TIKROJO MARGAINIO (SILYBUM MARIANUM L.) EKSTRAKTO VEIKLIŲJŲ MEDŢIAGŲ SKVARBOS Į ŢMOGAUS ODĄ TYRIMAS EX VIVO IR SKYSTŲ NEŠIKLIŲ ĮTAKOS SKVARBAI ĮVERTINIMAS

MEDICINOS AKADEMIJA FARMACIJOS FAKULTETAS KLINIKINĖS FARMACIJOS KATEDRA

RAMINTA VAIČIULEVIČIŪTĖ

TIKROJO MARGAINIO (SILYBUM MARIANUM L.) EKSTRAKTO

VEIKLIŲJŲ MEDŢIAGŲ SKVARBOS Į ŢMOGAUS ODĄ TYRIMAS

EX VIVO IR SKYSTŲ NEŠIKLIŲ ĮTAKOS SKVARBAI

ĮVERTINIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas Lekt. dr. Modestas Ţilius

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS KLINIKINĖS FARMACIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis Data

TIKROJO MARGAINIO (SILYBUM MARIANUM L.) EKSTRAKTO VEIKLIŲJŲ MEDŢIAGŲ SKVARBOS Į ŢMOGAUS ODĄ TYRIMAS EX VIVO IR SKYSTŲ NEŠIKLIŲ

ĮTAKOS SKVARBAI ĮVERTINIMAS Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas

Lekt. dr. Modestas Ţilius Data

Recenzentas Darbą atliko

Magistrantė

Raminta Vaičiulevičiūtė

Data Data

TURINYS

SANTRAUKA ... 5

SUMMARY ... 6

SANTRUMPOS ... 8

ĮVADAS ... 9

DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI ... 10

1. LITERATŪROS APŢVALGA ... 11

1.1. UV spinduliuotės sukeliami odos paţeidimai ... 11

1.2. Tikrojo margainio morfologiniai poţymiai ... 11

1.3. Tikrojo margainio cheminė sudėtis ... 12

1.4. Tikrojo margainio sausojo ekstrakto charakteristika ... 13

1.5. Tikrojo margainio junginių biologinis aktyvumas ... 14

1.6. Tikrojo margainio biologiškai aktyvių junginių analizės metodai ... 17

1.7. Tikrojo margainio produktų pritaikymo galimybės ... 20

2. TYRIMO METODIKA ... 23

2.1. Tyrimo medţiagos ir įranga ... 23

2.1.1. Naudotos medţiagos ... 23

2.1.2. Naudota įranga ... 23

2.2. Tyrimo metodai ... 24

2.2.1. Silimarino analizė ESC metodu ... 24

2.2.2. Silimarino tirpalų gamyba ... 25

2.2.3. Skystų silimarino nešiklių fizikinių savybių nustatymas ... 26

2.2.4. Silimarino junginių skvarbos į odą ex vivo tyrimai ... 26

2.2.5. Statistinis duomenų vertinimas ... 27

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 28

3.1. Silimarino analizė ESC metodu ... 28

3.1.1. Analizės metodo vystymas ... 28

3.2. Skystų silimarino nešiklių klampos ir pH vertinimas ... 31

3.3. Silimarino junginių skvarbos ex vivo vertinimas ... 32

3.3.1. Raginio sluoksnio įtakos silimarino junginių skvarbai vertinimas ... 32

3.3.2. Silimarino junginių skvarbos iš skirtingų nešiklių vertinimas ... 33

3.3.3. Skvarbos iš skirtingų nešiklių rezultatų apibendrinimas ... 37

4. IŠVADOS ... 42

5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 43

6. LITERATŪROS SĄRAŠAS... 44

SANTRAUKA

TIKROJO MARGAINIO (SILYBUM MARIANUM L.) EKSTRAKTO VEIKLIŲJŲ MEDŢIAGŲ SKVARBOS Į ŢMOGAUS ODĄ TYRIMAS EX VIVO IR SKYSTŲ NEŠIKLIŲ

ĮTAKOS SKVARBAI ĮVERTINIMAS

R. Vaičiulevičiūtės magistro baigiamasis darbas/ mokslinis vadovas lekt. dr. Modestas Ţilius; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmacijos fakulteto Klinikinės farmacijos katedra. – Kaunas.

Darbo tikslas: ištirti ir įvertinti skystų nešiklių įtaką tikrojo margainio ekstrakto veikliųjų junginių skvarbai į ţmogaus odą ex vivo.

Darbo uţdaviniai: Parinkti, išvystyti ir validuoti tikrojo margainio veikliosioms medţiagoms kiekybinės analizės metodiką; parinkti skirtingus skystus nešiklius ir/ar sumodeliuoti jų mišinius su tikrojo margainio ekstraktu, įvertinant jų kokybę (pH, klampą); ištirti tikrojo margainio veikliųjų medţiagų skvarbą į ţmogaus odą iš skystų nešiklių ir jų mišinių ir palyginti gautus rezultatus; įvertinti tikrojo margainio veikliųjų medţiagų pasiskirstymą odos sluoksniuose.

Metodai: Silimarino junginių kokybiniam ir kiekybiniam įvertinimui nešikliuose ir odos ekstraktuose naudotas validuotas ESC metodas. Skvarbos į ţmogaus odą tyrimas ex vivo atliktas naudojant Bronaugh tipo pratakias difuzines celes. Skystų nešiklių klampa matuota kambario temperatūroje, naudojant vibracinį viskozimetrą, o pH reikšmė nustatyta naudojant pH-metrą.

Rezultatai: Parinktų nešiklių klampos reikšmės buvo 0,75–2,08 mPas, o pH 4,01–5,23. Rezultatai parodė, kad nešikliai lemia skirtingą silimarino junginių skvarbą į odą. Didţiausias bendras silimarino junginių kiekis į odą įsiskverbė iš 5 proc. propilenglikolio tirpalo (6,98 ± 1,70 proc.), iš kitų nešiklių – nuo 0,10 ± 0,02 iki 4,67 ± 0,68 proc. Iš propilenglikolio ir glicerolio mišinio į odą įsiskverbė 3,33 ± 0,38 proc. silimarino junginių, o iš propilenglikolio ir polietilenglikolio-400 mišinio – 1,46 ± 0,16 proc. Atlikta koreliacinė analizė parodė, kad skvarba didėja maţėjant klampai (r = -0,577, p < 0,05) ir didėjant pH (r = 0,459, p < 0,05). Epidermyje susikaupė iki 6,7 proc. bendro silimarino junginių kiekio, o į dermą pateko iki 1,2 proc.

SUMMARY

THE ASSAY OF MILK THISTLE (SILYBUM MARIANUM L.) EXTRACT ACTIVE COMPOUNDS PENETRATION INTO THE HUMAN SKIN EX VIVO AND INFLUENCE OF

LIQUID VEHICLES EVALUATION

R. Vaičiulevičiūtės final thesis for master‘s degree/ scientific supervisor lect. dr. Modestas Ţilius; Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, department of Clinical Pharmacy. – Kaunas.

The aim of work: to analyze and evaluate the influence of liquid vehicles to penetration of milk thistle extract active compounds into the human skin.

Main tasks: to choose, develope and validate a quantative analysis method for milk thistle active compounds; choose different liquid vehicles and/or their mixtures and to model their mixtures with milk thistle extract, evaluating their quality (pH, viscosity); evaluate penetration of milk thistle active compounds into the human skin from liquid vehicles and their mixtures and compare obtained results; evaluate repartition of milk thistle active compounds in skin layers.

Methods: The validated HPLC method was used to identify and to quantify silymarin compounds. The skin permeation study ex vivo was performed using Bronaugh type flow-through diffusion cells with full-thickness human skin. Viscosity of liquid vehicles was measured in room temperature by vibro viscosimeter and pH was measured by pH-meter.

Results: Viscosity of chosen liquid vehicles was 0,75–2,08 mPas, and pH was 4,01–5,23. The results showed, that vehicles determine different penetration of silymarin compounds into the human skin. The largest amount of total silymarin compounds penetrated into human skin from 5 percents propylene glycol aqueous solution (6,98 ± 1,70 percents), from other vehicles – from 0,10 ± 0,02 to 4,67 ± 0,68 percents. From mixture of propylene glycol and glycerol 3,33 ± 0,38 percent of silymarin compounds penetrated into skin, and from mixture of propylene glycol and polyethylene glycol 400 - 1,46 ± 0,16 percents penetrated into skin. Correlative analysis showed, that penetration increases when viscosity decreases (r = -0,577, p < 0,05) and when pH increases (r = 0,459, p < 0,05). Up to 6,7 percents of total amount of silymarin compounds accumulated in epidermis and only 1,2 percents passed to dermis.

PADĖKA

SANTRUMPOS

UV spinduliuotė – ultravioletinė spinduliuotė ESC – efektyvioji skysčių chromatografija

DPPH – 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo radikalas (angl. 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl radical) BMR – branduolių magnetinis rezonansas

MS – masių spektrometrija PEG - polietilenglikolis

ĮVADAS

Tikrojo margainio (Silybum marinaum L.) sausasis ekstraktas, dar vadinamas silimarinu, yra flavonoidų (taksifolino) ir lipofilinių flavonolignanų (silikristino, silidianino, silibino A ir B bei izosilibino A ir B) mišinys [1]. Medicinoje silimarinas ilgą laiką vartotas lėtinėms kepenų ligoms gydyti. Vėliau atlikti tyrimai, patvirtinantys teigiamą silimarino poveikį kepenų patologijų, tokių kaip suriebėjimo, fibrozės, karcinomos gydymui [2,3]. Silimarino junginiai dar pasiţymi priešuţdegiminiu, antioksidaciniu, priešvėţiniu poveikiu, todėl gali būti naudojami ir kitų patologijų, kurias sukėlė oksidacinis stresas ar uţdegimas, prevencijai ir gydymui [4–6].

Pastaraisiais dešimtmečiais didėjantis ultravioletinės (UV) spinduliuotės kiekis didina riziką susirgti odos ligomis, tokiomis kaip eritema, ar odos vėţys [7,8]. UV spinduliuotė didina uţdegiminių mediatorių gamybą bei aktyvina oksidacinį stresą. Tai skaitina priemonių, stabdančių oksidacinį stresą, paiešką. Silimarinas, kaip augalinis antioksidantas, pasiţymintis dar ir priešuţdegiminiu poveikiu gali būti naudojamas odos ligų prevencijai ir gydymui, teigiamas poveikis patvirtintas tyrimais in vitro, tačiau reikalinga atlikti daugiau tyrimų, įrodančių teigiamą poveikį odoje [9,10].

DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI

Tyrimo objektas: eksperimentiniai vandeniniai skysti nešikliai, į kuriuos įterptas etanolinis tikrojo margainio ekstraktas.

Darbo tikslas: ištirti ir įvertinti skystų nešiklių įtaką tikrojo margainio ekstrakto veikliųjų junginių skvarbai į ţmogaus odą ex vivo.

Darbo uţdaviniai:

1. Parinkti, išvystyti ir validuoti tikrojo margainio veikliosioms medţiagoms kiekybinės analizės metodiką;

2. Parinkti skirtingus skystus nešiklius ir/ar sumodeliuoti jų mišinius su tikrojo margainio ekstraktu, įvertinant jų kokybę (pH, klampą);

3. Ištirti tikrojo margainio veikliųjų medţiagų skvarbą į ţmogaus odą iš skystų nešiklių ir jų mišinių ir palyginti gautus rezultatus;

1. LITERATŪROS APŢVALGA

1.1. UV spinduliuotės sukeliami odos paţeidimai

Pastaraisiais dešimtmečiais dėl suplonėjusio ozono sluoksnio išaugo UV spinduliuotės kiekis, pasiekiantis Ţemės paviršių [8]. UV spinduliuotė yra pagrindinis išorinis veiksnys, lemiantis odos senėjimą ir odos vėţio rizikos atsiradimą, todėl susirgimų odos vėţiu skaičius nuolat didėja. 2012 metais daugiau nei 100000 naujų piktybinės melanomos atvejų diagnozuota Europoje, daugiausiai atvejų nustatyta Šveicarijoje, Danijoje, Norvegijoje, Olandijoje [12]. Tiesiogiai veikdama UV spinduliuotė didina laisvųjų radikalų (superoksido anijono, singletinio deguonies, hidroksilradikalo ir kt.) kiekį ląstelėse. Šių radikalų kiekį reguliuoja endogeniniai fermentai – superoksido dismutazė, glutationo peroksidazė ir kiti. Tačiau sutrikus šių radikalų pusiausvyrai ir ţenkliai padidėjus jų kiekiui ląstelėse prasideda patologiniai procesai, pavyzdţiui, oksidacinis stresas [13]. Tiriant įvairių ligų patogenezę, nustatyta laisvųjų deguonies ir azoto radikalų svarba kai kurių ūminių ir lėtinių ligų atsiradimui, įskaitant ir natūralius senėjimo procesus [14]. Laisvieji deguonies ir azoto radikalai reaguoja su ląstelių DNR ir sukelia vienos ar abiejų grandinių nutrūkimą, oksiduoja purino ar pirimidino bazes, sukelia ląstelių membranų lipidų peroksidaciją, dėl ko įvyksta ląstelės nekrozė [15]. UV spinduliuotė tiesiogiai veikdama gali aktyvinti kaspazę-3 arba sukelti fosforilinto p53 geno kiekio padidėjimą. Šios ląstelių paţaidos lemia odos senėjimą bei tokių ligų kaip odos vėţio atsiradimo riziką [16,17]. Norint apsaugoti odos ląsteles nuo šių procesų galima naudoti augalinius ar sintetinius antioksidantus. Vienas iš galimų natūralių antioksidantų – tikrojo margainio ekstraktas [18].

1.2. Tikrojo margainio morfologiniai poţymiai

Tikrasis margainis (Silybum Marianum L. Gaertner) – astrinių (Asteraceae) šeimos augalas, kilęs iš Šiaurės Afrikos, Maţosios Azijos ir pietų Europos ir šiuo metu auginamas Šiaurės ir Pietų Amerikoje, Australijoje, Kinijoje ir Centrinėje Europoje [19,20]. Tikrojo margainio sinonimai:

Carduus marianus L., Carthamus maculatum Lam., Cirsium maculatum Scop., Mariana mariana (L.)

Tikrojo margainio farmakopėjinė ţaliava – subrendę vaisiai, be skristuko (Silybi mariani

fructus). Ţaliavos pavadinimo sinonimai: St. Mary‘s Thistle Fruit, Cardui mariae fructus. Europos

Farmakopėjoje nurodoma, jog vaisiai turi būti pailgai ovalūs, maţdaug 6-8 mm ilgio, 3 mm pločio ir 1,5 mm storio. Išorinis paviršius pilkas arba rusvas, lygus, blizgantis su pilkais arba rudais dryţiais. Vaisius prie pagrindo nusmailėja, viršūnėje yra karūnėlė. Skersai perpjovus matosi plonas rudas išorinis sluoksnis, gaubiantis dvi dideles, baltas sėklaskiltes. Ţaliavos kvapas vos jaučiamas, skonis kartus. Pagal Europos Farmakopėją tikrojo margainio vaisiams turi būti nustatomas nuodţiūvis ir bendras pelenų kiekis. Nuodţiūvis negali viršyti 8,0 proc. nustatant iš 1,000 g susmulkintos į miltelius ţaliavos, dţiovinus 105°C temperatūroje 2 valandas. Bendras pelenų kiekis taip pat negali viršyti 8,0 proc. [19,21]. Pasaulio sveikatos organizacijos (PSO) monografijose dar nurodyti šie grynumo testai: mikrobinės taršos, rūgštyje netirpių pelenų, vandenyje tirpių ekstraktyvų, pesticidų likučių, sunkiųjų metalų bei radioaktyvių likučių [20].

1.3. Tikrojo margainio cheminė sudėtis

Pagal Europos Farmakopėjos reikalavimus subrendusiuose margainio vaisiuose turi būti ne maţiau negu 1,5 proc. silimarino [21]. Silimariną sudaro šeši pagrindiniai flavonolignanai: silibinas A, silibinas B, silikristinas, silidianinas, izosilibinas A, izosilibinas B, ir flavonoidas taksifolinas. Visi šeši flavonolignanai turi vienodą molekulinę masę (482,4 Da) [22]. Pagrindinis aktyvus silimarino junginys yra silibinas [19]. Tikrojo margainio komponentų kiekybinė ir kokybinė sudėtis priklauso nuo augalo kultivavimo sąlygų. Naujojoje Zelandijoje atlikto tyrimo metu palyginta silimarino sudėtis ir kiekis skirtingu metu pasėjus augalą bei palyginta aktyvių medţiagų kiekis skirtingose augalo dalyse. Nustatyta, jog sėjos metas turi įtakos tik kiekybinei silimarino sudėčiai. Didesnės silimarino kiekio ribos nustatytos natūraliai gamtoje augančiuose augaluose, o kultivuojamuose augaluose nustatyti maţesni silimarino kiekiai. Kokybinė sudėtis skyrėsi neţymiai. Didţiausias bendro silimarino kiekis nustatytas tikrojo margainio vaisiuose. Silimarino junginių nenustatyta margainio stiebuose ir lapuose, o lyginant atskirų junginių kiekius nustatyta, kad šaknyse ir ţieduose yra tik silikristino ir silibino B, o sėklose silidianinas sudarė daugiau negu 30 proc. viso ekstrakto. Silimarino kiekis didėjo sėklų brendimo metu [23].

Tikrojo margainio kokybinės ir kiekybinės sudėties tyrimai parodė, kad pagrindinis tikrojojo margainio komponentas silimarinas yra flavonolignanų ir flavonoidų mišinys, daugiausiai yra šių junginių: silibino A ir B, izosilibino A ir B, silikristino, silidianino ir taksifolino. Riebalų rūgštys taip yra svarbi augalo junginių grupė. Didţiausias kiekis aktyvių tikrojo margainio junginių randamas augalo vaisiuje, maţesni kiekiai kitose augalo dalyse – šaknyse, stiebuose, lapuose. Tikrojo margainio cheminė sudėtis svarbi tolesniam augalo pritaikymui farmacijoje.

1.4. Tikrojo margainio sausojo ekstrakto charakteristika

Iš tikrojo margainio sėklų gaunamas sausasis ekstraktas, kurį sudaro įvairūs flavonolio dariniai, o jų visuma vadinama silimarinu. Ekstrakte taip pat yra flavonoidų, riebalų rūgščių ir sterolų (daugiausia β-sterolo) [19]. Sausasis ekstraktas – tai kietas preparatas, gautas išgarinus tirpiklį, kuris naudojamas jo paruošimui. Standartizuoti ekstraktai yra naudojami terapiniais tikslais, nustatant sudėtinių medţiagų kiekį. Sausieji ekstraktai paprastai turi nuodţiūvį ar vandens kiekį ne didesnį kaip 5 proc. m/m. Jiems atliekami drėgmės kiekio nustatymo, nuodţiūvio ir tirpiklio likučio testai. Ekstraktams gaminti daţniausiai naudojamas etanolis [21]. Margainio sausasis ekstraktas – tai gelsvai rudi, amorfiniai milteliai, gaunami iš tikrojo margainio sėklų, naudojant etilacetatą, acetoną, etanolį, metanolį arba jų mišinius su vandeniu metanolio. Europos Farmakopėja nurodo, kad silimarino kiekis sausajame ekstrakte turi sudaryti nuo 30 iki 65 proc. ekstrakto svorio. Silimarino kiekis išreiškiamas silibino kiekiu. Kitos silimarino sudedamosios dalys taip pat turi atitikti tam tikrus reikalavimus – silikristino ir silidianino suma turi sudaryti nuo 20 iki 45 proc., viso silimarino kiekio, silibino A ir silibino B suma – nuo 40 iki 65 proc., izosilibino A ir izosilibino B – nuo 10 iki 20 proc. [21].

laikas, temperatūra. Rezultatai parodė, kad didţiausias fenolinių junginių kiekis gaunamas po 3 valandų ekstrakcijos 95% etanoliu 50°C temperatūroje [28].

Apibendrinus galima teigti, kad ekstrakcijos būdu naudojant organinius tirpiklius (metanolį, etanolį ar acetonitrilą) iš sėklų gaunamas tikrojo margainio aktyvių junginių kompleksas – silimarinas, kuris gali būti vartojamas terapiniams tikslams, suteikus jam farmacinę formą.

1.5. Tikrojo margainio junginių biologinis aktyvumas

Silimarinas yra natūralus augalinis antioksidantas, galintis apsaugoti ląsteles nuo ţalingo laisvųjų radikalų poveikio. Antioksidacinio poveikio tyrimai atlikti tiek su silimarinu, tiek su jo komponentu silibinu [18,29,30]. Silibino antioksidacinis poveikis aiškintas gebėjimu slopinti laisvųjų radikalų (reaktyvios deguonies ar azoto formos) susidarymą [22].Skirtingo tikrojo margainio fenotipo antioksidacinis aktyvumas skiriasi – tyrimo metu nustatyta, kad rausvai ţydinčio augalo sėklos pasiţymi didesniu antioksidaciniu aktyvumu negu baltai ţydinčio augalo sėklos. Antioksidacinis aktyvumas vertintas 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo (DPPH) antiradikalinio aktyvumo nustatymo metodu. Taip pat stebėtas ir palygintas ir kitų skirtingų fenotipų augalo dalių antioksidacinis aktyvumas. Nustatyta, kad tiek jauni, tiek subrendę lapai bei šaknys didesnį aktyvumą turėjo to augalo, kuris ţydi baltai, o stiebų aktyvumas buvo panašus. Didţiausiu aktyvumu pasiţymėjo abiejų augalų sėklos ir stiebai, kurie gali būti vartojami kaip augaliniai antioksidantai [31]. Antioksidacinės silimarino savybės palygintos su kitų natūralių bei sintetinių antioksidantų savybėmis. Įvairių tyrimų rezultatai ir išvados pateiktos 1 lentelėje.

Silimarino antioksidacinio poveikio priklausomybė nuo koncentracijos tirta Cu2+ sukeltos plazmos oksidacijos slopinimo analizės metu. Nustatyta, kad didėjant koncentracijai, didėja vario jonų sukeltas konjuguotų alkadienų susidarymas ţmogaus plazmoje 0,01-1,0 mg/ml silimarino ekstrakto koncentracijos ribose [4].

1 lentelė. Silimarino ir kitų antioksidantų palyginimas

Lyginami junginiai

Tyrimas Išvados Literatūros

šaltinis Silimarinas ir

vitaminas E

Tiriamas fenitoino sukeltą oksidacinį stresą maţinantis poveikis, kuris vertinamas pagal ţiurkių jauniklių, turinčų vilko gomurį, kiekį.

Vitaminas E turėjo neţymiai didesnį antioksidacinį poveikį uţ silimariną.

[33]

Silimarinas ir vitaminas E

Tiriamas anglies tetrachlorido sukeltą oksidacinį stresą ţiurkių kepenims ir inkstams maţinantis poveikis. Rezultatai vertinami pagal glutationo ir lipidų peroksidacijos kiekius, katalazės aktyvumą.

Silimarinas pasiţymėjo stipresniu antioksidaciniu poveikiu negu vitaminas E. [34] Tikrasis margainis (Silybum marianum) ir saldţioji ceratonija (Ceratonia siliqua)

Tiriamas antioksidacinis poveikis nesočiosioms riebalų rūgštims. Poveikis vertinamas pagal lipidų peroksidacijos lygį ir DPPH

antiradikalinio aktyvumo tyrimo metu.

Abu augalai pasiţymi stipriomis antioksidacinėmis savybėmis, tarp jų skirtumas statistiškai nereikšmingas.

[35]

Silimarinas ir β-karotenas

Tiriamas L-arginino sukeltas oksidacinis stresas sveiko ţmogaus limfocitams.

Abiejų junginių antioksidacinis poveikis panašus, abiejų junginių kombinacija taip pat duoda tokį patį poveikį kaip naudojant vieną iš jų. [36] Silimarinas ir ţalioji arbata, vitaminas C, vitaminas E bei butilintas hidroksitoluenas (BHT)

Antioksidacinis aktyvumas nustatytas 4 metodais:

Geleţies redukcijos jėgos (FRAP, angl. Ferric reducing power) metodas bendram antioksidaciniam poveikiui nustatyti, DPPH antiradikalinio aktyvumo nustatymas, peroksidų radikalų sukeltos eritrocitų hemolizės inhibavimo poveikio bei Cu2+ sukeltos plazmos oksidacijos slopinimo poveikio nustatymas.

Silimarinas pasiţymėjo maţiausiu bendru antioksidaciniu aktyvumu, poveikiu DPPH radikalams, tačiau peroksidų radikalų sukeltą hemolizę maţino efektyviau nei ţalioji arbata ir BHT. [4] Silimarinas ir askorbo rūgštis, galo ir tanino rūgštys

DPPH antiradikalinio tyrimo būdu įvertintas antioksidacinis junginių aktyvumas.

Silimarino antioksidacinis poveikis buvo maţesnis nei kitų junginių.

[37]

Silimarinas ir N-acetil-L-cisteinas

MGMT (O6-metilguanino DNR metiltransferazės) kiekio tyrimas

Silimarinas efektyvus maţinti DNR paţaidų kiekį didindamas MGMT aktyvumą, nes nors jo aktyvumas maţesnis nei sintetinių antioksidantų, tačiau tolygesnis.

[38]

Įvairių tyrimų metu įrodytas silimarino antioksidacinis poveikis odos ląstelėms. Silimarino poveikis slopinti H2O2 gaminamų reaktyvių deguonies formų susidarymą odoje įrodytas tėkmės

citometriniu metodu nustatyta, kad odoje, kuri paveikta UV spinduliuote, pagrindinis oksidacinio steso šaltinis buvo CD11b+ ląstelės. Šios ląstelės buvo peroksido radikalų šaltinis. Tyrimu įrodytas silimarino poveikis slopinti H2O2 generuojamų laisvųjų radikalų susidarymą [39].

Silimarinas taip pat gali maţinti oksidacinį stresą slopindamas CD11b+ ląstelių bei leukocitų infiltraciją tiek epidermio, tiek dermos ląstelėse. Mieloperoksidazė naudota kaip leukocitų infiltracijos rodiklis epidermyje ir dermoje, lyginti jos kiekiai UV paveiktuose ir nepaveiktuose odos sluoksniuose. Rezultatai patvirtino, kad ţymiai didesni mieloperoksidazės kiekiai rasti UV paveiktame epidermyje ir dermoje. Tyrimo metu lygintas silimarino poveikis leukocitų infiltracijai naudojant jį ant odos prieš ir paveikus UV spinduliuote. Ši tyrimo dalis parodė, jog naudojant silimariną tiek prieš, tiek po UV spinduliuotės ţymiai sumaţinamas mieloperoksidazės kiekis, o tai reiškia, kad odoje yra maţiau uţdegimą sukeliančių leukocitų [40]. Atlikta nemaţai tyrimų siekiant nustatyti silimarino poveikį UV spinduliuotės paţeistoms ląstelėms. Vienas iš galimų mechanizmų - ciklobutano pirimidino dimerų kiekio maţinimas in vitro. Tyrimui naudoti natūralūs ţmogaus keratinocitai ir UVB spinduliuote sukelta jų apoptozė. UVB spinduliuotės sukeltų DNR paţaidų maţinimas taip pat yra susijęs su nukleotidų pašalinimu taisant genus. Tai patvirtinta tyrimu, kurio metu naudoti fibroblastai, neturintys šio geno ir juose silimarinas apoptozės nemaţino [41].

UV spinduliuotė yra reikšmingas veiksnys odos ligų atsiradimui [42]. Kitų tyrimų metu nustatyta, kokiais mechanizmais silimarinas slopina UVB spindulių sukeltas odos ląstelių paţaidas. Vienas iš jų yra autofagija. Tyrimui naudotos ţmogaus epidermio karcinomos ląstelės, paveiktos UVB spinduliuote 5 min. Tyrimas patvirtino hipotezę, kad paveikus UVB spinduliais atsiranda įvairios DNR bei baltymų paţaidos, kurios aktyvina ląstelės apoptozę. Silibinas aktyvina ląstelės autofagiją, kurios metu pašalinamos paţeistos DNR grandinės ir baltymai ir taip apsaugoma ląstelė nuo apoptozės [43]. UVB spindulių sukeltą ląstelių autofagiją silibinas gali maţinti inaktyvindamas fermentą kaspazę-8. Ţmogaus keratinocitų linija paveikta įvairios koncentracijos silibinu, o po to 9 valandas veikta UV spinduliuote. Rezultatai parodė, kad silimarimas perpus sumaţino šių ląstelių apoptozę, poveikis stiprėjo didėjant koncentracijai. Svarbu paţymėti, kad nenustatyta jokio toksinio poveikio ląstelėms. Tolesnio tyrimo metu nustatytas šio proceso mechanizmas. Silibinas inhibuoja kaspazės-8 fermentų grupę, kuri atsakinga uţ UV spindulių sukeltą ląstelių ţūtį [44].

Taigi, šie tyrimai parodo, jog tiek silimarinas, tiek jo atskiras komponentas silibinas pasiţymi antioksidaciniu poveikiu ir gali efektyviai slopinti oksidacinį stresą keliais skirtingais mechanizmais, taip apsaugodamas organizmą nuo UV spinduliuotės sukeliamų paţaidų. Tęsiant tyrimus in vitro ir in

vivo ir įrodţius teigiamą poveikį ţmogaus audiniams galimas silimarino, kaip natūralaus antioksidanto,

1.6. Tikrojo margainio biologiškai aktyvių junginių analizės metodai

Norint pritaikyti silimariną terapiniams tikslams, labai svarbu nustatyti jo cheminę sudėtį, identifikuoti ekstrakte esančius junginius bei nustatyti jų kiekius. Analizės metodai taip pat naudojami nustatyti aktyvių silimarino junginių kiekius rinkoje esančių produktų sudėtyje. Silimarino analizei galima pritaikyti skysčių ar plonasluoksnę chromatografiją, masių spektrometriją, ţiedinio dichroizmo spektus ir kapiliarinę zonų elektroforezę. Silimarino junginiai yra gana panašūs savo molekuline sandara, silibinas ir izosilibinas turi po du diastereomerus, kurie apsunkina tiek kokybinės, tiek kiekybinės sudėties analizę.

Paprasčiausias metodas, panaudotas augalinių vaistų, kurių sudėtyje yra silimarino, kiekybinei analizei – spektrofotometrija. Šis metodas pagrįstas geru silimarino tirpumu metanolyje ir prie 287 nm bangos ilgio nustatytas absorbcijos maksimumas. Taip pat metodas pasiţymi tikslumu ir pakartojamumu. Tačiau šis metodas nenaudojamas silimarino aktyvių komponentų atskyrimui ir nustatymui [45]. Kitas metodas, panaudotas augalinių vaistų analizei – masių spektrometrija kartu su skysčių chromatografija. Tikrojo margainio junginių atskyrimui naudota ESC su C18 kolonėle kartu su jonų gaudyklės ir praskriejimo laiko masių spektrometru. Nors tai sudėtingas, daug įrengimų reikalaujantis metodas, tačiau jis gali tapti vienu svarbiausių augalinių vaistų, tarp jų ir tikrojo margainio, junginių analizei dėl savo tikslumo bei galimybės nustatyti skirtingus izomerus [46].

Pagrindinių silimarino junginių analizei taip pat galima naudoti skysčių chromatografiją/ tandeminę masių spektrometriją (LC/MS/MS) [47]. Silibino nustatymas farmacinėse formose atliekant atvirkštinių fazių efektyviąją skysčių chromatografiją naudojant fotodiodų matricos detektorių patvirtintas kaip nesudėtingas ir tikslus analizės metodas [48]. Silimarino aktyvių junginių analizei galima naudoti skysčių chromatografiją kartu su masių spektrometrija. Šiuo metodu atskirti šeši prekyboje esančio silimarino standartizuoto ekstrakto junginiai – silidianinas, silikristinas, silibino ir izosilibino diastereomerai. Metodas naudotas junginių išskyrimui ir kiekybiniam nustatymui [49]. Dar vienas metodas, naudojamas silimarino nustatymui farmacinėse formose, yra atvirkštinių fazių skysčių chromatografija naudojant monolitinę kolonėlę. Šiuo metodu nustatyti aštuoni pagrindiniai silimarino komponentai, juo atskirti ir izosilibino bei silibino diastereomerai. Mobili fazė – metanolio ir NaH2PO4

mišinys, UV detekcija atlikta 288 nm bangos ilgyje. Metodas validuotas vertinant tikslumą, selektyvumą ir pakartojamumą [50].

atitinka tą pačią dėmę. Todėl silimarino komponentai atskirti naudojant ESC ir rekristalizaciją. Tyrimo rezultatai palyginti su branduolių magnetinio rezonanso (BMR) analizės rezultatais. Ištyrus branduolio magnetinio rezonanso metodu tiek silibinas A ir B, tiek izosilibinas A ir B turėjo beveik vienodus 1H BMR ir 13C BMR spektrus. Tačiau tiriant atvirkštinių fazių ESC, sulaikymo laikas reikšmingai skyrėsi [52]. Panašus metodas naudotas atskirti silibinui A ir B. Šiuo atveju silibinas ištirpintas tetrahidrofurane, kuriame junginių tirpumas didesnis nei metanolyje ar vandenyje ir tuomet analizuotas atvirkštinių fazių ESC. Atskirti junginiai nustatyti BMR, ţiedinio dichroizmo spektroskopijos metodais [53]. Šie tyrimai patvirtino, kad ESC yra tinkamas metodas silimarine esančių diastereomerų atskyrimui.

Pagrindiniams penkiems silimarino junginiams (taksifolinui, silikristinui, silidianinui, silibinui A ir B bei izosilibinui A ir B) atskirti daţniausiai naudojama ESC. Naudojant skirtingas kolonėles, eliuentus ir metodo atlikimo sąlygas galima pasiekti visišką šių junginių atskyrimą. 2 lentelėje pateikta skirtingų tyrimų sąlygos bei kokios išvados padarytos nustatant junginius.

Liu ir kt. [54] pirmą kartą nustatytė aštuonis papildomus komponentus: adeniną, uracilą, uridiną, adenoziną, 3,5,7-trihidroksichromono taksifoliną, chromoną, fenolinį glikozidą, sacharozę ir manitolį. Šie poliniai komponentai gauti silimariną ištirpinus vandeniniam etanolio (5%) tirpale, nufiltravus ir išdţiovinus. Taip gautas polinis silimarino ekstraktas. Ekstrakto medţiagos izoliuotos panaudojus chromatografiją silikagelio sluoksnyje, jos identifikuotos naudojant 1

H-BMR metodą. 2010 m. atlikto tyrimo metu ESC metodas panaudotas monosacharidų, esančių tikrojo margainio ekstrakte, atskyrimui ir nustatymui. Tyrimas atliktas naudojant 1-fenil-3-metil-5-pirazolononą (PMP) kaip priklijuojančią molekulę prie redukuojančių monosacharidų. Nustatyta 10 monosacharidų (manozė, ramnozė, gliukurono rūgštis, galakturono rūgštis, gliukozė, ksilozė, galaktozė ir arabinozė. Metodas patvirtintas kaip greitas, paprastas, tikslus, patikimas ir rezultatai pasiţymėjo atkartojamumu [55]. Kito tyrimo metu palyginta efektyvioji skysčių chromatografija ir kapiliarinė zonų elektroforezė. Nustatyta, kad izosilibino diastereomerai gali būti atskirti tik efektyviosios skysčių chromatografijos būdu, tačiau kapiliarinės zonų elektroforezės būdu geriau atskiriami silikristinas ir silidianinas bei šis metodas yra du kartus greitesnis nei ESC. Bendras flavonolignanų kiekis taip pat nustatytas didesnis naudojant ESC. Tačiau apibendrinus duomenis nustatyta, kad kapiliarinės zonų elektroforezės metodas atitinka Europos Farmakopėjoje nurodytus tikslumo ir atkartojamumo reikalavimus [56].

Atvirkštinių fazių ESC metodas panaudotas ir kiekybiniam silimarino aktyvių junginių nustatymui skirtingo amţiaus tikrojo margainio kultūrose, augintose in vitro. Kaip judanti fazė naudotas metanolis ir 5mM NaH2PO4 (1:1), nustatytas 1,5 ml/min tėkmės greitis. Tyrimui pagamintas

pagrindinės sąlygos aprašytos 2 lentelėje. Nustatyta silimarino kiekio koreliacija su vaisių spalva bei subrendimo stadija [58]. ESC taip pat panaudota nustatyti silimarino kiekį skirtingose augalo dalyse (šaknyse, lapuose, ţieduose, sėklose) [27].

2 lentelė. Skirtingos chromatografinės silimarino junginių atskyrimo metodikos

Kolonėlė Eliuentas Bangos

ilgis

Išvada Literatūros

šaltinis C18 (125mm

x 4mm, 5 μm)

Mobili fazė A: fosforo r., metanolis, vanduo (0,5:35:65)

Mobili fazė B : fosforo r., metanolis, vanduo (0,5:50:50)

288nm Farmakopėjinis tikrojo margainio ekstrakto junginių nustatymo metodas, nustatytas silikristinas, silidianinas, silibinas A ir B, izosilibinas A ir B [21] RP C8 ir RP C18 5m, 4.6 × 250 mm 30% acetonitrilas ir parūgštintas vanduo (0,5% fosforo r.)

288nm Naudojant C18 kolonėlę nepilnai atsiskiria silidianinas ir silikristinas, naudojant C8, atskyrimas pagerėja, bet neatsiskiria diastereomerai.

[58] C18 kolonėlė (5 mm × 2.1 mm I.D., 1.7 μm) Metanolis ir 0,01% skruzdţių rūgštim parūgštintas vanduo

288nm Ultra efektyviosios skysčių chromatografijos metodas, greitas atskyrimas (9 min.), visiškai atskirti 8 junginiai [59] C8 kolonėlė (4.6 mm × 250 mm,5 μm) Vanduo (parūgštintas fosforo rūgštimi iki pH 4) -acetonitrilas-metanolis (50∶30∶20)

288nm Visiškai atskirtas silibinas ir izosilibinas

[60]

C18 (150mm x 4,6mm, 3m)

Metanolis-vanduo (1:1) 254nm Išskirta 10 flavolignanų (silibinas A ir B, izosilibinas A ir B, silikristinas, izosilikristinas, neusilikristinas, silidianinas, cis-silibinas A ir 2,3-cis-silibinas B) [54] C18 kolonėlė (250 mm x 2,1 mm) Metanolis : 0,1% skruzdţių rūgštim parūgštintas vanduo (60:40 v/v)

288 nm Atskirti septyni silimarino junginiai: taksifolinas, silikristinas, silidianinas, silibinas A, silibinas B, izosilibinas A ir izosilibinas B.

[32]

panaudotas silibino farmakokinetinių tyrimų rezultatams nustatyti. Tirta silibino koncentracija ţmogaus plazmoje, metodas validuotas 3,5-14336,0 ng/ml koncentracijos ribose [63].

Taigi, silimarino analizei galima panaudoti daugybę įvairių instrumentinės analizės metodų: skysčių ar plonasluoksnę chromatografiją, masių spektrometriją, ţiedinio dichroizmo spektus ir kapiliarinę zonų elektroforezę, taip pat dar tikslesniam atskyrimui bei nustatymui gali būti naudojami šių metodų tarpusavio deriniai. Svarbu parinkti tinkamas sąlygas optimaliam junginių atskyrimui. Straipsniai, kuriuose išnagrinėtos skirtingų metodų sąlygos, padeda ekstrakto analizės metu pasirenkant reikalingą metodiką pagal tai, kokių junginių atskyrimas reikalingas.

1.7. Tikrojo margainio produktų pritaikymo galimybės

Silimarino terapinis panaudojimas siejamas su aktyvių junginių poveikiu ţmogaus ląstelėms. Šiuo metu labiausiai ištirtas silimarino antioksidacinis aktyvumas, kuris lemia ekstrakto pritaikymą odos bei vidaus organų ligų gydymui ir profilaktikai. Įvairūs atlikti tyrimai detaliau pagrindţia silimarino antioksidacinį poveikį atskiriems audiniams bei įrodo galimą jo pritaikymą medicinoje.

prieš ir po 6 mėn gydymo silimarinu. Nustatyta, kad silimarinas sumaţino patologinius šių rodiklių pokyčius, todėl silimarinas gali būti vartojamas šios patologijos atveju [5]. Kito klinikinio, placebu kontroliuojamo tyrimo metu tirtas silimarino (280 ir 560 mg kas 8 valandas 7 dienas) poveikis pacientams, kuriems nustatytas nealkoholinė suriebėjusių kepenų liga arba lėtinis hepatitas C. Pastebėtas teigiamas poveikis kepenų funkcijai vertinant biocheminius rodiklius (bendro bilirubino, alanino transaminazės, aspartato aminotransferzės, trombocitų kiekius). Lyginant skirtingas silimarino dozes, stipresnis poveikis nustatytas vartojant didesnę silimarino dozę [2]. Šie tyrimai parodė silimarino hepatoprotekcinį poveikį.

3 lentelė. Silimarino produktų pritaikymo galimybės

Vaisto forma Indikacija Tyrimo išvada Literatūros

šaltinis Odos tirpalas (60mg

silimarino ištirpina 2g polietilenglikolio (PEG))

Ţaizdų gydymas Silimarinas ţenkliai padidino epitelizaciją po 10 ir 15 dienų bei ir sumaţino uţdegimą po 5, 10 ir 15 dienų lyginant su nešiklio (PEG) grupe. Ţaizdos sumaţėjimui, kolagenizacijai bei hidroksiprolino kiekiui silimarinas įtakos neturėjo.

[65] Odos tirpalas (6mg silimarino ištirpinti 200l 0,5 proc. metilceliuliozės) ir suspensija (silimarinas suspenduotas fiziologiniame tirpale)

Nudegimų gydymas Po sisteminio silimarino pavartojimo naviko nekrozės faktoriaus α (TNF-α) ir laktato dehidrogenazės kiekiai plazmoje sumaţėjo, po vietinio pavartojimo malondialdehido ir glutationo kiekis bei mieloperoksidazės aktyvumas sumaţėjo. Silimarinas efektyvus vartojant tiek vietiškai, tiek sistemiškai.

[9]

Ekstraktas Alzheimerio ligos, Parkinsono ligos, smegenų išemijos gydymas

Silmarinas maţina oksidacinį stresą smegenyse, maţina uţdegimą, smegenų ląstelių apoptozę bei veikia estrogenų receptorius, todėl gali lėtinti smegenų degeneracinius procesus.

[66]

Ekstraktas Osteoporozės gydymas Silimarinas padidino kaulo tankį, šarminės fosfatazės ir osteokalcino kiekį kraujo serume ir pagerino kaulo lūţio gijimą [67] Tirpalas (silibinas A /silibinas B /izosilibinas A / izosilibinas B ištirpintas 200l 0,5 proc. metilceliuliozės) Prostatos vėţio gydymas

Visi junginiai slopino vėţio angiogenezės bioţymenys bei signalines molekules, reguliuojančias angiogenezę be nepageidaujamo poveikio sveikiems audiniams.

Šiuo metu Lietuvoje yra registruoti 3 vaistiniai preparatai, kurių sudėtyje yra silimarino: CARSIL (silimarinas), 110mg kietosios kapsulės, CARSIL (silimarinas), 22,5mg dengtos tabletės, LIVOSIL (silimarinas), 140mg kietosios kapsulės [69]. Visi šie preparatai vartojami esant kepenų ligoms.

Kitos silimarino produktų pritaikymo galimybės ir jas patvirtinantys moksliniai tyrimai pateikiami 3 lentelėje.

2. TYRIMO METODIKA

2.1. Tyrimo medţiagos ir įranga

2.1.1. Naudotos medţiagos

Tikrojo margainio sausasis ekstraktas – Naturex, South Hackensack, JAV Taksifolino standartas ≥99,9 proc., Chroma Dex, Irvine, JAV

Silikristino standartas ≥82,2 proc., Chroma Dex, Irvine, JAV Silibino A+B standartas ≥99,6 proc., Chroma Dex, Irvine, JAV Etanolis – 96,3 proc., AB „Stumbras“, Kaunas, Lietuva

Metanolis - Sigma – Aldrich® Chemie GmbH, Steinheim, Vokietija

Acto rūgštis ≥ 99,8 proc., Sigma – Aldrich® Chemie GmbH, Steinheim, Vokietija Polietilenglikolis-400 – Carl Roth GmbH, Vokietija

Propilenglikolis – Sigma – Aldrich® Chemie GmbH, Steinheim, Vokietija β-ciklodekstrinas – Sigma – Aldrich® Chemie GmbH, Steinheim, Vokietija Metilceliuliozė – Sigma – Aldrich® Chemie GmbH, Steinheim, Vokietija

Natrio karboksimetilceliuliozė – Sigma – Aldrich® Chemie GmbH, Steinheim, Vokietija Polisorbatas-20 – AppliChem GmbH, Vokietija

Glicerolis – Sigma – Aldrich® Chemie GmbH, Steinheim, Vokietija

2.1.2. Naudota įranga

Kapiliarinis skysčių chromatografas: Agilent 1260 Infinity Capillary LC – DAD, Agilent technologies Inc., Santa Clara, JAV

Svarstyklės: Scaltec SBC 31, Scaltec Instruments GmbH, Vokietija

Ultragarso vonelė: DT 156, Bandelin electronic GmbH & Co. KG, Berlynas, Vokietija Vibracinis viskozimetras: Vibro viscometer SV- 10, A&D Company ltd, Japonija

pH-metras: Knick pH-Meter, 766 Calimatic, Knick Elektronische Meßgeräte GmbH & Co, Vokietija Magnetinė maišyklė su kaitinamuoju paviršiumi: „IKAMAG C-MAG HS7“ (IKA-Werke GmbH & Co. KG, Vokietija)

2.2. Tyrimo metodai

2.2.1. Silimarino analizė ESC metodu

Pasirinktos chromatografinės analizės sąlygos:

Kolonėlė – ACE C18 (250  0,5 mm, 5 m dydţio dalelėmis) su prieškolone ACE C18 5 m Mobili fazė:

 Mobili fazė A: 0,5 proc. acto rūgšties vandeninis tirpalas

 Mobili fazė B: metanolis

Mobilios fazės gradiento kitimas nurodytas 4 lentelėje.

4 lentelė. Linijinis gradiento kitimas

Laikas (min) Mobili fazė A (proc.) Mobili fazė B (proc.)

0-10 7055 3045 10-35 5530 4570 Injekcijos tūris: 0,2 l Tėkmės greitis: 10 l/min Kolonėlės temperatūra: 25°C Detekcija: prie 290 nm

Silimarino junginiai identifikuoti, lyginant jų spektrus su gautais standartų spektrais prie 210-600 nm bangos ilgio. Gauta silimarino chromatograma, rodanti ekstrakto kokybinę ir kiekybinę sudėtį, pavaizduota 4 paveiksle. Taksifolino, silikristino, silibino A ir B standartų chromatogramos pavaizduotos 1 paveiksle. Junginių sulaikymo laikai: taksifolinas – 14,9 min., silikristinas – 19,8 min., silibinas A – 26,9 min., silibinas B – 28,0 min.

Metodikos validacija atlikta remiantis ICH Q2 (R1) gairėmis įvertinant šiuos parametrus: tikslumą, glaudumą, tiesiškumą, specifiškumą, nustatytos aptikimo (LOD) ir kiekybinio nustatymo (LOQ) ribos [70].

Tiesiškumas. Kalibracinių kreivių tiesiškumas nustatytas, naudojant penkių skirtingų

koncentracijų (0,1, 0,3, 0,9, 2,7 ir 8,1 g/ml) tirpalus, gaunamas smailės ploto priklausomybės nuo koncentracijos grafikas.

Ribos. Analizuojant standartų tirpalus (koncentracijos 0,1, 0,25 ir 0,5 g/ml) bei lyginant gautų smailių aukštį su bazinio triukšmo linija nustatytos aptikimo (LOD) ir kiekybinio nustatymo (LOQ) ribos.

Tikslumas ir glaudumas. Metodikos tikslumo ir glaudumo validacija vykdyta iš standartų

paruošus maţiausio, vidurinio ir didţiausio kalibracinės kreivės taško tirpalus. Pakartojamumo validacijai atlikti tą pačią dieną paruoštos trys tos pačios koncentracijos tirpalų serijos, atkuriamumo - po vieną tirpalų seriją per dieną tris dienas. Tikslumas išreikštas nustatytu analitės procentiniu kiekiu, o glaudumas – santykiniu standartiniu nuokrypiu (SSN).

Specifiškumas. Pasirinktos metodikos specifiškumas vertintas, siekiant nustatyti, ar iš odos

sluoksnių išekstrahuoti junginiai netrukdo kiekybiškai įvertinti tikrojo margainio ekstrakto junginius. Ekstrakcija atlikta naudojant epidermio ir dermos mėginius be silimarino junginių (0,64 cm2 ploto odos gabaliukai). Epidermiui atskirti nuo dermos naudotas sauso karščio metodas. Atskirti odos sluoksniai ekstrahuoti metanoliu ultragarso vonelėje 30 min. Gauti ekstrakcijos mėginiai tirti ESC metodu.

2.2.2. Silimarino tirpalų gamyba

Literatūroje yra duomenų, kad silimarinas praktiškai netirpus vandenyje, tirpsta etanolyje, izopropilo alkoholyje, β-ciklodekstrine ir laisvai tirpsta polietilenglikolyje-200, propilenglikolyje, polisorbate-20 [71–73]. Silimarinas tirpsta 0,5% metilceliuliozės tirpale, maţiau tirpus natrio karboksimetilceliuliozės tirpale [68,74,75]. Bai ir kt. nustatė, kad tiriant atskiro junginio silibino tirpumą polietilenglikolyje-6000 tirpumas didėja didėjant temperatūrai ir tirpiklio koncentracijai [76].

dirginančiomis savybėmis [77]. 0,5 proc. metilceliuliozės ir 0,5 proc. natrio karboksimetilceliuliozės tirpalai buvo atmesti dėl iškritusių nuosėdų.

Silimarino etanolinis ekstraktas pagamintas 2 g silimarino uţpylus 200 ml 96 proc. etanolio, maišyta, nufiltruota. Po to į gautą tirpalą įdėta dar 2 g silimarino, vėl maišyta ir filtruota. Gauto ekstrakto junginių koncentracija nustatyta ESC metodu. Pagaminti 5 proc., 10 proc., 15 proc. polisorbato-20, propilenglikolio, glicerolio ir polietilenglikolio vandeniniai tirpalai. Į šiuos tirpalus įterpta 5 proc. silimarino etanolinio ekstrakto, kuriame taksifolino, silikristino, silibino A ir silibino B koncentracija atitinkamai buvo 247,5 g/ml, 1848,00 g/ml, 909,50 g/ml ir 1607,50 g/ml. Silimarino junginių koncentracija nešikliuose nustatyta ESC metodu.

2.2.3. Skystų silimarino nešiklių fizikinių savybių nustatymas

Silimarino skystų nešiklių dinaminė klampa nustatyta vibraciniu viskozimetru (Vibro viscometer SV- 10, A&D Company ltd, Japonija), o pH reikšmė vertinta naudojant pH-metrą (Knick pH-Meter, 766 Calimatic, Knick Elektronische Meßgeräte GmbH & Co, Vokietija). Po to į nešiklį įterpta 5% etanolinio silimarino tirpalo ir vertinamos gauto tirpalo pH ir klampos reikšmės. Matavimai atlikti kambario temperatūroje.

2.2.4. Silimarino junginių skvarbos į odą ex vivo tyrimai

Silimarino junginių ekstrakcijos išgava nustatyta pagal Modesto Ţiliaus ir kt. metodiką [78]. Ant atskirtų sluoksnių uţpilta metanolinio tirpalo, kuriame atskirų silimarino junginių koncentracija – 20 g/ml, ir laikyta kambario temperatūroje ne maţiau 3 val. Metanolinis tirpalas nuimtas, epidermio ir dermos gabalėliai nusausinti, ant jų uţpilta metanolio ir 30 min. laikyta ultragarso vonelėje. Tiek nuimti tirpalai, tiek gauti ekstraktai analizuoti ESC metodu. Nustatyta, kad vidutinė silimarino junginių ekstrakcijos išgava iš epidermio siekė ≥97%, o iš dermos ≥92%. Atskirų junginių išgava nurodyta 5 lentelėje.

5 lentelė. Silimarino junginių išgava iš odos

Junginys Išgava iš epidermio (%) Išgava iš dermos (%)

Taksifolinas 97 92

Silikristinas 99 98

Silibinas A 99 98

Silimarino skvarba į odą tirta naudojant Bronaugh tipo celes. Po ekvilibracijos fazės ant odos uţnešta 0,500 g silimarino tirpalo ir palikta 24 valandom. Odos sluoksniai atskirti sauso karščio metodu. Epidermis ir derma sudėti į atskirus mėgintuvėlius, uţpilti metanoliu ir 30 min. ekstrahuoti ultragarso vonelėje. Gauti ekstraktai ir donorinė fazė analizuota ESC metodu. Skvarbos kontroliniai bandymai, su kuriais būtų lyginti skvarbos rezultatai iš skirtingų nešiklių, nebuvo atlikti dėl maţo silimarino tirpumo vandenyje ir ţalingo organinių tirpiklių poveikio odai.

2.2.5. Statistinis duomenų vertinimas

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1. Silimarino analizė ESC metodu

3.1.1. Analizės metodo vystymas

Kiekybiniam ir kokybiniam tikrojo margainio ekstrakto junginių nustatymui naudotas kapiliarinis skysčių chromatografas su diodų matricos detektoriumi.

Kolonėlės parinkimas. Pirmiausiai pasirinkta C8 kolonėlė ReproSil – Pur Basic C8, 5μm, 250

x 0,5 mm), kurią naudojant gautos tik 4 smailės [58,60]. Literatūros duomenimis tinkamesnis atskyrimas pasiekiamas, naudojant C18 kolonėlę. Todėl C8 kolonėlė pakeista į ACE C18 (250 x 0,5 mm, 5 m) [79,80]. Kaip judančioji fazė A naudotas 0,5 proc. acto rūgšties vandeninis tirpalas, o judančioji fazė B – acetonitrilas. Detekcija atlikta prie 290 nm bangos ilgio, nes silimarino junginių absorbcijos maksimumas yra ties 285-290 nm. Silimarino junginių spektrai pavaizduoti 2 pav.

(1) (2)

(3) (4)

2 pav. Silimarino junginių UV spektrai (1-taksifolinas, 2-silikristinas, 3-silibinas A, 4- silibinas B)

Eliuento parinkimas. Atskyrimui naudotas gradientinis eliuavimas, kai eliuento B

3 pav. Silimarino junginių chromatograma naudojant acetonitrilą kaip judančią fazę.

Literatūros duomenimis silimarino junginiai geriau atsiskiria, naudojant metanolį kaip judančiąją fazę. Todėl acetonitrilas pakeistas į metanolį [81]. Patikimas atskyrimas pasiektas, kai metanolio koncentracija didėjo nuo 30 iki 45 proc. 10 min ir nuo 45 iki 70 proc. 25 min., visos analizės trukmė 35 min (4 pav.). Gautų smailių skiriamoji geba Rs > 1,85. Temperatūros pakėlimas iki 30°C junginių atskyrimui įtakos neturėjo.

4 pav. Silimarino junginių chromatograma naudojant metanolį kaip judančią fazę (nuo 30 iki 45 proc. 10 min ir nuo 45 iki 70 proc. 25 min.), 1-taksifolinas, 2-silikristinas, 3-silibinas A, 4- silibinas

B

3.1.2 Tikrojo margainio ekstrakto ESC analizės metodo validacija

Vertinant metodo tiesiškumą gautas smailės ploto priklausomybės nuo koncentracijos grafikas, ir kiekvienai analitei sudaryta regresijos lygtis: Y = aX + b, kur Y – smailės ploto dydis, X – analitės kiekis. Tiesiškumas įvertintas pagal koreliacijos koeficientą (R2

6 lentelė. Silimarino junginių kalibracinių kreivių parametrai Analitė Koncentracijos

intervalas (g/ml)

Regresijos lygtis R2 LOD (g/ml) LOQ (g/ml)

Taksifolinas 0,1-8,10 Y=56,69X+1,04 0,99999 0,03 0,1

Silikristinas 0,1-8,10 Y=36,29X+0,66 0,99999 0,03 0,1

Silibinas A 0,1-8,10 Y=36,17X+0,52 0,99999 0,03 0,1

Silibinas B 0,1-8,10 Y=39,16X+0,61 0,99999 0,03 0,1

Pakartojamumo ir atkuriamumo rezultatai nurodyti 7 lentelėje. Tiriant metodikos pakartojamumą nustatyta, kad tikslumas yra 86,7-105,9% ribose, o glaudumas <7,68%. Atkartojamumo rezultatai parodė, kad tikslumas yra 90,9-107,3% ribose, o glaudumas <19,72%.

7 lentelė. ESC metodikos tikslumo ir glaudumo reikšmės

Analitė

Pakartojamumas Atkuriamumas

Tikslumas (%) Glaudumas SSN (%) Tikslumas (%) Glaudumas SSN (%)

Taksifolinas 86,7-97,1 3,54-7,68 94,7-98,1 3,42-13,46

Silikristinas 96,7-105,9 4,24-6,86 102,0-103,0 2,72-5,96

Silibinas A 96,7-98,5 4,12-4,77 90,9-107,3 13,78-19,72

Silibinas B 95,9-101,7 2,05-5,76 90,9-98,7 11,83-17,62

Pagal šiuos parametrus efektyviosios skysčių chromatografijos metodas tinkamas naudoti silimarino junginių kokybiniam ir kiekybiniam nustatymui tirpaluose ir odos ekstraktuose.

5 pav. Išgavos iš dermos (A), epidermio (B), epidermio (C) ir dermos (D) mėginių be silimarino junginių mėginių chromatogramos: 1-taksifolinas, 2-silikristinas, 3-silibinas A, 4-silibinas B.

3.2. Skystų silimarino nešiklių klampos ir pH vertinimas

Klampos ir pH reikšmės, gautos įvertinus skystus nešiklius su ir be silimarino junginių, pateiktos 8 lentelėje.

8 lentelė. Silimarino skystų nešiklių klampos ir pH reikšmės

Nešiklis Klampa, mPa·s

Klampa, įterpus 5% etanolinio silimarino ekstrakto, mPa·s pH pH, įterpus 5% etanolinio silimarino ekstrakto 5 proc. PEG-400 0,69 ± 0,01 0,87 ± 0,01 5,60 ± 0,02 4,86 ± 0,01 10 proc. PEG-400 0,82 ± 0,01 1,21 ± 0,01 5,60 ± 0,02 5,06 ± 0,01 15 proc. PEG-400 1,11 ± 0,01 1,40 ± 0,01 5,67 ± 0,01 5,23 ± 0,01 5 proc. propilenglikolis 0,68 ± 0,01 0,75 ± 0,01 5,30 ± 0,02 4,59 ± 0,01 10 proc. propilenglikolis 0,75 ± 0,01 0,87 ± 0,01 5,36 ± 0,02 4,55 ± 0,01 15 proc. propilenglikolis 0,92 ± 0,01 1,08 ± 0,01 5,38 ± 0,06 4,52 ± 0,01 5 proc. polisorbatas-20 0,8 ± 0,01 0,76 ± 0,01 3,85 ± 0,01 4,06 ± 0,02 10 proc. polisorbatas-20 1,08 ± 0,01 1,14 ± 0,01 3,99 ± 0,01 4,03 ± 0,01 15 proc. polisorbatas-20 1,96 ± 0,01 2,08 ± 0,01 4,00 ± 0,01 4,01 ± 0,01 5 proc. glicerolis 0,56 ± 0,01 0,75 ± 0,01 4,10 ± 0,01 4,23 ± 0,02 10 proc. glicerolis 0,65 ± 0,01 0,81 ± 0,02 4,17 ± 0,01 4,10 ± 0,01 15 proc. glicerolis 0,73 ± 0,01 0,94 ± 0,01 4,22 ± 0,01 4,07 ± 0,01 0,5 proc. metilceliuliozė 1,42 ± 0,01 1,29 ± 0,01 6,68 ± 0,05 5,31 ± 0,06 0,5 proc. natrio karboksimetilceliuliozė 2,66 ± 0,01 2,54 ± 0,01 7,01 ± 0,02 6,30 ± 0,02 5 proc. propilenglikolis + 5 proc.glicerolis 0,92 ± 0,01 0,95 ± 0,01 4,68 ± 0,03 4,30 ± 0,03 5 proc. propilenglikolis + 5 proc. PEG-400 0,84 ± 0,01 1,00 ± 0,01 5,40 ± 0,04 4,84 ± 0,02

Nešiklyje pagalbinės medţiagos koncentracijai didėjant nuo 5 proc. iki 15 proc.:

a) Klampa didėja 57 proc., 33 proc., 145 proc. ir 29 proc. atitinkamai nešiklyje esant PEG-400, propilenglikoliui, polisorbatui-20 ar gliceroliui;

b) pH didėja 0,7 proc., 2,6 proc., 3,6 proc. ir 3,2 proc. atitinkamai nešiklyje esant PEG-400, propilenglikoliui, polisorbatui-20 ar gliceroliui.

Nešiklio su etanoliniu silimarino ekstraktu pagalbinės medţiagos koncentracijai didėjant nuo 5 iki 15 proc.:

a) Klampa didėjo 59 proc., 41 proc., 172 proc. ir 24 proc. atitinkamai nešiklyje esant PEG-400, propilenglikoliui, polisorbatui-20 ar gliceroliui;

Į nešiklio tirpalą įterpus 5 proc. etanolinio silimarino ekstrakto, klampa padidėjo nuo 3,25 proc. iki 48,4 proc., išskyrus polisorbato-20 tirpalo – klampa sumaţėjo 4,5 proc. Statistiškai reikšmingas skirtumas (p < 0,05) nustatytas tarp visų nešiklių klampos reikšmių. pH reikšmė maţėjo nuo 1,5 proc. iki 16 proc. esant PEG-400, propilenglikoliui, 10 proc. bei 15 proc. gliceroliui, propilenglikolio mišiniams su gliceroliu ir PEG-400, o polisorbato-20 ir 5 proc. glicerolio tirpaluose pH reikšmė didėjo nuo 0,3 proc. iki 5,3 proc. Statistiškai reikšmingas skirtumas (p < 0,05) tarp visų nešiklių pH reikšmių išskyrus polisorbato-20 15 proc. tirpalą.

3.3. Silimarino junginių skvarbos ex vivo vertinimas

3.3.1. Raginio sluoksnio įtakos silimarino junginių skvarbai vertinimas

6 pav. Silimarino junginių skvarba į žmogaus odą su ir su pašalintu raginiu sluoksniu iš metanolinio ekstrakto

Gauti rezultatai parodė, kad iš silimarino metanolinio ekstrakto į odą su raginiu sluoksniu, įsiskverbė 5,1 ± 2,0 proc. taksifolino, 6,4 ± 1,2 proc. silikristino, 8,5 ± 2,2 proc. silibino A ir 10,5 ± 2,3 proc. silibino B, o srautas atitinkamai buvo 0,17 ± 0,07g/cm2, 1,38 ± 0,25 g/cm2, 0,48 ± 0,13 g/cm2, 1,41 ± 0,32 g/cm2. Pašalinus odos raginį sluoksnį, taksifolino odoje nustatyta 9,6 ± 1,3 proc., silikristino – 9,2 ± 2,0 proc., silibino A – 12,8 ± 3,9 proc. ir silibino B – 12,1 ± 2,6 proc., srautas atitinkamai: 0,32 ± 0,04 g/cm2, 1,97 ± 0,44 g/cm2, 0,73 ± 0,17 g/cm2 ir 1,63 ± 0,36 g/cm2. Nustatyta, kad pašalinus odos raginį sluoksnį labiausiai padidėjo taksifolino skvarba į ţmogaus odą – 47 proc. Silikristino, silibino A ir silibino B skvarba atitinkamai padidėjo 30 proc., 34 proc. ir 13 proc.

0 5 10 15 20

Taksifolinas Silikristinas Silibinas A Silibinas B

Silimarino junginių kiekis (proc.)

Raginio sluoksnio pašalinimas turėjo reikšmingą įtaką taksifolino, silikristino ir silibino A skvarbos į odą pagerinimui (p < 0,05).

3.3.2. Silimarino junginių skvarbos iš skirtingų nešiklių vertinimas

 Skvarba iš polisorbato-20 vandeninių tirpalų

Silimarino junginių skvarbos į odą iš 5 ir 15 proc. polisorbato-20 vandeninių tirpalų rezultatai pavaizduoti 7 paveiksle.

7 pav. Silimarino junginių skvarba į odą iš skirtingų koncentracijų polisorbato-20 tirpalo.

Gauti rezultatai parodė, kad iš 5 ir 15 proc. polisorbato-20 vandeninių tirpalų į odą įsiskverbė tik silibinas A – atitinkamai 0,8 ± 0,3 proc. ir 0,5 ± 0,1 proc., o srautas buvo atitinkamai 0,29 ± 0,11 g/cm2 ir 0,20 ± 0,05 g/cm2. Vertinant silimarino junginių pasiskirstymą skirtinguose odos sluoksniuose nustatyta, kad šis junginys kaupėsi tik dermoje.

 Skvarba iš propilenglikolio vandeninių tirpalų

Silimarino junginių skvarbos į odą iš 5 ir 15 proc. propilenglikolio vandeninių tirpalų rezultatai pavaizduoti 8 paveiksle.

Nustatyta, kad iš 5 ir 15 proc. propilenglikolio vandeninių tirpalų į odą įsiskverbė atitinkamai 8,8 ± 1,8 ir 4,3 ± 1,2 proc. silibino A, 8,9 ± 2,1 proc. ir 4,1 ± 1,1 silibino B, 5,1 ± 1,5 proc ir 1,7 ± 0,4 proc. silikristino. 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 Taksifolinas Silikristinas Silibinas A Silibinas B

Silimarino junginių kiekis (proc.)

8 pav. Silimarino junginių skvarba į odą iš skirtingų koncentracijų propilenglikolio tirpalo

Taksifolinas skverbėsi į odą tik iš 5 proc. propilenglikolio vandeninio tirpalo (2,3 ± 0,6 proc.), o iš 15 proc. vandeninio tirpalo – tik aptiktas odoje. Silimarino junginių pasiskirstymo odos sluoksniuose rezultatai pateikti 9 lentelėje.

9 lentelė. Silimarino junginių pasiskirstymas epidermyje ir dermoje naudojant 5 ir 15 proc. propilenglikolį Nešiklis Junginys Epidermis Derma Srautas (g/cm2) Kiekis (proc.) Srautas (g/cm2) Kiekis (proc.) 5 proc. propilenglikolis Taksifolinas 0,22 ± 0,06 2,3 ± 0,6 - Aptiktas Silikristinas 3,28 ± 0,79 4,6 ± 1,1 0,26 ± 0,13 0,4 ± 0,2 Silibinas A 2,56 ± 0,56 7,4 ± 1,6 0,45 ± 0,17 1,3 ± 0,5 Silibinas B 5,01 ± 1,15 7,9 ± 1,8 0,48 ± 0,22 0,8 ± 0,3 15 proc. propilenglikolis

Taksifolinas - Aptiktas - Nenustatytas

Silikristinas 1,12 ± 0,29 1,6 ± 0,4 0,16 ± 0,02 0,2 ± 0,03 Silibinas A 1,26 ± 0,32 3,4 ± 0,9 0,37 ± 0,16 1,0 ± 0,4 Silibinas B 2,54 ± 0,67 3,7 ± 1,0 0,33 ± 0,13 0,5 ± 0,2 Vertinant silimarino junginių pasiskirstymą odos sluoksniuose nustatyta, kad didţioji dalis silimarino junginių kaupiasi epidermyje – iš 5 ir 15 proc. propilenglikolio vandeninio tirpalo atitinkamai 88 proc. ir 86 proc. silimarino junginių. Iš 5 proc. propilenglikolio vandeninio tirpalo atsipalaidavęs taksifolinas kaupiasi tik epidermyje, o dermoje buvo tik aptiktas. Silikristino, silibino A ir silibino B kiekis epidermyje yra atitinkamai apie 12, 6 ir 10 kartų didesnis nei dermoje. Naudojant 15 proc. propilenglikolio vandeninį tirpalą nustatyta, kad taksifolinas epidermyje tik aptiktas. Silikristino ir silibino B epidermyje susikaupė maţdaug 7 kartus daugiau, o silibino A – 3 kartus daugiau nei dermoje.

0 2 4 6 8 10 12

Taksifolinas Silikristinas Silibinas A Silibinas B

Silimarino junginių kiekis (proc.)

 Skvarba iš glicerolio vandeninių tirpalų

Silimarino junginių skvarbos į odą rezultatai iš 5 ir 15 proc. glicerolio vandeninių tirpalų pavaizduoti 9 paveiksle.

9 pav. Silimarino junginių skvarba į odą iš skirtingų koncentracijų glicerolio tirpalo.

Nustatyta, kad iš 5 proc. ir 15 proc. glicerolio vandeninių tirpalų taksifolinas odoje tik aptiktas. Iš 5 ir 15 proc. glicerolio vandeninių tirpalų į odą įsiskverbė atitinkamai 3,4 ± 0,7 proc. ir 2,7 ± 0,5 proc. silikristino, 6,2 ± 0,9 proc. ir 5,5 ± 0,5 proc. silibino A ir 5,9 ± 0,8 proc. ir 5,2 ± 0,3 proc. silibino B. Silimarino junginių pasiskirstymo odos sluoksniuose rezultatai pavaizduoti 10 lentelėje.

10 lentelė. Silimarino junginių pasiskirstymas odoje naudojant 5 ir 15 proc. glicerolį

Nešiklis Junginys Epidermis Derma Srautas (g/cm2) Kiekis (proc.) Srautas (g/cm2) Kiekis (proc.) 5 proc. glicerolis

Taksifolinas - Aptiktas - Nenustatytas

Silikristinas 2,29 ± 0,49 3,4 ± 0,7 - Aptiktas Silibinas A 1,77 ± 0,25 5,0 ± 0,7 0,47 ± 0,25 1,3 ± 0,7 Silibinas B 3,45 ± 0,45 5,6 ± 0,7 0,27 ± 0,13 0,4 ± 0,2

15 proc. glicerolis

Taksifolinas - Aptiktas - Nenustatytas

Silikristinas 1,59 ± 0,33 2,4 ± 0,5 0,23 ± 0,05 0,4 ± 0,1 Silibinas A 1,52 ± 0,12 4,3 ± 0,3 0,45 ± 0,16 1,3 ± 0,4 Silibinas B 2,90 ± 0,26 4,7 ± 0,4 0,37 ± 0,10 0,6 ± 0,2 Lyginant silimarino junginių pasiskirstymą epidermyje ir dermoje nustatyta, kad tiek iš 5 proc., tiek iš 15 proc. vandeninio glicerolio tirpalo taksifolinas į dermą neprasiskverbė, o epidermyje buvo aptiktas. Silikristinas, atsipalaidavęs iš 5 proc. vandeninio glicerolio tirpalo, kaupėsi epidermyje, o dermoje buvo tik aptiktas. Silibino A epidermyje nustatyta maţdaug 4 kartus daugiau nei dermoje, o

0 2 4 6 8

Taksifolinas Silikristinas Silibinas A Silibinas B

Silimarino junginių kiekis (proc.)

silibino B – 13 kartų. Naudojant 15 proc. vandeninį glicerolio tirpalą silikristino epidermyje susikaupė 6 kartus daugiau nei dermoje, silibino A – 3 kartus, o silibino B – 8 kartus daugiau.

 Skvarba iš PEG-400 vandeninių tirpalų

Silimarino junginių skvarbos į ţmogaus odą iš 5 ir 15 proc. PEG-400 vandeninių tirpalų rezultatai pavaizduoti 10 paveiksle.

10 pav. Silimarino junginių skvarba į odą iš skirtingų koncentracijų PEG-400 tirpalo.

Rezultatai parodė, kad naudojant 5 proc. PEG-400 vandeninį tirpalą taksifolinas odoje tik aptiktas, silikristino į odą įsiskverbė 2,1 ± 0,3 proc., silibino A – 5,4 ± 0,7 proc., o silibino B – 5,1 ± 0,6 proc. Iš 15 proc. PEG-400 vandeninio tirpalo taksifolino odoje nenustatyta, o kitų junginių į odą prasiskverbė maţiau nei 1 proc. Silimarino junginių pasiskirstymo odos sluoksniuose rezultatai parodyti 11 lentelėje.

11 lentelė. Silimarino junginių pasiskirstymas epidermyje ir dermoje naudojant 5 ir 15 proc. PEG-400 Nešiklis Junginys Epidermis Derma Srautas (g/cm2) Kiekis (proc.) Srautas (g/cm2) Kiekis (proc.) 5 proc. PEG-400

Taksifolinas - Aptiktas - Nenustatytas

Silikristinas 1,65 ± 0,50 2,1 ± 0,6 - Aptiktas Silibinas A 1,70 ± 0,42 4,5 ± 1,1 0,32 ± 0,14 0,9 ± 0,4 Silibinas B 3,11 ± 0,68 4,7 ± 1,0 0,29 ± 0,07 0,4 ± 0,1

15 proc. PEG-400

Taksifolinas - Nenustatytas - Nenustatytas

Silikristinas 0,20 ± 0,04 0,3 ± 0,1 - Nenustatytas Silibinas A 0,28 ± 0,03 0,7 ± 0,1 - Aptiktas Silibinas B 0,42 ± 0,05 0,6 ± 0,1 - Nenustatytas 0 2 4 6 8 Taksifolinas Silikristinas Silibinas A Silibinas B

Silimarino junginių kiekis (proc.)

Vertinant silimarino junginių pasiskirstymo odos sluoksniuose rezultatus, nustatyta, kad iš 5 proc. PEG-400 vandeninio tirpalo taksifolinas į dermą neprasiskverbė, o epidermyje tik aptiktas. Silikristinas kaupėsi epidermyje, o dermoje tik aptiktas. Silibino A epidermyje nustatyta 5 kartus daugiau nei dermoje, o silibino B – apie 11 kartų daugiau. Iš 15 proc. PEG-400 vandeninio tirpalo dermoje silibinas A tik aptiktas.

3.3.3. Skvarbos iš skirtingų nešiklių rezultatų apibendrinimas

Silimarino junginių skvarba į ţmogaus odą iš skirtingų nešiklių lyginta pagal suminio silimarino junginių kiekio skvarbą į odą. Rezultatai pavaizduoti 11 paveiksle.

11 pav. Silimarino junginių skvarbos į žmogaus odą rezultatai iš skirtingų nešiklių.

Rezultatai parodė, kad daugiausiai silimarino junginių įsiskverbė į odą iš 5 proc. propilenglikolio vandeninio tirpalo – 7,0 ± 1,7 proc. Iš 5 ir 15 proc. glicerolio vandeninių tirpalų į odą prasiskverbė atitinkamai 4,7 ± 0,7 proc. ir 4,0 ± 0,4 proc. silimarino junginių. Iš 5 proc. PEG-400 ir 15 proc. propilenglikolio vandeninių tirpalų prasiskverbė atitinkamai 3,7 ± 0,8 proc. ir 3,1 ± 0,8 proc. silimarino junginių. Iš 15 proc. PEG-400, 5 proc. ir 15 proc. polisorbato-20 vandeninių tirpalų į odą įsiskverbė maţiau nei 1 proc. junginių. Įvertinus atskirų silimarino junginių skvarbą į odą nustatyta, kad silikristino ir silibino B skvarba yra ribojama, kadangi jų prasiskverbęs kiekis yra panašus arba maţesnis negu silibino A, kurio ekstrakte yra apie 2 kartus maţiau negu pastarųjų junginių. Lyginant skirtingų koncentracijų tirpalus, statistiškai nustatytas reikšmingas skirtumas tarp junginių skvarbos iš

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

5 proc. propilenglikolis + 5 proc. glicerolis 5 proc. propilenglikolis + 5 proc. PEG-400 15 proc. propilenglikolis 5 proc. propilenglikolis 15 proc. glicerolis 5 proc. glicerolis 15 proc. PEG-400 5 proc. PEG-400 15 proc. polisorbatas-20 5 proc. polisorbatas-20

PEG-400, propilenglikolio ir polisorbato-20 5 ir 15 proc. vandeninių tirpalų (p < 0,05). Lyginant silimarino junginių skvarbą iš skirtingų nešiklių, statistiškai reikšmingo skirtumo (p < 0,05) nenustatyta tarp:

a) 5 proc. polisorbato-20, 15 proc. polisorbato ir 15 proc. PEG-400 vandeninių tirpalų; b) 15 proc. PEG-400 vandeninio tirpalo ir 5 proc. propilenglikolio ir 5 proc. PEG-400 mišinio;

c) 15 proc. propilenglikolio, 5 proc. PEG-400, 15 proc. glicerolio vandeninių tirpalų ir 5 proc. propilenglikolio ir 5 proc. glicerolio mišinio;

d) 5 proc. PEG-400, 5 proc. glicerolio ir 15 proc. glicerolio vandeninių tirpalų.

Įvertinus šiuos rezultatus, nešiklių mišinių gamybai buvo pasirinkti tie nešikliai, iš kurių skvarba buvo didţiausia – 5 proc. propilenglikolis, 5 proc. glicerolis ir 5 proc. PEG-400

 Skvarba iš mišinių

Silimarino junginių skvarbos į ţmogaus odą rezultatai iš tirpalo, kuriame yra 5 proc. propilenglikolio ir 5 proc. glicerolio, pavaizduoti 12 paveiksle.

12 pav. Silimarino junginių skvarbos į odą iš 5 proc. propilenglikolio, 5 proc. glicerolio ir jų mišinio rezultatai

Gauti rezultatai parodė, kad iš 5 proc. propilenglikolio ir 5 proc. glicerolio mišinio atsipalaidavęs taksifolinas odoje tik aptiktas, į odą įsiskverbė 2,6 ± 0,3 proc. silikristino, 4,3 ± 0,6 proc. silibino A ir 4,1 ± 0,6 proc. silibino B. Lyginant silimarino junginių skvarbą iš propilenglikolio ir glicerolio mišinio su skvarba iš 5 proc. propilenglikolio vandeninio tirpalo nustatyta, kad su junginių skvarba sumaţėjo apie 2 kartus (11 pav.). Lyginant silimarino junginių skvarbą su skvarba iš 5 proc. glicerolio tirpalo nustatyta, kad skvarba viduriniškai sumaţėjo apie 1,5 karto. Lyginant pavienių

0 5 10 15

Taksifolinas Silikristinas Silibinas A Silibinas B

Silimarino junginių kiekis (proc.)

5 proc. propilenglikolis + 5 proc. glicerolis

5 proc. glicerolis

nešiklių tirpalų ir jų mišinio įtaką silimarino junginių skvarbai į odą nustatyta, kad nėra statistiškai reikšmingo skirtumo tarp skvarbos iš 5 proc. glicerolio vandeninio tirpalo ir 5 proc. propilenglikolio + 5 proc. glicerolio mišinio (p > 0,05). Silimarino junginių pasiskirstymas odos sluoksniuose parodytas 12 lentelėje.

12 lentelė. Silimarino junginių pasiskirstymas epidermyje ir dermoje naudojant vandeninį tirpalą, kuriame yra 5 proc. propilenglikolio ir 5 proc. glicerolio.

Nešiklis Junginys Epidermis Derma Srautas (g/cm2) Kiekis (proc.) Srautas (g/cm2) Kiekis (proc.) 5 proc. propilenglikolis + 5 proc. glicerolis

Taksifolinas - Aptiktas - Nenustatytas

Silikristinas 1,44 ± 0,25 1,9 ± 0,3 0,34 ± 0,14 0,5 ± 0,2 Silibinas A 1,26 ± 0,21 3,3 ± 0,6 0,33 ± 0,03 0,9 ± 0,9 Silibinas B 2,47 ± 0,45 3,6 ± 0,7 0,23 ± 0,06 0,3 ± 0,1

Verinant silimarino junginių pasiskirstymą odos sluoksniuose nustatyta, kad taksifolinas aptiktas tik epidermyje. Silikristino ir silibino A epidermyje susikaupė 4 kartus daugiau, o silibino B – 11 kartų daugiau nei dermoje.

Silimarino junginių skvarbos į ţmogaus odą rezultatai iš tirpalo, kuriame yra 5 proc. propilenglikolio ir 5 proc. PEG-400, pavaizduoti 13 paveiksle.

13 pav. Silimarino junginių skvarbos į odą iš 5 proc. propilenglikolio, 5 proc. PEG-400 ir jų mišinio rezultatai

Gauti rezultatai parodė, kad iš 5 proc. propilenglikolio ir 5 proc. PEG-400 vandeninų tirpalų mišinio taksifolinas į odą neįsiskverbė. Odoje nustatyta 1,0 ± 0,2 proc. silikristino, 2,5 ± 0,3 proc. silibino A ir 1,7 ± 0,2 proc. silibino B. Lyginant su 5 proc. PEG-400 vandeniniu tirpalu ir 5 proc. propilenglikolio vandeniniu tirpalu, iš jų mišinio į odą įsiskverbė atitinkamai 2 ir 5 kartus maţiau

0 2 4 6 8 10 12

Taksifolinas Silikristinas Silibinas A Silibinas B

Silimarino junginių kiekis (proc.)

5 proc. propilenglikolis + 5 proc. PEG-400

5 proc. PEG-400

silimarino junginių (11 pav.). Nustatytas statistiškai reikšmingas skirtumas tarp skvarbos iš pavienių nešiklių ir jų mišinio (p < 0,05). Silimarino junginių pasiskirstymas odos sluoksniuose parodytas 13 lentelėje.

13 lentelė. Silimarino junginių pasiskirstymas epidermyje ir dermoje naudojant vandeninį tirpalą, kuriame yra 5 proc. propilenglikolio ir 5 proc. PEG-400.

Nešiklis Junginys Epidermis Derma Srautas (g/cm2) Kiekis (proc.) Srautas (g/cm2) Kiekis (proc.) 5 proc. propilenglikolis + 5 proc. PEG-400

Taksifolinas - Aptiktas - Nenustatytas

Silikristinas 0,58 ± 0,09 0,8 ± 0,1 0,23 ± 0,06 0,3 ± 0,1 Silibinas A 1,60 ± 0,04 1,6 ± 0,1 0,32 ± 0,10 0,9 ± 0,3 Silibinas B 1,14 ± 0,10 1,7 ± 0,2 - Aptiktas

Verinant silimarino junginių pasiskirstymą epidermyje ir dermoje nustatyta, kad taksifolinas aptiktas tik epidermyje, silibino B epidermyje susikaupė 1,7 proc., o dermoje šis junginys tik aptiktas. Silikristino epidermyje susikaupė 2,5 karto daugiau, o silibino A – 2 kartus daugiau nei dermoje.

Apibendrinus visus silimarino junginių skvarbos rezultatus nustatyta, kad didţiausias bendras silimarino junginių kiekis tiek odoje, tiek atskiruose jos sluoksniuose nustatytas iš 5 proc. propilenglikolio vandeninio tirpalo. Didţiausias taksifolino kiekis prasiskverbia į odą ir kaupiasi tik epidermyje iš 5 proc. propilenglikolio vandeninio tirpalo. Didţiausias silikristino kiekis prasiskverbė į odą ir kaupėsi epidermyje iš 5 proc. propilenglikolio vandeninio tirpalo, o didţiausias kiekis dermoje nustatytas iš 5 proc. propilenglikolio ir 5 proc. glicerolio mišinio. Didţiausias silibino A kiekis prasiskverbė į odą ir kaupėsi epidermyje iš 5 proc. propilenglikolio vandeninio tirpalo, o didţiausias kiekis dermoje nustatytas iš 5 proc. glicerolio vandeninio tirpalo. Didţiausias silibino kiekis prasiskverbė į odą ir daugiausiai kaupėsi epidermyje ir dermoje iš 5 proc. propilenglikolio vandeninio tirpalo.