DERMATOLOGINIŲ PREPARATŲ SU BAIKALINĖS KALPOKĖS (SCUTELLARIA BAICALENSIS GEORGI) EKSTRAKTU GAMYBA IR BIOFARMACINIS VERTINIMAS

MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS

KLINIKINĖS FARMACIJOS KATEDRA

VYTIS ČIŽINAUSKAS

DERMATOLOGINIŲ PREPARATŲ SU BAIKALINĖS KALPOKĖS

(SCUTELLARIA BAICALENSIS GEORGI) EKSTRAKTU GAMYBA

IR BIOFARMACINIS VERTINIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Vadovas:

prof. Vitalis Briedis

Konsultantė:

prof. Kristina Ramanauskienė

MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS

KLINIKINĖS FARMACIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis,

Data

DERMATOLOGINIŲ PREPARATŲ SU BAIKALINĖS KALPOKĖS

(SCUTELLARIA BAICALENSIS GEORGI) EKSTRAKTU GAMYBA IR

BIOFARMACINIS VERTINIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Konsultantė

Darbo vadovas

Prof. Kristina Ramanauskienė

Prof. Vitalis Briedis

Data

Data

Recenzentas

Darbą atliko

Prof. Hiliaras Rodovičius

Magistrantas

Vytis Čižinauskas

Data

Data

TURINYS

3. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 10

4. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10

4.1.BAIKALINĖS KALPOKĖS (SCUTELLARIA BAICALENSIS GEORGI) CHEMINĖ SUDĖTIS IR BIOLOGINIS AKTYVUMAS ... 10

4.2.FLAVONOIDŲ ANALIZĖS METODAI ... 13

4.2.1. Flavonoidų struktūros ypatumai ... 13

4.2.2. Tiriamųjų flavonoidų mėginių paruošimas analizei... 14

4.2.3. Flavonoidų skirstymas ir nustatymas ... 16

4.2.4. Efektyvioji skysčių chromatografija ... 16

4.2.5. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodų taikymas baikalinės kalpokės veikliųjų junginių tyrimams ... 18

4.2.6. Spektrofotometrinių metodų pritaikymas flavonoidų kiekybinei analizei ... 21

4.3.PUSKIEČIŲ VAISTO FORMŲ KATEGORIJOS IR JŲ TECHNOLOGIJOS ... 21

4.4.VEIKLIŲJŲ JUNGINIŲ ATSIPALAIDAVIMO TYRIMAI IŠ PUSKIEČIŲ PREPARATŲ, VARTOJAMŲ ANT ODOS ... 24 5. TYRIMO METODIKA ... 29 5.1.TYRIMO MEDŽIAGOS ... 29 5.1.1. Reagentai: ... 29 5.1.2. Įranga: ... 30 5.2.ANALITINIAI METODAI ... 30

5.2.1. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodika ... 30

5.2.2. Baikalinės kalpokės ekstrakto veikliųjų junginių tirpumo tyrimas ... 31

5.2.3. Pirminiai baikalinės kalpokės ekstrakto vertinimo metodai ... 31 5.2.4. Puskiečių vaistų formų su baikalinės kalpokės ekstraktu pH reikšmių nustatymas . 32

5.2.5. Puskiečių vaistų formų su baikalinės kalpokės ekstraktu dinaminės klampos

nustatymas ... 32

5.2.6. Puskiečių vaistų formų su baikalinės kalpokės ekstraktu veikliųjų junginių atsipalaidavimo tyrimas in vitro ... 33

5.2.7. Statistinė analizė ... 34

5.3.PUSKIEČIŲ VAISTO FORMŲ SU BAIKALINĖS KALPOKĖS EKSTRAKTU GAMYBOS METODAI .. 34

5.3.1. Gelių technologija ... 34

5.3.2. Gelifikuotų kremų su baikalinės kalpokės ekstraktu technologija ... 35

5.3.3. Kremų su baikalinės kalpokės ekstraktu technologija ... 36

6. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 37

6.1.PIRMINIO BAIKALINĖS KALPOKĖS EKSTRAKTO VERTINIMO REZULTATAI ... 37

6.2.BAIKALINĖS KALPOKĖS EKSTRAKTO VEIKLIŲJŲ JUNGINIŲ EFEKTYVIOSIOS SKYSČIŲ CHROMATOGRAFIJOS ANALIZĖS METODO VALIDACIJA ... 38

6.3.BAIKALINĖS KALPOKĖS EKSTRAKTO VEIKLIŲJŲ JUNGINIŲ TIRPUMO TYRIMAS ... 40

6.4.PUSKIEČIŲ SISTEMŲ SU BAIKALINĖS KALPOKĖS EKSTRAKTU KOKYBINIS VERTINIMAS ... 42

6.4.1. Gelių su baikalinės kalpokės ekstraktu tyrimas ... 42

6.4.2. Kremų ir gelifikuotų kremų su baikalinės kalpokės ekstraktu analizė ... 44

7. IŠVADOS ... 47

8. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 48

9. LITERATŪROS SĄRAŠAS... 49

SANTRAUKA

DERMATOLOGINIŲ PREPARATŲ SU BAIKALINĖS KALPOKĖS

(SCUTELLARIA BAICALENSIS GEORGI) EKSTRAKTU GAMYBA

IR BIOFARMACINIS VERTINIMAS

V. Čižinausko magistro baigiamasis darbas/ mokslinis vadovas prof. V. Briedis; konsultantė prof. K. Ramanauskienė

Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Klinikinės farmacijos katedra. – Kaunas.

Darbo tikslas: pagaminti pusiau kietas vaisto formas su baikalinės kalpokės (Scutellaria baicalensis Georgi) ekstraktu ir atlikti jų biofarmacinį vertinimą.

Darbo uždaviniai:

1. Išvystyti ir validuoti metodiką baikalinės kalpokės ekstrakto veikliųjų junginių (baikalino, baikaleino ir vogonino) kokybinei ir kiekybinei analizei.

2. Pagaminti pusiau kietas vaisto formas (kremus, gelius ir gelifikuotus kremus) su baikalinės kalpokės ekstraktu ir atlikti jų biofarmacinį vertinimą.

3. Ištirti baikalinės kalpokės veikliųjų junginių atsipalaidavimą iš sumodeliuotų pusiau kietų vaisto formų tyrimais in vitro.

Metodai: Ekstraktas analizuotas pritaikant fenolinių junginių ir flavonoidų nustatymą

spektrofotometriniais metodais, spektrofotometrinį metodą laisvųjų DPPH· radikalų surišimo aktyvumui pagal troloksą nustatyti, efektyviosios skysčių chromatografijos metodiką biologiškai aktyviems junginiams – baikalinui, baikaleinui ir vogoninui – nustatyti kokybiškai ir kiekybiškai. Pusiau kietų vaisto formų gamyba: gelifikuotos sistemos gaminamos, naudojant karbomerą 980 kaip gelifikuojančią medžiagą ir įterpiant baikalinės kalpokės ekstraktą ištirpintą 30 % etanolyje; kremai gaminami naudojant skirtingus pagrindus, sudarytus iš polietileno ir vazelino aliejaus mišinys (PLW) ir iš hidrogenizuoto polideceno, polietileno ir tokoferolio mišinio (PLW PAO E), sumaišant ir homogenizuojant sistemas automatine maišykle; gelifikuoti kremai gaminami paruošiant dvi skirtingas fazes, kurios vėliau gelifikuojamos poloksameru 407.

Vaisto formų kokybė vertinama nustatant dinaminę klampą, pH reikšmę ir atliekant veikliųjų junginių atpalaidavimo tyrimą in vitro.

Rezultatai: Bendras flavonoidų kiekis etanoliniame 30 % (v/v) baikalinės kalpokės ekstrakte

4,2639±0,1979 %. Vandeniniame ekstrakte nustatyta 4,7097±0,0611 % fenolinių junginių. Efektyvi 50 % laisvųjų DPPH· radikalų surišanti baikalinės kalpokės ekstrakto, ištirpinto 30 % (v/v) etanolyje

koncentracija EC50= 4,305 mg/l. Įteisinta ESC metodika baikalino, baikaleino ir vogonino kiekybiniam

nustatymui. Kiekvieno veikliojo junginio atskyrimo reikšmė Rs>1,5. Nustatytas kalibracijos kreivių koreliacijos koeficientas R2>0,999. Nustatyta optimali etanolio koncentracija (30 % (v/v)) baikalinės kalpokės ekstraktui ištirpinti. Į gelius įterpus 1 % baikalinės kalpokės ekstrakto, sumažėja jų dinaminė klampa: 0,5 % gelyje sumažėja 86,03 %; 0,75 % - 49,03 %; 1,0 % - 29,84 %. Veikliųjų baikalinės kalpokės ekstrakto junginių atsipalaidavimo tyrimai in vitro parodė: jog iš gelių veikliųjų junginių atsipalaidavo 8,591±0,150 % iš 0,5 % karbomero gelio, 7,491±0,700 % iš 0,75 % gelio, 7,930±0,900% iš 1,0 % gelio; iš kremo su PLW PAO E pagrindu atsipalaidavo 0,500 ± 0,103 % veikliųjų junginių, o iš kremo su PLW pagrindu 0,390±0,009 %; iš gelifikuoto kremo KRG atsipalaidavo 8,091±0,692 % veikliųjų junginių, o daugiausiai, lyginant su visomis sistemomis, atsipalaidavo iš gelifikuoto kremo KRG2 10,334 ± 0,486 %.

Išvados:

1. Įvertinus paskelbtus mokslinius duomenis, pasirinktas, išvystytas ir validuotas baikalinės kalpokės ekstrakto veikliųjų junginių – baikalino, baikaleino ir vogonino – efektyviosios skysčių chromatografijos analizės metodas, pritaikytas ekstrakto kokybės vertinimui ir puskiečių sistemų su baikalinės kalpokės ekstraktu biofarmaciniuose tyrimuose in vitro.

2. Remiantis mokslinės literatūros duomenimis, sumodeliuotos pusiau kietos vaisto formos su baikalinės kalpokės ekstraktu – geliai, gelifikuoti kremai ir kremai, kuriose baikalinės kalpokės ekstraktas įvestas tirpalo ir suspensine forma. Įvertinta jų kokybė ir nustatytos pH reikšmės, kurių intervalai geliams pH 7 – 8, kremams pH 5 – 6, gelifikuotiems kremams pH 6 – 7.

3. Tyrimų rezultatai parodė, kad tinkamiausia vaisto forma baikalinės kalpokės ekstrakto įvedimui ir tolimesniems tyrimams, pagal didžiausią atsipalaidavusių veikliųjų junginių kiekį, yra gelifikuoti kremai.

SUMMARY

DEVELOPMENT AND COMPARATIVE EVALUATION OF

TOPICAL SEMISOLID FORMULATIONS CONTAINING BAIKAL

SCULLCAP (SCUTELLARIA BAICALENSIS GEORGI) EXTRACT

Vytis Čižinauskas master thesis/ Term paper advisor: prof. V. Briedis; Consultant: prof. K. Ramanauskienė

Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of pharmacy, Department of Clinical Pharmacy. – Kaunas

Objective of work: To prepare and analyze semisolid preparations with baikal skullcap (Scutellaria baicalensis Georgi) extract and evaluate their quality.

Main tasks:

1. To develop and validate a suitable method for main active compounds (baicalin, baicalein and wogonin) of baikal skullcaps extract quality and quantity analysis.

2. To formulate semisolid dosage forms (creams, gels and jellified creams) containing extract of baikal skullcap and evaluate their quality.

3. To determine the release of baikal skullcap active compounds in vitro, from designed semisolid dosage forms.

Methods: The analysis of the extract is executed by using spectrophotometric methods for analysis of

total flavonoids, total phenolic compounds measuring, DPPH· free radical scavenging activity measuring according to trolox and capillary HPLC.

Formulation of semisolids: jellified systems are prepared using carbomer 980 as a jellifying agent and adding baikal skullcap extract which is dissolved in 30 % ethanol; creams are prepared by stirring and homogenizing with an unguator using different bases: a mixture of polyethylene and vaseline (PLW) and a mixture of polyalphaolefine, polyethylene and vitamin E (PLW PAO E); jellified creams are made from two different phases, later they are jellified with poloxamer 407.

Quality of the systems is evaluated: by detecting viscosity, measuring pH values and by testing release of active compounds in vitro.

Results: Total amount of flavonoids in ethanolic 30 % baikal skullcap extract was measured to be

baikal skullcap extract into water, was detected. Free radical scavenging activity is EC50=4,305 mg/l.

Capillary HPLC method for analysis of baicalin, baicalein and wogonin was validated. The separation value for each active compound was Rs>1,5. Calibration curves correlation coefficient was R2> 0,999. Optimal concentration to dissolve baikal skullcap extract was measured to be 30 %. Addition of 1 % of baikal skullcap extract reduced the viscosity of gels: in 0,5 % carbomer 980 gel the viscosity was reduced by 86,03 %; in 0,75 % gel by 49,03 %; in 1,0 % gel by 29,84 %. In vitro release testing showed: that from gels was released 8,591±0,15 % of active compounds from 0,5 % carbomeric gel, 7,491±0,70 % from 0,75 % gel, 7,930±0,90 % from 1,0 % gel; from cream PLW PAO E 0,500±0,103 % of active compounds was released and from PLW cream 0,390 ± 0,009 %; from jellified cream KRG 8,091±0,692 % of active compounds was released and the highest amount was released from jellified creams composition KRG2 10,334 ± 0,486 %.

Conclusions:

1. Based on published scientific data an HPLC method was developed and validated to evaluate main active compounds of baikal skullcaps extract (baicalin, baicalein and wogonin) in quality assays of the extract and during biopharmaceutical assays in vitro with semisolid dosage forms with baikal skullcap extract.

2. Based on scientific literature, semisolid dosage forms with baikal skullcaps extract were developed – gels, jellified creams and creams, when the extract was incorporated in the forms of solution and suspension. Their quality was evaluated and pH was measured to be 7 – 8 in gels, 5 – 6 in creams and 6 – 7 in jellified creams.

3. The results showed that the most appropriate form to incorporate baikal skullcaps extract and continue the research, based on the highest amount of released compounds, is jellified creams.

Key words: Baikal skullcap, Scutellaria baikalensis Georgi, biopharmaceutical evaluation, in vitro

evaluation, carbomer gels, gel – creams, creams, semisolids, topical dosage forms

PADĖKA

Už suteiktas kokybiškas darbo sąlygas ir materialinę bazę atlikti mokslinį tiriamąjį darbą „Dermatologinių preparatų su baikalinės kalpokės (Scutellaria baicalensis Georgi) ekstraktu gamyba ir biofarmacinis vertinimas“ dėkoju Klinikinės farmacijos katedrai ir visam kolektyvui.

1. SANTRUMPOS

ESC – efektyvioji skysčių chromatografija UV – ultravioletiniai spinduliai

MS – masių spektrometrijos

UVB – ultravioletiniai beta spinduliai °C – laipsniai Celsijaus

% - procentai Pa – Paskaliai

s-1 – sekundės minus pirmame laipsnyje rad/s – radianai per sekundę

COX – II – fermentas ciklooksigenazė-II; UV – ultravioletinis;

pKa – medžiagos rūgštingumo rodiklis; pav. – paveikslas; h – valandos; min – minutės; bar – barai PEG – propilenglikolis N – normalingumas pH – vandenilio potencialas v.d. – vidinis diametras

2. ĮVADAS

Plečiantis augalinių preparatų rinkai ir didėjant susidomėjimui fitopreparatų kūrimu ieškoma augalų, kuriuos būtų galima pritaikyti naujų preparatų kūrimui. Ypač daug tokių augalų atrandama tolimųjų Rytų rinkoje, kurios augalinės žaliavos vis populiarėja vakaruose ir su jomis atliekami atrankiniai tyrimai. Šių tyrimų metu atrinktas vienas plačiausiai Kinijoje naudojamų augalų – baikalinė kalpokė (Scutellaria baicalensis Georgi). Pastaruoju metu vykdomi šio augalo ekstrakto ir jo veikliųjų junginių tyrimai rodo jų svarbą ne tik vidaus ligų, tokių kaip kvėpavimo takų, išeminio insulto, kraujodaros organų sutrikimų, gydymui bei korekcijai, bet ir išoriniam poveikiui, dėl antimikrobinio ir priešuždegiminio poveikio, apsaugant nuo įvairių odos pažaidų, tokių kaip UVB radiacijos, mažinant oksidacinį stresą ar net slopinant odos karcinomos bei auglių plitimą. Pritaikius tinkamą nešiklį šio augalo ekstrakto veiklieji junginiai gali tapti efektyvaus fitopreparato, skirto išoriniam vartojimui, sudėtine dalimi.

Pirminiam nešiklio sistemos tinkamumo įvertinimui geriausiai tinka veikliųjų junginių atsipalaidavimo tyrimai in vitro, nes jų metu galima nustatyti pakankamai fizikinių ir cheminių baikalinės kalpokės veikliųjų junginių savybių. Atliekant atpalaidavimo tyrimus in vitro būtina naudoti tikslią ir atrankią metodiką kiekybiniam tiriamų ekstrakto veikliųjų junginių nustatymui bei analizei. Todėl dėl plataus taikymo fitopreparatų analizei, tikslumo ir efektyvumo skirstant daugiakomponenčius mišinius, pasirinkta pritaikyti efektyviąją skysčių chromatografiją.

3. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Tyrimo problema: pusiau kietų vaisto formų su baikalinės kalpokės ekstraktu technologinių ir

kokybės vertinimo metodų trūkumas.

Tyrimo objektas: pusiau kietos vaisto formos su baikalinės kalpokės ekstraktu.

Darbo tikslas: pagaminti pusiau kietas vaisto formas su baikalinės kalpokės (Scutellaria baicalensis Georgi) ekstraktu ir atlikti jų biofarmacinį vertinimą.

Darbo uždaviniai:

1. Išvystyti ir validuoti metodiką baikalinės kalpokės ekstrakto veikliųjų junginių (baikalino, baikaleino ir vogonino) kokybinei ir kiekybinei analizei.

2. Pagaminti pusiau kietas vaisto formas (kremus, gelius ir gelifikuotus kremus) su baikalinės kalpokės ekstraktu ir atlikti jų biofarmacinį vertinimą.

3. Ištirti baikalinės kalpokės veikliųjų junginių atsipalaidavimą iš sumodeliuotų pusiau kietų vaisto formų tyrimais in vitro.

4. LITERATŪROS APŽVALGA

4.1. Baikalinės kalpokės (Scutellaria baicalensis Georgi) cheminė sudėtis ir

biologinis aktyvumas

Baikalinė kalpokė (Scutellaria baicalensis Georgi) yra vienas pagrindinių tradicinės kinų medicinos augalų, priskiriamų prie vėsinantį ir džiovinantį poveikį turinčių vaistų. Istoriškai ji buvo naudojama kaip priešuždegiminė ir priešvėžinė priemonė [11,43]. Gamtoje natūraliai aptinkama nuo Korėjos pusiasalio iki Kinijos, Japonijos, Mongolijos ir Rusijos [44].

Augalo pavadinimo sinonimai: Scutellaria grandiflora Adams, Scutellaria barbata D. Don,

Scutellaria lanceolaria Miq., Scutellaria macrantha Fisch., Scutellaria rivularis Wall., Scutellaria bardata. Notrelinių (Lamiaceae) šeima, kuriai priklauso baikalinė kalpokė taip pat žinoma kaip

Lūpažiedžių (Labiatae). Bendriniai augalo pavadinimai aptinkami įvairioje literatūroje: Baikal skullcap, ban-ji-ryun, banjiryun, ban-zhi-lian, huang chin, huang lien, huang qin, huangqin, hwanggum, hwang-keum, koganebana, skull cap, senohgon, whang-geum, whangegum, wogon [44].

Baikalinės kalpokės farmakopėjinė žaliava – išdžiovintos, nuplautos, dažniausiai supjaustytos šaknys be šakniastiebių. Renkamos pavasarį ir/ar rudenį. Išdžiovinto augalo žaliavoje turi būti ne mažiau kaip 9,0 % baikalino (C21H18O11; molekulinė masė: 446,4) nustatyto efektyviosios skysčių

chromatografijos metodu aprašytu farmakopėjoje. Veikliųjų junginių kiekiui gali būti taikomi ir kiti metodai, tokie kaip kapiliarinė elektroforezė [10].

Baikalinės kalpokės vartojimas aprašytas Kinijos farmakopėjoje, PSO monografijoje bei kituose įvairiose šalyse pripažintuose dokumentuose – pykinimo, vėmimo, ūmios dizenterijos, geltos, karbunkulų ir žaizdų gydymui bei persileidimo prevencijai [35,43,44]. Tradicinėje medicinoje baikalinės kalpokės žaliava naudojama viršutinių kvėpavimo takų ligų, alergijų, aterosklerozės, diarėjos, dermatito ir hipertenzijos gydymui. Atlikti tyrimai su šaknų nuoviru, kuris buvo vartotas gydyti viršutinių kvėpavimo takų infekcijas vaikams iki 5 metų ir jaunesniems, pagrindė tradicinį baikalinės kalpokės nuoviro vartojimo efektyvumą [44]. Tokių tyrimų, pagrindžiančių tradicinį baikalinės kalpokės vartojimą įvairiomis formomis vis gausėja.

Šiuo metu baikalinė kalpokė tapo vienu iš intensyviai tiriamų augalų dėl didelio kaupiamų flavonoidų kiekio ir jų įvairovės. Nustatyti pagrindiniai veiklieji junginiai: flavonoidų glikozidai – tai daugiausia baikalinas (žaliavose aptinkama iki 14 %), vogonino–7–O–glukuronidas (žaliavose aptinkama iki 4 %), mažesnis kiekis skutelarino; ir jų aglikonai – baikalino aglikonas baikaleinas (žaliavose aptinkama iki 5 %), vogoninas (žaliavose aptinkama iki 0,7 %), taip pat nustatomi mažesni kiekiai oroksilino A, ir skutelareino [10,35,44].

Nustatyta, jog baikalinas ir baikaleinas gali inhibuoti žmogaus imunodeficito 1 tipo viruso aktyvumą, slopina navikų augimą, turi antioksidacinį ir laisvuosius radikalus surišantį veikimą [26,44]. Kinijos mokslininkų aprašyti vogonino tyrimai rodo, jog jis pasižymi aktyvumu prieš respiracinį sincitinį virusą bei hepatito B virusą, taip pat antinavikiniu ir laisvuosius radikalus surišančiais efektais [41]. Kito kaupiamo flavonoido – oroksilino A – nustatytas aktyvumas prieš respiracinį sincitinį virusą rodo tradicinio vartojimo viršutinių kvėpavimo takų ligų gydymui pagrįstumą [18]. Tuo tarpu svarbiausi aprašomi skutelarino tyrimai susiję su jo vartojimu širdies ir kraujagyslių ligų gydymui bei profilaktikai [11]. Nustatytas keturių veikliųjų baikalinės kalpokės šaknų junginių mechanizmas ir prisijungimo prie receptorių aktyvumas. Baikalinas, baikaleinas, skutelareinas ir vogoninas jungiasi su benzodiazepinų γ-amino sviesto rūgšties A receptoriais, o prisijungimo aktyvumas: vogonino (2,03 μmol/l) > baikaleino (5,69 μmol/l) > skutelareino (12,00 μmol/l) > baikalino (77,00 μmol/l). Aprašomi Smolianinovo su kolegomis (1997) tyrimai su chemoterapijos pacientais, kuriems nustatytas plaučių vėžys. Šių tyrimų metu nustatyta, jog peroralinis baikalinės kalpokės šaknų ekstrakto vartojimas indukuoja hematopoezę, suaktyvina kaulų čiulpų, eritro ir granulocitopoezę, rodo limfocitų daugėjimo tendenciją, gerina imunoreguliacijos rezultatus, normalizuoja G baltymo lygį organizme [44].

Literatūroje aprašomi tyrimai su baikalinės kalpokės kaupiamais veikliaisiais junginiais pagrindžia, jos vartojimą tradicinėje medicinoje.

Baikalinės kalpokės preparatams patekus į vakarų rinką, daugėja pranešimų apie indukuotą hepatotoksiškumą, kai maisto papildai, kurių sudėtyje yra baikalinės kalpokės ekstrakto vartojant per

os. Tačiau dėl augalo pavadinimų ir sinonimų įvairovės, skirtingos kalpokių rūšys dažnai maišomos

literatūroje ir vadinamos tuo pačiu pavadinimu ir tampa sudėtinga atskirti, kurios rūšies kalpokės ekstraktas sukėlė nepageidaujamą poveikį. Juolab, pasak Yang su kolegomis (2012), pranešimai gaunami apie maisto papildus, kuriuose baikalinė kalpokė yra sudėtyje kartu su kitais preparatais (tanidinė akacija, gliukozaminas, chondroitinas, amalas, sukatžolė, laminarijos ar kt.) [21]. Pasaulinės sveikatos organizacijos monografijoje, taip pat aprašytos retos gastrointestinalinės reakcijos, pasižyminčios diskomfortu ir diarėja [44]. Galimi šalutiniai poveikiai vartojant per os sukelia daug klausimų, kurių galbūt nekiltų jei augalo ekstraktas būtų vartojamas kitais būdais.

Išoriniam baikalinės kalpokės panaudojimui svarbūs: antimikrobinis, antioksidacinis, UVB radiaciją mažinantis, priešuždegiminis ir priešalerginis poveikiai. Nustatytas, baikalinės kalpokės antimikrobinis aktyvumas prieš Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus, Bacillus

megaterium [11]. N. A. Kang su kolegomis (2011) nustatė, jog baikalinas suriša reaktyvias deguonies

formas ir inhibuoja H2O2 indukuojamą ląstelių apoptozę [24]. Tyrimu in vivo naudojant Balb/C peles,

nustatytas jo apsauginis poveikis nuo UVB spinduliuotės sukeliamų pažaidų [4,48]. Zhou su kolegomis (2011), ištirtas apsauginis baikalino poveikis imortalizuotoms keratinocitų HaCaT ląstelėms indukavus UVB – odos pažaidas ir nustatyti numanomi veikimo mechanizmai. Jis inhibavo UVB – indukuotą citotoksiškumą, apoptozę ir ciklobutano pirimidino dimerus (CPD), sumažindamas reguliacinių baltymų, kurie atsakingi už lastelių ir DNR pažaidų/atstatymo mechanizmus, ekspresiją. Baikaleinio savybę apsaugoti žmogaus tinklainės pigmentines epitelio ląsteles nuo oksidacinio streso indukuotos ląstelių mirties yra pastebėję ir keli tyrėjai (A. Hanneken et al. (2006); J. Liu et al. (2010)) [15,28]. Pietų Korėjos mokslininkų 2012 metais atliktais tyrimais su Sprague – Dawlei žiurkėmis ir žmogaus putliųjų ląstelių linijomis (HMC) nustatyta, jog baikalinės kalpokės ekstraktas inhibuoja pasyviąją anafilaksinę reakcija ir sumažina histamino išskyrimą, atkuria IL-8 ir TNF-α ekspresiją bei inhibuoja MAP kinazę. Šie tyrimai rodo, jog per paminėtų įvairių prekursorių ekspresijos sumažinimą, baikalinės kalpokės ekstraktas gali būti naudinga priešuždegiminį poveikį turinti medžiaga [23]. Chi su kolegimis (2003) su pelėmis atliktas priešuždegiminio vogonino aktyvumo tyrimas parodė, jog vietiškai vartojamas vogoninas tik didelėmis dozėmis nedaug padidina COX–1 ir fibronektino mRNR lygius, tačiau ir mažesnėmis dozėmis mažina COX–2 mRNR ir TNF–α lygius. Pastebėtas žymus prostaglandino E2 koncentracijos sumažėjimas vogoninu paveiktoje grupėse lyginant su nepaveikta. Panašūs efektai nustatyti ir ūmiam uždegimui indukavus ausies edemą arachidonine rūgštimi. Todėl,

kaip teigia tyrėjai (Y. S. Chi et al. (2003)), vogoninas reguliuodamas uždegimo mediatorius reguliuojančių genų ekspresiją gali būti naudojamas odos uždegiminiams procesams gydyti [9].

Ypatingai aktualūs tyrimai nustatant baikalinės kalpokės veikliųjų junginių aktyvumą prieš odos vėžį. W. Min su kolegomis (2008) ištyrė apsauginį baikalino poveikį imortalizuotoms keratinocitų HaCaT ląstelėms indukavus UVB odos pažaidas. Šio tyrimo metu nustatyti numanomi veikimo mechanizmai – baikalinas inhibavo UVB indukuotą citotoksiškumą, apoptozę ir ciklobutano pirimidino dimerus (CPD), sumažindamas reguliacinių baltymų, kurie atsakingi už lastelių ir DNR pažaidų/atstatymo mechanizmus, ekspresiją [32]. W. Hsu (2011) nustatė baikaleino poveikio melanomos ląstelių linijoms mechanizmus – baikaleinas sukelia superoksidų radikalų ir hidroksilo radikalų formavimąsi lipoksigenazių keliu bei slopina melanomos ląstelių gyvybingumą sukeldamas jų apoptozę [17]. Pasak kitų Kinijos mokslininkų, net ir mažesnėmis nei apoptozę sukeliančiomis koncentracijomis baikaleinas sumažina A431 odos karcinomos ląstelių invazyvumą ir migraciją inhibuodamas ezrino ekspresiją, kas sumažina ir auglių metastazes [46]. Šie tyrimai rodo baikalinės kalpokės ekstrakto veikliųjų junginių potencialą veikti prieš vieną iš dažniausiai nustatomų vėžio formų – odos vėžį.

Baikalinės kalpokės ekstraktas gali būti pritaikomas pusiau kietų preparatų, skirtų vartoti ant odos gamyboje, dėl savo antioksidacinio, UVB – apsauginio, antimikrobinio, priešuždegiminio, priešalerginio ir priešvėžinio poveikio.

4.2. Flavonoidų analizės metodai

4.2.1. Flavonoidų struktūros ypatumai

Flavonoidai yra didžiausia natūraliai aptinkamų fenolių grupė. Remiantis skirtingais šaltiniais, jų priskaičiuojama nuo 3000 iki 6500, tačiau šis skaičius nuolat didėja [37]. Jie plačiai paplitę gamtoje, tačiau dažniau aptinkami aukštesniuosiuose augaluose ir jų jaunuose audiniuose. Ląstelėse kaupiami vakuolėse – ląstelių sultyse ir kartu su chlorofilu bei karotenoidais yra tarp trijų dažniausiai aptinkamų pigmentų augaluose. Flavonoidai dažnai vartojami kaip chemotaksonominiai žymenys ir plačiai aptinkami Polygonaceae, Rutaceae, Leguminosae, Umbelliferae ir Compositae šeimose.

Cheminiu požiūriu flavonoidai gali būti nagrinėjami ir skirstomi įvairiai. Pasak C. W. Evans (2009), jie dažnai nagrinėjami kaip fenoliniai junginiai, kurių gamtoje aptinkama daugiau nei 8000 ir yra apibrėžiami kaip junginiai turintys aromatinį žiedą, kurie turi bent vieną hidroksi grupės pakaitą. O analizuojant pagal numanomus biosintezės mechanizmus – flavonoidai yra junginiai, esantys visuose augaluose, sudaryti iš aromatinių amino rūgščių – fenilalanino, tirozino ir malonato. Jų pagrindą

(C6–C3–C6), kurie žymimi raidėmis A, B ir C ir jų struktūra varijuoja priklausomai nuo hidroksilinimo, metoksilinimo, prenilinimo ir glikozilinimo laipsnio. E. Rijke su kolegomis (2006) teigia, jog flavonoidai dažniausiai būna hidroksilinti 3, 5, 7, 3´, 4´ ar 5´ pozicijose, o viena iš hidroksilo grupių būna metilinta, acetilinta, prenilinta ar sulfatuota, o tai nulemia flavonoidų tirpumą skirtinguose tirpikliuose.

Gamtoje flavonoidai aptinkami ir laisvi ir kaip glikozidai, kas lemia jų tirpumą vandenyje. Flavonoidų glikoziduose dažniausiai pasitaikantys cukrūs (angliavandeniai) – ramnozė, gliukozė, galaktozė ir arabinozė. Dauguma yra O-glikozidai, bet yra žinoma ir C-glikozidų. Flavonoidai, prie kurių prijungti disacharidai, vadinami diglikozidais, ir yra dažnai aptinkami gamtoje. Du labai dažnai pasitaikantys disacharidai susideda iš gliukozės ir ramnozės. 1→6 jungtimi sujungta – neohesperidozė ir 1→2 jungtimi sujungta – rutinozė. Cukrūs dažnai turi acilo grupių pakaitų, tokių kaip malonatas ir acetatas [11]. Prijungtų prie flavonoido aglikono cukrų kiekis, tiesiogiai įtakoja tirpumą vandenyje. Kuo didesnė glikozidinė grandinėlė, tuo flavonoido glikozidas geriau tirpsta vandenyje.

Flavonoidų glikozidai dažniausiai tirpūs vandenyje ir alkoholyje, bet netirpūs organiniuose tirpikliuose. Flavonoidų aglikonai silpnai tirpūs vandenyje, bet tirpūs eteryje. Flavonoidai ištirpsta šarmuose, sudarydami geltonus tirpalus, kurie pridėjus rūgšties išblanksta ir tampa bespalviais [11,37]. Remiantis flavonoidų struktūros ir tirpumo skirtinguose tirpikliuose ypatumais pasirenkami flavonoidų analizės metodai.

4.2.2. Tiriamųjų flavonoidų mėginių paruošimas analizei

Tiriamojo mėginio paruošimas, bet kurioje analizėje sudaro pirmą ir vieną svarbiausių analizės etapų. Yra parengta daugybė metodikų mėginių paruošimui, tačiau visi gali būti suskirstyti pagal tai iš kokios terpės junginys, šiuo atveju flavonoidai, yra paimamas. Pagrindinės trys terpės iš kurių siekiama išskirti ir ištirti flavonoidus yra patys augalai, maisto produktai ir skysti mėginiai, tarp kurių gali būti ir biologiniai skysčiai [40].

Ruošiant mėginius siekiama, kad mėginio paruošimo procedūra susidarytų iš kuo mažiau etapų. Dažniausiai taikoma dviejų etapų procedūra ir siekiama pasitelkti kuo optimalesnį mėginio paruošimo metodą, nes kiekvienas analitės paruošimo žingsnis padidina galimų klaidų riziką. Taip pat sumažėja metodo atkartojamumas. Naudojamos mėginio paruošimo technikos priklauso nuo pirminio analizuojamo mėginio formos. Kietos formos mėginiams taikomas malimas, grūdimas ir homogenizacija prieš tai išdžiovinus oru ar šaldant. Skysti mėginiai iš pradžių filtruojami, o paskui centrifūguojami. Siekiama, kad mėginį būtų galima injekuoti į analizės aparatūrą be papildomo paruošimo ar tiesiai po filtracijos. Pasak D.C.Stalikas (2007), flavonoidų analizėje pasirenkant mėginio

paruošimo techniką, siekiama numatyti galimus tiriamų junginių pokyčius, ir pasirinkti metodus, kurių metu tiriamųjų junginių dekompozicija ir nuostoliai bus mažiausi.

Svarbu numatyti ar kartu bus analizuojamos visos flavonoidų konjuguotos bei glikozidintos formos ir aglikonai ar tik aglikonai. Biologiniuose skysčiuose flavonoidai egzistuoja kaip glukuronidai ir sulfatuoti konjugatai, todėl gali būti taikoma hidrolizės procedūra siekiant nustatyti grynus aglikonus (C. W. Evans (2009)). Dažniausiai tam naudojami fermentai – β-glukuronidazė ir sulfatazė. Kitais atvejais – tiriant augalus ar maisto produktus, dažniausiai siekiama nustatyti visus junginius nepaliestus, todėl hidrolizės žingsnis praleidžiamas. Tačiau jei reikalinga atlikti hidrolizę iš augalinių ar maisto produktų gautiems flavonoidams, dažniausiai pasirenkamas 1-2 N šarmas (pvz. natrio šarmas) ar neorganinė rūgštis (pvz. druskos rūgštis), kartu su arba be organinio tirpiklio (pvz. metanolio). Atliekant bet kurią hidrolizę turi būti pasirinktas optimalus metodas, kad būtų nustatomas didžiausias įmanomas aglikonų kiekis [37].

Po pirmųjų paruošimo žingsnių, siekiant išskirti flavonoidus iš mėginio vykdoma ekstrakcija. Jos metu tiriamieji flavonoidai išgryninami ir gali būti atskirti nuo nereikalingų analizei – balastinių junginių prieš atliekant analizę. Iki šiol populiariausi ir dažniausiai vartojami ekstrakcijos metodai yra ekstrakcija panaudojant tirpiklį (skystis – skystis ir kieta fazė – skystis) ir kietafazė ekstrakcija, taip pat taikoma Soksleto ekstrakcija, superkritinių skysčių ekstrakcija ir kiti rečiau pasitaikantys metodai kaip ekstrakcija padedant mikrobangoms ar naudojant ultragarsą [40].

G. Liu su kolegomis (2009) baikalinės kalpokės šaknies veikliųjų junginių ekstrakcijai panaudojo preparatyvinę chromatografija. Šaknis buvo susmulkinta iki miltelių, užpilama 2 L 60 % acetonitrilo ir naudojant grįžtamąjį šaldytuvą šildoma 80oC temperatūroje 2 kartus po 2 valandas, kaskart užpilant naują acetonitrilo porciją. Po filtravimo, atliktas fazių atskyrimas naudojant dichlormetaną (600 ml). Atskirta organinė dalis buvo chromatografuota silikagelio kolonėle ir paskui preparatyvine efektyviąja skysčiu chromatografija. Šiuo metodu išskirstyta 11 aglikonų: tenaksinas I, oroksilinas A, kalpokės flavonas II, 5,7-dihidroksi-6,8-dimetoksi flavonas, vogoninas, kalpokės flavonas I, baikaleinas, norvogoninas, 5,7,2‘,5‘-tetrahidroksi-8,6‘-dimetoksi flavonas, 5,7,3,2‘,6‘-pentahidroksi flavonas ir 5,7,3,2‘,6‘-5,7,3,2‘,6‘-pentahidroksi flavanonas [30].

Vis plačiau taikoma superkritinių skysčių ekstrakcija, kurios metu gaunami itin gryni ekstraktai, kuriuose neaptinkama dėl šilumos ar deguonies poveikio atsirandančių flavonoidų degradacijos produktų. Taikant superkritinių skysčių ekstrakciją išvengiama tokių balastinių nepolinių junginių kaip chlorofilas, kurie netirpsta superkritiniame anglies dvideginyje. Pasak M.C.Lin su kolegomis (1999), superkritinį skystį modifikuojant organiniais modifikatoriais ir kontroliuojant slėgį dažnai pasiekiamas geresnis ekstrakcijos rezultatas nei kitais būdais. Kadangi šis metodas naudoja mažus tirpiklio kiekius, o ekstrakcija vyksta greitai ir mėginio sąlytis su tirpikliu yra palyginti trumpas, superkritinių skysčių ekstrakcija taikoma vis plačiau ne tik analizėje, bet ir pramonėje [11, 40].

Superkritinių skysčių ekstrakciją baikalinės kalpokės šaknų veikliesiems junginiams išskirti pritaikė Didžiosios Britanijos mokslininkai. Rezultatai buvo geresni nei vykdant ultragarsinę ekstrakciją. Šie mokslininkai, kaip optimalias superkritinių skysčių ekstrakcijos sąlygas baikalinės kalpokės šaknims ekstrahuoti pasirinko: ekstrahentą – superkritinį anglies dioksidą sumaišytą su metanoliu ir vandeniu, santykiu 20 : 2,1 : 0,9, sudarant 200 bar slėgį, 50oC temperatūroje [27].

Planuojant tyrimus, kurių metu siekiama nustatyti vaisto formos įtaką baikalinės kalpokės ekstrakto veikliųjų junginių atpalaidavimui, svarbus mėginio paruošimo etapas. Kadangi naudojamas susas ekstraktas, reikalinga pasirinkti tinkamą tirpiklį jo veikliesiems junginiams ištirpinti, taip pat pagal veikliųjų junginių tirpumą numatyti akceptorinės terpės pasirinkimą vykdant atpalaidavimo iš vaistų formų tyrimą in vitro. Ši terpė turi būti tokia, kad iš jos paimto mėginio paruošimas būtų nesudėtingas, o rezultatai atlikus mėginio analizę – atkartojami.

4.2.3. Flavonoidų skirstymas ir nustatymas

Pagrindinis metodas flavonoidų skirstyme ir nustatyme yra efektyvioji skysčių chromatografija (ESC) (E. Rijke et al. (2006)). Rečiau taikomi metodai – dujų chromatografijos, plonasluoksnės chromatografijos ir kapiliarinės elektroforezės. Galima išskirti ir naujesnius apjungtus analizės metodus, kurie vis plačiau pritaikomi flavonoidų analizei – tai tandeminė masių spektrometrija ir branduolių magnetinis rezonansas, kurie dažniausiai taikomi kartu su skysčių chromatografija bei UV spektrofotometriniais metodais [37].

Analitinių metodų įvairovė, leidžia pasirinkti optimaliausią metodą baikalinės kalpokės ekstrakto veikliųjų junginių analizei, pagal numatomus tyrimus ir turimus išteklius.

4.2.4. Efektyvioji skysčių chromatografija

Daugiau nei 20 metų ESC yra dominuojantis fenolinių junginių atskyrimo ir charakterizavimo metodas. Panaudojant ESC, galima išskirstyti visus analizuojamus junginius, kartu su galimais jų derivatais ar degradacijos produktais. Nustatymas gali būti vykdomas, net kai analičių koncentracijos yra mažos, o kartu jose yra ir kitų maišančių ir koeliucinių junginių. C. D. Stalikas (2007) teigia, jog tai patogūs metodai fenolinių junginių nustatymui augalų ir biologinės kilmės matricose, nes rinkoje yra didelė komercinės gamybos kolonėlių įvairovė, kurias galima naudoti pavienes arba sujungiant dvi ar daugiau [40].

ESC kolonėlės. Flavonoidų skirstymas ir nustatymas dažniausiai vykdomas naudojant

atvirkštinių fazių chromatografiją. Tam taikomos kolonėlės kuriose sorbentas yra silicio oksidas, prie kurio prijungtos C8 arba C18 grandinėlės. Dažniausiai pasitaikančios metodikos – kuriose naudojamos

atvirkštinių fazių C18 kolonėlės, kurių ilgis 100 – 250 mm, o vidinis diametras 3,9 – 4,6 mm. Dalelių dydžiai varijuoja nuo 3 iki 10 µm. Rečiau taikomos silicio oksido pagrindo chemiškai sujungtos fazės, ne silicio oksido polimerai ar mišrios neorganinės – organines fazės [37].

Daugumai fenolinių junginių analizių naudojama kambario – aplinkos temperatūra. Tačiau siekiant sutrumpinti analizės laiką taikomas ir kolonėlės termostatavimas aukštesnėse temperatūrose (pvz. 30 – 40oC), o norint gauti geresnius junginių sulaikymo laikus, termostatuojama žemesnėse temperatūrose (pvz. 10o

C). Taip pat termostatavimas pagerina rezultatų atkuriamumą.

Nuolat siekiama pagerinti flavonoidų skirstymo rodiklius. E. Rijke (2007) aprašo, jog didesniu skirstymo efektyvumu pasižymi dviejų dimensijų chromatografija. Atliekant analizę šiuo metodu naudojamos sujungtos skirtingos kolonėlės (pvz. PEG ir C18 monolitinę kolonėlę). Tinkamai parinkus skirtingas kolonėles pagerinama junginių atskyrimo raiška, lyginant su analize atliekama panaudojant vieną kolonėlę. Tačiau atsiradus ultra efektyviajai skysčių chromatografijai ir pritaikius kolonėlės, kuriose sorbento dalelių dydis mažesnis nei 2,5 µm, pasiekiama dar geresnio junginių išskirstymo. Taip pat dėl padidėjusio slėgio, ryškiai sumažėja analizės laikas [37, 40].

Pasirinkus tinkamą kolonėlę ir jos termostatavimo sąlygas, galima optimaliai išskirstyti ir nustatyti tiriamus baikalinės kalpokės ekstrakto junginius.

Naudojamos mobilios fazės. Flavonoidų analizei naudojant ESC, gali būti taikoma ir

izokratinė, ir gradientinė eliucija. Pasirinkimas priklauso nuo analitės ir kiek junginių norima atskirti. Dažniausi eliuentai – metanolis ir acetonitrilas, kurie naudojami kaip organinė fazė. Metanolis pasirenkamas dėl mažesnio toksiškumo ir galimybės naudoti didesnes jo koncentracijas, nepažeidžiant kolonėlės. Tuo tarpu acetonitrilas padeda išgauti ryškesnius pikus. Kartais naudojami kiti eliuentai, kurie yra mažiau poliški, tačiau turintys stiprią eliucijos galią – tokie kaip tetrahidrofuranas ir 2 – propanolis [37]. Kaip neorganinė fazė dažnai pasirenkamos mažos koncentracijos acto, fosforo, skruzdžių ir kartais perchloratinė rūgštys, sudarant pH=2–4 ir siekiant sumažinti pikų „uodegas“. Tačiau vietoje rūgščių siūloma naudoti 5 iki 50 mM koncentracijos fosfato, citrato ir amonio acetato buferius [40].

H.B.Li su kolegomis (2004) nustatė, jog baikalinės kalpokės šaknų veikliesiems junginiams analizuoti dažniausiai taikomos mobilios fazės sudaromos iš rūgštinio buferio (fosforo ar acto rūgšties) ir organinio tirpiklio (dažniausiai metanolio arba acetonitrilo) kombinacijos [25]. Vystant ESC metodiką baikalinės kalpokės šankų ekstrakto analizei, mobilios fazės ir gradiento parinkimas yra vienas svarbiausių metodo vystymo etapų.

Detektoriai. Flavonoidų nustatymui dažniausiai naudojami ultravioletinės – regimosios šviesos

(UV/vis), diodų matricos (DAD) ir UV – fluorescensijos detektoriai. Taip pat gali būti naudojami elektrocheminiai detektoriai bei cheminiai analizės metodai. Pastarieji šiuo metu naudojami vis rečiau,

o prie UV absorbcijos detektorių dažniau taikomi masių spektrometrijos ir branduolių magnetinio rezonanso metodai [37].

Dėl savo struktūros ypatybių flavonoidai gerai absorbuoja UV spindulius. Dauguma jų turi absorbcijos maksimumus ties 240 – 285 nm ir 300 – 350 nm, tačiau naudojant UV – diodų matricos detektorius, galima skenuoti visą spektrą, kas padeda analizuoti sudėtingesnius mišinius, siekiant atskirti veikliuosius junginius. Šie detektoriai suteikia daugiau informacijos apie analičių grynumą taip pat apie polifenolinius junginius. UV – fluorscenciniai detektoriai naudojami žymiai rečiau, tačiau gali būti taikomi siekiant atskirti analičių junginius, kai žinoma kurie iš jų gali fluorescuoti, o kurie ne [40]. Kadangi flavonoidai pasižymi antioksidacinėmis savybėmis, jie gali būti nustatomi ir elektrocheminiais detektoriais, kurie yra palyginti jautrūs turintiems oksidacinių – redukcinių savybių. Tokie detektoriai plačiau taikomi rutininėms fenolinių rūgščių analizėms maiste ir žmogaus plazmoje.

Siekiant tiksliai nustatyti flavonoidų struktūrą, naudojami masių spektrometrijos ir branduolių magnetinio rezonanso detektoriai. Šiuos detektorius sujungus su UV/vis ar UV – diodų matricos detektoriais, galima tiksliai nustatyti daugumą flavonoidų, išskirtų iš augalų, maisto produktų ir įvairių biologinių terpių [40].

Žinant tiriamųjų flavonoidų struktūrą, baikalinės kalpokės ekstrakto veikliųjų junginių detekcijai pakanka pasirinkti plačiai vartojamus UV detektorius, kurių naudojimas plačiai aprašytas literatūroje, taip pat yra duomenų apie numatomų tirti veikliųjų junginių UV spektrus.

4.2.5. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodų taikymas baikalinės

kalpokės veikliųjų junginių tyrimams

Baikalinės kalpokės flavonoidų nustatymui įvairiuose mėginiuose ir terpėse, dažniausiai naudojami ESC – UV metodai. Tačiau apžvelgdamas taikomus metodus baikalinės kalpokės metodų skirstymui H.B.Li su kolegomis (2004) pabrėžia ESC – masių spektrometrijos metodų (ESC – MS) pranašumą, dėl didesnio nei ESC – UV metodų jautrumo ir geresnio atrankumo junginiams. Tačiau sujungus abu metodus kartu baikalinės kalpokės šaknų veikliuosius junginius įvairiose, net ir pakankamai sudėtingose matricose, tampa dar lengviau [25]. Literatūroje plačiai aprašomi metodai naudojant ir ESC – UV ir ESC – masių spektroskopijos metodikas baikalinės kalpokės šaknų flavonoidams analizuoti.

J. Gao su kolegomis (2008) naudodami ESC – UV įrangą sudarytą iš HP1050 chromatografo (kolonėlė Luna C18, 5 μm (150 x 4,6 mm, Phenomenex)) su kintamo bangų ilgio UV detektoriumi nustatytu ties 270 nm banga ir automatiniu mėginio paėmimo aparatu, kambario temperatūroje, sukūrė metodiką baikalinui, baikaleinui ir vogoninui analizuoti. Naudota gradientinė eliucija, kai eliuentai: 0,1% skruzdžių rūgštis (eliuentas A) ir metanolis (eliuentas B). Gradiento eliucijos sąlygos: nuo 45 %

B eliuento iki 60 % nuo 2 iki 10 min, toliau iki 30 min B eliuentas kinta iki 70 %, tada iki 31 min užkeliama B eliuento koncentracija iki 99 % ir laikoma minutę. Tada grįžtama į pradines sąlygas. Eliucijos greitis 1 mL/min. Šiuo metodu analizuojamos komercinės Scutellaria lateriflora ir

Scutellaria baicalensis tinktūros [13].

Tiriant Europoje augintos baikalinės kalpokės šaknis Čekijos mokslininkai pritaikė ESC aparatą sudarytą iš LCP 4000.1 siurblio, LCD 2040 UV detektoriaus (ECOM, Czech Republic) ir Rheodyne 7125 švirkštinio mėginių injektoriaus (Cotati, CA USA), mėginio kilpos talpa 50µL. Atskyrimas atliktas atvirkštinių fazių kolonėle (Separon SGX C18, 5µm, 150 ×3 mm I.D, Tessek Prague, Czech Republic). Mobilioji fazė buvo sudaryta iš dviejų komponentų S1 ir S2, kurie pagaminti iš pradinio tirpalo pagaminto iš distiliuoto vandens su trietilaminu (0,1 mol/L) ir fosforo rūgštimi pakoreguotu pH iki 2,5. Tirpiklyje S1 sudaryta 20 % acetonitrilo koncentracija, o S2 60 % acetonitrilo koncentracija. Eliucijos profilis: 0 – 1 min 30 %S1, 1 – 15 min linijiniu gradiento kitimu 30 – 100 % S2. UV detekcija: λ = 270 nm, eliuentų tekėjimo greitis 0.5 mL/min. Šiuo metodu jie atskyrė ir kiekybiškai nustatė baikaliną, baikaleiną, oroksiliną, vogonino gliukuronidą ir vogoniną [8].

Siekiant įvertinti ir nustatyti baikalinės kalpokės preparatų parduodamų Jungtinėje karalystėje kokybę ir kiekybę buvo atliktas tyrimas, kuriuo ištirtos galimybės panaudoti ESC – diodų matricos detektoriaus ir ESC – MS metodikas. Analizei pasirinkti baikalinės kalpokės kaupiami flavonoidai: baikalinas, skutelareinas, baikaleinas, vogoninas ir chrizinas. Abiem būdais, pavyko tiksliai atskirti ir įvertinti pagamintus preparatus.

ESC analizę mokslininkai (S. P. Boyle et al. (2011)) atliko su Shimadzu SPD-M20A Prominence keturių dalių ESC sistema su automatine mėginių paėmimo sistema SIL-20AC Prominence auto-sampler, Prominence CTO-20AC kolonėlės termostatu, vakuuminiu degazeriu, sujungtu su Shimadzu SPD-20A Prominence diodų matricos detektoriumi. Kolonėlė Zorbax SB C18 (5µM) (150×4.6 mm v.d.) termostatuojama 30o_{C temperatūroje. Gradientinė analizė atlikta naudojant}

(A) 0.1% skruzdžių rūgštį vandenyje ir (B) metanolį. Eliuento tekėjimo greitis 1 ml/min, o pilnas analizės laikas 45 min. Pradžioje taikoma trumpa izokratinė fazė (10 % B) toliau seka linijinis gradientinis kitimas iki 40 % B per 30 min. Po jo vykdomas kolonėlės plovimas ir reekvilibracija į pradines sąlygas. Detekcija vykdoma 278 nm bangos ilgyje ir kartu 200–450 nm bangų diapazone kas 2 nm. Šiuo metodu kiekybiškai ir kiekybiškai įvertinti baikalinas, skutelareinas, baikaleinas, vogoninas ir chrizinas.

ESC – MS analizei pasirinkta Agilent 1100/1200 serijos sistema su automatine mėginių paėmimo sistema, diodų matricos detektoriumi ir 6130 MS kvadrupolių detektoriumi su API-ES sąsaja. Gradientinė analizė atlikta naudojant (A) 0.1% skruzdžių rūgštį vandenyje ir (B) metanolį. Eliuento tekėjimo greitis 1 ml/min, o pilnas analizės laikas 45 min. Pradžioje taikoma trumpa izokratinė fazė (10 % B) toliau seka linijinis gradientinis kitimas iki 40 % B per 30 min. Po jo

vykdomas kolonėlės plovimas ir reekvilibracija į pradines sąlygas. Detekcija vykdoma 278 nm bangos ilgyje ir kartu 200–450 nm bangų diapazone kas 2 nm. MS purkštuvinė kamera nustatyta dujų temperatūra 350 o_{C, džiovinimo dujų purškimas 13 L/min, purkštuvo slėgis 60 psig, kvadrupolio}

temperatūra 300 o_{C o VCap įtampa 3000 V teigiamam ir neigiamam jonizacijos režimui. Atmosferos}

slėgio jonizacija buvo atlikta su 70 V fragmentatoriaus įtampa, atliktas teigiamas ir neigiamas skanavimas 60–500 amu masės diapazone. Šiuo metodu tiksliau nei ESC – UV nustatyti tirti junginiai (baikalinas, skutelareinas, baikaleinas, vogoninas ir chrizinas) ir įvertintas jų kiekis [6].

Sukurta daug metodikų greitam baikalinės kalpokės junginių nustatymui, kurio metu nustatomi keli pagrindiniai veiklieji junginiai įvairiose terpėse. Kinijos mokslininkai per vieną analizę nustatė

keturis baikalinės kalpokės veiklieji junginiai (baikalinas, baikaleinas, vogoninas ir vogonino 7-O-glukuronidas) augaliniuose preparatuose naudojant ESC metodiką su YMC-Pack ODS A-132

kolonėle (15 cm × 6 mm v.d.) su metanoliu ir 0,1 M fosfato buferiu kaip mobiliąja faze (santykiu 1:1 baikalinui ir vogoninui, ir santykiu 17:8 baikalinui ir vogonino 7-O-glukuronidui), kai detekcija vykdoma 270 nm bangos ilgyje.

Kiti kinų mokslininkai išvystė metodiką, pagal kurią išskirstyti 6 pagrindiniai baikalinės kalpokės šaknų veiklieji junginiai – baikaleinas, baikalinas, vogoninas, vogonino glukuronidas, oroksilinas A ir oroksilino A glukuronidas. Skirstymui ir nustatymui buvo naudojama jonų mainų ESC sudaryta iš nerūdijančio plieno kolonėlės (15 cm×4 mm v.d.) užpildytos TSK geliu LS-410 (5µm), mobili fazė – vandeninis 32% acetonitrilą, kuriame yra 5 mM tetrapentilamonio bromido, o pH= 4, kuris palaikomas fosforo rūgštimi [25].

Japonų mokslininkai atliko baikalinės kalpokės šaknų analizę, kai buvo naudojama ESC kolonėlė (20 cm×6 mm) Develosil ODS-5, 50 o_{C detekcija 274 nm bangos ilgyje, mobili fazė:}

tetrahidrofuranas – dioksanas – metanolis – acto rūgštis–5% fosforo rūgštis – vanduo (145:125:50:20:2:322) ir tetrahidrofuranas – acto rūgštis – 5% fosforo rūgštis – vanduo (95:10:1:444). Sujungus 2 mobilias fazes per dvi analizes atskirta 11 flavonoidų [25].

Vienas plačiausių tyrimų siekiant nustatyti baikalinės kalpokės šaknyse kaupiamus flavonoidus atliktas G. Liu su kolegomis (2011). Tyrimo metu HPLC - UV/MS metodu buvo tiksliai nustatyti 32 flavonoidai, kuriuos kaupia baikalinė kalpokė. Tirtas ekstraktas, pagamintas iš smulkintų šaknų ekstrahuojant 60 % etanoliu ir ultragarsu. Tyrėjai chromatografiją atliko naudojant skysčių chromatografą su UV diodų matricos detektoriumi, sujungtu su masių spektrometriniu skysčių chromatografijos kvadrupoliniu jonų gaudyklės detektoriumi, panaudojant elektropurkštuvinę jonizaciją [30]. Toliau tęsdami tyrimus ir analizuodami Scutellaria baicalensis antžeminėje dalyje ir šaknyse kaupiamus flavonoidus tie patys mokslininkai naudodami HPLC-UV/MS bei branduolių magnetinį rezonansą aptiko dar vieną baikalinės kalpokės flavoną: 5,6,7,3‘,4‘-pentahidroksi flavanoną, [29].

Nors atliekama daug tyrimu su baikalinės kalpokės šaknimis ir ekstraktais, tačiau vis dar nėra pilnai nustatyti visi jos kaupiami veiklieji junginiai. Skirtinguose regionuose augančių baikalinių kalpokių kokybinei ir kiekybinei sudėčiai analizuoti ir nežinomų flavonoidų nustatymui taikomi ESC metodai, kurie jungiami su keletu detektorių. Tačiau analizuojant pagrindinius baikalinės kalpokės ekstrakto komponentus, galima rasti daug metodikų, kurios gali padėti sukurti efektyvią metodiką pritaikant turimą ESC techninę įrangą.

4.2.6. Spektrofotometrinių metodų pritaikymas flavonoidų kiekybinei

analizei

Nustatant suminius flavonoidų kiekius spektrofotometriniais metodais siekiama atrasti kuo specifiškesnį metodą. Flavonoidų analizei dažnai taikomi bendrieji fenolinių junginių nustatymo metodai po reakcijos su bendriniu reagentu, tokiu kaip Folin Denis, Folin Ciocalteau. Bendram flavonoidų kiekiui nustatyti vis dar taikoma reakcija su aliuminio trichloridu sudarant kompleksus. Šių metodų esmė – sukelti antrinį batochrominį poslinkį, kuris yra bendras fenoliniams junginiams ar flavonoidams. Šie metodai dažnai taikomi ir pirminei baikalinės kalpokės šaknų ekstrakto analizei. Tačiau minėti metodai nėra specifiški ir taikomi vis rečiau, o juos pakeičia kur kas atrankesni ir tikslesni ESC metodai.

Palyginamajame baikalinės kalpokės preparatų analizės tyrime Didžiojoje Britanijoje UV spektrofotometru (Shimadzu UV-160A) ištirti baikalinės kalpokės augalinių preparatų veiklieji junginiai: baikalinas, skutelareinas, baikaleinas, vogoninas ir chrizinas. Rezultatų tikslumas nusileido ESC – UV ir ESC – UV/MS metodų tikslumui [6].

Spektrofotometriniai metodai gali būti panaudoti pirminiams ekstraktų tyrimams ar rutininei analizei, kurioje nereikalingas didelis tikslumas. Todėl ir tiriamajame darbe numatyta atliekant pirminį ekstrakto kokybės vertinimą, nustatyti bendrą fenolinių junginių ir flavonoidų kiekį spektrofotometriniais metodais.

4.3. Puskiečių vaisto formų kategorijos ir jų technologijos

Puskiečius preparatus skirtus vartoti ant odos sudaro pagrindas, kuris yra vientisas arba sudėtinis, jame ištirpinta ar disperguota viena ar daugiau veikliųjų medžiagų. Preparato efektyvumui yra svarbios pagrindo savybės, nuo kurių gali priklausyti veikliųjų junginių atsipalaidavimas iš vaisto formos.

Pagrindas gali būti sudarytas iš natūralių arba sintetinių medžiagų, kurių prigimtis lemia jo hidrofobines arba hidrofilines savybes. Pagal tai iš kiek fazių jis sudarytas pagrindas gali būti

vienafazis arba daugiafazis. Siekiant optimizuoti pusiau kietą vaisto formą į preparatus gali būti įterpta ir kitų – pagalbinių medžiagų, tokių kaip antimikrobinės medžiagos, antioksidantai, stabilizatoriai, emulsikliai, minkštikliai ir medžiagos pagerinančios prasiskverbimą [14].

Tepalai. Tai minkšta, klampios konsistencijos vaisto forma, skirta vartoti išoriškai – vietiniam

vartojimui – tepti odą, žaizdas, gleivines [7]. Kadangi jie sudaryti iš pagrindo, kuris gali būti paprastas arba sudėtinis, į kurį įterpta veiklioji medžiaga – tai sudėtinė vaisto forma. Į tepalo pagrindą gali būti įterpiamos viena ar kelios vaistinės medžiagos, taip pat siekiant patobulinti pačią vaisto formą, įterpiamos pagalbinės medžiagos. Tepalai, kaip vaisto forma, naudojami siekiant apsauginio ir minkštinančio efekto odai, ar siekiant užnešti medikamentus skirtus vietiniam ligų gydymui, dėl savo savybės suminkštėti ir lydytis odos temperatūroje. Gaminant tepalus siekiama, kad jie lengvai pasiskirstytų ir būtų vientisos konsistencijos [2, 12]. Tepalai skirstomi į [10]:

1. Hidrofobinius/lipofilinius tepalus. Pagal Europos farmakopėją, tai preparatai, kurie paprastai gali absorbuoti tik labai mažus vandens kiekius. Jų pagrindą paprastai sudaro vazelinas, parafinas, skystas parafinas, augaliniai aliejai, sintetiniai gliceridai, vaškai ir skysti polialkilsiloksanai.

2. Tepalus absorbuojančius vandenį (hidrofiliniai – lipofiliniai). Jie gali absorbuoti daugiau vandens. Visų bazės yra kaip hidrofobinių tepalų, tik į juos įterpti emulsikliai tokie kaip lanolinas, vilnos riebalų alkoholiai, sorbitano esteriai, riebiųjų rūgščių monogliceridai. 3. Hidrofilinius tepalus. Tai preparatai, kurių pagrindas maišosi su vandeniu. Tai yra skystų ir

kietų makrogolių mišiniai (polietilenglikoliai). Kartais jie savyje turi tam tikrą kiekį vandens.

4. Kada į tepalo sudėtį įeina sakai – jis vadinamas onguent.

Kremai. Kremai yra sudaryti iš lipofilinės ir vandeninės fazės [7]. Jie panašūs į tepalus, tačiau

yra ne tokie riebus, nes juos gaminant įterpiamas didesnis vandens kiekis. Terminas kremas dažniausiai taikomas švelniems, kosmetiškai priimtiniems preparatams. Dėl sudėtyje esančio didesnio vandens kiekio, kremai savo savybėmis, yra panašūs į emulsijas ir kartais vadinami puskietėmis emulsijomis Kremuose veikliosios medžiagos ištirpinamos ar suspenduojamos vandenyje tirpiuose ar išgaruojančio kremo pagrinduose ir gali būti laikomi vanduo/aliejuje arba aliejus/vandenyje tipo emulsijomis. Hidrofilinių kremų sudėtyje yra daug vandens išorinėje fazėje (pvz. išgaruojantis kremas), hidrofobiniuose kremuose vanduo yra vidinėje fazėje (koldkremas). Gamyboje naudojami emulsikliai siekiant disperguoti vandeninę fazę aliejinėje ar atvirkščiai. Kremai yra naudojami siekiant apsauginio, minkštinančio efekto odai. Taip pat siekiant užnešti veikliuosius junginius ant odos ar pernešti į gilesnius odos sluoksnius. Tai vaisto forma, kuri yra minkštesnė nei tepalai ir dažniau naudojama dėl gero pasiskirstymo absorbcijos srityje bei priimtinesnės vartotojui konsistencijos [7,14,16]. Kremai skirstomi į [45]:

1. Hidrofobinius kremus. Jų pagrindas – lipofilinis. Šiuose kremuose yra vanduo/aliejuje tipo emulsiklių, tokių kaip vilnos riebalai/lanolinas, sorbitano esteriai, monogliceridai.

2. Hidrofilinius kremus. Jų pagrindas – hidrofilinis. Šiuose kremuose yra aliejus/vandenyje tipo emulsikliai, tokie kaip natrio muilai arba trietanolaminas, riebalų alkoholių sulfatai, polisorbatai (kurie gali susijungti su vanduo/aliejuje tipo emulsikliais), rūgščių esteriai ir riebalų alkoholių polioksietilenai, sujungti su aliejus/vandenyje tipo emulsikliais.

Geliai. Tai puskietės sistemos susidedančios iš suspensijų, kurias sudaro smulkios neorganinės

dalelės arba didelės molekulinės masės organinės molekulės, tarp kurių įsiskverbęs skystis [7]. Kitaip tariant, juos sudaro skysčiai gelifikuoti atitinkamu gelifikuojančiu agentu. Jei gelio masė susideda iš mažų atskirų tinklo dalelių, gelis klasifikuojamas kaip dvifazė sistema. Dvifazėje sistemoje, jei dispersinės fazės dalelės yra didelės, produktas vadinamas magma. Vienfazius gelius sudaro didelės organinės molekulės ar makromolekulės, tolygiai pasiskirsčiusios su skysčiu tokiu būdu, kad nelieka pastebimų skysčio ir makromolekulių ribų. Vienfaziai geliai gali būti gaminami iš sintetinių makromolekulių arba natūralių lipų (augalinės gleivės). Skystoji fazė dažniausiai vandeninė, tačiau galima ir alkoholinė ar aliejinė [2,12]. Geliai skirstomi į [16]:

1. Lipofilinius gelius. Kitaip oleogelius, kurių pagrindai paruošiami iš skysto parafino aliejaus į kurį įterpta polietileno, arba riebiųjų aliejų gelifikuotų koloidiniu siliciu, aliuminio arba cinko muilais.

2. Hidrofilinius gelius arba hidrogelius. Tai preparatai, kurių pagrindas dažniausiai sudarytas iš vandens, glicerolio ir propilenglikolio, kurie gelifikuojami gelifikuojančiomis medžiagomis, tokioms kaip poloksamerai, krakmolas, celiuliozės derivatai, karbomerai arba magnio – aliuminio silikatai.

3. Glicerogelius – hidrogelius, pagamintus naudojant glicerolį, krakmolą ir vandenį. Šių medžiagų mišinys po atsargaus pašildymo suformuoja persišviečiančią masę.

Aptartos pusiau kietos vaisto formos yra plačiausiai naudojamos vaistų ir kosmetikos pramonėje. Ieškant vartotojui priimtinos ir efektyvios puskietės vaisto formos, baikalinės kalpokės ekstrakto įvedimui, pasirinktos trys formos: geliai dėl gero veikliųjų junginių pasiskirstymo pačioje vaisto formoje ir nesudėtingo veikliųjų medžiagų įvedimo būdo; kremai dėl gero pasiskirstymo absorbcijos srityje bei priimtinesnės vartotojui konsistencijos nei tepalų; gelifikuoti kremai, kaip nauja daugiafazė vaisto forma, apjungianti gelių ir kremų savybes.

4.4. Veikliųjų junginių atsipalaidavimo tyrimai iš puskiečių preparatų,

vartojamų ant odos

Pagrindinis vaisto efektyvumo parametras – jo veiksmingumas, nustatytas kontroliuojamais klinikiniais bandymais, tačiau atliekant pirmines vaistų ar jų formų paieškas, toks tyrimas yra neracionalus dėl didelių laiko ir finansinių sąnaudų [38]. Svarbu žinoti tikslų veikliojo junginio kiekį, kuris pasiekia taikinį. Tačiau susiduriama su sunkumais, siekiant nustatyti ir palyginti veikliųjų junginių atsipalaidavimą iš pusiau kietų formų. Vertinimą apsunkina tai, jog veiklieji junginiai pasižymi skirtingomis fizikinėmis ir cheminėmis savybėmis, taip pat sudėtinga numatyti odos fiziologinių savybių įtaką. Siekiant nustatyti tiriamojo preparato perspektyvumą arba palyginti skirtingas preparato gamybos serijas pasitelkiami atsipalaidavimo tyrimai in vitro. Nors šis tyrimas ir neatitinka rezultatų gaunamų in vivo, tačiau suteikia pakankamai fizikinių ir cheminių duomenų apie tiriamojo produkto savybių derinį – tarp jų tirpumo, dalelių dydžio ir reologinių formos savybių – pagal kuriuos galima numatyti galimas farmakokinetines savybes [19].

Vaistų veikliųjų junginių atpalaidavimo tyrimai in vitro yra rekomenduojami pagal JAV Maisto ir vaistų administracijos (FDA) SUPAC – SS (Scale-Up and post approval changes for non-sterile semisolid dosage forms including creams, oinments, gels and lotions) gaires, pakitus preparatų gamybos technikai, technologijai, modifikavus preparatą ar didinant gamybos serijas. Nuo 2009 metų puskiečių preparatų veikliųjų junginių atpalaidavimo tyrimas įtrauktas į JAV farmakopėją skirsniuose: <3>Topical and Transdermal Products—Product Quality Tests ir <725>Topical and Transdermal Products—Product Performance Tests. Taip pat šie tyrimai naudojami lyginant skirtingas gaminių serijas ir gali pakeisti bioekvivalentiškumo tyrimus atliekamus modifikuojamiems preparatams po registracijos vaistų registre ar sukurtiems generiniams preparatams [19,31,33,47].

In vitro atpalaidavimo tyrimai remiasi Higuči kinetikos, nulinio ir pirminio laipsnio kinetikos,

bei Fick‘o difuzijos dėsniais paremtais modeliais. Pagal A. Olejnik su kolegomis (2012) apžvalgą, difuzija gali vykti dviguboje difuzijos celėje, kurioje koncentruotas tirpalas atskirtas nuo akceptoriaus tirpalo pusiau pralaidžia membrana. Šio proceso metu medžiagos juda pagal koncentracijos gradientą iš didesnės koncentracijos (donorinės srities) į mažesnę (į akceptorinę sritį). Difuzijos per membraną koeficientas gali būti nustatytas kinetiniais metodais, kai patikrinamos donorinės ir akceptorinės srities koncentracijos [33].

Pagal pirmąjį Fick‘o dėsnį molekulių difuzija apibrėžiama kaip masės perkėlimas (dM/dt) ir išreiškiama kaip takumas (J). Takumas – tai masės perkėlimas per tam tikrą barjero paviršiaus plotą – šiuo atveju membranos (1 formulė).

Sdt

dM

1 formulė [33]

Kur dM – masės pokytis (g), S – barjero paviršiaus plotas (cm2), dt – laiko pokytis (s).

Yra tiesioginė koreliacija tarp takumo ir koncentracijos gradiento, kuri išreiškiama (2 formulė):

dx dC D J 

2 formulė [33]

Kur dC – tirpalo koncentracijos pokytis, D – tirpalo difuzijos koeficientas, dx – atstumo pokytis.

Pagal antrąjį Fick‘o dėsnį, koncentracijos pokytis pagal laiką yra apibrėžiamas erdviniame regione (x, y, z). Šis dėsnis teigia, kad koncentracijos pokytis atitinkamu laiko momentu ir atitinkamoje erdvės vietoje yra proporcingas koncentracijos gradiento pokyčiui tame laiko taške (3 formulė).                2₂ 2₂ 2₂ z C y C x C D at aC 3 formulė [33]

Kur x, y ir z specifinės koordinatės.

Pagal dažniausiai naudojamą in vitro atpalaidavimo tyrimų skaičiavimams Higuči modelį, atpalaiduotas veikliojo junginio kiekis kinta atitinkamu greičiu analizės metu ir priklauso nuo jo difuzijos. Pagrindinė Higuči lygties išraiška (4 formulė):

2 / 1 0 t t K M M  4 formulė [33]

Kur Mt – atpalaiduoto veikliojo junginio kiekis per laiką t, o M0 – pradinis atpalaiduojamojo

veikliojo junginio kiekis, t – laikas.

Pagal Higuči modelį gaunama linijinė atpalaiduojamų junginių tiesė. Gali būti taikomos Higuči modelio modifikacijos tirpalams ir suspensinėms formoms. Suspensinėms formoms (5 formulė):





2 / 1 0 2         t D C Q 6 formulė [33]

Kur Q – veikliojo junginio kiekis atpalaiduotas per vieną ploto vienetą, C0 – pradinė koncentracija pusiau kietoje formoje, CS – veikliojo junginio tirpumas pusiau kietos formos matricoje, D – veikliojo junginio difuzijos koeficientas pusiau kietame preparate, t – praėjęs laikas.

Atpalaiduoto junginio kiekis per membranos plotą išreiškiamas mg/cm2

, pagal kvadratinę šaknį iš praėjusio laiko, turėtų sudaryti tiesišką kreivę. Šios kreivės nuožulnumas parodo veikliųjų junginių atpalaidavimo iš pusiau kietos vaisto formos efektyvumą.

Akceptorinė terpė. Vienas iš svarbiausių tyrimo in vitro etapų yra tinkamos akceptorinės terpės

pasirinkimas. Ši terpė turi būti artima fiziologinėms terpės, ant kurios bus aplikuojamas preparatas, sąlygoms. Norint nustatyti veikliųjų junginių atpalaidavimo greitį, akceptorinė terpė turi priimti pakankamą kiekį tiriamo veikliojo junginio per atitinkamą laiko tarpą.

In vitro tyrimų apžvalgose siūloma pasirinkti vandeninį buferinį tirpalą vandenyje tirpiems

junginiams ar hidro-alkoholinę terpę su pridėtu buferiu junginiams, kurie vandenyje tirpsta prasčiau. Terpės pH turėtų būti 5–6 ± 0,05. In vitro atsipalaidavimo tyrimams būtina sudaryti sudaryti „sink“ sąlygas. Tai reiškia, jog tirpiklis ir jo kiekis turi būti parinktas taip, kad jame galėtų ištirpti didelis kiekis tiriamosios medžiagos, tačiau tyrimo pabaigoje atpalaiduoti junginiai nesudarytų didesnės kaip 10 % koncentracijos. Kaip buferis pH korekcijai ir fiziologinei terpei atkartoti dažniausiai siūlomas fosfatinis buferis [19].

Temperatūra. Puskiečių formų tyrimui tipinė terpės temperatūra yra 32 ± 0,5o

C, kuri atitinka įprastą žmogaus odos temperatūrą. Siekiant pritaikyti preparatą specifinėms veikimo vietoms – pvz. rektaliniai ar vaginaliniai kremai – gali būti naudojamos kitos temperatūros, šiuo atveju 37 ± 0,5oC. Aukštesnėse temperatūrose tyrimai nevykdomi, nes gali įvykti fizikiniai pokyčiai tiriamajame produkte ir pasikeisti matricos per kurią vyksta difuzija pasipriešinimas, todėl rezultatai gali išsikreipti.

Net nežymus temperatūros pokytis nuo 32o

C iki 37oC, gali žymiai įtakoti veikliųjų medžiagų atpalaidavimą iš pusiau kietų vaisto formų, ką parodė Chattaraj ir Kanfer (1995) atliktas eksperimentas su skirtingais acikloviro kremais. Manoma, jog šis termodinaminis pusiau kietų vaisto formų efektas atsiranda dėl formos savybių ir jos sudedamųjų dalių jautrumo šilumai. Dėl šilumos sumažėjus formos klampai, veikliųjų medžiagų atpalaidavimas palengvėja [33].

Mėginio paėmimo laikas. Prieš pradedant in vitro atpalaidavimo tyrimo eksperimentus, turi būti

paruoštas analitinis metodas, kuris bus taikomas atpalaiduotiems veikliesiems junginiams analizuoti iš paimtų mėginių. Šis metodas priklauso nuo analizuojamųjų junginių, tačiau A. Marangon su kolegomis (2009), pabrėžia šiuo metu taikomo ESC – UV/DAD/MS metodo universalumą [31].

Tyrimo eigoje rekomenduojama paimti nuo 5 iki 6 mėginių. Mėginiai turi būti imami nustatytais intervalais atsižvelgiant į veikliosios medžiagos tirpumą akceptorinėje terpėje. Standartinėje procedūroje siūloma mėginius imti bent per pirmas 6 tyrimo valandas (įprastai praėjus 0,25 h, 0,5 h, 1 h, 2 h, 4 h ir 6 h nuo tyrimo pradžios). Tam tikrais atvejais tyrimas gali trukti ir ilgiau – 24 – 48 val. Svarbiausia, kad mėginiai būtų imami nuo periodo, kada membrana nebedaro įtakos veikliųjų medžiagų atpalaidavimui, nes pradžioje membrana kartu su neišmaišytų akceptorinės terpės sluoksniu sukelia pasipriešinimą. Pastebėta, jog vykdant ilgesnį tyrimą tam tikrais momentais atpalaiduotų veikliųjų medžiagų keikis gali stipriai pakisti. Šis pokytis didžiausias, kai jau atpalaiduota nuo 35 % iki 45 % veikliųjų medžiagų kiekio [19,31,33,42].

Naudojama įranga. Svarbiausia savybė, kurią turi tenkinti įranga naudojama in vitro tyrimams

jos inertiškumas, nes siekiant tikslių ir atkuriamų rezultatų, visos įrangos dalys, kurios gali liestis su tiriamuoju preparatu turi būti chemiškai inertiškos. Tokiomis savybėmis pasižymi dažniausiai in vitro atpalaidavimo tyrimams naudojamos Franz celės, Franz celės su modifikacijomis, pratekamosios celės,

enhancer tipo celės ir invertuotos enhancer tipo celės.

Franz difuzinės celės naudojamos in vitro veikliųjų medžiagų atpalaidavimo tyrimams nuo 1978 metų ir yra plačiausiai tiriamos bei taikomos ir rekomenduojamos taikyti pagal JAV farmakopėją [33]. Jos sudarytos iš dviejų talpų – donorinės ir akceptorinės. Šias talpas perskiria pusiau laidi membrana. Donorinė talpa skirta tiriamajam pusiau kietam preparatui talpinti, o akceptorinė talpa – veikliąsias medžiagas priimančiam tirpalui – akceptorinei terpei. Akceptorinėje talpoje yra mėginio paėmimo vamzdelis, per kurį nustatytais laiko tarpais paimamas mėginys. Visa celė yra patalpinta į termostatą, o akceptorinės talpos dugne dedamas maišiklis.

Pasak Keshary ir kitų (1995), originalios Franz celės neleidžia atlikti tikslaus tyrimo, nes nesuteikia akceptorinei terpei pakankamų hidrodinaminių savybių, maišymo efektyvumo ir temperatūros kontrolės. Todėl buvo sukurtos modifikacijos, kuriose akceptorinė talpa apgobta papildomu sluoksniu ir sudarytas vandens švarkas, kas pagerina pastovios temperatūros palaikymo galimybes. Pati talpa sutrumpinta, o maišymas vykdomas su žvaigždės formos magnetu.

A. Olejnik su kolegomis (2012) aprašoma kita modifikacija – Hansen microette (Hanson Research Corporation, Chatsworth, CA) – pilnai automatizuotos 6 modifikuotos Franz celės sujungtos į vieną. Ši sistema automatiškai paima mėginius nustatytais laiko intervalais iš visų 6 celių ir siunčia į analizės aparatūrą (dažniausiai pasirenkamas ESC). Šiuo metu, kaip ir Hansen microette, nauji komerciniai in vitro tyrimų aparatai būna sudaryti iš 6 celių, kuriose vienu metu analizuojami 3 tiriamojo ir 3 lyginamojo preparato mėginiai.

Vis plačiau naudojamas pratekančiosios difuzinės celės aparatas, kurį aprašo A. Marangon su kolegomis (2009). Šioje celėje akceptorinė terpė pastoviai prateka pro akceptorinę dalį. Aparatas sudarytas iš rezervuaro su akceptorine terpe, siurblio ir vandens vonios. Siurblys naudojamas sudaryti