Capitolo 2

__________________________________________________

13

__________________________________________________

14

Capitolo 2 : Fitochimica

2.1 Precedenti studi fitochimici sul genere

Euphorbia

Oltre più di trecento pagine di studi si possono ritrovare sul genere Euphorbia ed in base ai precedenti lavori di indagine fitochimica riportati in letteratura, esso risulta caratterizzato da una notevole molteplicità di composti di natura terpenica, quali diterpeni, triterpeni, steroli e da diverse classi di derivati fenolici quali flavonoidi e cumarine. I composti però più rappresentativi di questo genere rimangono quelli terpenoidici.

2.1.1 Terpenoidi

I terpeni sono una grande classe di metaboliti secondari caratterizzati da varietà di strutture, ma aventi in comune la medesima via biogenetica. Questi composti sono multipli interi di più unità isopreniche (Fig. 2.1) a cinque atomi di carbonio legate insieme in modo testa-coda per formare emiterpeni (C5), monoterpeni (C10),

sesquiterpeni (C15), diterpeni (C20).

Fig 2.1 - Unità isoprenica

L’accoppiamento testa-testa del precursore dei sesquiterpeni, farnesil-pirofosfato, porta alla generazione di triterpeni (C30), ed il successivo accoppiamento testa-testa

del geranil-geranil-pirofosfato, precursore dei diterpeni, forma tetraterpeni e carotenoidi (C40) (Dewick, 2002).

__________________________________________________

15

2.1.1.1 Diterpeni

I diterpeni sono costituiti da quattro unità isopreniche legate insieme in modo testa-coda a costituire uno scheletro a 20 atomi di carbonio. Possono essere aciclici, monociclici, biciclici, triciclici, tetraciclici, macrociclici o avere altri scheletri completamente nuovi. Tali composti detengono un ruolo molto spesso importante nei processi di difesa delle piante e hanno un ampio spettro di azione in attività terapeutiche. Il genere Euphorbia risulta molto ricco di tali composti che infatti sono stati abbondantemente studiati e trattati in letteratura. Tali studi hanno consentito l’isolamento di numerosi derivati diterpenici appartenenti alle più svariate classi tra cui:  ent-kaurani  ent-atisani  abietani  ingenani  jatrophani  lathyrani  myrsinani  nuovi scheletri

Consideriamo qui di seguito i principali composti diterpenici isolati dal genere Euphorbia ed analogamente saranno trattati gli altri composti appartenenti alle altre classi di metaboliti secondari.

2.1.1.1.1

Ent

-kaurani

Essi sono caratterizzati da uno scheletro carbonioso a 20 atomi, disposti in tre anelli a 6 atomi di carbonio e in un anello a 5 termini con un ponte carbonioso a due atomi. Questi diterpeni differiscono dai comuni poiché sono enantiomerici ed assumono configurazione invertita in C5, C9 e C10. I composti si differenziano gli uni gli altri a

__________________________________________________

16

Dall’intera pianta Euphorbia wangii Oudejans sono stati isolati per la prima volta quattro composti nuovi (Jia et al., 1994):

 Euphoranginol A 11-acetato (1) (Fig 2.2)  Euphoranginol B (2) (Fig 2.2)  Euphoranginol C (3) (Fig 2.3)  Euphoranginone D (4) (Fig 2.3) R₂ H HO H R₁ 1 R1= H, R2= OAc 2 R1= OH, R2= H

Fig 2.2 - Ent-kaurani: euphoranginol A 11-acetato, euphoranginol B in Euphorbiawangii

Oudejans R H H O 3 R= α-OH, β-H 4 R=O

__________________________________________________

17

2.1.1.1.2

Ent

-atisani

Sono diterpeni costituiti da uno scheletro carbonioso ripiegato a formare quattro anelli a sei termini.

Dall’estratto esanico di Euphorbia fidjiana Boiss. è stato isolato un nuovo diterpene appartenente alla famiglia degli ent-atisani (Cambie et al., 1991):

 ent -14[S],16β,17-triidrossiatisan-3-one (5) (Fig 2.4)

O H OH OH OH H

Fig 2.4 - Diterpene appartenente alla classe degli ent-atisani

Anche dall’Euphorbia acaulis Roxb. Sono identificati stati nuovi composti interessanti (Satti et al., 1988): il primo è stato isolato nel 1988 dal rizoma di tale pianta ed è

 ent -atisane-3β,16α,17-triol (6) (Fig 2.5)

il secondo è stato identificato nel 1990 sempre dal rizoma (Suri et al., 1990) ed è  acido ent -3,4-seco-4,16α,17-triidrossiatisan-3-oico (7) (Fig 2.5)

__________________________________________________

18 R' H CH2OR" OH H 6 R’= H OH, R”= H COOH OH H H CH₂OH HO 7

Fig 2.5 - Ent-atisani da Euphorbia acaulis Roxb.

2.1.1.1.3 Abietani

Numerosi diterpeni appartenenti alla classe degli abietani sono stati trovati nel genere Euphorbia tra cui sei nuovi composti dalla specie E. retusa Forsk. (Haba et al., 2009)

__________________________________________________

19  3,4,18β-ciclopropa-8β-idrossi-14-oxo-ent-abiet-13,15-en-16,12-olide (8) (Fig 2.6)  3,4,18β-ciclopropa-14-oxo-ent-abieta-8,9,13,15-dien-16,12-olide (9) (Fig 2.6)  3,4,18β-ciclopropa-14-oxo-ent-abieta-7,13,15-dien-16,12-olide (10) (Fig 2.6)  3,4,18β-ciclopropa-7 β –idrossi-14-oxo-ent-abieta-8,9,13,15-dien-16,12-olide (11) (Fig 2.6)  3,4,18β-ciclopropa-14-oxo-ent-abiet-7-en-16,12-olide (12) (Fig 2.6)  3,4,18β-ciclopropa-12β-idrossi- ent -abiet-7-en-16,14-olide (13) (Fig 2.6)

8 O O O H H OH H 9 O O O H H 10 O H H H O O 11 O H OH H O O

__________________________________________________

20 12 O H H H H O O 13 O H H OH O H H

Fig 2.6 - Diterpeni con scheletro degli abietani isolati da Euphorbia retusa Forsk.

2.1.1.1.4 Ingenani

Molto numerosi tra le Euphorbiaceae sono anche i composti diterpenici con nucleo degll’ingenano.

Si ritrovano molti lavori recenti di identificazione di nuovi composti appartenenti a questa classe tra cui due esempi sono i sedici nuovi ingenani ottenuti dall’intera pianta di Euphorbia esula L. nel 2007 (Lu et al., 2008). Sono stati isolati:

__________________________________________________

21  17-benzoilossi-3-O-(2,3-dimetilbutanoil)-13-(2,3-dimetilbutanoilossi)-20-deossiingenol (15) (Fig 2.7)  Benzoilossi-3-O-(2,3-dimetilbutanoil)-13-(2,3-dimetilbutanoilossi)ingenol (16) (Fig 2.7)  17-benzoilossi-20-O-(2,3-dimetilbutanoil)-13-(2,3-dimetilbutanoilossi)ingenol (17) (Fig 2.7)  17-benzoilossi-13-octanoilossiingenol (18) (Fig 2.7)  3-O-benzoil-17-benzoilossi-13-octanoilossiingenol (19) (Fig 2.7)  20-O-benzoil-17-benzoilossi-13-octanoilossiingenol (20) (Fig 2.7)  3-O-benzoil-17-benzoilossi-13-octanoilossi-20-deossiingenol (21) (Fig 2.7)  17-benzoilossi-3-O-(2,3-dimetilbutanoil)-13-octanoilossiingenol (22) (Fig 2.7)  17-benzoilossi-20-O-(2,3-dimetilbutanoil)-13-octanoilossiingenol (23) (Fig 2.7)  3-O-benzoil-13,17-dibenzoilossiingenol (24) (Fig 2.7)  13,17-dibenzoilossi-3-O-(2,3-dimetilbutanoil)ingenol (25) (Fig 2.7)  3-O-benzoil-17-benzoilossi-13-(2,3-dimetilbutanoilossi)ingenol (26) (Fig 2.7)  13,17-dibenzoilossi-3-O-(2,3-dimetilbutanoil)-20-deossiingenol (27) (Fig 2.7)  3-O-benzoil-13-octanoilossiingenol (28) (Fig 2.7)  3-O-(2,3-dimetilbutanoil)-13-octanoilossiingenol (29) (Fig 2.7) H R₂ R₄ R₁O HO HO _H R₃ O

__________________________________________________

22 A CO B CO C CH3(CH2)6CO R1 R2 R3 R4 14 A H OB H 15 A OA OB H 16 A OA OB OH 17 H OA OB OA 18 H OC OB OH 19 B OC OB OH 20 H OC OB OB 21 B OC OB H 22 A OC OB OH 23 H OC OB OA 24 B OB OB OH 25 A OB OB OH 26 B OA OB OH 27 A OB OB H 28 B OC H OH 29 A OC H OH

Fig 2.7 - Diterpeni con scheletro degli ingenani isolati da Euphorbia esula L.

Uno dei più recenti studi in cui si ritrova un composto con scheletro nuovo riconducibile all’ingenano risale al 2012 ed è stato fatto su radici di Euphorbia kansui Liou (Khiev et al., 2012). Il nuovo composto è:

 (3S,5R)5-O-(2,3-dimetilbutanoil)-13-O-dodecanoil-20-O-deossiingenol (30) (Fig 2.8)

__________________________________________________

23 O R₃ R1O H R₄O HO H "RH2C 30 R1=H, R”=H, R3=OCO-(CH2)10-CH3, R4= CO-CH(CH3)-CH(CH3)2

Fig 2.8 - Diterpene con scheletro ingenanico

2.1.1.1.5 Jatrophani

Numerosissimi tra le Euphorbiaceae sono anche i diterpeni appartenenti alla classe degli jatrophani. Per citare alcuni dei composti ritrovati analizzeremo quelli scoperti in:

 radici di Euphorbia kansui Liou in cui è stato scoperto per la prima volta (Guo et al., 2010):

__________________________________________________

24 O AcO H H _OAc H OAc O AcO OAc H OH O O

Fig 2.9 - Diterpene isolato da Euphorbia kansui Liou

 intera pianta di Euphorbia pubescens Vahl da cui sono stati isolati tre nuovi diterpeni poliesteri macrociclici con scheletro degli jatrophani (Valente et al., 2003):  Pubescene A (32) (Fig 2.10)  Pubescene B (33) (Fig 2.10)  Pubescene C (34) (Fig 2.10) O R₁O R₃O R₂O H OR₄

__________________________________________________

25 32 R1=R2=R4= Ac, R3= C O 33 R1=R2=R4= Ac, R3= C O CH2-CH2-CH3 34 R1=H, R2=R4= Ac, R3= C O

Fig 2.10 - Jatrophani isolati da Euphorbia pubescens Vahl

 intera pianta di Euphorbia esula L. da cui sono stati identificati due nuovi diterpeni (Gϋnther et al., 1998):

 Esulatin D (35) (Fig 2.11)  Esulatin E (36) (Fig 2.11) 35 O CH2 AcO AcO AcO AcO H AcO OAc

__________________________________________________

26 36 O O OAc AcO CH2 AcO H OAc

Fig 2.11 - Diterpeni isolati da Euphorbia esula L.

2.1.1.1.6 Lathyrani

Anche questi composti diterpenoidici sono diffusi tra la Euphorbiaceae, un esempio fra questi è il: lathyrol-3-fenilacetato-5,15-diacetato (37) noto anche con il nome di deossi Euphorbia factor L1 (Fig 2.12) isolato dalle parti aeree di Euphorbia pithyusa L. subsp. cupanii (Guss.) (Appendino et al., 1999)

O H AcO H H AcPhO AcO

Fig 2.12 - Diterpene isolato da Euphorbia pithyusa L.subsp. cupanii Guss.

Altre due molecole appartenenti a questa classe sono state isolate dall’estratto metanolico di Euphorbia lagascae Spreng. (Duarte et al., 2006):

__________________________________________________

27 38 Latilagascene A (Fig 2.13) 39 Latilagascene B (Fig 2.13) 40 Latilagascene C (Fig 2.13) CH3 H CH3 H CH3 H H H R1OCH2 O CH3 H R2O O O O 38 R1=Ac; R2=H 39 R1= R2= H 40 R1= R2= Ac

Fig 2.13 - Diterpeni isolati da Euphorbia lagascae Spreng.

2.1.1.1.7 Myrsinani

Relativamente meno numerosi ma non meno importanti sono i diterpeni appartenenti alla classe dei myrsinani. Riscontriamo tra questi:

 Euphorbialoids A-J (41-50) (Fig 2.14) isolati ed identificati dalle radici di Euphorbia prolifera Buch-Ham. (Xu et al., 2012):

__________________________________________________

28 R₁O HO OR2 H AcO BzO H H O NicO H 41 R1 = Prop R2= H 42 R1= Ac R2= H 43 R1= Prop R2= Ac 44 R1= Bu R2= Ac O R₁O AcO OR₂ H H OAc O OAc 45 R1= Nic R2= Ac 46 R1= Prop R2= Nic

__________________________________________________

29 O O H AcO H H PropO R3O R2O H OAc OR1 47 R1= Nic R2= Ac R3= H 48 R1= Bz R2= Nic R3= Ac OAc O OBz R₁O H AcO AcO H AcO R₂O 49 R1= Nic R2= Prop 50 R1= i Bu R2= Nic Dove :  Bu = O  Prop = O

__________________________________________________

30  i Bu = O  Bz= O  Nic = O N

Fig 2.14 - Diterpeni isolati da Euphorbia prolifera Buch-Ham.

 Due esteri ciclomyrsinoli ottenuti dall’estratto metanolico delle parti aeree essiccate di Euphorbia microsciadia Boiss. (Ghanadian et al.,2013):

 3-O-propionil-5,10,14-O-triacetil-8-O-(2’-metil-butanoil)-ciclomyrsinol (51) (Fig 2.15)  3,5,10,14,15-O-penta-acetil-8-O-isobutanoil-ciclomyrsinol (52) (Fig 2.15) O Me R₁O R₃O OAc OAc OR₂ H OAc Me Me H H O H

__________________________________________________

31

51 R1= propionil R2= 2’-metil-butanoil R3= H

52 R1= acetil R2= iso-butanoil R3= acetil

Fig 2.15 - Diterpeni isolati da Euphorbia microsciadia Boiss.

2.1.1.1.8 Nuovi scheletri

Sono stati isolati anche diterpeni aventi nuovi scheletri, tra cui il nuovo lattone norditerpene isolato da Euphorbia fischeriana Steud. avente uno scheletro nuovo. Questo composto è stato denominato: fischeria A (53) (Fig 2.16) (Pei et al., 1999).

O H H₃C H H H H H O H₃C H H H _H H CH₃ H H H₃C 53

Fig 2.16 - Fischeria A, isolato da E. fischeriana Steud.

2.2 Composti fenolici

I composti fenolici comprendono un’ampia varietà di metaboliti secondari caratterizzati dal fatto che possiedono almeno un anello benzenico con uno o più sostituenti ossidrilici di tipo fenolico, i quali possono essere liberi, metilati o legati a zuccheri o ad acidi. Quelli di gran lunga più diffusi nel regno vegetale sono i

__________________________________________________

32

flavonoidi, ma numerosi sono anche i composti appartenenti alla sottoclasse dei chinoni, cumarine e tannini (Morelli et al., 2006).

I composti fenolici originano da una cascata di reazioni che prendono avvio dalla biosintesi dell’acido shikimico, da cui si formano gli amminoacidi fenilalanina e tirosina, precursori dei fenilpropanoidi semplici e ciclici (cumarine), e sono anche base dello scheletro dei flavonoidi che terminano la loro sintesi tramite l’unione della via dello shikimato con la via dell’acetato o via polichetidica, e dunque caratterizzati da biosintesi mista.

Nel genere Euphorbia sono stati isolati sia flavonoidi che cumarine.

2.2.1 Cumarine

Le cumarine sono fenilpropanoidi ciclici che derivano dall’acido cinnamico.

Le cumarine sono lattoni aromatici biciclici, con il nucleo dell’ α-cromone o 2H-cromen-2-one (Fig 2.17).

O O

Fig 2.17 - Nucleo dell’α-cromone o 2H-cromen-2-one

Possono essere classificate in base alla natura dei loro sostituenti in (Dewick, 2002):

 idrossicumarine  furanocumarine  piranocumarine  cumarine glicosilate

Nel genere Euphorbia sono state isolate specialmente due cumarine in particolar modonell’Euphorbia lunulata Bge. (Yang et al., 2011):

__________________________________________________

33  esculetina (54) (Fig 2.18) O O HO HO 54

Fig 2.18 - Cumarina isolata da Euphorbia lunulata Bge.

Dall’estratto metanolico dell’Euphorbia lagascae Spreng. (Duarte et al., 2010):  scopoletina (55) (Fig 2.19)

O MeO

HO O

55

Fig 2.19 - Cumarina isolata da Euphorbia lagascae Spreng.

Si possono trovare anche sottoforma di glicosidi di vario genere come sono stati riscontrati nelle radici dell’Euphorbia soongarica Boiss. tra cui (Shi et al., 2009):

 esculetina-6-O-(6’-O-galloil)-β-D-galattopiranoside (56) (Fig 2.20)

__________________________________________________

34 O RO HO R₁ O 56 R= O HO OH CH2 OH O C O OH OH OH R1= H 57 R= O HO OH CH2 OH O O C O OH OH OH R1= CH3

Fig 2.20 - Cumarine isolate da Euphorbia soongarica Boiss.

2.2.2 Flavonoidi

E’ una classe di metaboliti secondari molto diffusi nel regno vegetale, soprattutto sottoforma di glicosidi. Si riscontrano numerosi anche nel genere Euphorbia. Alcuni esempi tra questi sono:

 quercetina, kaempferolo, apigenina e luteolina isolati in Euphorbia lunulata Bge. (Yang et al., 2011).

__________________________________________________

35

Altri flavonoidi con struttura analoga, diversi sostituenti e glicosilazioni sono stati isolati anche dalle parti aeree di Euphorbia petiolata Bank & Sol. (Nazemiyeh et al., 2010) come:

 O-glucoside, kaempferolo 3-O-(2-O-galloil)-glucoside, miricetina3-O-ramnoside, quercetina3-O-glucoside, kaempferolo3-O-glucoside, quercetina 3-O-ramnoside, kaempferolo3-O-ramnoside, quercetina3-O-rutenoside.

2.3 Precedenti studi sperimentali sulla specie

Euphorbia

laurifolia

Non esistono ad oggi studi fitochimici sulle foglie della pianta. Gli unici riferimenti bibliografici su Euphorbia laurifolia si riferiscono a questi studi: il primo riguarda gli effetti dei diterpeni isolati dal latice di tale pianta e di Euphorbia lactea in riferimento alla riattivazione del virus tipo 1 dell’immunodeficienza umana per eliminare focolai virali resistenti ad HAART (Highly Active Anti-Retroviral Therapy, ossia terapia antiretrovirale altamente attiva, mediante l’uso contemporaneo di tre o più farmaci antiretrovirali per il trattamento dell’infezione da HIV) e latenti; da qui la ricerca di molecole che possano riattivare il provirus latente da utilizzarsi insieme all’attuale terapia antiretrovirale. Sono state isolate tre molecole di cui due nuovi diterpeni (58 e 59) da Euphorbia laurifolia Juss. ex Lam. e (60) da Euphorbia lactea Haw. identificato come 3,12-O-acetil-8-O-tigloil-ingol (Fig 2.21) (Avila et al., 2010):

__________________________________________________

36 H H O H O O O O O O 58 O O H O H O H O O O 59 O O AcO OAc H H OTig OH 60

__________________________________________________

37

Il secondo è uno studio fitochimico su Euphorbia latazi Kunth. volto a identificare i composti contenuti all’interno del latice ottenuto da tale pianta. E’ stato isolato ed identificato un solo nuovo diterpene con scheletro del lathyrano sottoforma di polvere bianca amorfa. Il nuovo scheletro è stato determinato dalla combinazione di tecniche di spettroscopia NMR mono e bidimensionale e ed è stato identificato come:

 8α,15β-diacetossi-7β-benzoilossi-3β-(2-metilpropanoilossi)-4αH,9αH,11αH-lathyra-5E,12E-dien-14-one o più semplicemente latazienone (61) (Fig 2.22) (Rondòn et al., 2005). O O O H O O O O O O 61