RAUDONŲJŲ DOBILŲ EKSTRAKTO ĮTERPIMAS Į GELIUS IR BIGELIUS BEI JŲ BIOFARMACINIS VERTINIMAS

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

FARMACIJOS FAKULTETAS

KLINIKINĖS FARMACIJOS KATEDRA

PAULIUS DŪDONIS

RAUDONŲJŲ DOBILŲ EKSTRAKTO ĮTERPIMAS Į

GELIUS IR BIGELIUS BEI JŲ BIOFARMACINIS

VERTINIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas

Prof. dr. Vitalis Briedis

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

FARMACIJOS FAKULTETAS

KLINIKINĖS FARMACIJOS KATEDRA

Tvirtinu:

Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis

Data

RAUDONŲJŲ DOBILŲ EKSTRAKTO ĮTERPIMAS Į GELIUS IR BIGELIUS

BEI JŲ BIOFARMACINIS VERTINIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas

Prof. dr. Vitalis Briedis

Data

Recenzentas

Darbą atliko

Magistrantas

Paulius Dūdonis

Data

Data

TURINYS

3 DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 12

4 LITERATŪROS APŽVALGA... 13

4.1 Odos pažeidimų priežastys ir jų prevencija ... 13

4.2 Raudonojo dobilo (trifolium pretense) paplitimas... 13

4.3 Raudonųjų dobilų ekstrakto cheminė sudėtis ... 14

4.4 Raudonojo dobilo (trifolium pratense) biologiškai aktyvių junginių analizės metodai 15 4.5 Raudonųjų dobilų ekstrakto biologinis aktyvumas ... 17

4.6 Geliai ... 19

4.7 Bigeliai... 19

4.8 Veikliųjų junginių atpalaidavimo iš puskiečių vaisto formų kinetikos tyrimai... 20

5 METODIKA ... 25

5.1 Tyrimo objektas ... 25

5.2 Medžiagos ir įranga ... 25

5.2.1Medžiagos ... 25

5.2.2Įranga ... 25

5.3 Efektyviosios skysčių chromatografijos metodo sąlygos ... 26

5.4 Raudonųjų dobilų ekstrakto tirpumo tyrimas ... 26

5.5 Eksperimentinių formuluočių su raudonųjų dobilų ekstraktu gamyba ... 27

5.5.1Gelių gamybos metodika ... 27

5.6 Eksperimentinių formuluočių su raudonųjų dobilų ekstraktu kokybės vertinimas ... 28

5.6.2Eksperimentinių formuluočių su raudonųjų dobilų ekstraktu reologiniai tyrimai ... 28

5.7 Raudonųjų dobilų ekstrakto atpalaidavimas iš eksperimentinių gelių in vitro tyrimai 28 5.8 Statistinė duomenų analizė ... 29

6 REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 30

6.1 Raudonųjų dobilų ekstrakto ultra-efektyviosios skysčių chromatografijos metodo validacija 30 6.2 Raudonųjų dobilų ekstrakto tirpumas ... 32

6.3 Eksperimentinių formuluočių su raudonųjų dobilų ekstraktu kokybės vertinimas ... 34

6.3.1Eksperimentinių formuluočių su raudonųjų dobilų ekstraktu pH reikšmių nustatymas ... 34

6.3.2Eksperimentinių formuluočių su raudonųjų dobilų ekstraktu reologiniai tyrimai ... 35

6.4 Raudonųjų dobilų ekstrakto atpalaidavimas iš eksperimentinių gelių in vitro tyrimai 36 7 IŠVADOS ... 40

8 PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 41

SANTRAUKA

RAUDONŲJŲ DOBILŲ EKSTRAKTO ĮTERPIMAS Į GELIUS IR BIGELIUS

BEI JŲ BIOFARMACINIS VERTINIMAS

P. Dūdonio magistro baigiamasis darbas/ mokslinis vadovas prof. dr. V. Briedis

Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmacijos fakulteto Klinikinės farmacijos katedra. Kaunas.

Darbo tikslas – pagaminti gelius ir bigelius su raudonųjų dobilų ekstraktu ir atlikti jų

biofarmacinį vertinimą.

Darbo uždaviniai:

1. Išvystyti ir validuoti metodiką raudonųjų dobilų ekstrakto veikliųjų junginių (daidzeino, genisteino, formononetino ir biochanino A) kokybinei ir kiekybinei analizei.

2. Pagaminti eksperimentines formuluotes su raudonųjų dobilų ekstraktu – gelius ir bigelius – bei įvertinti jų kokybę.

3. Ištirti ir įvertinti pagamintų formuluočių reologines charakteristikas.

4. Ištirti raudonųjų dobilų ekstrakto veikliųjų junginių atpalaidavimą iš sumodeliuotų formuluočių tyrimais in vitro.

Metodai: Ekstraktas analizuojamas pritaikant ultra-efektyviosios skysčių chromatografijos

metodiką biologiškai aktyviems junginiams – daidzeinui, genisteinui, formononetinui ir biochaninui A – kokybiškai ir kiekybiškai nustatyti. Gelių ir bigelių su raudonųjų dobilų ekstraktais kokybė vertinama nustatant pH reikšmes, reologines savybes bei atliekant biofarmacinį veikliųjų junginių atpalaidavimo tyrimą in vitro.

Rezultatai: Įteisinta UESC metodika daidzeino, genisteino, formononetino ir biochanino A

kiekybiniam nustatymui. Nustatytas kalibracinių kreivių koreliacijos koeficientas R2 _{> 0,999.} Nustatyta optimali polisorbato 80 (5 %) koncentracija raudonųjų dobilų ekstraktui ištirpti. Sumodeliuotos stabilios puskietės vaisto formos, kurių pH svyruoja nuo 6,24 iki 6,82, konsistencijos koeficientas nuo 6,89 ± 0,25 iki 259,28 ± 0,49 Pa·s n. Biofarmacinio tyrimo in vitro metu iš sumodeliuotų gelių ir bigelių atsipalaidavo nuo 25,32 ± 0,3 iki 157,16 ± 1,9 µg/cm2 _{veikliųjų junginių.}

Išvados:

1. Įvertinus mokslinius duomenis, pasirinktas, išvystytas ir validuotas raudonųjų dobilų veikliųjų junginių – daidzeino, genisteino, formononetino ir biochanino A – ultra-efektyviosios skysčių chromatografijos analizės metodas. Šis metodas buvo pritaikytas ekstrakto kokybės ir gelių bei bigelių su raudonųjų dobilų ekstraktu vertinimui biofarmaciniuose tyrimuose.

2. Remiantis moksline literatūra sumodeliuotos eksperimentinės formuluotės su raudonųjų dobilų ekstraktu – geliai ir bigeliai, kuriose raudonųjų dobilų ekstraktas įterptas tirpalo forma. Suformuotų eksperimentinių formuluočių pH reikšmės (6,24 - 6,82) atitiko ant odos vartojamų preparatų ribas.

3. Tyrimų rezultatai parodė, jog formuojant gelius ir bigelius pasirinkta gelifikuojanti medžiaga ir jos kiekis daro įtaką reologinėms charakteristikoms. Didžiausia konsistencijos koeficiento reikšmė būdinga geliams su KMC gelifikuojančia medžiaga – 259,28 ± 0,49 Pa·s n_{, o} mažiausia, bigeliams su mažiausia gelifikuojančių medžiagų koncentracija – 6,89 ± 0,25 Pa·s n_. 4. Tyrimų rezultatai parodė, kad karboksimetilceliuliozės geliai yra tinkamiausia forma ekstrakto

SUMMARY

DEVELPMENT EVALUATION OF GELS AND BIGELS CONTAINING RED

CLOVER EXTRACT

Paulius Dūdonis master thesis/ Term paper advisor: prof. V. Briedis;

Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of pharmacy, Department of Clinical Pharmacy. Kaunas

Objective of work: To prepare and analyze gels and bigels with red clover extract and evaluate their quality.

Main tasks:

1. To develop and validate a suitable method for main active compounds (daidzein, genistein, formononetino and biochanino A) of red clover extract quality and quantity analysis.

2. To formulate experimental formulations (gels and bigels) with red clover extract and evaluate their quality.

3. Investigate and evaluate the rheological characteristics of the finished formulations.

4. To investigate the release of red clover extract active compounds in vitro, from designed semisolid dosage forms.

Methods: The analysis of the extract is executed by using UHPLC for biologically active compounds.

Quality of the bigels and gels with red clover extract was evaluated by measuring pH values, rheological properties and by testing the release of active compounds in vitro.

Results: Capillary UHPLC method for analysis of daidzein, genistein, formononetin and biochanin A

was validated. Calibration curves correlation coefficient was R2 > 0,999. Optimal concentration of tween 80 to dissolve red clover extrat was measured to be 5 %. Formulated semisolid forms are stable with pH values of 6,24 to 6,82, a consistency coefficient (K) values – of 6,89 ± 0,25 to 259,28 ± 0,49 Pa·s n_{. In vitro release studies showed that from modulated gels and bigels formulations released of} 25,32 ± 0,3 to 157,16 ± 1,9 µg/cm2 active compounds.

Conclusions:

1. Based on published scientific data an UHPLC method was developed and validated to evaluate main active compounds of red clover extract (daidzein, genistein, formononetin and biochanin a) in quality assays of the extract and during biopharmaceutical assays in vitro with semisolid dosage forms with red clover extract.

2. Based on scientific literature, semisolid dosage forms with Red clover extract were developed – gels and bigels, when the extract was incorporated in the forms of solution.

3. The results showed that selected auxiliary material influence rheological characteristics in the semisolid dosage forms. The biggest consistency coefficient value show gels with carboxymethyl cellulose, the lowest bigels.

4. The results showed that carboxymethyl cellulose gels are the most appropriate semisolid form to incorporate red clover extract, based on the highest amount of released active compounds.

PADĖKA

Už suteiktas kokybiškas darbo sąlygas, teorinę, praktinę pagalbą ir materialinę bazę rengiant mokslinį darbą nuoširdžiai dėkoju darbo vadovui, Klinikinės farmacijos katedros vedėjui prof. dr. Vitaliui Briedžiui.

Už pagalbą bei patarimus atliekant mokslinius tyrimus nuoširdžiai dėkoju Klinikinės farmacijos katedros doktorantui Vyčiui Čižinauskui ir visam katedros kolektyvui.

1 SANTRUMPOS

% – procentai

UESC – ultra-efektyvioji skysčių chromatografija pH – vandenilio potencialas °C – laipsniai Celsijaus pav. – paveikslas K – konsistencijos koeficientas n – tekėjimo indeksas UV – ultravioletiniai spinduliai LOD – kokybinio nustatymo riba LOQ – kiekybinio nustatymo riba SN – bazinės linijos triukšmas

CE-ED – kapiliarinę elektroforezę su elektrochemine detekcija KMC – karboksimetilceliuliozė

NADPH – nikotinamido adenindinukleotido fosfatas (redukuota forma) DPPH – 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo laisvasis radikalas

2 ĮVADAS

Raudonųjų dobilų ekstraktas yra vienas iš plačiai naudojamų izoflavonų šaltinių. Įvairūs raudonųjų dobilų produktai yra vartojami peroraliai, siekiant pagerinti esamą sveikatos būklę ar apsisaugoti nuo galimų sveikatos sutrikimų. Rinkoje esančių produktų pagrindiniais veikliaisiais komponentais laikomi izoflavonai genisteinas, daidzeinas, formononetinas ir biochaninas A, pagal kuriuos šis ekstraktas ir yra standartizuojamas JAV farmakopėjoje. Europoje šio ekstrakto standartizavimui naudojamasi JAV farmakopėjos gairėmis. Literatūros duomenimis, dėl izoflavonų gausos šis ekstraktas pasižymi stipriomis antioksidacinėmis, uždegimą slopinančiomis bei antimikrobinėmis savybėmis ir pradedamas dažniau naudoti kosmetiniuose produktuose (1). Klausimų kelia mokslinės informacijos apie dobilų ekstrakto veikliųjų junginių atsipalaidavimą iš puskiečių vaisto formų stoka bei ribotos galimybės numatyti ekstrakto poveikį odai ir jos struktūroms.

Šio darbo tikslas yra įvertinti eksperimentinių formuluočių su raudonųjų dobilų ekstraktu fizikines bei chemines savybes. Tyrimo metu bus prasirinkti ir pritaikyti analitiniai metodai raudonųjų dobilų ekstrakto izoflavonų analizei ir kokybei įvertinti. Taip pat, nustatyti veikliųjų junginių atsipalaidavimą iš puskiečių vaisto formų in vitro tyrimais.

3 DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas – pagaminti gelius ir bigelius su raudonųjų dobilų ekstraktu ir atlikti jų biofarmacinį

vertinimą.

Darbo uždaviniai:

1. Išvystyti ir validuoti metodiką raudonųjų dobilų ekstrakto veikliųjų junginių (daidzeino, genisteino, formononetino ir biochanino A) kokybinei ir kiekybinei analizei.

2. Pagaminti eksperimentines formuluotes su raudonųjų dobilų ekstraktu – gelius ir bigelius – bei įvertinti jų kokybę.

3. Ištirti ir įvertinti pagamintų formuluočių reologines charakteristikas.

4. Ištirti raudonųjų dobilų ekstrakto veikliųjų junginių atpalaidavimą iš sumodeliuotų formuluočių tyrimais in vitro.

4 LITERATŪROS APŽVALGA

4.1 Odos pažeidimų priežastys ir jų prevencija

Oda – pats didžiausias žmogaus kūno paviršiaus dangalas. Odos pagrindinė funkcija yra apsauginė, tačiau dėl didelio paviršiaus ploto ir lengvo prieinamumo gali būti pažeidžiama įvairių išorinių faktorių. Vienas iš svarbiausių faktorių didinančių odos vėžio riziką ir sukeliančių odos pažeidimus yra ultravioletinė spinduliuotė (2). Ultravioletinė spinduliuote yra skirstoma į UVC ( 200-280nm), UVB (280-320nm) ir UVA (320-400nm) bangų ilgius. Tačiau tiktai UVA ir UVB spinduliuotės pasiekia žemę. UV spinduliai odai turi dvejopą poveikį: fotocheminį ir terminį. UVC ir UVB dažniausiai sukelia fotocheminius pakitimus, o UVA terminius. Ultravioletinė spinduliuotė absorbuojama ląstelėse ir suardo baltymų, nukleininių rūgščių jungtis. Skatina laisvųjų radikalų susidarymą (3).

Laisvieji radikalai – chemiškai aktyvus vienetas turintis neporinį elektroną. Pagrindiniai laisvieji radikalai yra superoksidas, peroksidas, hidroksilo radikalas, singletinis deguonis, azoto oksidas, azoto dioksidas. Žmogaus oda pasižymi endogenine antioksidacine sistema, kuri mažina oksidacinį stresą ir neutralizuoja laisvuosius radikalus (4). Tačiau veikiant UV spinduliuotei laisvųjų radikalų susidarymas paspartėja, todėl odos endogeninė sistema nesugeba apsisaugoti nuo oksidacinio streso. Oksidacinio streso poveikis ne tik didina sergamumą širdies ir kraujagyslių ligomis, bet ir skatina odos senėjimą, sausėjimą, eritemas bei didina odos vėžio riziką (3,5).

Natūralios kilmės medžiagos ir ekstraktai gali būti naudojami apsaugant odą nuo oksidacinio streso poveikio bei siekiant užkirsti kelią galimiems odos pažeidimams. Antioksidantai – tai natūralios cheminės medžiagos, kurios mažina, neutralizuoja ir apsaugo nuo laisvųjų radikalų daromos žalos. Šiuo metu plačiausiai išnagrinėtas kvercetino, resveratrolio, silimarino ir kitų natūralių antioksidantų poveikis odos pažeidimų prevencijai (6,7). Mokslinių tyrimų rezultatai, taip pat patvirtina ir raudonųjų dobilų ekstrakto antioksidacinį, priešuždegiminį, antimikrobinį ir antikarcinogeninį poveikį (2,3,8).

Raudonųjų dobilų ekstraktas dėl savo antioksidacinio poveikio gali būti pritaikytas dermatologinių preparatų kūrime siekiant apsisaugoti nuo UV spindulių ar kitų odą veikiančių faktoriu.

4.2 Raudonojo dobilo (trifolium pretense) paplitimas

Pupinių augalų šeima yra viena didžiausių ir ekonomiškai svarbiausių augalų šeimų. Ši grupė yra trečia pagal dydį augalų šeima turinti 730 genčių ir per 19400 rūšių augalų. Ši augalų grupė plačiai paplitusi visame pasaulyje, auga skirtingose aplinkose bei klimato zonose. Dobilai yra viena

svarbiausių pupinių šeimos augalų genčių, kurią sudaro apie 300 įvairių rūšių (9).

Augalo pavadinimo sinonimai: Trifolium borysthenicum Gruner, Trifolium bracteatum Schousb., Trifolium lenkoranicum (Grossh.) Roskov, Trifolium pratense var. lenkoranicum Grossh.,

Trifolium ukrainicum Opperman (10).Raudonasis dobilas tai daugiametis 40 - 60 cm aukščio augalas

su stora, išsišakojusia, liemenine šaknimi ir 3 - 10 stiebų. Stiebai žali, kartais rausvi, dažniausiai kylantys arba pagulę, rečiau statūs, nuo pat pamato arba tik viršūnėje vagoti. Pamatinių lapų lapkočiai ilgi, stiebinių trumpesni arba lapai bekočiai. Visi lapai su prielapiais, jų lakštai trilapiai; lapeliai pailgi kiaušiniški arba elipsiški, trumpais koteliais. Lapelių viršus plikas, apačia plaukuota. Žiedai smulkūs, bekočiai, įstriži, po 30-150 susitelkę apvaliose ar plačiai kiaušiniškose, 2-3 cm pločio, tankiose galvutėse. Vainikėlis šviesiai ar tamsiai raudonas, jo lapelių nageliai tarpusavyje suaugę. Žydi birželio-rugsėjo mėnesį (11).

4.3 Raudonųjų dobilų ekstrakto cheminė sudėtis

Raudonasis dobilas dėl didelio kaupiamų izoflavonų kiekio ir jų įvairovės yra vienas iš intensyviausiai tiriamų augalų siekiant atrasti naujus komponentus apsaugančius nuo UV ir kitų žalingų poveikių. Raudonieji dobilai kaupia iki 35,54% izoflavonų, 1,11% flavonoidų, 0,06% pterokarpanų, ≤ 0,03% kumarinų ir ≤ 0,03% tiramino junginių (12). Nustatyti pagrindiniai veiklieji junginiai: pagrindiniai izoflavonai – biochaninas A (žaliavoje randama iki 15%), genisteinas (biochanino A pagrindinis metabolitas) ir formononetinas (žaliavoje randama iki 14%), daidzeinas (pagrindinis formononetino metabolitas), taip pat randamas kvercetinas (žaliavoje aptinkama iki 1%), irilonas (žaliavoje aptinkama iki 4%). Atitinkamai nustatomi mažesni kiekiai prunetino, pratenseino, pseudobaptigenino (13). 14 13 12 11 16 15 3 2 O 1 6 7 8 9 10 5 4 OH 17 A B C O O OH OH O H O O OH O H

Genisteinas

Daidzeinas

C H₃ O O O OH C H₃ O O O OH OH

Formononetinas

Biochaninas A

1 pav. Pagrindinių izoflavanoidų cheminė struktūra

(14)

Pagrindinių izoflavanų randamų raudonųjų dobilų ekstrakte cheminė struktūra sudaryta iš benzeno žiedo A, kondensuoto su šešianariu žiedu C, kuris 3-oje padėtyje turi prijungtą fenilo grupę B. Didižiausią biologinį aktyvumą nulemia C-4 atomas turintis keto grupę, ir tarp C-2 ir C-3 atomo esantis dvigubas ryšys (14).

4.4

Raudonojo dobilo (trifolium pratense) biologiškai aktyvių junginių analizės

metodai

Norint pritaikyti izoflavonus terapiniams tikslams, labai svarbu nustatyti jų cheminę sudėtį, identifikuoti ekstrakte esančius junginius bei nustatyti jų kiekius. Analizės metodai taip pat naudojami nustatyti aktyvių izoflavonų junginių kiekius rinkoje esančių produktų sudėtyje. Izoflavonų analizei galima pritaikyti skysčių ar plonasluoksnę chromatografiją, masių spektrometriją, kapiliarinę elektroforezę. Izoflavonų junginiai yra gana panašūs savo molekuline sandara, todėl apsunkina tiek kokybinės, tiek kiekybinės sudėties analizę.

Plonasluoksnė chromatografija yra paprastas ir pigus metodas nustatyti izoflavonus turinčiuose augaluose. Tačiau dėl izoflavonų cheminės struktūros panašumo jų atskyrimas sukelia problemų, todėl šis metodas retai taikomas (15). Kitas metodas taikomas izoflavonų nustatymui yra kapiliarinė elektroforezė kartu taikant masių spektrometriją. Šis metodas leidžia efektyviai atskirti ir identifikuoti izoflavonus, taip pat šio metodo specifiškumas yra didesnis nei taikant kapiliarinę elektroforezę kartu su UV detektoriais. Rezultatai rodo, jog kapiliarinės elektroforezės išskirtinai mažas tėkmės greitis (nl min-1_{) leidžia lengviau susieti su MS, nei skysčių chromatografija (16). Pirmą} kart taikant kapiliarinę elektroforezę su elektrochemine detekcija nustatyti pagrindiniai raudonųjų dobilų izoflavonai (biochininas A, genisteinas, daidzeinas). Nustatyta, jog CE-ED metodas pasižymi puikiu jautrumu, atkartojamumu bei reikalingas nedidelis kiekis mėginių (17). Taikant ESC-UV-MSD

metodą iš raudonųjų dobilų buvo išskirta 31 izoflavonas, įskaitant 9 aglikonus. Šis metodas yra lengvai kontroliuojamas ir leidžia kiekybiškai bei kokybiškai nustatyti izoflavonus raudonųjų dobilų ekstrakte (18).

Pagrindiniams raudonųjų dobilų ekstrakto izoflavonams (biochininas A, formononetinas, genisteinas, daizeinas) atskirti dažniausiai taikomas ESC metodas. Naudojant skirtingas kolonėles, eliuentus ir metodo atlikimo sąlygas galima pasiekti visišką šių junginių atskyrimą. 1 lentelėje pateikta skirtingų tyrimų sąlygos.

1 lentelė. Skirtingos chromatografinės izoflavonų atskyrimo metodikos

Kolonėlė Eliuentas Bangos

ilgis Išvados Literatūros šaltinis C18 (4.6-mm × 25-cm, 5 μm) Mobili fazė A: Acetonitritas, vanduo(1:3) kartu su 0,05% trifluoracto rūgštim. Mobili fazė B: Acetonitritas kartu su 0,05% trifluoracto rūgštim. 254nm Farmakopėjinis raudonojo dobilo ekstrakto junginių nustatymo metodas, nustatytas biochaninas A, formononetinas, genisteinas, daizeinas. (19) BDS–C18 250x34mm I.D 5μm Waters

Mobili fazė A: Vanduo su sieros rūgštimi Mobili fazė B: Acetonitrilo 254 nm Išskirti pagrindiniai raudonojo dobilo izoflavonai: biochaninas A, formononetinas, genisteinas, daizeinas (20) BEH C18 100 mm × 2.1 mm I. D., 1.7 μm, Waters

Mobili fazė A: Vanduo Mobili fazė B:

Metanolis/Vanduo(80:20) abu turi 0,25% acto rūgšties 200nm 500nm Ultra efektyviosios skysčių chromatografijos metodas, greitas atskyrimas, atskirti 16 izoflavonų (21) Phenomenex Prodigy ODS (3) column, 5μm, 150mm × 3.2mm Mobili fazė A: 0,1% skruzdžių rūgštis vandenyje. Mobili fazė B: 0,1% skruzdžių rūgštis acetonitrile

254 nm. Taikant ESC kartu su UV ir MS metodais, atskirta 25 izoflavonai ir jų anglikonai.

(18)

Taigi, izoflavonų analizei galima panaudoti daugybę įvairių instrumentinės analizės metodų: skysčių ar plonasluoksnę chromatografiją, masių spektrometriją ir kapiliarinę zonų elektroforezę, taip pat dar tikslesniam atskyrimui bei nustatymui gali būti naudojami šių metodų tarpusavio deriniai.

Svarbu parinkti tinkamas sąlygas optimaliam junginių atskyrimui. Straipsniai, kuriuose išnagrinėtos skirtingų metodų sąlygos, padeda ekstrakto analizės metu pasirinkti reikalingą metodiką pagal tai, kokių junginių atskyrimas reikalingas.

4.5 Raudonųjų dobilų ekstrakto biologinis aktyvumas

Remiantis JAV farmakopėja, raudonųjų dobilų ekstraktas standartizuojamas pagal pagrindinių izoflavonų: daidzeino, genisteino, formononetino, biochanino A kiekį. Jų kiekis turėtų buti ne mažiau nei 90 % ir ne daugiau nei 110 % skaičiuojant nuo sausos medžiagos masės. Raudonųjų dobilų vartojimas aprašomas PSO monografijoje bei kituose įvairiose šalyse pripažintuose dokumentuose – menopauzės simptomam, hiperlipidemijos gydymui, osteoporozei, prostatos vėžiui, antioksidaciniu poveikiu (10,22). Tradicinėje medicinoje buvo naudojami kaip alternatyvi priemonė, odos ligų gydymui, tokių kaip žvynelinė, egzemos ar bėrimai. Koncentruoti tirpalai buvo naudojami siekiant palengvinti kokliušą, bronchitą ar laringitą (10).

Nustatyta, jog raudonųjų dobilų ekstrakto komponentas biochaninas A palengvina menopauzės simptomus, pasižymi antioksidaciniu, priešuždegiminiu, antikancerogeniniu bei endotelio vientisumą saugančiu poveikiais (23). Taip pat įrodyta, jog biochanino A užtenka suvartoti 10 mg/kg, kad pradėtu veikti antihiperlipidemiškai (24). Remiantis Jung. Wang (2015) atliktais tyrimais su pelėmis buvo nustatyta, jog biochaninas A slopina mikroglijų ir NADPH – oksidazės aktyvavimą, taip mažindamas oksidacinį stresą ir apsaugo dopaminerginius neuronus (25). Kito kaupiamo izoflavono – formononetino – nustatytas antimikrobinis aktyvumas prieš Gargia lambia, antioksidacinis poveikis, taip pat pasižymi neuroprotekciniu poveikiu, kuris naudingas Alzhaimerio ligos gydymui (26). Atlikti tyrimai rodo, jog formononetinas turi teigiamą poveikį gydant osteoartritą bei greitina lūžių gijimą skatindamas angiogenezę (27,28). Australijos mokslininkų aprašyti genisteino tyrimai rodo, jog jis apsaugo nuo UV spindulių sukelto uždegimo ir imunosupresijos, netgi vartojant po UV spindulių poveikio (3). A. Sureda ir kolegų atlikti tyrimai su genisteinu parodė, jog jis gali sumažinti kraujo spaudimą, mažindamas kraujagyslių pasipriešinimą (19). Taip pat, svarbiausi kvercetino aprašomi tyrimai susiję su jo vartojimu širdies kraujagyslių sistemos susirgimų profilaktikai, pasižymi priešuždegiminiu, antihistamininiu, antivirusiniu poveikiu (29). Nustatyta, jog formononetinas sumažindamas Bax/BCl-2 santykį ir slopindamas Casp3 aktyvumą, apsaugo smegenų žievės neuronus nuo NMDA–indukuotos apoptozės. Todėl, formononetinas gali būti vartojamas neurodegeneracinių sutrikimų gydymui (34).

Pavienių raudonųjų dobilų ekstrakto komponentų vartojimas yra retas reiškinys. Dažniausiai praktikoje vartojamas ekstraktas siekiant, jog veikliųjų junginių pasisavinimas būtų geresnis. Vidiniam raudonųjų dobilų panaudojimui svarbūs: antihiperlipideminis ir neuroprotekcinis poveikis. Nustatyta,

jog raudonasis dobilas pasižymi antihiperlipidiniu poveikiu. Serbijos mokslininkai atliko tyrimą, kuriame dalyvavo 40 sveikų moterų, kurių amžiaus vidurkis 56 metai. Tyrimo metu nustatyta, jog reikšmingai sumažėjo bendras cholesterolio ir MTL kiekis, tačiau padidėjo DTL kiekis (30). P. Nestel su kolegomis (2004) atliko randomizuotą, dvigubai aklą, kryžminį placebu kontroliuojamą tyrimą, kuriame dalyvavo 46 vidutinio amžiaus vyrai ir 34 postmenopauzinio periodo moterys. Tyrimo metu buvo siekiama nustatyti biochanino A ir formononetino gebėjimą paveikti MTL kiekį kraujo serume. Tyrimo rezultatai parodė, jog 10 % MTL sumažėjimas pasireiškė tik vyrams, vartojusiems biochaninu A praturtintus dobilo izoflavonoidus (31). Kinijos mokslininkai nustatė, jog vartojant izoflavanoidus (formononetiną, daidzeiną, pratenseiną, kalykosiną, iriloną) gautus iš raudonųjų dobilų, silpninama LPS–stimuliuoto dopamino absorbcija ir dopaminerginių neuronų skaičius, žiurkių mesencefalinėse neuroglijų kultūrose (32). Occhiuto su kolegomis (2008) atliko tyrimą, kurio metu žmogaus žievės smegenų ląstelių linija HCN, buvo veikiama izoflavonais papildyta frakcija iš raudonųjų dobilų ir glutamatu. Tyrimo rezultatai parodė, jog, izoflavonų frakcija apsaugojo HCN ląstelių linija nuo morfologinio suirimo, kurį sukelia glutamatas (33). Apibendrinant gautus duomenis apie raudonųjų dobilų ekstrakto pritaikymą vidiniam vartojimui – ekstraktas gali būti vartojamas, kaip profilaktinė priemonė siekiant sumažinti cholesterolio kiekį kraujyje.

Išoriniam raudonųjų dobilų panaudojimui svarbūs: antioksidacinis, priešuždegiminis ir antimikrobinis poveikiai. S.Widyarini su kolegomis (2001) su pelėmis atliktas priešuždegiminis genisteino aktyvumo tyrimas parodė, jog vietiškai vartojamas genisteinas sumažino edemas ir uždegimą, kuriuos sukėlė UV spinduliuotė (3). Yang su kolegomis (2008) atliko tyrimą su pelėmis ir nustatė, jog raudonųjų dobilų ekstraktas pasižymi stipriu priešuždegiminiu poveikiu, aktyvuodamas limfocitų proliferaciją ir slopindamas uždegimo mediatorių gamybą (11). Kinijos mokslininkai nustatė, jog biochaninas mažindamas TNFα ir interleukino-6 sekreciją RAW264 ląstelėse pasižymi priešuždegiminiu poveikiu (1). Italijos mokslininkai atliko tyrimus su pelėmis, kurioms pašalintos kiaušidės ir buvo stebima pelių odos būklė. Tyrimo rezultatai parodė, jog pelių, kuriuos buvo gydomos raudonųjų dobilų izoflavonoidais oda buvo elastingesnė, keratinizacija ir kraujotaka nesutrikus. Tuo tarpu negydomų pelių epidermio sluoksnis buvo nevienodo storio, sutrikusi kraujotaka, taip pat sumažėja kolageno skaidulų. Taigi, galima teigti jog raudonųjų dobilų izoflavonai buvo veiksmingi mažinant odos senėjimą, kurį gali sukelti estrogeno sumažėjimas (35). Tyrimo in vitro metu, taikant DPPH ir lipidų peroksidacijos metodus buvo nustatytas teigiamas raudonųjų dobilų ekstrakto antioksidacinis poveikis (11).

Dėl mokslinėje literatūroje skelbtų antioksidacinio, priešuždegiminio, antimikrobinio poveikio raudonųjų dobilų ekstraktas yra perspektyvus pusiau kietų preparatų gamyboje. Viena iš patogių ir perspektyvių formų ekstrakto įterpimui yra geliai.

4.6 Geliai

Europos farmakopėja gelius apibūdina, kaip puskietes vaisto formas, sudarytas iš skysčio, gelifikuoto tam tikromis medžiagomis (36). Geliai remiantis naudojamo tirpiklio pobūdžiu klasifikuojami į lipofilinius ir hidrofilinius gelius. Lipofiliniai geliai (oleogeliai) – preparatai, kurių pagrindus dažniausiai sudaro skystasis parafinas mišiniuose su polietilenu arba riebaliniais aliejais, gelifikuotas koloidiniu silicio dioksidu arba aliuminio ar cinko muilais. Hidrofilinių gelių (hidrogelių) pagrindus dažniausiai sudaro vanduo, glicerolis arba propilenglikolis. Hidrogeliai gelifikuojami atitinkamomis gelifikuojančiomis medžiagomis, pvz., krakmolu, celiuliozės dariniais, karbomerais ar magnio aliuminio silikatais (37,38). Taip pat geliai gali būti vienafaziai arba dvifaziai. Dvifazių gelių struktūrą sudaryta iš mažų dalelių tinklo. Vienafaziai geliai sudaryti is polimero makromolekulių, kurios pasiskirsčiusios taip, jog nėra nustatyta aiškios ribos tarp skysčio ir jame disperguotų makromolekulių (39).

Gelių gamybai naudojamos įvairios gelifikuojančios medžiagos: natūralūs polimerai (želatina, agaras, tragakantas), pusiau sintetiniai polimerai (metilceliuliozė, karboksimetilceliuliozė), sintetiniai polimerai (karbomerai, poloksamerai). Lyginant su kitomis puskietėmis vaisto formomis, geliai pasižymi šiais privalumais: stabilesni; greitesnis veikliųjų junginių išsiskyrimas; pasižymi drėkinančiomis savybėmis, todėl skatina vaisto skvarbą pro odą (40).

Geliai tampa vis populiaresnė puskietė vaisto forma dėl savo stabilumo ir lengviau kontroliuojamo vaistinės medžiagos atpalaidavimo nei kitos pusiau kietos vaisto formos pvz., kremai, tepalai, pastos. Gelių kompozicijos gali suteikti geresnes absorbcines savybes ir padidinti vaistų biologinį praeinamumą.

4.7 Bigeliai

Bigeliai tai dvifazės sistemos sudarytos iš vandeninį pagrindą turinčių hidrofilinių gelių ir aliejinį pagrindą turinčių organogelių. Bigeliai nuo kitų daugiafazių sistemų, kaip, pvz., emulsijos, emulgeliai skiriasi tuo, jog jų abi fazės sudarytos iš pusiau kietų medžiagų (41).Bigeliai dažniausiai skirstomi į dvi pagridines grupes: 1) organogeliai hidrofilinių gelių sistemoje, 2) hidrofiliniai geliai organogelių sistemoje. Pirmoji bigelių grupė apima sistemas, kuriose aliejinė fazė disperguota vandeninėje fazėje. Šių sistemų hidrofiliniai fazei gelifikuoti naudojamos tokios medžiagos, kaip krakmolas, karboksimetilceliuliozė, želatina, želatinos ir agaro mišinys arba vandenyje tirpūs sintetiniai polimerai (polivinilo alkoholis). Antroji bigelių grupė apima sistemas, kuriose hidrofilinė fazė disperguojama aliejinėje sistemoje. Šių sistemų oragonelių fazei gelifikuoti naudojamos tokios medžiagos, kaip saulėgrąžų aliejus, žuvų taukai (42).

Dėl savo struktūros bigeliai pasižymi tiek hidrofilinėmis, tiek lipofilinėmis savybėmis. Lyginant su kitomis puskietėmis vaisto formomis bigeliai pasižymi šiais privalumais: pagerina raginio sluoksnio drėkinimą; pasižymi odą minkštinančiomis savybėmis; gerina tiek lipofilinių tiek hidrofilinių medžiagų svarbą pro odą; pasižymi didesniu stabilumu (43–45). Bigeliai yra nauja ir perspektyvi puskietė vaistų forma. Dėl savo lipofilinių ir hidrofilinių savybių gali būti plačiai pritaikoma dermatologinių preparatų kūrime.

Aptartos pusiau kietos vaisto formos yra dažniausiai naudojamos vaistų ir kosmetikos pramonėje. Siekiant parinkti tinkamiausią puskietę forma raudonųjų dobilų ekstrakto įterpimui pasirinktos šios formuluotės: geliai su skirtingomis gelifikuojančiomis medžiagomis; bigeliai, kaip nauja dvifazė sistema, kuri pasižymi tiek lipofilinėmis, tiek hidrofilinėmis savybėmis ir gali būti plačiai pritaikoma vaistų pramonėje.

4.8 Veikliųjų junginių atpalaidavimo iš puskiečių vaisto formų kinetikos tyrimai

Pagrindinis vaistinio preparato parametras yra jo veiksmingumas įrodytas kontroliuojamais klinikiniais tyrimais. Tačiau dėl laiko ir finansų, kurių reikalauja klinikiniai tyrimai pradėta ieškoti naujų tyrimų, kurie galėtų suteikti kuo daugiau informacijos apie vaistinio preparato savybes. Tam buvo pradėti naudoti in vitro atpalaidavimo tyrimai, kurie leidžia įvertinti veikliųjų junginių tirpumą, dalelių dydį, klampumą, homogeniškumą (46).

In vitro atpalaidavimo tyrimai remiasi trimis pagrindiniais modeliais; Higuči kinetika; nulinio

ir pirminio laispnio kinetikomis, kurios remiasi Fick`o difuzijos dėsniais. Difuzija gali atsirasti dviguboje difuzinėje celėje, kuomet tiriamoji medžiaga yra atskirta nuo akceptorinės terpės pusiau pralaidžia membrana. Difuzijos procesas vyksta iš didesnės koncentracijos į mažesnę, per membraną, tol kol donorinėje srityje ir akceptorinėje srityje pasiekiama tiriamosios medžiagos pusiausvyra. Difuzijos koeficientas apskaičiuojamas nustatant medžiagų koncentracijas donorinėje ir akceptorinėje srityse ir pritaikant kinetinius metodus (47,48).

Pirmasis Fick`o dėsnis teigia, jog molekulių difuzija yra apibrėžiama kaip masės perkėlimas dM/dt) ir išreiškiamas kaip srautas (J). Srautas yra apibrėžiamas kaip masės perkėlimo greitis per tam tikro barjero plotą (membraną) (1 formulė).

J = 0.5 dM Sdt

1 formulė

Kur dM – masės pokytis (g), S – barjero paviršiaus plotas (cm2), dt – laiko pokytis (s). Taip pat, yra tiesioginė koreliacija tarp srauto ir koncentracijos gradiento, kuri išreiškiama (2 formulė):

J = −DdC dx

2 formulė

Kur dC – tirpalo koncentracijos pokytis, D – tirpalo difuzijos koeficientas cm2/s, dx – atstumo pokytis (cm).

Antrasis Frick`o dėsnis teigia, jog koncentracijos pokytis tam tikru laiko momentu, tam tikrame taške yra tiesiogiai proporcingas koncentracijos gradiento pokyčiui tam laiko taške (3 formulė).

∂C ∂t = D [ ∂2C ∂x2 + ∂2C ∂y2+ ∂2C ∂z2] 3 formulė

Kur, x, y ir z yra specifinės koordinatės.

Šiuo metu, Higuči lygtis yra plačiausiai naudojama siekiant įvertinti medžiagų atpalaidavimą. Remiantis Higuči, medžiagos atpalaidavimas priklauso nuo jos difuzijos (4 formulė).

M_𝑡 𝑀₀ = 𝐾𝑡

1/2

4 formulė

Kur, Mt – atpalaiduotas medžiagos kiekis per laiką t, M0 – bendras atpalaiduotas medžiagos kiekis, t – laikas. (49)

Taip pat, buvo pasiūlyti du teoriniai modeliai. Pirmasis teigia, jog veiklioji medžiaga egzistuoja kaip suspensija bazėje. Antrasis teigia, jog veiklioji medžiaga egzistuoja, kaip tirpalas bazėje.

Nulinio laipsnio atpalaidavimo modelis yra panašus į Higuči. Tačiau jis teigia, jog atpalaidavimas išlieka pastovus per tam tikrą laikotarpį, nes membranos paviršius yra pastovus. Šis modelis remiasi prielaida, jog vidutinis porų dydis patekimo sistemoje yra mažesnis nei tiriamos medžiagos (49).

Membranos. In vitro tyrimams membranos naudojamos siekiant užtikrinti tiriamosios

formuluotės ir akceptorinės terpės nuolatinį sąlytį. Renkantis membraną in vitro tyrimams reikia atsižvelgti į keletą aspektų. Membranos turėtų būti komerciškai prieinamos, inertiškos bei nesukelti jokių fizinių ar cheminių sąveikų su tiriamomis kompozicijomis. Be to, membranos turi nesudaryti ar sudaryti kuo mažesnį pasipriešinimą veikliųjų junginių perėjimui į akceptorinę terpę (50). Tyrimuose naudojamos membranos dažniausiai skirstomos į sintetines ir biologines (žmogaus, pelės oda). Sintetinės membranos dėl savo stabilumo, komercinio prieinamumo ir naudojimo paprastumo yra daug plačiau naudojamos in vitro tyrimuose. Pagal medžiagas iš kurių gaminamos sintetinės membranos skirstomos į celiuliozės pagrindu ir polimerų pagrindu pagamintas membranas. Siekiant gauti kuo tikslesnius rezultatus rekomenduojama membranas prieš tyrimų pradžią išmirkyti akceptorinėje

terpėje. Uždėjus tiriamąjį mėginį būtina patikrinti ar nėra oro burbulų po membrana, kurie gali trukdyti atsipalaiduoti veikliosioms medžiagoms (49,51,52).

Akceptorinė terpė. Akceptorinės terpės parinkimas yra vienas svarbiausių in vitro tyrimo

etapų. Akceptorinė terpė turėtų būti kuo labiau panaši į odos fiziologines savybes bei pasižymėti geru veikliųjų medžiagų tirpumu. Kitas svarbus faktorius lemiantis akceptorinės terpės pasirinkimą yra pH. Pasirenkant pH reikia atsižvelgti į tiriamosios formuluotės pH bei veikliosios medžiagos tirpumą. Akceptorinės terpės pH turėtų būti 5 – 6 ± 0,05, siekiant atspindėti odos fiziologines savybes (53,54).

Mėginių paėmimo laikas. Norint įvertinti veikliųjų junginių atsipalaidavimą siūloma tyrimo

metu atlikti ne mažiau nei šešis mėginio paėmimus. Atlikus paėmimą, išimtas tūris turi būti pakeičiamas akceptorine terpe siekiant išlaikyti pastovų jos tūrį. Mėginių ėmimo skaičių priklauso nuo medžiagos tirpumo. Tačiau siūloma, kad mėginiai tūrėtų būti imami ne mažiau kaip 6 valandų laikotarpių, ne mažiau kaip 5 mėginiai ( tipinis mėginių intervalas 0,25, 0,5, 1, 2, 4 ir 6 val.), nors kartais tyrimas gali trukti 24 – 48 val. Pastebėta, jog tyrimo pradžioje membrana su akceptorinės terpės sluoksniu sukelia pasipriešinimą. Todėl svarbu, jog mėginiai būtų pradėti imti nuo tada, kaip membrana nebedaro įtakos veikliųjų junginių atsipalaidavimui (55,56).

Temperatūra. Pusiau kietų vaisto formų tyrimams dažniausia terpės temperatūra yra 32 ± 0,5

ºC, kuri atitinka žmogaus odos temperatūrą (48). Siekiant įvertinti specifinėms vietoms pritaikytus preparatus, pvz., makšties, rektaliniai kremai gali tiriami 37 ± 0,5 ºC. Tačiau aukštesnės temperatūros parinkimas gali išlydyti tiriamą preparatą ir pakeisti jo fizines savybes, kurios įtakotų veikliųjų junginių atsipalaidavimą į akceptorinę terpę. Temperatūros įtaką veikliųjų junginių atsipalaidavimui parodė ir Chatarraj ir Kanfer (1995) atliktas tyrimas, su skirtingais acikloviro kremais (57). Manoma, kad temperatūros įtaka puskietėms vaisto formoms pasireiškia, nes sumažėja preparato klampa ir padidėja veikliųjų junginių atsipalaidavimas (53).

Naudojama įranga. Naudojamos įrangos pasirinkimas atpalaidavimo tyrimams priklauso nuo

fizikinių ir cheminių tiriamojo preparato savybių. Visos įrangos dalys turinčios tiesioginį sąlytį su preparatu ar akceptorine terpe turėtų būti inertiškos. Taip pat, visos metalinės dalys turi būti pagamintos iš nerūdijančios plieno arba padengtos apsaugine medžiaga. In vitro tyrimams dažniausiai naudojamos Franz celės ir jų modifikacijos, „Paddle over disk“ celės, pratekamosios celės, enhancer tipo celės ir invertuotos enhancer tipo celės (48,49,58).

Franz celės. Franz celės tai standartinė sistema naudojama puskiečių vaisto formų

atpalaidavimo tyrimuose in vitro bei rekomenduojama JAV farmakopėjos. Tai įtaisas sudarytas iš dviejų dalių. Viršutinės dalies, kurioje talpinama tiriamoji sistema bei apatinės dalies, kurioje talpinama akcektorinė terpė. Šios dalys atskirtos membrana, kurios dažniausiai naudojamos sintetinės, tačiau gali būti naudojamos ir biologinės ( žmogaus, pelės oda). Pagrindiniai Franz celių privalumai yra jos paprastumas bei didelis mėginio dydis, kuris užtikrina nuoseklius rezultatus. Be to, šios celės

yra paprastos, patikimos, jų didelis atkuriamumas bei tinkamos gelių, kremų ir tepalų in vitro tyrimams (54,59,60).

A. Olejnik ir kolegų (2012) aprašoma viena iš franz celės modifikacijų – Hansen microette.

Hansen microette celės sudarytos iš 6 sujungtų Franz celių. Tai automatizuota sistema, kuri

automatiškai paima mėginius iš akceptorinės terpės ir siunčia į analizės aparatūrą. Šiuolaikinės in vitro tyrimų sistemos sudarytos iš 6 celių ir vienu metu analizuojama 3 tiriamieji bei 3 lyginamieji mėginiai (49).

Kitas metodas, kuris gali būti naudojamas tai „Paddle-over-dsk“ metodas. Šis metodas susideda iš mėgintuvėlio ant kurio dugno yra padedamas nerūdijančiojo plieno diskas ir užžildoma akceptorine terpe. Analizė atliekama naudojant maišymo menteles. Taikant šį metodą membrana nenaudojama, barjero funkciją atlieka nerūdijančio plieno diskas. Pagrindinis šio metodo trūkumas, kad formuluotė ištirps akceptorinėje terpėje. Tokiu atveju nustatoma formuluotės tirpimas tam tikroje terpėje, bet ne veikliųjų junginių atsipalaidavimas iš jos. Todėl šis metodas gali būti pritaikomas tik tokioms formuluotėms, kurios nėra tirpios pasirinktoje akceptorinėje terpėje (58).

Enchancer cell tai dar vienas modelis naudojamas in vitro tyrimų iš puskiečių vaisto formų. Šis

metodas nuo „Paddle-over-disk“ skiriasi tuo, jog į mėgintuvėlį po disku dedama celė. Enchancer celės vienas galas uždaras ant kurio dedama tiriama medžiaga, o ant viršaus uždedamas membrana ir prispaudžiamaO formos žiedu. Šio metodo privalumai yra didelis tūrio diapazonas leidžiantis pritaikyti šią sistemą tiriant formuluotes, kuriose yra nedidelis kiekis aktyvių junginių. Taip pat, analizuojant junginius, kurių analizė yra sudėtinga. Tefloninės celės yra inertiškos naudojamiems reagentams, tačiau dėl teflono cheminių savybių ( pasižymi labai mažu šilumos laidumu) sunku pasiekti vienodą tiriamosios medžiagos ir akceptorinės terpės temperatūrą (49,61).

Invertuotos enhancer celės sudarytos iš tefloninio ar nerūdijančio plieno cilindro, kuriame patalpintas tiriamasis preparatas. Cilindras patalpinamas į mėgintuvėlį bei sukamas 50 rpm greičiu. Skirtingai nuo kitų metodų, membranos naudojimas nėra būtinas. Tačiau šis metodas gali būti naudojamas tik su tais preparatais, kurie netirpsta akceptorinėje terpėje. Šis metodas dažniausiai taikomas hidrofobinių tepalų tyrimams (53,62).

Pratekančiosios celės įrenginys susideda iš rezervuaro su akceptorine terpe, siurblio ir vandens vonios. Šio metodo esmė, jog akceptorinė terpė nuolat teka per akceptorinę dalį ir yra nuolat atnaujinama. Siurblys yra naudojamas palaikyti akceptorinės terpės tėkmę, o apatinė dalis pripildyta stiklo rutuliukais, kurie apsaugo nuo akceptorinės terpės grįžimo atgal. Akceptorinė terpė renkama į atskirą rezervuarą. Mėginiai nustatytais intervalais pašalinami ir analizuojami (49,63). Šis metodas dažniausiai naudojamas lipofilinių kietų preparatų tyrimams. Pratekančiosios celės taikymo privalumai skiriasi nuo Franz celės, nes yra lengviau pritaikomos ir naudojamos su pratekančiaisiais įrenginiais.

Taikant šį metodą nesusiduriama su oro burbuliukų tarp membranos ir tiriamojo mėginio problema, kuri yra viena iš pagrindinių Franz celės trūkumų (60,64).

Kontroliuojamas veikliųjų junginių atpalaidavimas iš puskiečių vaisto formų yra vienas svarbiausių veiksnių vertinant veikliuosius junginius. In vitro tyrimai padeda nustatyti veikliųjų junginių fizikines ir chemines savybes bei nuspėti galimą naujų produktų terapinį poveikį. Tinkamai pasirinkus in vitro tyrimo sąlygas ir pritaikius kinetikos modelius, galima įvertinti pusiau kietų preparatų su raudonųjų dobilų ekstraktu, veikliųjų junginių pernašą.

5 METODIKA

5.1 Tyrimo objektas

Ekspermentinės formuluotės su raudonųjų dobilų ekstraktu

 Geliai

 Bigeliai

5.2 Medžiagos ir įranga

5.2.1 Medžiagos

Raudonųjų dobilų ekstraktas, Linnea, Šveicarija Daidzeino standartas, Alfa Aesar, Vokietija Genisteino standartas, Alfa Aesar, Vokietija

Formononetino standartas, Sigma-Aldrich, Steinheim, Vokietija Biochanino – A standartas, Sigma-Aldrich, Steinheim, Vokietija Acetonitrilas (≥ 99,9 proc.), Sigma-Aldrich, Steinheim, Vokietija Skruzdžių rūgštis (≥ 98 proc.), Sigma-Aldrich, Steinheim, Vokietija Metanolis (≥ 99,9), Sigma-Aldrich, Steinheim, Vokietija

Etanolis, 96 proc. (v/v), AB ,,Stumbras“, Lietuva Karbomeras 980, Fagron BV, Rotterdam, Olandija

Trietanolaminas, 98 proc., Sigma - Aldrich, Saint Louis, JAV

Karboksimetilceliuliozė, Sigma-Aldrich® Chemie GmbH, Steinheim, Vokietija Polisorbatas 80, Sigma-Aldrich® Chemie GmbH, Steinheim, Vokietija

Labrasolis, Sigma-Aldrich® Chemie GmbH, Steinheim, Vokietija

5.2.2 Įranga

Ultra-efektyvusis skysčių chromatografas: Waters Acquity UPLC System, Waters, MA, JAV. Magnetinė maišyklė su kaitinimo įranga: IKAMAG C-MAG HS7, IKA-Werke GmbH & Co. KG, Vokietija

pHmetras: ph-meter 766 su elektrodu Knick SE 104 N, Knick Elektronische Meßgeräte GmbH & Co, Vokietija

Svarstyklės: Scaltec SBC 31, Scaltec Instruments GmbH, Vokietija Ultragarsinė vonelė: USC1200THD, VWR, USA

Reometras: Anton Paar® GmbH, Modular Compact Rheometer, MCR 102, Austrija

5.3 Efektyviosios skysčių chromatografijos metodo sąlygos

Tyrimo metu izoflavanoidų kiekybinė analizė buvo atliekama naudojant Waters Acquity ultra-efektyvųjį skysčių chromatografą (Waters, MA, USA) sujungtą su fotodiodų matricos (PDA) detektoriumi. Chromatografinės smailės buvo identifikuotos pagal analičių ir standartinių junginių sulaikymo laiką. Veikliųjų junginių atskyrimui naudota BEH C18 kolonėlė. Viso tyrimo metu buvo palaikoma 30°C kolonėlės temperatūra. Analizės metu injekuojama 1 μl tiriamojo tirpalo, mobiliosios fazės tėkmės greitis – 0,5ml/min. Tyrimo metu buvo taikyta gradientinė sistema: 0,1% trifluoracto rūgštis vandenyje (tirpiklis A) ir acetonitrilas (tirpiklis B). Mobilios fazes gradientas: nuo 70 proc. iki 10proc. tirpiklio A ir nuo 30 proc. iki 90 proc. tirpiklio B per 5 minutes. Izoflavanoidų detekcija atlikta prie 254nm bangos ilgio. Metodas validuotas reminatis ICH Q2 (R1) gairių rekomendacijomis (65).

5.4 Raudonųjų dobilų ekstrakto tirpumo tyrimas

Paruošiami prisotinti raudonųjų dobilų tirpalai 10, 20, 30, 40, 50 proc. etanolyje, bei 5, 10, 15 ir 20 % proc. labrasolio ir polisorbato 80 vandeniniai tirpalai. Į mėgintuvėlius, apsaugotus nuo šviesos poveikio, pilama 10ml tirpalo ir dedamas raudonųjų dobilų ekstraktas. Prisotinti tirpalai, purtomi 24 val. termostatinėje spintoje. Tyrimas atliekamas +25 ± 1 °C temperatūroje. Po 24 val. tirpalai filtruojami pro membraninį filtrą. Vykdomi skiedimai ir taikoma tiriamųjų junginių analizę UESC metodu.

5.5 Eksperimentinių formuluočių su raudonųjų dobilų ekstraktu gamyba

5.5.1 Gelių gamybos metodika

Gaminami 2 proc. raudonųjų dobilų ekstrakto geliai. Kaip gelifikuojančios medžiagos pasirinkos Karboksimetilceliuliozė (KMC) ir karbomeras 980. Gelių su karbomeru 980 neutralizavimui naudojamas 98 proc. trietanolaminas. Eksperimentinių gelių su raudonųjų dobilų ekstraktu sudėtys pateiktos 2 lentelėje.

2 lentelė. Eksperimentinių gelių su raudonųjų dobilų ekstraktu sudėtys

Gelis Karbomeras 980 Raudonųjų dobilų ekstraktas Polisorbatas 80 5% Karboksimetilceliuliozė G1 0,3 0,6 29,1 - G2 0,45 0,6 28,95 - G3 0,6 0,6 28,8 - G4 - 0,6 28,2 1,2 G5 - 0,6 27,9 1,5 G6 - 0,6 27,6 1,8 G7 0,15 0,6 29,25 0,6 G8 0,225 0,6 29,025 0,75 G9 0,3 0,6 28,8 0,9 Gelių gamyba

Karbomero gelių gamyba: 5 proc. Polisorbato 80 vandeniniame tirpale ištirpinamas raudonųjų

dobilų ekstraktas. Tirpalas maišomas 2 val., tuomet suberiamas apskaičiuotas karbomero 980 kiekis. Mišinys parūgštinamas 0,1M HCL rūgštimi ir maišoma 30min. Mišinys neutralizuojamas 98 proc. trietanolaminu, kol susidaro reikiamos konsistencijos gelis.

Karboksimetilceliuliozės gelių gamyba: Karboksimetilceliuliozės geliai gaminami raudonųjų

dobilų ekstraktą ištirpinant 5 proc. Polisorbato 80 vandeniame tirpale. Mišinys šildomas iki 60 ± 1 °C temperatūros ir suberiamas apskaičiuotas celiuliozės gelis. Palaikant temperatūrą mišinys maišomas, kol susidaro reikiamos konsistencijos gelis.

Bigelių gamyba: Bigeliai buvo gaminami remiantis M.M. Ibrahim ir kolegų optimizuotomis

sumaišytos G1 su G4. G2 su G5 ir G3 su G6. Formuluotės buvo maišomos, kol susidaro reikiamos konsistencijos bigeliai.

5.6 Eksperimentinių formuluočių su raudonųjų dobilų ekstraktu kokybės

vertinimas

5.6.1 Eksperimentinių formuluočių su raudonųjų dobilų ekstraktu pH reikšmių

nustatymas

Pagamintų formuluočių pH nustatyta pH-metru (pH-meter 766 Calimatic, Knick Elektronische Meßgeräte GmbH & Co, Vokietija) su elektrodu Knick SE 104 N.

5.6.2 Eksperimentinių formuluočių su raudonųjų dobilų ekstraktu reologiniai

tyrimai

Reologinės charakteristikos (klampumas, takumas) buvo vertinamos reometru (Anton Paar® GmbH, Modular Compact Rheometer, MCR 102, Austrija) esant 25 ir 32 ºC temperatūroms. Naudojama lygiagreti plokštės-kūgio geometrijos sistema (diametras – 50 mm, mėginio storis – 1 mm) ir Paar Physica US200 programinė įranga.

5.7 Raudonųjų dobilų ekstrakto atpalaidavimas iš eksperimentinių gelių in

vitro tyrimai

Atpalaidavimo tyrimams in vitro atlikti buvo naudojamos modifikuotos Franz tipo difuzinės celės. Modifikuotos Franz celės susideda iš donorinės dalies ir akceptorinės dalies atskirtomis celiuliozine membrana (2 pav.). Į celės donorinę dalį dedama gelio 1g. Donorinės terpės atvirasis galas uždengiamas celiuliozine membrana Cuprophan® (Medicell International Ltd., Londonas, Didžioji Britanija). Celiuliozinės membranos prieš tyrimo pradžią laikomos išgrynintame vandenyje, ne trumpiau nei 30min. Membranos difuzijos plotas – 1,54 cm2 . Akceptorinė modifikuotos Franz celės dalis užpildoma akceptorine terpe – 25ml 5 proc. polisorbato 80 vandeniniu tirpalu. Donorinė terpė patalpinama į akceptorinę terpę. Akceptorinė terpė nuolat maišoma, tyrimo metu palaikoma 32 ± 1 °C temperatūra. Tyrimo metu mėginiai analizei imami po 0,5, 1, 2, 4, 6 valandų. Iš akceptorinės terpės

imamas 1ml tiriamo tirpalo ir gražinamas toks pat tūris šviežios akceptorinės terpės. Mėginiai analizuojami ESC metodu. Atpalaidavimo tyrimas in vitro atliekamas po 3 kartus su kiekviena formuluote.

2 pav. Modifikuota Franz celė

5.8 Statistinė duomenų analizė

Apskaičiuoti tyrimų duomenų vidurkiai, standartiniai nuokrypiai, santykiniai standartiniai nuokrypiai. Duomenų analizei pritaikytas blokuotųjų duomenų analizės modelis ANOVA naudojant LSD kriterijų. Statistinis duomenų reikšmingumas nustatytas kai p < 0,05. Statistinė duomenų analizė atlikta naudojant Microsoft Office Excel 2013 ir IBM SPSS 22 programas.

6 REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

6.1 Raudonųjų dobilų ekstrakto ultra-efektyviosios skysčių chromatografijos

metodo validacija

Buvo atlikti tyrimai raudonųjų dobilų ekstrakto veikliųjų junginių daidzeino, genisteino, formononetino ir biochanino A UESC analizės metodo validacijai. Naudojant pasirinktą gradientą ir detekciją visos smailės buvo atskirtos ir analizės trukmė ne ilgesnė kaip 5min. Atskirti keturi pagrindiniai standartai, kurių atskyrimo eiliškumas: daidzeinas (1,293min), genisteinas (1,866min), formononetinas (2,375min) ir biochaninas A (3,055min) (3 pav.)

3 pav. Etaloninių tirpalų chromatograma: A – daidzeinas, B – genisteinas, C – formononetinas, D – biochaninas A

Kokybinio ir kiekybinio nustatymo ribos (LOD ir LOQ) apskaičiuotos lyginant smailės aukštį su bazinės linijos triukšmu (SN). Nustatyti 0,25, 0,5 ir 1,0 μg/ml etaloninių tirpalų LOD ir LOQ bei išvesti jų vidurkiai. Remiantis kiekybinio nustatymo riba (LOQ), sudarytos kalibracinės kreivės. Buvo paruošti 0,2, 0,55, 1,51, 4,16, 11,44, 31,46 μg/ml etaloniniai tirpalai ir injekuojami 3 kartus taikant

UESC sistemą. Analitėms suteiktos regresijos lygtys, kur y- smailės ploto dydis, x- analitės kiekis. Sudarytos chromatogramos ploto priklausomybės nuo koncentracijos grafikas. Kalibracinių kreivių tiesiškumas buvo vertinamas pagal koreliacijos koficientą (R2_{). Rezultatai pateikti 3 lentelėje.}

3 lentelė. Analičių kalibracinių kreivių charakteristikos

Analitės

pavadinimas Regresijos lygtis R²

LOD, μg/ml LOQ, μg/ml intervalas, μg/ml Koncentracijų Daidzeinas y = 10966x - 641,56 R² = 0,9992 0,040 0,132 0,2-31,46 Genisteinas y = 13027x - 769,25 R² = 0,9992 0,037 0,123 0,2-31,46 Formononetinas y = 9169,9x - 652,39 R² = 0,9993 0,039 0,130 0,2-31,46 Biochaninas A y = 11267x - 967,39 R² = 0,9996 0,038 0,128 0,2-31,46

Gauti koreliacijos koeficientai (R²) patvirtino kalibracinių kreivių tiesiškumą.

Metodo tikslumas ir glaudumas buvo vertinamas atliekant pakartojamumo (dienos) ir atkuriamumo ( skirtingų dienų) validaciją. Tyrimo metu buvo ruošiami ir analizuojami 1, 3, 5, 6 kalibracinio grafiko taškai. Kiekvieno taško buvo paruošiamos 3 tirpalų serijos tą pačią dieną ir 3 tirpalų serijos skirtingomis dienomis (4 lentelė.)

4 lentelė. Ultra-efektyviosios skysčių chromatografijos metodo validacijos rezultatai

Komponentų pav. Konc., μg/ml Pakartojamumas Atkuriamumas Tikslumas, proc. Glaudumas, proc. Tikslumas, proc. Glaudumas, proc. Daidzeinas 0,20 130,7 0,22 126,2 0,82 Genisteinas 0,20 124,8 0,46 119,5 1,51 Formononetinas 0,20 130,3 0,80 126,7 0,82 Biochaninas A 0,20 125,2 0,61 119,3 1,35 Daidzeinas 1,51 104,3 0,98 110,4 0,67 Genisteinas 1,51 103,5 0,45 108,9 0,47 Formononetinas 1,51 106,2 0,53 110,4 0,32 Biochaninas A 1,51 105,2 0,88 110,0 0,71 Daidzeinas 11,44 98,7 1,82 99,1 0,60 Genisteinas 11,44 98,7 0,83 100,8 2,22 Formononetinas 11,44 101,0 0,95 101,0 1,48 Biochaninas A 11,44 107,2 1,45 107,7 0,21 Daidzeinas 31,46 103,0 0,91 100,3 0,25 Genisteinas 31,46 102,3 1,17 99,9 0,48 Formononetinas 31,46 104,1 0,85 103,7 0,61 Biochaninas A 31,46 109,7 0,73 108,9 0,29

Metodo tikslumas 0.2 μg/ml koncentracijos tirpaluose buvo nustatytas nuo 119.3 iki 130,7%, o 1,51 – 31.46 μg/ml koncentracijos tirpaluose buvo nustatytas nuo 98.7 iki 110.4%. Metodo glaustumas buvo ne didesnis nei 2,22%. Metodas validuotas.

4 pav., Raudonojo dobilų ekstrakto chromatograma: A – daidzeinas, B – genisteinas, C – formononetinas, D – biochaninas A, X1,x2,x3,x4 – ekstrakto komponentai

Gauti validacijos rezultatai patvirtina metodo tinkamumą kiekybinei ir kokybinei raudonųjų dobilų ekstrakto analizei bei metodo pritaikymą biofarmaciniuose tyrimuose (4 pav.).

6.2 Raudonųjų dobilų ekstrakto tirpumas

Raudonųjų dobilų ekstraktas prastai tirpus vandenyje, todėl sunku, jį įterpti į pasirinktas formuluotes. Todėl raudonųjų dobilų ekstrakto tirpumas buvo vertinamas pasirinktuose tirpikliuose. RD ekstrakto tirpumas buvo vertinamas, pagal pagrindinių veikliųjų junginių: formononetino ir biochanino A sumą (5 pav.).

5 pav. Raudonųjų dobilų ekstrakto tirpumas vandenyje, vandeniniuose etanolio, labrasolio ir polisorbato 80 tirpaluose

Lyginant raudonųjų dobilų veikliųjų junginių tirpumą vandenyje ir skirtingose etanolio koncentracijose, statistiškai reikšmingas skirtumas nustatytas 10 %, 20 %, 50 % etanolyje (p < 0,05). Statistiškai reikšmingo skirtumo nenustatyta tiktai etanolio 30 % ir 40 % tirpaluose. Palyginus veikliųjų junginių tirpumą labrasolyje ir polisorbate 80, nustatytas statistiškai reikšmingas skirtumas (p < 0,05).

Įvertinus gautus tyrimo rezultatus, buvo siekiama parinkti tinkamiausią tirpiklį formuojant 2 % raudonųjų dobilų ekstrakto gelių formuluotes. Gauti rezultatai patvirtino, kad į vandenį įterpus iki 50 % etanolio ar iki 20 % labrasolio, raudonųjų dobilų ekstrakto tirpumas buvo mažesnis nei 2 mg/ml. Todėl šie tirpikliai nėra tinkami pasirinktoms formuluotėms gaminti. Didžiausias raudonųjų dobilų ekstrakto tirpumas buvo gautas į vandenį įterpus polisorbato 80. Didinant polisorbato kiekį RD ekstrakto tirpumas kito nežymiai, todėl buvo pasirinktas 5 % vandeninis polisorbato tirpalas, siekiant užtikrinti, kad RD ekstraktas būtų įvestas į eksperimentines formuluotes.

In vitro tyrimams, kaip akceptorinė terpė buvo pasirinktas 5 % polisorbato vandeninis

tirpalas, kadangi šiame tirpale RD ekstrakto tirpumas buvo didžiausias. Akcepktorinės terpės tūris buvo apskaičiuotas remiantis RD ekstrakto tirpumo rezultatais.

0,385 0,916 0,461 0,304 0,399 0,539 1,362 1,791 1,119 1,629 2,407 2,2 2,201 2,078 0,000 0,500 1,000 1,500 2,000 2,500 3,000 Konc ., mg /m l Tirpikliai

6.3 Eksperimentinių formuluočių su raudonųjų dobilų ekstraktu kokybės

vertinimas

6.3.1 Eksperimentinių formuluočių su raudonųjų dobilų ekstraktu pH reikšmių

nustatymas

Gaminant puskietes vaisto formas ant odos, siekiant įvertinti jų kokybę bei pritaikymo galimybes svarbu nustatyti jų pH reikšmes (6 pav.).

6 pav. Eksperimentinių formuluočių su raudonųjų dobilų ekstraktu pH reikšmės

Gauti rezultatai rodo, kad statistiškai tarp karbomero gelių (G1 – G3) ir KMC (G4 – G6) bei bigelių (G7 – G9) nustatytas statistiškai reikšmingas skirtumas (p < 0,05). Tačiau tarp KMC gelių ir bigelių statistiškai reikšmingo skirtumo nenustatyta (p > 0,05). Tiek karbomero gelių, tiek bigelių pH didėjimas nustatytas didėjant gelifikuojančios medžiagos koncentracijai. Tačiau KMC gelių pH mažėjo didėjant gelifikuojančios medžiagos kiekiui.

Įvertinus rezultatus galima teigti, kad pH reikšmėms įtaką daro naudojamos gelifikuojančios medžiagos bei jų kiekis. Pagamintų formuluočių pH reikšmės buvo nustatytos nuo 6,24 iki 6,82 pH. Gauti rezultatai patvirtina, kad pagamintos formuluotės tinkamos vartoti and odos (66). pH reikšmės visų tyrimų metu nepakito.

6.3.2 Eksperimentinių formuluočių su raudonųjų dobilų ekstraktu reologiniai

tyrimai

Įvertinus eksperimentinių formuluočių pH reikšmes tikslinga atlikti reologinių savybių klampumo bei takumo nustatymą.

Buvo atliekamas eksperimentinių formuluočių su raudonųjų dobilų ekstraktu konsistencijos koeficiento (K) ir tekėjimo indekso (n) reikšmių nustatymas, naudojant reometrą ir plokštės – kūgio geometrijos sistemą. Tyrimas buvo atliekamas 25 º C ir 32 º C temperatūrose. Gauti rezultatai pateikti 5 lentelėje.

5 lentelė Temperatūros įtaka gelių ir bigelių konsistencijos koeficiento ir tekėjimo indekso reikšmėms. Sudėties Nr. 25 º C 32 º C K, Pa · s n _{n K, Pa · s} n _n G1 82,22 ± 0,20 0,2915 ± 0,0032 74,26 ± 0,31 0,2939 ± 0,0024 G2 128,86 ± 0,25 0,2842 ± 0,0019 125,64 ± 0,40 0,2875 ± 0,0022 G3 143,86 ± 0,23 0,3033 ± 0,0025 139,69 ± 0,26 0,3143 ± 0,0030 G4 31,11 ± 0,28 0,4889 ± 0,0018 22,754 ± 0,29 0,5179 ± 0,0026 G5 79,78 ± 0,32 0,3918 ± 0,0029 63,32 ± 0,40 0,4205 ± 0,0027 G6 259,28 ± 0,49 0,2585 ± 0,0017 224,68 ± 0,37 0,3105 ± 0,0035 G7 6,89 ± 0,25 0,6132 ± 0,0024 4,938 ± 0,36 0,6375 ± 0,0019 G8 22,19 ± 0,34 0,4959 ± 0,0035 17,62 ± 0,45 0,5229 ± 0,0026 G9 86,67 ± 0,24 0,3883 ± 0,0023 72,89 ± 0,39 0,422 ± 0,0024

Tyrimų metu buvo nustatyta, jog didžiausia konsistencijos koeficiento (K) reikšmė būdinga geliui G6 ( lentelė), kuriame gelifikuojanti medžiaga yra karboksimetilceliuliozė. Konsistencijos koeficientas (K) yra puskietės formos klampos matas. Kuo didesnis K, tuo didesnė jėga reikalinga pasiekti tinkamam takumui ir puskietės formos savybėms įvertinti. Remiantis šiais duomenis galima kelti hipotezę, jog iš G6 gelio tyrimų in vitro metu atsipalaiduos mažiausias raudonųjų dobilų veikliųjų junginių kiekis, lyginant su kitomis formuluotėmis. Palyginus karbomero gelių sudėtis (G1, G2, G3), nustatytas statistiškai reikšmingas konsistencijos koeficiento ir tekėjimo indekso skirtumas ( p < 0,05). Palyginus gelių su karboksimetilceliulioze (G4, G5, G6) mažiausias konsistencijos koeficientas

nustatytas G4 gelyje, kurio sudėtyje yra 4 % karboksimetilceliuliozės. Eksperimentinių tyrimu metu nustatyta, jog mažiausias konsistencijos koeficientas nustatytas bigeliams (G7, G8, G9). Įvertinus gautus rezultatus skirtingose temperatūrose visose formuluotėse nustatytas statistiškai reikšmingas skirtumas (p < 0,05).

Remiantis gautais rezultatais galima teigti, jog konsistencijos koeficientui ir tekėjimo indekso reikšmėms didžiausią įtaką daro naudojamos gelifikuojančios medžiagos, jų kiekis bei temperatūra.

6.4 Raudonųjų dobilų ekstrakto atpalaidavimas iš eksperimentinių gelių in

vitro tyrimai

Siekiant įvertinti raudonųjų dobilų veikliųjų junginių atpalaidavimą iš puskiečių vaisto formų – gelių ir bigelių, buvo atlikti in vitro tyrimai.

RD veikliųjų junginių atpalaidavimo kinetika iš 1 %, 1,5 %, ir 2 % karbomero gelio formuluočių (G1, G2, G3) pateikta 7 pav.

7 pav. RD veikliųjų junginių atpalaidavimo kinetika iš karbomero gelių: G1 – 1 %, G2 – 1,5 %, G3 – 2 %

Po 6 valandų iš G1 formuluotes atsipalaidavo didžiausias kiekis veikliųjų junginių 52,62 ± 0,93 µg/cm2_{. Tuo tarpu iš G2 ir G3 gelių atsipalaidavo mažesni veikliųjų junginių kiekiai – 37,60 ±} 0,37 µg/cm2 _{bei 32,09 ± 0,4 µg/cm}2_{. Iš gautų rezultatų galima teigti, jog didinant karbomero kiekį} raudonųjų dobilų veikliųjų junginių atsipalaidavimas mažėja. Statistiškai reikšmingas skirtumas

0 10 20 30 40 50 60 0 1 2 3 4 5 6 B endr a bioc ha nino A ir f or monon etino konc entra cij a, µ g/cm 2 Laikas, val.

nustatytas tarp G1 ir G2 bei G1 ir G3 gelių (p < 0,05). Tuo tarpu tarp G2 ir G3 statistiškai reikšmingo skirtumo nenustatyta. Remiantis Higuči kinetika, buvo apskaičiuoti karbomero gelių koreliacijos koeficientai: 0,896 G1 geliui, 0,884 G2 geliui bei 0,815 G3 geliui. Koreliacijos koeficientai nors ir neatspindi visiško tiesiškumo, tačiau atitinka Hugiči modelį.

Raudonųjų dobilų veikliųjų junginių atpalaidavimo kinetika iš 4 %, 5 %, 6 % gelių su karboksimetilceliulioze pateikta 8 pav.

8 pav. RD veikliųjų junginių atpalaidavimo kinetika iš karboksimetilceliuliozės gelių: G4 – 4 %, G5 – 5 %, G6 – 6 %.

Nustatyta, jog iš G4 formuluotės po 6 valandų buvo atpalaiduota 157,16 ± 1,9 µg/cm2 veikliųjų junginių. Tuo tarpu iš G5 ir G6 formuluočių atpalaiduota atitinkamai mažesni kiekiai, 148,81 ± 1,4 µg/cm2 _{bei 122,45 ± 1,2 µg/cm}2_{. Veikliųjų junginių atsipalaidavimo tendencija liko tokia pati,} kaip ir iš karbomero gelių: procentiškai didėjant gelifikuojančios medžiagos kiekiui, veikliųjų junginių atsipalaidavimas mažėja. Nustatyti statistiškai reikšmingi skirtumai tarp G4 ir G6 bei tarp G5 ir G6 formuluočių (p < 0,05). Pagal Higuči modelį buvo nustatyti koreliacijos koeficientai: 0,948 nustatyta G4 geliui, 0,918 G5, 0,974 G6. CMC geliai pasižymi didesniu tiesiškumu lyginant su karbomero geliais bei visiškai atitinka Higuči modelį.

RD veikliųjų junginių atpalaidavimo kinetika iš bigelių pavaizduota 9 pav.

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 0 1 2 3 4 5 6 B endr a bioc ha nino A ir f or monon etino konc entra cij a, µ g/cm 2 Laikas, val.

9 pav. RD veikliųjų junginių atpalaidavimas iš bigelių

Nustatyta, kad iš G7 formuluotės per 6 valandas veikliųjų junginių kiekis yra 32,62 ± 0,5 µg/cm2_{, iš G8 formuluotės atsipalaidavo 33,46 ± 0,7 µg/cm}2_{, o iš G9 atsipalaidavo 25,32 ± 0,3 µg/cm}2_. Statistiškai reikšmingo skirtumo tarp G7 ir G8 formuluočių nenustatyta. Lyginant bigelius su karbomerų bei CMC geliais nustatytas statistiškai reikšmingas skirtumas (p<0,05). Iš bigelių atsipalaidavo mažiausias kiekis veikliųjų junginių. Mažesnį veikliųjų junginių atpalaidavimą iš bigelių galėjo lemti dvifazė bigelių struktūra. Remiantis Higuči modelių apskaičiuota bigelių koreliacijos koeficientai: G7 0,931, G8 0,942, G9 0,967, kurie patvirtina, jog šios sistemos tiesiškai atitinka ši modelį.

RD veikliųjų junginių kinetikos iš skirtingų formuluočių palyginimas pateiktas 10 pav. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 0 1 2 3 4 5 6 B endr a bioc ha nino A ir f or monon etino konc entra cij a, µ g/cm 2 Laikas, val. G7 G8 G9

10 pav. RD veikliųjų junginių atpalaidavimas iš skirtingų formuluočių

RD veikliųjų junginių atpalaidavimo in vitro tyrimo rezultatai parodė, kad iš KMC gelių buvo atpalaiduota statistiškai reikšmingai ( p < 0,05) didesnis kiekis, lyginant su karbomero geliais ar bigeliais. Tuo tarpu palyginus karbomerų gelius ir bigelius, statistiškai reikšmingas skirtumas nustatytas tik tarp mažiausią koncentraciją turinčio karbomero gelio G1 ir likusių formuluočių. Daugiausia veikliųjų junginių atsipalaidavo iš G4 formuluotės 157,16 ± 1,9 µg/cm2_{. Tuo tarpu} mažiausią atpalaidavimą parodė G9 formuluotė 25,32 ± 0,3 µg/cm2_.

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 0 1 2 3 4 5 6 B endr a bi ocha ni no A i r for m ononet ino konce nt raci ja, µg /cm 2 Laikas, val. G1 G2 G3 G4 G5 G6 G7 G8 G9

7 IŠVADOS

1. Įvertinus mokslinius duomenis, pasirinktas, išvystytas ir validuotas raudonųjų dobilų veikliųjų junginių – daidzeino, genisteino, formononetino ir biochanino A – ultra-efektyviosios skysčių chromatografijos analizės metodas. Šis metodas buvo pritaikytas ekstrakto kokybės ir gelių bei bigelių su raudonųjų dobilų ekstraktu vertinimui biofarmaciniuose tyrimuose.

2. Remiantis moksline literatūra sumodeliuotos eksperimentinės formuluotės su raudonųjų dobilų ekstraktu – geliai ir bigeliai, kuriose raudonųjų dobilų ekstraktas įterptas tirpalo forma. Suformuotų eksperimentinių formuluočių pH reikšmės (6,24 - 6,82) atitiko ant odos vartojamų preparatų ribas.

3. Tyrimų rezultatai parodė, jog formuojant gelius ir bigelius pasirinkta gelifikuojanti medžiaga ir jos kiekis daro įtaką reologinėms charakteristikoms. Didžiausia konsistencijos koeficiento reikšmė būdinga geliams su KMC gelifikuojančia medžiaga 259,28 ± 0,49 K, Pa·s n_{, o mažiausia bigeliai} su mažiausia gelifikuojančių medžiagų koncentracija 6,89 ± 0,25 K, Pa·s n_.

4. Tyrimų rezultatai parodė, kad karboksimetilceliuliozės geliai yra tinkamiausia forma ektrakto įvedimui, pagal didžiausią atsipalaidavusių veikliųjų medžiagų kiekį.

8 PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS

Raudonųjų dobilų ekstraktas yra vienas iš plačiai naudojamų izoflavonų šaltinių, jo galimas vartojimas ant odos vis plačiau pagrindžiamas šiuolaikiniais tyrimais, todėl reikėtų tęsti eksperimentus su šio augalo ekstraktu, atliekant skvarbos tyrimus in vitro per odą. Tęsti optimalių formuluočių paiešką analizuojant gelius ir bigelius su skirtingomis gelifikuojančiomis medžiagomis.