdžiui, prieš skerdimą (Ross, 2006).
Yra manoma, jog suaugusiems atrajotojams kampilobakterijos yra nepatogeniškos. Nors sp÷jama, jog galvijai yra besimptomiai bakterijų nešiotojai, kampilobakterijos gali paskatinti veršelių enterito atsiradimą, kuriems pataloginiai pokyčiai stebimi klubin÷je ir storosiose žarnose. Diar÷ja žmon÷ms ir žinduoliams dažnai būna malabsorbcinio pobūdžio, o suaugusių galvijų gaubtin÷ žarna gali įsisavinti didžiulį kiekį vandens, kas, tik÷tina jog gali paaiškinti kod÷l jie būna besimptomiai susirgimo suk÷l÷jo nešiotojai. Rezultatai rodo, jog C. jejuni pirmiausiai kolonizuoja sveikų galvijų plonąsias žarnas, tai yra, dvylikapirštę ir tuščiąją žarnas (Inglis ir kt., 2005). Taip pat įrodyta, jog kampilobakterijos pas m÷sinius galvijus buvo randamos dažniau, nei pas pieninius (Hakkinen ir kt., 2007).
Galvijų ir paukščių virškinimo trakto aplinka yra gana skirtinga, kurią galbūt ir pasirenka atitinkamos paderm÷s d÷l įvairių savybių, pavyzdžiui, tokių, kurios susijusios su energijos
11 apykaita, didesnio ar mažesnio deguonies kiekio poreikiu ar amino rūgščių metabolizmu. C. jejuni kolonizacija galvijų žarnyne gali būti nuolatin÷, kaip rodo tyrimai, tie patys genotipai iš organizmo išskiriami iki metų laiko, tod÷l galvijų gyvenimo ciklo mikroorganizmams pilnai užtenka prisitaikyti prie šeimininko virškinamojo trakto (Gonzalez ir kt., 2008). Be to, galvijų žarnyne dažniau randama C. jejuni, nei C.coli (Berry ir kt., 2006).
1.3. Kampilobakterijų identifikavimas
Didžiausias genotipavimo metodų pranašumas, tas, jog jie yra universaliai prieinami (1 lentel÷). Kai kurie metodai, kaip fla geno ar ribosomų genotipavimas, PGR-RFLP, MLST, PFGE yra naudojami daugelyje laboratorijų.
1.3.1. FlaA GENO GENOTIPAVIMAS
C. jejuni žiuželinis genas susideda iš dviejų genų - flaA ir flaB, kurie yra išd÷styti vienas paskui kitą ir atskirti ~170 nukleotidų. D÷l abiejuose genuose esančių gerai apsaugotų ir kintančių sričių, šios vietos yra prieinamos PGR produktų RFLP analizei. Pradmenys, naudojami C. jejuni genotipavimo protokoluose, taip pat gali būti naudojami kuriant panašius protokolus giminingų patogenų tipavimui. Fla geno tipavimas pasirod÷ esąs vertingas daugumai C. coli ir kai kurioms C. lari, C. helveticus ir C. jejuni por. doylei paderm÷ms. Dauguma pradmenų specialiai sukurti flaA geno sekos amplifikavimui. Visi RFLP bandymai rodo, jog daugeliu atvejų, tik vienas fla genas yra amplifikuojamas, nors kartais pastebimi silpni antro geno ruoželiai analizuojamame profilyje.
Pradmenų įvairov÷ turi didelį poveikį PGR-RFLP profilių steb÷jimui, tod÷l įvedus kokius nors pakeitimus metodikoje dažniausiai reikalinga duomenų optimizacija ir standartizacija (sunorminimas).
Vienodi pradmenų rinkiniai flaA amplifikavimui buvo sukurti pagal turimas flaA geno sekas maksimaliam polimorfizmo susekamumui. G (guanino) ar C (citozino) buvimas galin÷se pad÷tyse užtikrina atkaitinimo pastovumą ir sutapatina priekyje einantį pradmenį. D÷l to, vienodi pradmenys rekomenduojami naudoti flaA geno amplifikavime, kur pradmuo einantis į priekį sudarytas iš 5’-ATG GGA TTT CGT ATT AAC AC-3’, o priešingai einantis pradmuo sudarytas iš 5’-CTG TAG TAA TCT TAA AAC ATT TTG-3‘.
12 Restrikcijos fermentai yra naudojami gauti atskirus PGR produkto fragmentus. AluI, DdeI, HinfI, EcoRI ir PstI fermentai dažnai naudojami įvairiomis kombinacijomis. Vieno HinfI nepakanka fragmentų išskyrimui, tuo tarpu iš AluI gauti produktai bandymams yra per maži. DdeI geriausiai išskiria izoliatus naudojamus veterinarijoje. Išskyrimas yra padidinimas kai derinami du fermentai (pavyzdžiui, DdeI su HinfI).
Įrodyta, jog flaA tipavimas yra naudingas, patikimas ir jo atlikimo metodika yra gana paprasta. Įvairios variacijos metodikose dažnai neleidžia palyginti rezultatų tiesiogiai gautų skirtingose laboratorijose. Bet flaA tipavimo profiliai lengvai gali būti patalpinami į elektroninę duomenų bazę, kur daugelis izoliatų gali būti lyginami ir moksliniai tyrin÷jimai įmanomi pasauliniu mastu, tačiau, prieš pradedant lyginti yra būtina internacionalin÷ naudotų pradmenų ir fermentų standartizacija.
1.3.2. PFGE METODAS
Genotipuojant daugelį bakterijų restrikcijos fermentai, suskaldantys DNR, retai būna naudingi. Taip pat daugelis DNR fragmentų dažnai būna labai dideli nuo 20 iki 200 kb, tod÷l paprastai jie yra išskirstomi pagal dydžius, naudojant specialias elektroforez÷s sąlygas. Nukrypimų atsiradimas tiesiogiai atsiliepia genotipavimo profilyje. Siekiant išvengti nukrypimų, dar prieš prasidedant ląstelių lizei, chromosomin÷ DNR yra apsaugoma bakterijų suspensiją imobilizuojant agaroz÷je. Tolimesni fermentų žingsniai vyksta pasyvios difuzijos būdu agaroz÷s gelyje. Visos Campylobacter spp. plazmid÷s ir choromosomin÷s DNR aptinkamos PFGE metodu. Bandiniai su išgryninta ir suskaldyta DNR tiesiogiai perkeliami į agaroz÷s gelį, kuris naudojamas elektroforezei, kur elektrinių laukų orientacija kinta pulsavimo būdu. Pradžioje PFGE buvo naudojamas vien C. jejuni, tik v÷liau metodas pritaikytas C. coli, C. hyointestinalis, C. fetus ir C. upsaliensis.
Sąlygos, naudojamos PFGE skirtinguose moksliniuose darbuose varijuoja. Elektroforez÷s sąlygų pakeitimas gali būti matomas pokytis to paties preparato DNR profilyje. Fermentai, naudojami skaldyti DNR chromosomoms, skirtinguose moksliniuose darbuose taip pat gali būti skirtingi: SmaI, SalI, KpnI, ApaI ar BssHII. XhoI naudojamas C. upsaliensis. Naudojant daugiau nei vieną fermentą ženkliai padidinama metodo išskirdinimo galia. D÷l didel÷s restrikcijos fermentų ir elektroforez÷s sąlygų įvairov÷s, PFGE profilių palyginimas iš skirtingų laboratorijų yra pakankamai sud÷tingas.
13 1.3.3. RIBOSOMŲ GENOTIPAVIMAS
rRNR genų lokų skaičius (rRNR kodavimas 5S, 16S ir 23S) chromosomų pozicijose yra skirtingas. D÷l stipriai apsaugotų ir labai kintančių gretutinių regionų rRNR šie genai yra tinkami genotipavimo taikiniai. Dažniausiai metodas naudojamas genotipavimui imant ribosomų genus ir atliekant elektroforezę tik po to kai specifinis rRNR genas suskaldomas Pietų d÷m÷s (Southern blot) hibridizacijos metodu, naudojant atitinkamą rRNR kodavimą. Kadangi dauguma Campylobacter spp. turi tik tris rRNR genų kopijas, šio metodo skiriamoji geba yra limituota. Pavyzdžiui, šiuo metodu negalima atskirti C. fetus por. fetus nuo C. fetus por. veneralis ar diferencijuoti kitas padermes nuo šių porūšių. Apskritai, metodas labiausiai naudingas nustatin÷jant rūšis, kurias sunku analizuoti fenotipiškai. Nepaisant to, metodas buvo s÷kmingai
panaudotas genotipuojant (bent tik iki tam tikro laipsnio) C. jejuni, C. coli, C. upsaliensis, C. lari, C. helveticus ir aerotolerancines Campylobacter spp.
Fermentai, naudojami skaldyti chromosomas ribosomų tipavimui, taip pat yra labai skirtingi; PstI, HaeIII, HindIII ir PvuII buvo naudojami atskirai, poromis ar net deriniais po tris. Skirtingas restrikcijos fermentų ir kodavimų naudojimas paprastai trukdo palyginti iš skirtingų laboratorijų ribosomų genotipavimo metu gautus profilius.
Santykinai maža metodo galia ir parengimo pobūdis daro jį netinkamą įprastam genotipavimui. Neseniai ribosomų genotipavimui buvo panaudotos C. jejuni ir C. coli paderm÷s, tačiau d÷l didelių išlaidų (tiek įrangai, tiek reikmenims) ir mažo našumo metodo naudojimas yra ribotas, nors jis gali būti taikomas daugeliui bakterijų.
1.3.4. RAPD ANALIZĖ
„Savavališkai“ atsiradę pradmenys gali būti naudojami atsitiktinai sustiprinti DNR produktams, remiantis negriežtomis PGR sąlygomis. Paprastai atsitiktinai paskirti dešimtiniai pradmenys yra naudojami tokiomis sąlygomis, kurios leidžia kai kuriuos neatitikimus padidinant pagrindinių pradmenų skaičių. PGR produktai gaminami tada, kai pradmenys yra išsid÷stę amplifikacijos atstumu mažiau nei 5 kb ir teisinga priešinga orientacija. Šių produktų ilgiai bei „paleidimo“ efektyvumas varijuoja d÷l pasirinktų pradmenų. Tod÷l „juostiniai keliai“ susidaro tiek iš silpnų, tiek iš stiprių amplikonų, ir tai žymiai apsunkina rezultatų aiškinimą. Atsitiktinai ampilikuotų polimorfinių DNR metodas buvo sukurtas Campylobacter spp. naudojant įvairius pradmenis ir reakcijos sąlygas. Teoriškai, metodas turi aukštą tipavimo gebą, bet praktiškai iki 14% tirtų padermių negenotipuojamos d÷l DNRaz÷s veikimo. Naudotų pradmenų pasirinkimas yra
14 reikšmingas RAPD rezultatų analizei. Pradmenys dažnai pasirenkami atsitiktinai. Vienas pradmuo sustiprina tik vieną PGR produktą.
Pagrindinis analiz÷s trūkumas yra blogas atkuriamumas, kuris iš esm÷s yra svarbesnis net ir už greitą atlikimą ar ekonominį efektyvumą. Šis metodas buvo naudojamas siekiant nustatyti C. jejuni ir C. upsaliensis potipius.
1.3.5. AFLP ANALIZĖ
Ši metodika pradžioje buvo sukurta augalų genetinei įvairovei analizuoti ir tik paskui buvo pritaikyta genotipuoti daugeliui bakterijų. Metodas yra paremtas visišku chromosomin÷s DNR „suvirškinimu“ naudojant du restrikcijos fermentus, vienas su 4 bp atpažinimo vieta ir kitas su 6 bp atpažinimo vieta.
Suvirškintų PGR produktų amplifikavimas yra paremtas tuo, kad amplifikuojami tik tie fragmentai kurie yra šone abiejų restrikcijos vietų. Amplifikavimui naudojami pradmenys yra radioaktyviai ar fluorescentinai pažym÷ti, ir remiantis gautu PGR žym÷jimu yra analizuojami poliakrilamidiniame gelio profilyje. Tai leidžia atskirti molekulinio lygio fragmentus, kurie dažniausiai būna nuo 50 iki 500 nukleotidų ilgio. Atsiradusių ruoželių skaičius analizuojamame profilyje (nuo 80 iki 100 ruoželių yra optimalu) gali būti sumažintas jungiantis PGR pradmenims į vieną ar daugiau specifinių nukleotidų, gretimai restrikcijos vietų. Taigi tik tiek fragmentai, kurie turi specifinį nukleotidą restrikcijos vietoje yra aptinkami ir analizuojami. Metodas gali būti pritaikytas daugeliui bakterijų rūšių.
Šio metodo pranašumas yra toks, jog atrenkama atsitiktin÷ genomo dalis. Nepatogumas, jog metodas sud÷tingas ir reikalauja didelių investicijų.
1.3.6. DAUGINĖ PGR-RFLP ANALIZĖ
Kiti nei fla polimorfiniai genai gali būti naudojami dauginei PGR-RFLP, bei gali būti sujungiami ir analizuojami keletas polimorfinių genų. Toks dauginis PGR buvo sukurtas C. jejuni naudojant polimorfinius genus gyrA ir pflA. Metodo išskyrimo lygis gali būti padidinamas įterpiant fla, kaip trečią geną taikinį. Kitas galimas PGR-RFLP genas yra flgE, genas koduojantis žiuželio proteinus, kuris pas skirtingas padermes yra skirtingas.
Žinoma, jog genetin÷ įvairov÷ yra vienas iš mechanizmų MEE būdu sudarantis atsekamų pakitimų pagrindą.
15 1.3.7. NUKLEOTIDŲ SEKOS NUSTATYMAS
Tiesioginis nukleotidų sekos nustatymas (su ar be PGR amplifikavimo) darosi vis labiau mechanizuotas ir tod÷l yra priimtinas metodas bakterijų izoliatų genotipavimui. Sekos nustatymo pranašumas yra didelis atkuriamumas, o gauti rezultatai yra lengvai analizuojami. Vis d÷lto, kompleksų duomenų gausa ir didžiul÷ išskyrimo galia padaro aiškinimą labai priklausomą nuo kompiuterinių palyginamųjų programų, o naudojami programinių įrangų kompleksai paprastai nustatin÷ja parametrus (Wassenaar ir kt., 2000).
1.3.8. MLST METODAS
C. jejuni MLST paremta septynių vietų gene seka, kurių ilgis 402-507 bp ir viena nuo kitos paderm÷s atskirtos > 15 000 bp. ST – sekos tipai– septynių unikalių alelių kombinacija. CC – klonų kompleksai– grupel÷ artimai susijusių ST, iš septynių alelių besiskiriančių >2. Klonų komplesai yra grupel÷s padermių, kurios dalijasi „naujesnį” bendrą prot÷vį, nei paderm÷s nesančios komplekse, bet n÷ra identiškos viena kitai visose MLST vietose (McCarthy ir kt., 2007).
Didel÷ išskiriamoji galia ir atkuriamumas, lengvas duomenų interpretavimas ir informacijos keitimasis tarp skirtingų laboratorijų yra MLST metodo pranašumai. Šiuo metodu, taip pat aptinkamos sumaišytos kultūros, genetiniai pasikeitimai ir rekombinacijos tarp Campylobacter spp. (Eberle ir Kiess, 2012).
16 1 lentel÷. Skirtingų genotipavimo metodų palyginimas genotipuojant kampilobakterijas (Wassenaar ir kt., 2000). Metodas Išskyri mo galia a Tipavimo geb÷jimas (%) b Atkuria mumas c Jautrumas genetiškam nestabilum ui Laikas, reikaling as atlikti metodui Kaina Prieina mumas fla geno genotipa vimas Priimtin
a 100 Geras Taip <1 d. Maža Geras
PFGE
Gera 100 Geras Taip 3-4 d. Vidutin
iška Limituot as Riboso mų genotip avimas
Menka 100 Geras Taip 3-4 d. Vidutin
iška Metodas yra sud÷ting as RAPD Vidutini
ška ~80 Žemas Taip <1 d. Maža Geras
AFLP
Gera 100 Geras Ne 2-3 d. Vidutin
iška Metodas yra sud÷ting as Sekos nustaty mas Labai
gera 100 Geras Netinkamas 2-3 d.
Vidutin iška
Limituot as
a
Metodo išskyrimo galia - tai geb÷jimas diferencijuoti genetiškai nesusijusias padermes;
b
Tipavimo geb÷jimas yra 100%, jei visos tikrinamos paderm÷s galimos tipuoti duotuoju metodu;
c
Metodo atkuriamumas - geb÷jimas identifikuoti m÷ginio kopiją. Tai nepriklausomas išorinis faktorius, pvz. kaip genetinis nestabilumas.
17
1.4. Galvijų C. jejuni genetinė įvairovė
Epidemiologin÷ rizikos faktorių analiz÷ yra naudojama identifikuoti veiksnius, kurių poveikyje kyla pavojus įsigyti infekciją. Toks rizikos veiksnių vertinimas dažnai rodo, kad rizikos faktoriai, susiję su skirtingais susirgimo šaltiniais yra homogeniniai. Vis d÷lto, daugeliu atvejų yra daug infekcijos šaltinių, ir skirtingi rizikos veiksniai yra susiję su tais skirtingais šaltiniais (Bessell ir kt., 2012).
Maistui skirtų gyvūnų, kaip naminių paukščių, galvijų, kiaulių ar avių žarnyne yra randami dideli kiekiai C. jejuni ir tai įvardijama kaip svarbus kelias bakterijoms patekti į maisto vartotojų grandinę. Be to, laukiniai paukščiai ir žinduoliai taip pat yra kampilobakterijos nešiotojai (Kwan, P.S.L, Barrigas, M. ir kt., 2008).
Neseniai atlikti bandymai akcentuoja galvijus, kaip svarbią vieta C. jejuni epidemiologijoje užimantį šaltinį (Kwan, P.S.L, Barrigas, M. ir kt., 2008). Aišku, jog galvijų žarnynas yra pastovi aplinka bakterijoms, nes buvo rastos genetiškai stabilios ir dominuojančios mikroorganizmų paderm÷s (Kwan, P.S.L., Birtles, A ir kt., 2008). Taip pat nustatyta, jog C. jejuni genetin÷ sud÷tis galvijų populiacijoje pastoviai apibr÷žia didelį izoliatų skaičių (Kwan, P.S.L, Barrigas, M. ir kt., 2008).
Genetinio tipavimo duomenys yra vertingas šaltinis padedantis nustatyti kaip įgyta infekcija. Kampilobakterijos gali būti klasifikuojamos pagal jų alelinius profilius, naudojant genotipavimo techniką, kuri išskirsto izoliatus į specifinius ST - sekos tipus (Bessell ir kt., 2012).
C. jejuni padermių dinamika galvijų populiacijoje nustatoma pagal tirtų atvejų ST ir CC (Kwan, P.S.L., Birtles, A ir kt., 2008). Dauguma galvijų genotipavimo duomenų priskirta keliems klonų kompleksams ST-21, ST-61, ST-48, ST-42, ST-45 (Kwan, P.S.L, Barrigas, M. ir kt., 2008; Colles ir kt., 2003; Ragimbeau ir kt., 2008) ir ST-22 (Kwan, P.S.L., Birtles, A ir kt., 2008). Bet yra trys vyraujančios klonų linijos, tai ST-61, ST-21 ir ST-42. Tolimesni tyrimai rodo, jog klonų kompleksas ST-61 yra prisitaikęs, o ST-42 yra tiesiogiai susijęs su C. jejuni genotipu (Kwan, P.S.L., Birtles, A ir kt., 2008).
Tyrin÷jimai įrod÷, jog klounų kompleksai ST-21, ST-45 ir ST-61 yra dažniausiai pasitaikantys C. jejuni genotipai galvijų fermos aplinkoje, ir kurie sudaro net 60 % visų apie bakteriją gaunamų duomenų. Pas žmones šie genotipai izoliuojami taip pat dažniausiai (Kwan, P.S.L, Barrigas, M. ir kt., 2008).
ST-61, ST-42 ir ST-21 kompleksai pasirod÷ labiau paplitę tarp jaunesnių galvijų, o vyresni gyvuliai pasirod÷ esą rečiau pasitaikančių ir įvairesnių C. jejuni padermių nešiotojai (Kwan,
18 P.S.L., Birtles, A ir kt., 2008). Skirtingi klonų kompleksų pasiskirstymai tarp suaugusių galvijų ir veršelių, laikant gyvulius atskirtus skirtingose amžiaus grup÷se, gali atspind÷ti skirtingas sąlygas ar ūkininkavimo metodus, o gal net ir šeimininko imunologinę brandą (Colles ir kt., 2003).
Nustatyta, jog žmonių infekcija, kurios šaltinis galvijai, yra linkusi labiau būti sezoniškas susirgimas ir dažniau pasitaiko kaimo regionuose, negu susirgimai, kurių šaltiniu laikoma paukštiena (Bessell ir kt., 2012). Sezoninis C. jejuni padid÷jimas galvijų žarnyne dažniausiai sutampa su ganiavos periodu, kada gyvuliai potencialiai kontaktuoja su užterštais paviršiniais vandenimis, taip pat galimi bakterijos plitimo vektoriai aplinkoje yra mus÷s bei laukiniai triušiai (Ragimbeau ir kt., 2008).
Kampilobakterijų užterštumas dažniausiai pasiekia piką vasaros metu, o žiemos metu, šie skaičiai sumaž÷ja (Ross, 2006). Yra įrodyta, jog metų pradžioje Campylobacter paplitimas santykinai mažas, o kovo – geguž÷s m÷nesiais pradeda tolygiai did÷ti, birželį pasiekia piką, liepą bakterijos paplitimo skaičius sumaž÷ja, o lapkritį pasiekia antrą piką.
Apskaičiavus Simpson‘o įvairov÷s indeksą kiekvienam metų sezonui, pasteb÷ta, jog C. jejuni genetin÷ įvairov÷ didžiausia būna vasarą, o pavasarį ji - mažiausia. ST-61 ir ST-22 kompleksai labiausiai būna paplitę pavasarį, ST-21 žiemą, ST-48 vasarą o kompleksas ST-42 vienodai pasiskirstęs per visus metus (Kwan, P.S.L., Birtles, A ir kt., 2008).
19
2. Tyrimo metodika ir organizavimas
2.1. Tyrimo objektas
Tyrimai buvo atliekami Lietuvos Sveikatos Mokslų Universiteto Veterinarijos Akademijos Užkrečiamųjų ligų katedros laboratorijoje 2012 m. 03 – 2012 m. 09 m÷n. laikotarpiu.
Šio tyrimo metu, iš trijų skirtingų galvijų ūkių, buvo išskirtas 91 teigiamas C. jejuni izoliatas, ir su 49 izoliatais buvo atliktas kampilobakterijų genotipavimas. Genotipavimas atliktas restrikcijos fragmentų ilgio polimorfizmo metodu (PGR-RFLP) pagal flaA geną (Harrington ir kt., 2003).
2.2. FlaA geno amplifikavimas
Pasigaminamas reagentų mišinys, reikalingam atlikti reakcijų skaičiui (N), papildomai pridedant dar vienai reakcijai reikalingo mišinio kiekį (N+1).
Reagentų kiekis reikalingas vienai reakcijai atlikti (50µl) yra: 10XPCR buferis 5µl; MgCl2
3µl; dNTP’s 5µl; Pradmuo A1 0,5µl; Pradmuo A2 0,5µl; Taq polimerz÷ 0,25µl; Sterilus bidistiliuotas H2O 33,25µl.. Reagentai (išskyrus Taq polimerazę) prieš reakciją atšildomi.
Mišinys gaminamas ant šaltį palaikančio stovo. Gaminant mišinį pirmiausia pilami tie reagentai kurių tūris yra didžiausias. Taq polimeraz÷ pilama pakutin÷ ( iš -20°C temperatūros išimama tik prieš pat naudojimą ir v÷l patalpinama atgal). Pasigaminto mišinio po 49µl išpilstoma į sužym÷tus PGR m÷gintuv÷lius, sud÷tus ant šaltį palaikančio stovo. Į kiekvieną PGR m÷gintuv÷lį maišant antgaliu pridedama 1µl atšildytos DNR. PGR m÷gintuv÷liai patalpinami į termociklerį ir paleidžimaama programa, kurios trukm÷ 2,5 val..
Iki tyrimo elektroforeze PGR produktai turi būti laikomi 4°C.
2.3. Amplifikuotų produktų aptikimas agarozės gelyje
Pasiruošiama iš anksto:
1 x TBE buferio- į 1000 ml tūrio cilindrą įpilama 100 ml 10 x TBE buferio. Iki 1000 ml žymos cilindre pripilama bidistiliuoto vandens.
Pasiruošiama maždaug 30 min iki baigiantis PGR reakcijai:
R÷melis geliui - laisvi r÷melio kraštai apklijuojami lipnia pl÷vele, užlenkiant jos kraštus ant r÷melio, suformuojant sandarią talpą. Įstatomos pasirinktos „šukos“.
20 2 % agaroz÷s tirpalas - analitin÷se svarstykl÷se pasveriama 2,21 g agaroz÷s ir į kolbą įpilama 140 ml 1 x TBE buferio. Pirmiausia į 350 ml talpos kolbą suberiama agaroz÷, po to supilamas buferis. Šiek tiek pamaišoma ir tirpinama 3 min 610 V mikrobangų krosnel÷je, stebint, kad užviręs tirpalas neišb÷gtų per viršų kai užverda. Stipriai nemaišyti, kad nesusidarytų burbulai.
Kolba v÷sinama pakišus ją po tekančio, drungno vandens srove atsargiai sukant per riešą, kad gelis v÷stų tolygiai. Atv÷sus iki temperatūros, kai kolba galima laikyti rankose nenusideginant, pridedama 7,5 µl ethidium bromido tirpalo ir išmaišoma, iki tolygiai pasiskirsto raudona bromido spalva. Gelis kuo greičiau supilamas į paruoštą r÷melį, susidarę burbulai, kol gelis dar neprad÷jo stingti, nustumiami į kraštus naudojant vienkartinį antgalį. Gelis sustingsta per 20 min. Atsargiai, stengiantis “nesugadinti” gelio, ištraukiamos „šukos“. Nuo r÷melio kraštų nuimama lipni juosta ir gelis atsargiai „išstumiamas“ į elektroforez÷s vonelę, užpildytą iš anksto pasigamintu TBE buferiu. Patikrinama ar gelis visiškai apsemtas, jei reikia į vonelę papildomai įpilama 1 x TBE buferio kad apsemtų gelį bent 2 mm.
PGR produkto elektroforez÷
Dar stingstant geliui paruošiama 6 x Loading Dye (dažas) kiekvienam PGR produktui. Naudojamas Petri l÷kštel÷s dangtelis. 1,5 cm atstumu vienas nuo kito d÷liojama tiek 2 µl 6 x Loading Dye lašų, kiek yra m÷ginių, plius dar vienas papildomas - markeriui.
Kai gelis jau patalpintas į vonelę, naudojant mikropipetę pritraukiama 11 µl PGR produkto ir maišoma su 6 x Loading Dye Petri l÷kštel÷je taip, kad nesusidarytų burbulai ir iš karto gautas „miksas“ perkeliama į „šulin÷lius“ esančius gelyje. Į per vidurį esantį šulin÷lį dedama 2 µl markerio sumaišyto su 2,5 µl 6 x Loading Dye Petri l÷kštel÷je ir tik tuomet perkeliama į šulin÷lį. Uždengiamas elektroforez÷s vonel÷s dangtis, prijungiami laidai, įjungiama elektroforez÷, kuri trunka 30 min 105 V.
Pasibaigus elektroforezei padaroma gelio nuotrauka (1 nuotauka). Gauti duomenys išsaugomi gelių dokumentavimo sistemoje.
21 1 nuotr. PGR produktų profilis po elektroforez÷s
1 – šulin÷lis; į kuriuos perkeliamas PGR produktas sumaišytas su Loading Dye; 2 – žymeklis – orientyras, rodantis bazių porų nueitą ilgį 3 – būdingas flaA geno bazių porų išsid÷stymas
2.4. FlaA geno kirpimas DdeI (HpyF31)
Pasigaminamas mišinys reikalingam atlikti reakcijų skaičiui (N), papildomai pridedant dar vienai reakcijai reikalingo mišinio kiekį (N+1).
Reagentų kiekis reikalingas atlikti vienai reakcijai (30 µl): Sterilus bidistiliuotas vanduo 21,8 µl; Buferis 3 µl; DdeI 0,2 µl. Reagentai ( išskyrus DdeI ) prieš reakciją atšildomi.
Mišinys gaminamas ant šaltį palaikančio stovo. Gaminant mišinį pirmiausia pilami tie reagentai kurių tūris yra didžiausias. DdeI pilamas paskutinis ( iš -20°C temperatūros išimamas tik prieš pat naudojimą ir v÷l patalpinamas atgal). Pasigaminto mišinio po 25µl išpilstoma į sužym÷tus PGR m÷gintuv÷lius sud÷tus ant šaltį palaikančio stovo. Į kiekvieną PGR m÷gintuv÷lį maišant antgaliu pridedama 5 µl atšildyto PGR produkto, kuris buvo gautas prieš tai atlikus flaA geno amplifikavimą. Inkubuojama 37°C temperatūroje 3val..
2.5. FlaA fragmentų aptikimas agarozės gelyje
R÷melis geliui ruošiamas maždaug 30 min prieš baigiantis DdeI kirpimo reakcijai.
2,5% agaroz÷ - analitin÷mis svarstykl÷mis atsisveriama 3,25 g agaroz÷s ir į kolbą įpilama 140 ml 1 x TBE buferio. Pirmiausia į 350 ml talpos kolbą dedama agaroz÷, po to įpilamas buferis. Šiek tiek pamaišoma ir tirpinama 3 min 610 V mikrobangų krosnel÷je, prižiūrint kad užviręs tirpalas neišb÷gtų per viršų. Stipriai nemaišyti, kad nesusidarytų burbulai. Užviręs tirpalas
21 v÷sinamas pakišus kolbą po tekančio, drungno vandens srove, atsargiai sukant per riešą, kad gelis v÷stų tolygiai. Atv÷sus iki temperatūros, kai kolba galima laikyti rankose nenusideginant, pridedama 7,5 µl ethidium bromido tirpalo ir išmaišoma, iki tolygiai pasiskirsto bromido spalva. Gelis kuo greičiau supilamas į paruoštą r÷melį, susidarę burbulai, kol gelis neprad÷jo stingti, nustumiami į kraštus naudojant vienkartinį antgalį. Gelis sustingsta per 20 min. Atsargiai ištraukiamos „šukos“. Nuo r÷melio kraštų nuimama lipni juosta ir gelis atsargiai išstumiamas į eketroforez÷s vonelę, pripildytą TBE buferio. Patikrinama ar gelis pilnai apsemtas, jei ne į vonelę dapilama 1 x TBE buferio, kad gelis būtų apsemtas 2 mm.
FlaA fragmentų elektroforez÷ - į kiekvieną PGR produkto m÷gintuv÷lį pridedama 6 µl 6 x Loading Dye ir išmaišoma. Kai gelis jau patalpintas į vonelę į kas šeštą šulin÷lį dedama po 3 µl markerio sumaišyto su 2 µl 6 x Loading Dye ir perkeliama į šulin÷lius. Į likusius šulin÷lius dedama po 30 µl paruošto PGR produkto. Uždengiamas elektroforez÷s vonel÷s dangtis, prijungiami laidai, įjungiama elektroforez÷, kurios sąlygos 90 min 90 V ( arba stebint kol dažo linija pasiekia 1 cm atstumą nuo apatinio gelio krašto ).
Po elektroforez÷s padaroma gelio nuotrauka ir analizuojamas fragmentų išsid÷stymas, gelio nuotraukoje ( 2 nuotrauka).
2 nuotr.. FlaA geno fragmentų išsid÷stymas
23
3. Tyrimo rezultatai
3.1. C. jejuni paplitimas skirtinguose galvijų ūkiuose
Geguž÷s-rugpjūčio m÷nesiai iš trijų skirtingų galvijų ūkių (D, S ir B) buvo renkami m÷giniai. M÷giniai buvo renkami iš skirtingų galvijų ir iš skirtingo amžiaus gyvulių – veršelių, telyčių ir karvių. 47 (dviejuose m÷giniuose nustatyta po du skirtingus genotipus) m÷giniai, teigiami C. jejuni atžvilgiu, analizuojami sekančiai (2 lentel÷).
Kaip matyti iš lentel÷s, daugiausia teigiamų C. jejuni izoliatų buvo išskirta iš ūkio S=19 ir tai sudaro 38,8% nuo visų tyrimui paimtų m÷ginių skaičiaus. M÷ginių skaičius iš ūkio D buvo 16, procentin÷ dalis nuo visų m÷ginių sudaro 32,6%. Mažiausiai m÷ginių paimta iš ūkio B=14 ir procentin÷ išraiška, atitinkamai, taip pat mažiausia 28,6%.
Ūkyje S m÷ginių iš veršelių buvo daugiausia 9 ir tai sudaro net 60% nuo visų iš veršelių (15) paimtų m÷ginių skaičiaus. Telyčių m÷ginių iš šio ūkio paimta 6 ir tai sudaro 25% nuo visų iš telyčių (24) paimtų m÷ginių skaičiaus, tuo tarpu karvių m÷ginių tik 4, ir tai sudaro 40% nuo visų iš karvių (10) paimtų m÷ginių skaičiaus. Ūkyje D telyčių m÷ginių – 9 (37,5%)- buvo dvigubai daugiau nei veršelių 4 (26,7%) ir tik 3 (30%) m÷giniai buvo iš karvių. Ūkis B m÷ginių iš veršelių tur÷jo tik 2 (13,3%), 3 iš karvių (30%), ir net 9 iš telyčių (37,5%).
2 lentel÷. Genotipuotų C jejuni m÷ginių skaičius iš skirtingų ūkių ir pagal amžiaus grupes Ūkis M÷ginių skaičius % nuo visų m÷g. sk. Veršeliai % nuo visų verš. m÷g. sk. Telyčios % nuo visų telyč. m÷g. sk. Karv÷s % nuo visų karvių m÷g. sk. D 16 32,6 4 26,7 9 37,5 3 30 B 14 28,6 2 13,3 9 37,5 3 30 S 19 38,8 9 60 6 25 4 40 Iš viso 49 100 15 100 24 100 10 100
Viso 24 m÷giniai surinkti iš telyčių ir tai sudaro 49% nuo visų m÷ginių skaičiaus. Tuo tarpu iš veršelių gauta 15 teigiamų C. jejuni m÷ginių ir tai yra 30,6% nuo visų m÷ginių. Iš karvių gautų m÷ginių skaičius yra mažiausias tik 10, atitinkamai procentin÷ dalis yra tik 20,4%.
24 1 diagramoje pateikiamas C. jejuni izoliatų skaičiaus pasiskirstymas skirtingose gyvulių amžiaus grup÷se. Diagramoje matome, jog visuose ūkiuose daugiausia m÷ginių yra surinkta iš telyčių, o ūkiuose D ir B jų skaičius yra vienodas ir didžiausias nei iš ūkio S. Tuo tarpu iš ūkio S akivaizdžiai daugiausia m÷ginių gauta iš veršelių, o m÷ginių skaičius ūkiuose D ir B yra gerokai mažesnis. Karvių m÷ginių visuose trijuose ūkiuose surinkta gerokai mažiau lyginant su m÷ginių skaičiumi gautu iš kitų amžiaus grupių, ūkyje B ir D jų skaičius vienodas, bet mažesnis negu iš ūkio S. 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 D B S veršeliai telyčios karv÷s
1 diagrama. C. jejuni izoliatų pasiskirstymas skirtingose amžiaus grup÷se ūkiuose D, B ir S
3.2. C. jejuni genetinė įvairovė
Iš viso buvo genotipuoti 49 m÷giniai, bei gauta 19 skirtingų genotipų. Buvo taikytas savas genotipų žym÷jimas.
Iš 19 skirtingų genotipų, vienuolikai buvo priskirta tik po vieną izoliatą. Paskaičiavus santykį nuo visi genotipų gauta 0,58. Trims skirtingiems genotipams priskirti keturi izoliatai, santykis daugiau nei tris kartus mažesnis ir sudaro 0,15. P=0,05 sudaro vieną genotipą ir jam priklauso du izoliatai. Tuo tarpu po tris ir devynis izoliatus buvo priskirta dviem skirtingiems genotipams, ir tai atitinkamai jų santykį sudaro po 0,11 (3 lentel÷).
3 lentel÷. Izoliatų pasiskirstymas tarp skirtingų genotipų
Genotipai 11 3 1 2 2
Izoliatų skaičius 1 4 2 3 9
Skirtingi genotipai/visi genotipai
25 Po 9 izoliatus buvo priskirta I ir III genotipams, po 4 izoliatus rasta II, V ir XVII genotipų. VI ir VII genotipams priskirta po 3 izoliatus, ir tik 2 izoliatai priklaus÷ XIII genotipui. Tuo tarpu genotipų, su vienu jam priskirtu izoliatu buvo rasta dauguma, tai IV, VIII, IX, X, XI, XII, XIV, XV, XVI, XVIII ir XIX (4 lentel÷).
4 lentel÷. Tyrimo metu gauti genotipai ir jiems priklausančių izoliatų skaičius
Genotipai I II III IV V VI VII VIII IX
Izoliatų skaičius
9 4 9 1 4 3 3 1 1
X XI XII XIII XIV XV XVI XVII XVIII XIX
1 1 1 2 1 1 1 4 1 1
2 diagramoje pateikiama procentin÷ išraiška visų genotipų, pagal jiems priklausančių izoliatų skaičių. Diagramoje ryškiausiai išsiskiria du genotipai I ir III, sudarantys po 18% nuo visų genotipų procentin÷s dalies. Po 8% tenka trims genotipams: II, V ir XVII. VI ir VII sudaro po 6%, ir tik vienintelis XIII genotipas sudaro 4% nuo bendro genotipų procento. Tuo tarpu IV, VIII, IX, X, XI, XII, XIV, XV, XVI, XVIII ir XIX genotipų procentin÷ dalis pagal kiekvienam jų individualiai priskirtų izoliatų skaičių sudaro po 2%.
Iš 91 teigiamo C. jejuni m÷ginio, 49 izoliatai buvo genotipuoti pagal flaA geną PGR-RFLP metodu. Iš išskirtų 19 skirtingų genotipų I ir III genotipai dominavo, bet I genotipas buvo nustatytas tik ūkyje S, tuo tarpu III genotipas buvo pasiskirstęs tarp visų trijų ūkių. Abiejų genotipų izoliatai buvo išskirti tiek iš veršelių, tiek iš telyčių, bet n÷ vieno izoliato nebuvo iš karvių. I genotipas dominuoja tarp veršelių, o III genotipas – tarp telyčių (4 lentel÷).
II, V, VI, VII, XIII ir XVII genotipai nebuvo dominuojantys, bet buvo išskirti daug dažniau nei kiti. VI ir XVII genotipai buvo rasti visuose trijuose ūkiuose, visų kitų genotipų pasiskirstymas tarp ūkių buvo skirtingas: II ir XIII genotipai buvo rasti ūkyje D, bet II genotipas buvo taip pat rastas dar ir ūkyje B, o XIII genotipas – ūkyje S. Tuo tarpu V genotipas buvo rastas tik ūkyje B, o VII genotipas – tik ūkyje S. V genotipas buvo rastas visose amžiaus grup÷se, tuo tarpu II ir XVII genotipai rasti tik pas telyčias ir karves. Vien tik pas karves buvo rastas VII genotipas, o vien tik pas veršelius rastas XIII genotipas. VI genotipas rastas pas veršelius ir telyčias, bet neišskirtas n÷ vienas izoliatas iš karvių.
26 Visų kitų genotipų išskirta labai mažai ir visi jie rasti pavieniai skirtinguose ūkiuose. IV, IX, XI, XVI ir XIX genotipai rasti tik ūkyje D. Genotipai VIII, X, XII, XV ir XVIII rasti tik ūkyje B, ir tik vienintelis genotipas XIV rastas ūkyje S. Pas veršelius buvo rastas vienintelis genotipas XIX. O pas telyčias išskirti ir rasti VIII, IX, X, XI ir XV genotipai. IV, XII, XIV ir XVI genotipai rasti tik pas karves.
18% 8% 18% 2% 8% 6% 6% 2% 2% 2% 2% 2% 4% 2% 2%2% 8% 2%2%
I - 9
II - 4
III - 9
IV -1
V - 4
VI - 3
VII - 3
VIII - 1
IX - 1
X - 1
XI - 1
XII - 1
XIII - 2
XIV - 1
XV - 1
XVI - 1
XVII - 4
XVIII - 1
XIX - 1
2 diagrama. Procentin÷ genotipų išraiška pagal jiems priklausančių izoliatų skaičių
Ūkiuose D ir B rasta po 10, o ūkyje S tik 7 skirtingi genotipai. Iš ūkio D išskirta 16 izoliatų, iš ūkio B – 14, o iš ūkio S išskirta 19 izoliatų. Tuo tarpu izoliatų skaičius išskirtas iš telyčių buvo didžiausias, net 24. Iš veršelių išskirtas skaičius buvo gerokai mažesnis tik 15, o iš karvių išskirtas izoliatų skaičus buvo tik 10.
27 4 lentel÷. Visų genotipų genetin÷s įvairov÷s palyginimas pagal išskirtų izoliatų skaičių skirtinguose ūkiuose ir tarp skirtingų amžiaus grupių
Ūkis D Ūkis B Ūkis S Veršeliai Telyčios Karv÷s
flaA tipai Izoliatų skaičius Izoliatų skaičius Izoliatų skaičius Izoliatų skaičius Izoliatų skaičius Izoliatų skaičius Izoliatų skaičius I 9 - - 9 7 2 - II 4 3 1 - - 3 1 III 9 4 2 3 3 6 - IV 1 1 - - - - 1 V 4 - 4 - 1 2 1 VI 3 1 1 1 1 2 - VII 3 - - 3 - - 3 VIII 1 - 1 - - 1 - IX 1 1 - - - 1 - X 1 - 1 - - 1 - XI 1 1 - - - 1 - XII 1 - 1 - - - 1 XIII 2 1 - 1 2 - - XIV 1 - - 1 - - 1 XV 1 - 1 - - 1 - XVI 1 1 - - - - 1 XVII 4 2 1 1 - 3 1 XVIII 1 - 1 - - 1 - XIX 1 1 - - 1 - - 49 16 14 19 15 24 10
28 Trys genotipai III, VI ir XVII buvo paplitę tarp visų ūkių. Vienintelis V genotipas buvo paplitęs tarp visų amžiaus grupių, bet nebuvo dominuojantis.
VII genotipas dominavo tarp karvių, III tarp telyčių, o I tarp veršelių.
Paskaičiavus Simpson‘o įvairov÷s indeksą (D), didžiausia genotipų įvairov÷ buvo nustatyta B ūkyje D=0,92 ir D ūkyje - 0,91, o mažiausia genotipų įvairov÷ buvo trečiame ūkyje S ir sudar÷ D=0,75.
Apskaičiavus visų galvijų genetinę įvairovę, gauta jog ji sudaro D=0,91. O tuo tarpu didžiausia genotipų įvairov÷ buvo nustatyta tarp karvių D=0,93, mažiausia tarp veršelių D=0,76. O pas telyčias sudar÷ D=0,91.
29
4. Rezultatų aptarimas
Genotipavimas buvo atliekamas siekiant nustatyti šio tyrimo metu surinktų C. jejuni padermių genetinę įvairovę ir genetiškai palyginti kampilobakterijų padermes, išskirtas iš trijų skirtingų galvijų ūkių ir iš skirtingų amžiaus grupių gyvulių.
RFLP atlikimo metodika paremta restrikcijos fragmentų ilgio polimorfizmu iš žiuželinio – flaA - geno, yra gana paprastai atliekama ir pasižymi didele diskriminacine galia (Parisi ir kt., 2007).
C. jejuni rūšis yra dažnai randama pas galvijus (Horrocks ir kt., 2008). Galvijai ir jų produktai yra siejami su protrūkiais ir pavieniais susirgimo atvejais, kuriuos daugiausiai lemia nepasterizuoto pieno, jautienos bei jos produktų ir paviršinio vandens vartojimas, kuris dažnai būna užterštas nuotekomis iš galvijų ganyklų (Nielsen, 2002). D÷l įvairesnių aplinkos šaltinių poveikio ir kontakto su aplinkoje esančiomis išmatomis užsikr÷timo galimyb÷ ganiavos metu padid÷ja (Oporto ir kt., 2007).
Tarp skirtingų amžiaus grupių buvo rasta reikšmingų skirtumų, susijusių su kampilobakterijų paplitimu ir ekskrecija bei padermių įvairove. Jaunesni gyvuliai - telyčios ir veršeliai - yra didesnis C. jejuni rezervuaras, nei vyresni gyvuliai. Atliktais tyrimais, Nielsen (2002) nustat÷, jog pas jaunus gyvulius kampilobakterijų paplitimas ir koncentracija išmatose būna dvigubai didesn÷ nei pas karves. Nustatyta, jog su amžiumi susijusi paplitimo įtaka yra didel÷. Atrodo, jog veršeliai palaipsniui tapo kolonizuoti C. jejuni per pirmuosius keturis m÷nesius po gimimo.
Naujagimiai veršeliai horizontaliu užsikr÷timo keliu iš ūkio aplinkos gali užsikr÷sti kampilobakterijomis. Visą laiką tur÷dami kontaktą su guoliaviete, vargu ar jauni veršeliai gali išvengti pakartotino užsikr÷timo plintančio per užterštą maistą ar vandenį, ar nuo jų pačių suteršto išmatomis kailio. Atlikti tyrimai su veršeliais parod÷, jog n÷ vienas gimęs veršelis kampilobakterijų netur÷jo, bet prad÷jo išskirti pra÷jus keturioms dienoms nuo gimimo. 1-2 m÷nesių amžiaus veršelių išmatų m÷giniuose jau randami dideli kiekiai bakterijų. Iš kai kurių veršelių m÷giniai buvo imami iki 7 m÷nesių amžiaus, ir išskirtų bakterijų kiekio vidurkis buvo panašus į iš pieninių galvijų išskiriamų bakterijų skaičių.
Kas keisčiausiai, jog pas 30-60 dienų amžiaus veršelius randamas toks pats bakterijų kiekis kaip ir pas 40 dienų amžiaus broilerius prieš skerdyklą (Stanley ir Jones, 2003).
30 Labai ryškiai dominuojančio genotipo nepasitaik÷. Bet pas vyresnius galvijus randama įvairesnių genotipų. Nors nešiotojų mastas ir kolonizacijos lygis su amžiumi maž÷ja, pas vyresnius gyvulius randamas didesnis įvairesnių serotipų paplitimas.
Be to, tie patys C. jejuni klonai, nustatyti keletu genotipavimo metodų, buvo rasto tiek pas galvijus, tiek pas žmones. Tai rodo, jog galvijai gali būti svarbus žmonių infekcijos rezervuaras (Nielsen, 2002). Tod÷l žinios apie C. jejuni genotipų paplitimą, jų plitimo dinamiką tarp galvijų ūkių ir taip pat ūkio viduje tarp skirtingo amžiaus galvijų yra svarbios siekiant suprasti šių mikroorganizmų ekologiją ir pritaikyti geresnius kontrol÷s metodus. O vienas iš efektyviausių būdų kontroliuoti žmonių susirgimų kampilobakterioze skaičių yra mažinti C. jejuni paplitimą galvijų ūkiuose (Oporto ir kt., 2007).
Įvairūs kampilobkaterijų protrūkiai ir sezonins suaktyv÷jimas buvo dažniau pranešamas šiltaisiais metų m÷nesiais (Horrocks ir kt., 2008). Renkant ir tiriant per metus (kiekvieną m÷nesį) galvijų išmatų m÷ginius 97-100% galvijų buvo nustatomi kaip kampilobakerijos nešiotojai, bet sausį (80%), balandį (53%), rugs÷jį (70%) ir lapkritį (80%) šie skaičiai buvo skirtingi. Visi naujagimiai veršeliai buvo laisvi nuo kampilobakterijų, bet nuo 4 dienų amžiaus dauguma jas jau ima išskirti. Galvijai gali platinti kampilobakterijas intermituojančiai visą savo gyvenimą. (Stanley ir Jones, 2003).
Kampilobakterijos, kaip ir dauguma kitų zoonozių bakterijų, gali migruoti tarp šeimininkų ir d÷l šios priežasties visiškai atskirti genotipus yra mažai tik÷tina. Be to, neseniai atlikti tyrimai rodo, jog šeimininko ekologija gali tur÷ti didelį poveikį šių organizmų tolimesnei raidai ir buvo pasiūlyta, jog žem÷s ūkio aplinkoje esančių kampilobakterijų rekombinacijos veda į C. jejuni ir C. coli rūšių supanaš÷jimą (Sheppard ir kt., 2009).
31
Išvados
Campylobacter jejuni yra dažnai pas galvijus randama rūšis;
Jauni veršeliai išskiria daug didesnį kampilobakterijų skaičių nei vyresni gyvuliai;
Pas vyresnius galvijus randama daugiau ir įvairesnių genotipų;
Labai ryškiai dominuojančio genotipo šio tyrimo metu nepasitaik÷, bet pastebima didel÷ genotipų įvairov÷.
32
LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Anoniminis, 2010. The Community Summary Report on trends and sources of zoonoses, zoonotic agents and food-borne outbreaks in the European Union in 2008. The EFSA Journal 1496, 124-127.
2. Berry, E.D., Wells, J.E., Archibeque, S.L., Ferrell, C.L., Freetly, H.C. and Miller, D.N.. Influence of genotype and die ton steer performance, manure odor, and carriage of pathogenic and other fecal bacteria. II. Pathogenic and other fecal bacteria. Journal of Animal Science. 2006.
3. Bessell, P.R., Rotariu, O., Innocent, G.T., Smith-Palmer, A., Strachan, N.JC., Forbes, K.J., Cowden, J.M., Reid, S.W.J. and Matthews, L.. Using sequence data to identify alternative routes and risk of infection: a case-study of Campylobacter in Scotland. BMC Infectious Diseases. 2012.
4. Blaser, M.J.. Epidemiologic and clinical features of Campylobacter jejuni infections. The Journal of infectious disease. Vol. 176. Nashville, Tennessee. 1997.
5. Boer, P., Wagennar, J.A., Achterberg, R.P., Putten, J.P.M., Schouls, L.M., Duim, B.. Generation of Campylobacter jejuni genetic diversity in vivo. Molecular Microbiology. 2002.
6. Colles, F.M., Jones, K., Harding, R.M. and Maideen, M.C.J.. Genetic Diversity of Campylobacter jejuni Isolates from Farm Animals and the Farm Environment. Applied and Environmental Microbiology. Vol. 69, No. 12. 2003.
7. Eberle, K.N. and Kiess, A.S.. Phenotypic and genotypic methods for typing Campylobacter jejuni and Campylobacter coli in poultry. Poultry Science Association Inc.. 91:255-264. 2012.
8. Forsythe, S.J., Hayes, P.R.. Food hygiene, microbiology and HACCP. Aspen Publisher, Inc.. Gaithersburg, Maryland. 1988.
9. French, N.F., Barrigas, M., Brown, P., Ribiero, P., Williams, N., Leatherbarrow, H., Birtles, R., Bolton, E., Fearnhead, P. and Fox, A.. Spatial epidemiology and natural population structure of Campylobacter jejuni colonizing a farmland ecosystem. Environmental Microbiology, Vol. 7, Issue 8. P.1116-1126. 2005.
10. French, N.P., Midwinter, A., Holland, B., Collins-Emerson, J., Pattison, R., Colles, F. and Carter, P.. Molecular Epidemiology of Campylobacter jejuni Isolates from Wild-Bird Fecal Material in Children‘s Playgrounds. Applied and Environmental Microbiology. 2009.
33 11. Gillespie, I.A., O‘Brien, S.J., Frost, J.A., Adak, G.K., Horby, P., Swan, A.V., Painter, M.J., Neal, K.R. and the Campylobacter Sentinel Surveillance System Colloborators. Emerging infectious diseases. 2002.
12. Gonzalez, M., Hakkinen, M., Rautelin, H. and Hānninen, M.L.. Bovine Campylobacter jejuni Strains Differ from Human and Chicken Strains in an Analysis of Certain Molecular Genetic Markers. Applied and Environmental Microbiology. 2008.
13. Hakkinen., M., Heiska, H. and Hānninen M.L.. Prevalence of Campylobacter spp. in Cattle in Finland and Animicrobial Susceptibilities of Bovine Campylobacter jejuni Strains. Applied and Environmental Microbiology. Vol. 73, No. 10. 2007.
14. Hannon, S.J., Taboada, E.N., Russell, M.L., Allan, B., Waldner, C., Wilson, H.L., Potter, A., Babiuk, L., Townsend, H.G.G.. Genomics - Based molecular epidemiology of Campylobacter jejuni isolates from feedlot cattle and from people in Alberta, Canada. Journal of clinical microbiology. 2008.
15. Harrington, C.S., Moran, L., Ridley, A.M., Newell, D.G. and Madden, R.H.. Interlaboratory evaluation of three flagellin PCR/RFLP methods for typing Campylobacter jejuni and C. coli: the CAMPYNET experience. Journal of Applied Microbiology 95, 1321-1333. 2003.
16. Hazard identification, exposure assessment and hazard characterization of Campylobacter spp. in broiler chickens and Vibrio spp. in seafood, Food and Agriculture organization of the United Nations, Switzerland, 2001.
17. Horrocks, S.M., Anderson, R.C., Nisbet, D.J. and Rickie, S.C.. Incidence and ecology of Campylobacter jejuni and coli in animals. Food microbiology. Anaerobe. 2008.
18. Humphrey, T., O‘Brien, S. and Madsen, M.. Campylobacters as zoonotic pathgens: a food production perspective. International Journal of Food Microbiology. 2007.
19. Inglis, G.D., Kalischuk, L.D., Busz, H.W. and Kastelic, J.P.. Colonization of Cattle Intestines by Campylobacter jejuni and Campylobacter lanienae. Applied and Environmental Microbiology. Vol. 71, No. 9. 2005.
20. Kwan, P.S.L., Barrigas, M., Bolton, F.J., French, N.P., Gowland, P., Kemp, R., Leatherbarrow, H., Upton M. and Fox, A.J.. Molecular Epidemiology of Campylobacter jejuni Populations in Dairy Cattle, Wildlife and the Environmental in a Farmland Area. Applied and Environmental Microbiology. Vol. 74, No.16. 2008.
34 21. Kwan, P.S.L., Birtles, A., Bolton, F.J., French, N.P., Robinson, S.E., Newbold, L.S., Upton, M. and Fox, A.J.. Longitudinal Study of he Molecular Epidemiology of Campylobacter jejuni in Cattle on Dairy Farms. Applied and Environmental Microbiology. Vol. 74, No. 12. 2008.
22. Kudirkien÷ E., Bunevičien÷ J., BrØndsted L., Ingmer H., Olsen J.E., Malakauskas M.. Evidence of broiler meat contamination with post-disinfection strains of Campylobacter jejuni from slaughterhouse,. International Journal of Food Microbiology. 2010.
23. McCarthy, N.D., Colles, F.M., Dingle, K.E., Bagnall, M.C., Manning, G., Maiden, M.C.J. and Falush, D.. Host-associated Genetic Import in Campylobacter jejuni. Emerging Infectious Diseases. Vol.13, No.2. 2007.
24. Mexia R.. A case-cohort study of domestic campylobacter infections Norway 2010-11, Norwegian institute of Public health, 2011.
25. Moore, J.E., Corcoran, D., Dooley, J.S.G., Fanning, S., Lucey, B., Matsuda, M., McDowell, D.A., Mégraud, F., Millar, B.C., O’Mahony, R., O’Riordan, L., O’Rourke, M., Rao, J.R., Rooney, P.J., Sails, A. and Whyte, P.. Veterinary research. Campylobacter. A Journal on Animal Infection. Vol. 36, No. 3. 2005.
26. Narkevičiūt÷ I., Petraitien÷ S., ir Pažemeckien÷ A.. Ūmios bakterin÷s žarnyno infekcijos ir ilgalaik÷s jų pasekm÷s. Sveikatos mokslai. Vilnius. 2002’3. P.30-33.
27. Nielsen, E.M.. Occurrence and strain diversity of thermophilic campylobacters in cattle of different age groups in dairy herds. Letters in Applied Microbiology. 2002.
28. OIE Terrestrial Manual. Chapter 2.9.3. Campylobacter jejuni and Campylobacter coli. Manual of Diagnostic Tests and Vaccinesfor Terrestrial Animals 2009
29. Oporto, B., Esteban, J.I., Aduriz, G., Juste, R.A. and Hurtado, A.. Prevalence and strain diversity of thermophilic campylobacters in cattle, sheep and swine farms. Journal of Applied Microbiology, Vol.103, Issue 4, P.977-984. 2007.
30. Parisi, A., Lanzilotta, S.G., Addante, N., Normanno, G., Modugno, G.D., Dambrosio, A. and Montagna, C.O.. Prevalence, Molecular Characterization and Antimicrobial Resistance of Thermophilic Campylobacter Isolates from Cattle, Hens, Broilera and Broiler Meat in South-eastern Italy. Veterinary Research Communications. 2007.
31. Pond, K.. Water recreation and disease, Plausibility of associated infections:acute effects, sequelae and mortality. World Health Organization. 2005.
35 32. Ragimbeau, C., Schneider, F., Losch, S., Even, J. And Mossong, J.. Multilocus Sequence Typing, Pulsed-Field Gel Electrophoresis, and fla Short Variable Region Typing of Clonal Complexes of Campylobacter jejuni Strains of Human, Bovine and Poultry Origins in Luxembourg. Applied and Environmental Microbiology. Vol.74, No.24. 2008.
33. Ross, S.. Development of Comparative Genomic Fingerprinting for Molecular Epidemiological Studies of Campylobacter jejuni. Bachelor of Science, University Of Lethbridge. 2006.
34. Rotariu, O., Dallas, J.F., Ogden, I.D., MacRae, M., Sheppard, S.K., Maiden, M.C.J., Gormley, F.J., Forbes, K.J. and Strachan, N.J.C.. Spatiotemporal Homogeneity of Campylobacter Subtypes from Cattle and Sheep across Northeastern and Southwestern Scotland. Applied and Environmental Microbiolgy. Vol. 75, No. 19. 2009.
35. Sheppard, S.K., Dallas, J.F., MacRae, M., McCarthy, N.D., Sproston, E.L., Gormley, F.J., Strachan, N.J.C., Ogden, I.D., Maiden, M.C.J. and Forbes, K.J.. Campylobacter genotypes from food animals, environmental sources and clinical disease in Scotland 2005/6. International Journal of Food Microbiology. 2009.
36. Sproston, E.L., Ogden, I.D., MacRae, M., Dallas, J.F., Sheppard, S.K., Cody, A.J., Colles, F.M., Wilson, M.J., Forbes, K.J. and Strachan, N.J.C.. Temporal Variation and Host Association in the Campylobacter Population in a Longitudinal Ruminant Farm Study. Applied and Environmental Microbiology. Vol. 77, No. 18. 2011.
37. Stanley, K.N., Wallace, J.S., Currie, J.E., Diggle, P.J. and Jones, K.. The seasonal variation of thermophilic campylobacters in beef cattle, dairy cattle and calves. Journal of Applied Microbiology. Vol. 85, Issue 3. 2002.
38. Stanley, K. and Jones, K.. Cattle and sheep farms as reservoirs of Campylobacter. Journal of Applied Microbiology, Vol. 94, 104S-113S. 2003.
39. Wassenaar, T.M. and Newell, D.G.. Genotyping of Campylobacter spp.. Applied and Environmental Microbiology. Vol. 66, No.1. 2000.
40. Weisent J., Rohrbach B., Dunn J.R., Odoi A., Detection of high risk campylobacteriosis clusters at three geographic levels. Geospatial Health 6(1), 2011.
41. World Health Organization Food and Agriculture Organization of the United Nations, Risk assessment of Campylobacter spp. In brioler chikens technical report, Microbiological risk assessment series, 2009.
36 42. World Health Organization. Water Recreation and Disease. Plausibility of Associated Infections: Acute Effects, Sequelae and Mortality by Kathy Pond. Published by IWA Publishing, London, UK, 2005.
43. Nacionalinis Maisto ir Veterinarijos Rizikos vertinimo institutas. Kampilobakterioz÷. http://www.nmvrvi.lt/lt/zoonozes/kampilobakterioze/. Prieiga per internetą 2012-12-07
44. World Health Organization Media Center, Fact sheet N°255, October 2011: Campylobacter.
http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs255/en/index.html. Prieiga per internetą
2012-12-08
45. The Merck Veterinary Manual. Home: Digestive System: Campylobacteriosis: introduction. http://www.merckvetmanual.com/mvm/index.jsp?cfile=htm/bc/20700.htm&word=campylobact eriosis.Prieiga per internetą 2012-12-09
46. European Food Safety Authority. Home: Topics A-Z: Zoonotic diseases: Food-borne zoonotic diseases: Campylobacter. http://www.efsa.europa.eu/en/topics/topic/campylobacter.htm. Prieiga per internetą 2012-12-13
47. Wikipedia. The Free Encyclopedia. Campylobacter jejuni.
