JUODOSIOS IR ŽALIOSIOS ARBATOS VEIKLIŲJŲ MEDŽIAGŲ CHEMINĖS SUDĖTIES TYRIMAS BEI PALYGINIMAS, TAIKANT CHROMATOGRAFINĖS ANALIZĖS METODUS

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

FARMACIJOS FAKULTETAS

ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA

URŠULĖ KALVAITYTĖ

JUODOSIOS IR ŽALIOSIOS ARBATOS VEIKLIŲJŲ MEDŽIAGŲ

CHEMINĖS SUDĖTIES TYRIMAS BEI PALYGINIMAS, TAIKANT

CHROMATOGRAFINĖS ANALIZĖS METODUS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas

Prof. dr. Andrejus Ževžikovas

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

FARMACIJOS FAKULTETAS

ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanė Ramunė Morkūnienė Data:

JUODOSIOS IR ŽALIOSIOS ARBATOS VEIKLIŲJŲ MEDŽIAGŲ

CHEMINĖS SUDĖTIES TYRIMAS BEI PALYGINIMAS, TAIKANT

CHROMATOGRAFINĖS ANALIZĖS METODUS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas

Prof. dr. Andrejus Ževžikovas Data

Recenzentas Darbą atliko

Docentė Magistrantas

Gailutė Drakšienė Uršulė Kalvaitytė

Data Data

KAUNAS, 2019 2

TURINYS

SANTRAUKA ... 3 SUMMARY ... 5 SANTRUMPOS ... 9 ĮVADAS ... 10

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 11

1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 12

1.1 Kininis arbatmedis (lot. Camellia sinensis L. Kuntze) ... 12

1.2 Arbatos rūšys ... 12

1.3 Žaliosios arbatos cheminė sudėtis ... 13

1.4 Juodosios arbatos cheminė sudėtis... 14

1.5 Kininio arbatmedžio (lot. Camellia sinensis L. Kuntze) žaliavos apdorojimas ... 15

1.6 Kofeinas ... 16

1.7 Teobrominas ... 17

1.8 Teofilinas ... 18

1.9 Juodosios ir žaliosios arbatos terapinės savybės ... 18

2. TYRIMO METODIKA IR METODAI ... 20

2.1 Tyrimo planavimas ... 20

2.2 Naudotos medžiagos ir reagentai ... 20

2.3 Įranga ... 21

2.4 Tyrimo objektas ir kintamųjų parinkimas ... 21

2.5 Mėginių paruošimas ... 22

2.6 Standartinių tirpalų ruošimas ... 22

2.7 Efektyviosios skysčių chromatografijos metodo sąlygos ... 23

2.8 Plonasluoksnės chromatografijos metodo sąlygos ... 24

2.9 Duomenų analizės metodai ... 24

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 25

3.1. ESC metodo validacija kokybiniam ir kiekybiniam junginių tyrimui ... 25

3.1.1. Specifiškumas ... 25

3.1.2. Tiesiškumas ... 26

3.1.3. Glaudumas ... 28 3

3.1.4. Nustatymo ir aptikimo ribos ... 29

3.2. Tiriamųjų tirpalų kokybinis ir kiekybinis vertinimas ESC analizės metodu ... 29

3.3. Kokybinis teobromino, teofilino ir kofeino identifikavimas mėginiuose, taikant plonasluoksnės chromatografijos analizės metodą ... 34

3.4. Juodosios ir žaliosios arbatų sudėčių palyginimas... 36

IŠVADOS... 37

PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 38

LITERATŪROS SĄRAŠAS... 39

PRIEDAI ... 42 4

SANTRAUKA

U. Kalvaitytės magistro baigiamasis darbas „Juodosios ir žaliosios arbatos veikliųjų medžiagų cheminės sudėties tyrimas bei palyginimas, taikant chromatografinės analizės metodus“/ mokslinis vadovas prof. A. Ževžikovas; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmacijos fakulteto Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra. – Kaunas.

Darbo tikslas: atlikti žaliosios ir juodosios arbatų (Camellia sinensis (L.) Kuntze) vandeninių

ekstraktų kokybinę ir kiekybinę biologiškai aktyvių medžiagų analizę chromatografiniais analizės metodais.

Darbo uždaviniai: Kokybinį arbatų įvertinimą atlikti plonasluoksnės chromatografijos

metodu, kokybinį ir kiekybinį - efektyviosios chromatografijos metodu.. Remiantis literatūra, parinkti bei validuoti efektyviosios skysčių chromatografijos metodiką, tinkamą kokybiniam ir kiekybiniam kofeino, teobromino ir teofilino nustatymui vandeniniuose tirpaluose. Pagal metodiką ištirti žaliosios bei juodosios arbatų tirpalus ir įvertinti, kokiom sąlygom vykdant ekstrakciją, nustatoma didžiausios koncentracijos tiriamųjų junginių. Pasirinkti kintamieji - ekstrakcijai naudojamo vandens temperatūra bei ekstrakcijos laikas. Remiantis gautais rezultatais įvertinti žaliąją ir juodąją arbatas atskirai ir palyginti tarpusavyje.

Tyrimo objektas ir metodai: Kininio arbatmedžio (Camellia sinensis (L.) Kuntze) augalo lapai,

skirtingu apdorojimo būdu gautos žalioji ir juodoji arbatos. Tyrimui pasirinkta vieno gamintojo žalioji ir juodoji birios arbatos. Tyrimo kokybinis įvertinimas buvo atliktas plonasluoksnės chromatografijos tyrimo metodu. Kokybinei ir kiekybinei analizei pasirinktas efektyviosios skysčių chromatografijos metodas. Kofeino, teobromino ir teofilino nustatymui buvo naudoti vandeniniai arbatų užpilai, pagaminti keičiant ekstrakcijos parametrus – vandens temperatūrą (70 °C, 100 °C ir kambario t°) ir ekstrakcijos laiką (3 min, 5 min, 10 min, 15 min, 22 val. – kambario temperatūros ekstrakcijos mėginiui). ESC skirstymas atliktas Waters chromatografu su ACE C18 kolonėle, fotodiodų matricos detektoriumi. Mobilioji fazė buvo sudaryta iš trifluoracto rūgšties (0,1 %) ir acetonitrilo (grynas). Eliuavimo rėžimas – gradientinis, tėkmės greitis – 1,23 ml/min. PC analizė pasirinkta kokybiniam įvertinimui, mobiliąją fazę sudarė acetonas/toluenas/chloroformas (4:3:3). Buvo tiriama po 4 žaliosios ir juodosios arbatos tirpalus, ekstrakcijos temperatūra – 70 °C, ekstrakcijos laikai – 5 min., 15 min., 35 min. Po vieną mėginį buvo paruošta su kambario temperatūros vandeniu, ekstrahuota 22 val.. Rezultatai vertinti lyginant standartinių tirpalų sulaikymo faktorius su tiriamųjų tirpalų sulaikymo faktoriais.

Rezultatai ir išvados: Validuota efektyviosios skysčių chromatografijos metodika kofeino,

teobromino bei teofilino kokybiniam bei kiekybiniam identifikavimui, atsižvelgiant į reikiamus parametrus – tiesiškumą, specifiškumą, nustatymo ir aptikimo ribas bei glaudumą. Duomenų

patikimumą parodantis rodiklis p < 0,05. Pritaikius validuotą metodiką kokybiškai bei kiekybiškai įvertinti tiriamieji žaliosios ir juodosios arbatų vandeniniai ekstraktai. Žaliosios arbatos tirpaluose didžiausios koncentracijos tiriamųjų junginių nustatyta, kai ekstrakcija buvo vykdoma naudojant 70 °C vandenį, o ekstrakcijos laikas – 3 min. Šiomis sąlygomis kofeino nustatyta 2696,544 g/ml, teobromino - 89,598 g/ml. Teofilinas nustatytas tik viename žaliosios arbatos mėginyje – kai ekstrahentu naudojamas kambario temperatūros vanduo, o ekstrakcijos laikas – 22 val. Juodosios arbatos tirpaluose didžiausios tiriamųjų junginių koncentracijos nustatytos atliekant žaliavos ekstrakciją 15 min 70 °C vandeniu. Šiomis sąlygomis nustatytos koncentracijos: kofeino 2494,05 g/ml, teobromino - 159,754 g/ ml, teofilino - 18,994 g/ml. Plonasluoksnės chromatografijos tyrimo metu visuose mėginiuose identifikuotas kofeinas, teobrominas – visuose juodosios arbatos ir viename žaliosios arbatos mėginyje, teofilinas nebuvo nustatytas nei viename mėginyje, dėl žemos koncentracijos tirpaluose.

SUMMARY

The aim of the study:To elucidate, what are the most suitable conditions for the highest concentrations of three active substances - caffeine, theobromine and theophylline extraction from black and green tea, assimilating domestic conditions of brewing tea, by changing two variables – temperature of the extrahent and the extraction time.

Objective: The aim of the study: the main objective was to analyze quantitative and

qualitative parameters of aqueous black and green tea extracts, and to determine the conditions (by changing the water temperature and the extraction time) under which the amount of chemical constituents is the highest by high performance liquid chromatography (qualitative and quantitative) and thin-layer chromatography (qualitative) methods. The chosen active substances were caffeine, theobromine and theophylline. Based on the results, evaluate green and black tea solutions separately and to compare their quantitative parameters with each other.

Object and methods: The objects of the research were black and green tea, which were purchased from the same manufacturer in the form of loose tea leaves. The samples were grinded separately and weighed into sample sizes of 2,0 g each. Each sample was mixed with 50,0 ml distilled water of the chosen temperature. Chosen temperatures were 70 oC and 100 oC and the extraction times were 3 min, 5 min, 10 min, 15 min. One sample of each tea was made using room temperature distilled water and left in room temperature for 22 h. After the extraction of the determined period of time samples were filtered through a paper filter and chilled samples were used for further HPLC analysis. Analysis was conducted using a Waters 2690/5 chromatographer, 2998 PDA detector, ACE C18 (250 mm × 4,6 mm) column, sorbent particle size of 5 μm, gradient pump mode, mobile phase consisting of trifluoroacetic acid (TFA) and acetonitrile (ACN). The amounts of caffeine, theophylline and theobromine were determined by comparison of sample results with standard solutions of the chosen substances. Thin-layer chromatography method was used to determine the qualitative composition of the solutions. For analysis samples were applied onto the chromatography plate by semi-automatic autosampler, the mobile phase consisted of acetone/toluene/chloroform (4:3:3). 4 of each black and green tea samples were analyzed by TLC. To prepare the solutions extraction temperature was chosen 70 °C, the extraction times were 5 min., 15 min., 35 min. One of each tea sample was made using room-temperature water and left for 22 h extraction. The results were analyzed by comparison of retention factors of the samples and the standart solutions.

Results and Conclusions: The HPLC methodology was validated for qualitative and

quantitative analysis of caffeine, theobromine and theophylline by evaluating criteria of specificity, linearity, limits and precision. Data were considered statistically reliable when p < 0,05. By applying the validated method for qualitative and quantitative analysis, black and green tea samples were

analyzed. Among the green tea samples the highest amounts of the analyzing compounds were determined, when the extrahent (distilled water) temperature was 70 °C and the extraction carried out for 3 minutes. Under these conditions the concentrations were: caffeine - 2696,544 g/ml, teobromine - 89,598 g/ml. Theophylline was detected only in one sample – the one which was made by using room temperature distilled water and leaving the solution for 22-hour-extraction. In black tea sample all the substances were identified. The highest concentrations of the caffeine (2494,05 g/ml), theobromine (159,754 g/ ml) and theophylline (18,994 g/ml) were determined under the conditions of 15 minute extraction with 70 °C water. By thin-layer chromatography analysis caffeine was determined in all of the samples, theobromine – in all of the black tea samples and one out of four green tea sample, but theophylline was not detected in any of them due to the low concentration of the substance in the sample solutions.

PADĖKA

Už suteiktas kokybiškas darbo sąlygas bei materialinę bazę dėkoju visam Analizinės ir toksikologinės chemijos katedros kolektyvui. Ačiū asistentui Mindaugui Marksai, katedros vedėjui prof. Liudui Ivanauskui bei darbo vadovui prof. Andrejui Ževžikovui už konsultacijas ir pagalbą.

SANTRUMPOS

ACN – acetonitrilas;

CNS - centrinė nervų sistema; DMD – diodų matricos detektorius; ESC - efektyvioji skysčių chromatografija; p - reikšmingumo lygmuo;

PC – plonasluoksnė chromatografija; Rf – sulaikymo faktorius;

SNS – simpatinė nervų sistema;

SSN – santykinis standartinis nuokrypis; TFA – trifluoracto rūgštis;

ĮVADAS

Arbata – tai vienas iš labiausiai suvartojamų gėrimų visame pasaulyje, populiarus tarp įvairių amžiaus grupių skirtinguose visuomenės sluoksniuose [1, 2, 3, 4]. Kasdien pasaulyje suvartojama daugiau nei 3 milijardai puodelių arbatos [3]. Galima teigti, kad arbata – tai seniausias, populiariausias nealkoholinis gėrimas pasaulyje [4, 5]. Iš pradžių arbata buvo vartojama kaip medicininis gėrimas, priemonė sustiprinti meditacijos pojūčius. Vėliau pradėta vartoti kaip gaivusis gėrimas [4, 5].

Kininis arbatmedis (Camellia sinensis (L.) Kuntze) – tai visžalis augalas, iš kurio lapelių gaunamos ir žalioji, ir juodoji arbatos [6, 7]. Skirtumas yra surinktų lapų tolimesniame apdorojimo procese. Žalioji arbata yra gaunama arbatos lapelius garinant ir džiovinant [8]. Tokiu būdu yra stabdomi fermentacijos procesai, o juodosios arbatos apdorojimo atveju šie procesai yra inicijuojami [9, 10]. Dėl šių skirtumų skirtingos arbatos rūšys tarpusavyje skiriasi tiek kiekybinėmis, tiek kokybinėmis sudėtimis. Tačiau abi arbatos rūšys yra plačiai vartojamos ne tik dėl skoninių, bet ir dėl sveikatos gerinimo ir stiprinimo savybių. Žalioji ir juodoji arbatos pasižymi priešvėžiniu, chemoprotekciniu, antivirusiniu, antialerginiu, stimuliuojančiu veikimu [11, 7, 12]. Taip pat mažina lėtinių ligų, tokių kaip diabetas ar širdies – kraujagyslių sistemos susirgimų, išsivystymo riziką [9].

Šiame darbe tiriamos medžiagos – kofeinas, teobrominas, teofilinas – pasižymi farmakologinėmis savybėmis. Kofeinas dažniausiai naudojamas kaip nervų sistemos, širdies ir kraujagyslių sistemos stimuliatorius [13, 14]. Teobrominas, kaip ir kofeinas, teigiamai veikia kognityvines funkcijas, gerina emocinę būklę [15]. O teofilinas, kofeino metabolitas, taip pat pasižymi ir bronchus plečiančiu, priešuždegiminiu aktyvumu [16].

Tradicinis arbatos paruošimas yra karštu ar verdančiu vandeniu užpilant arbatžoles, ir pasirinktą laiką leidžiant organoleptines ir biologinio aktyvumu suteikiančiom medžiagoms ekstrahuotis [4]. Šis paruošimo būdas ir yra naudojamas plačiausiai, tačiau retas matuoja vandens temperatūrą, kuria užpilamos arbatžolės – vieni naudoja tik užvirusį vandenį, kiti palaukia, kol vanduo pravės. Taip pat varijuoja ir ekstrakcijos laikas. Šie skirtumai lemia pagamintos arbatos kokybinę ir kiekybinę sudėtį [17]. Todėl šio darbo tikslas buvo nustatyti, kokios sąlygos – temperatūra ir ekstrakcijos laikas - yra tinkamiausios paruošti juodąją ir žaliąją arbatas, lyginant kofeino, teobromino ir teofilino kiekius jose. Kokybinė analizė atlikta naudojant plonasluoksnės chromatografijos metodą, o kokybiniam ir kiekybiniam arbatų sudėties vertinimui pasirinktas efektyviosios skysčių chromatografijos metodas. Remiantis gautais rezultatais vertinamos kiekvienai arbatos rūšiai tinkamiausios sąlygos tiriamų medžiagų ekstrakcijai. Taip pat lyginami žaliosios ir juodosios arbatų rezultatai tarpusavyje.

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas:

Atlikti žaliosios ir juodosios arbatų (Camellia sinensis (L.) Kuntze) vandeninių ekstraktų kokybinę ir kiekybinę biologiškai aktyvių medžiagų analizę chromatografiniais analizės metodais.

Darbo uždaviniai:

1. Remiantis tinkamiausių metodikų duomenimis, pritaikyti plonasluoksnės chromatografijos metodiką kofeino, teobromino ir teofilino, išskirtų iš žaliosios ir juodosios arbatos mišinių, kokybiniam įvertinimui.

2. Remiantis tinkamiausių metodikų duomenimis, validuoti efektyviosios skysčių chromatografijos metodiką kofeino, teobromino, ir teofilino, išskirtų iš žaliosios ir juodosios arbatos mišinių, kokybiniam ir kiekybiniam įvertinimui.

3. Taikant aukščiau minėtus chromatografinės analizės metodus, kokybiškai ir kiekybiškai įvertinti cheminę arbatos lapų sudėtį, lyginant žaliąją ir juodąją arbatas.

1. Taikant skirtingas ekstrakcijos sąlygas (temperatūrą, ekstrahavimo trukmę), palyginti kokybinius ir kiekybinius sudėties pokyčius arbatų vandeniniuose užpiluose.

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1 Kininis arbatmedis (lot. Camellia sinensis L. Kuntze)

Kininis arbatmedis (lot. Camellia sinensis L. Kuntze) – tai iš Kinijos kilęs visžalis augalas, priklausantis erikiečių (Ericales) eilei, arbatmedinių (Theaceae) šeimai, kamelijos (Camellia) genčiai, kininio arbatmedžio (Camellia sinensis L.) rūšiai [4, 5, 6, 7]. Kininio arbatmedžio medis/krūmas, auginamas kultivavimui auga iki 1,5 m, o natūralioje aplinkoje – iki 15 m. Augalo lapeliai yra trumpakočiai, šviesiai žalios spalvos, pražanginiai, elipsiškos – ovalo formos, odiški, lygiu paviršiumi, smulkiai dantytais kraštais. Lapų dydis varijuoja nuo 5 iki 30 cm. Žiedai baltos, kartais rausvos spalvos, iki 4 cm dydžio, brandinami vaisiai – dėžutės, kurių kiekvienoje randama 1 – 5 sėklų [7].

Šiuo metu kininiai arbatmedžiai yra auginami daugiau nei 50 – iose šalyse, iš kurių, 2016 m. duomenimis, Kinija ir Indija yra didžiausios eksportuotojos pasaulinei rinkai [18].

1.2 Arbatos rūšys

Priklausomai nuo Kininio arbatmedžio (Camellia sinensis L.) lapų žaliavos apdorojimo etapų, gaunamos arbatos klasifikuojamos į 4 skirtingų arbatų rūšis [33]:

1pav. Arbatos rūšys [33]

Kituose šaltiniuose klasifikacija pateikiama kitokia, kurioje suskirstoma pagal fermentacijos laipsnį (įtraukiant ir antrinę fermentaciją) [9]:

1) Nefermentuotos žaliosios ir baltosios arbatos, apdorojamos džiovinant ir garinant šviežius arbatos lapelius.

2) Pusiau – fermentuota oolong‘o arbata, gaunama šviežios žaliavos dalinės fermentacijos stadijos prieš džiovinimo etapą, būdu.

3) Visiškai fermentuotos juodoji ir raudonoji arbatos, gaunamos po šviežios žaliavos surinkimo atliekamos fermentacijos, po to džiovinant ir garinant.

4) Post – fermentuojama arbata Pu-erh, kuri yra gaunama po antrinės fermentacijos ir oksidacijos gryname ore.

Cheminiu aspektu, arbata yra sudėtingas mišinys su daugybe metabolitų, varijuojant medžiagų kiekiams, priklausomai nuo skirtingų kriterijų [9].

Visų arbatoje esančių junginių kiekis priklauso nuo arbatžolių kilmės šalies, rūšies, auginimo sąlygų (dirvožemio, klimato, auginimo aukščio virš jūros lygio, agrokultūrinių aspektų) bei apdorojimo – džiovinimo, garinimo, fermentacijos, laikymo sąlygų [9, 3]. Pavyzdžiui, vieno iš įtaką darančių veiksnių, klimato, pokyčių, sukeliami dirvožemio išdžiuvimai – tai lemia mažesnį drėgmės kiekį arbatoje, mažina žaliavos kokybę, naujų kenkėjų atsiradimą [3].

Geriausia žaliava arbatos gamybai yra laikomi lapeliai, atitinkantys šiuos sudėties parametrus [19]:

2pav. Rekomenduojami arbatos žaliavos sudėties rodikliai

1.3 Žaliosios arbatos cheminė sudėtis

Žalioje arbatoje yra randamas platus spektras junginių: • Ksantinai (kofeinas, teobrominas teofilinas)

• Polifenoliniai junginiai (iki 30 % [9])

a) flavan-3-oliai (dar kitaip vadinami katechinais) b) proantocianidinai

c) flavonoliai (kvercetino ir kempferolio konjugatai, taip pat aptinkama ir miricetino, mono-, di- ir triglikozidų [20].

d) flavandioliai

e) flavonoidai. Žaliojoje arbatoje didžiausi kiekiai randama šių katechinų: epikatechino, (-) katechino, (2)-epigalokatechino (EGC), (2)-epigalokatechino, epikatechin-3-galato EGCG, galokatechino (GC).

• Pigmentai (chlorofilas, karotenoidai) • Vitaminai (B, C, E)

• Amino rūgštys (baltymus sudarančios ir baltymų nesudarančios) – L-teaninas, 5-N-etilglutaminas, glutamo rūgštis, triptofanas, glicinas, serinas, asparto rūgštis, tirozinas, valinas, leucinas, treoninas, argininas, lizinas)

• Baltymai bei jų fermentai

• Mineralai ir makroelementai (kalcis, magnis, chromas, manganas, geležis, varis, cinkas, molibdenas, selenas, natris, fosforas, kobaltas, stroncis, nikelis, kalis, fluoras, aliuminis) • Angliavandeniai (celiuliozė, pektinai, gliukozė, fruktozė, sukrozė)

• Nedideli kiekiai lipidų (linolinės rūgšties ir -linoleno rūgšties) • Nedideli kiekiai sterolių (stigmasterolio)

• Saponinai

• Lakiosios medžiagos (aldehidai, alkoholiai, esteriai, laktonai, hidrokarbonatai) • Terpenoidai

• Fenolinės rūgštys (galo rūgštis) [8, 20, 21, 22, 23, 9, 2, 4, 17, 24]

Žalioje arbatoje aptinkamas didelis kiekis polifenolinių junginių, nes arbatžolių apdorojimo metu inaktyvuojami polifenolių oksidazės fermentai, dėl to išvengiama oksidacinių reakcijų, kurios užtikrina didesnį kiekį polifenolinių medžiagų žaliavoje [9].

1.4 Juodosios arbatos cheminė sudėtis

Juodosios arbatos apdorotoje žaliavoje, yra nustatoma daug grupių biologiškai aktyvių medžiagų:

• Ksantinai (kofeinas, teobrominas, teofilinas)

• Katechinai – epikatechinas, epigalokatechinas, epikatechino galatas, epigalokatechino galatas, katechino galatas.

• Polifenoliai - tearubiginai ir teaflavinai (fermentacijos metu susidaro iš katechinų [20]). Pagrindiniai 4 teaflavinai: teaflavinas (TF1), teaflavin-3-O-galatas (TF2a), teaflavin-3‘-O-galatas (TF2b) ir teaflavin-3,3‘-O,O-diteaflavin-3‘-O-galatas (TF3) [12].

• Teaflavinų izomeriniai junginiai – teaflavinės rūgštys, teaflagalinai, metilinti teaflavinai ir kt. • Flavanoliai (kvercetinas, kempferolis, miricetinas)

• Kiti benzotropolono junginiai • Flavanai (apigeninas, luteolinas)

• Amino rūgštys (L-teaninas, glutamo rūgšties -etilamidas)

• Angliavandeniai (celiuliozė, pektinai, gliukozė, fruktozė, sukrozė) • Vitaminas C

• -karotenas

• Glikozilinti flavonoidai • Saponinai

• Fenolinės rūgštys (galo rūgštis) • Eteriniai aliejai

• Lakiosios medžiagos • Terpenoidai

[22, 23, 9, 1, 4, 17, 12]

1.5 Kininio arbatmedžio (lot. Camellia sinensis L. Kuntze) žaliavos

apdorojimas

Visų arbatos žaliavų paruošimas prasideda nuo jaunų augalo lapelių surinkimo, kurie apdorojimo proceso metu kinta tiek fiziškai, tiek cheminiu atžvilgiu [19, 25].

Juodosios arbatos apdorojimo vienas svarbiausių etapų yra aeracija, anksčiau vadinta fermentacija. Kitų arbatos rūšių gamyboje šis etapas yra atliekamas dalinai arba iš viso nenaudojamas. Aeracijos etapą sudaro oksidacijos reakcijų seka ir polifenolių bei kitų junginių kondensacija [19]. Reakcijų metų susidarę junginiai bei jų kiekis lemia organoleptines arbatos savybes, nes paties apdorojimo metu nėra pridedama papildomų medžiagų, tik deguonis, o arbatmedžio lapų džiovinimo metu pašalinamas vanduo. Juodosios arbatos žaliavos apdorojimo fermentacijos reakcijos skatina oksidacinius procesus bei tolimesnes kondensacijos reakcijas. Tai lemia katechinų kiekio sumažėjimą, nes jie yra paverčiami į teaflavinus ir tearubiginus. Šie junginiai ir suteikia specifines organoleptines savybes (kvapą, skonį, spalvą) juodajai arbatai [9]. Fermentacijos metu katechinų skaičius yra ženkliai sumažinamas – iki 20 % [1]. Juodosios arbatos apdorojimo metu endogeninių fermentų, pagrinde polifenolio oksidazės ir peroksidazės, pagalba vyksta flavanolių konversija oksidacinių reakcijų metu. Katechinai, esantys arbatoje, yra verčiami į oksidacinių procesų produktus - dimerinius ar oligomerinius junginius, tokius kaip teaflavinai, teacitrinai, teasinensinai, teanaftochinonai ar tearubiginai [20, 12]. Pastarųjų junginių juodoje arbatoje yra daugiausia, palyginus su kitomis arbatos rūšimis [10].

Juodosios arbatos apdorojimas gali būti kelių skirtingų būdų – „ortodoksinis“ ir „pjaustyti-plėšyti-vynioti“ (angl. cut-tear-curl). Abiejų procesų pagrindinis tikslas yra viduląstelinių struktūrų suardymas, norint, kad fenoliniai junginiai atsidurtų terpėje, kurioje yra polifenolių oksidazės, ir taip inicijuoti fermentines reakcijas. Vidutiniškai šis procesas trunka 1-2 valandas, esant 40 °C temperatūrai [10].

Žaliosios arbatos apdorojimas skiriasi nuo kitų rūšių arbatų. Šviežiai surinkti lapeliai iškart yra garinami, norint sustabdyti fermentacijos procesus ir užtikrinti paruošto produkto kokybę ir stabilumą. Vienas iš pagrindinių arbatos identifikavimo kriterijų yra spalva. Arbatos lapelių garinimo proceso metu yra sunaikinami fermentai, atsakingi už lapuose esančių pigmentų suskaidymą, todėl net ir po džiovinimo arbata išlaiko savo žalią spalvą. Žalioji arbata turi daugiausia polifenolinių medžiagų, nes apdorojimo eigoje yra išsaugomi, o labiau fermentuotose arbatose – juodoje ir Oolong‘o polifenolių (katechinų) yra mažiau. Katechinai, esantys žalioje arbatoje yra dimerizuojami į teaflavinus, kurie pasižymi plačiu biologinio aktyvumo spektru [8].

1.6 Kofeinas

Ksantinų grupei priklausantis junginys, natūraliai randamas maisto produktuose bei gėrimuose, tokiuose kaip arbata, kava, kakavos pupelės [13, 14, 25]. Cheminė formulė (3 pav.) yra 1,3,7-trimetilksantinas [13, 15]. Be to, kad kofeinas naudojamas kaip skonio stipriklis, dažniau pabrėžiamas jo terapinis panaudojimas [25].

Kofeinas naudojamas kaip nervų sistemos, širdies bei kraujagyslių bei kvėpavimo sistemos stimuliatorius. Taip pat turi fiziologinį poveikį gliukozės metabolizmui, miego kokybei ir fizinei ištvermei [13, 14]. Vaistų žinyne indikacijos kofeino vartojimui apibrėžiamos kaip fiziniam bei psichiniam darbingumui didinti ir nuovargiui mažinti [26]. Tačiau kofeino poveikio spektras neapsiriboja vien šia funkcija. Kofeinas padidina adenozinui jautrios simpatinės nervų sistemos (SNS) jautumą. SNS signalai sukelia ciklinio adenozino monofosfato (cAMP) koncentraciją postsinaptinėse ląstelėse. Kofeinas, veikdamas kaip konkurentinis adenozino antagonistas, slopina fermentinį cAMP skaidymą, taip stiprindamas perduodamų signalų stiprumą. Nepageidaujamoms reakcijoms priskiriamas nerimas, ažitacija, nemiga, tachikardija, padidėjęs dirglumas [26, 11]. Po suvartojimo kofeino koncentracijos plazmoje pikas pasireiškia praėjus nuo 30 iki 60 min. Kofeino dozės nuo 32 iki 400 mg teigiamai veikia kognityvines funkcijas, tokias kaip emocinė būklę, klausos bei regos budrumas [15]. O kasdienis kofeino vartojimas stimuliuoja neuromuskulinius metabolinius procesus be akivaizdžių šalutinių reiškinių [9]. Taip pat su laboratorinėm pelėm atlikto tyrimo rezultatai parodė, kad kofeino vartojimas sumažino plaučių vėžio atsiradimo dažnį [2]. Atlikti epidemiologiniai tyrimai,

tiriantys ilgalaikio kofeino vartojimo rezultatus, nenustatė kardiovaskulinių ligų ar opų atsiradimo rizikos padidėjimo [25].

3pav. Kofeino (1,3,7-trimetilksantino) formulė [34]

1.7 Teobrominas

Teobrominas (3,7 – dimetilksantinas) yra natūraliai randamas metilksantinas. (4 pav.) Jo veikimas, kadangi teobrominas patenka pro hematoencefalinį barjerą, yra pagrįstas prisijungimu prie adenozino receptorių smegenyse ir antagonistiniu poveikiu patiems receptoriams. Palyginus su kofeinu, teobrominas veikia receptorius daug silpniau – stimuliuojantis poveikis yra 5 kartus silpnesnis. Tačiau ir silpnos dozės kofeino (mažiau nei 32 mg) turi poveikį nuotaikai ir elgsenai [15]. Taip pat, teobromino pusinės eliminacijos laikas yra ilgesnis, negu kofeino [27]. Po suvartojimo teobromino koncentracija plazmoje didžiausia būna praėjus nuo 1 iki 3 valandų [15, 27]. Šis metilksantinas mažina kraujospūdį bei pasižymi diuretinėmis savybėmis, atpalaiduoja lygiuosius raumenis. Manoma, kad kofeinas labiau veikia CNS, o teobromino poveikis stipriau pasireiškia per periferinę fiziologiją [27].

4pav. Teobromino (3,7-dimetilksantino) formulė [35] 18

1.8 Teofilinas

Teofilinas (1,3-dimetilksantinas) yra priskiriamas bronchus plečiančių metilksantinų grupei, taip pat jis yra ir kofeino (1,3,7-trimetilksantino) metabolitas, jo formulė pavaizduota 5 pav. [28]. Abu alkaloidai yra randami tokiuose produktuose, kaip arbata, kava, kakavos pupelės ar šokoladas [28]. Indikacijos pagrįstos būklėmis, kai nepakankamai veikia 2 agonistai. Pavartojus dideles dozes

teofilino gali pasireikšti paradoksalus bronchų spazmas, padažnėti širdies plakimas [26, 16]. Mažomis koncentracijomis teofilinas pasižymi priešuždegiminėmis savybėmis [16]. Kaip ir kofeinas, teofilinas slopina fosfatidilinozitol-3-kinazės aktyvumą ir insulino aktyvuojamos protein-kinazės B fosforilinimą [16].

5pav. Teofilino (1,3-dimetilksantino) formulė [36]

1.9 Juodosios ir žaliosios arbatos terapinės savybės

Antioksidacinis poveikis. Arbatoje esantys polifenoliai (katechinai) pasižymi stipriomis

antioksidacinėmis savybėmis, dėl to medicininiu požiūriu turi didelį potencialą karcinogenezės, tumorigenezės, mutagenezės procesų slopinimui [22, 24, 29]. Auglių vystymosi lėtėjimo mechanizmas, manoma, yra rezultatas tiek intraląstelinių, tiek ekstraląstelinių procesų, moduliuojant metabolinius procesus ir DNR replikaciją [7]. Katechinai yra vieni pagrindinių junginių, lemiančių biologinį poveikį – antimikrobinį, antivirusinį, antiaterosderotinį [2].

Priešvėžinis ir chemoprotekcinis veikimas. Vandeniniai juodosios ir žaliosios arbatų

ekstraktai dėl antioksidacinio ir chemoprotekcinio poveikio, yra naudingi, sergant lėtinėmis ligomis, kai kuriomis vėžinių susirgimų formomis [11]. Šis panaudojimas yra pargįstas tuo, kad juodosios arbatos tirpalai labiau slopina kepenyse vykstančias lipidų peroksidacijos reakcijas, suriša laisvuosius radikalus - veikimas paremtas tiobarbitūrinės rūgšties susidarymu [11]. Galo rūgštis, vienas iš aštuonių juodoje ir žalioje arbatoje aptinkamų katechinų, sumažina vėžinių ir kardiovaskulinių susirgimų riziką [1].

Antivirusinis, antialerginis poveikis. Arbatoje esantys bioflavonoidai turi antibakterinių,

antivirusinių, antialerginių savybių. Taip pat bioflavonoidai slopina trombocitų agregaciją, skatina apoptozinius procesus, slopina ŽIV viruso atvirkštinės transkriptazės fermentą [22].

Arbatos vartojimas sumažina neutrofilų infiltraciją (vieną iš alerginių procesų indikatorių), kuri yra vertinama kaip odos raudonio intensyvumo rodiklis [7].

Poveikis UVA ir UVB spinduliuotei ir jų sukeliamoms būklėms. Arbatos tirpalai,

naudojami išviršiniu būdu, sumažina UV spindulių skvarbą į gilesnius audinius, mažina uždegiminių imunoreguliacinių interleukinų koncentraciją [7]. Taip pat, juodosios ir žaliosios arbatos vartojimas per os plikoms pelėms ženkliai sumažina odos papilomų ir auglių, sukeltų UVA ir UVB spinduliuotės, kiekį. Juodosios arbatos vartojimas, palyginus su žaliąja, geriau apsaugo nuo UVB spindulių ir jų sukeliamų auglių vystymosi [7].

Antihipercholesteroleminis aktyvumas. 6 puodelių arbatos suvartojimas, lyginant su

placebo kontroliuojama grupe, sumažino vidutinę cholesterolio koncentraciją kraujo serume [7]. Teaflavinai, juodosios arbatos komponentai, turintys stiprų antioksidacinį poveikį, taip pat pasižymi antibakteriniu, antimutageniniu bei hipocholesteroleminiu poveikiu [1, 30]. Atlikti tyrimai taip pat nustatė, jog biologiškai aktyvios medžiagos arbatoje turi antialerginių savybių, bei mažina nutukimo riziką [2].

Anksiolitinis veikimas ir poveikis smegenų veiklai. Nuo seno arbatos vartojimas yra

grindžiamas nervų sistemą stimuliuojančiu, tonizuojančiu poveikiu [12]. Žalioje arbatoje randamas L-teaninas skatina GABA (gama-amino sviesto-rūgšties) gamybą, taip mažindamas nerimo pojūtį, stresą, gerina fiziologines funkcijas [9]. L – teaninas, specifinė amino rūgštis, taip pat padeda sureguliuoti cerebrines funkcijas, mažina kraujo spaudimą bei slopina kofeino jaudinamąjį poveikį [1]. Juodoje ir žalioje arbatose kaupiami biologiškai aktyvūs junginiai yra svarbūs ligų prevencijai. Taip pat vartojimas yra siejamas su širdies ir kraujagyslių ligų, neurodegeneracinių pakitimų rizikos mažinimu ir senėjimo procesų slopinimu [1].

Poveikis širdies ir kraujagyslių sistemai. Bendru požiūriu arbatos vartojimas, remiantis

epidemiologiniais tyrimais, mažina lėtinių ligų, tokių kaip kardiovaskulinių ligų ar diabeto, išsivystymo riziką [9]. Arbatoje esantys ksantinai stimuliuoja CNS, sukelia bronchų raumenų atsipalaidavimą, mažina skrandžio rūgšties išsiskyrimą [28]. 30–70 m. amžiaus vyrų ir moterų tiriamųjų grupėje, per dieną suvartojant po 480,0 ml arbatos, buvo nustatytas reikšmingas koronarinės širdies ligos rizikos sumažinimo poveikis [7].

2. TYRIMO METODIKA IR METODAI

2.1 Tyrimo planavimas

Prieš tyrimo pradžią buvo išskirti pagrindiniai atlikimo etapai:

1. Parinkti tyrimo objektai (konkrečios rūšies arbatžolės, to paties gamintojo žaliosios ir juodosios arbatos);

2. Tiriamųjų medžiagų standartų ekstraktų paruošimas;

3. Efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodikos parinkimas, tinkamų parametrų nustatymas, su kuriais aiškiausiai būtų galima identifkuoti tiriamų medžiagų standartus bei nustatyti jų kiekius;

4. Plonasluoksnės chromatografijos (PC) metodikos parinkimas, tinkamų parametrų nustatymas, su kuriais aiškiausiai būtų galima identifkuoti tiriamų medžiagų standartus bei kokybiškai nustatyti tiriamas medžiagas;

5. Kofeino, teobromino ir teofilino ekstrahavimas iš arbatžolių distiliuotu vandeniu.

6. Kofeino, teobromino ir teofilino identifikavimas ir kiekybinis įvertinimas pritaikant anksčiau eksperimentiškai optimizuotą ESC metodiką;

7. Kofeino, teobromino ir teofilino identifikavimas ir kokybinis įvertinimas pritaikant anksčiau eksperimentiškai parinktą PC metodiką

8. Gautų duomenų analizė ir vertinimas.

2.2 Naudotos medžiagos ir reagentai

• Žalioji arbata – „Dilmah“, Ceilonas, Šri Lanka • Juodoji arbata – „Dilmah“, Ceilonas, Šri Lanka • Toluenas – Sigma – Aldrich, Saint Luisas, JAV • Acto rūgštis – Honeywell, Sigma – Aldrich, Vokietija • Acetonas – Sigma – Aldrich, Prancūzija

• Acetonitrilas – Sigma – Aldrich, Vokietija

• Kofeino standarto reagentas – Sigma – Aldrich, Kinija • Teofilino standarto reagentas - Sigma – Aldrich, Vokietija • Teobromino standarto reagentas – Sigma – Aldrich, Vokietija

2.3 Įranga

Mėginių paruošimui reikalingus arbatžolių kiekius bei standartus medžiagoms atsverti buvo naudojamos svarstyklės Shimadzu AUW120D.

Žaliavų smulkinimui buvo naudojama elektrinė smulkintuvė.

Ekstraktų gamybai naudotas distiliuotas vanduo buvo gaminamas MILIPORE vandens gryninimo sistemoje.

Gaminant standartinius tiriamųjų junginių tirpalus, siekiant visiško medžiagų ištirpimo distiliuotame vandenyje buvo naudojama Heidolph MR Hei – Standart kaitinimo plokštė ir glicerolio (įkaitinto iki 109°C) vonelė.

Plonasluoksnės chromatografijos tyrimui skirti ekstraktai ant plokštelės buvo užnešami naudojant CAMAG Linomat 5 pusiau-automatinį mėginių užnešėją. PC analizė atlikta chromatografavimo kameroje. Gautų duomenų analizei naudotas vizualizavimo prietaisas CAMAG TLC Visualizer bei kompiuterinė VisionCATS programa.

Efektyviosios chromatografijos tyrimui naudotas WATERS 2690/5 chromatografas su fotodiodų matricos (PDA) detektoriumi.

2.4 Tyrimo objektas ir kintamųjų parinkimas

Kofeino, teofilino, teobromino kokybiniam bei kiekybiniam nustatymui pasirinkta po vieną žaliosios ir juodosios arbatos žaliavą – birias arbatžoles. Arbatžolės yra grynos, be papildomai pridėtų kvapiklių, skonio stipriklių ar kitų priemaišų. Abiejų arbatžolių kilmės šalis – Šri Lanka, Ceilono regionas. Viso tyrimo metu naudota tos pačios serijos arbata, siekiant užtikrinti rezultatų tikslumą. Arbatžolės pakuotėse fasuojamos po 100,0 g. Ant pakuočių gamintojas nurodo rekomendacijas arbatos paruošimui:

• Žaliajai arbatai – kaitinti vandenį iki 100 °C, atvėsintu iki 70 – 80 °C užpilti arbatžoles, ir vartoti po 2 min. ekstrakcijos.

• Juodajai arbatai – kaitinti vandenį iki 100 °C ir iškart užpilti arbatžoles, vartoti po 3 – 5 min. ekstrakcijos.

Tyrimui buvo naudojama biri arbata, todėl mėginiams pagaminti naudotas svoris parinktas atsižvelgiant į pakeliais fasuojamos arbatos vidutinį svorį. Mėginiams buvo sveriama po 2,500 g arbatžolių.

Pagrindiniai kintamieji, lemiantys arbatos kokybinę ir kiekybinę sudėtį yra temperatūra bei ekstrakcijos laikas, dėl to šie parametrai buvo pasirinkti.

• Temperatūra - 80 °C ir 100 °C

• Ekstrakcijos laikai – 3 min., 5 min., 10 min., 15 min.

• Po vieną žaliosios ir juodosios arbatos mėginį buvo paruošta arbatžoles užpylus distiliuotu 20 °C temperatūros vandeniu ir 22 h palikta kambario temperatūroje ekstrahuotis. Taip norėta palyginti kiekybiškai ekstrakcijos produktus, priklausomai nuo temperatūrinio faktoriaus įtakos.

2.5 Mėginių paruošimas

Tiriamiesiems tirpalams ruošti buvo naudojama ekstrakcija, kai ekstrahentu pasirinktas vanduo, norint kuo tiksliau atkartoti buitinį arbatos paruošimo metodą. Siekiant užtikrinti rezultatų tikslumą, buvo pasirinktas distiliuotas vanduo. Birios juodoji ir žalioji arbatos buvo atskirai susmulkintos elektriniu malūnėliu, siekiant padidinti ekstrakcijos paviršiaus plotą bei užtikrinti tikslesnį svėrimą [17]. Mėginiams gaminti žaliavos atsvertos po 2,500 g ir suberiamos į 100 ml tūrio kolbutes. Kaip anksčiau minėta, pasirinkti kintamieji buvo temperatūra (80 °C ir 100 °C) bei ekstrakcijos laikas (3 min., 5 min., 10 min., 15 min). Ekstraktų paruošimas skirtingomis temperatūromis buvo vykdomas šiais etapais:

1. 100 °C. Karščiui atspariose cheminėje kolbose vanduo buvo kaitinamas iki 100 °C

kiekvienam mėginiui atskirai ir po 50 ml distiliuoto vandens užpilta ant arbatžolių. Ekstrakcijos laikas sekamas chronometru, ir atitinkamai praėjus reikiamam laikui, gautas tirpalas buvo filtruojamas į 50 ml tūrio kolbą pro popierinį filtrą.

2. 80 °C. Karščiui atspariose cheminėje kolbose distiliuotas vanduo buvo kaitinamas iki

100 °C kiekvienam mėginiui atskirai, po to atvėsinamas iki 80 °C ir po 50 ml distiliuoto vandens užpilta ant arbatžolių. Ekstrakcijos laikas sekamas chronometru, ir atitinkamai praėjus reikiamam laikui, gautas tirpalas buvo filtruojamas į 50 ml tūrio kolbą pro popierinį filtrą.

3. Kambario temperatūros distiliuotas vanduo. 20 °C temperatūros vandeniu 100 ml

kolboje buvo užpiltas analogiškas kaip ir kitiem mėginiam paruošti naudotas kiekis arbatžolių, ir kambario temperatūroje, tamsioje vietoje paliktas 22 h ekstrahuotis.

2.6 Standartinių tirpalų ruošimas

Visi trys etaloniniai tirpalai buvo ruošiami iš standartinių medžiagų, gautų iš Sigma – Aldrich (Vokietija). Kiekvienam mėginiui buvo atsverta po 0,0010 g medžiagos. Kofeinas yra gerai tirpus vandenyje. Teobromino ir teofilino tirpumai vandenyje yra mažesni, iš šių medžiagų blogiausiai vandenyje tirpsta teobrominas. Dėl to tirpalai buvo papildomai šildomi ant kaitinimo plokštės

įkaitintoje glicerolio vonelėje (109 °C) iki tol, kol medžiagos pilnai ištirpo. Pagaminti tirpalai buvo naudojami kaip palyginamieji, norint kiekybiškai bei kokybiškai įvertinti tiriamas medžiagas. Kalibracinių grafikų sudarymui naudoti skirtingų koncentracijų standartinių junginių tirpalai.

2.7 Efektyviosios skysčių chromatografijos metodo sąlygos

Atlikus skirtingų metodikų literatūros apžvalgą kofeino, teobromino bei teofilino nustatymui pasirinkti chromatografijos parametrai – tirpikliais naudoti TFA (trifluoracto rūgštis) ir ACN (acetonitrilas). Pagrindiniai metodikų atrankos kriterijai tai, kad medžiagų ekstrakcijai yra naudojamas tik vanduo, be pridėtų etanolio, metanolio ar kitų medžiagų, kurios pagerintų bei padidintų ekstrakcijos produktų kiekį. Pasirinktas eliuavimo rėžimas – gradientinis. Tai reiškia, kad skirtingu laiku eliuentai yra tiekiami į chromatografą pasirinktomis koncentracijomis. (1 lentelė).

Chromatografinei analizei naudotas skysčių chromatografas Waters 2690/5 su fotodiodų matricos detektoriumi PDA 2998. Tyrimui naudota ACE C18 kolonėlė, kurios parametrai: 250 mm x 4,6 mm, sorbento dalelių dydis 5 μm. ESC analizės metu termostate palaikoma temperatūra buvo 25 °C, o tiriamųjų tirpalų injekcijos tūris – 10 µl.

Visos tiriamosios medžiagos – kofeinas, teofilinas bei teobrominas chromatografuotos vienodomis sąlygomis. Eliuentų koncentracijos – TFA 0,1 %, ACN – 100 % (grynas).

1 lentelė. Eliuacijos parametrai kofeino, teobromino ir teofilino nustatymui

Laikas, min Eliuento tėkmės greitis, ml/min TFA , % ACN, %

0-2 1,23 100 0

2-35 1,23 70 30

35-40 1,23 10 90

40-45 1,23 10 90

45-46 1,23 100 0

Kokybinis bei kiekybinis tiriamųjų medžiagų vertinimas atliktas lyginant žinomų koncentracijų etaloninių junginių sulaikymo laikus su tiriamųjų tirpalų rezultatais. Pasirinktos detekcijos ribos buvo 200 – 600 nm. Tiriamieji junginiai identifikuoti prie 270 nm šviesos bangos ilgio.

2.8 Plonasluoksnės chromatografijos metodo sąlygos

Taikant plonasluoksnės chromatografijos metodą tiriamos medžiagos buvo identifikuojamos kokybiškai. Metodas atliktas pagal C. Oellig ir kt. 2017 m. rekomendacijas [31].

Standartiniai tirpalai paruošti 100 mg/l koncentracijos, norint užtikrinti rezultato kokybinio vertinimo tikslumą. Tyrimui naudoti 100 °C 6 skirtingi tirpalai, po 3 žaliosios ir juodosios arbatos mėginių, kurių ekstrakcijos laikai buvo 5 min, 15 min, 35 min. Taip pat tirta po vieną žaliosios ir juodosios arbatos mėginį, 22 h ekstrahuotą kambario temperatūros distiliuotu vandeniu. Standartai ir mėginiai ant chromatografinės plokštelės uždėti naudojant pusiau automatinį užnešėją, 6 mm pločio juostų pavidalu.

Mobiliai fazei naudotas mišinys iš acetono/tolueno/chloroformo (4:3:3). Prieš atliekant analizę traukos spintoje paruošta tirpiklių sistema supilama į chromatogafavimo kamerą ir laikoma uždengus, kad pačioje kameroje pasklistų naudojamų lakių medžiagų garai. Į kamerą dedama plokštelė su užneštais mėginiais ir laukiama, kol sistema užkils iki pažymėtos 60 mm ribos. Po chromatografavimo plokštelė džiovinama traukos spintoje, kol išgaruoja tirpikliai.

Kokybinis rezultatų vertinimas atliekamas su vizualizavimo prietaisu bei programine įranga. Tiriamos medžiagos identifikuojamos esant mėlynai – žalios spalvos dėmėms, kurių Rf sutampa su

standartinių kofeino, teofilino bei teobromino tirpalų Rf reikšmėmis.

2.9 Duomenų analizės metodai

Atliktų kokybinių bei kiekybinių tyrimų rezultatų duomenys buvo apdorojami naudojant Microsoft Office Excel statistinį duomenų analizės paketą. Kokybinė analizė atlikta tyrimus kartojant po 3 kartus ir vedant gautų rezultatų vidurkius.

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1. ESC metodo validacija kokybiniam ir kiekybiniam junginių tyrimui

Pagal Tarptautinės harmonizacijos konferencijos reglamentuojamus parametrus, norint validuoti efektyviosios skysčių chromatografijos metodą, turi būti vertinami pagrindiniai kriterijai: specifiškumas, tiesiškumas, glaudumas ir nustatymo ir aptikimo ribos [32].

3.1.1. Specifiškumas

6 pav. Standartinių tirpalų sulaikymo laikai: 1-teobrominas, 2-teofilinas, 3-kofeinas

Vertinant ESC metodikos specifiškumą buvo lyginamos standartinių tiriamųjų medžiagų bei tiriamųjų tirpalų gautos chromatogramos. Standartų sulaikymo laikai buvo: kofeino – 21,227 min, teobromino – 15,506 min, teofilino - 17,687 min. 6 pav. pateikta chromatograma su standartinių tirpalų spektrais bei sulaikymo laikais.

Vertinant specifiškumo parametrą pastebėta, kad tiriamųjų tirpalų chromatogramos bei sulaikymo laikai yra artimi standartinių tirpalų rezultatams, todėl galima teigti, kad taikytas metodas yra specifiškas.

3.1.2. Tiesiškumas

Antrasis metodikos parametras – tiesiškumas – buvo vertinamas nustatant skirtingas kofeino, teobromino bei teofilino koncentracijas etaloninių tirpalų intervaluose: kofeinui nuo 3,125 g/ml iki 50,000 g/ml; Teobrominui nuo 2,706 g/ml iki 43,400 g/ml; Teofilinui nuo 2,294 g/ml iki 36,700 g/ml.

Tiriamoms medžiagom sudarytos kalibracinės kreivės, pateiktos 7, 8, 9 pav. Gautos kalibracinių kreivių lygtys bei koreliacijos koeficientai R pateikti 3 lentelėje. Mažiausias rekomenduojamas taškų skaičius kalibracinei kreivei sudaryti yra 5, tiek taškų ir buvo naudojama visoms tiriamosioms medžiagoms tirti. Vienas iš apskaičiuojamų rodiklių – koreliacijos koeficientas R parodo tiesinės priklausomybės stiprumą. Tiksliausi duomenys gaunami, kai jis yra artimas 1.

2 lentelė. Tiesiškumo parametrai

Analitės pavadinimas Koreliacijos Kalibracinės kreivės lygtis Kalibracinei kreivei koeficientas

sudaryti naudoti taškai Kofeinas (9 pav.) 0,999968469 y=6,234295*103_{*x + 4,949331*10}3 ₅

Teobrominas (10 pav.) 0,99998137 y=4,038162*103*x + 8,9867155*103 5 Teofilinas (11 pav.) 0,99997266 y=9,239289*103*x + 2,5478644*104 5

Kofeino, teobromino bei teofilino tyrimo atvejais koreliacijos koeficientai yra didesni, negu 0,99 ir yra labai artimi 1, tai parodo stiprią tiesinės priklausomybės reikšmę tarp smailė plotų bei tirpalų koncentracijų.

7 pav. Kofeino kalibracinė kreivė

8 pav. Teobromino kalibracinė kreivė 28

9 pav. Teofilino kalibracinė kreivė

Įvertinus šiuos rodiklius, galima teigti, kad naudota ESC metodika pasižymi tiesiškumu, ir yra tinkama vertinti junginius kokybiškai bei kiekybiškai.

3.1.3. Glaudumas

Trečiasis parametras – glaudumas buvo vertinamas apskaičiuojant gautų rezultatų atkuriamumą bei pakartojamumą. Tai rodo gautų rezultatų tikslumą ir vienodumą, atliekant analizę esant toms pačioms sąlygoms. Kiekybiniam tyrimui SSN neturi viršyti 5 %.

Pakartojamumo tyrimui naudoti etaloniniai tirpalai buvo tiriami 2 kartus tą pačią dieną. Atkuriamumo kriterijui tirpalai buvo tiriami 2 dienas iš eilės, analizę atliekant tomis pačiomis sąlygomis. Vertinimo kriterijus atkuriamumui bei pakartojamumui – SSN (santykinis standartinis nuokrypis). Gauti rezultatai pateikiami lentelėje:

3 lentelė. Glaudumo nustatymo parametrai

Tiriamas junginys Pakartojamumas Atkuriamumas SSN (%) SSN (%) Kofeinas 0,1 0,1 Teobrominas 0,1 0,2 Teofilinas 0,1 0,2 29

Remiantis gautais rezultatais galima teigti, jog pasirinkta ESC metodika atitinka glaudumo parametrui keliamus kriterijus (ne daugiau 5 %) kiekybiniam kofeino, teobromino ir teofilino įvertinimui.

3.1.4. Nustatymo ir aptikimo ribos

Validacijos metu buvo nustatytos kofeino, teobromino ir teofilino nustatymo ir aptikimo ribos. Rezultatai pateikiami lentelėje:

4 lentelė. Nustatymo ribų parametrai

Tiriamas junginys

Koncentracija μg/ml

Aptikimo riba Nustatymo riba

Kofeinas 0,20 0,06

Teobrominas 0,17 0,07

Teofilinas 0,14 0,05

Apibendrinant, buvo vertinami keturi naudotos metodikos validacijai reikalingi parametrai: specifiškumas, tiesiškumas, preciziškumas bei nustatymo ir aptikimo ribos. Galima teigti, kad pasirinkta metodika atitinka visus reikalavimus, rodikliai yra normos ribose. Validuota metodika vėliau buvo pritaikyta tiriamųjų mėginių kokybiniam ir kiekybiniam sudėties vertinimui.

3.2. Tiriamųjų tirpalų kokybinis ir kiekybinis vertinimas ESC analizės metodu

Norint kokybiškai ir kiekybiškai įvertinti pagamintų žaliosios ir juodosios arbatų tirpalus buvo naudojamas validuotas efektyviosios skysčių chromatografijos metodas. Analizei pasirinkta tirti po 9 kiekvienos rūšies arbatos mėginius, pagamintus skirtingomis sąlygomis. Kiekybiškai ir kokybiškai vertintos medžiagos – kofeinas, teobrominas ir teofilinas. Kiekvienas mėginys buvo tiriamas tris kartus, ir vedamas vidurkis, norint užtikrinti rezultatų patikimumą ir tikslumą. 10 pav. pateikiama vieno iš mėginių chromatograma, su identifikuotų junginių spektrais. Identifikavimui gauti analičių sulaikymo laikai lyginti su standartinių tirpalų analičių sulaikymo laikais.

10 pav. Juodosios arbatos (5 min;70 °C) mėginio chromatograma 1-teobrominas, 2-teofilinas, 3-kofeinas

Atlikus tyrimą buvo vertinama žalioji ir juodoji arbatos atskirai, išskiriant pagal arbatžolių ekstrakcijai naudoto distiliuoto vandens temperatūrą.

Pirmiausia pasirinkti juodosios arbatos tirpalai, pagaminti naudojant 70 °C vandenį. Ekstrakcijos laikas – 3 min, 5 min, 10 min ir 15 min.

11 pav. Kofeino, teobromino ir teofilino kiekis (g/ml) tirtuose juodosios arbatos (70 °C) preparatuose

Vertinant 11 pav. pateiktus rezultatus matoma, kad , esant 70 °C, kofeino, teobromino ir teofilino kiekiai didžiausi nustatyti tame pačiame mėginyje, kurio ekstrakcijos laikas buvo 15 min. Nustatyti kiekiai buvo: kofeino 2494,05 g/ml, teobromino - 159,754 g/ ml, teofilino - 18,994 g/ml. Likusiuose preparatuose kiekiai varijavo ribose: kofeino 2432,543 g/ml – 1403,827 g/ml; teobromino 152,757 g/ml – 86,492 g/ml; teofilino nustatyti maži kiekiai, jo kiekis mėginiuose

varijavo nuo 15,07 g/ml iki 7,743 g/ml. Mažiausi kiekiai visų tiriamų medžiagų buvo nustatyti mėginyje, kurio ekstrakcijos laikas - 10 min.

12 pav. Kofeino, teobromino ir teofilino kiekis (g/ml) tirtuose juodosios arbatos (100 °C) preparatuose

Esant didesnei, 100 °C temperatūrai, juodosios arbatos mėginiuose buvo nustatytos visos trys tiriamosios medžiagos. (12 pav.) Tačiau didžiausi kiekiai junginių buvo nustatyti skirtinguose mėginiuose – daugiausia kofeino (2044,957 g/ml) ir teobromino (125,377 g/ml) nustatyta, kai ekstrakcijos laikas buvo 5 min, o teofilino didžiausias kiekis (10,359 g/ml) nustatytas mėginyje, kurio ekstrakcijos laikas – 15 min.

Vienas iš mėginių buvo paruoštas naudojant kambario temperatūros distiliuotą vandenį ir tirpalas paliktas ekstrahuotis 22 h. Lentelėje palyginti didžiausi kiekiai juodosios arbatos tirpaluose nustatyti kiekiai, esant skirtingoms temperatūroms su kambario temperatūros mėginio rezultatais:

5 lentelė. Didžiausi nustatyti tiriamųjų junginių kiekiai (g/ml) juodoje arbatoje, palyginti su kambario temperatūros sąlygom ekstrahuoto mėginio rezultatais

Junginys 70°C 100°C Kambario t°

Kofeinas 2494,058 2044,957 1417,129

Teobrominas 159,754 125,377 99,572

Teofilinas 18,994 10,359 9,485

Matoma, kad didžiausias tiriamųjų medžiagų kiekis, lyginant skirtingomis temperatūromis paruoštus juodosios arbatos tirpalus, nustatomas, kai ekstrahentu naudojamas 70 °C distiliuotas vanduo (ekstrakciją atliekant 15 min). Nors ekstrakciją atliekant kambario temperatūros vandeniu, visos trys tiriamos medžiagos yra identifikuojamos, didžiausi skirtumai kiekybiškai matomi kofeino koncentracija.

Tiriant žaliąją arbatą ekstrakcijos sąlygos buvo taikomos tokios pat, kaip ir juodajai arbatai – ekstrakcijos laikai 3 min, 5 min, 10 min ir 15 min, vandens temperatūra – 70 °C ir 100 °C. Vienas mėginys 22 h paliktas ekstrakcijai kambario temperatūros distiliuotu vandeniu.

13pav. Kofeino ir teobromino kiekis (g/ml) tirtuose žaliosios arbatos (70°C) preparatuose Stebint grafiškai 13 pav. iliustruotus rezultatus, esant 70 °C, matoma, jog nei viename mėginyje nebuvo nustatytas teofilinas. Kitų junginių didžiausia koncentracija nustatyta viename mėginyje – kai ekstrakcijos laikas 3 min.: kofeino – 2696,544 g/ml, teobromino - 89,598 g/ml.

14 pav. Kofeino ir teobromino kiekis (g/ml) tirtuose žaliosios arbatos (100 °C) preparatuose Pakeitus vieną iš parametrų – temperatūrą – į 100 °C, teofilino taip pat nebuvo nustatyta nei viename tirpale (14 pav.). Kofeino ir teobromino didžiausi kiekiai, atitinkamai 2596,522 g/ml ir 86,178 g/ml rasti viename mėginyje – kai ekstrakcijos laikas buvo 10 min. Matomi dideli skirtumai tarp junginių kiekių, kofeino kiekis likusiuose mėginiuose varijuoja plačiu intervalu – nuo 1282,605 g/ml iki 963,934 g/ml. Teobromino – antrame pagal kiekį mėginyje teobromino koncentracija skyrėsi daugiau nei du kartus. Kituose kiekis skyrėsi dar daugiau. Tai ryškiai parodo tinkamiausią ekstrakcijos laiką, kai naudojamo vandens temperatūra yra 100°C.

Kaip anksčiau minėta, vienas mėginys buvo paruoštas ekstrahentu naudojant kambario temperatūros distiliuotą vandenį, ekstrakciją vykdant 22 h iki chromatografavimo. Gauti rezultatai palyginti su didžiausiais nustatytais teobromino ir kofeino kiekiais skirtingomis temperatūromis 7 lentelėje:

6 lentelė. Didžiausi nustatyti tiriamųjų junginių kiekiai(g/ml) žalioje arbatoje, palyginti su kambario temperatūros sąlygomis ekstrahuoto mėginio rezultatais

Junginys 70°C 100°C Kambario t°

Kofeinas 2696,544 2596,522 2045,26

Teobrominas 89,598 86,178 73,899

Teofilinas 0 0 2,821

Palyginus skirtingomis temperatūromis pagamintuose žaliosios arbatos tirpaluose nustatytus junginių kiekius matoma, jog kofeino ir teobromino didžiausi kiekiai nustatyti, kai ekstrakcijai naudojamo vandens temperatūra yra 70 °C, o ekstrakcijos laikas – 3 min. Įdomu tai, kad vieninteliame mėginyje – pagamintame naudojant kambario temperatūros vandenį – nustatytas teofilinas. Kitų medžiagų – kofeino ir teobromino kiekiai, skiriasi, tačiau iki 25 % ribose.

Apibendrinant tyrimo rezultatus, galima teigti, kad juodajai arbatai tinkamiausios sąlygos yra, kai ekstakcijai naudojamo vandens temperatūra yra 70 °C, o ekstrakcijos laikas – 15 min. Anot gamintojo, rekomenduojama juodąją arbatą ruošti 100 °C vandeniu, o ekstrakcijos laiką pasirinkti 3-5 min. Žaliosios arbatos paruošimui, tinkamiausios sąlygos kiekybiškai ekstrahuoti daugiausia kofeino ir teobromino yra vandens temperatūrą pasirinkus 70 °C, kai ekstrakcijos laikas – 3 min. Teofilinas žaliosios arbatos mėginiuose nustatytas tik ekstrakciją vykdant kambario temperatūros vandeniu.

3.3. Kokybinis teobromino, teofilino ir kofeino identifikavimas mėginiuose,

taikant plonasluoksnės chromatografijos analizės metodą

Tiriamųjų junginių juodosios bei žaliosios arbatos vandeniniuose ekstraktuose kokybiniam nustatymui pasirinktas plonasluoksnės chromatografijos metodas, remiantis 2017 m. atliktu efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodu su Matės arbatos turinčiais gaiviaisiais gėrimais [31]. Gauti rezultatai buvo analizuojami lyginant standartinių teobromino, teofilino bei kofeino tirpalų sulaikymo faktorius (Rf) su tiriamųjų tirpalų sulaikymo faktoriais.

Standartiniai tirpalai buvo paruošti 100 mg/l koncentracijos stiprumo. C. Oellig ir kt. [31] taikyto tyrimo metu PC plokštelė buvo apipurškiama magnio chlorido vandeniniu tirpalu. Šis žingsnis yra atliekamas dėmių sukoncentravimui padidinti. Kadangi plonasluoksnės chromatografijos metodas pasirinktas įvertinti tiriamąsias medžiagas tik kokybiškai, buvo nuspręsta apipurškimo atsisakyti.

Atliekant tyrimą kaip tirpiklį naudojant distiliuotą vandenį, o mobilia faze pasirinkus acetoną/tolueną/chloroformą (4:3:3) gauta teobromino, teofilino bei kofeino tapatybę įrodanti chromatograma(15pav).

15pav. Kokybinio kofeino, teofilino ir teobromino nustatymo plonasluoksnės chromatografijos metodu chromatograma. Skaitinės reikšmės simbolizuoja tiriamuosius mėginius.

Tiriamieji mėginiai chromatogramoje išdėstyti tokia tvarka: A – kofeino standartinis tirpalas

B – teofilino standartinis tirpalas C – teobromino standartinis tirpalas

1 – arbata – juodoji , t° = kambario temperatūros, T = 22 h 2 – arbata – juodoji , t° = 100 °C , T = 5 min

3 – arbata – juodoji , t° = 100 °C, T = 15 min 4 – arbata – juodoji , t° = 100 °C, T = 35 min

5 – arbata – žalioji , t° = kambario temperatūros, T = 22 h 6 – arbata – žalioji , t° = 100 °C, T = 5 min

7 – arbata – žalioji , t° = 100 °C, T = 15 min 8 – arbata – žalioji , t° = 100 °C, T = 35 min

Standartinių tirpalų sulaikymo faktorių reikšmės buvo: • Kofeino Rf1 = 0,4

• Teofilino Rf2 = 0,27

• Teobromino Rf3 = 0,21

Atskyrimas atliktas esant 254 nm šviesos bangos ilgiui.

Kofeino, teobromino bei teofilino identifikacijai buvo paskaičiuojami tiriamųjų tirpalų sulaikymo faktoriai, ir lyginami su standartinių tirpalų reikšmėmis. Kofeinas nustatytas visuose mėginiuose, o teofilinas – nei viename iš tiriamųjų tirpalų. Teofilino palyginamasis tirpalas buvo gaminamas didesnės koncentracijos, negu buvo nustatyta mėginiuose ESC kokybinės analizės metodu. Tai lėmė tai, kad palyginamasis tirpalas chromatogramoje identifikuotas, o mėginiuose – ne. Teobrominas nustatytas visuose juodosios arbatos tirpaluose, o iš žaliosios arbatos mėginių tik viename – kai ekstrahuojama buvo 35 min 100 °C. Gauti kokybinio tyrimo rezultatai pateikiami 2 lentelėje:

7 lentelė. Plonasluoksnės chromatografijos tyrimu identifikuotų junginių rezultatai su nustatytomis Rf reikšmėmis Junginys/Mėginio Nr. Standartas 1 2 3 4 5 6 7 8 Kofeinas (A) + (0,400) + (0,396) + (0,397) + (0,399) + (0,398) + (0,399) + (0,399) + (0,402) + (0,405) Teofilinas (B) + (0,270) – – – – – – – – Teobrominas (C) + (0,210) + (0,203) + (0,208) + (0,211) + (0,213) – – – + (0,218) 36

3.4. Juodosios ir žaliosios arbatų sudėčių palyginimas

Kokybiškai ir kiekybiškai įvertinus juodąją ir žaliąją arbatas atskirai, galime palyginti gautus rezultatus tarpusavyje.

Remiantis kokybiniais plonasluoksnės chromatografijos tyrimo rezultatais galime teigti, kad kofeinas buvo nustatytas visuose mėginiuose, teofilinas – nei viename (dėl mažos koncentracijos nebuvo galima identifikuoti kokybiškai). Teobrominas nustatytas visuose juodosios arbatos mėginiuose, ir tik viename žaliosios arbatos mėginyje. Tai rodo, kad juodojoje arbatoje teobromino yra didesnė koncentracija, negu žaliojoje arbatoje.

Vertinant efektyviosios skysčių chromatografijos tyrimo rezultatus, lyginimas yra tikslesnis, nes galima kofeino, teobromino ir teofilino koncentracijas palyginti ir kokybiškai, ir kiekybiškai. 8 lentelėje yra palyginti mėginiai, kuriuose nustatytos didžiausios tiriamų medžiagų koncentracijos.

8 lentelė. Žaliosios ir juodosios arbatų kokybinių ir kiekybinių (g/ml) sudėčių palyginimas Žalioji arbata (70 °C, 3 min) Juodoji arbata (70 °C, 15 min)

Kofeinas 2696,544 2494,058

Teobrominas 89,598 159,754

Teofilinas _{0 18,994}

Palyginus ESC rezultatus, galima teigti, kad didesnis kofeino kiekis yra nustatomas žaliojoje arbatoje, tačiau teobromino ir teofilino kiekiai didesni juodojoje arbatoje.

IŠVADOS

1. Parinkta plonasluoksnės chromatografijos metodika pritaikyta kokybiniam kofeino, teobromino ir teofilino nustatymui vandeniniuose arbatos tirpaluose. Tirpiklių sistema, sudaryta iš acetono/tolueno/chloroformo (4:3:3) yra tinkama visų tiriamųjų medžiagų identifikavimui, remiantis etaloninių tirpalų tyrimo rezultatais.

2. Pritaikius tinkamą PC metodiką, visuose tiriamuosiuose tirpaluose buvo nustatytas kofeinas, teobrominas buvo identifikuotas visuose juodosios arbatos tirpaluose (ekstrakcijos laikai – 5 min, 15 min, 35min ir 22h (su kambario temperatūros vandeniu)) ir viename žaliosios arbatos mėginyje - 22h ekstrahuotame kambario temperatūros vandeniu. Teofilinas nebuvo nustatytas dėl per mažos koncentracijos mėginiuose.

3. Validuota efektyviosios skysčių chromatografijos metodika kofeino, teobromino ir teofilino kokybinei ir kiekybinei analizei, įvertinus tiesiškumo, specifiškumo, ribų ir glaudumo parametrus.

4. Pritaikius ESC metodiką nustatyta, kad juodosios arbatos paruošimui tinkamiausios sąlygos yra naudojant 70 °C vandenį ir ekstrahuojant 15 min. Esant šioms sąlygom, kofeino, teobromino ir teofilino koncentracijos yra didžiausios, atitinkamai: 2494,058 g/ml, 159,754 g/ml, 18,994 g/ml.

5. Pritaikius validuotą ESC metodiką nustatyta, kad žaliojoje arbatoje tiriamųjų junginių koncentracija yra didžiausia, kai ekstrakcijai naudojamas 70 °C vanduo ir ekstrahuojama 3 min. Esant šioms sąlygom, nustatytos koncentracijos: kofeino - 2696,544 g/ml, teobromino - 89,598 g/ml. Teofilinas nustatytas tik viename – kambario temperatūros vandeniu 22 h ekstrahuotame mėginyje (2,821 g/ml).

6. Tarpusavyje palyginus juodosios ir žaliosios arbatų mėginius, kuriuose buvo nustatyti didžiausios koncentracijos kofeino, teobromino ir teofilino galima teigti, jog kofeino daugiau yra žaliojoje arbatoje (2696,544 g/ml  2494,058 g/ml), teobromino koncentracija yra didesnė juodojoje arbatoje (89,598 g/ml  159,754 g/ml), o teofilino nustatyta tik juodosios arbatos mėginyje (18,994 g/ml).

PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS

1. Validuotas efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodas yra tinkamas kokybiniam ir kiekybiniam juodosios ir žaliosios arbatų vandeninių tirpalų įvertinimui, nustatant žaliavose esančius kofeiną, teobrominą ir teofiliną.

2. Kadangi daugiausia arbatos paruošiama buitiniu būdu, kaip ekstrahentą naudojant vandenį, o dažnai nėra atsižvelgiama į tai, kokios temperatūros vanduo yra naudojamas, ir kiek laiko yra paliekama arbata ekstrahuotis. Todėl buvo nustatytos tinkamiausios sąlygos juodosios ir žaliosios arbatų paruošimui, norint išgauti didžiausius kiekius kofeino, teobromino ir teofilino. Į tai reikėtų atsižvelgti ruošiant skirtingų rūšių arbatas.

3. Tyrimo metu buvo nustatyta tik viena junginių grupė, nustatoma juodojoje ir žaliojoje arbatose. Tolimesni tyrimai galėtų būti skirti nustatymui, kokios sąlygos yra tinkamiausios (kaip

kintamuosius taip pat pasirinkus temperatūrą bei ekstrakcijos trukmę), norint išgauti

didžiausius kiekius kitų junginių grupių (pavyzdžiui, katechinų), kurios lemia arbatos žaliavos farmakologinį poveikį. Gautus rezultatus palyginti su šio tyrimo rezultatais ir padaryti

apibendrintas išvadas apie optimaliausias sąlygas arbatos paruošimui buitinėmis sąlygomis. 39

LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. Barragan Ferrer D, Maželienė Ž, Barragan Ferrer JM, Morkutė V, Bladaitytė E, Viliušienė I, Čepulkauskienė v. Juodosios arbatos kokybinis vertinimas pagal fenolinių junginių kiekį, antiradikalinį ir antimikrobinį aktyvumą. Žurnalas „Sveikatos mokslai“ 2017, 27 tomas, Nr. 6, p. 12-16

2. Hu B, Wang L, Zhou B, Zhang X, Sun Y, Ye H, Zhao L, Hu Q, Wang G, Zeng X. Efficient procedure for isolating methylated catechins from green tea and effective simultaneous analysis of ten catechins, three purine alkaloids, and gallic acid in tea by high-performance liquid chromatography with diode array detection. Journal of Chromatography A. 2009 Apr 10;1216(15):3223-31.

3. Zakir M. Review on Tea (Camellia sinensis) Research Achievements, Challenges and Future Prospective Including Ethiopian Status. International Journal of Forestry and Horticulture (IJFH) Volume 3, Issue 4, 2017, p. 27-39.

4. Gebrewold AZ. Review on integrated nutrient management of tea (Camellia sinensis L.). Cogent Food & Agriculture. 2018 Jan 1;4(1):1543536.

5. Meegahakumbura MK, Wambulwa MC, Thapa KK, Li MM, Möller M, Xu JC, Yang JB, Liu BY, Ranjitkar S, Liu J, Li DZ. Indications for three independent domestication events for the tea plant (Camellia sinensis (L.) O. Kuntze) and new insights into the origin of tea germplasm in China and India revealed by nuclear microsatellites. PloS one. 2016 May 24;11(5):e0155369.

6. Namita P, Mukesh R, Vijay KJ. Camellia sinensis (green tea): A review. Global journal of pharmacology. 2012;6(2):52-9.

7. Ross IA. Medicinal plants of the world, volume 3: Chemical constituents, traditional and modern medicinal uses. Springer Science & Business Media; 2007 Oct 28.

8. Chacko SM, Thambi PT, Kuttan R, Nishigaki I. Beneficial effects of green tea: a literature review. Chinese medicine. 2010 Dec;5(1):13.

9. Daglia M, Antiochia R, Sobolev AP, Mannina L. Untargeted and targeted methodologies in the study of tea (Camellia sinensis L.). Food Research International. 2014 Sep 1;63:275-89.

10. Kuhnert N. Unraveling the structure of the black tea thearubigins. Archives of biochemistry and biophysics. 2010 Sep 1;501(1):37-51.

11. Misra H, Mehta D, Mehta BK, Soni M, Jain DC. Study of extraction and HPTLC-UV method for estimation of caffeine in marketed tea (Camellia sinensis) granules. International Journal of Green Pharmacy (IJGP). 2009;3(1).

12. Li S, Lo CY, Pan MH, Lai CS, Ho CT. Black tea: chemical analysis and stability. Food & function. 2013;4(1):10-8.