KOKYBINIS IR KIEKINIS SAPONINŲ TYRIMAS MAISTO PAPILDUOSE, KURIŲ SUDĖTYJE YRA GULSČIŲJŲ RAGUŽIŲ (TRIBULUS TERRESTRIS L.) ŽOLĖS EKSTRAKTO

FARMACIJOS FAKULTETAS

ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA

MONIKA PŪRAITĖ

KOKYBINIS IR KIEKINIS SAPONINŲ TYRIMAS MAISTO

PAPILDUOSE, KURIŲ SUDĖTYJE YRA GULSČIŲJŲ RAGUŽIŲ

(TRIBULUS TERRESTRIS L.) ŽOLĖS EKSTRAKTO

Vadovas: Prof. dr. Andrejus Ževžikovas

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS

ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA

KOKYBINIS IR KIEKINIS SAPONINŲ TYRIMAS MAISTO

PAPILDUOSE, KURIŲ SUDĖTYJE YRA GULSČIŲJŲ RAGUŽIŲ

(TRIBULUS TERRESTRIS L.) ŽOLĖS EKSTRAKTO

KAUNAS, 2019 Recenzentas

Vardas, pavardė, parašas Data:

Darbą atliko Magistrantė

Monika Pūraitė, parašas Data:

Darbo vadovas

Andrejus Ževžikovas, parašas Data:

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanė Ramunė Morkūnienė, parašas Data:

TURINYS

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 10

1.LITERATŪROS APŽVALGA ... 11

1.1 Gulsčiosios ragužės (Tribulus terrestris L.) morfologinės savybės ir paplitimas ... 11

1.2 Gulsčiosios ragužės panaudojimas ... 11

1.2.1 Poveikis reprodukcinei sistemai ... 12

1.2.2 II tipo diabeto gydymas ... 13

1.2.3 Širdies - kraujagyslių sistema ... 13

1.2.4 Priešvėžinis aktyvumas ... 14

1.2.5 Poveikis raumenų masei ... 14

1.3 Gulsčiųjų ragužių cheminė sudėtis ir pagrindiniai komponentai ... 15

1.4 Gulsčiųjų ragužių saponinų įvairovė ... 16

1.5 Saponinų ekstrakcijos metodai ... 17

1.6 Saponinų kokybinės ir kiekybinės analizės metodai ... 18

1.7 Gulsčiųjų ragužių maisto papildai ... 19

2. TYRIMO OBJEKTAS IR METODIKOS ... 20

2.1 Tyrimo objektas ... 20

2.1.1 Maisto papildų sudėtis ... 20

2.2 Kiekinis ir kokybinis diosgenino įvertinimas plonasluoksnės chromatografijos metodu ... 21

2.2.1 Reagentai ... 21

2.2.2 Aparatūra ir įranga ... 21

2.2.3 Tiriamojo tirpalo paruošimas ... 22

2.2.4 Etaloninio tirpalo paruošimas ... 22

2.3 Efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodikos validacija ... 23

Efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos analizės metodo validacija buvo atliekama pagal šiuos parametrus: metodo glaudumas (preciziškumas), specifiškumas, aptikimo riba, nustatymo riba, tiesiškumas. ... 23

2.4 Kiekybinis furostanolo tipo saponinų įvertinimas, skaičiuojamas kaip protodioscino kiekis ... 24

2.4.1 Metodika ... 24

2.4.2 Reagentai ... 24

2.4.3 Aparatūra ir įranga ... 24

2.4.4 Tiriamųjų tirpalų paruošimas ... 25

2.4.5 Standartinio ir lyginamojo tirpalų paruošimas ... 25

2.4.6 Spektrofotometrinio metodo atlikimo sąlygos ... 25

2.5 Duomenų statistinis įvertinimas ... 25

3. TYRIMO REZULTATAI ... 26

3.1 Diosgenino kokybinis nustatymas efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodu ... 26

3.2 Statistinis kokybinio identifikavimo duomenų įvertinimas ... 28

3.3 Kiekybinio diosgenino nustatymo EPC analizės metodo validacija... 29

3.4 Standartinio diosgenino tirpalo kalibracinės kreivės sudarymas ... 29

3.5 Diosgenino nustatymas gulsčiųjų ragužių maisto papildų tirpaluose ... 31

3.6 Furastanolo tipo saponinų, išreikštų protodioscino kiekiu, gulsčiųjų ragužių maisto papilduose įvertinimas UV-spektrofotometrijos metodu ... 31

3.7 UV-Spektrofotometrijos metodo ir efektyviosiosios plonasluoksnės chromatografijos metodo rezultatų palyginimas ... 33

4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 34

5. IŠVADOS ... 36

6. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS... 37

SANTRAUKA

KOKYBINIS IR KIEKINIS SAPONINŲ TYRIMAS MAISTO PAPILDUOSE, KURIŲ SUDĖTYJE YRA GULSČIŲJŲ RAGUŽIŲ (TRIBULUS TERRESTRIS L.) ŽOLĖS EKSTRAKTO

Monikos Pūraitės magistro baigiamasis darbas. Mokslinis vadovas prof. dr. Andrejus Ževžikovas; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos falkulteto, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra. – Kaunas.

Raktiniai žodžiai: Tribulus terrestris, zygophyllaceae, efektyvioji plonasluoksnė chromatografija, UV-spektrofotometrija, steroidiniai saponinai, protodioscinas, diosgeninas.

Tikslas: ištirti maisto papildų, kurių sudėtyje yra gulsčiųjų ragužių (Tribulus terrestris L.) žolės ekstrakto, cheminėje sudėtyje esančius saponinus taikant efektyviosios plonasluoknės chromatografijos ir UV- spektrofotometrijos metodus.

Tyrimo objektas: maisto papildai, kurių sudėtyje yra gulsčiųjų ragužių (Tribulus terrestris L.) ekstrakto bei miltelių.

Tyrimo metodika: gulsčiosios ragužės ekstrakte esančio saponino - diosgenino, identifikavimui ir kiekybės nustatymui pritaikyta efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos analizės metodika. Judrios fazės tirpiklių sistema sudaryta iš tolueno/etilacetato/skruzdžių rūgšties, (5/4/1, v/v/v), o ryškiklis, sudarytas iš anisaldehido/acto rūgšties/ konc. sieros rūgšties/ metanolio (5/100/50/850, v/v/v/v). Atliktas diosgenino identifikavimas, panaudojant diosgenino etaloninio junginio metanolinį tirpalą. Kiekinis diosgenino nustatymas atliktas remiantis kalibracinės kreivės sudarymo metodu. Taip pat, furostanolo tipo saponinų kiekis maisto papilduose įvertintas, taikant UV-spektrofotometrijos metodiką, kuri sudaryta remiantis Europos farmakopėjos 2.2.25 paragrafu.

Rezultatai: maisto papilduose, kurių sudėtyje yra gulsčiųjų ragužių ekstrakto, indentifikuotas diosgeninas, remiantis Rf reikšmėmis. Diosgenino standarto Rf reikšmė yra 0,623±0,02. Kiekinės analizės metu, taikant plonasluoksnės chromatografijos metodą, nustatytos diosgenino koncentracijos MP-1 (0,020 mg/ml), MP-2 (0,024 mg/ml), MP-3 (0,197 mg/ml), MP-4 (0,464 mg/ml) maisto papilduose. Taip pat, UV-spektrofotometrijos metodu įvertintas furostanolo tipo saponinų kiekis. Didžiausias kiekis nustatytas MP-4 (95,01%) maisto papilde, o mažiausias MP-1 (29,65%) ir MP-3 (30,15%).

SUMMARY

QUALITATIVE AND QUANTITATIVE ANALYSIS OF SAPONINS IN FOOD SUPPLEMENTS CONTAINING EXTRACT OF PUNCTURE VINE (TRIBULUS TERRESTRIS L.)

M. Pūraitė Master’s thesis/ academic cordinator prof. dr. Andrejus Ževžikovas; Lithuanian University of Health Sciences, medicine faculty, department of Analytical and Toxicological Chemistry, Kaunas. Keywords: Tribulus terrestris, zygophyllaceae, high-performance thin-layer chromatography, UV-spectrophotometry, steroidal saponins, protodioscin, diosgenin.

Aim of research: The aim of the study is to evaluate saponins in food supplements of Tribulus Terrestris presented in various pharmaceutical forms, using High-performance Thin-layer chromatographic analysis method and UV-spectrophotometric analysis.

Subjects of interest: Food supplements are presented in various pharmaceutical forms (gelatine capsules and tablets) containing steroidal saponins of Tribulus Terrestris.

Research medhodology: The methods used in this study are High-performance thin-layer chromatography (HPTLC) and UV-spectrophotometry. The HPTLC methodology has been adapted and validated for the quantitative assessment of diosgenin in food supplements. HPTLC was applied for identification and quantification of steroidal saponin – diosgenin. Solvent system containing toluene/etilacetate/formic acid (5/4/1, v/v/v) and the refining reagent was in a mixture of anisaldehide, acetic acid, concentrated sulfuric acid and methanol (5/100/50/850, v/v/v/v). Diosgenin was qualitatively determined by evaluation of Rf value of standard and comparing it with stock solution’s values. Quantification of diosgenin was evaluated by calibration curve of standard (diosgenin). Quantification of furostanol saponins determined as protodiosdin was made by UV-spectrophotometric analysis (Ph.eur. 2.2.25).

Results: Diosgenin was identificated in all food supplements of Tribulus terrestris. Rf value of diosgenin standard 0,623 ± 0,02. Quantative analysis of diosgenin by TLC showed these concentrations: MP-1 (0,020 mg/ml), MP-2 (0,024 mg/ml), MP-3 (0,197 mg/ml), MP-4 (0,464 mg/ml). Furostanol saponins determined as protodioscin evaluated by UV-spectrophotometry showed that MP-4 (95,01%) has the highest level of saponins and lowest level was determined in MP-1 (29,65%) and in MP-3 (30,15%) food supplements.

PADĖKA

Norėčiau padėkoti visiems padėjusiems atlikti magistrinį darbą. Dėkoju darbo vadovui profesoriui daktarui Andrejui Ževžikovui už rekomendacijas ir konsultacijas. Dėkoju docentei Augustai Ževžikovienei už patarimus. Taip pat, norėčiau padėkoti lektoriui Mindaugui Marksai už patarimus, konsultacijas ir pagalbą dirbant analitinėje laboratorijoje ir ruošiant magistro baigiamą jį darbą .

SANTRUMPOS

R2 _{– koreliacijos koeficientas;}

UV – ultravioletinė spinduliuotė;

TT – Tribulus terrestris L. (gulsčioji ragužė); EPC –efektyvioji plonasluoksnė chromatografija.

ĮVADAS

Moderniame amžiuje augalinės kilmės preparatai sulaukia vis daugiau dėmesio. Žmonės sveikatos palaikymui ar nežymiems sutrikimams renkasi žolinius preparatus, nes jie sukelia mažiau šalutinių reakcijų lyginant su sintetinės kilmės vaistais [1].

Šiuo metu Lietuvos ir kitų šalių augalinių preparatų rinkoje randama nemažai įvairių gulsčiųjų ragužių maisto papildų. Dažniausiai, tai yra Tribulus terrestris L. ekstrakto kapsulės ar tabletės. Taip pat, toks ekstraktas įeina ir į sudėtinių maisto papildų sudėtį. Pirmiausia literatūroje randamas gulsčiųjų ragužių poveikis reprodukcinei sistemai, kraujotakai bei raumenų masei, o galiausiai atliekami priešvėžinio poveikio tyrimai [2].

Nėra atlikta daug mokslinių tyrimu su gulsčiųjų ragužių maisto papildais, todėl yra svarbu ištirti, kokius veikliųjų medžiagų kiekius galima rasti maisto papilde esančiame sausajame ekstrakte. Viena svarbiausių biologiškai aktyvių junginių grupė nustatoma Tribulus terrestris L. augale ir apsprendžianti jo veikimą yra saponinai.

Tobulėjant šiuolaikinėms technologijoms, plonasluoksnės chromatografijos (PC) metodas vis dažniau naudojamas daugiakomponenčių mėginių analizei. Tai yra pusiau automatizuotas kokybinės ir kiekybinės analizės metodas, dėl ko tyrimas tampa tikslesnis ir greitesnis. Taip pat, PC galima derinti su tokiu metodu kai UV-spektrofotometrija, kuri nėra labai jautrus metodas, tačiau tinkamas bendram junginių kiekiui įvertinti.

Tyrimo problema yra ta, kad literatūroje plačiai aptariama ir nustatoma gulsčiųjų ragužių (Tribulus terrestris L.) žaliavos cheminė sudėtis, tačiau nėra atliekama daug tyrimų su maisto papildais arba jie yra senesni nei 10 metų. Kadangi, šiais laikais augalinės kilmės preparatų poreikis yra išaugęs, tai ne išimtis ir gulsčiųjų ragužių maisto papildai. Todėl svarbu tirti Tribulus terrestris L. sausojo ekstrakto cheminę sudėtį, kad išsiaiškinti, kokie aktyvūs junginiai bei kokie jų kiekiai įeina į maisto papildų sudėtį.

Mūsų tyrimo objektas yra maisto papildai, kurių sudėtyje yra gulsčiųjų ragužių (Tribulus terrestris L.) žolės ekstrakto. Šio tyrimo metu buvo atliktas kokybinis ir kiekinis diosgenino (vienas iš kaupiamųjų saponinų) nustatymas efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodu bei furostanolo tipo saponinų kiekio įvertinimas UV- spektrofotometrijos metodu. Gauti šio tyrimo rezultatai gali padėti greičiau ir tiksliau nustatyti furostanolo saponinų ir diosgenino kiekius augaliniuose preparatuose ir bus naudingi ateityje plėtojant panašaus pobūdžio tyrimus.

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Ištirti maisto papildų, kurių sudėtyje yra gulsčiųjų ragužių (Tribulus terrestris L.) žolės ekstrakto, saponinus taikant efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos ir UV-spektrofotometrijos metodus.

Darbo uždaviniai:

• Atlikti diosgenino kokybinę ir kiekybinę analizę taikant efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodą;

• Nustatyti furostanolo tipo saponinų kiekį analizei taikant UV-spektrofotometrijos metodą; • Palyginti rezultatus gautus efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos tyrimo metu su

1.LITERATŪROS APŽVALGA

1.1 Gulsčiosios ragužės (Tribulus terrestris L.) morfologinės savybės ir paplitimas

Gulsčiųjų ragužių (Tribulus terrestris L.) augalas yra keimerūninių (Zygophyllaceae L.) šeimos

atstovas, natūraliai augantis subtropiniuose ir dykumų regionuose. Jį galima rasti Bulgarijoje, Ispanijoje, Indijoje, Kinijoje, Meksikoje ir kitose panašaus klimato vietovėse . Šis augalas auga greitai, tačiau tam reikalingos gerai apšviestos, sausos vietos [3].

Gulsčioji ragužė – nedidelis, 10-60 cm. aukščio krūmas, kurio paviršius yra padengtas smulkiais šereliais. Lapai yra sudėtiniai, sudaryti iš 5-8 porų elipsinių arba pailgos formos lapelių. Žiedai yra geltonos spalvos, augantys ant trumpo kotelio [4]. Vaisiai yra penkiakampės žvaigždės formos, suspausti, padengti gelsvos spalvos gumbeliais. Priklausomai nuo porūšio, gulsčiųjų ragužių vaisiai, lapai ir žiedlapiai gali skirtis. Sveikatinimosi tikslais naudojami vaisiai, šaknys arba visas augalas [5].

1.2 Gulsčiosios ragužės panaudojimas

Gulsčioji ragužės naudojama įvairiose kultūrose jau nuo labai seniai. Kinijoje ir Indijoje tradicinėje medicinoje vartoti pradėta net prieš 5000 metų. Jos panaudojimas apima labai plačias sritis, pradedant akių ligomis, virškinamojo trakto sutrikimai ir baigiant lytinės sistemos sutrikimais. Bulgarijoje Tribulus L. ekstraktas naudotas hemorojaus gydymui [6].

Literatūroje skiriami ir kiti gulsčios ragužės panaudojimai. Bene labiausiai tiriamas yra poveikis reprodukcinei sustemai, nes atlikti tyrimai parodė teigiamus rezultatus gydant oligospermiją [7,8]. Tai pat, nustatyta, kad augalo ekstraktas stabdo vėžinių ląstelių proliferaciją bei skatina jų apoptozę [9].

1.2.1 Poveikis reprodukcinei sistemai

Į gulsčiosios ragužės sudėtį įeinantys furostanolio tipo saponinai (pvz.: prodioscinas, dioscinas) aktyvina liuteinizuojančio hormono (LH) gamybą hipofizėje. Dėl LH kiekio padidėjimo vyrų organizme padidėja testosterono išskyrimas [10]. Taip pat, reprodukcinei sistemai svarbus kitas aktyvių junginių poveikis. TT ekstrakto vartojimas, skatina organizme išsiskirti dehidroepiandrosteroną (DHEA). Manoma, kad tokį poveikį nulemia steroidinis saponinas – protodioscinas. Dėl šio junginio ilgėja ištvermė bei atsiranda lytinis potraukis [11].

Vyrų nevaisingumą gali lemti genetika, persirgtos ligos, gyvenimo būdas ar aplinkos veiksniai. Dažnai tai paveikia spermos kokybę: koncentraciją, judrumą, kiekį.[11] Mitybos ir maistinių medžiagų vaidmuo vaisingumui nėra aiškus, tačiau yra mokslinių tyrimų įrodančių TT ekstrakto naudą vyrams sergantiems oligospermija. Tyrimo tikslas buvo įvertinti TT ekstrakto poveikį reprodukcinei sistemai po ciklofosfamido vartojimo. Nors tyrimas buvo atliktas su žiurkėmis, gauti rezultatai parodė teigiamą poveikį gerinant biocheminius spermos parametrus, didinant testosterono kiekį bei gerinant histopatologinius pokyčius po ciklofosfamido vartojimo [12].

Z. Kamenov ir kt. tyrime buvo siekiama ištirti gulsčiųjų ragūžių ekstrakto (maisto papildas tabletėmis)

poveikį vyrams, kuriems pasireiškė impotencija, kai kuriais atvejais pasižyminti ir lytinio potraukio sumažėjimu ar išnykimu. Tyrime dalyvavo 180 vyrų, iš kurių pusė gavo TT ekstrakto tabletes, o kita pusė buvo placebo grupė. Tiriamieji 12 savaičių vartojo TT ekstrakto tabletes ( po 2 tabletes (250 mg) 3 kartus per parą). Poveikis lytinei funkcijai nustatytas, vertinant erekcijos, orgazmo, pasitenkinimo kriterijus pagal sudarytą klausimyną. Po tyrimo, gauti rezultatai parodė statistiškai reikšmingą lytinės funkcijos pagerėjimą, vertinant atskirus kriterijus. Nors TT ekstrakto poveikis reprodukcinei sistemai siejamas su protodioscino poveikiu dehidroepiandrosteronui (DHEA), tačiau tyrimo metu DHEA bei testosterono reikšmingų pokyčių nenustatyta [13].

Tai pat, yra nustatyta, kad apie 40 % moterų įvairiame amžiuje gali pasireikšti lytinės sistemos sutrikimai. Tokio pobūdžio disfunkcija moterims pasižymi pasikartojančiomis lytinės reakcijos ar noro problemomis [14]. Atlikto tyrimo metu, buvo siekiama įvertinti TT ekstrakto poveikį moterims. Gauti rezultatai atskleidė, kad vartojant 250 mg/3k. ekstrakto, pastebimas teigiamas pokytis vertinant DHEA kiekį organizme bei vertinant moterų savijautą [15].

1.2.2 II tipo diabeto gydymas

Tradicinėje Kinijos ir kitų šalių medicinoje viena iš nurodytų indikacijų yra II tipo diabeto gydymas. Tai nulemia augalo sudėtyje esantys saponinai (pvz.: harminas) [16]. Nors dauguma tyrimų yra atlikta su gyvūnais tačiau yra tirtas ir poveikis žmogaus organizmui. Tyrime dalyvavo II tipo diabetu sergančios moterys ir buvo tiriamas gulsčiųjų ragužių ekstrakto poveikis gliukozės kiekiui kraujo serume, glikozilintas hemoglobinas (HbA1c), didelio tankio lipoproteinai (DTL), mažo tankio lipoproteinai (MTL). Po 3 mėnesių vartojant 1000mg/d TT ekstrakto, gauti rezultatai parodė statistiškai reikšmingą gliukozės kiekio bei MTL sumažėjimą lyginant su placebo grupe [17].

Tyrime su gyvūnais nustatytas TT ekstrakto kartu su Andrographis paniculata L. ekstaktu antidiabetinis veikimas pelėse, kurioms buvo diagnozuotas aloksano monohidrato sukeltas diabetas. Pastebėta, kad toks ekstraktų derinys mažina gliukozės koncentraciją kraujyje ir manoma, kad šį veikimą galima sieti su antioksidantinėmis augalų savybėmis, tačiau veikimo mechanizmas nėra įrodytas. Taip pat, A.Istiak

ir kt. tyrime buvo nustatinėjamas tirto augalų mišinio toksiškumas. Analizės metu gauta, kad, vartojant

1 g/kg ekstraktų, žalingo poveikio pelėms nenustatyta [18].

1.2.3 Širdies - kraujagyslių sistema

Dar vienas gulsčiųjų ragužių veikimas, aprašytas tradicinėje tolimųjų rytų šalių medicinoje, yra poveikis kraujotakai. Teigiama, kad TT ekstraktas, kuriame yra gausu saponinų, plečia kraujagysles ir gerina kraujotaką [19]. Vienu naujausių tyrimu metu, nustatyta, kad vartojant TT ekstraktą galima sumažinti išeminio smegenų insulto riziką. Rezultatai parodė, kad ekstraktas pasižymi neuroprotekciniu poveikiu [20].

Taip pat, TT ekstraktas mažina cholesterolio kiekį organizme. Tyrime vertinamas TT gydymo poveikis po cholesterolio turinčios dietos triušiams, nustatant lipidų profilio pokyčius bei aortos struktūrinius pokyčius. Nustatyta, kad didelis cholesterolio kiekis lemia endotelio pakitimus, o TT ekstraktas sumažina pažaidą [21]. Taip pat, tiriant TT poveikį moterims, sergančioms II tipo diabetu, buvo nustatytas mažesnis bendro cholesterolio bei mažo tankio lipoproteinų kiekis lyginant su placebo grupe [17]. Deja, bet Z.Kamenov ir kt. tyrime, vyrams, vartojantiems po 2 tabletes (TT ekstrakto 250 mg) 3 kartus dienoje 12 savaičių, cholesterolio kiekio pokyčių nenustatyta. [13]

1.2.4 Priešvėžinis aktyvumas

Vis labiau didėjant moksliniam aktyvumui dėl augalinių vaistų ne išimtis, kad tiriamas ir TT ekstraktas. Šio ekstrakto pagrindiniai komponentai yra steroidiniai saponinai, kurie labiausiai žinomi dėl adrogeninio poveikio. Tačiau buvo pastebėtas ir priešvėžinis saponinų veikimas [22]. Tyrimo metu nustatyta, kad TT saponinai padidina keratinocitų atsparumą po dirbtinio spinduliavimo, slopindami ląstelių apoptozę dalyvaudami pažeistų ląstelių DNR atstatyme [24].

Kitame tyrime, buvo analizuojamas terestrozino D (TED), išgauto iš TT poveikis žmogaus, kuriam nustatyta neoperuojamo prostatos vėžio diagnozė, ląstelėms. Rezultatai parodė, kad TED efektyviai sustabdė vėžinių ląstelių augimą, o tuo pačiu auglio augimą ir angiogenezę [24].

Taip pat, tirtas TT ekstrakto poveikis žmogaus gaubtinės žarnos adenokarcinomos, prostatos karcinomos ir raumenų ląstelėms (fibroblastams), vertinant ląstelių gyvybingumą, proliferaciją bei žūties indukciją. Veikiant ląsteles 7 µg/m koncentracijos TT ekstraktu, buvo nustatyta 74% (prostatos karcinomos ląstelių) ir 46 % (gaubtinės žarnos karcinomos ląstelių) apoptozinių mirčių, taip pat pastebėtas daugiau kaip 90 % proliferacijos sumažėjimas visose ląstelėse. Tyrimo išvadoje pabrėžiama, kad TT ekstraktui yra jautresnės prostatos vėžio ląstelės lyginant jas su gaubtinės žarnos vėžio ląstelėmis [25].

1.2.5 Poveikis raumenų masei

Kaip ir minėta anksčiau gulsčiųjų ragužių sudėtyje esančios aktyvios medžiagos didina liuteinizuojančio hormono gamybą. Šis hormonas skatina testosterono gamybą, o kuo didesnis testosterono kiekis, tuo labiau auga raumenų masė ir ilgėja ištvermė. Dėl šio veikimo, TT ekstrakto maisto papildus vartoja sportininkai.

Tyrime dalyvavo trisdešimt du 20–22 metų sportininkai, kurių fizinis aktyvumas buvo susijęs su mokymusi sporto ir kūno kultūros studijų programoje. Dalyviai mokėsi apie 12 valandų per savaitę. Tiriamoji grupė vartojo 1875 mg TT ekstrakto per dieną. Literatūros analizė ir dabartinis tyrimas parodė, kad asmenų, kurie 20 dienų vartojo TT (1875 mg per parą), raida nebuvo pastebimai paveikta, tačiau buvo nustatytas jų rankų galios padidėjimas. Nors daug pakitimų nenustatyta, manoma, kad ilgesnis TT preparatų vartojimas turėtų didesnį poveikį [2].

Kinijoje atlikto tyrimo metu, buvo vertinamas TT ekstrakto poveikis boksininkų raumenų masei, pažaidai ir anaerobiniam pajėgumui. Sportininkai padalinti į dvi grupes, o viena iš grupių vartojo TT ekstraktą. Viso tyrimo metu abi grupės turėjo 3 savaites aukšto intensyvumo ir didelės apimties treniruotes tarp kurių buvo 4 savaičių pertrauka. Įvertinus rezultatus, vartojant 1250 mg TT ekstrakto,

nustatytas statistiškai reikšmingas raumenų pažaidos mažėjimas bei anaerobinio pajėgumo didėjimas. Deja, bet šio tyrimo metu pastebėta, kad TT ekstrakto vartojimas nepakeitė raumenų masės ir testosterono kiekio [26].

1.3 Gulsčiųjų ragužių cheminė sudėtis ir pagrindiniai komponentai

Gulsčiųjų ragužių augale nustatomi įvairūs komponentai: alkaloidai, flavonoidai, saponinai, tačiau pagrindinį augalo veikimą nulemia steroidiniai saponinai (furostanolo ir spirostanolo tipo) [27]. Jų augale identifikuojama virš 100 junginių [28].

Saponinai tai junginiai, kurių cukraus grandinė paprastai yra prijungta prie C-3 ir joje vyrauja 2–5 linijiniai arba šakotieji monosacharidai. Klasikinis saponinų apibrėžimas grindžiamas jų paviršinio aktyvumo arba ploviklių savybėmis, atspindint jų stabilų putų susidarymą vandens tirpaluose. Pagal struktūrą saponinus galima suskirstyti į dvi grupes. Pirmoji - spirostanolo tipo, kurią sudaro spirostano tipo aglikonai su C-3 padėtyje išsidėsčiusiomis cukraus grandinėmis (2 pav.). Antroji grupė apima furostanolo glikozidus, į kurių sudėtį įeina spirostanolo tipo skeleto aglikonai su atvira šonine grandine (transformuotas žiedas F hidrolizuojant C-22 acetatą iki 22,26-diolio) (3 pav.). Nustatyta mažiau furostanolo aglikono struktūrinių formų nei spirostanolų, bet daugiau glikozidų konjugatų (saponinų), nes cukraus grandinės gali būti susietos ne tik su C-3 padėtimi, bet dažnai ir C-26. Furostanolo tipo saponinai hidrolizės metu, veikiant specifiniams fermentams, gali būti verčiami spirostanoliniais. Taip pat, spirostanolo tipo saponinai rūgštinės hidrolizės metu, esant tam tikroms sąlygoms, gali virsti furostanoliniais. Kadangi, galimos įvairios junginių variacijos, tai ir saponinų nustatoma labai daug. Pagrindinės augalų šeimos, kuriose nustatomi saponinai yra lelijinių (Liliacea L.), dioskorėjinių (Dioscoracea L.) bei agavinių (Agavacea L.) [29].

Dažniausiai gulsčiųjų ragužių augale nustatomi yra protodioscinas, terestrosinai A-E, degalaktotigoninas, gitoninas, tigogeninas, diosgeninas, hekogeninas [2].

Skirtingose augalo dalyse aktyvių junginių kiekis nėra vienodas, vaisiuose ir lapuose jis didesnis nei šaknyse, tačiau išgaunant junginius dažnai naudojamas visas augalas [30].

1.4 Gulsčiųjų ragužių saponinų įvairovė

Saponinų kiekis gulsčiųjų ragužių augale priklauso nuo augimo vietos, sąlygų. Yra atlikta nemažai tyrimų, lyginančių skirtingose augimvietėse augančių TT cheminę sudėtį. Pavyzdžiui Fejer J.

ir kt. tyrime buvo analizuojami TT augalai, augantys Slovakijoje, Ukrainoje, Portugalijoje ir Turkijoje.

Atskirų saponinų (protodioscino, prototribescino, dioscino) kiekiai buvo vertinami efektyviosios skysčių chromatografijos metodu. Po analizės išsiaiškinta, kad didžiausias protodioscino kiekis nustatytas Portugalijoje augančiame augale, prototribescino – Ukrainoje augančiame augale, dioscino – Turkijoje augančiame augale. Didžiausias bendras saponinų kiekis nustatytas Ukrainoje ir Turkijoje augančiuose augaluose [31].

Dinchev D. ir kt. tyrime buvo analizuojami protodioscino, prototribestino, pseudoprotodioscino,

dioscino, tribestino ir tribulosino kiekiai Bulgarijos, Graikijos, Serbijos, Makedonijos, Turkijos, Gruzijos, Irano, Vietnamo, Indijos žaliavose. Analizės metu nustatyta, kad Bulgarijos, Turkijos, Graikijos, Serbijos, Makedonijos, Gruzijos ir Irano TT augalų cheminė sudėtis yra labai panaši, dominuojantys saponinai – protodioscinas, prototribestrinas. Vietnamo ir Indijos TT žaliavose nustatytas visiškai skirtingas saponinų profilis. Čia dominuojantis saponinas (iš tirtų 7) yra tribulosinas, o prototribestrino ir tribestino praktiškai nenustatyta [32].

Kitame tyrime, buvo vertinama Egipte augančių gulsčiųjų ragužių cheminė sudėtis. Analizei naudojamos išdžiovintos augalo dalys. Nustatyta 7,38 % saponinų ir 0,51 % diosgenino (efektyviosios skysčių chromatografijos metodu) [33].

Tokie gulsčiųjų ragužių sudėties tyrimai įrodo, kad skirtingomis sąlygomis augantys augalai, pasižymi ir skirtinga chemine sudėtimi. Galima teigti, aktyvių medžiagų sudėtis augaluose Azijos šalyse bei pietryčių Europoje skiriasi.

2 pav. Spirostanolo tipo saponinų struktūra.

3 pav. Furostanolo tipo saponinų struktūra.

1.5 Saponinų ekstrakcijos metodai

Saponinų ekstrakcija ir atskyrimas yra sudėtingas dėl struktūrinės įvairovės, atsirandančios dėl įvairių pakaitų (pvz., OH, CH3 arba COOH) aglikono fragmente. Taip pat, ekstrakciją dar labiau apsunkina cukraus vienetų skaičius, išdėstymas ir orientacija bei cukraus grandinių, prijungtų prie aglikono fragmento, skaičius ir tipai. Vertinant bendras saponinų savybes, jie turi didelį poliškumą, yra chemiškai ir termiškai labilūs, yra nepastovūs ir paprastai randami mažomis koncentracijomis augaluose [34]

Literatūroje yra siūlomas keletas naujesnių ekstrakcijos metodų: ultragarsinė ekstrakcija, ekstrakcija panaudojant mikrobangas, ekstrakcija superkritiniais skysčiais, pagreitinta ekstrakcija.

Ultragarsinė ekstrakcija vyksta, panaudojant ultragarsinę vonelę, kurioje galima nustatyti temperatūrą bei veikimo pobūdį. Šio metodo esmė yra ultragarso panaudojimas (dažniausiai nuo 20-100 MHz) tam kad tirpiklyje susidarytų burbuliukai, kurie dėl kavitacijos proceso suardo augalų ląstelių sieneles ir taip pagreitina tirpiklio skverbimąsi į augalinę žaliavą [35]. Nustatyta, kad šis metodas gali pagerinti aktyvių junginių išgavimą iš augalinės medžiagos. Tai pat, tai yra greitas, pigus metodas, nes sunaudojama mažiau tirpiklių. Kaip tirpiklius saponinų išskyrimui galima naudoti metanolį, etanolį [36].

Ekstrakcija panaudojant mikrobangas. Šis metodas yra pagrįstas tirpiklio ir matricos kaitimu, vykstančiu są veikaujant mikrobangoms su medžiaga. Dėl dipolių rotacijos ir dėl joninio laidumo mikrobangų energija virsta šiluma. Mikrobangų panaudojimas leidžia greitai ištirpinti, išdžiovinti organinius junginius ekstrakcijos metu. Pagrindiniai privalumai yra sumažėjusios tirpiklio sąnaudos, greitas atlikimas ir kokybiško ekstrakto pagaminimas. Deja, bet vienas iš trūkumų yra didelis balastinių medžiagų išekstrahavimas. [36].

Pagreitinta ekstrakcija tirpikliais, tai ekstrakcija naudojant slėgį ir padidintas temperatūras. Aukštame slėgyje padidėja tirpiklio virimo temperatūra, todėl analizę galima atlikti aukštesnėje temperatūroje. Taip pat slėgis pagerina tirpiklio skverbimąsi į matricą. Aukšta temperatūra sumažina tirpiklio klampą bei paviršiaus įtempimą, todėl tai dar labiau pagerina tirpiklio skverbimąsi į matricą. Metodas naudoja gana mažai tirpiklių, yra greitas, visiškai automatizuotas, paprastas [37].

Ekstrakcija superkritiniais skysčiais. Tai yra plačiai naudojamas metodas, kurio privalumas yra, kad gaunami nuo balastinių medžiagų išvalyti tirpalai. Juose nėra chlorofilo ar kitų nepolinių junginių, kurie netirpūs superkritiniame skystyje (dažniausiai naudojamas CO2 superkritiniame būvyje, nes yra chemiškai inertiškas, pigus, netoksiškas, nedegus) [38].

1.6 Saponinų kokybinės ir kiekybinės analizės metodai

Kokybiniam ir kiekybiniam augalinės žaliavos įvertinimui gali būti taikoma daugelis metodų. Tiek spektrofotometrinė analizė (naudojama bendram saponinų kiekiui įvertinti), tiek chromatografinė analizė (naudojama norint įvertinti specifinius junginius). Metodo pasirinkimas priklauso nuo tiriamųjų junginių savybių, kiekio, turimos aparatūros.

Gulsčiojoje ragužėje esančių saponinų nustatymui dažniausiai pasirenkami yra efektyviosios skysčių chromatografijos, plonasluoksnės chromatografijos, kiek rečiau UV- spektrofotometrijos metodai [39]. Efektyvioji skysčių chromatografija – tai efektyvus, automatizuotas, greitas metodas, kurio metu galima nustatyti kokybinę ir kiekybinę preparato sudėtį. Jis yra paremtas teigiama analičių bei stacionarios fazės są veika. Analičių skirstymas metode vyksta kolonėlėje. Kolonėlės turi daug porų, kurios pripildytos tam tikra stacionaria faze. Mišinio komponentų atskyrimas vyksta dėl sąveikos su nejudria ir judria fazėmis [40]. Steroidinių saponinų nustatymui dažniausiai pasirenkamos chromatografavimo sąlygos yra: UV matomos šviesos detektorius, 40 laipsnių temperatūra, C18 tipo kolonėlė, dvinarė skysčių sistema, sudaryta iš vandens ir acetonitrilo arba parūgštinto vandens ir acetonitrilo [31, 41]. Taip pat, galimi ir kitokie judrios fazės komponentai. Šis metodas yra tinkamas ir maisto papildų kokybinei ir kiekybinei analizei atlikti. Nustatyta, kad parinkus tinkamas judrios fazės tirpiklių sistemas, galima identifikuoti diosgenino junginį [42].

Plonasluoksnė chromatografijos metodas yra greitas ir itin tinkamas daugiakomponenčių mišinių analizei, nes galima identifikuoti ir kiekybiškai įvertinti tiek organinius, tiek neorganinius junginius. Taip pat, analizės metu galima tirti nežinomos sudėties tirpalus, juos lyginti su jau nustatytais junginiais ir taip ištirti cheminę sudėtį. Šio metodo metu nejudri fazė yra aliuminio folijos ar stiklinės plokštelės, padengtos plonu sorbento sluoksniu (pavyzdžiui silikageliu, aliuminio oksidu, celiulioze ar kt.). Chromatografavimo jautrumas bei greitis priklauso nuo sorbento sluoksnio storio ant inertinio paviršiaus. Judrioji fazė yra tirpiklių sistema, kuri teka plokštele kapiliarinio veikimo principu [40]. Dažniausiai naudojamos tirpiklių sistemos saponinų nustatymui yra: toluenas/etilacetatas/metanolis (7/3/1/v/v/v), toluenas/etilacetatas/skruzdžių rūgštis (5/4/1, v/v/v), ar kitos sistemos. Kaip ryškiklis naudojamas anisaldehido – sieros rūgšties reagentas [43,44].

1.7 Gulsčiųjų ragužių maisto papildai

Remiantis sveikatos apsaugos ministerijos apibrėžimu, maisto papildas - maisto produktas, skirtas papildyti įprastą maisto racioną ir kuris vienas arba derinyje su kitomis medžiagomis yra koncentruotas maistinių ar kitų medžiagų, turinčių mitybinį arba fiziologinį poveikį, šaltinis. Europos vartotojų centro duomenimis apie 20% Europos gyventojų vartoja bent vieną maisto papildą, o šiaurės Europos šalyse suvartojimo lygis žymiai didesnis nei pietų. Ne išimtis ir maisto papildai, kurių sudėtyje yra gulsčiosios ragužės ekstrakto. Lietuvoje tokių notifikuotų maisto papildų yra 17 rūšių, neskaitant nebaigtų nagrinėti arba sudarytų iš kelių veikliųjų medžiagų. Analizuojant preparatus, galima pastebėti, kad dažnai gulsčioji ragužė derinama su gulsčiosios serenojos vaisių ekstraktu, ženšenio ekstraktu, L-argininu ar kitomis medžiagomis, kurios lemia platesnį veikimo pobūdį. Vienkomponenčiai gulsčiųjų ragužių maisto papildai yra standartizuojami pagal furostanolio tipo saponinų kiekį. Jis gali būti nurodytas procentais, pažymint bendrą saponinų kiekį arba išskiriant vieno saponino kiekį (dažniausiai protodioscino). Kadangi pagrindinė biologiškai aktyvi medžiaga yra saponinai, tai preparatai yra skiriami impotencijos profilaktikai, miokardo pažaidos mažinimui, tai pat sportininkams, dėl raumenų ištvermės didinimo. Literatūroje ginčijamasi dėl vienkartinės dozės ir dažnumo. Vienur nurodoma 250mg/3k/d, 500 mg/d, kitur 30mg/kg, tačiau rekomenduojama neviršyti 1500 mg/d ekstrakto dozės, nes galimos šalutinės reakcijos (viena dažniausių buvo skrandžio dirginimas ir gastroezofaginis refliuksas). Be to, įrodyta, kad dozuojant mažesniais kiekiais ekstrakto bei skiriant dažnesniais intervalais pasiekiamas geresnis preparato įsisavinimas nei vartojant didelėmis dozėmis.

2. TYRIMO OBJEKTAS IR METODIKOS

2.1 Tyrimo objektas

Tyrime analizuojami maisto papildai, kurių sudėtyje yra gulsčiųjų ragužių (Tribulus terrestris L.) ekstrakto bei miltelių. Maisto papildai pasirinkti, norint įvertinti kokybinę ir kiekinę saponinų (diosgenino ir protodioscino) įvairovę efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos ir UV-spektrofotometrijos metodais. Preparatai įsigyti įvairiose Lietuvos vaistinėse ir elektroninėje parduotuvėje, atsisžvelgiant į tai, ar jie yra notifikuoti ir patvirtinti Lietuvoje, ar tai vienkomponenčiai preparatai, koks kiekis ekstrakto įeina į sudėtį ir kokia yra preparato farmacinė forma.

Tyrime analizuojami šie papildai :

• MP-1 (pagaminta Europos Sąjungoje pagal specialų užsakymą); • MP-2 (pagaminta Jungtinėse Amerikos Valstijose);

• MP-3 (pagaminta Bulgarijoje); • MP-4 (pagaminta Lietuvoje).

2.1.1 Maisto papildų sudėtis

Maisto papildas – 1 (MP-1). 1 tabletėje yra 1500 mg gulsčiosios ragužės ekstrakto (79% saponinų). Pagalbinės medžiagos: lipnumą reguliuojančios medžiagos (dikalcio fosfatas, mikrokristalinė celiuliozė ir riebalų rūgščių magnio druskos).

Maisto papildas – 2 (MP-2). 1 kapsulėje yra 625 mg Tribulus mišinio (Tribulus terrestris L. ekstraktas

(40% saponinų), gulsčiųjų ragužių milteliai). Pagalbinės medžiagos: apvalkalas (želatina), lipnumą reguliuojanti medžiaga dikalcio fosfatas, magnio stearatas.

Maisto papildas – 3 (MP-3). 1 tabletėje yra 250 mg gulsčiųjų ragužių žolės ekstrakto (furostanolo tipo saponinų ne mažiau nei 112,5 mg). Pagalbinės medžiagos: lipnumą reguliuojanti medžiaga (mikrokristalinė celiuliozė), stabilizatoriai (polivinilpirolidonas, krospovidonas), apvalkalą sudarančios medžiagos (emulsiklis polivinilo alkoholis, lipnumą reguliuojanti medžiaga talkas, dažikliai titano dioksidas ir geležies oksidai, hidroksidai, emulsiklis lecitinas, tirštiklis ksantano derva), lipnumą reguliuojančios medžiagos (talkas, silicio dioksidas, magnio stearatas).

Maisto papildas – 4 (MP-4). 1 kapsulėje yra 350 mg sausojo gulsčiųjų ragužių žolės ekstrakto, atitinkančio 210 mg protodioscino (60%). Pagalbinės medžiagos: kapsulės apvalkalas (želatina), užpildas (mikrokristalinė celiuliozė, magnio stearatas), dažiklis (titano dioksidas).

2.2 Kiekinis ir kokybinis diosgenino įvertinimas plonasluoksnės chromatografijos

metodu

2.2.1 Reagentai

Naudotos medžiagos ir reagentai yra analitinio švarumo:

Etaloninio tirpalo gamybai naudojamas diosgenino standartas (≥93% Sigma Aldrich, Vokietija) ir metanolis (99,9%, Sigma Aldrich);

Tiriamųjų tirpalų gamyboje naudojami: sieros rūgštis (99,9 %, Sigma Aldrich), etanolis (96% ,,Vilniaus degtinė’’, Lietuva), amonio chloridas (99,5 %, Sigma Aldrich), dichlormetanas (≥99.8%, Sigma Aldrich), natrio hidroksidas (≥98%,Sigma Aldrich), metanolis (99,9%, Sigma Aldrich), išgrynintasis vanduo, pagamintas ,,Milipore’’ (JAV) vandens gryninimo sistema;

Judrios fazės gamybai: toluenas (99,8 %, Sigma Aldrich), etilacetatas (Sigma-Aldrich, Toluca, Meksika), skruzdžių rūgštis (≥96%, Sigma-Aldrich, Scnelldorf);

Ryškiklio gamybai: anisaldehidas (99 %, Sigma Aldrich), acto rūgštis (≥99 %, Sigma Aldrich), sieros rūgštis (99,9 %, Sigma Aldrich), metanolis (99,9%, Sigma Aldrich).

2.2.2 Aparatūra ir įranga

• Analitines svarstyklės (Shimadzu Auw 120 D, Bellingen, Vokietija); • Automatinės pipetės (Eppendorf Research, Eppendorf, JAV);

• Vandens gryninimo sistema Millipore (Bedfordas, MA, JAV); • Ultragarso vonelė Biosonic UC100 (JAV);

• Termostatinė vonelė (WiseClean, Korėja);

• Q-Max membraninis filtras (25 mm diametro, 0,45 μm dydžio poros, Frisenette, Knebel, Vokietija);

• Termostatinė vonelė (ViseClean, Korėja);

• _{10 cm aukščio, 10 cm pločio, 0,2 mm storio aliuminio plokštelė, dengta silikageliu (60F254, Merck,} Vokietija);

• Stiklinė, dvivietė, plonasluoksnės chromatografijos kamera su metaliniu dangčiu (Camag, Muttenz, Šveicarija);

• Mikrošvirkštas (100 μl; Camag Linomat Syringe, Muttenz, Šveicarija); • Elektrinė kaitlentė (Camag, TLC Plate Heater III, Šveicarija);

• Pusiau automatinis mėginių ėmiklis Camag Linomat 5(Camag, Muttenz, Šveicarija); • Plonasluoksnės chromatografijos vizualizatorius (Camag, Muttenz, Šveicarija).

2.2.3 Tiriamojo tirpalo paruošimas

Į 100 ml kolbas atsveriama po 0,5 g kiekvieno mėginio miltelių. Kaip ekstrahentas naudojamas sieros rūgštimi parūgštintas 96 % etanolis. Kolbų turinys maišomas ultragarso vonelėje 10 minučių ir kaitinamas su grįžtamuoju šaldytuvu 60 min 100 ∘C temperatūroje. Po hidrolizės tirpalai atvėsinami ir filtruojami per 0.22𝜇m polipropileno membraną. Tuomet filtratai koncentruojami 50 ∘C temperatūroje, panaudojant rotacinį garintuvą, kol tampa klampios konsistencijos. Koncentratai atvėsinami, šarminami 25 % amoniako tirpalu (pH > 12) ir skiedžiami išgrynintu vandeniu santykiu 1:2. Reekstrakcija vykdoma, panaudojant dichlormetaną. Ekstraktai pirmiausia plaunami pridedant 2 ml 0,1 M natrio hidroksido tirpalo, po to 1 ml išgryninto vandens. Tirpalai sumaišomi ir paliekami nusistovėti 15 min. Tuomet atskiriamas dichlormetano sluoksnis, panaudojant dalomąjį piltuvą. Dichlormetano tirpalai garinami, panaudojant rotacinį garintuvą iki sauso likučio, kuris tirpinamas 5 ml metanolio. Prieš analizę tirpalai filtruojami per 0.22 𝜇m polipropileno membraną.

2.2.4 Etaloninio tirpalo paruošimas

Standartinio tirpalo paruošimui panaudojamas diosgenino standartas. Ruošiamas 1 mg/ml metanolyje (99,9 %) tirpalas. Siekiant užtikrinti visišką diosgenino ištirpimą, tirpalas dedamas į ultragarso vonelę 10 minučių.

2.2.5 Efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos sąlygos

Šiame tiriamajame darbe saponino diosgenino kiekinis ir kokybinis tyrimas buvo atliktas naudojant efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodą. Junginys identifikuotas pagal standartinį tirpalą. Ieškomo junginio poslinkis plokštelėje atitiko standartinį junginį.

• Silikageliu dengtos aliuminio plokštelės paruošimas: plokštelė dedama į plonasluoksnės chromatografijos kamerą, kurioje judri fazė yra metanolis (99,9%, Sigma Aldrich). Paliekama, kol judri fazė pakils per visą plokštelę ir tuomet džiovinama 60∘C temperatūroje 5 minutes. • Pagaminti tiriamieji tirpalai ir etaloninis diosgenino tirpalas užnešti ant paruoštos

chromatografinės plokštelės, naudojant pusiau automatinį mėginių užnešėją Camag Linomat 5 su 100 tūrio mikrošvirkštu, plokštelėje paliekančiu brūkšnio pavidalo dėmes.

• Plokštelė perkeliama į chromatografavimo kamerą, kurioje judri fazė sudaryta iš trijų eliuentų sistemos: tolueno, etilacetato, skruzdžių rūgšties (5 : 4 : 1, v/v/v).

• Tirpikliui pakilus apie 8 cm nuo pradžios linijos (ji žymima 1 cm nuo apačios), plokštelė ištraukta ir džiovinama kambario temperatūroje (25 ± 2∘C) kelias minutes.

• Plokštelė apipurškiama ryškikliu, sudarytu iš : anisaldehido, acto rūgšties, koncentruotos sieros rūgšties, metanolio (5:100:50:850, v/v/v/v) ir džiovinama 105∘C 10 min.

• Išdžiovintos plokštelės apšviestos regimąja šviesa. Tiriamųjų junginių reikšmės nustatytos vizualizatoriaus ir programinės įrangos pagalba.

• Norint atlikti kiekinį diosgenino nustatymą buvo sudaryta kalibracinė kreivė (panaudojant Camag vizualizatorių, Win-Cats ir VideoScan programas).

2.3 Efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodikos validacija

Efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos analizės metodo validacija buvo atliekama pagal šiuos parametrus: metodo glaudumas (preciziškumas), specifiškumas, aptikimo riba, nustatymo riba, tiesiškumas.

Atlikus pakartojamumo ir atkuriamumo tyrimus buvo įvertintas analizės metodo preciziškumas. Glaudumas vertinamas atsižvelgiant į santykinį standartinį nuokrypį (SSN): SSN išreiškiamas procentais apskaičiuojant standartinio nuokrypio ir vidutinio smailės ploto santykį. Pakartojamumas: atliktos trys mėginio analizės tą pačią dieną (angl.k. intra-day); atkuriamumas: atliktos trys mėginio analizės trijų skirtingų dienų laikotarpiu (angl.k. inter-day). Specifiškumas buvo vertinamas lyginant standartinio diosgenino tirpalo ir mėginiuose esančio diosgenino Rf reikšmių sutampamumą . Apsikaičiuojamos aptikimo (angl.k. limit of detection – LOD) ir nustatymo ribos (angl.k. limit of quantitation – LOQ). Identifikavimo galimybės vertinamos lyginant standartinio diosgenino tirpalo ir mėginių Rf reikšmes; kiekinio nustatymo galimybės vertinamos lyginant standartinių diosgenino ir mėginių dėmių ryškumo analizės duomenis.

2.4 Kiekybinis furostanolo tipo saponinų įvertinimas, skaičiuojamas kaip

protodioscino kiekis

2.4.1 Metodika

Furostalolo tipo saponinų, skaičiuojamų kaip protodioscinas, analizė vykdoma remiantis Europos farmakopėjos straipsniu Ph.Eur.2.2.25. Furostanolo tipo saponinai, išreikšti protodioscinu, apskaičiuojami pagal formulę:

(%) = 𝐴𝑡 × 0,2 × 0,00566 × 50 𝐴𝐶𝑜𝐶𝑙2 × 𝐺𝑡 × 2

× 100

At - tiriamojo tirpalo absorbcijos dydis 515 nm šviesos bangos ilgyje;

A - Kobalto chlorido heksahidrato absorbcijos dydis 515 nm šviesos bangos ilgyje; 0,2 - kobalto chlorido kiekis (1 g/10ml);

Gt - tiriamajam tirpalui imto ekstrakto kiekis gramais; 2 - tiriamojo tirpalo kiekis mililitrais;

0,00566 - koreliacijos koeficientas.

2.4.2 Reagentai

Visi naudoti reagentai ir medžiagos yra analitinio tikslumo: p-dimetilaminobenzaldehidas (98 %, Sigma Aldrich), vandenilio chloridinė rūgštis (≥ 37 %, Sigma Aldrich), metanolis (99,9%, Sigma Aldrich), kobalto chloridas (≥ 98 %, Sigma Aldrich).

2.4.3 Aparatūra ir įranga

• Analitines svarstyklės (Shimadzu Auw 120 D, Bellingen, Vokietija); • Automatinės pipetės (Eppendorf Research, Eppendorf, JAV);

2.4.4 Tiriamųjų tirpalų paruošimas

Pirmiausia paruošiamas reagentas A (R-A): 1,0 g p-dimetilaminobenzaldehido ištirpinama 14,4% metanolinėje vandenilio chlorido rūgštyje.

50,0 mg gulsčiosios ragužės ekstrakto sumaišoma su 40 ml metanoliu (99,9%, Sigma Aldrich) ir paliekama 15-20 minučių kambario temperatūroje. Tuomet pridedama dar 50 ml metanolio ir filtruojama per popieriaus filtrą. Imama 2 ml filtrato, pridedama 3 ml metanolio (99,9%, Sigma Aldrich) ir 2 ml R-A. Tuomet tirpalai kaitinami vandens vonioje 55-60 ∘C temperatūroje 2 valandas. Pasibaigus kaitinimui, tirpalai atvėsinami ir adsorbcijos dydis matuojamas esant 515 nm šviesos bangos ilgiui.

2.4.5 Standartinio ir lyginamojo tirpalų paruošimas

Kaip standartinis tirpalas, vietoje protodioscino standartinio tirpalo, naudojamas vandeninis kobalto chlorido tirpalas (20g/l). Siekiant visiško kobalto chlorido ištirpimo tirpalas dedamas į ultragarso vonelę 10 min.

Kaip lyginamasis tirpalas, naudojamas metanolis (99,9%, Sigma Aldrich).

2.4.6 Spektrofotometrinio metodo atlikimo sąlygos

• Analizė atliekama UV-spektrofotometru (Dynamica, Halo DB-20, Vokietija), esant 515 nm šviesos bangos ilgiui;

• Pirmiausia nustatomas lyginamojo tirpalo absorbcijos dydis, tuomet tiriamųjų tirpalų ir galiausiai standartinio tirpalo.

2.5 Duomenų statistinis įvertinimas

Gautų duomenų analizė atlikta ,,Microsoft Office Excel 2007"(Microsoft, JAV), programine įranga. Gauti duomenys apskaičiuoti pagal formules, apskaičiavus gautų tyrimo duomenų matematinį vidurkį, standartinį nuokrypį, santykinį standartinį nuokrypį. Kiekybinio nustatymo bandymai kartoti po tris kartus, jų gauti rezultatai išreikšti vidurkiais ± standartine išraiška.

3. TYRIMO REZULTATAI

3.1

Diosgenino

kokybinis

nustatymas

efektyviosios

plonasluoksnės

chromatografijos metodu

Maisto papildai, kurių sudėtyje yra gulsčiosios ragužės ekstrakto, buvo įsigyti Lietuvos vaistinėse Kaune ir Vilniuje bei elektroninėje parduotuvėje.
Šių maisto papildų mėginiuose buvo nustatomas diosgeninas. Jis identifikuotas visuose tiriamuosiuose tirpaluose.

Atliekant steroidinio saponino diosgenino nustatymą maisto papildų tiriamuosiuose tirpaluose, siekiant išgauti ryškesnes dėmes, pradiniams tirpalams ruošti buvo sveriama po 0,50 g kiekvieno maisto papildo ekstrakto miltelių.

Kadangi maisto papildų farmacinės formos buvo tabletės ir kapsulės, sveriančios nevienodai, tai buvo smulkinamos iki miltelių formos, kad būtų patogiau sverti. Imama po 10 vienetų kiekvienos rūšies kapsulių ar tablečių, nustatomas vidutinis tabletės svoris ir tuomet smulkinama grūstuvėje iki vientisų miltelių.

Kadangi saponinai yra poliniai junginiai, tai poliariniai tirpikliai, tokie kaip etanolis, metanolis, vanduo ir jų derinys gali būti naudojami geresniam šių medžiagų ekstrahavimui nei nepoliniai tirpikliai. Metanolis ir etanolis parodė didesnę ekstrakcijos galią nei vanduo, tačiau nustatyta, kad diosgeninas yra labiau tirpus metanolyje, todėl jis ir pasirinktas standartinio tirpalo ruošimui.

Ruošiant tiriamuosius gulsčiųjų ragužių maisto papildų tirpalus buvo naudojamos Deshmukh ir kt. [42] ir Ghodasara ir kt. [33] metodikos. Pirmosios metodikos esmė buvo metanolinių tirpalų sonifikavimas ultragarso vonelėje, o antrosios metanolinių tirpalų kaitinimas panaudojant grįžtamąjį šaldytuvą. Taip pat, tos pačios metodikos buvo išbandytos su etanoliu. Po ekstrakcijos tiriamieji tirpalai bei standartinis diosgenino tirpalas buvo užnešami ant chromatografinės plokštelės ir patalpinama į chromatografavimo kamerą. Apipurškus ryškikliu bei pakaitinus, plokštelėje išryškėjo tik diosgenino standarto dėmė, o tiriamuosiuose tirpaluose diosgenino identifikuoti nepavyko (4 pav.).

5 paveiksle pavaizduota standartinio diosgenino bei tiriamųjų maisto papildų ekstraktų chromatograma regimojoje šviesoje ir 366 nm bangos ilgio ultravioletinės šviesos spektre.

Remiantis Laila O. ir kt. [37] rekomendacijomis, buvo pasirinktas sudėtinis ekstrakcijos būdas, kai apjungiami ultragarsinės ekstrakcijos ir ekstrakcija, panaudojant rotacinį garintuvą. Kaip tirpiklis panaudojamas parūgštintas etanolis, o reekstracija vykdoma dichlormetanu. Apipurškus ir pakaitinus plokštelę, buvo gauta diosgenino standarto ir maisto papildų tiriamųjų tirpalų chromatografiniai stulpeliai (5 pav.).

Ieškant tinkamiausios efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodikos, norint identifikuoti steroidinį saponiną – diosgeniną, būtina pasirinkti tinkamas ryškinimo sąlygas. Atlikus eksperimentinius tyrimus, siekiant įvertinti, kuris ryškinimo būdas yra tinkamesnis diosgenino identifikavimui, buvo pasirinktas ryškinimas regimąja šviesa, vietoje 366 nm bangos ilgio ultravioletinės šviesos, nes taip geriau galima įvertinti tiriamąjį saponiną (5 pav).

4 pav. Diosgenino standarto (S) ir tiriamųjų tirpalų, ruoštų ultragarsinės vonelės (3,4) ir su grįžtamuoju šaldytuvu (1,2) ekstraktų chromatogramos.

Atsižvelgiant į duomenis, gautus atlikus kokybinį diosgenino nustatymą maisto papilduose EPC analizės metodu remiantis Laila O. ir ktl. rekomendacijomis, nustatyta, kad į visų mėginių sudėtį įeina diosgeninas. Duomenys vertinti pagal vidutines Rf reikšmes, gautas pakartotinių tyrimų metu. Diosgenino standarto pasikliautinasis intervalas 0,603-0,643, o mėginių Rf reikšmės pateiktos 1 lentelėje.

Diosgenino standartas

MP-1 MP-2 MP-3 MP-4

Rf reikšmė 0,623 0,619 0,620 0,621 0,623

3.2 Statistinis kokybinio identifikavimo duomenų įvertinimas

Norint įvertinti, ar pritaikyta metodika yra patikima, buvo atlikti pakartotiniai bandymai su tiriamais maisto papildais: trys mėginio analizės trijų skirtingų dienų laikotarpiu EPC metodu, nustatant diosgeniną. Atlikus pakartotinius bandymus gautas Rf vidurkis yra 0,623, paklaida ±0,02, pasikliautinasis intervalas 0,603-0,643.

Atsižvelgiant į tai, kad atlikto statistinio pakartojamumo bandymo paklaidos neviršijo 5 % ribos, galima teigti, jog naudotas metodas yra patikimas vykdant kokybinį identifikavimą tiriamuosiuose mėginiuose.

S 1 2 3 4 (I) Regimojoje šviesoje

S 1 2 3 4 (II) UV- šviesoje

1 lentelė. Sulaikymo rodiklių reikšmių lentelė

3.3 Kiekybinio diosgenino nustatymo EPC analizės metodo validacija

Metodikos validacija yra svarbi analizės dalis, patvirtinanti, kad metodas atitinka specifinius parametrus ir yra tinkamas naudoti praktikoje. Buvo atlikta efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos analizės metodo kiekiniam diosgenino nustatymui maisto papilduose validacija pagal pasirinktus validacijos parametrus. Remiantis ICH gairėmis buvo įvertintas metodo tinkamumas ir atitikimas šiems parametrams: specifiškumui, tiesiškumui, rezultatų preciziškumui, taip pat buvo nustatytos aptikimo ir nustatymo ribos.

Įvertinus naudotos metodikos pakartojamumą, buvo gautas variacijos koeficientas 0,02 %, atkuriamumo 0,02%. Duomenų preciziškumas neviršija 5 % ribos ir yra tinkamas norint metodiką pritaikyti diosgenino kiekinei analizei maisto papilduose.

Metodo validacijos metu nustatyta analitės aptikimo riba (LOD) – 0,008 mg/ml, o kiekybinio nustatymo riba (LOQ) – 0,022 mg/ml. Tiesiškumas buvo įvertintas matuojant skirtingų koncentracijų diosgenino standarto tirpalus ir sudarant kalibracinę kreivę nuo 0,03125 mg/ml iki 0,5 mg/ml. Apskaičiuotas kalibracinės diosgenino kreivės koreliacijos koeficientas (R2_{=0,9985) patvirtino metodo tiesiškumą.}

3.4 Standartinio diosgenino tirpalo kalibracinės kreivės sudarymas

Standartio tirpalo kalibracinės kreivės sudarymui buvo naudojami 0,5 mg/ml, 0,25 mg/ml, 0,125 mg/ml, 0,0625 mg/ml, 0,03125mg/ml metanoliniai diosgenino tirpalai. Kalibracinės kreivės sudarymas yra paremtas šviesos absorbcijos smailės priklausomybe nuo tirpalo koncentracijos dėmėje. Priklausomai nuo analizuojamo junginio koncentracijos, skiriasi dėmės ryškumas, o tuo pačiu ir dėmės šviesos absorbcijos plotas (6 pav.)

Gautos chromatogramos plotas buvo įvertintas naudojant vizualizatorių ir VideoScan programą. Atlikus analizę nustatomas santykis tarp esamo diosgenino kiekio ir chromatografinės smailės ploto (2 lentelė).

Eilės numeris

Diosgenino koncentracija (mg/ml) Chromatografinės smailės užimamas plotas 1. 0,03125 34593,75 2. 0,0625 41687,50 3. 0,125 55875,00 4. 0,25 84250,00 5. 0,5 1410000,00

Bandymas buvo kartojamas tris kartus, norint įsitikinti, kad rezultatai nekinta. Pagal gautus rezultatus buvo sudaryta kalibracinė kreivė (5 pav.) ir gauta kalibracinė formulė (𝑦 = 2,75 ∗ 104_{+ 2,27 ∗ 10}5_𝑥), kuria galima apskaičiuoti esamo diosgenino kiekį, žinant chromatografinės smailės plotą. Čia Y – chromatografinės smailės plotas, o X – nustatomas diosgenino kiekis (mg/ml).

7 pav. Diosgenino kalibracinė kreivė

2 lentelė. Diosgenino kiekių ir chromatografinių smailių užimamų plotų santykiai

3.5 Diosgenino nustatymas gulsčiųjų ragužių maisto papildų tirpaluose

MP-1 MP-2 MP-3 MP-4

Diosgeninas

(mg/ml) 0,020±0,001 0,0236±0,001 0,197±0,010 0,464±0,023

Vertinant diosgenino kiekį, didžiausia jo koncentracija nustatyta MP-4 (0,464±0,023) mėginyje, o mažiausiai MP-1 (0,020±0,001). Kaip matoma 8 paveiksle, MP-1 ir MP-2 maisto papilduose diosgenino kiekis beveik nesiskiria, o lyginant su MP-3 mėginiu, jie yra 9,8 karto mažesni. Taip pat lyginant MP-1 ir MP-2 mėginius su MP- 4, skirtumas yra 23 kartai.

Rasto diosgenino kiekio papilduose negalima palyginti su gamintojo nurodytais kiekiais, nes gamintojas nurodo tik bendrą saponinų kiekį procentais.

3.6 Furastanolo tipo saponinų, išreikštų protodioscino kiekiu, gulsčiųjų ragužių

maisto papilduose įvertinimas UV-spektrofotometrijos metodu

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0.5 MP-4 MP-3 MP-1 MP-2 DIO SG EN IN O KIE KIS ( MG /ML )

DIOSGENINO KIEKIO T.TERRESTRIS L.

MAISTO PAPILDUOSE PALYGINIMAS

8 pav. Diosgenino kiekio maisto papildų mėginiuose palyginimas 3 lentelė. Nustatyta vidutinė diosgenino koncentracija mėginiuose

Protodioscino kiekis maisto papildų ekstraktuose buvo vertinamas pagal Europos farmakopėjos straipsnį 2.2.25. Kaip standartinis tirpalas naudojamas kobalto chlorido heksahidrato tirpalas, o furastanolo tipo saponinų kiekis išreikštas protodioscinu įvertintas panaudojant koreliacijos koeficientą A=f(C). Siekiant gauti tikslius rezultatus, tyrimas kartotas tris kartus.

Atlikus saponinų analizę, vertinant bendrą furostanolio tipo saponinų kiekį, buvo nustatyti procentiniai kiekiai farmacinėje formoje (tabletėse arba kapsulėse) (4 lentelė).

Maisto papildas

Farmacinė forma

Furostanolo tipo saponinų, išreikštų,

protodioscinu, kiekis 1 kapsulėje ar tabletėje

MP-1 Tabletė 29,65 ± 1,483 %

MP-2 Kapsulė 56,21 ± 2,811 %

MP-3 Tabletė 30,15 ± 1,508 %

MP-4 Kapsulė 95,01 ± 4,755 %

Analizės metu, daugiausia furostanolo tipo saponinų nustatyta MP-4 maisto papilduose (95, 01 %). Mažiausiai furostanolo tipo saponinų nustatyta MP-1 (29,65 %) ir MP- 3 (30,15 %). Žymaus skirtumo tarp MP-1 ir MP-3 furostanolio tipo saponinų kiekio nepastebėta. MP-2 maisto papilde nustatytas saponinų kiekis yra 1,7 karto mažesnis nei MP-4 .

Tabletėse (MP-1, MP-3) nustatytas furostanolo tipo saponinų kiekis buvo abejais atvejais mažesnis nei maisto papilduose, kurių farmacinė forma yra kapsulės (MP-2, MP-4).

Ant dviejų (MP-3; MP-4) iš keturių tirtų maisto papildų pakuočių buvo nurodytas furostanolo saponinų kiekis (5 lentelė). MP-3 analizės metu nustatytas saponinų kiekis yra 30,15 %, o gamintojo nurodytas – 45 %. MP-4 mėginyje nustatyta 95,01 % saponinų, o gamintojo nurodytas – 100 %. Vertinant preparatų kokybę, galima būtų teigti, kad MP-4 maisto papildas atitinka kokybės reikalavimus, nes neviršija 5 % ribos, o MP-3 neatitinka kokybės standartų. Tačiau, darant tokio pobūdžio išvadas, reikėtų atsižvelgti į tai, jog analizė buvo vykdoma taikant UV-spektrofotometrijos metodą. Remiantis literatūra, tai nėra labai jautrus metodas, o analizei įtakos galėjo turėti gulsčiųjų ragužių kaupiami antocianidinai ir maisto pipildų sudėtyje esančios pagalbinės medžiagos. Tam, kad geriau vertinti maisto papildų kokybę, reikėtų atlikti saponinų nustatymą kitu modernesniu metodu (pavyzdžiui efektyviaja skysčių chromatografija).

Maisto papildas Gamintojo nurodytas furostanolo tipo saponinų kiekis

Eksperimentinio tyrimo metu nustatyto furostanolo tipo saponinų kiekis

MP-1 40% saponinų 29,65 %

MP-2 79% saponinų 56,21 %

MP-3 45 % furostanolo saponinų 30,15 %

MP-4 100% furostanolo saponinų 95,01 %

3.7

UV-Spektrofotometrijos

metodo

ir

efektyviosiosios

plonasluoksnės

chromatografijos metodo rezultatų palyginimas

UV-spektrofotometrinis metodas yra tinkamas įvertinti bendrą saponinų kiekį augaliniuose preparatuose, tačiau tai nėra tikslus metodas, norint nustatyti atskirus saponinus. Siekiant tikslesnių duomenų galima rinktis chromatografinius metodus. Šiame darbe, diosgenino nustatymui, buvo pasirinktas efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodas. Vertinant gautus rezultatus, nustatyta, kad didžiausi kiekiai furostanolo tipo saponinų bei diosgenino nustatyta MP-4 maisto papilde. Mažiausia furostanolo tipo saponinų koncentracija, o taip pat diosgenino, gauta MP-1 preparate. Lyginant MP-2 ir MP- 3 maisto papildus, pastebėta, kad nors ir MP-3 preparate nustatoma mažesnė furostanolo saponinų koncentracija, čia aptinkama daugiau diosgenino, kas galėtų lemti platesnį šio papildo terapinį poveikį.

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 MP-1 MP-2 MP-3 MP-4 FURO ST A N O LO S A PO N IN Ų IR DIO SG EN IN O KIE KIS ( PR O C.) Furostanolo saponinų kiekis (proc.) Diosgenino kiekis (proc.)

9 pav. Furostanolo saponinų ir diosgenino kiekio palyginimas

4. REZULTATŲ APTARIMAS

Šio tyrimo metu buvo analizuojami TT ekstrakto maisto papildai efektyviosio plonasluoksnės chromatografijos ir UV-spektrofotometrijos metodais. Įvertintas bendras furostanolo tipo saponinų kiekis ir diosgenino kiekis ekstraktuose.

Efektyvioji plonasluoksnė chromatografija, tai vienas dažniausių analizės metodų saponinų identifikavimui ir kiekybei nustatyti. Tai yra lengvas, pusiau automatizuotas metodas, tinkantis daugiakomponenčių preparatų tyrimui atlikti. S.Ivanova ir kt. [2] straipsnyje tiriami maisto papildai, kurių sudėtyje yra gulsčiųjų ragužių ekstrakto, ultraefektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodu. Kaip ir atliktame tyrime, S.Ivanova ir kt. metodikoje reikėjo tinkamai paruošti maisto papildus, tai reiškia išvalyti juos nuo balastinių medžiagų. Atsvertas medžiagos kiekis buvo sumaišytas su parūgštintu etanoliu ir kaitintas su grįžtamuoju šaldytuvu, reekstrakcija vykdoma panaudojant chloroformą. Tirpalai pirmiausiai plaunami natrio šarmo tirpalu (laisvųjų riebalų rūgščių pašalinimui), vėliau išgrynintuoju vandeniu (hidrofilinių medžiagų pašalinimui). Tuomet tirpalai išgarinami ir likutis tirpinamas pradiniame tirpiklyje. Šį procesą būtina atlikti analizuojant maisto papildus, tam kad įvyktų konjugatų hidrolizė ir iš ekstraktų atsipalaiduotų aktyvūs junginiai. S.Ivanova ir kt. tyrime buvo atlikta metodikos validacija ir optimizacija bei maisto papilde nustatyti po 0,006% kempferolio ir harmino, 0,108% oleino rūgšties, 0,022% diosgenino. Šis diosgenino kiekis maisto papilde S.Ivanova ir ktl. tyrime yra panašus į kiekį gautą mūsų atliktame tyrime.

R. Kalyani ir kt. [45] tyrime, ultraefektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodu buvo

vertinamas diosgenino kiekis ,,Laghu Gokshur’’ (Tribulus terrestries L.) ir ,,Brihat Gokshur ‘’(Pedalium murex L.) ekstraktuose, įeinančiuose į ajurvedinius maisto papildus. Kaip ir mūsų atliktame tyrime, R.Kalyani ir kt. metodikoje, kaip tirpiklių sistema, buvo naudotas tolueno, etilacetato, skruzdžių rūgšties sistema, ruošiant preparatų tiriamuosius tirpalus, pradinė stadija buvo kaitinimas su grįžtamuoju šaldytuvu. R.Kalyani ir kt. tyrime nustatytas diosgenino kiekis yra žymiai didesnis nei nustatytas mūsų analizės metu.

Ghodasara T. ir kt. [33] tyrime buvo tiriamas preparatas, kurio sudėtyje yra TT ir Bergenia ligulata L.

ekstraktų. Analizės metu tiriamosios tabletės buvo kaitinamos su grįžtamuoju šaldytuvu, kaip ekstrahentą panaudojant metanolį (99,9 %). Tirpiklių sistema chromatografavimo kameroje buvo sudaryta iš tolueno, etilacetato ir skruzdžių rūgšties (6/5/1, v/v/v). Tirpikliams pakilus iki reikiamos ribos, plokštelė džiovinama kambario temperatūroje ir analizuojama densitometriškai. Ši metodika skiriasi nuo mūsų atliktos, nes Ghodasara T. ir kt. tyrime pritaikytos tiriamojo tirpalo ruošimo sąlygos netiko mūsų analizuojamiems preparatams (neišryškėjo diosgenino dėmės). Taip pat, mūsų atveju buvo

naudotas sieros rūgšties – anisaldehido ryškiklis bei plokštelės kaitinimas 105 temperatūroje. Vaidya v.

ir kt. [46] tyrime preparato, kurio sudėtyje yra TT ekstrakto, tiriamasis tirpalas buvo ruošiamas panašiai

kaip ir mūsų atliktame tyrime, be to plokštelė buvo apipurškiama tokiu pačiu ryškikliu (sieros rūgšties – anisaldehido). Vaidya V. ir kt. metodikoje skyrėsi judriosios fazės komponentai (toluenas, etilacetatas, skruzdžių rūgštis/ledinė acto rūgštis). Gavus rezultatus, nustatytas diosgenino kiekis TT preparate buvo 0.022%, kas yra žymiai mažiau nei gauta mūsų atliktos analizės metu

Kadangi į gulsčiųjų ragužių cheminę sudėtį įeina labai daug saponinų, kurių kiekis skirtingose rūšyse gali būti nevienodas, tai ir tiriamuosiuose maisto papilduose jis gali skirtis. Be to, maisto papildų gamintojas ženklinimo tekste nenurodo iš kokios šalies gauta žaliava, todėl yra sunku vertinti skirtingus preparatus.

UV-spektrofotometrija yra rečiau naudojamas saponinų nustatymo metodas, tačiau taip pat naudingas norint kiekybiškai įvertinti saponinų kiekį preparate. Kadangi tai nėra labai atrankus metodas, naujausi tyrimai nėra atliekami arba jie yra derinami su modernesniais (pvz.: efektyviaja skysčių chromatografija). Baccou J.C. ir kt. [47] tyrime buvo siekiama nustatyti bendrą steroidinių saponinų kiekį spektrofotometriškai, panaudojant spalvos reakcijas su anisaldehidu, sieros rūgštimi ir etilacetatu. Nors reakcijų principas nėra iki galo aiškus, autoriai teigia, kad saponinų ir koncentruotos sieros rūgšties sąveika sukelia hidrolizę ir susidarę sapogeninai iš karto reaguoja su etilacetatu ir anisaldehidu. Šis aprašytas metodas skiriasi nuo atlikto mūsų tyrime, tačiau taip pat efektyvus bendram saponinų kiekio nustatymui. Pandya K. ir kt. [48] tyrime buvo tirta įvairių augalų, tarp jų ir gulsčiųjų ragužių, preparatų kokybė. Vertinamas mikrobinis užterštumas, sunkiųjų metalų kiekis, o taip pat ir aktyvių komponentų kiekis. TT augalo ekstrakte buvo nustatinėjamas saponinų kiekis gravimetriniu metodu. Šio metodo mūsų tyrime nebuvo taikyta, tačiau nustatytas saponinų kiekis preparate (28,95± 0,36) buvo panašus į mūsų tyrime UV-spektrofotometrijos metodu nustatytą kiekį MP-1 (29,65 %) ir MP-3 (30,15 %) maisto papilduose.

Steroidinių saponinų nustatymui galima naudoti įvairias metodikas, tačiau atliekant maisto papildų tyrimus, svarbu atkreipti dėmesį į tiriamųjų tirpalų ruošimo rekomendacijas, aprašytas literatūroje. Nors tyrimų su gulsčiųjų ragužių preparatais nėra daug, tačiau išskiriami keli pagrindiniai modernūs metodai (EPC ir ESC) jų saponinų identifikavimui ir kiekiniam įvertinimui. Taip pat, svarbu paminėti, kad ne visos aprašytos ekstrakcijos metodikos yra tinkamos visiems TT preparatams. Mūsų atliktas tyrimas parodė, kad metanolio ir etanolio ekstrakcija, kaitinant su grįžtamuoju šaldytuvu, taip pat ekstrakcija ultragarsu (tiek metanolio, tiek etanolio) nebuvo tinkama MP-1, MP-2, MP-3, MP-4 maisto papildams tirti EPC metodu.

5. IŠVADOS

1. Išnagrinėjus literatūrą, buvo parinkta Laila O. ir kt. metodika diosgenino nustatymui maisto papildų mėginiuose. Visuose tirtuose maisto papilduose identifikuotas diosgeninas. Nustatymui buvo naudota tirpiklių sitema sudaryta iš tolueno, etilacetato, skruzdžių rūgšties, (5/4/1, v/v/v), o ryškiklis sudarytas iš anisaldehido, acto rūgšties, konc. sieros rūgšties, metanolio (5/100/50/850, v/v/v/v). Kiekinės analizės metu didžiausias diosgenino kiekis nustatytas MP-4 maisto papilde (0,464 mg/ml), o MP-1 (0,020 mg/ml) ir MP-2 (0,024 mg/ml) preparatuose gautas mažiausias kiekis.

2. Furostanolo tipo saponinų kiekis, išreikštas protodioscino kiekiu, buvo vertinamas pritaikant Europos farmakopėjoje nurodytą metodiką (Ph.Eur.2.2.25), atliekant analizę UV-spektrofotometrijos metodu. Didžiausias kiekis nustatytas MP-4 (95,01%) maisto papilde, o mažiausias MP-1 (29,65%) ir MP-3 (30,15%) preparatuose.

3. Efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos bei UV-spektrofitometrijos analizių metu didžiausias diosgenino ir furostanolo saponinų kiekis nustatytas MP-4 maisto papilde, o mažiausi atitinkamų junginių kiekiai MP-1 preparate. UV-spektrofotometrijos metodu nustatyta, kad mažesni furostanolo saponinų kiekiai yra tablečių farmacinėje formoje nei kapsulėse. Tiriant skirtingų farmacinių formų maisto papildus EPC metodu, diosgenino kiekiui įtakos nenustatyta. Atlikus diosgenino analizę plonasluoksnės chromatografijos metodu, galima teigti jog tai yra atrankus, greitas, tikslus metodas, nustatinėjant atskirus junginius vienkomponenčiuose preparatuose. Bendram saponinų kiekiui įvertinti galima rinktis UV- spektrofotometrinį metodą, tačiau tai nėra itin jautrus metodas, todėl vertinant augalinių preparatų sudėtį reikėtų spektrofotometrinį būdą derinti su chromatografiniais.

6. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS

Šiame tyrime buvo vertinamas furostanolo tipo saponinų kiekis ir diosgenino kiekis. Tam, kad tiksliau galima būtų analizuoti maisto papildų sudėtį, reikėtų pasirinkti daugiau konkrečių saponinų. Galėtų būti vertinamas protodioscino, tribestrino, dioscino, diosgenino standartų tirpalas. Taip pat, analizės metu reikėtų analizuoti ir gulsčiųjų ragužių žaliavą, kad nustatytume, kiek vidutiniškai aptinkama tam tikrų saponinų. Kaip lyginamasis analizės metodas galėtų būti efektyvioji skysčių chromatogafija, nes remiantis literatūros analize, tai irgi jautrus, atrankus, greitas metodas saponinų analizei atlikti.