MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
DOMAS MELAIKA
MARGALAPIŲ MARGAINIŲ (SILYBUM MARIANUM L.)
FITOPREPARATŲ ANALITINIS TYRIMAS
CHROMATOGRAFINIAIS METODAIS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas: Prof. Dr. V.Jakštas
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanė Ramunė Morkūnienė Data:
MARGALAPIŲ MARGAINIŲ (SILYBUM MARIANUM L.)
FITOPREPARATŲ ANALITINIS TYRIMAS
CHROMATOGRAFINIAIS METODAIS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas: Prof. Dr. V.Jakštas Data: Recenzentas: Data: Darbą atliko: Magistrantas Domas Melaika Data: KAUNAS, 2018
TURINYS
SANTRAUKA ... 5 ABSTRACT ... 6 PADĖKA ... 8 SANTRUMPOS ... 9 ĮVADAS ... 10 1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 11 1.1Botaninis apibūdinimas ... 11 1.2Cheminė sudėtis ... 12 1.3Nepageidaujami poveikiai ... 13 1.4 Veikimo mechanizmas ... 14 1.5Farmakokinetika ... 14 1.6 Farmakologinis poveikis ... 16 1.7 Silimarino identifikavimas ... 191.7.1 Plonasluoksnės chromatografijos taikymas ... 2419
1.7.2 Efektyviosios skysčių chromatografijos taikymas ... 24
2. TYRIMO OBJEKTAS IR METODIKOS ... 22
2.1 Tyrimo objektas ... 22
2.2 Naudotos medžiagos ... 23
2.3 Naudota aparatūra ... 23
2.4 Tyrimo metodai ... 24
2.4.1 Silimarino analizė plonasluoksnės chromatografijos metodu ... 24
2.4.2 Silimarino analizė efektyviosios skysčių chromatografijos metodu ... 26
2.4.2.1 Europos farmakopėjos metodika ... 246
2.4.2.2 JAV farmakopėjos metodika ... 248
3. TYRIMO REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 31
3.1 Kokybinis silimarino nustatymas plonasluoksnės chromatografijos metodu ... 31
3.2 Silimarino nustatymas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu ... 33
3.3 Kiekybinis silimarino nustatymas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu ... 40
4. REZULTATŲ APIBENDRINIMAS ... 45
5. IŠVADOS ... 47
6. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 48
SANTRAUKA
Domo Melaikos magistro baigiamasis darbas „Margalapių margainių (Silybum marianum L.) fitopreparatų analitinis tyrimas chromatografiniais metodais“. Darbo vadovas Prof. Dr. Valdas Jakštas. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Medicinos akademijos, Farmacijos fakulteto, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra. Kaunas, 2018.
Tyrimo tikslas: Ištirti farmakopėjinių chromatografinių metodikų ypatumus kokybiškai ir
kiekybiškai analizuojant įvairios sudėties fitopreparatus su margalapių margainių ekstraktu.
Tyrimo uždaviniai:
1. Atlikti Europos ir JAV farmakopėjų monografijose taikomų Silybum marianum (L.) plonasluoksnės chromatografijos metodikų tyrimą ir atlikti kokybinę preparatų sudėties analizę; 2. Atlikti Europos ir JAV farmakopėjų monografijose taikomų Silybum marianum (L.) efektyviosios skysčių chromatografijos metodikų tyrimą ir atlikti kokybinę preparatų sudėties analizę;
3. Atlikti Europos ir JAV farmakopėjose nurodytų chromatografinių metodikų bandymus (farmakopėjinių testų ir gretutinių tyrimų lygmenyse) taikant atrinktų Silybum marianum (L.) fitopreparatų modelines sistemas ir įvertinti kiekybines jų sudėtis.
Tyrimo objektas ir metodika: Farmakopėjiniais chromatografiniais metodais išanalizuoti
skirtingi silimarino preparatai. Kokybinė analizė atlikta plonasluoksnės ir efektyviosios skysčių chromatografijos metodais, o kiekybiškai produktai įvertinti taikant efektyviosios skysčių chromatografijos metodiką.
Rezultatai ir išvados: Atlikta skirtingų preparatų Europos ir JAV farmakopėjų kokybinė
plonasluoksnės chromatografijos, efektyviosios skysčių chromatografijos analizė ir kiekybinė ESC analizė. Pažymėtina, kad taikytos farmakopėjų ESC metodikos monografijose skyrėsi kolonėlės tėkmės greičiu, temperatūra ir mobilios fazės tirpalų tūrių proporcijomis. Analizuotuose fitopreparatuose kokybiškai identifikuoti visi farmakopėjose reglamentuojami silimarino aktyvieji žymenys (silikristinas, silidianinas, silibininas A, silibininas B, izosilibininas A, izosilibininas B). Atsižvelgiant į preparatų gamintotų reglamentuojamus silimarino kiekius bei atlikus kiekybinius tyrimus, Europos farmakopėjos metodika lygiagrečių duomenų gauti nepavyko. Europos farmakopėjos metodikos rezultatais, 7 iš 10 preparatų neatitiko keliamų reikalavimų. JAV farmakopėjos metodika – 4 iš 10 preparatų nustatytas silimarino kiekis nesiekė minimalaus nustatyto. Tačiau nepaisant skirtingų farmakopėjinių metodikų, pateikiami rezultatai skiriasi. Europos farmakopėjos metodikos rezultatai labiau skiriasi nuo gamintojo pateiktos informacijos ženklinime.
ABSTRACT
‘Analytical investigaton of Milk thistle (Silybum marianum L.) phytocompounds using chromatographic methods’ master thesis by Domas Melaika. Supervisor Professor Valdas Jakštas. Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, The Faculty of Pharmacy, Department of Analytical and Toxicological Chemistry, Kaunas, 2018
Research aim: Cross-investigation, evaluation, and qualitative and quantitative comparison of
the milk thistle (Silybum marianum L.) phytocompounds using various pharmacopoeial chromatographic methods.
Research goals:
1. Application of European and U.S. pharmacopoeial methods for Silybum marianum (L.) using thin layer chromatography methods to determine and assess principal chromatography methods suitability and index values, and qualitative analysis of phytocompounds’ compositions.
2. Application of European and U.S. pharmacopoeial methods for Silybum marianum (L.) using high performance liquid chromatography methods to determine and assess principal chromatography systems suitability and index values, and qualitative analysis of phytocompounds’ compositions.
3. Application of European and U.S. pharmacopoeial chromatographic methods (on the grounds of pharmacopoeial tests and parallel research reported in the literature) and quantitative evaluation of the composition for selected Silybum marianum (L.) phytocompound model systems.
Research objective and methods: Over the course of the study different silymarin
phytocompounds were analysed using pharmacopoeial chromatographic methods. Qualitative and quantitative analysis were done using thin layer chromatography and high performance liquid chromatography, respectively.
Results and Conclusion: Measurements of different phytocompounds using thin layer and
high performance liquid chromatographic methods in combination with quantitative HPLC-PDA analysis as specified by European and USA pharmacopoeia methodology were performed. The recommended pharmacopoeial HPLC methodologies differ in the column flow rate, temperature and the mobile phase solution volume proportions. All silymarin compounds characterised in both pharmacopoeias were identified in the study (silychristin, silydianin, silybin A, silybin B, isosilybin A, isosilybin B). The results obtained using European Pharmacopoeial methodology proved to be incompliant 7 out of 10 times according the determined silymarin quantities and analytical quantitative characterisation by the manufacturers of the phytocompounds. In comparison, using U.S.
Pharmacopoeial methodology, in 4 out 10 phytocompounds, the determined silymarin quantity has not exceed the minimal threshold. However, despite the parameter differences between pharmacopoeias, the results of the European Pharmacopoeial methodology are more distinct from the labeling information provided by the manufacturer.
PADĖKA
Nuoširdžiai dėkoju analizinės ir toksikologinės chemijos katedros lektoriui Mindaugui Marksai už pagalbą ir rekomendacijas analizuojant ir atliekant mokslinius tyrimus. Dėkoju mokslinio darbo vadovui prof. Valdui Jakštui už vertingus patarimus ir konsultacijas.
SANTRUMPOS
ALT – alaninaminotransferazė AST – aspartataminotransferazė
AUC – chromatogramos smailės plotas CNS – centrinė nervų sistema
DNR – deoksiribonukleorūgštis
ESC – efektyvioji skysčių chromatografija HCV – hepatito C virusas
JAV – Jungtinės Amerikos Valstijos LPS – lipopolisacharidas
OATP2 – organinis anijoną transportuojantis polipeptidas 2
PBMC – periferinės kraujyje susiformavusios mononuklearinės ląstelės PC – plonasluoksnė chromatografija
Ph.Eur. – Europos farmakopėja
PSO – Pasaulinė sveikatos organizacija Rf – sulaikymo rodiklis
Rt – sulaikymo laikas
RNR – ribonukleino rūgštis
TNF-α – naviko nekrozės faktorius α
USP – Jungtinių Amerikos Valstijų farmakopėja UV – ultravioletiniai spinduliai
ĮVADAS
Tradicinėje medicinoje margalapių margainių preparatai naudojami tūkstančius metų žmonių ligų profilaktiktai ir gydymui. Nuolat auganti augalinių produktų pramonė ir reglamentų bei teisės aktų trūkumas kelia Pasaulinės sveikatos organizacijos (PSO) ir kitų reguliavimo institucijų susirūpinimą dėl augalinių maisto papildų ir vaistinių preparatų saugumo ir veiksmingumo [1,2]. Natūralių produktų kokybės kontrolė yra labai svarbi, nes augalinių preparatų veiksmingumas ir kokybė priklauso nuo jų veikliųjų junginių kiekio. Daugybė veiksnių, pavyzdžiui klimatas, derliaus nuėmimo laikas, ekstrahavimo technika ir sąmoningas ar atsitiktinis komponentų suklastojimas gali sukelti reikšmingą preparato veikliųjų sudedamųjų medžiagų pokytį ir taip gali pakenkti paciento sveikatai ir saugumui [3].
Siekiant įveikti šias iškilusias problemas, PSO patvirtino „pirštų antspaudų“ analizę kaip natūralių produktų vertinimo metodiką. „Pirštų antspaudas“ gali būti apibrėžiamas kaip būdingas profilis, atspindintis analizuojamo mėginio cheminę sudėtį, kurią galima gauti spektroskopiniais ar chromatografiniais analizės metodais. Nors spektroskopiniai metodai atlieka visą mėginių analizę, chromatografiniai metodai yra labiau informatyvūs. Padidėjus „pirštų antspaudų“ profiliavimo svarbai, nustatyti aukštesni standartai.
Per pastarąjį dešimtmetį Europos ir JAV farmakopėjose paskelbta daug monografijų apie augalinių medžiagų kokybės kontrolę [4]. Pagal esančius straipsnius, Silybum marianum L. identifikavimas ir kiekybės kontrolė gali būti atliekama remiantis chromatografiniais metodais – plonasluoksne ir efektyviąja skysčių chromatografijomis. Tačiau atsiradus validuotomis ir kiekvienam lengvai prieinamomis metodikomis, atsiranda ir nauji iššūkiai, pavyzdžiui, analitinių sąlygų optimizavimas ir parametrų individualūs skirtumai.
Darbo aktualumas: Plintant fitopreparatų vartojimui ir plečiantis rinkos pasiūlai, esminiu
žingsniu tampa kokybės kontrolė. Šiame darbe siekta atlikti Europos ir JAV farmakopėjų pateiktą kokybinę ir kiekybinę plonasluoksnės bei efektyviosios skysčių chromatografijos analizę ir išsiaiškinti farmakopėjinių metodikų ypatumus, tiriant Silybum marianum L. fitopreparatus.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1 Botaninis apibūdinimas
Margalapis margainis - Silybum marianum L. (sinonimai: Carduus marinus, milk thistle, saint mary thistle, blessed milk-thistle) yra Astrinių (Asteraceae) šeimos augalas. Tai vienmetis ar dvimetis žolinis augalas. Margalapio margainio stiebas yra 40-200 cm aukščio. Margainio lapai yra kintamieji, dideli ir glausti, su spygliuotais kraštais. Lapai gali užaugti iki 50-60 cm ilgio ir 20-30 cm pločio, tačiau stieblapiai yra žymiai mažesni. Augalo išskirtinis požymis – pieno spalvos gyslelės [5].
Augalo stiebas baigiasi raudonai violetiniu maždaug 5 cm diametro žiedu. Žiedo kraštai padengti spygliais.
Margainio sėklos būna juodai rudos spalvos, 5-8 mm su ilgais baltais skrystukais. Kiekvienas augalo žiedas pagamina apie 190 sėklų, o visas augalas – 6350.
Margalapio margainio sėklos yra naudojamos jau 2000 metų kaip puiki priemonė kepenų ligų profilaktikai ir gydymui. Šis augalas be galo svarbus Šiaurės Amerikoje, o pastaruoju metu labai paplito ir Europoje. Lenkija yra didžiausias margainio sėklų ir preparatų tiekėjas visoje Europoje, kurios kiltivuojama teritorija apima net 2000 hektarų žemės ploto [6].
Minėtą augalo farmakologinį poveikį nulemia flavolignanų mišinys – silimarinas. Silimarino didžiausia koncentracija randama sėklose, tačiau mediciniškai panaudojamas ir visas augalas. Todėl silimarinas dažniausiai šiuolaikinėje medicinoje naudojamas kaip chronines kepenų ligas gydantis augalinis preparatas. Silimarinas taip pat pasižymi stipriu antioksidantiniu požymiu, kuris ne tik skatina kepenų ląstelių regeneraciją, mažina cholesterolio kiekį kraujyje, bet ir padeda užkirsti kelią vėžiui [5].
1 pav. Margalapis margainis (Silybum marianum L.) [7]
1.2 Cheminė sudėtis
Vaisiuose randama riebalinių aliejų: oleino rūgšties (30 proc.), linoleno rūgšties (60 proc.), palmitino rūgšties (9 proc.). Taip pat aptinkama sterolių (0,6 proc.): cholesterolio, stigmasterolio, sitosterolio, tokoferolio (vit. E). Fitochemiškai svarbiausių veikliųjų medžiagų – flavolignanų (kitaip dar vadinamu silimarinu), kurios apsprendžia farmakologinį poveikį, randama 2 – 3 proc.. Pagal Europos farmakopėjos reikalavimus, subrendusiuose margalapių margainių vaisiuose silimarino turi būti daugiau nei 1.5 proc. Silimariną sudaro pagrindiniai flavolignanai: silikristinas ir silidianinas (sudaro 20 – 45 proc silimarino), silibinas A ir B (sudaro 40 – 65 proc. silimarino) bei izosilibinas A ir B (sudaro 10 – 20 proc. silimarino) [8].
2 pav. Silimarino flavolignanai [9]
1.3 Nepageidaujami poveikiai
Margalapių margainių preparatai laikomi kaip saugūs ir gerai toleruojami. Užregistruoti nepageidaujami poveikiai labai panašūs į placebo. Tačiau retais atvejais, pastebimos nepageidaujamos reakcijos, pasireiškiančios lengvu vidurius laisvinančiu poveikiu ir virškinamojo trakto sutrikimu. Taip pat pranešta apie lengvas alergines reakcijas, kai suvartojamos dozės viršija 1500 mg/silimarino per dieną. Anot Vokietijos E Komisijos, preparatą vartojant rekomenduojamomis dozėmis, šalutinių poveikių neužregistruota [10].
Alkoholis ir hepatotoksiniai virusai sukelia daugumą kepenų ligų. Randomizuotai atliki klinikiniai tyrimai padeda įrodyti hipotezę, ar Silybum marianum L. ekstraktas turi kokį nepageidaujamą poveikį pacientams, serganties alkoholio ir hepatito B ar C virusų sukeltomis ligomis. Atlikta 13 klinikinių tyrimų, kuriuose dalyvavo 915 pacientų, sistematinė apžvalga. Pacientų tarpe nepastebėta komplikacijų ar mirčių dėl alkoholio ar virusiniu keliu sukeltų lėtinių kepenų pažeidimų. Margalapis margainis nebuvo susijęs su su padidėjusia nepageidaujamų reiškinių rizika (3.5 proc. lyginant su 4.5 proc. placebo grupėje). Abiejose tyriamosiose grupėse dažniausiai pasireiškę simptomai buvo niežulys,
pykinimas, epigastrinis diskomfortas ir galvos skausmas [11]. Todėl margalapių margainių ekstraktas yra saugus vartoti.
1.4 Veikimo mechanizmas
Silybum marianum L. mokslinėje literatūroje dažniausiai įvardinamas kaip augalas, turintis antioksidantinių ir hepatoprotekcinių savybių. Jis labai gerai absorbuojamas per os, todėl pasižymi ryškiu pirminiu metabolizmu pro kepenis. Laboratorinių tyrimų metu nustatyta, kad silibininas stabilizuoja ląstelių membranas, todėl toksinėms medžiagoms neleidžiama patekti į ląstelę, ko pasekoje nepageidaujamos cheminės medžiagos iš karto pašalinamos iš organizmo. [12]. Atlikti tyrimai su kepenų lastelių glutationo lygį padidinančiu toksinu užkrėstomis žiurkėmis, gaunančiomis silimarino. Rezultatų duomenimis išsiaiškinta apie sumažėjusį oksidacinį stresą ir mažus kepenų imunofermeninių tyrimų pokyčius (AST ir ALT). Taip pat įrodyta, kad silibininas sužadina detoksikacijos kelius ir pagreitina kepenų ląstelių regeneraciją, stimuliuojant DNR sintezės prekursorius ir skatinant ląstelių fermentų gamybą [13].
1.5 Farmakokinetika
Absorbcija
Margalapių margainių ekstraktas yra greitai absorbuojamas iš skrandžio, tačiau absorbcija yra gana maža dėl jo riboto tirpumo vandenyje, todėl biologinis prieinamumas yra pagrindinis rūpestis, keliamas klinikinių tyrimų metu. Atliekant tyrimus su gyvūnais, nustatyta, kad 500 mg silibinino/kg kūno svorio vartojimo metu, maksimali nekonjuguoto ir viso silibinino koncentracija plazmoje buvo atitinkamai 8.5 ± 2.6 ir 76 ± 15 g/ml. Biologinis prieinamumas per os pelėse sudaro maždaug 0.95 proc., kas įvardijama prastu biologiniu prieinamumu. Prastas biologinis prieinamumas gali būti susijęs su dideliu 2 konjugacijos fazės reaktyvumu ir prastu absorbcijos greičiu. Sisteminis silibinino biologinis prieinamumas gali būti padidintas kompleksu su fosfatidilcholinu arba β-ciklodekstrinu ir kapsulės medžiagos parinkimu. Pelėms per os pavartojus silimarino preparato, atitinkančio 200 mg/kg silibinino
tarp silibinino-fosfatidilcholino komplekso ir gryno silimarino, nustatyta, kad santykinis biologinis prieinamumas silibinino-fosfatidilcholino komplekso buvo 10 kartų didesnis nei silimarino [14].
Pasiskirstymas
Siekiant, kad augalinė ar vaistinė medžiaga suteiktų norimą poveikį, privalu, kad organizme ji pasiskirstytų efektyviai ir greitai. Tiek laisvas, tiek konjuguotas silibininas rodo greitą pasiskirstymą organizme. 2007 metais Japonijos mokslininkų atlikto tyrimo metu, ištirtos laisvo (nesurišto) ir konjuguoto silibinino koncentracijos audiniuose, kad būtų pasiektas didžiausias jų kieks per 1val. Po 50 mg/kg silibinino dozės pelėms, maksimali koncentracija audiniuose buvo labai nevienoda: kepenyse 8 ± 1.6 µg silibinino/g, plaučiuose 4.3 ± 0.8 µg silibinino/g, epigastriume 123 ± 21 µg silibinino/g, odoje 1.4 ± 0.5 µg silibinino/g, prostatoje 2.5 ± 0.4 ir kasoje 5.8 ± 1.1 µg silibinino/g. Atliktas tyrimas parodė, kad žiurkių kraujo plazmos jungimasis su baltymais yra 70.3 proc. ± 4.6 proc.. Endogeninis lipoproteinas gali atlikti svarbų vaidmenį transportuojamt silibininą iš kepenų į ekstrahepatinius audinius, todėl silibininas greitai ir lengvai pasiskirsto į tulžies pūslę, kuri atitinkamai padidina tulžies koncentraciją iki 100 kartų daugiau nei kraujyje [15].
Metabolizmas ir eliminacija
Silibininas praeina I ir II fazės metabolizmą ir II fazės konjugacijos reakcijas žmonių kūnuose. Vieno klinikinio tyrimo metu, trims sveikiems savanoriams duota 600 mg silimarino per os. Išmatuotos laisvos, sulfatintos ir gliukuronizuotos frakcijos žmonių kraujo plazmoje, atitinkamai 17 proc., 28 proc. ir 55 proc. nuo bendros dozės. Analogiško tyrimo duomenimis nustatyta, kad gliukuronizacijos procese naudojant silibininą su galvijų kepenų mikrosomomis pasiekiamas platus metabolizmas, o pagrindinės gliukuronizacijos vietos – fenolinės OH grupės C-7 ir C-20 padėtyse. Gliukuronizacijos procese labai rekšmingas silibinino stereoselektyvumas. Silibinas B gliukuronizuotas veiksmingiau, nei jo diastereoizomeras silibinas A [14,15].
Konjuguotas ir laisvas silimarinas iš žmonių ir žiurkių organizmo eliminuojamas labai greitai. Po peroralinės 560 mg silimarino dozės (kurią maždaug atitinka 240 mg silibinino), vidutinis pusinis eliminacijos periodas yra 6.5 val. Išgėrus 560 mg silimarino (atitinkančio 240 mg silibinino), silibinino koncentracija šlapime, surinktame per 24 val. po pavartojimo, labai maža – nuo 1 proc. iki 7 proc. visos dozės [14].
1.6 Farmakologinis poveikis
Antioksidantinis poveikis
Apžvelgus mokslinę literatūrą, nustatytas margainio tiesioginis ir netiesioginis laisvuosius radikalus mažinantis poveikis. Įvertinta, kad silimarinas neleidžia padidėti gliukozės koncentracijai plazmoje ir stabdo kasos lipidų peroksidaciją [16].
Mokslininkai teigia, kad silimarinas užkerta kelią diabetui, kurį aloksanas (kristalinė medžiaga, gaunama organizme oksiduojant šlapimo rūgštį) sukelia žiurkėms. Manoma, kad šis poveikis pasireiškia dėl padidėjusios gliukozės koncentracijos plazmoje ir kasos glutatione [17]. Šiame tyrime pagrindinė iškelta hipotezė, kad silimarinas stabdo kasos antioksidantinių fermentų sumažėjimą, sukeltą aloksano. Svarbu pažymėti, kad silimarinas atstatė šį fermentinį aktyvumą, kai buvo skiriamas 9 savaites ir 20 dienų po apsinuodijimo aloksanu. Kartu su šiuo poveikiu, gliukozės koncentracija sumažėja iki normalaus dydžio. Atliktų tyrimų rezultatai ir ankstesni mokslininkų duomenys rodo, kad silimarinas yra svarbi prevencinė priemonė aloksano sukeliamam cukriniam diabetui ir atkuriant normalią gliukozės koncentraciją kraujo serume [16,17].
Uždegimo slopinamasis poveikis
2007 m. gastroenterologijos specialistų atliktas tyrimas, siekiant įvertinti uždegimo slopinamąjį ir antivirusinį standartizuoto silimarino ekstrakto poveikį hepatito C virusu (HCV) sergantiems pacientams [18]. Pirmą kartą įrodomos standartizuoto silimarino priešuždegiminės savybės, slopinant NF- κβ (baltymų kompleksas, reguliuojantis DNR transkripciją) sužadintą traskripciją žmogaus kepenų lastelių kultūrose, citokinų slopinimas uždegimo metu žmogaus PBMC (kraujo ląstelės, turinčios apvalų branduolį) ląstelėse ir tiesioginis antivirusinis poveikis prieš HCV infekciją. Pateikti duomenys atitinka nuomonę, kad silimarinas turi antioksidacinį ir uždegimo slopinamąjį poveikį. Be to, nustatyta, kad silimarinas slopina endotelio, plaučių auglių, prostatos vėžio ir žmogaus hepatomos HepG2 ir Hep3B ląstelių dauginimąsi. Todėl silimarinas gali būti naudingas kaip vaistas nuo daugumos vėžio auglių rūšių [19,20].
Kadangi NF-κβ yra geriausiai charakterizuojamas kaip nuo redukcijos priklausantis transkripcijos faktorius, yra manoma, kad silimarinas sukelia priešuždegiminius veiksmus, slopindamas NF-κβ per antioksidacinį poveikį. Galima teigti, kad silimarinas moduliuoja kepenų membranos
stabilumą ir slopina epidermio augimo faktoriaus susirišimą su receptoriumi. Paprasčiau tariant, silimarinas moduliuoja ląstelių membranas ir membranos funkcijas [18].
Gastroenterologų klinikinių tyrimų metaanalizė parodė, kad silimarinas sumažina kepenų fermento (ALT) padidėjimą, susijusį su hepatitu. 50 HCV sergiantiems pacientams, gydytiems 7 antioksidantų mišiniu su silimarinu, 44 proc. tiriamųjų sumažėjo kepenų fermentų kiekis, taip pat sumažėjo virusų kiekis 25 proc. pacientų. Pagrindiniai standartizuoto silimarino ekstrakto komponentai, sukeliantys stiprų uždegimo slopinamąjį ir anti-HCV poveikį - silibininas A, silibininas B, isosilibininas A ir isosilibininas B [21].
Neuroprotekcinis ir neurotopinis silimarino/silibino poveikis
Dėl savo antioksidantinių savybių, silimarinas gali būti naudingas kai kurių neurodegeneracinių ir neurotoksinių procesų gydymui ir prevencijai. Atlikti tyrimai parodė, kad silimarinas veiksmingai apsaugo dopaminerginius neuronus nuo lipopolisacharido (LPS) sukelto neurotoksiškumo, slopindamas mikroglijų aktyvaciją, kuri atspindi į makrofagus-panašią ląstelių populiaciją šeimininko imuninėje sistemoje ir atkūriamasias ląsteles centrinėje nervų sistemoje [22]. Yra vis daugiau įrodymų, kad mikroglijų sužadinimas prisideda prie tam tikrų CNS ligų neuropatologinių pokyčių (išsėtinės sklerozės, Parkinsono, Alzhaimerio ligų, AIDS demencijos). Silimarinas taip pat slopina uždegimo mediatorių gamybą, pavyzdžiui, naviko nekrozės faktorių-α (TNF-α) ir azoto oksidą, todėl sumažėja dopaminerginių neuronų pažaida. Be to, nustatyta, kad silimarinas, priklausomai nuo jo dozavimo, mažina indukuojamos azoto oksido sintazės gamybą LPS stimuliuotose BV-2 (mikroglijų aktyvacijos modelio) ląstelėse. Todėl yra siūloma, kad silimarino inhibuojantis poveikis mikroglijų ląstelėms yra pernešamas dėl NF- κβ aktyvacijos slopinimo [23].
Silimarino hepatoprotekcinis poveikis
Vienas iš alkoholio sukeliamo kepenų pažeidimo mechanizmų yra laisvųjų radikalų susidarymas dėl šio ksenobiotiko metabolizmo. Silimarinas yra antioksidantas, apsaugantis kepenis nuo laisvųjų radikalų žalos, kurią sukelia alkoholio metabolizmas. Silimarinas veikia stabilizuojant biologines membranas ir skatinant sintezę [24].
Silimarinas pasižymi tiek hepatoprotekciniu, tiek regenariciniu poveikiu [25]. Dėl savo veikimo mechanizmo sudaro kompleksą, kuris trukdo toksinams patekti į kepenų ląsteles. Be to, silimarinas
metaboliškai stimuliuoja kepenų ląsteles ir aktyvina RNR sintezę ribosomose, skatinančiose baltymų susidarymą. Tyrime, kurį paskelbė Seulo nacionalinio universiteto (Pietų Korėja) mokslininkai, nustatytas silimarino apsauginis poveikis žiurkių kepenų ląstelėms, jį panaudojant kaip palyginamąjį faktorių, identifikuojantį kepenų ir gyvūnėlio svorį (hepatomegalija). Hepatomegalija sumažėjo, lyginant su kitomis tiriamosiomis grupėmis, kurioms buvo skirtos atitinkamos antioksidacinės medžiagos. Reikšmingas skirtumas tarp grupių, kurios buvo veiktos silimarinu ir silimarinu bei etanoliu, pastebėtas nebuvo [26]. Šis rezultatas įrodo silimarino apsaugomąjį poveikį kepenims. Būtina paminėti, kad silimarinas pagerina kepenų glutationo susidarymą padidinant cisteino praeinamumą ir skatinant cisteino sintezę, slopinant jo katabolizmą taurinui. Cisteino sintezės reguliavimas vėliau gali prisidėti prie antioksidacinės gynybos. Atlikus analizę paaiškėjo, kad silimarinas sumažino kolageno kaupimąsi 30 proc. cistinės tulžies fibrozės pažeistoms žiurkėms [25,26].
Tyrime su žmonėmis buvo pateikti rezultatai, įrodantys atsistatymą nuo alkoholio sukeltos kepenų cirozės, lyginant su silimarinu negydyta kontroline grupe. Silimarinas yra dažniausiai pasauliniu mastu vartojamas natūralus junginys, skirtas kepenų lygų gydymui dėl savo antioksidantinio, uždegimo slopinamojo ir antifibrozinio aktyvumo [27]. Silimarino tyrinėjimui yra naudojami įvairūs kepenų pažeidimo ir sužalojimo etanoliu modeliai, nes etanolis labiausiai kepenų pažeidimus sukelianti medžiaga visame pasaulyje. Dabartiniai duomenys rodo, kad alkoholio ciroze sergantiems pacientams, gydymas silimarinu gali sušvelninti žalą, tačiau įtakos mirtingumui kol kas nenustatyta.
Toksinų blokada
Silimarinas yra puikus „įrankis“, gydantis jatrogenines ir toksines kepenų ligas. Jis reguliuoja ląstelių ir mitochondrijų membranų pralaidumą, kartu stiprindamas membranos stabilumą nuo ksenobiotikų sužalojimo [28]. Atitinkamai galima užkirsti kelią toksinų absorbcijai į hepatocitus, užblokuojant aktyviuosius centrus bei slopinant daugybę transporto baltymų ląstelės membranoje. Faloidiną transportuojanti sistema, priklausanti hepatocitų specifiniam organininiam pernašos anijonui OATP2, prisijungimo vietoje konkuruoja su silimarinu, tačiau neįtakoja membranos skysčių. OATP2 anijoną galima apbibūdinti ir kaip dalį kepenų apsaugos, kuri išvalo tulžies rūgštimi, lipofiliniais hormonais ar ksenobiotikais užterštą kraują [29]. Transportavimo sistema sujungia falatoksinus su kepenų ląstelėmis, todėl ištinka hepatocitų nekrozė. Kepenų lastelių tyrimo rezltatais patvirtinta - faloidinas (biciklinis heptapeptidas) ir antamanidas (monociklinis dekapeptidas iš Amanita phalloides L. grybo) sąveikauja su hepatocitų membranos rišančiaisiais tulžies druskos polipeptidais. Antamanidas apbibūdinamas kaip panašus arba identiškas transportavimo mechanizmas, slopinamas silibinino, todėl
silimarinas gali sumažinti kenksmingų ksenobiotikų, išskyrus grybų nuodus, ląstelių absorbciją ir taip darant tiesioginę įtaką ląstelių apsaugai [25-27].
1.7 Silimarino identifikavimas
Augalinių vaistų sudėtyje gali būti šimtai įvairių junginių, nors ir daugelio iš jų koncentracija yra maža. Jų terapinis poveikis pagrįstas sudedamųjų komponentų sinergetine sąveika, tad jie gali būti svarbūs augalinių vaistų kokybei, saugai ir veiksmingumui. Norint įvertinti veikliųjų medžiagų kiekį bei visą profilį, chromatografija su atitinkama identifikavimo technika suteikia galingą junginių nustatymo „įrankį“ ir sukuria bendrą mėginio profilį, vadinamą „pirštų antspaudu“.
Nagrinėjant mokslinę literatūrą, galima rasti daug metodų Silybum marianum L. ekstrakto pagrindiniams komponentams identifikuoti ir nustatyti: efektyvioji skysčių chromatografija, spektrofotometrija, dujų chromatografija, ultra efektyvioji plonasluoksnė chromatografija, masių spektrometrija [30-34]. Priklausomai nuo tikslo, mokslininkai kuria chromatografinius augalinių preparatų „pirštų antspaudus“ bei metodus, skirtus biomarkerių kokybės kontrolei bei tam tikrų junginių grupių analizei. Tačiau dauguma mokslininkų naudoja greitus ir pigesnius metodus „pirštų antspaudams“ identifikuoti ir produktų sudėčiai nustatyti - plonasluoksę ir efektyviąją skysčių chromatografijas.
1.7.1 Plonasluoksnės chromatografijos taikymas
Pluonasluoksnė chromatografija yra lengvai prieinama technika, naudojama greitai mėginių atrankai, siekiant ne tik nustatyti augalinius produktus, bet ir atskirti jų biologiškai aktyvius žymenis. Vienas pagrindinių PC privalumų yra galimybė lengvai optimizuoti reikiamus parametrus, pavyzdžiui mėginių užnešimą, plokštelės paruošimą ir derivatizaciją. Tačiau plačiau paplisti PC naudojimui maisto papildų ir augalinių vaistinių preparatų analizei ir kokybės kontrolei trukdo sudėtingas parametrų atkuriamumas, detekcijai reikalingos didelės junginių koncentracijos ir tik pusiau kiekybinė nustatymo technika [35-38]. PC sunku sukontroliuoti keletą veiksnių, pavyzdžiui mėginių užnešimą, garų sudėtį chromatografinėje kameroje ir nestabilią spalvą, naudojant chromogeninius plokštelės ryškinimo reagentus. Nepaisant to, PC yra vis dar plačiai pritaikoma, nes tai yra lengvai prieinama, paprasta naudoti ir ekonomiška analizės technika, reikalaujanti tik kelių brangesnių prietaisių ir tirpiklių. Naujausi pokyčiai ir metodikos modifikacijos žymiai padidina jos atkuriamumą, rezoliuciją ir jautrumą [39-40].
Kartu su patobulinta skaitmenine nuskaitymo ir dokumentacijos programine įranga, dėl kurios gaunama tikslesnė informacija, žymiai pagerėjo visapusiškas PC taikymas identifikuojant ir vertinant vaistažoles bei augalinius preparatus. Didelio našumo plonasluoksnė chromatografija (UEPC) padidino atkuriamumą ir skiriamąją gebą, automatizuodama įvairius etapus ir naudodama mažesnius dalelių dydžius (5 µm ir 20 µm) [41].
2005m. Xiamen universiteto (Kinija) mokslininkai sukūrė mikroemulsijos plonasluoksnės chromatografijos (ME-PC) metodą vandeniniams Silybum marianum L. ekstraktų mėginių pirštų antspaudams nustatyti. Sukurtas metodas padidino atskyrimo efektyvumą, sumažinant aptikimo ribas ir taip padidinant metodikos jautrumą [42]. Kitose populiariose analizės modifikacijose naudojama densitometrinė PC (skaitmenine nuskaitymo programine įranga suskaido junginius) ir keliasluoksnė planarinė chromatografija (junginiai dalinai atskirti pirmąjame bandyme, paskui perkeliami į kitą adsorbentą ir analizuojami antrame matmenyje) [43].
1.7.2 Efektyviosios skysčių chromatografijos taikymas
Efektyvioji skysčių chromatografija (ESC) yra populiariausias augalinių produktų analizės metodas. ESC yra lengvai valdoma, aukštos rezoliucijos, visiškai automatizuota, selektyvi ir jautri instrumentinė tyrimo technika. Vienas iš pagrindinių ESC pranašumų yra galimybė analizėje panaudoti įvairius detektorius [44-46]. Augalinių preparatų „pirštų antspaudų“ analizei naudojami įvairūs detektoriai: ultra violetinės šviesos (UV) ir diodų matricos (DAD) – UV ir regimąją šviesą abosrbuojantiems junginiams; šviesos sklaidos (ELSD) ir chemiliuminescencinis detektorius (CL) – UV ir regimosios šviesos neabsorbuojantiems junginiams; masių spektrometrinis detektorius (MS) – atskirų junginių identifikavimui [47-49].
Tan X Jie, Li Q, Chen X Hui 2008 m. sukūrė efektyviosios skysčių chromatografijos metodą su fotodiodų matricos detektoriumi (PDA), kurio pagalba vienu metu būtų galima nustatyti 6 skirtingų augalo Silybum marianum L. biologiškai aktyvius junginius. ESC analizėje naudojant keturis skirtingus bangos ilgius, sukurtas metodas leido nustatyti bioaktyvius junginius, turinčius puikų atsparumą, tikslumą ir atkūrimą. Metodas buvo taikomas nustatant „pirštų antspaudus“ devyniuose skirtingų kultūrinių regionų ir sezonų mėginiuose Kinijoje [50].
Tačiau ESC reikalauja gana brangios įrangos, dažnai sunaudoja didelį kiekį aplinkai kenksmingų skysčių ir reikalauja kvalifikuoto bei patyrusio personalo. Svarbu paminėti, kad „pirštų antspaudų“ nustatymui reikšmingas veiksnys yra ir judriosios fazės parinkimas. Dažniausiai augalinių preparatų „pirštų antspaudų“ analizei naudojama dalelių pagrindo C18 kolonėlė. Šių kolonėlių efektyvumas priklauso nuo jų dalelių dydžio (3 – 5 µm). Mažesni dalelių dydžiai smarkiai padidina
atgalinį slėgį: kai dalelių dydis sumažėja per pusę, slėgis padidėja keturis kartus. Kadangi dabartinė ESC įranga gali atlaikyti iki 400 atmosferų slėgį, mažinant dalelių dydį ir didinant jų srautą, galimas didesnis efektyvimas ir trumpesnis analizės laikas [51,52].
Taigi, siekiant įvertinti įvairių augalinių produktų sudėtį ir bendrą profilį, plonasluoksnė ir efektyvioji skysčių chromatografija yra galingos analizės priemonės, sukuriančios charakteringą „pirštų antspaudų“ profilį. Aptariamos įvairios, gerai žinomos chromatografijos technologijos, naudojamos vaistažolių preparatams vertinti ir „pirštų antspaudams“ identifikuoti, puikiai tinka ir kiekybiniam ir kokybiniam junginių nagrinėjimui.
2. TYRIMO OBJEKTAS IR METODIKOS
2.1 Tyrimo objektas
Tyrimas atliktas, analizuojant pasirinktus tiriamuosius objektus, kurie šiuo metu yra Lietuvos respublikos ir JAV rinkoje esantys Silybum marianum L. (silimarino) maisto papildai bei nereceptiniai vaistiniai augaliniai preparatai. „CVS“ ir „Walgreens“ vaistinėse JAV įsigyti du maisto papildai. Lietuvos vaistinėse „Benu“, „Gintarinė vaistinė“ ir „Eurovaistinė“ įsigyti 3 maisto papildai ir 5 nereceptiniai vaistiniai augaliniai preparatai, į kurių sudėtį įeina ženklinime nurodytas silimarino kiekis.
1 lentelė. Tiriamieji preparatai
Preparatas Ženklinime nurodytas preparato tipas Vaisto forma Ženklinime nurodytas silimarino kiekis dozuotės vienete
„Spring Valley“ Milk
thistle (JAV) Maisto papildas Kietos kapsulės 140 mg
„CVS Health“ Milk
thistle (JAV) Maisto papildas Kietos kapsulės 140 mg
„Sopharma“ Carsil (BG) Vaistinis preparatas Kietos kapsulės 110 mg
„Aconitum“ Livosil (LT) Vaistinis preparatas Kietos kapsulės 140 mg
„Aconitum“ Helar (LT) Vaistinis preparatas Kietos kapsulės 22,5 mg
“Limedika” Ambio Kepenims su margainiu
(LT)
Maisto papildas Kietos kapsulės 45 mg
„Vox Pharmaceutica“
Hepamax (LT) Maisto papildas
Plėvele dengtos
tabletės 420 mg
„IBE Pharma“ Siromed
Silymarin (LT) Vaistinis preparatas
Plėvele dengtos
tabletės 150 mg
„Sopharma“ Carsil (BG) Vaistinis preparatas Plėvele dengtos
tabletės 22,5 mg
„Biofarmacija“
2.2 Naudotos medžiagos
Reagentai:
Metanolis (>99,9%, Sigma-Aldrich, Seelze, Vokietija);
Sausasis standartinis silibinino ekstraktas (≥98,3 proc. Sigma-Aldrich, Čekija); Bevandenė skruzdžių rūgštis (Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Vokietija);
Acetonas (Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Vokietija);
Metileno chloridas (≥99 % Sigma-Aldrich, Missouri, JAV);
Difenilboro rūgšties aminoetilo esteris (Fluka BioChemika, Bornem, Belgija); Makrogolis 400 (Fluka BioChemika, Bornem, Belgija).
Fosforo rūgštis (≥99 % Sigma-Aldrich, Missouri, JAV);
Efektyviosios skysčių chromatografijos judrioje fazėje A naudojama fosforo rūgštis, metanolis, distiliuotas vanduo (0.5:50:65 V/V/V);
Efektyviosios skysčių chromatografijos judrioje fazėje B naudojama fosforo rūgštis, metanolis, distiliuotas vanduo (0.5:50:50 V/V/V)
2.3 Naudota aparatūra
Preparatų svėrimui buvo naudotos Shimadzu AUW120D (Duisburg, Vokietija) analitinės svarstyklės.
Ekstrakcijos paruoštos ultragarso bangų vonelėje BioSonic UC100 (Mavajai, JAV).
Distiliuoto vandens gamybai buvo naudojama MILIPORE (Darmstadt, Vokietija) vandens gryninimo sistema.
Atliekant kokybinį įvertinimą plonasluoksne chromatografija buvo naudotos stiklinės plokštelės TLC Silica gel 60 F254 (Darmstadt, Vokietija), kurios buvo padengtos 0,25 mm storio
silikagelio sluoksniu, o jų matmenys buvo 20 × 20 cm. Analizuojamų mėginių užnešimas buvo atliktas su pusiau automatiniu užnešėju Camag Linomat 5. Naudota chromatografinė kamera – Camag Twin Trough Chamber 20 × 20 cm. Flavolignanų identifikavimui ant plokštelių buvo naudotas chromatogramų analizavimo prietaisas Camag TLC Visualizer (Muttenz, Šveicarija).
Siekiant kiekybiškai įvertinti silimarino kiekį preparatuose, buvo naudota efektyviosios skysčių chromatografijos sistema Waters Alliance e2695 Separations Module kartu su fotodiodų matricos detektoriumi Waters 2998 PDA (Milford, JAV).
2.4 Tyrimo metodai
Visa taikyta metodika rėmėsi Europos ir JAV farmakopėjų monografijomis apie margalapių margainių vaisių (sėklų) ekstrakto paruošimą. Todėl, atliekant pasiruošimą kokybinei ir kiekybinei analizei, buvo svarbu išanalizuoti minėtų farmakopėjų metodikų skirtumus.
2.4.1 Silimarino analizė plonasluoksnės chromatografijos metodu
Kokybinė fitopreparatų analizė atliekama plonasluoksnės chromatografijos metodu, remiantis Margalapio margainio Europos farmakopėjos monografija Nr. 01/2014:2071 [4].
Tiriamojo tirpalo paruošimas:
Atsveriama 0,250 g tiriamojo gryno standartizuoto margainių ekstrakto ir ištirpinama 5 ml metanolio plokščiadugnėje kolboje ir 15 min patalpinama į ultragarso bangų vonelę. Paruoštas tiriamasis tirpalas filtruojamas per 0,45 µm porų dydžio membraninį filtrą į chromatografinį buteliuką.
Etaloninio tirpalo paruošimas:
Atsveriama 2 mg silibinino standarto ir ištirpinama 10 ml metanolio plokščiadugnėje kolboje ir 15 min patalpinama į ultragarso bangų vonelę. Paruoštas etaloninis tirpalas filtruojamas per 0,45 µm porų dydžio membraninį filtrą į chromatografinį buteliuką.
Plokštelės paruošimas:
Pasiruošti standartinis ir tiriamieji tirpalai užnešami ant stiklinės TLC Silica gel 60 F254
plokštelės pusiau automatiniu mėginių užnešėju Camag Linomat 5 su 100 μl tūrio mikrošvirktu, plokštelėje pažyminčiu 11 mm brūkšnio pavidalo dėmę kiekvienam analizuojamam ekstraktui. Pažymima starto linija 2 cm nuo plokštelės apačios.
Analizė ir rezultatų įvertinimas:
Pažymėta analitinė plokštelė perkeliama į chromatografavimo kamerą, kurią sudaro judrioji fazė, paruošta iš trijų eliuentų sistemos: bevandenės skruzdžių rūgšties, acetono ir metileno chlorido (8,5:16,5:75 V/V/V). Analitinė kamera sandariai uždengiama, siekiant garantuoti tolygų garų pasiskirstymą sistemoje.
Plokštelė laikoma chromatografavimo kameroje, kol užnešti mėginiai pakyla iki 10 cm aukščio nuo pažymėtos starto linijos. Atliekamas plokštelės džiovinimas ant elektrinės kaitinamosios plytelės 100 – 105 °C temperatūroje.
Vis dar karšta išdžiovinta plokštelė ryškinama (apipurškiama) iš anksto pasigamintu 10 g/l difenilboro rūgšties aminoetilo esterio tirpalu metanolyje ir 50 g/l makrogolio 400 tirpalu metanolyje. Toliau išryškinta chromatografinė plokštelė paliekama išdžiūti kambario temperatūroje 30 min.
Pagal Europos farmakopėjos reikalavimus, išryškinta ir išdžiovinta plokštelė analizuojama po 365 nm bangos ilgio UV šviesa. Apskaičiuojamas tiriamųjų komponentų nueitas kelias, nustatomos Rf reikšmės. Gauti rezultatai pateikti lentelėje:
2 lentelė. PC chromatogramos fluorescuojančios zonos
Plokštelės viršus
Silibininas: gelsvai žalsva fluorescuojanti sritis _____
Taksifolinas: oranžinė fluorescuojanti sritis _____
Gelsvai žalsva fluorescuojanti sritis (silibininas) _____
Oranžinė fluorescuojanti sritis (taksifolinas) Gelsvai žalsva fluorescuojanti sritis (silikristinas)
Fluorescuojanti sritis (starto linija)
2.4.2 Silimarino analizė efektyviosios skysčių chromatografijos metodu
Kokybinė ir kiekybinė fitopreparatų analizė atliekama efektyviosios skysčių chromatografijos metodu, remiantis Margalapio margainio Europos farmakopėjos monografija Nr. 01/2014:2071 ir JAV farmakopėjos monografija USP35-NF30.
2.4.2.1 Europos farmakopėjos metodika
Tiriamojo tirpalo paruošimas:
Analitinėmis svarstyklėmis atsveriama 60 mg sausojo standartizuoto silimarino ekstrakto ir ištirpinama 100 ml metanolio plokščiadugnėje kolboje ir 15 min patalpinama į ultragarso bangų vonelę. Paruoštas tiriamasis tirpalas filtruojamas per 0,45 µm porų dydžio membraninį filtrą į chromatografinį buteliuką.
Etaloninio tirpalo paruošimas:
Pasveriamas tikslus kiekis Silybum marianum L. sausojo standartizuoto ekstrakto, atitinkantis 10 mg silibinino standarto ir ištirpinamas 100 ml metanolio plokščiadugnėje kolboje ir 15 min patalpinama į ultragarso bangų vonelę. Paruoštas etaloninis tirpalas filtruojamas per 0,45 µm porų dydžio membraninį filtrą į chromatografinį buteliuką.
Analizėje naudojama įranga ir sąlygos:
Analizėje junginių atskyrimui naudojama 0,125 m ilgio ir 4 mm skersmens nerūdijančio plieno kolonėlė su atvirkščių fazių oktadecilsililo silikagelio sorbentu.
Kiekybiniam nustatymui ESC metodu sudaromos dvi mobiliosios fazės – A ir B. Pirmoji (A) parengiama iš fosforo rūgšties, metanolio ir išgryninto vandens (0,5:35:65 V/V/V). Judrioji fazė B paruošiama iš fosforo rūgšties, metanolio ir išgrynintojo vandens (0,5:50:50 V/V/V).
3 lentelė. Eliuentų sudėties pokytis, keičiantis laikui. Europos farmakopėja
Laikas (min) Judrioji fazė A
(procentai V/V) Judrioji fazė B (procentai V/V) 0 - 28 28 - 35 35 - 36 36 - 51 100 0 0 0 100 100 0 100 100 100 0 0
Nustatomas 0,8 ml/min eliuentų tekmės greitis ir 10 µl injekcijos tūris. Kolonėlės temperatūra 30 ℃. Biologiškai aktyvių junginių nustatymas atliekamas spektrofotometriškai prie 288 nm bangos ilgio.
Analizė ir rezultatų įvertinimas:
Flavolignanai nustatomi pagal jų sulaikymo laiką, lyginant su standartinio (etaloninio) tirpalo sulaikymo laiku. Nustatyti vidutiniai pasiruoštų tiriamųjų tirpalų silimarino komponentų sulaikymo laikai: silikristino – apie 14 min, silidianino – apie 16 min, silibinino A – apie 26 min, silibinino B – apie 27 min, izosilibinino A – apie 31 min, izosilibinino B – apie 33 min.
Kiekybinis tiriamųjų maisto papildų ir vaistinių augalinių preparatų silimarino koncentracijos nustatymas atliekamas pagal chromatografinių smailių plotus:
o Silimarino procentinė koncentracija (išreikšta silibininu), apskaičiuojama naudojant formulę:
(𝐴1+ 𝐴2 + 𝐴3+ 𝐴4+ 𝐴5+ 𝐴6) × 𝑚1 × 𝑝
(𝐴7+ 𝐴8) × 𝑚2
o Silikristino ir silidianino sumos procentinė koncentracija (nuo bendro silimarinio kiekio), apskaičiuojama naudojant formulę:
(𝐴1+ 𝐴2 ) × 100
𝐴1+ 𝐴2 + 𝐴3+ 𝐴4+ 𝐴5+ 𝐴6
o Silibinino A ir silibinino B sumos procentinė koncentracija (nuo bendro silimarinio kiekio), apskaičiuojama naudojant formulę:
(𝐴3+ 𝐴4 ) × 100
𝐴1+ 𝐴2 + 𝐴3+ 𝐴4+ 𝐴5+ 𝐴6
o Izosilibinino A ir izosilibinino B sumos procentinė koncentracija (nuo bendro silimarinio kiekio), apskaičiuojama naudojant formulę:
(𝐴5+ 𝐴6 ) × 100
𝐴1+ 𝐴2 + 𝐴3+ 𝐴4+ 𝐴5+ 𝐴6
A1 = tiriamojo tirpalo silikristino chromatogramos smailės plotas;
A2 = tiriamojo tirpalo silidianino chromatogramos smailės plotas;
A3 = tiriamojo tirpalo silibinino A chromatogramos smailės plotas;
A4 = tiriamojo tirpalo silibinino B chromatogramos smailės plotas;
A5 = tiriamojo tirpalo izosilibinino A chromatogramos smailės plotas;
A6 = tiriamojo tirpalo izosilibinino B chromatogramos smailės plotas;
A7 = etaloninio tirpalo silibinino A chromatogramos smailės plotas;
A8 = etaloninio tirpalo silibinino B chromatogramos smailės plotas;
m1 = etaloninio tirpalo gamybai atsisvertas silibinino standartizuoto sauso grynojo
ekstrakto kiekis, gramais;
m2 = tiriamojo tirpalo gamybai atsisvertas standartizuoto silimarino ekstrakto kiekis,
gramais;
p = silibinino standartizuoto sauso grynojo ekstrakto procentinė koncentracija.
2.4.2.2 JAV farmakopėjos metodika
Tiriamojo tirpalo paruošimas:
Tiriamasis silimarino standartizuoto ekstrakto mėginio kiekis ištirpinamas metanolyje, kad silimarino koncentracija pasigamintame tirpale būtų lygi 0,4 mg/ml.
Tirpalas 20 min patalpinamas ultragarso bangų vonelėje.
Paruoštas tiriamasis tirpalas atvėsinamas iki 20 ℃ temperatūros ir filtruojamas pro 0,45 µm porų dydžio membraninį filtrą į chromatografinį buteliuką.
Etaloninio tirpalo paruošimas:
Paruošiami trys tikslios koncentracijos etaloniniai tirpalai metanolyje, atitinkantys 0.2, 0.02 ir 0.04 mg/ml silibinino standarto.
Tirpalai 15 min. patalpinami į ultragarso bangų vonelę.
Paruošti etaloniniai tirpalai filtruojami per 0,45 µm porų dydžio membraninį filtrą į chromatografinį buteliuką.
Analizėje naudojama įranga ir sąlygos:
Analizėje junginių atskyrimui naudojama 0,150 m ilgio ir 4,6 mm skersmens nerūdijančio plieno kolonėlė su atvirkščių fazių oktadecilsililo silikagelio sorbentu.
Sudaromos dvi judriosios fazės – A ir B. Pirmoji (A) parengiama iš metanolio, fosforo rūgšties ir išgryninto vandens (20:0,5:80 V/V/V). Judrioji fazė B paruošiama iš metanolio, fosforo rūgšties ir išgryninto vandens (80:0,5:20 V/V/V).
4 lentelė. Eliuentų sudėties pokytis, keičiantis laikui. JAV farmakopėja
Laikas (min) Judrioji fazė A (proc.) Judrioji fazė B (proc.) 0 0 0 5 85 15 20 55 45 40 55 45 41 85 15 55 85 15
Nustatomas 1,0 ml/min eliuentų tekmės greitis ir 10 µl injekcijos tūris. Kolonėlės temperatūra 40℃. Biologiškai aktyvių junginių nustatymas atliekamas spektrofotometriškai 288 nm bangos ilgyje.
Analizė ir rezultatų įvertinimas:
Flavolignanai nustatomi pagal jų sulaikymo laiką, lyginant su standartinio (etaloninio) tirpalo sulaikymo laiku. Nustatyti vidutiniai pasiruoštų tiriamųjų tirpalų silimarino komponentų
sulaikymo laikai: silikristino – apie 22 min, silidianino – apie 23 min, silibinino A – apie 35 min, silibinino B – apie 36 min, izosilibinino A – apie 41 min, izosilibinino B – apie 43 min.
Nustatomi tiriamųjų tirpalų silikristino, silidianino, silibinino A, silibinino B, izosilibinino A, izosilibinino B chromatogramų smailių plotai.
Nustatomi pasigamintų silibinino etaloninių tirpalų silibinino A ir silibinino B chromatogramų smailių plotai. Sudaroma kalibracinė kreivė.
Atskirai apskaičiuojamas kiekvieno atitinkamo silimarino (išreikšto silibininu) komponento masės kiekis (mg), atsižvelgiant į paimto tiriamojo preparato turinio dalį:
𝑥 = 𝐶 × 𝑉
Apskaičiuojama silimarino procentinė koncentracija, atsižvelgiant į paimto tiriamojo preparato turinio dalį:
𝑦 = 𝐶𝑆 ×𝐴𝑤𝑐
𝑊 ×
100 𝐿 𝑥 = silimarino komponento kiekis;
𝑦 = silimarino procentinė koncentracija;
C = iš kalibracinės kreivės nustatyto atitinkamo silimarino komponento koncentracija tiriamajame tirpale (mg/ml);
V = tiriamojo tirpalo tūris (ml);
CS = kiekvieno atitinkamo silimarino komponento suma, esanti paimtame tiriamojo
preparato kiekyje (mg);
Awc = vidutinė atitinkamo tiriamojo preparato masė (mg);
W = analizei paimtas mėginio kiekis (mg);
L = atitinkamo tiriamojo preparato reglamentuojamas silimarino kiekis (mg).
2.5 Duomenų statistinė analizė
Duomenų statistinė analizė atlikta naudojantis “Microsoft Excel 2016” (Vašingtonas, JAV) ir “SPSS 21” (Čikaga, JAV) duomenų apdorojimo programine įranga. Statistinis reikšmingumas tarp tiriamųjų mėginių nustatytas naudojant ANOVA dispersinę analizę, taikant „Tuckey“ kriterijų ir vertinant trijų matavimų duomenis. Rezultatai laikyti statistiškai reikšmingais, jei reikšmingumo lygmuo p < 0,05.
3. TYRIMO REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1 Kokybinis silimarino nustatymas plonasluoksnės chromatografijos
metodu
Kokybinė silimarino preparatų analizė (tapatybės nustatymas), atlikta pagal Europos farmakopėjos 01/2014:2071 monografijos plonasluoksnės chromatografijos metodiką, aprašytą 2.4.1 skyriuje. Kadangi Europos ir JAV farmakopėjų PC metodikos ir jų pateikiami parametrai nesiskiria, analizė atlikta pagal vieną metodiką. Remiantis išnagrinėta moksline literatūra ir minėtu Ph. Eur. straipsniu, kokybiškai analizuojant silimarino preparatus, PC chromatogramos „pirštų anstpauduose“ fluorescuoja trys pagrindinės biologiškai aktyvios medžiagos – silibininas, taksifolinas ir silikristinas.
Margalapių margainių (Silybum marianum L.) preparatų ir standartinio silibinino ekstrakto chromatograma, taikant Europos farmakopėjos metodiką, pateikta 3 paveiksle. Skaičiumi 1 pažymėto tiriamojo tirpalo gamybai buvo panaudotas grynasis standartinis silibinino ekstraktas.
Taksifolinas ir silikristinas buvo aptiktas pagal sulaikymo charakteristikas, lyginant gautus rezultatus su chromatografiniu profiliu, pateiktu farmakopėjoje. Analizuojant 3 paveiksle pateiktą chromatogramą, galime aiškiai matyti, kad flavolignanai silibininas, taksifolinas ir silikristinas išryškėjo visuose 10 analizuotų tiriamųjų mėginių.
3 pav. Silimarino preparatų PC chromatograma. 1 - Silibinino standartas; 2 - „Spring Valley“ Milk thistle; 3 - „CVS Health“ Milk thistle; 4 - Carsil kaps.; 5 - Livosil; 6 – Helar; 7 - Ambio
kepenims su margainiu; 8 - Hepamax; 9 - Siromed silymarin; 10 - Carsil tab.; 11 – bioSilymarin. sil – silibininas, tax – taksifolinas, silcr – silikristinas
Panaudojant 2.4.1 skyriuje aprašytą PC metodiką, Silybum marianum L. preparatų analizė pakartota po tris kartus. Surinkti duomenys apdoroti statistiškai, apskaičiuojant aritmetinį sulaikymo rodiklių (Rf) reikšmių vidurkį, standartinį nuokrypį ir santykinį standartinį nuokrypį (4 lentelė).
Išanalizavus statistinius duomenis, santykinis standartinis nuokrypis neviršijo leistinos 5 proc. ribos. Europos (Nr. 01/2014:2071) ir JAV (USP35-NF30) farmakopėjų monografijų reglamentuojama Silybum marianum L. plonasluoksnės chromatografijos metodikos yra vienodos ir puikiai tinkamos pilnam junginių atskyrimui. Taikant aprašytą tirpiklių sistemą (bevandenė skruzdžių rūgštis, acetonas ir metileno chloridas [8,5:16,5:75 V/V/V]) vidutinės sulaikymo rodiklių reikšmės įrodė taikytos metodikos tinkamumą flavolignanų nustatymo metu.
4 lentelė. Statistinis silibinino, taksifolino, silikristino Rf reikšmių įvertinimas, taikant Ph. Eur.
Tirpiklių sistema Tiriamasis junginys Rf vidurkis
Santykinis standartinis nuokrypis (%)
Bevandenė skruzdžių rūgštis, acetonas, metileno
chloridas (8,5:16,5:75 V/V/V)
silibininas 0,637 0,740
taksifolinas 0,457 1,032
silikristinas 0,404 3,087
3.2 Silimarino nustatymas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu
Margalapių margainių fitopreparatų kokybinė ir kiekybinė analizė atlikta efektyviosios skysčių chromatografijos metodika, remiantis Europos ir JAV farmakopėjų monografijų rekomendacijomis.
Vykdant kokybinę Silybum marianum L. preparatų analizę, labai svarbu nustatyti visus silimarino biologiškai aktyvius junginius, nustatyti jų atsikartojamumą bei sulaikymo laikus (Rt)
panaudojant Europos ir JAV farmakopėjų ESC metodikas. Remiantis minėtomis metodikomis ir moksline literatūra, chromatogramoje margalapių margainių flavonoidų komplekso junginiai išsidėsto tam tikra eilės tvarka: silikristinas, silidianinas, silibininas A, silibininas B, izosilibininas A, izosilibininas B [33,37,38,44,46,53].
Remiantis Europos farmakopėjos monografija Nr. 01/2014:2071 ir JAV farmakopėjos monografija Nr. USP35-NF30, iš gautų efektyviosios skysčių chromatografijos chromatogramų nustatyti standartinio silibinino tirpalo sulaikymo laikai ir chromatogramų smailių plotai, sudarytos palyginamosios diagramos (4 ir 5 pav.).
4 pav. Silibinino standartinio tirpalo sulaikymo laikų palyginimas pagal Europos ir JAV farmakopėjas
5 pav. Silibinino standartinio tirpalo chromatogramų smailių plotų palyginimas pagal Europos ir JAV farmakopėjas
Analizuojant standartinį silibinino tirpalą Europos ir JAV farmakopėjų efektyviosios skysčių chromatografijos metodikomis, skirtumas tarp sulaikymo laikų yra aiškiai matomas. Tačiau nors ir naudojamos metodikos savitarpiškai skiriasi ne vienu kriterijumi - tirpalų pasiruošimo būdais, mobilios fazės tirpalų tūrių proporcijomis bei kolonėlės tekmės greičiu ir temperatūra – Rt reikšmių skirtumas
nėra didelis. Tai galima pastebėti ir iš gautų chromatogramų panašumo tarp Europos ir JAV farmakopėjų deklaruojamų standartinių ESC metodikų chromatogramų silibinino A ir B sulaikymo laikų reikšmių. Išanalizavus statistinius (5 ir 6 lentelė) sulaikymo laikų ir chromatogramų smailių plotų duomenis, santykinis standartinis nuokrypis neviršijo rekomenduojamos 5 proc. ribos.
25.145 27.063 23.588 24.725 21.000 22.000 23.000 24.000 25.000 26.000 27.000 28.000 silibininas A silibininas B Su laik ym o la ika s (m in )
Europos farmakopėja JAV farmakopėja
silibininas A silibininas B Europos farmakopėja 1121019 1205933 JAV farmakopėja 2423757 2489420 0 500000 1000000 1500000 2000000 2500000 3000000 Sm ailė s p lot as (µV * se c)
5 lentelė. Statistinis silibinino (A, B) Rt reikšmių įvertinimas, taikant Ph. Eur. ir USP
reglamentuojamas ESC metodikas
Naudojama ESC
metodika Tiriamasis junginys Rt vidurkis
Santykinis standartinis nuokrypis (%) Ph. Eur. Silibininas A 25,023 0,535 Ph. Eur. Silibininas B 27,136 0,304 USP Silibininas A 23,344 1,011 USP Silibininas B 24,609 0,831
6 lentelė. Statistinis silibinino (A, B) chromatogramos smailių plotų įvertinimas, taikant Ph. Eur. ir USP reglamentuojamas ESC metodikas
Naudojama ESC
metodika Tiriamasis junginys
Smailės ploto vidurkis Santykinis standartinis nuokrypis (%) Ph. Eur. Silibininas A 1137419,667 1,656 Ph. Eur. Silibininas B 1217594,667 1,928 USP Silibininas A 2350682,333 3,919 USP Silibininas B 2498655,667 2,951
Ph. Eur. ir USP monografijų nurodymais nustatytos silibinino standarto chromatogramos pateikiamos 6 ir 7 paveiksluose. Iš chromatogramų galima matyti, kad gauti duomenys ir bendras kreivių profilis tarp farmokopėjinių metodų atsikartoja labai panašiai, tačiau USP metodikos chromatograma yra šiek tiek pasislinkusi į kairę pusę, galimai dėl minėtų metodikų skirtumų.
6 pav. Silibinino referencinio tirpalo chromatograma gauta pagal Ph. Eur. ESC metodiką. Detekcija atliekama spektofotometriškai 288 nm bangos ilgyje. 1 – silibininas A; 2 – silibininas B
7 pav. Silibinino referencinio tirpalo chromatograma gauta pagal USP ESC metodiką. Detekcija atliekama spektofotometriškai 288 nm bangos ilgyje. 1 – silibininas A; 2 – silibininas B
Analogiškai tiriami ir margalapių margainių preparatai. Tokiomis pat ESC sąlygomis išanalizuoti 5 maisto papildai ir 5 augaliniai vaistiniai preparatai, remiantis Europos ir JAV farmakopėjų rekomandacijomis. 8-11 paveiksluose pateikiamos dviejų tirtų preparatų - Lietuvoje įsigyto maisto papildo „bioSilymarin“ granulių ir vaistinio preparato „Carsil 22,5 mg“ tablečių - Ph. Eur. bei USP metodikomis gautos chromatogramos. Nagrinėjant gautas chromatogramas, galima pastebėti, kad tiek Europos, tiek JAV farmakopėjų nurodytais metodais preparatuose dominuojančios smailės bei bendras „pirštų antspaudų“ profilis schematiškai atsikartoja. Identifikuojami visi 6 silimarino biologiškai aktyvūs komponentai - silikristinas, silidianinas, silibininas A ir B bei izosilibininas A ir B.
8 pav. „Carsil kaps.“ vaistinio preparato tiriamojo tirpalo chromatograma gauta pagal Ph. Eur. ESC metodiką. Detekcija atliekama spektofotometriškai 288 nm bangos ilgyje. 1 - silikristinas; 2 –
silidianinas; 3 – silibininas A; 4 – silibininas B; 5 – izosilibininas A; 6 – izosilibininas B
9 pav. „Carsil kaps.“ vaistinio preparato tiriamojo tirpalo chromatograma gauta pagal USP ESC metodiką. Detekcija atliekama spektofotometriškai 288 nm bangos ilgyje. 1 - silikristinas; 2 –
silidianinas; 3 – silibininas A; 4 – silibininas B; 5 – izosilibininas A; 6 – izosilibininas B
10 pav. „bioSilymarin“ maisto papildo tiriamojo tirpalo chromatograma gauta pagal Ph. Eur. ESC metodiką. Detekcija atliekama spektofotometriškai 288 nm bangos ilgyje. 1 - silikristinas; 2 –
11 pav. „bioSilymarin“ maisto papildo tiriamojo tirpalo chromatograma gauta pagal USP ESC metodiką. Detekcija atliekama spektofotometriškai 288 nm bangos ilgyje. 1 - silikristinas; 2 –
silidianinas; 3 – silibininas A; 4 – silibininas B; 5 – izosilibininas A; 6 – izosilibininas B
Kadangi visuose preparatuose identifikuoti silimarino veiklieji žymenys, analizuojami tirtų maisto papildų ir vaistinių preparatų chromatogramų smailių plotai. Schematinis smailių plotų palyginimas pateikiamas 12 ir 13 paveiksluose. Nagrinėjant pateiktus duomenis, matomas chromatogramų smailių plotų skirtumas tarp metodikų. Europos farmakopėjos atlikta metodika, mažiausias plotas po kreive nustatytas preparatų „Ambio kepenims su margainiu“, „Siromed Silymarin“, „Carsil tab.“ bei „bioSilymarin“. Tačiau pastaruosius preparatus analizuojant USP reglamentuojama metodika, „Siromed Silymarin“, „Carsil tab.“ ir „bioSilymarin“ preparatų smailių plotai didžiausi, o „Ambio kepenims su margainiu“ - mažiausi. Ryškus skirtumas matomas vaistinio preparato „Helar“. Grafiškai nagrinėjant rezultatus, gautus pagal JAV farmakopėjos siūlomą metodiką, „Helar“ preparato chromatogramos smailės plotas yra didžiausias. Analizę atlikus Europos farmakopėjos validuota metodika, negauti analogiški duomenys. Kitų, diagramose vaizduojamų analizuotų preparatų chromatogramų smailių plotai skyrėsi nežymiai.
12 pav. . Europos farmakopėjos metodika preparatuose identifikuotų biologiškai aktyvių medžiagų chromatogramų smailių plotų palyginimas
13 pav. . JAV farmakopėjos metodika preparatuose identifikuotų biologiškai aktyvių medžiagų chromatogramų smailių plotų palyginimas
Apibendrinant kokybinės analizės rezultatus, galima teigti jog silimarino aktyviuosius komponentus pavyko vienodai nustatyti remiantis tiek Europos, tiek JAV farmokopėjų monografijų pateikiamomis efektyviosios skysčių chromatografijos metodikomis. Didžioji dauguma tirtų preparatų tarpusavyje abiejomis metodikomis pateikia labai panašius duomenis, tačiau atsiradę skirtumai priklauso nuo metodikų pateikiamų nevienodų parametrų (tirpalų paruošimo būdų, judrosios fazės tirpalų tūrių proporcijų, kolonėlės tekmės greičio, temperatūros).
0 500000 1000000 1500000 2000000 2500000 3000000 Pl o ta s p o k re iv e (µV * se c) Preparatai
silikristinas silidianinas silibininas A silibininas B izosilibininas A izosilibininas B
0 500000 1000000 1500000 2000000 2500000 3000000 3500000 4000000 4500000 Pl o ta s p o k re iv e (µV * se c) Preparatai
silikristinas silidianinas silibininas A silibininas B izosilibininas A izosilibininas B
3.3 Kiekybinis silimarino nustatymas efektyviosios skysčių
chromatografijos metodu
Atliekant kiekybinę Silybum marianum L. preparatų sudėties analizę, siekiama nustatyti silimarino koncentraciją nagrinėtuose preparatuose, palyginti gautus rezultatus su gamintojo pateikiamais duomenimis ant pakuotės, bei palyginti bendrą flavolignanų mišinio profilį. Remiantis Ph. Eur. ir USP monografijų rekomendacijomis, margalapių margainių preparatai kiekybiškai analizuojami efektyviosios skysčių chromatografijos metodu. Europos ir JAV farmakopėjos kiekybinį įvertinimą reglamentuoja atlikti pagal bendrą silimarino kiekį (išreikštą silibininu) bei sudedamųjų komponentų silikristino ir silidianino, silibinino A ir silibinino B, izosilibinino A ir izosilibinino B koncentracijų sumą. Pagal Ph. Eur ir USP straispnius, pateikiamas silimarino kiekis tiriamajame preparate privalo pateikti į 90 - 110 proc. ribą. Tačiau atsižvelgiant į galimas leistinas paklaidas, augalinių vaistinių preparatų, kurių sudėtyje yra terapiniai žymenys, kiekybinis rodiklis ribojamas ± 5 proc. diapazone. Maisto papildams taikytinas diapazonas platesnis – siekia ± 15 proc. Todėl taikytinos ribos pakoreguotos iki 75 – 125 proc. maisto papildams ir 85 – 115 proc. analizuojamiems vaistiniams preparatams. Taip pat, silimarino kiekis turi atitikti silikristino ir silidianino, silibinino A ir silibinino B, izosilibinino A ir izosilibinino B veikliųjų sudedamųjų dalių sumą, apskaičiuotą atsižvelgiant į bendrą silimarino kiekį. Atitinkamai 20 – 45 proc., 40 – 65 proc. ir 10 – 20 proc. viso silimarino kiekio.
Atliekant kiekybinį skaičiavimą, pirmiausia privaloma nustatyti kiekviename preparate esančių silimarino aktyviųjų komponentų chromatogramų smailių plotų reikšmes (AUC) pagal Ph. Eur. ir USP metodikas. Chromatogramų smailių plotai pateikiami aukščiau esančiuose 12 ir 13 paveiklsuose. Panaudojant gautus duomenis, apskaičiuojamos bei susumuojamos preparatų flavolignanų mišinio sudedamųjų dalių koncentracijos (7 ir 8 lentelė).
7 lentelė. Silimarino preparatų žymenų kiekiai, gauti remiantis Europos farmakopėjos metodika. I - Spring
Valley; II - CVS Health; III - Carsil kaps.; IV - Livosil; V – Helar; VI - Ambio; VII - Hepamax; VIII - Siromed silymarin; IX - Carsil tab.; X – bioSilymarin.
a – silikristinas; b – silidianinas; c – silibininas A; d – silibininas B; e – izosilibininas A; f – izosilibininas B Ph. Eur. Ribos (%) I (%) II (%) III (%) IV (%) V (%) VI (%) VII (%) VIII (%) IX (%) X (%) a + b (%) 20 - 45 52,0 26,3 32,5 25,2 23,7 30,0 28,1 31,7 31,1 30,1 c + d (%) 40 - 65 29,7 63,2 52,6 63,2 64,2 57,6 61,2 54,5 54,2 60,4 e + f (%) 10 - 20 18,3 10,6 11,6 11,6 12,1 12,4 10,7 13,8 14,7 9.5
8 lentelė. Silimarino preparatų žymenų kiekiai, gauti remiantis JAV farmakopėjos metodika. I - Spring Valley;
II - CVS Health; III - Carsil kaps.; IV - Livosil; V – Helar; VI - Ambio; VII - Hepamax; VIII - Siromed silymarin; IX - Carsil tab.; X – bioSilymarin.
a – silikristinas; b – silidianinas; c – silibininas A; d – silibininas B; e – izosilibininas A; f – izosilibininas B
USP Ribos (%) I (%) II (%) III (%) IV (%) V (%) VI (%) VII (%) VIII (%) IX (%) X (%) a + b (%) 20 – 45 43,6 25,7 30,1 24,3 23,9 28,7 25,7 26,6 30,1 29,0 c + d (%) 40 - 65 43,6 66,6 58,8 66,5 65,0 63,2 66,1 62,7 59,4 60,4 e + f (%) 10 - 20 12,8 7,7 11,1 9,2 11,2 8,1 8,2 10,7 10,5 10,5
Atsižvelgiant į gautus rezultatus, bendras profilis tarp Europos ir JAV reglamentuojamų metodikų atsikartoja labai panašiai, tačiau yra atsiradusių individualių skirtumų. Europos farmakopėjos atlikta ESC technika „Spring Valley“ preparato silikristino ir silidianino bei silibinino A ir silibinino B koncentracija nepatenka į Ph. Eur. monografijos reglamentuojamas 40 – 65 proc. ir 10 – 20 proc. ribas (a + b = 52,0 proc.; c + d = 29,7 proc.). Maisto papildo „bioSilymarin“ izosilibinino A ir izosilibinino B suminė procentinė koncentracija neatitinka nurodomų 10 – 20 proc. apribojimų (e + f = 9,5 proc.). JAV farmakopėjos atlikta ESC metodika gauti skirtingi bendro proflilio analizės rezultatai. Maisto papildo „CVS Health“ (c + d = 66,6 proc.; e + f = 7,7 proc.) ir vaistinio preparato “Livosil” (c + d = 66,5 proc.; e + f = 9,2 proc.) silibinino A ir silibinino B bei izosilibinino A ir izosilibinino B aktyviųjų junginių
