LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
Indrė Šveikauskaitė
NEŠIKLIŲ PRIGIMTIES BEI FIZINIŲ
IR CHEMINIŲ AKTYVIKLIŲ ĮTAKOS
AMOROLFINO IR NAFTIFINO
PERNAŠAI Į ŽMOGAUS NAGĄ
VERTINIMAS
Daktaro disertacija Medicinos ir sveikatos mokslai,farmacija (M 003)
Disertacija rengta 2014–2019 metais Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademijos Klinikinės farmacijos katedroje.
Mokslinis vadovas
prof. dr. Vitalis Briedis (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Medi-cinos akademija, mediMedi-cinos ir sveikatos mokslai, farmacija – M 003).
Disertacija ginama Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmacijos mokslo krypties taryboje:
Pirmininkė
prof. dr. Lina Raudonė (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Medi-cinos akademija, mediMedi-cinos ir sveikatos mokslai, farmacija – M 003).
Nariai:
prof. dr. Sonata Trumbeckaitė (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Medicinos akademija, medicinos ir sveikatos mokslai, farmacija – M 003);
prof. dr. Skaidra Valiukevičienė (Lietuvos sveikatos mokslų universi-tetas, Medicinos akademija, medicinos ir sveikatos mokslai, medicina – M 001);
prof. dr. Vytas Martynaitis (Kauno technologijos universitetas, techno-logijos mokslai, chemijos inžinerija – T 005);
prof. dr. Ruta Muceniece (Latvijos universitetas, medicinos ir sveikatos mokslai, farmacija – M 003).
Disertacija ginama viešame Farmacijos mokslo krypties tarybos posėdyje 2019 m. rugpjūčio 30 d. 10 val. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto „Santakos“ slėnio Naujausių farmacijos ir sveikatos technologijų centro A – 203 auditorijoje.
Disertacijos gynimo vietos adresas: Sukilėlių pr. 13, LT-50162 Kaunas, Lietuva.
LITHUANIAN UNIVERSITY OF HEALTH SCIENCES MEDICAL ACADEMY
Indrė Šveikauskaitė
EVALUATION OF CARRIER TYPE,
PHYSICAL AND CHEMICAL
ENHANCERS FOR TRANSUNGUAL
DELIVERY OF AMOROLFINE
AND NAFTIFINE
Doctoral Dissertation Medical and Health Sciences,
Pharmacy (M 003)
Dissertation has been prepared at the Department of Clinical Pharmacy of Faculty of Pharmacy of Medical Academy of Lithuanian University of Health Sciences during the period of 2014–2019.
Scientific Supervisor
Prof. Dr. Vitalis Briedis (Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Medical and Health Sciences, Pharmacy – M 003).
Dissertation is defended at the Pharmacy Research Council of the Lithuanian University of Health Sciences.
Chairperson
Prof. Dr. Lina Raudonė (Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Medical and Health Sciences, Pharmacy – M 003).
Members:
Prof. Dr. Sonata Trumbeckaitė (Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Medical and Health Sciences, Pharmacy – M 003);
Prof. Dr. Skaidra Valiukevičienė (Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Medical and Health Sciences, Medicine – M 001);
Prof. Dr. Vytas Martynaitis (Kaunas University of Technology, Tech-nological Sciences, Chemical Engineering – T 005);
Prof. Dr. Ruta Muceniece (University of Latvia, Medical and Health Sciences, Pharmacy – M 003).
Dissertation will be defended at the open session of the Pharmacy Research Council of the Lithuanian University of Health Sciences at 10 a. m. on the 30th of August 2019 in A-203 auditorium of “Santaka” Valley Center for the Advanced Pharmaceutical and Health Technologies of Lithuanian University of Health Sciences.
TURINYS
SANTRUMPOS ... 7
ĮVADAS... 8
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 13
1.1. Skvarbos į nagą procesų modeliavimas ... 13
1.1.1. Sveiko ir onichomikozės pažeisto nago struktūra ... 13
1.1.2. Alternatyvūs nago modeliai ... 16
1.1.3. Skvarbos į nago plokštelę aktyvinimas ... 17
1.2. Farmacinės formos, vartojamos ant nago ... 19
1.2.1. Nagų lakai ir jų pritaikymas vaistinių medžiagų skvarbai ... 20
1.2.2. Koloidinių sistemų pritaikymas skvarbai į nagą ... 22
1.2.3. Pusiau kietų farmacinių formų pritaikymas skvarbai į nagą .. 23
1.3. Vietinio poveikio farmacinių formų biofarmaciniai tyrimai ... 24
1.3.1. Vaistinių medžiagų in vitro atpalaidavimo tyrimai ... 24
1.3.2. Vaistinių medžiagų ex vivo skvarbos į nagą tyrimai ... 25
1.4. Amorolfino hidrochlorido ir naftifino hidrochlorido fizikinės–cheminės savybės ir biologinis poveikis ... 26
2. TYRIMŲ OBJEKTAS IR METODAI ... 29
2.1. Tyrimų objektas ... 29
2.2. Reagentai, medžiagos ir priemonės ... 29
2.3. Tyrimų metodai ir metodikos ... 30
2.3.1. Amorolfino hidrochlorido kiekybinis nustatymas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu ... 30
2.3.2. Naftifino hidrochlorido kiekybinis nustatymas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu ... 31
2.3.3. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos pritaikymas ir validacija amorolfino hidrochlorido kiekybiniam nustatymui ... 31
2.3.4. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos pritaikymas ir validacija naftifino hidrochlorido kiekybiniam nustatymui ... 35
2.3.5. Amorolfino hidrochlorido ir naftifino hidrochlorido tirpumo nustatymas ... 38
2.3.6. Nagų lakų gamyba ... 38
2.3.7. Nagų lakų kokybinių parametrų tyrimas ... 39
2.3.8.Amorolfino hidrochlorido ir naftifino hidrochlorido atpalaidavimo iš nagų lakų in vitro tyrimai ... 40
2.3.9. Mikroemulsijų formulavimas ... 40
2.3.11. Cheminių skvarbos aktyviklių į nagą vertinimas ir
atranka ... 41
2.3.12. Fizinių skvarbos aktyviklių į nagą vertinimas ... 42
2.3.13. Ex vivo skvarbos į nagą tyrimai ... 43
2.3.14. Statistinis duomenų vertinimas ... 45
3. REZULTATAI ... 46
3.1. Nagų lakų modeliavimas ir optimizavimas ... 46
3.1.1. Amorolfino hidrochlorido nagų lakų sudėties optimizavimas ... 49
3.1.2. Naftifino hidrochlorido nagų lakų sudėties optimizavimas ... 53
3.2. Mikroemulsijų pritaikymas amorolfino HCl ir naftifino HCl skvarbai į nagą ... 58
3.2.1. Mikroemulsijų su amorolfino HCl ir naftifino HCl formulavimas ... 58
3.2.2. Mikroemulsijų reologiniai tyrimai ... 60
3.2.3. Mikroemulsijų pritaikymas vaistinių medžiagų tiekimui į nagą ex vivo ... 62
3.3. Skvarbą į nagą gerinančių medžiagų atranka ... 63
3.4.Amorolfino hidrochlorido skvarbos į nagą procesų modeliavimas ... 66
3.5. Naftifino hidrochlorido skvarbos į nagą procesų modeliavimas ... 71
IŠVADOS ... 76
REKOMENDACIJOS ... 77
BIBLIOGRAFIJOS SĄRAŠAS ... 78
DISERTACIJOS TEMA PASKELBTŲ PUBLIKACIJŲ SĄRAŠAS ... 91
SUMMARY ... 110
PRIEDAI ... 129
CURRICULUM VITAE ... 133
SANTRUMPOS
DMSO – dimetilsulfoksidas
ESC – efektyvioji skysčių chromatografija FTIR – Furjė transformacinė spektroskopija LoD – aptikimo riba (angl. Limit of Detection)
LoQ – kiekybinio nustatymo riba (angl. Limit of Quantitation) PDI – polidispersiškumo indeksas
PEG 400 – polietilenglikolis 400 PEG 1500 – polietilenglikolis 1500 PG – propilenglikolis R2 – determinacijos koeficientas Rt – sulaikymo laikas MJ – megadžaulis
SSN – santykinis standartinis nuokrypis
TOWL – vandens, esančio nage, praradimo koeficientas (angl. Transungual Water Loss)
VDD – vidutinis dalelių dydis UG – ultragarsas
ĮVADAS
Biologinių barjerų struktūra ir specifiškumas turi įtakos vaistinių me-džiagų skvarbai ir biologiniam pasisavinimui. Kuriant efektyvius vietinio poveikio preparatus, svarbu naudoti patikimus ir atkuriamus modelius, kurie gebėtų atkartoti natūralių barjerų savybes. Skvarbos tyrimuose papildomu iššūkiu tampa barjerų pokyčiai patologijų metu – žmogaus nagas yra vienas iš natūralių barjerų, kintantis infekcijų metu ir sukuriantis papildomas veiks-mingos terapijos rizikas.
Onichomikozė (nagų grybelis) – nago guolio ar nago plokštelės grybelinė užkrečiama liga, sudaranti maždaug 50 proc. visų nagų ligų atvejų pasaulyje ir paveikianti apytiksliai 14 proc. visos populiacijos [33, 130]. 70–80 proc. visų onichomikozės atvejų sąlygoja Trichophyton rubrum ir Trichophyton
interdigitale dermatofitai, maždaug 5 proc. – Candida albicans [93].
Seny-vame amžiuje onichomikoze susergama dažniau dėl imuninio atsako su-silpnėjimo bei degeneratyvinių ir metabolinių pokyčių [7, 64]. Negydoma onichomikozė progresuoja ir tampa lėtine liga, pažeidžiančia visus kojų nagus bei aplinkinę odą.
Nagų grybelis gali būti gydomas vaistais per os, išoriškai arba kombi-nuojant abu gydymo metodus [47]. Gydymas per os laikomas efektyviausiu, tačiau ilgas (mažiausiai 6 mėn.) vaistų vartojimas gali sąlygoti hepatotok-siškumą, sunkias nepageidaujamas reakcijas, sąveikas su kitais vartojamais vaistais, yra netinkamas nėštumo ir žindymo laikotarpiu [78].
Onichomikozės vietinis gydymas trunka 12–18 mėn., jo efektyvumas siekia iki 50 proc. [130], tačiau užfiksuojama mažiau nepageidaujamų reak-cijų, mažesnė sąveikų su kitais vaistais tikimybė, o gydymas gali būti ski-riamas visoms pacientų grupėms [32]. Vietinį infekcijos gydymą apsunkina nago struktūra – tai vienas tvirčiausių hidrofilinėmis savybėmis pasižymin-čių barjerų žmogaus organizme, sudarytas iš 80 proc. keratino. Keratino mo-lekulės yra susijungusios disulfidiniais ryšiais, sąlygojančiais nago plokš-telės tvirtumą ir ribotą lipofilinių priešgrybelinių medžiagų pralaidumą [9, 156]. Pernašai per nagą įtakos turi vaistinių medžiagų lipofiliškumas, ribota farmacinės formos sąveika su nago paviršiumi, skirtingas vaistinės medžia-gos ir nago keratino giminiškumas [68, 146].
Vaistinių medžiagų skvarbai į nago sluoksnius didelę įtaką daro naudo-jamos nešiklių sistemos. Dėl sukuriamo vaistinės medžiagos rezervuaro nage bei didelio pernašos gradiento, nagų lakai laikomi viena tinkamiausių farmacinių formų, skirtų naudoti ant nago paviršiaus [3]. Nano- ir mikro-struktūriniai nešikliai gali pagerinti veikliųjų medžiagų skvarbą į nago sluoksnius, tačiau su nago paviršiumi gali sąveikauti tik ribotą laiką dėl skystos farmacinės formos ypatybių.
Siekiant užtikrinti priešgrybelinių veikliųjų medžiagų fungicidines ir fun-gistatines koncentracijas nago sluoksniuose, taikomi mechaniniai, cheminiai ir fiziniai aktyvinimo metodai, kurie priklausomai nuo mechanizmo, gali su-kelti skirtingus nago barjero pokyčius: jonoforezės, fototerapijos bei ultra-garso sukeliami nago plokštelės pokyčiai yra grįžtami [9], lazerio spindu-liuotės panaudojimas nago struktūroje sukuria mikrokanalus [86], o che-minės medžiagos gali sąlygoti nago ėsdinimą (tioglikolio rūgštis), suminkš-tėjimą (urėja, salicilo rūgštis), brinkimą (polietilenglikoliai) [96].
Tiriamajame darbe buvo pasirinktos dvi modelinės vaistinės medžiagos: amorolfinas ir naftifinas, pasižyminčios dermatofitus veikiančiu priešgry-beliniu poveikiu [45]. Medicinos praktikoje yra naudojama amorolfino hidrochlorido preparatų, skirtų vartoti ant nago bei naftifino hidrochlorido preparatų, skirtų odos grybelinėms ligoms gydyti. Nago hidrofilinės savybės bei amorolfino ir naftifino lipofiliškumas sąlygoja ribotą jų skvarbą į gilesnius nago sluoksnius. Siekiant gerinti modelinių vaistinių medžiagų skvarbą į nagą, įvertintos skirtingų nešiklių – nagų lakų ir mikroemulsijų – pritaikymo galimybės.
Vykdytų tyrimų metu buvo modeliuojami ir tiriami nagų lakai ir mikro-emulsijos, į kurias įterpti amorolfinas ir naftifinas bei įvertinta pagamintų nešiklių kokybė ir suderinamumas. Modeliuojant vietinio poveikio for-muluotes, svarbu įvertinti jų gebėjimą atpalaiduoti veikliąsias medžiagas bei jų tinkamumą šių medžiagų skvarbai į nagą užtikrinti. Vertinant cheminių ir fizinių aktyviklių įtaką skvarbos į nagą procesams, nustatytas sąveikaujantis lazerio ir tioglikolio rūgšties poveikis, lemiantis efektyvų amorolfino ir naftifino kaupimąsi ir pernašą pro nagą. Sumodeliuotų formuluočių skvar-bos į žmogaus nagą in vitro ir ex vivo tyrimų rezultatų vertinimas leidžia prognozuoti pagamintų sistemų efektyvumą vartojant ant nago paviršiaus ir veiksmingai kontroliuoti vystomų produktų kokybę.
Darbo tikslas
Ištirti nešiklių prigimties įtaką bei cheminių ir fizinių veiksnių pritaiko-mumą, skatinant amorolfino ir naftifino skvarbą į nagą.
Darbo uždaviniai
1. Sumodeliuoti priešgrybelinių vaistinių medžiagų amorolfino ir naftifino skirtingas farmacines formas, vartojamas ant nago, optimizuoti formu-luotes ir įvertinti jų kokybinius parametrus.
2. Įvertinti amorolfino ir naftifino atpalaidavimo iš eksperimentinių nagų lakų formuluočių kinetiką bei vaistinių medžiagų skvarbą iš mikroemul-sijų į žmogaus nago plokštelės sluoksnius.
3. Įvertinti cheminių aktyviklių įtaką amorolfino ir naftifino kaupimuisi modelinėje galvijų nagų sistemoje bei atrinktų aktyviklių suderinamumą su pagamintų formuluočių komponentais.
4. Įvertinti fizinių aktyviklių poveikį amorolfino ir naftifino kaupimuisi mo-delinėje žmogaus nago sistemoje.
5. Įvertinti fizinių ir į formuluotes įterptų cheminių aktyviklių derinimo įta-ką amorolfino ir naftifino skvarbai į modelinę žmogaus nago sistemą.
Mokslinio darbo naujumas. Mokslinio darbo naujumas grindžiamas cheminių ir fizinių aktyviklių sąveikaujančiu poveikiu bei nešiklių įtaka naftifino ir amorolfino skvarbai į žmogaus nagą ex vivo.
Pirmą kartą atlikta išsami cheminių aktyviklių atranka, vertinant me-džiagų įtaką amorolfino ir naftifino kaupimuisi modelinėje galvijų nagų sis-temoje. Pirmą kartą įvertinta naftifino skvarba į žmogaus nagą ex vivo, vais-tinę medžiagą įterpus į nagų lakų bei mikroemulsijų formuluotes. Įvertinta naftifino ir amorolfino skvarba į žmogaus nago sluoksnius ex vivo, vertinant pasiskirstymą skirtinguose nago sluoksniuose.
Pirmą kartą įvertintas sąveikaujantis dviejų fizinių aktyvinimo metodų: ultragarso ir frakcinio CO2 lazerio bei sąveikaujantis frakcinio CO2 lazerio
ir tioglikolio poveikis amorolfino ir naftifino skvarbai į žmogaus nagą ex
vivo. Išvystytos ir validuotos efektyviosios skysčių chromatografijos
meto-dikos, kurios pritaikytos nustatyti amorolfiną ir naftifiną žmogaus naguose
ex vivo.
Praktinė ir teorinė reikšmė. Nagų lakams modeliuoti pritaikytas eks-perimentinis planavimas, kuris leido sumažinti eksperimentų skaičių ir kryptingai vystyti nagų lakų formuluotes. Pasirinkto metodo tinkamumas įvertintas praktiškai atliekant sumodeliuotų nagų lakų sudėties optimiza-vimą. Sukurtas optimizacijos modelis gali būti pritaikytas vystant hidro-fobinių polimerų pagrindu gaminamus nagų lakus su lipofilinėmis vaisti-nėmis medžiagomis.
Atlikta cheminių aktyviklių atranka, leido įvertinti jų tinkamumą skati-nant amorolfino ir naftifino skvarbą į nagus. Pritaikytos efektyviosios skys-čių chromatografijos metodikos leidžia atskirti amorolfiną ir naftifiną nuo galimų žmogaus nagų komponentų. Tai sukūrė prielaidas patikimai vertinti cheminių ir fizinių aktyviklių įtaką amorolfino ir naftifino skvarbai į žmo-gaus nagą.
Ex vivo ir in vitro skvarbos į nagą tyrimų rezultatai patvirtino, jog
formu-luočių sudėtis turi įtakos amorolfino ir naftifino kaupimuisi nage. Nustatyta, jog sumodeliuotos mikroemulsijos nėra tinkamas nešiklis amorolfino ir naftifino skvarbai į gilesnius nago sluoksnius.
Įvertinta, jog frakcinio CO2 lazerio suformuojami mikrokanalai bei
tio-glikolio rūgšties ėsdinantis poveikis turi statistiškai reikšmingą poveikį amorolfino ir naftifino skvarbai į žmogaus nagus. Skvarba padidėja, jeigu panaudojamas šių metodų sąveikaujantis poveikis. Vertinant cheminių ak-tyviklių įtaką, nustatyta, jog modelinė žmogaus nagų nuokarpų sistema yra patikimesnė nei galvijų nagų modelis, kadangi gaunami atsikartojantys ir statistiškai reikšmingi rezultatai.
Disertacinio darbo metu išvystyti ir pritaikyti skvarbos į nagą aktyvinimo modeliai gali būti panaudojami praktiniame onichomikozės gydyme, siekiant užtikrinti efektyvią amorolfino ir naftifino pernašą į žmogaus nago sluoksnius.
Darbo rezultatų aprobavimas. Tyrimų rezultatai paskelbti 7 mokslinėse konferencijose: The 6th International Pharmaceutical Conference „Science and practice 2015“ (2015 m. lapkričio 5–6 d., Kaunas, Lietuva); PBP World Meeting – 10th World Meeting on Pharmaceutics, Biopharmaceutics and Pharmaceutical Technology (2016 m. balandžio 4–7 d., Glazgas, Škotija); IX nacionalinė doktorantų mokslinė konferencija „Mokslas – sveikatai“ (2016 balandžio 13 d., Kaunas, Lietuva); 10th International Scientific Con-ference „The Vital Nature Sign“ (2016 m. gegužės 19–20 d., Vilnius, Lietuva); 11th International Scientific Conference „The Vital Nature Sign“ (2017 m. spalio 19–20 d., Vilnius, Lietuva); Skin Forum 2018 Annual Meet-ing (2018 m. birželio 20–21 d., Talinas, Estija); 3rd European conference on Pharmaceutics (2019 m. kovo 25–26 d., Bolonija, Italija).
Tyrimų tematika paskelbti 2 moksliniai straipsniai, išspausdinti leidi-niuose, įtrauktuose į Mokslinės informacijos instituto duomenų bazę.
Doktoranto indėlis disertaciniame darbe. Eksperimentai atlikti bendra-darbiaujant su kitomis mokslo įstaigomis. Eksperimentinės nagų lakų for-muluotės išvystytos ir optimizuotos doktorantės LSMU Klinikinės farma-cijos katedroje, eksperimentinės mikroemulsijų formuluotės išvystytos ir pagamintos doktorantės Martino Liuterio universiteto (Vokietija) Farmaci-jos fakulteto Dermatologinės farmaciFarmaci-jos instituto laboratorijoje. Analitiniai efektyviosios skysčių chromatografijos kiekybinės analizės metodai išvystyti, pritaikyti ir validuoti doktorantės LSMU Klinikinės farmacijos katedroje. Pagamintų formuluočių FTIR spektroskopija atlikta doktorantės LSMU Vaistų chemijos katedroje, o mikrokalorimetrinė analizė – LSMU Klinikinės farmacijos katedroje. Galvijų nagų paruošimas vykdytas bendra-darbiaujant su LSMU Veterinarijos akademijos Veterinarinės patobiologi-jos katedros mokslininkais: raginis nagų sluoksnis nuo galvijų nagų atskir-tas Veterinarinės patobiologijos katedros mokslininkų, gautų mėginių
išvalymas bei paruošimas pjaustymui atliktas doktorantės LSMU Veteri-narijos akademijos Patologijos centre, o nagų pjaustymas kriotomu į sek-cijas atliktas LSMU VA Patologijos centro histologo. Mikroemulsijų reolo-ginių savybių tyrimas atliktas doktorantės Martino Liuterio universiteto Fizikos instituto Polimerų fizikos eksperimentinėje laboratorijoje, vadovau-jant dr. Klaus’ui Schröter’ui. Cheminių aktyviklių atranka ir vertinimas atlikti doktorantės LSMU Klinikinės farmacijos katedroje, o mechaninės pažaidos nage suformuotos doktorantės, bendradarbiaujant su lazerinės dermatologijos klinika Kaune. Vaistinių medžiagų ex vivo skvarbos į nu-kirptą žmogaus nagą tyrimai vykdyti doktorantės LSMU Klinikinės far-macijos katedroje. Vaistinių medžiagų ex vivo skvarbos iš mikroemulsijų į žmogaus nago plokštelės sluoksnius tyrimai atlikti doktorantės ir Martino Liuterio universiteto klinikų Dermatologijos ir Venerologijos klinikos mokslininkų, vadovaujant prof. dr. Johannes’ui Wohlrab’ui. Pagamintų formuluočių struktūra ir nago pokyčiai vizualizuoti doktorantės KTU Mate-matikos ir gamtos mokslų fakulteto Fizikos katedroje.
Konferencijoms pateiktos mokslinės tezės paruoštos ir pristatytos dok-torantės.
Darbo apimtis ir struktūra. Disertaciją sudaro įvadas, literatūros ap-žvalga, tyrimo objektas ir metodai, rezultatai ir jų aptarimas, išvados, bib-liografijos sąrašas (162 šaltiniai), disertacijos tema paskelbtų publikacijų sąrašas, sumodeliuotų formuluočių sudėtys, mokslinių publikacijų diserta-cijos tema kopijos, santrauka (anglų k.), mokslinės ir kūrybinės veiklos aprašymas ir padėka. Darbe pateikta 14 lentelių ir 38 paveikslai. Diserta-cijos apimtis 134 puslapiai.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Skvarbos į nagą procesų modeliavimas
Onichomikozės (nagų grybelio) vietinio gydymo veiksmingumas pri-klauso nuo priešgrybelinių medžiagų gebėjimo prasiskverbti į nago plokš-telę ir gilesnius sluoksnius, užtikrinant fungistatinių ir fungicidinių koncen-tracijų susidarymą [57, 68].
Viršutinis žmogaus nago sluoksnis sudarytas iš kietųjų, ypač nepralaidžių keratinocitų, o onichomikozės metu nagas linkęs sustorėti, pradeda vystytis dermatofitomos, kurios trukdo efektyviai pernašai. Veikliųjų medžiagų skvarbą į nago sluoksnius lemia įvairūs veiksniai: difunduojančios mole-kulės hidrofiliškumas bei lipofiliškumas, nešiklio prigimtis ir pH, keratino afinitetas, jonų krūvis bei užkrėsto nago plokštelėje susiformavusios ertmės [11, 99].
1.1.1. Sveiko ir onichomikozės pažeisto nago struktūra
Žmogaus nagas – epiderminė struktūra, sudaryta iš 80 proc. α– keratino ir 0,1–1,0 proc. lipidų. Keratino struktūros suformuoja tvirčiausią barjerinę struktūrą žmogaus organizme [9, 133]. Žmogaus nago struktūra pavaizduota 1.1.1.1 pav. Nago plokštelė sudaryta iš negyvų, plokščių ląstelių, kurios neturi organelių ar branduolių ir yra išsidėsčiusios maždaug 90 ląstelių sluoksnių. Nago plokštelė savotiškas hidrofilinis barjeras, panašus į hidrofilinio gelio membraną [156].
1.1.1.1 pav. Žmogaus nago struktūra
0,25–0,6 mm storio nago plokštelė sudaryta iš plokščių keratinizuotų ląstelių. Struktūriškai nago plokštelė panaši į epidermio raginį sluoksnį, tačiau šių biologinių membranų sudėtis visiškai skiriasi.
Iš disulfidiniais ryšiais sujungtų keratino molekulių sudaryta nago plokštelė apie 100 kartų storesnė už odos raginį sluoksnį. Skirtingos plaukų keratino rūšys išsidėsčiusios visuose nago sluoksniuose (1.1.1.1 lentelė). 1.1.1.1 lentelė. Keratino išsidėstymas nago sluoksniuose [13, 112]
Nago sluoksnis Keratino rūšis
Epidermis
Panagė Viršutinis sluoksnis Vidinis sluoksnis K5, K17 K10 Epitelio keratinas Matriksas Viršutinis sluoksnis K5, K17 Epitelio ir plaukų
keratinų rūšys Vidinis sluoksnis K1, K10, K5, K17, K85 (hHb5) Keratogeninė zona K85, K31, K81, K86, K34, K5, K17 Nago guolio epitelis K5, K17, K6, K16 Epitelio keratinas
Nago plokštelės fizikinės charakteristikos priklauso nuo skirtinguose sluoksniuose esančių keratino tipų. Keratino pluoštai surišami cisteinu praturtintais baltymais. Keratino pluoštų išsidėstymas ir baltymų stabilumas paverčia nago plokštelę mažai pralaidžia, tvirta struktūra.
Pasitelkus gelinę chromatografiją, kietuosius keratinus galima klasifi-kuoti į kelias grupes: 8 didelius (Ha1–4 ir Hb1–4) ir 2 mažus (Hax ir Hbx) baltymus, abi keratinų grupės randamos žmogaus nago struktūroje. Atlikus genomo analizę, ši keratinų šeima buvo suskirstyta į mažiausiai septynis I Ha keratinus ir šešis II Hb keratinus. Šiuo metu atrandama vis naujų I Ha ir II Hb keratinų izoformų [18].
Paviršiniuose nago plokštelės sluoksniuose yra sąlyginai daug fosfoli-pidų, tačiau bendras jų kiekis nesiekia 1 proc. (odos raginiame sluoksnyje – 10 proc). Drėgmės kiekis nage priklauso nuo keleto faktorių. Vidutiniškai nago plokštelėje apie 18 proc. drėgmės, jai sumažėjus iki 16 proc., nagas pradeda lūžinėti, padidėjus iki 25 proc. – tampa itin minkštas. Nagas nesu-geria daugiau negu 25 proc. drėgmės, todėl tai dažnai apsunkina skvarbos pro nagą modeliavimą – sėkmingai vaistinės medžiagos skvarbai reikalinga kuo didesnė drėgmė nage, tik tada disulfidiniai ryšiai tarp keratino mo-lekulių yra suardomi, ir vaistinė medžiaga geba pasiekti gilesnius nago sluoksnius [13, 121].
Onichomikozė – nago guolio ar nago plokštelės grybelinė infekcija. 90 proc. onichomikozės atvejų sukelia dermatofitai Trichophyton rubrum, T.
mentagrophytes bei Epidermophyton flociorum [33, 47]. Dermatofitui
pate-kus ant nago paviršiaus, siūlus formuojanti grybiena pradeda skverbtis į nago plokštelės vidų, patekusios grybelio ląstelės pradeda gaminti kera-tinocitų proteazes, kurios užima sveikų ląstelių tūrį. Keratinocitinės pro-teazės skatina keratino degradaciją ir skaidymą iki oligopeptidų bei amino-rūgščių [131, 150]. Dermatofitai nesugeba redukuoti keratino molekules jungiančių disulfidinių jungčių, tačiau jas susilpnina arba dalinai defor-muoja. Nustatyta, jog toks efektas priklauso nuo individualaus sieros kiekio, kuris užkoduotas TruSsu1 genuose [44, 120]. Itin dažnai senyviems žmo-nėms pasitaikanti onichomikozė siejama su imuninio atsako susilpnėjimu bei degeneratyviniais ir metaboliniais pokyčiais senėjimo metu [69]. Senė-jimo procesas sąlygoja sutrikdytą periferinę cirkuliaciją bei sulėtėjusius bio-loginius mechanizmus: pakinta sveiko nago spalva, storis, vidinė struktūra (nage padaugėja kalcio, bet sumažėja geležies jonų) – šie pokyčiai gali lemti dažnesnį onichomikozės vystymąsi senyvame amžiuje [7, 64]. Dermatofitai pasižymi parazituojančiomis savybėmis – keratino turinčiose struktūrose dauginasi itin greitai, tačiau jų išnaikinimas itin sudėtingas ir ilgas procesas. Nago plokštelė tampa neskaidri, praranda blizgesį, pasidaro trapi. Nagas pradeda gelsti, sustorėja, yra nelygus, gruoblėtas. Iš pradžių pažeidžiamas vienas nagas, infekcijos negydant, pažeidžiami visi nagai [48, 55].
Didžiausi skirtumai sveikame ir užkrėstame nage pastebimi tarp disulfi-dinių ryšių formos ir intensyvumo [150]. Disulfidiniai ryšiai, kryžmai išsi-dėstydami keratine, garantuoja fizikines ir mechanines keratino savybes bei stabilumą. Užkrėstame nage disulfidiniai ryšiai tarp cisteino molekulių pa-kinta: S-S ryšio tvirtumas ir persidengimas pasikeičia, todėl kinta nagų kera-tino mechaninės savybės [28]. Onichomikoze sergančio paciento nagai linkę į hiperkeratozę [157], pakinta jų fizikinės cheminės savybės: sveiko nago porų dydis 0,78 ± 0,29 µm2, o onichomikoze užkrėsto – 1,52 ± 0,59 µm2
; nagas maždaug tris kartus sustorėja [6], tačiau nustatyta, jog porų atsira-dimas sąlygoja didesnį vaistinių medžiagų pralaidumą [35].
Sudėtinga nagų plokštelės struktūra bei pokyčiai patologijos metu, sąly-goja itin mažą vaistinių medžiagų skvarbą iš vietinio poveikio preparatų į nago guolį. Pernešama molekulė turėtų pasižymėti maža molekuline mase ir išlikti nedisocijavusi ją pernešant pro nago plokštelę. Literatūros duome-nimis, vaistinių medžiagų skvarbą pro nagą skatina vaistinės medžiagos hidrofiliškumas, pH, nešiklio prigimtis, paviršiaus krūvis. Vertinant šiuos aspektus, vaistinių medžiagų skvarba pro nagą skatinama taikant įvairius cheminius ir fizinius aktyvinimo metodus, kurie gali pakeisti nago mecha-nines savybes bei padidinti pralaidumą.
1.1.2. Alternatyvūs nago modeliai
Dėl riboto žmogaus nago plokštelės gavimo bei panaudojimo, buvo pradėti vystyti alternatyvūs nago plokštelės modeliai, kurie galėtų imituoti vaistinių medžiagų skvarbą į nago sluoksnius [10, 128]. Apžvelgus literatūrą nustatyta, jog plačiai taikoma žmogaus nago plokštelės alternatyva – sa-vanorių rankų ir kojų sveikų nagų nuokarpos [34, 41, 70], kurios gali būti naudojamos be specifinio paruošimo arba brinkinamos įvairiose eksperi-mentinėse terpėse. Pagrindinis modelio trūkumas – santykinai nedidelis paviršiaus plotas ir išlenkta forma: reikalinga itin jautri analitinė aparatūra bei specialūs difuzijos celėms pritaikyti nago adapteriai [146].
Viena dažniausiai taikomų žmogaus nago alternatyvų – gyvūninės kilmės nago modeliai, pagal cheminę keratino struktūrą panašūs į žmogaus nago plokštelę [128, 156]. In vitro skvarbos tyrimuose taikomos jaučių [95], kiaulių [103] nagos bei arklių [77] kanopos.
Žinduolių kanopos yra pralaidesnės vandeniui, lyginant su žmogaus nago plokštele. Kanopose išsidėsčiusius baltymus jungia mažiau disulfidinių tiltelių [127] nei žmogaus nage, tai lemia didesnį vandens pasisavinimą [77] ir atsparumą aktyvikliams. Lyginant žmogaus nago, arklio kanopos ir jaučio nagos pralaidumą nustatyta, jog arklio kanopos yra net 28 kartus pralai-desnės veikliosioms medžiagoms nei žmogaus nagas, kuomet jaučio nagos pralaidumas yra tik 1,8 karto didesnis už žmogaus nago [107]. D. Mertin ir kt. [91] buvo pirmieji, kurie matematiškai įrodė, jog dėl panašaus drėgmės kiekio (38 proc.) bei cheminės keratino struktūros jaučio nagos gali būti taikomos kaip alternatyvus žmogaus nago modelis, vertinant vaistinių me-džiagų skvarbą. Kol kas tai vienintelis validuotas [95] gyvūninės kilmės nago modelis, plačiai taikomas skvarbos tyrimuose [38, 108, 117]. Dėl di-delio paviršiaus ploto galvijų nagos membranos gali būti pritaikomos dau-gelyje difuzijos celių, vertinant puskietes ir skystas farmacines formas, tačiau cheminis ar fizinis skvarbos aktyvinimas gali būti mažiau efektyvus, lyginant su žmogaus nagu [127].
Remdamiesi pagrindiniais žmogaus nagų ir galvijų nagų skirtumais, S. Lusiana ir kt. [88] išvystė keratino plokštelės modelį, panaudodami žmo-gaus plaukų keratiną. Skvarbos tyrimų metu nustatyta, jog laboratorinėmis sąlygomis pagamintos keratino plokštelės ir galvijo nagos pralaidumas buvo vienodas. Vertinant drėgmės sugėrimą, keratino plokštelė sugėrė vos 5 proc. drėgmės bei buvo mažiau jautri cheminių aktyviklių poveikiui nei galvijo naga. Tolimesniuose palyginamuosiuose keratino plokštelių ir galvijo nagų tyrimuose [89] įvertintas jų pritaikomumas sukuriant grybelio pažeistą nago modelį. Įvertinus terbinafino skvarbą iš gelio ir nagų lako, statistiškai reikšmingo skirtumo tarp dviejų nago modelių nebuvo pastebėta. Keratino
plokštelių geba imituoti nago modelį taip pat nustatyta A. Täuber ir kt. [144] atliktų palyginamųjų keratino plokštelių ir galvijų nagų skvarbos tyrimų metu – nustatyta jog taikant skirtingus nago membranos modelius ciklo-pirokso skvarbos rezultatai statistiškai reikšmingai nesiskyrė.
Mokslinės literatūros duomenimis, vertinant skvarbos į nagą procesus, alternatyviais patikimais nago plokštelės modeliais gali būti naudojamos žmogaus nago nuokarpos bei galvijų nagų sekcijos. Įvertinta, jog žmogaus nago nuokarpos tiksliausiai atkartoja biologines žmogaus nago plokštelės savybes, tačiau yra techniškai sudėtinga atlikti in vitro tyrimus dėl nuokarpų mažo paviršiaus ploto bei lenktos formos. Naudojant galvijų nagas galima atkurti žmogaus nago pralaidumą, garantuojamas skvarbos tyrimams rei-kalingas paviršiaus plotas, tačiau modelis nėra tinkamas vertinant aktyviklių poveikį. Apibendrinus mokslinėje literatūroje pateikiamų tyrimų rezultatus, tiriamajame darbe nuspręsta vystyti ir pritaikyti abu alternatyvius nago plokštelės modelius.
1.1.3. Skvarbos į nago plokštelę aktyvinimas
Norint nagų ligas gydyti tik vietiškai veikiančiais preparatais, būtina garantuoti, jog didesnė nei minimali inhibicinė vaistinės medžiagos kon-centracija prasiskverbs pro kieto keratino sluoksnį nago plokštelėje bei ge-bės pasiekti gilesnius nago sluoksnius. Vienas iš būdų tai pasiekti – taikyti fizinius, cheminius arba mechaninius skvarbos į nagą aktyvinimo metodus [128, 148].
Jonoforezė ir ultragarsas laikomi saugiausiais skvarbos į nagą aktyvinimo būdais, kadangi nesukuria nago sluoksnio pažaidos bei procesų sukeltas efektas yra grįžtamas – juos nustojus taikyti atsistato nago barjero savybės [17, 135]. S. Murthy ir kt. [102] vieni pirmųjų nustatė ir įrodė jonoforezės efektyvumą, vertindami salicilo rūgšties skvarbą į nago sluoksnius. Salicilo rūgšties skvarba pagerėjo 6 kartus, lyginant su pasyvios pernašos rezultatais. J. Hao ir kt. [72] pritaikė jonoforezę vertindami neutralių ir krūvį turinčių molekulių skvarbą į nagą. Taikant neigiamo krūvio jonoforezę, statistiškai reikšmingai pagerinta manitolio bei urėjos pernaša į nagą. A. B. Nair ir kt. [104] nustatė, jog jonoforezė gali statistiškai reikšmingai pagerinti teigiamą krūvį turinčių terbinafino hidrochlorido molekulių pernašą į žmogaus nagą, lyginant su pasyvia pernaša: po in vitro skvarbos tyrimo nago plokštelėje atitinkamai nustatyta 55,64 µg/mg ir 5,75 µg/mg terbinafino hidrochlorido. Vertinant terbinafino hidrochlorido pasiskirstymą nage, nustatyta, jog pasyvios difuzijos metu vaistinė medžiaga susikaupė paviršiniuose nago sluoksniuose, o taikant jonoforezę, terbinafino hidrochloridas nustatytas visuose nago plokštelės sluoksniuose. Nustatyta, jog jonoforezę derinant
kartu su paviršiui aktyviomis medžiagomis, gerėja didelės molekulinės ma-sės, vandenyje netirpių molekulių skvarba į nago sluoksnius [96]. Skvarbos aktyvinimo jonoforeze efektyvumą nulemia keletas veiksnių: elektroforezė ir elektros pulsacija (sukuriamo elektros lauko bei pernašai naudojamos molekulės krūvio sąveika), elektros osmozė [71], pralaidumas bei elektros lauko sukuriamų nago plokštelės porų indukcija [11, 37, 72].
Vidinių ertmių susidarymą odos ir nago struktūroje taip pat gali sukelti žemo dažnio ultragarsas. Kavitacijos reiškinys (oro burbuliukų susidarymas ir staigus sprogimas) pastebimas tiriant veikliųjų medžiagų skvarbą iš skystų farmacinių formų. Staigus oro burbulų sprogimas skystoje terpėje sukelia smūgines bangas ir jų perėjimą per biologinę membraną. Šis efektas sukuria asimetrinį slėgį, sąlygoja vidinių ertmių susidarymą biologinėje membra-noje [1, 4] bei gali statistiškai reikšmingai padidinti vaistinių medžiagų skvarbą į nago membraną [151].
Taikant frakcinį CO2 lazerį nago struktūroje sukeliamas negrįžtamas
efektas: sukuriami mikrokanalai, padidant kontaktinį paviršiaus plotą tarp nago ir formuluotės, tai sąlygoja didesnį vaistinių medžiagų praeinamumą pro nago barjerą [17, 19, 109]. Fizinio metodo efektyvumas įvertintas kli-nikinėje praktikoje, gydant onichomikozę: nagus paveikiant lazerio spin-duliuote prieš naudojant amorolfino HCl kremą: 22 pacientams iš 24 pa-stebėtas teigiamas atsakas, o 12 pacientų buvo visiškai išgydyta onicho-mikozė [86]. Lazerio spinduliuotę derinant su 2 proc. tiokonazolo nagų laku pastebėtas statistiškai reikšmingas (p = 0,036) gydymo efektyvumas, didesni grybelio inhibicijos plotai bei mažesnis šalutinių poveikių dažnis, nei gydant tik su 2 proc. tiokonazolo nagų laku [40]. Frakcinis CO2 lazeris gali būti
puiki onichomikozės gydymo alternatyva pacientams, kuriems kontrain-dikuotini per os vartojami vaistai, o ant nago paviršiaus naudojami prie-paratai neefektyvūs.
Nago struktūros hidrofiliškumas lemia tai, jog daugelis transderminės pernašos cheminių aktyviklių nėra tinkami gerinant veikliųjų medžiagų skvarbą į nagą [113], kadangi jų pagrindinė savybė – paveikti membranoje esančius lipidus [127]. Cheminis skvarbos į nagą aktyvinimas efektyvus, kai suardomas keratino struktūros cheminis ir fizinis struktūros integralumas, paveikiant pagrindinius taikinius – molekules: disulfidus, peptidus, vande-nilines ir polines jungtis [5, 72, 114]. Cheminiai aktyvikliai gali būti taikomi dvejopai: paveikiant nagą tiesiogiai arba įterpiant į formuluotes [12, 72].
Sulfhidrilinę grupę turinčios medžiagos sukelia nago plokštelės brinkimą ir porėtumą, ardydamos disulfidinius tiltelius tarp keratino molekulių, pvz., tioglikolio rūgšties ėsdinantis poveikis yra negrįžtamas [72, 157]. Kera-tolinės medžiagos (pvz. urėja ar salicilo rūgštis) sukelia keratino molekulių denatūraciją, tai nulemia nago plokštelės suminkštėjimą [36, 62] ir porų
susidarymą nago struktūroje [92, 128]. Urėja geba išvynioti ir denatūruoti nagų keratiną, suardydama tarp keratino molekulių esančius vandenilinius ryšius [158]. Nustatyta, jog urėja efektyvumas padidėja, jeigu sinergistiškai taikomas kitas skvarbos aktyviklis: itrakonazolo koncentracija nago plokšte-lės sluoksniuose 94 kartus pagerėjo, lyginant su kontrole, kai skvarba buvo aktyvinama derinant urėją ir N–acetilcisteinu. Aktyviklius taikant atskirai, pastebėtas mažesnis efektyvumas: skvarba 20 kartų pagerėjo, kai buvo nau-dojama urėja bei 49 kartus pagerėjo, kai buvo aktyvinama N–acetilcisteinu [15]. Organiniai tirpikliai (etanolis, isopropanolis, isopropilmiristatas) netin-kami gerinant veikliųjų medžiagų skvarbą į nagus, nes sukelia nago plokšte-lės dehidrataciją bei sulėtina skvarbos procesus [135]. Nustatyta, jog hidrok-sipropil-beta-ciklodekstrino pridėjimas į nagų lako formuluotę nulėmė nago plokštelės hidrataciją, o aktyviklio koncentracijos didinimas statistiškai reikšmingai pagerino terbinafino hidrochlorido atpalaidavimą [30].
Įvertinta, jog N–metil–2–pirolidonas, PEG 400, dimetilsulfoksidas (DMSO), Labrasol®, merkaptoetanolis, Transcutol® pagerina vaistinių medžiagų skvarbą į nago membraną. Nustatyta, jog neorganinės druskos (pvz., natrio metabisulfitas, natrio citratas, kalio fosfatas) pagerino terbi-nafino hidrochlorido kaupimąsi nago sluoksniuose, o natrio fosfatas sta-tistiškai reikšmingai (p < 0,05) pagerino terbinafino hidrochlorido skvarbą pro nagą dėl padidėjusios nagų plokštelės hidratacijos ir didesnio vaistinės medžiagos termodinaminio aktyvumo [105]. Polietilenglikolių įtaka terbi-nafino skvarbai į nagą buvo įvertinta taikant pasyvią ir jonoforeze aktyvi-namą pernašą. Pasyvios pernašos metu, PEG 200 ir PEG 400 neturėjo įtakos terbinafino hidrochlorido skvarbai, tačiau statistiškai reikšmingas skvarbos pagerėjimas nustatytas mažos molekulinės masės polietilenglikolius deri-nant kartu su jonoforeze [5]. Vertideri-nant veikliosios medžiagos AR–12 skvar-bą į žmogaus nagus, pastebėta, jog veikliosios medžiagos pasyvi pernaša aktyvinama PEG 400 derinant kartu su 10 proc. dekspantenolio [82]. Manoma, jog mažos molekulinės masės polietilenglikoliai geba padidinti vandens įsisavinimą bei sąlygoja nagų plokštelės brinkimą. Didelės mole-kulinės masės (1000–3350) polietilenglikoliai neturėjo įtakos terbinafino hidrochlorido pasyvios ar jonoforeze aktyvinamos pernašos procesuose [5].
1.2. Farmacinės formos, vartojamos ant nago
Kuriant vietinio poveikio farmacines formas, skirtas vartoti ant nago, svarbu įvertinti vaistinės medžiagos atpalaidavimą iš formuluotės, pasi-skirstymą nago plokštelėje ir nago guolyje. Atsižvelgiant į vartojimo dažnį, patogumą ir efektyvumą, nustatyta, jog svarbu garantuoti vaistinės
medžiagos rezervuaro susidarymą nago sluoksniuose, taip užtikrinant fun-gicidinių ir fungistatinių koncentracijų pastovumą nage.
1.2.1. Nagų lakai ir jų pritaikymas vaistinių medžiagų skvarbai Vaistiniai nagų lakai yra viena iš perspektyviausių farmacinių formų naudojamų vaistinių medžiagų pernašai pro nagą. Šiuos preparatus sudaro plėvelę formuojančio polimero ir veikliosios medžiagos tirpalas [3]. Už-tepus nagų lako tirpalo ant paviršiaus, tirpiklis išgaruoja, susidaro plėvelė, kuri tampa vaistinės medžiagos rezervuaru ant nago paviršiaus [46, 76]. Garantuojamas didelis difuzijos gradientas vaistinės medžiagos pralaidumui į nagą [80], plėvelės susiformavimas sumažina nago struktūroje esančio vandens praradimą – vyksta paviršinio nago sluoksnio hiperhidratacija, turinti teigiamos įtakos veikliųjų medžiagų pernašai [100]. 1.2.1.1 pav. pateikiamas nagų lakų veikimo mechanizmas.
1.2.1.1 pav. Vaistinio nagų lako veikimo mechanizmas
Hidratacija sąlygoja nago plokštelės brinkimą, porų nago plokštelėje formavimąsi [101, 110], skatina vaistų poveikiui neatsparių hifų augimą bei lėtina grybo sporų formavimąsi nago sluoksniuose [65]. Susidariusi nagų lako plėvelė inhibuoja grybų sporų prisitvirtinimą prie nago plokštelės [49]. Daugelio komercinių vaistinių nagų lakų pagrindą sudaro polimeras, iš-tirpintas organinių tirpiklių mišiniuose, pagerinantis lipofilinių priešgrybeli-nių medžiagų tirpumą [100, 155]. Hidrofobiniai polimerai (pvz., metakrili-nės grupės) formuoja vandenyje netirpias, nusiplovimui atsparias nagų lako
plėveles, kurios nulemia ilgalaikę vaistinių medžiagų pernašą, tačiau jų su-dėtyje esantys organiniai tirpikliai gali sukelti alergijas, išsausinti aplink na-gus esančią odą, sulėtinti vaistinių medžiagų skvarbą [34, 41], be to verti-nant komercinius produktus, pastebėta, jog grybelio sukėlėjus inhibavo tos formuluotės, kurių sudėtyje buvo organinių rūgščių [133]. Įrodyta, jog trans-derminės skvarbos aktyvinimu pasižymintis etanolis neveikia pernašos į nagus, o propilenglikolis ir PEG 400 neigiamai veikia urėjos, tetraetilamo-nio, vandenilio jonų pernašą į nagus [135]. Pastebėtas teigiamas skvarbos aktyvinimo poveikis, hidrofobinius polimerus derinant kartu su plastifikato-riais: pagerėja plėvelės lankstumas, atpalaiduojamas didesnis vaistinių medžiagų kiekis, o plėvelė ilgiau išlieka ant nago paviršiaus [101]. Atpalai-duotas vaistinės medžiagos kiekis, klampa ir plėvelės susidarymo laikas pri-klauso nuo polimero prigimties ir naudojamos koncentracijos formuluotėje [148]. Nustatyta, jog didinant polimero poliuretano koncentraciją, mažėja atpalaiduojamas ciklopirokso kiekis, didėja nagų lako klampa bei ilgėja plė-velės susidarymo laikas [153]. Dididant etilceliuliozės koncentraciją nagų lake, pastebėta, jog atpalaiduojamas mikanozolo nitrato kiekis didėja [152].
Žmogaus nagas pasižymi hidrofilinėmis savybėmis [115], tačiau dau-guma priešgrybelinių vaistinių medžiagų yra lipofiliškos. Norint išvengti organinių tirpiklių neigiamo poveikio ir užtikrinti vaistinių medžiagų tir-pumą, hidrofilines plėveles bandoma formuoti naudojant vandenyje tirpius polimerus ir tirpumą gerinančias medžiagas [30, 61, 111]. Nustatyta, jog naudojant poloksamerą 407 bei pridedant ciklodekstrino, pagerinta ciklo-pirokso skvarba į nagą, tačiau pagaminta formuluotė nepasižymėjo tinkama adhezija. Dalį poloksamero 407 pakeitus etanoliu, gautos tinkamomis ko-kybinėmis charakteristikomis pasižyminčios plėvelės [34]. Hidrofilinės nagų lako plėvelės, formuojamos naudojant hidroksipropilchitozaną [23, 139], pasižymi stipresne adhezija ant nago paviršiaus bei greitesne vaistinės medžiagos pernaša. Nustatyta, jog hidroksipropilchitozanas skatina nagų augimą bei reikšmingai pagerina amorolfino ir ciklopirokso skvarbą į nagus, lyginant su jau rinkoje esančiais komerciniais preparatais [94, 97], tačiau sąlygoja greitą nusiplovimą ir silpnas mechanines savybes [101].
Gydant grybelines nago infekcijas svarbu, jog pažeistas nago paviršius kuo ilgiau kontaktuotų su formuluote. Vienas iš šios problemos sprendimo būdų – dvifaziai nagų lakai, sudaryti iš hidrofilinio sluoksnio, kuris tie-siogiai liečiasi su nago plokštele, ir hidrofobinio sluoksnio, kuris padengia nagą ir apsaugo nuo aplinkos poveikio. Nustatyta, jog dvifazis nagų lakas gali būti efektyvus terbinafino hidrochlorido nešiklis į nago sluoksnius – lyginant su monosluoksniu nagų laku, terbinafino skvarba po dviejų sa-vaičių tyrimo pagerėjo dvigubai, atitinkamai nustatyta 1,27 ± 0,18 µg/mg ir 0,67 ± 0,18 µg/mg terbinafino hidrochlorido [131].
1.2.2. Koloidinių sistemų pritaikymas skvarbai į nagą
Dauguma priešgrybelinių vaistinių medžiagų pasižymi blogu tirpumu vandenyje ir mažu biologiniu pasisavinimu per os [85, 137]. Vienas iš šių problemų sprendimo būdų – stabilumu ir pritaikomumu pasižymintys mikro- ir nanostruktūriniai nešikliai [159]. Priklausomai nuo priešgrybelinės vaistinės medžiagos savybių, gali būti formuluojamos skirtingos koloidinės sistemos (1.2.2.1 pav.), kurios gali būti įterpiamos į skystas bei pusiau kietas farmacines formas.
1.2.2.1 pav. Koloidinių sistemų rūšys ir savybės
Schema modifikuota pagal [73].
Koloidinės vaistų tiekimo sistemos sudarytos iš dalelių ar vezikulių, kurių dydis svyruoja tarp 1 ir 500 nm, gali sąlygoti geresnį vaistų biologinį pasisavinimą, mažesnį toksinį poveikį, ribotai tirpių vaistinių medžiagų pernašą [137], užtikrinti kontroliuojamą vaistinės medžiagos atpalaidavimą bei didesnį efektyvumą [25].
Nano- ir mikrostruktūriniai nešikliai, derinami kartu su fizinio aktyvi-nimo metodais (pvz., mikroadatomis ar lazerio spinduliuote), gali prailginti lipofilinių vaistinių medžiagų skvarbą į nago sluoksnius [27, 50, 160], o jų
sudėtyje esanti vandeninė fazė turėti įtakos nago plokštelės hidratacijai ir vaistinių medžiagų pernašai [51].
Vertinant liposomų ir etosomų sistemas su terbinafinu, pastebėta, jog didžiausias (8,71 proc.) vaistinės medžiagos kiekis nage susikaupė naudo-jant liposominį poloksamero gelį, o suspensija su liposomomis sąlygojo mažiausią terbinafino kiekį nage – 1,12 proc. Į gelio formuluotę pridė-jus 30–50 proc. etosomų pastebėtas nagą dirginantis efektas [143]. Terbi-nafino hidrochloridą įterpus į transferosomas, pagerėjo jo skvarba į grybelio pažeistus nago sluoksnius: transferosomų sudėtyje esantis polisorbatas 80 sąlygojo grybo sienelės membranos suminkštėjimą, tai nulėmė didesnę vais-tinės medžiagos pernašą [139]. Lyginant komercinį terbinafino hidrochlo-rido kremą su nanonešiklių formuluotėmis, nustatyta, jog terbinafino hidro-chlorido skvarba į nagą pagerėja du kartus, vaistinę medžiagą įterpus į liposomų sudėtį [42].
Ketokonazolą įterpus į nanoemulsijų gelį, pastebėta, jog vaistinės me-džiagos į nagą patenka 2 kartus daugiau, nei naudojant vaistinės meme-džiagos suspensiją. Vertinant šių dviejų formuluočių mikrobiologinį aktyvumą, pa-stebėta, jog nanoemulsinis gelis pasižymi stipresniu grybelius inhibuojančiu poveikiu [90].
Vertinant mikrostruktūrinius nešiklius, pastebimi prieštaringi rezultatai. Lipofilinių medžiagų itrakonazolo [112] bei EV–086K [107] skvarba į nagą pagerėjo, juos įterpus į mikroemulsijas ar gelius su mikroemulsijomis, ta-čiau terbinafinas [56] įterptas į mikroemulsijų formuluotes, nago sluoks-niuose nebuvo nustatytas. Mikrostruktūrinių nešiklių įtaka ir skvarbos į nagą mechanizmai nėra visiškai išaiškinti – kol kas jų veiksmingumas siejamas su medžiagų pernaša pro odą, esančią aplink nago plokštelę.
Nano- ir mikrostruktūrinių nešiklių pranašumas – galimybė į jų for-muluotes įterpti didesnius lipofiliškų, vandenyje netirpių priešgrybelinių medžiagų kiekius bei geba išlaikyti nago plokštelės hidrataciją. Vienas pa-grindinių trūkumų, susijusių su koloidinių nešiklių formuluotėmis, – ribotas išsilaikymas ant nago paviršiaus. Gelifikuotos formos, lyginant su tirpalais, sąlyginai ilgiau geba išsilaikyti ant nago, tačiau nė viena iš jų negali sudaryti vaistinės medžiagos rezervuaro ant nago paviršiaus.
1.2.3. Pusiau kietų farmacinių formų pritaikymas skvarbai į nagą Modeliuojant ant nago vartoti skirtas farmacines formas, svarbu atsi-žvelgti į formuluotės gebėjimą sąveikauti su nago plokštele. Pusiau kietos farmacinės formos išsilaikymas ant nago plokštelės yra ribotas – ji greitai nusivalo nuo paviršiaus, nepatogi vartoti ant kojų nagų. Gydymo efekty-vumas padidėja, jeigu pusiau kietos farmacinės formos derinamos kartu su
fiziniais skvarbos aktyvikliais: nustatytas pusiau kietų farmacinių formų ir frakcinio CO2 lazerio sąveikaujantis efektas [14, 161]. Įvertinta, jog
amo-rolfino hidrochlorido kremas, vartojamas ant onichomikoze paveiktų nagų, buvo neefektyvus. Formuluotę derinant kartu su frakcinio CO2 lazerio
po-veikiu, pastebėtas onichomikozės simptomų sumažėjimas, o po pusmečio vartojimo visiškas išgijimas, be atsinaujinimo po 3 mėnesių [86].
Efektyviai vaistinių medžiagų pernašai iš gelio formuluočių reikalingas pakankamas nago išbrinkimas – šis efektas pastebėtas lyginant terbinafino hidrochlorido skvarbą iš gelio formuluočių, nagą paveikus neorganinėmis rūgštimis [105]. Klampos didinimas gali būti viena iš išeičių, norint pratęsti gelio buvimo laiką ant nago paviršiaus. Pastebėta, jog naudojant in situ ge-lifikuojantį hidrogelį, nago sluoksniuose nustatytas didesnis vaistinės me-džiagos kiekis, nei naudojant įprastą hidrogelį [39]. Remiantis mokslinės literatūros duomenimis, pastebima, jog pusiau kietų farmacinių formų efek-tyvumas ir pranašumas padidėja, kai į jų pagrindą pridedama nano- arba mikrostruktūrinių nešiklių, kuriuose yra vaistinė medžiaga. Inovatyvi for-muluotė garantuoja geresnę pernašą bei ilgesnį forfor-muluotės išsilaikymo laiką, lyginant su jų pavieniu vartojimu [8, 144]. Įvertinta, jog gydant oni-chomikozę, pusiau kietos farmacinės formos efektyvios po nago plokštelės pašalinimo chirurginiu ar cheminiu būdu [63, 115, 119], kadangi vaistinės medžiagos skverbiasi tiesiogiai į nago guolį.
Apibendrinant mokslinėje literatūroje pateikiamą informaciją, galima daryti prielaidą, jog vietinė onichomikozės monoterapija pusiau kietomis farmacinėmis formomis yra neefektyvi dėl riboto formuluotės išsilaikymo ant nago bei nesukuriamo vaistinės medžiagos rezervuaro nago sluoks-niuose.
1.3. Vietinio poveikio farmacinių formų biofarmaciniai tyrimai 1.3.1. Vaistinių medžiagų in vitro atpalaidavimo tyrimai
Sumodeliuotų vietinio poveikio preparatų kokybė vertinama atliekant biofarmacinius tyrimus: (1) in vitro atpalaidavimo tyrimus su sintetinėmis membranomis; (2) ex vivo tyrimus su gyvūnų arba žmogaus nagais; (3) in
vivo tyrimus su eksperimentiniais gyvūnais [161].
Vienas pagrindinių kriterijų, vertinant vietinio poveikio preparato koky-bę – jo gebėjimas atpalaiduoti vaistinę medžiagą. Šis aspektas svarbus, no-rint pasiekti sumodeliuotų preparatų vietinį poveikį: vaistinė medžiaga pir-miausia turi būti atpalaiduota iš nešiklio, o tik po to skverbiasi į nagą. Vais-tinių medžiagų atpalaidavimo pro pusiau laidžias sintetines membranas in
Hanson [147]. Svarbu paminėti, jog in vitro tyrimų rezultatai negali būti
tiesiogiai siejami su in vivo vykstančiu atpalaidavimo procesu, kadangi žmogaus nago plokštelės pralaidumas skiriasi, tai riboja vaistinių medžiagų skvarbą.
1.3.2. Vaistinių medžiagų ex vivo skvarbos į nagą tyrimai
Vaistinės medžiagos, atpalaiduotos iš vietinio poveikio farmacinės for-mos, patenka ant nago plokštelės paviršiaus. Tolimesnė vaistinių medžiagų skvarba gali būti dvejopa: (1) vaistinė medžiaga kaupiama nago plokštelės sluoksniuose (angl. accumulation) ir pereina iš vieno sluoksnio į kitą (angl.
permeation), tačiau į nago guolį neprasiskverbia; (2) vaistinė medžiaga
pra-siskverbia pro nago plokštelę į nago guolį (angl. penetration) [146]. Moks-linės literatūros analizė parodė, jog vaistinių medžiagų skvarbos į nagą procesus nulemia nago plokštelės struktūra [121]. Ji sukuria barjerą, kuris riboja vaistinių medžiagų skvarbą į nagą, todėl sudėtinga pasiekti norimą terapinį poveikį.
Vertinant vaistinių medžiagų skvarbą ex vivo, tyrimai gali būti atliekami su modifikuotomis Franz celėmis, kai nago membrana yra įtvirtinama į specialų adapterį, kadangi nago arba nago nuokarpos paviršiaus plotas yra per mažas įprastoms Franz difuzijos celėms. Franz difuzijos celės tinkamos vertinant skvarbos procesus, aktyvinimo metodų įtaką bei bendrą skvarbos ir kaupimosi kinetiką [29, 148]. Priklausomai nuo vaistinės medžiagos tir-pumo ir pasirinktos modelinės nagų sistemos, Franz celių sistemoje cirku-liuojantis akceptorinės terpės (mažiausiai 7 ml) tūris dažnai yra per didelis, vertinant skvarbą į nagus. Dėl šios priežasties gali būti taikomas alterna-tyvus – „suvilgyto kamuolėlio“ (angl. wetted ball) metodas, kai celės pakei-čiamos akceptorine terpe suvilgytu medvilniniu kamuolėliu, ant kurio tiesiogiai dedamas nagas ir tiriama formuluotė. Taikant šį metodą, gali būti naudojami minimalūs akceptorinės terpės tūriai, tačiau neįvertinama skvar-bos kinetika, nes paimamas tik vienas mėginys [107].
Norint įvertinti priešgrybelinių medžiagų efektyvumą, skvarbos tyrimai atliekami su TurChub® ir ChubTur® celėmis [31]. Naudojant TurChub® celes, akceptorine terpe naudojamas agaro gelis, kuriame auginami grybeli-nių infekcijų sukelėjai. Šis metodas leidžia apskaičiuoti, kiek vaistinės me-džiagos prasiskverbia pro žmogaus nagą bei kokia grybelį inhibuojanti kon-centracija yra pasiekiama [67]. Norint įvertinti vaistinių medžiagų skvarbą pro grybelio pažeistą nagą, naudojamos ChubTur® celės. Į celę įtvirtinamas dermatofitais užkrėstas nagas, nago paviršius padengiamas tiriamąja formu-luote. Vaistinės medžiagos efektyvumas ir skvarba vertinami apskaičiuojant
biologinių žymenų skaičių, taikant polimerazės grandinines reakcijas bei įvertinant dermatofitų gyvybingumą [21].
Ex vivo tyrimų metu gali būti nustatomas vaistinės medžiagos skvarbos
srautas, pasiskirstymas nago sluoksniuose bei efektyvumas. Šių tyrimų re-zultatai leidžia prognozuoti galimą vaistinių medžiagų biologinį pasisavi-nimą in vivo ir yra vertingi kuriant vietinio poveikio farmacines formas.
1.4. Amorolfino hidrochlorido ir naftifino hidrochlorido fizikinės – cheminės savybės ir biologinis poveikis
Amorolfinas – morfolinų grupės, lipofilinėmis savybėmis pasižymintis junginys, paveikia grybelį slopindamas ergosterolio sintezę, veikdamas fermentą delta 14- reduktazę ir delta 8- delta 7- izomerazę (1.4.1 pav.). Dėl šios priežasties grybelių ląstelių membranose pradeda kauptis steroliai, turintys delta 14 arba (ir) delta 8 jungtis [84]. Šių junginių savybės skiriasi nuo ergosterolio, todėl kinta grybelių ląstelių membranos savybės ir joje esančių baltymų funkcijos [59].
1.4.1 pav. Priešgrybelinių vaistinių medžiagų veikimo mechanizmas
Nustatyta, jog amorolfinas yra linkęs prisijungti prie nago keratino mo-lekulių [123], todėl norint pasiekti fungicidines koncentracijas nage, būtina ilgesnė amorolfino sąveika su nagu [129].
Naftifinas – alilaminų grupės junginys, pasižymintis lipofilinėmis savy-bėmis, veikia (1.4.1 pav.) grybelio sukėlėjus slopindamas fermentą skvaleno epoksidazę [126], todėl sumažėja bendras sterolių kiekis grybelių ląstelių membranoje [26, 66]. Pakinta membranos fizikinės cheminės savybės bei membranoje esančių transportinių baltymų funkcija [43].
Amorolfino ir naftifino biologinis poveikis grybeliams ir dermatofitams įrodytas in vitro, ex vivo ir in vivo tyrimų metu.
Amorolfinas geba paveikti dermatofitus (Trichophyton spp, Microsporum spp., Epidermophyton spp.), mieles (Candida spp., Cryptococcus spp.,
Malassezia spp.), kai kuriuos pėlesius (Alternaria spp., Hendersonula spp., Scopulariopsis spp.) bei patogeninius grybus (Cladosporium, Coccidioides, Histioplasma, Sporothrix) [142].
Naftifinas pasižymi aktyvumu prieš Trichophyton rubrum, T.
menta-grophytes, T. tonsurans, Epidermophyton floccosum, Microsporum canis, o
minimali grybelius inhibuojanti koncentracija 0,031–-0,1 µg/ml [54, 126, 140] bei grįžtamąja depigmentacija, paveikiant Rhodotorula mucilaginosa grybelius [98]. Naftifino efektyvumas tiesiogiai priklauso nuo naudojamos koncentracijos [26]. Nustatyta, jog naftifinas nepasižymi mutageniškumu, tačiau nėštumo metu rekomenduojama preparatus naudoti ribotuose plo-tuose [117]. 1–2 proc. naftifino hidrochlorido formuluotės: kremas, gelis ir tirpalas plačiai taikomos gydant odos grybelines ligas [124].
Vertinant 17 priešgrybelinių medžiagų efektyvumą prieš skirtingus oni-chomikozės sukėlėjus, nustatyta, jog amorolfinas turi didžiausią pranašumą gydant odos ir nagų grybelį vietinio poveikio preparatais [45], kadangi minimali onichomikozės sukėlėjus inhibuojanti koncentracija: 0,004– 0,015 µg/ml [75,129]. Lyginant onichomikozei gydyti dažniausiai varto-jamo 5 proc. amorolfino hidrochlorido nagų lako efektyvumą su 10 proc. terbinafino hidrochlorido tirpalu ar 8 proc. ciklopirokso nagų laku, nusta-tyta, jog tik amorolfino hidrochloridas geba pasiekti gilesnius nago sluoks-nius po 24 val. tyrimo [57]. 5 proc. amorolfino hidrochlorido nagų lako efektyvumas inhibuoti nagų grybelio sukelėją Trichophyton rubrum įver-tintas lyginant preparatą su taip pat onichomikozei gydyti naudojamomis medicinos priemonėmis, kurių pagrindą sudaro etilacetatas, acto rūgštis ar urėja. Nustatyta, jog rūgštinės medicinos priemonės neturėjo jokios įtakos dermatofitų inhibicijai, o amorolfino hidrochloridas sukūrė 59,2 mm inhi-bicijos plotą [58]. 5 proc. amorolfino hidrochlorido nagų lakas, pasižymintis hidrofobinėmis savybėmis, įvardijamas kaip viena efektyviausių onichomi-kozės gydymo priemonių, tačiau 0,25 proc. amorolfino kremas įvardijamas
kaip neefektyvus gydant nagų grybelį [49, 86] bei sukeliantis odos dirgi-nimą.
Nors amorolfinas įvardijamas viena efektyviausių priešgrybelinių mole-kulių, vertinant mokslinėje literatūroje skelbiamus duomenis pastebima, jog onichomikozės gydymo vietinio poveikio amorolfino preparatais efektyvu-mas yra vos 30–50 proc. [47], todėl aktualu įvertinti galimus skvarbos aktyvinimo būdus bei jų poveikį amorolfino skvarbai. Naftifinas odos gry-belinėms ligoms gydyti vartojamas jau keletą dešimtmečių, o aktyvumas prieš dermatofitus – pagrindinius onichomikozės sukėlėjus nustatytas 2010 metais [26], tačiau vaistinė medžiaga skvarbos pro nagą procesuose netaikyta. Aktualu modeliuoti inovatyvias farmacines formas ir įvertinti naftifino pritaikomumą skvarbai į nagą.
2. TYRIMŲ OBJEKTAS IR METODAI
2.1. Tyrimų objektas
Amorolfino hidrochloridas ir naftifino hidrochloridas, jų skvarbą į nagą gerinantys fiziniai ir cheminiai aktyvikliai bei su jais modeliuojami nagų lakai ir mikroemulsijos, kurių efektyvumas grindžiamas kokybinėmis formuluočių charakteristikomis.
2.2. Reagentai, medžiagos ir priemonės Reagentai ir medžiagos
Amorolfino hidrochloridas (98 proc.) ir naftifino hidrochloridas (98 proc.) įsigyti iš Chemical Point (Deisenhofer, Vokietija). Plėvelę formuojantys polimerai metilmetakrilato polimeras (Eudragit E100), amonio metakrilato polimerai (Eudragit RS100 ir Eudragit RL100) gauti iš
Evonik Industries AG (Essen, Vokietija). Etilceliuliozė Ethocel Standard 20
Premium gauta iš Colorcon (Jungtinė Karalystė). Transcutol P® gautas iš
Gattefosse (Prancūzija), triacetinas – iš Lanxess (Vokietija), o tioglikolio
rūgštis (99,6 proc.) – iš Merck Group (Darmstadt, Vokietija).
Polisorbatas 40 (Tween 40), polisorbatas 60 (Tween 60), citrinų rūgšties monohidratas, natrio karbonatas, acetonas, benzoinė rūgštis, metanolis, etilacetatas, butilacetatas, acetonas ir trifluoracto rūgštis įsigyti iš
Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Vokietija). Salicilo rūgštis įsigyta iš Alfa Aesar (Vokietija), glicerolis – iš Applichem (Vokietija). 1,2–propandiolis,
polietilenglikolis 400, polietilenglikolis 1500, karbamidas (urėja) įsigyti iš
Roth (Karlsruhe, Vokietija).
Visi kiti naudoti reagentai buvo analitinio grynumo.
Tyrimams naudotos modelinės nago sistemos
Nukirptas žmogaus nagas
Tyrimams naudoti sveikų savanorių (vyrų ir moterų, 25–60 metų am-žiaus) nukirpti distaliniai nagų galiukai. Nagų nuokarpų mėginiai buvo nuplaunami fosfato buferio tirpalu ir visiškai išdžiovinami iki nekintančio svorio.
Galvijų (jaučių) nãgos
Remiantis moksline literatūra [91, 95], alternatyviu žmogaus nago mo-deliu pasirinkti galvijų nagų raginiai sluoksniai. Atrenkant tinkamus nagų pavyzdžius, buvo atsižvelgiama į gyvūno amžių (2–3 metai), nagų sveikatos būklę, raginio sluoksnio vandens praradimo koeficientą (angl. TOWL –
transungual water loss) pokyčius po nago mirkymo.
Šviežios galvijų nagos buvo supjaustomos 4 cm2 dydžio gabalėliais, nuo
kurių skalpeliu visiškai pašalinti likę audiniai, paliekant tik raginę nago dalį. Išvalytos nagos buvo laikomos vandenyje 72 val., 4 °C temperatūroje. Tai sąlygojo pakankamą nagų suminkštėjimą, tačiau neturėjo įtakos TOWL ro-dikliams. Išmirkytos galvijų nagos buvo pjaustomos 60 µm storio sekcijo-mis kriotomu Thermo Scientific Cryotome FSE (JAV). Tinkamos tyrimams sekcijos įvertinamos vizualiai, visiškai išdžiovinamos ir iki tyrimo laikomos –20 °C temperatūroje.
2.3. Tyrimų metodai ir metodikos 2.3.1. Amorolfino hidrochlorido kiekybinis nustatymas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu
Amorolfino HCl kiekybinė analizė atlikta pritaikius skysčių chroma-tografiją ir naudojant Acquity UPLC H – Class System (Waters, JAV) skys-čių chromatografą su diodų matricos detektoriumi. Amorolfino HCl bei naftifino HCl atskirti nuo skilimo produktų ir endogeninių nago kompo-nentų naudota ultra efektyviosios skysčių chromatografijos Acquity UPLC BEH C18 kolonėlė (130Å, užpildyta 1,7 µm dydžio dalelėmis, matmenys 50×2,1 mm) su Acquity UPLC BEH C18 1,7 µm VanGuard prieškolonėle.
Chromatografinės metodikos eliuentų sistema buvo sudaryta iš
tri-fluoracto rūgšties 0,1 proc. (v/v) vandeninio tirpalo (eliuentas A) ir acetonitrilo (eliuentas B). Gradiento kitimas: 0–3 min. 30 proc. B, 3– 4,5 min. 30–60 proc. B; 4,5–5 min. 60–30 proc. B. Judrios fazės tėkmės greitis 0,7 ml/min, injekcijos tūris – 1 µl. Kolonėlė termostatuojama palai-kant 30 °C temperatūrą. Amorolfino HCl detekcija atlikta esant 218 ± 2 nm UV šviesos bangos ilgiui.
Prieš atliekant chromatografinę analizę, visi tyrimuose naudoti mėginiai buvo filtruojami pro 0,20 µm nailoninius membraninius švirkštų filtrus Rotilabo® (Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Vokietija). Išplautas
amorolfino hidrochloridas nustatytas pagal UV spektrą ir sulaikymo laiką, lyginant su etalono sulaikymo laiku.
2.3.2. Naftifino hidrochlorido kiekybinis nustatymas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu
Naftifino HCl kiekybinė analizė atlikta pritaikius skysčių chromatografiją ir naudojant Acquity UPLC H – Class System (Waters, JAV) skysčių chro-matografą su diodų matricos detektoriumi. Amorolfino HCl bei naftifino HCl atskirti nuo skilimo produktų ir endogeninių nago komponentų naudota ultra efektyviosios skysčių chromatografijos Acquity UPLC BEH C18 kolo-nėlė (130Å, užpildyta 1,7 µm dydžio dalelėmis, matmenys 50 × 2,1 mm) su Acquity UPLC BEH C18 1,7 µm VanGuard prieškolonėle.
Chromatografinės metodikos eliuentų sistema buvo sudaryta iš
trifluo-racto rūgšties 0,1 proc. (v/v) vandeninio tirpalo (eliuentas A) ir acetonitrilo (eliuentas B). Gradiento kitimas: 0–3 min 30 proc. B, 3–4 min. 30–50 proc. B; 4–4,5 min. 50–70 proc. B; 4,5–5 min. 70–30 proc. B. Judrios fazės tėk-mės greitis 0,7 ml/min, injekcijos tūris – 1 µl. Kolonėlė termostatuojama pa-laikant 30 °C temperatūrą. Naftifino HCl detekcija atlikta esant 294 ± 2 nm UV šviesos bangos ilgiui.
Prieš atliekant chromatografinę analizę, visi tyrimuose naudoti mėginiai buvo filtruojami pro 0,20 µm nailoninius membraninius švirkštų filtrus Rotilabo® (Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Vokietija). Išplauti
naftifino hidrochloridas nustatytas pagal UV spektrą ir sulaikymo laiką, lyginant su etalono sulaikymo laiku.
2.3.3. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos pritaikymas ir validacija amorolfino hidrochlorido kiekybiniam nustatymui
Amorolfino HCl skysčių chromatografijos metodikos validacija atlikta nustatant šiuos parametrus: specifiškumą, tiesiškumą, tikslumą, glaudumą, aptikimo (LoD) ir kiekybinio nustatymo (LoQ) ribas.
Naudojant 0,1 proc. (v/v) trifluoracto rūgštį ir acetonitrilą bei gradientinį eliuavimą, nustatytas amorolfino HCl sulaikymo laikas Rt = 2,4 min, o
2.3.3.1 pav. Amorolfino hidrochlorido standarto chromatograma
Specifiškumas. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos
spe-cifiškumas vertintas naudojant nukirptus žmogaus nagus (n = 6) bei šviežias galvijų nagas (n = 6). Norint nustatyti ekstrahuojamus junginius, buvo atlikta jų ekstrakcija ultragarso vonelėje USC 1200 THD (VWR, Malaizija) naudojant 1 ml metanolio. Ekstrakcijos trukmė – 45 min.
Efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos specifiškumas vertin-tas pagal chromatogramas (2.3.3.2 ir 2.3.3.3 pav.), gautas injekavus nukirptų žmogaus nagų bei galvijų nagų mėginius su ir be amorolfino HCl. Iš nu-kirptų žmogaus nagų ir galvijų nagų išekstrahuotų komponentų sulaikymo laikai ir UV absorbcijos spektrai buvo lyginami su etaloninio amorolfino HCl sulaikymo laiku ir UV absorbcijos spektru (2.3.3.1 pav).
Aptikimo (LoD) ir kiekybinio nustatymo (LoQ) ribos. Aptikimo ir
kieky-binio nustatymo ribos įvertintos lyginant smailės aukštį su bazinės linijos triukšmu. Skaičiuojant aptikimo ribą, smailės aukščio ir bazinės linijos triukšmo santykis turi būti 3:1, o skaičiuojant kiekybinio nustatymo ribą – 10:1. Remiantis šiais parametrais, aptikimo ir kiekybinio nustatymo ribos apskaičiuotos analizuojant trijų koncentracijų (0,5 µg/ml, 1 µg/ml ir 2 µg/ml) etaloninius tirpalus. Tyrimo metu nustatyta, jog amorolfino HCl aptikimo riba buvo 0,6 µg/ml, o kiekybinio nustatymo riba – 1,9 µg/ml.
2.3.3.2 pav. Žmogaus nago ekstraktų chromatogramos, esant 218 nm
bangos ilgiui
A, B, C, D – žmogaus nago ekstrakcijos komponentai; E – amorolfino hidrochloridas. 1 – žmogaus nago ekstracijos mėginio su amorolfino HCl chromatograma; 2 – žmogaus nago ekstracijos mėginio be amorolfino HCl chromatograma.
Tiesiškumas. Tiesiškumas nustatytas vertinant amorolfino HCl smailės
ploto priklausomybę nuo jo koncentracijos tiriamajame tirpale. Remiantis kiekybinio nustatymo riba, paruošti šešių skirtingų koncentracijų amorolfino HCl etaloniniai tirpalai (2,4–458,65 µg/ml), kurie naudoti kalibracinei krei-vei sudaryti. Kiekvienas tirpalas injekuotas po 3 kartus. Sudaryta kalibra-cinio grafiko determinacijos lygtis: y = 2090x + 1. Nustatytas kalibracinio grafiko determinacijos koeficientas R2
= 0,999910, kuris patvirtino kalibra-cinės kreivės tiesiškumą.
2.3.3.3 pav. Galvijo nagos ekstraktų chromatogramos,
esant 218 nm bangos ilgiui
A, B, C – galvijo nagos ekstrakcijos komponentai; D – amorolfino hidrochloridas. 1 – galvijo nagos ekstracijos mėginio su amorolfino HCl chromatograma; 2 – galvijo nagos ekstracijos mėginio be amorolfino HCl chromatograma.
Tikslumas ir glaudumas. Efektyviosios skysčių chromatografijos
meto-dikos tikslumas ir glaudumas vertintas ruošiant tris serijas trijų skirtingų koncentracijų tirpalus tą pačią dieną (pakartojamumo validacija) ir skirtin-gomis dienomis (atkuriamumo validacija). Tikslumas vertintas pagal pro-centinį nustatytos analitės kiekį, o glaudumas – pagal santykinį standartinį nuokrypį (SSN, proc.). Tikslumo ir glaudumo rezultatai pateikiami 2.3.3.1 lentelėje. Tikslumo ir glaudumo tyrimų rezultatai parodė, kad pakartoja-mumo sąlygomis tikslumas buvo nuo 98,2 proc. iki 100,3 proc., o atkuria-mumo sąlygomis – nuo 97,8 proc. iki 99,8 proc. Glaudumo reikšmės pakar-tojamumo ir atkuriamumo sąlygomis neviršijo 3 proc.
2.3.3.1 lentelė. Amorolfino hidrochlorido efektyviosios skysčių
chromato-grafijos metodikos tikslumo ir glaudumo reikšmės pakartojamumo ir
atku-riamumo sąlygomis.
Analitė Tikslumas Pakartojamumas Atkuriamumas (proc. ) Glaudumas, SSN (proc.) Tikslumas (proc. ) Glaudumas, SSN (proc.)
