NATRIO VALPROATO POVEIKIO TYRIMAS SMULKIALĄSTELINIO PLAUČIŲ VĖŽIO LĄSTELIŲ NAVIKŲ INVAZIJAI IR NEOANGIOGENEZEI TAIKANT VIŠČIUKO EMBRIONO CHORIOALANTOJINĖS MEMBRANOS MODELĮ

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA

Lina Šlekienė

NATRIO VALPROATO POVEIKIO TYRIMAS

SMULKIALĄSTELINIO PLAUČIŲ VĖŽIO

LĄSTELIŲ NAVIKŲ INVAZIJAI IR

NEOANGIOGENEZEI TAIKANT VIŠČIUKO

EMBRIONO CHORIOALANTOJINĖS

MEMBRANOS MODELĮ

Disertacija rengta 2013–2018 metais Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademijos Histologijos ir embriologijos katedroje.

Mokslinė vadovė

prof. habil. dr. Angelija Valančiūtė (Lietuvos sveikatos mokslų universi-tetas, biomedicinos mokslai, biologija – 01B)

Disertacija ginama Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademijos Biologijos mokslų krypties taryboje:

Pirmininkas:

prof. habil. dr. Limas Kupčinskas (Lietuvos sveikatos mokslų universi-tetas, biomedicinos mokslai, biologija – 01B)

Nariai:

dr. Vacis Tatarūnas (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, biomedi-cinos mokslai, biologija – 01B);

doc. dr. Jurgita Skiecevičienė (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, biomedicinos mokslai, biologija – 01B);

prof. dr. Violeta Žalgevičienė (Vilniaus universitetas, biomedicinos mokslai, medicina – 06B);

doc. dr. Ivan Varga (Bratislavos Komenskio universitetas, biomedicinos mokslai, biologija – 01B).

Disertacija ginama viešame Biologijos mokslo krypties tarybos posėdyje 2018 m. birželio 11 d. 16 val. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Rekto-rato posėdžių salėje.

LITHUANIAN UNIVERSITY OF HEALTH SCIENCES MEDICAL ACADEMY

Lina Šlekienė

THE INVESTIGATION OF SODIUM

VALPROATE EFFECT ON THE INVASION

AND NEO-ANGIOGENESIS OF SMALL CELL

LUNG CANCER CELL LINE TUMORS USING

CHICKEN EMBRYO CHORIOALLANTOIC

MEMBRANE

Doctoral Dissertation Biomedical Sciences,

Biology (01B)

Dissertation has been prepared at the Department of Histology and Embryo-logy of Medical Academy of Lithuanian University of Health Sciences during the period of 2013–2018.

Scientific supervisor:

Prof. Dr. Habil. Angelija Valančiūtė (Lithuanian University of Health Scien-ces, Biomedical ScienScien-ces, Biology – 01B)

Dissertation is defended at the Biology Research Council of Medical Academy of the Lithuanian University of Health Sciences.

Chairperson

Prof. Dr. Habil. Limas Kupčinskas (Lithuanian University of Health Sciences, Biomedical Sciences, Biology – 01B)

Members

Dr. Vacis Tatarūnas (Lithuanian University of Health Sciences, Biomedical Sciences, Biology – 01B)

Assoc. Prof. Dr. Jurgita Skiecevičienė (Lithuanian University of Health Sciences, Biomedical Sciences, Biology – 01B)

Prof. Dr. Violeta Žalgevičienė (Vilnius University, Biomedical Sciences, Medicine – 06B)

Assoc. Prof. Dr. Ivan Varga (Commenius University of Bratislava, Biomedi-cal Sciences, Biology – 01B)

The dissertation will be defended at the open session of the Biology Research Council of Lithuanian University of Health Sciences at 16 p.m. on the 11th _of

June, 2018 at the Rectorate Meeting Hall of Lithuanian University of Health Sciences.

5

TURINYS

SANTRUMPOS ... 7

ĮVADAS ... 8

1. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 10

2. LITERATŪROS APŽVALGA ... 12

2.1. Plaučių vėžio klasifikacija ir paplitimas ... 12

2.2. Glioblastomos klasifikacija ir paplitimas ... 13

2.3. SLPV vėžio biologinės ypatybės ir imuninių žymenų mutantinio p53, EZH2, PLBA ir CD56 vaidmuo diagnostikai ... 15

2.4. Glioblastomos biologinės ypatybės ir imuninių žymenų mutantinio p53, EZH2 ir PLBA vaidmuo diagnostikai ... 18

2.5. NCI-H146 ir U-87 ląstelių charakteristika ... 20

2.5.1. NCI-H146 ląstelių charakteristika ... 20

2.5.2. U-87 ląstelių charakteristika ... 21

2.5.3. NCI-H146 ir U-87 ląstelių embriologinės kilmės sąsajos ... 21

2.6. Viščiuko embriono CAM formavimasis ir struktūra ... 23

2.7. Viščiuko embriono CAM panaudojimas navikinių ląstelių transplantavimo bei angiogenezės tyrimo modeliams ... 26

2.8. Natrio valproato naudojimas eksperimentiniams CAM modeliams ... 29

2.9. Natrio valproato, kaip priešvėžinės medžiagos vartojimas, NCI-H146 ir U-87 ląstelių linijose ... 30

3. DARBO METODIKA ... 34

3.1. Viščiuko embriono chorioalantojinė membrana kaip eksperimentinis modelis joje sukeltų navikų analizei ... 34

3.1.1. Kiaušinių inkubavimas ir langelių atidarymas ... 34

3.1.2. NCI-H146 ląstelių auginimo ir skaičiavimo metodika ... 34

3.1.3. U-87 ląstelių auginimo ir skaičiavimo metodika ... 36

3.2. Navikinių modelių, siekiant CAM ir navike sukelti neoangiogeninį atsaką, formavimo ypatumai ... 38

3.2.1. Pagrindiniai absorbuojančios kempinėlės-chorioalantojinės membranos navikinio modelio formavimo elementai ... 39

3.2.2. NCI-H146 ir U-87 ląstelių navikų galutinio suformavimo ir jų implantavimo ant viščiuko embriono CAM etapai naudojant absorbuojančios kempinėlės-CAM metodiką ... 42

3.3. Eksperimentinių CAM ir ant jos prigijusių NCI-H146 ir U-87 ląstelių suformuotų navikų bei kontrolinių CAM įvertinimas in vivo biomikroskopijos, fluorescencinės stereomikroskopijos, histologiniu bei histomorfometriniu ir imunohistocheminiu tyrimo metodais ... 45

3.3.1. Eksperimentinių CAM ir ant jos prigijusių NCI-H146 ir U-87 ląstelių suformuotų navikų in vivo biomikroskopijos, fluorescencijos ir histologinis tyrimo metodai ... 45

6

3.3.2. Kontrolinių ir eksperimentinių CAM bei navikų, suformuotų iš

NCI-H146 ir U-87 ląstelių, histomorfometrinės analizės metodika ... 48

3.3.3. Imunohistochemija antikūnais prieš mutantinį p53, EZH2 ir PLBA NCI-H146 ir U-87 ląstelių suformuotuose navikuose ... 50

3.3.4. Imunohistochemija antikūnais prieš CD56, E- ir N-kadheriną tik NCI-H146 ląstelių suformuotuose navikuose ... 51

3.4. Statistinė duomenų analizė ... 52

4. DARBO REZULTATAI ... 54

4.1. Eksperimentinių navikų formavimasis ir jų plitimas CAM priklausomai nuo NaVP koncentracijos ... 54

4.1.1. NCI-H146 ląstelių suformuotų navikų in vivo biomikroskopinis tyrimas bei invazija į CAM mezenchimą ir jos palyginimas su U-87 ląstelių linija ... 54

4.1.2. NCI-H146 ląstelių migracija CAM paviršiumi nuo suformuotų navikų . 63 4.1.3. Navikinių ląstelių fenotipas ir jo kitimas invazyvuojant į CAM mezenchimą ir migruojant CAM paviršiumi ... 65

4.2. Navikų poveikyje susiformavusi neoangiogenezė ir CAM pokyčiai priklausomai nuo NaVP koncentracijos ... 70

4.2.1. Ant CAM suformuotų NCI-H146 ląstelių navikų įtaka kraujagyslių skaičiui po naviku bei šoninėse zonose ... 70

4.2.2. NCI-H146 ląstelių navikų įtaka CAM kraujagyslių plotui po naviku ir šoninėse zonose ... 72

4.2.3. NCI-H146 ląstelių navikų įtaka CAM storiui po naviku ir šoninėse nuo naviko zonose ... 74

4.3. Imunohistocheminis EZH2, p53 ir PLBA žymenų raiškos kiekybinis tyrimas priklausomai nuo NaVP koncentracijos ... 76

4.3.1. Navikinių žymenų p53, EZH2 ir PLBA koreliacija su kraujagyslių skaičiumi priklausomai nuo NaVP koncentracijos ... 82

4.3.2. Navikinių žymenų p53, EZH2 ir PLBA raiškos palyginimas tarp NCI-H146 ir U-87 navikų, transplantuotų ant CAM ... 82

5. DARBO REZULTATŲ APTARIMAS ... 86

5.1. Navikų invazijos į CAM ir navikinių ląstelių migravimo jos paviršiumi rezultatų aptarimas ... 86

5.2. Neoangiogenezės ir CAM pokyčių rezultatų aptarimas ... 88

5.3. Imunohistocheminio tyrimo rezultatų aptarimas ... 92

IŠVADOS ... 95 LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 96 PUBLIKACIJŲ SĄRAŠAS ... 109 SUMMARY... 149 CURRICULUM VITAE ... 160 PADĖKA ... 161

7

SANTRUMPOS

CAM – chorioalantojinė membrana

CD5 – nervinių ląstelių adhezijos molekulė (angl. Cluster of Differentiation 56)

ChE – chorioninis epitelis CNS – centrinė nervų sistema

ED50 – vidutinė efektyvi dozė (angl. Median Effective dose) EMT – epitelio mezenchimos tranzicija

ES – Europos Sąjunga

EZH2 – zeste homologo 2 enhanceris GBM – multiforminė glioblastoma H+E – hematoksilinas ir eozinas HDAC – histonų deacetilazės

HDACI – histonų deacetilazių inhibitoriai IFN – interferonas

NaVP – natrio valproatas

NSLPV – nesmulkiųjų ląstelių plaučių vėžys p53 – genas p53

PLBA – proliferuojančių ląstelių branduolių antigenas

PRC – „Polycomb“ slopinimo kompleksas (angl. “Polycomb” repressive complex)

PSO – Pasaulinė sveikatos organizacija RB – retinoblastomos baltymas SLPV – smulkiųjų ląstelių plaučių vėžys

8

ĮVADAS

Neuroendokrininės kilmės navikai sudaro 20 proc. plaučių navikų atvejų. Apie 15 proc. iš jų yra smulkiųjų ląstelių plaučių vėžys (SLPV), kuriam rūkymas turi didžiulę įtaką [1–3]. Lyginant su kitais plaučių navikais, SLPV būdingas greitas ląstelių dauginimasis bei ankstyvos metastazės [4]. Daugu-mai tolesnės stadijos pacientų būna hematogeninės metastazės ir tik apie trečdaliui pacientų metastazės pasireiškia krūtinės srityje. Nors šie navikai iš pradžių yra jautrūs chemoterapijai ir radioterapijai, vis dėlto pacientai miršta dėl ligos progresavimo ir atsinaujinimo [2, 5, 6], o išgyvenamumas iki 5 metų neviršija 5 proc. [1].

Multiforminės glioblastomos (GBM) yra vienos letaliausių vėžio formų, nes vidutinis išgyvenamumas trunka 10–12 mėnesių. Priešingai nei SLPV, GBM retai metastazuoja. Pacientų išgyvenamumą lemia atsparumas chemo-terapiniams preparatams ir invazija į sveikus smegenų audinius [7]. Taikant operacinį ir chemoterapinį gydymo būdą ar taikant vieną iš jų, glioblastomos gydymas išlieka paliatyvus, nes išgyvenamumas trunka 6–8 mėnesius, ir tik keletas pacientų išgyvena iki 2 metų išgyvenamumo ribos [8, 9].

SLPV metastazuoti didelės įtakos turi naujų kraujagyslių susidarymas (neoangiogenezė), todėl šie navikai ypač tinka norint tyrinėti angiogeninius mechanizmus bei antiangiogenines chemines medžiagas [10]. Savitą angio-genezės patogenezę turi ir GBM navikai, kuriems būdinga mikrokraujagyslių hiperproliferacija, edema bei hemoragijos [11].

Natrio valproatas (NaVP), vartojamas kaip antikonvulsinė medžiaga, pastaruoju metu vis daugiau tyrinėjamas dėl jo antiangiogeninių ir antinavi-kinių savybių [12]. Šiuo metu atlikti in vitro tyrimai su U-87 glioblastomos ląstelėmis ir NaVP nepateikė statistiškai reikšmingų rezultatų, įrodančių NaVP antiangiogenines savybes, kai NaVP buvo naudojamas terapinėmis dozėmis [13]. Kombinuojant NaVP su kitais chemoterapiniais vaistais, GBM augimas labai sumažėjo [14]. Vadinasi, NaVP išlieka perspektyvus gydant gliomas.

Kitaip nei GBM, SLPV yra mažai tyrinėjamas ieškant naujų terapinių gydymo priemonių. Yra įrodymų, kad gana nedidelės NaVP dozės in vitro sąlygomis slopino SLPV ląstelių augimą [15]. Tačiau vėliau buvo įrodyta, kad vieno NaVP terapinės dozės poveikis nėra toks efektyvus, kaip standar-tinių chemoterapinių priemonių [16, 17]. Tyrimai su SLPV ir GBM ląstelių linijomis vertina moduliacinius mechanizmus, DNR pažaidą, apoptozę, tačiau mažai yra tyrimų, kurie vertintų navikų sukeltą neoangiogenezę, invaziją ir ieškotų tinkamų in vivo sąlygomis antiangiogeninių medžiagų, dėl kurių sumažėtų SLPV metastazavimas bei lokalus GBM išplitimas. Įvairūs

9

literatūros šaltiniai pateikia skirtingus rezultatus, ypač SLPV atžvilgiu. Todėl atliekant šį tyrimą, buvo patikrinta kaip NaVP veikia mažai tyrinėjamą SLPV ląstelių in vivo sukeltą neoangiogenezę.

Disertacijoje taip pat bus palyginti navikų, suformuotų iš dviejų skirtingų ląstelių linijų (NCI-H146 ir U-87), invazijos į chorioalantojinės membranos (CAM) mezenchimą dažnis bei navikinių žymenų p53, EZH2 ir proliferuo-jančių ląstelių branduolio antigeno (PLBA) raiškos pokyčiai priklausomi nuo NaVP koncentracijos. Tyrimui pasirinktos ląstelės yra komercinės ląstelių linijos, išskirtos iš pacientų, sergančių orfaninėmis ligomis – SLPV ir GBM. Šios ląstelės turi embriologinės kilmės sąsajų ir pasižymi daugelio tų pačių žymenų raiška. p53 yra transkripcijos veiksnys, reguliuojantis ląstelės ciklo pabaigą. Tai svarbus baltymas, užtikrinantis vėžinių ląstelių nuslopinimą. Dažnai pasitaikantis genetinis pokytis daugelio rūšių piktybiniuose navikuose yra p53 geno mutacija. Mutantinio geno koduojamas p53 baltymas prisiriša prie DNR ir aktyvuoja tam tikrų genų raišką, kurie lemia nereguliuojamą ląstelių proliferaciją. PLBA raiška taip pat padidėja daugelio vėžinių ląstelių branduoliuose. PLBA aptinkamas ląstelės ciklo vėlyvojoje G1 ir S fazėse [18].

Jis yra nukleoproteinas, reikalingas DNR sintezei ir replikacijai [19]. Kadangi vėžio vystymasis yra siejamas ne tik su genetinias, bet ir su epigenetiniais pokyčiais, todėl buvo tiriama ir epigenetinio reguliatoriaus EZH2 raiška. „Polycomb“ baltymai yra svarbūs epigenetiniai reguliatoriai, kurie gali nuslopinti genų raišką per chromatino modifikacijas. EZH2 yra vienas iš ,,Polycomb“ slopinimo komplekso (angl. Polycomb repressive complex) PRC2 komponentų, svarbus vėžio susiformavimui, progresavimui, metasta-zavimui ir galimai lemia jo atsparumą vaistams [20]. Ląstelių fenotipo kaita atspindi ląstelių gebėjimą migruoti ir charakterizuoja jų piktybiškumą. Ląstelių fenotipas nustatomas naudojant epitelinius bei mezenchiminius žymenis. Epitelinio fenotipo pasikeitimas mezenchiminiu indikuoja padidė-jusią ląstelių gebą migruoti ir invazyvuoti į aplinkinius audinius. Šiame darbe naudojant epitelinį žymenį E-kadheriną ir mezenchiminius žymenis N-kadhe-riną bei vimentiną, buvo nustatyti ląstelių fenotipo pokyčiai, sietini su NaVP poveikiu.

10

1. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas

Nustatyti ir įvertinti viščiuko embriono chorioalantojinės membranos ir smulkialąstelinio plaučių vėžio navikų pokyčius priklausomai nuo natrio valproato koncentracijos ir juos palyginti su pokyčiais glioblastomos navi-kuose.

Hipotezės:

(1) Natrio valproatas priklausomai nuo koncentracijos mažina SLPV navikų invaziją į CAM, angiogenezę, navikinių žymenų raišką. (2) Giminingos embriologinės kilmės SLPV ir GBM ląstelių linijų

navikų invazija ir p53, EZH2 ir PLBA žymenų raiška yra priklau-soma nuo natrio valproato koncentracijos.

Uždaviniai:

1. Sukūrus navikinį modelį, palyginti smulkialąstelinio plaučių vėžio NCI-H146 ir glioblastomos U-87 ląstelių linijų suformuotų navikų invazijos į CAM dažnį bei įvertinti NCI-H146 ląstelių migracijos CAM paviršiuje dažnį priklausomai nuo NaVP koncentracijos ir invazijos tipo.

2. Įvertinti plintančių CAM paviršiumi NCI-H146 navikinių ląstelių fenotipą imunohistochemiškai tiriant epitelinius ir mezenchiminius žymenis ir fenotipo kitimą priklausomai nuo NaVP poveikio. 3. Įvertinti viščiuko embriono CAM pokyčius bei NCI-H146 navikų

sukeltą neoangiogenezę membranoje bei navike priklausomai nuo NaVP koncentracijos.

4. Įvertinti NCI-H146 navikų ląstelių imunohistocheminių žymenų p53, EZH2 ir PLBA raiškos pokyčius priklausomai nuo NaVP koncentracijos.

5. Palyginti NCI-H146 ir U-87 ląstelių navikų imunohistocheminių žymenų p53, EZH2 ir PLBA raiškos pokyčius esant tai pačiai NaVP koncentracijai.

Darbo mokslinis naujumas

Viščiuko embriono CAM vis dažniau tampa patraukliu eksperimentiniu modeliu, ypač tiriant navikines ląsteles. Smulkialąstelinis plaučių vėžys pasižymi geru pradiniu atsaku į chemoterapiją, tačiau greitai recidyvuoja ir dėl vėlyvo diagnozavimo greitai išplinta į gretimus organus [21]. Standartinei

11

chemoterapijai neduodant teigiamų rezultatų, reikalingi tolesni ir tikslesni SLPV antiangiogeninių ir chemoterapinių medžiagų tyrimai.

Kadangi SLPV metastazavimui didelės reikšmės turi angiogeninis indeksas [22], todėl antiangiogeninių medžiagų tyrimai turi būti aiškinami ir suvokiami ne tik in vitro sistemose, bet ir in vivo.

Glioblastomos pasižymi atsparumu chemoterapijai ir invazija į sveikus smegenų audinius, o dauguma pacientų išgyvena vos vienerius metus [7].

Modeliuose iki šiol yra atlikta nemažai eksperimentų, vertinančių įvairių medžiagų poveikį CAM kraujotakai. CAM yra puikus modelis ikikliniki-niams su angiogeneze susijusiems tyrimams atlikti [23–26]. Taip pat plačiai yra nagrinėjamas įvairių medžiagų, tarp jų ir anti-angiogeninių bei galimų chemoterapinių, poveikis SLPV ląstelėms in vitro sąlygomis [27–29]. Žymiai mažiau tyrimų yra atlikta vertinant SLPV ląstelių NCI-H146 ir GBM ląstelių U-87 poveikį taikant CAM metodiką [30]. Šis tyrimas yra pirmasis, vertinan-tis NCI-H146 ir U-87 navikų elgseną naudojant unikalų 3D modelį ir pasitel-kiant viščiuko embriono CAM, kurios pokyčiai vėliau vertinami atsižvelgiant į kintančią NaVP koncentraciją. Be to, CAM yra žinoma kaip labai vaskulia-rizuota struktūra ir ypač tinka su angiogeneze susijusiems tokio tipo eksperi-mentams atlikti. Kol kas nėra palyginamųjų tyrimų vertinant NCI-H146 ir U-87 ląstelių suformuotų navikų sukeltą invaziją į CAM bei jų atsaką į NaVP, kuris vertinamas navikus žymint navikiniais žymenimis. Teoriškai yra žinoma, kad SLPV ir glioblastomoms būdinga bendra embriologinė kilmė. Mūsų atlikti pirmieji palyginamieji eksperimentai įrodo, kad ir NCI-H146, ir U-87 ląstelių linijų navikai pasižymi labai panašiomis imunohistocheminėmis navikinių žymenų raiškomis paveikus juos NaVP. Visa tai gali padėti toliau plėtoti su šių navikų terapinėmis galimybėmis susijusias studijas ir turėti sąsajų. Mūsų eksperimentas yra pirmasis pasaulyje, kuriame buvo nustatyta NaVP paveiktų NCI-H146 ląstelių specifinė migracija CAM paviršiumi. Be to, buvo nustatytas labai pakitęs fenotipas, kuris ateityje bus naudingas tiriant SLPV vėžio morfologines ypatybes veikiant NaVP.

12

2. LITERATŪROS APŽVALGA

2.1. Plaučių vėžio klasifikacija ir paplitimas

Plaučių vėžys yra viena labiausiai paplitusių ir letaliausių vėžio formų. Taip yra dėl vėlyvos diagnozės, mažo klinikinio atsako bei rezistentiškumo chemoterapinėms medžiagoms. Tačiau tiksli plaučių vėžio patogenezė nėra nustatyta iki šiol. Ankstyvų stadijų plaučių vėžio diagnostika galėtų pakeisti ligos pasekmes, o epigenetinių modifikacijų perpratimas būtų naudingas kontroliuojant ligą. Viena iš tiksliai apibrėžtų modifikacijų yra histonų modifikacijos, stipriai veikiančios chromatino išsidėstymą bei genų raišką esant vėžiniams pakitimams [31]. Remiantis Amerikos vėžio organizacijos duomenimis, 2014 metais buvo manoma, kad atsiras dugiau kaip 500 tūkst. naujų vėžio atvejų. Plaučių, prostatos ir tiesiosios žarnos vėžys vyrams bei plaučių, krūties ir tiesiosios žarnos vėžys moterims išlieka vieni dažniausių navikinių susirgimų bei mirties priežasčių. Šie 4 vėžio tipai užima beveik pusę visų vyrų ir moterų vėžio atvejų, o plaučių vėžys sudaro daugiau nei 25 proc. visų vėžio atvejų [32, 33].

Adenokarcinomos ir plokščiųjų ląstelių karcinomos (PLK) yra du pagrindiniai histologiškai skiriami karcinomų potipiai, sudarantys 90 proc. visų plaučių vėžio tipų. Plokščiųjų ląstelių karcinoma yra dažnesnė nei adenokarcinoma. Tačiau adenokarcinomos turi tendenciją dažniau susidaryti nerūkančiųjų plaučiuose. Atsižvelgiant į tai, kad plaučių adenokarcinomos yra heterogeninės kilmės navikas su nenuspėjama prognoze, įvairios organizacijos pateikia naujas klasifikavimo gaires [34]. 2004 metais Pasauli-nė sveikatos organizacija (PSO) patvirtino plaučių navikų klasifikaciją, o 2011 metais Tarptautinė plaučių vėžio tyrimų, Amerikos krūtinės ląstos bei Europos respiratologų draugija pasiūlė adenokarcinomų klasifikaciją.

Morfologiškai skiriami keturi pagrindiniai histologiniai tipai: plokščiųjų ląstelių karcinoma, adenokarcinoma, didelių ląstelių karcinoma, smulkiųjų ląstelių karcinoma. Visi jie klinikinėje praktikoje, atsižvelgiant į plaučių vėžio biologiją, prognozę ir gydymo taktiką, skirstomi į nesmulkiųjų ir smul-kiųjų ląstelių plaučių vėžį [35]. Manoma, kad SLPV yra kilęs iš neuroekto-derminių ląstelių [36], o 1926 metais buvo nustatyta jo epitelinių ląstelių kilmė [37]. Vėliau buvo detaliau aprašyti šios onkologinės ligos klinikiniai ypatumai. Dažniausiai navikas randamas krūtinės centre radiologinio tyrimo metu. Jam būdinga tendencija: anksti pasklisti po aplinkinius audinius, teigia-mas chemoterapinio gydymo poveikis ligos pradžioje ir dažnos metastazės. Šie požymiai išliko nepakitę apie 40 metų po to, kai buvo paskelbti, todėl drąsiai galima teigti, kad SLPV yra itin agresyvus plaučių navikas. Nors

13

daugeliui pacientų SLPV pasiduoda chemoterapiniam gydymui, tačiau daugiau nei 95 proc. tokių atvejų baigiasi mirtimi, o 5 metų išgyvenamumas neviršija 5 proc. [37, 38]. Daugelio autorių teigimu ši plaučių vėžio forma sudaro apie 12–16 proc. visų plaučių vėžio atvejų [21, 39–41]. Vis dėlto didelį mirtingumą lemia tai, kad SLPV yra diagnozuojamas vėlesnėse stadijose, kai gydymas retai kada būna sėkmingas. Be to, SLPV atveju yra trumpas išgyve-namumo laikas (7–12 mėnesių) nuo ligos diagnozavimo. Išgyvenamumas pacientų, sergančių plaučių vėžiu, ypač SLPV, labai priklauso nuo ankstyvos diagnostikos ir efektyvaus gydymo [42].

Fenotipiniu požiūriu SLPV potipiai buvo apibūdinti kaip „avižos grūdo“ arba mišrūs. Tačiau šie terminai PSO klasifikacijoje šiuo metu nevartojami. PSO duomenimis prieš tai vadinti „mišrūs“ potipiai dabar yra priskiriami nesmulkiųjų ląstelių plaučių vėžiui (NSLPV). Atvejų daugėjimas numatomas šalyse, kur rūkymo paplitimas išlieka didelis, pvz., Rytų Europa ir Azija [43]. Daugiau nei 90 proc. SLPV susidaro vyresnio amžiaus rūkančiųjų arba prieš tai rūkiusiųjų plaučiuose. Be to, rūkymo trukmės ir intensyvumo didinimas riziką susirgti tik didina [21, 44].

Remiantis Europos ir Lietuvos plaučių vėžio statistiniais duomenimis, moterų ir vyrų mirtingumas skiriasi. Europos sąjungos (ES) plaučių vėžio mirtingumo rodiklis siekia 40,5 atv. 100 tūkst. gyv., o moterų mirtingumo rodiklis ES yra 12,8 atv. 100 tūkst. gyv.; jis yra antroje vietoje po krūties vėžio. 2008 metų duomenimis Lietuvos vyrų rodikliai buvo prastesni negu ES vidurkis: mirtingumas – 49,8 atv. 100 tūkst. gyv., o sergamumas – 55,6 atv. 100 tūkst. gyv. Tačiau geresni buvo moterų rodikliai: sergamumas siekė 6,5 atv. 100 tūkst. gyv., o mirtingumas – 5,7 atv. 100 tūkst. gyv., tai yra žymiai mažiau už ES moterų vidurkį. Vis dėlto Lietuvos vyrų plaučių vėžio epidemiologiniai rodikliai verčia skirti daugiau dėmesio šios ligos diagnos-tikai, gydymui ir profilaktikai [35].

2.2. Glioblastomos klasifikacija ir paplitimas

GBM yra dažniausiai pasitaikantis pirminis centrinės nervų sistemos (CNS) navikas [45–47] Jungtinėse Amerikos Valstijose (JAV) ir Europos Sąjungoje. Jis kasmet apytiksliai naujai diagnozuojamas 3 atvejais iš 100 000 žmonių [48] ir sudaro maždaug 51 proc. visų gliomos atvejų. Tai yra piktybiš-kiausias astrocitinės kilmės navikas su šiomis histopatologinėmis savybėmis: ląstelių polimorfizmas, greitas mitozinis aktyvumas, mikrokraujagyslių proli-feracija ir nekrozė [49].

14

PSO duomenimis gliomos klasifikuojamos į 4 tipus (I–IV) priklausomai nuo histologinių charakteristikų, kurios koreliuoja su prognoze ir išgyvena-mumu. Pagal PSO glioblastoma yra 4 tipo glioma, kuri yra pati piktybiš-kiausia. Seniai žinoma, kad mažesnio laipsnio gliomos gali atsistatyti, progre-suoti ir transformuotis į glioblastomas, kurios yra apibūdinamos kaip antrinės, tačiau de novo būdu susiformuojantys glioblastomų navikai yra vertinami kaip pirminiai [50].

Atsižvelgiant į pirminių CNS navikų pasiskirstymą, apie 75 proc. visų gliomų yra astrocitomos, kurios specifiškai kilusios iš astrocitų. Tačiau pirminiai CNS navikai – gliomos – yra kilusios iš astrocitų, oligodendrocitų bei ependiminių ląstelių. Be glioblastomų, sudarančių didžiąją dalį CNS navikų atvejų, likusi dalis yra III laipsnio anaplastinės astrocitomos (7,5 proc.), II laipsnio difuzinės astrocitomos (1,5 proc.), I laipsnio pilocitinės astrocitomos (5,8 proc.), oligodendrogliomos (8,4 proc.), ependimomos (5,8 proc.), kito tipo gliomos (11,1 proc.) ir kito tipo astrocitomos (8,7 proc.) [50]. Nepaisant pažangių chemoterapinių galimybių ir dažniausiai vartojamo temozolamido, vidutinis išgyvenamumas lieka mažas – 15 mėnesių naujai diagnozuotiems GBM atvejams ir 5–7 mėnesiai recidyviniams GBM atve-jams [47]. Nors GBM gali atsirasti bet kokio amžiaus asmenims, tačiau šie navikai dažniau pasitaiko vyresnio amžiaus grupėse.

Pažymima, kad pirminis GBM tipas yra dažnesnis vyrams nei moterims. Antrinis atvirkščiai – dažniau pasireiškia moterims nei vyrams. Pastebėta, kad pirminis GBM tipas retai nustatomas jaunesnio amžiaus pacientams; jis tesudaro 8,8 proc. [51]. Nors glioblastomų etiologija nėra aiški, tačiau yra keletas veiksnių, kurie galimai didina susirgimų riziką. Vienintelis aplinkos veiksnys, įrodantis susirgimų riziką, yra jonizuojančios spinduliuotės povei-kis vaikams, kuriems ji buvo taikyta gydant juos nuo leukemijos [52]. Lite-ratūroje nurodyta daug ir kitų veiksnių, pvz., cheminių kancerogenų poveikis dirbant srityse, susijusiose su gumos, kuro, pesticidų produkcija bei miški-ninkyste. Į rizikos veiksnius taip pat yra įtraukiami asmenys, dirbantys valymo įmonėse ir pasyvūs rūkaliai, nors tai nėra iki galo moksliškai pagrįsta. Vienos meta-analizės studijoje buvo pastebėta, kad mobilieji telefonai, naudoti daugiau kaip 10 metų, taip pat nežymiai didina GBM riziką, tačiau tai gali neturėti didelės reikšmės dėl šių dienų pažangiųjų technologijų [50]. Įdomu tai, kad didėjantis socioekonominis statusas didina GBM susirgimų riziką [53].

15

2.3. SLPV vėžio biologinės ypatybės ir imuninių žymenų mutantinio p53, EZH2, PLBA ir CD56 vaidmuo diagnostikai

Smulkiųjų ląstelių plaučių vėžys yra letalus piktybinis navikas dėl savy-bių metastazuoti į įvairius organus bei recidyvuoti po chemoterapijos, o tai leidžia teigti, jog ši forma yra atspari preparatams nuo vėžio [3]. 90 proc. SLPV atvejų sudaro smulkiosios ląstelės, likusi dalis yra kombinuoti navikai, kuriuose yra didelių ląstelių komponentų [43]. Ankstyvų stadijų plaučių vėžio diagnostika galėtų pakeisti ligos pasekmes, o epigenetinių modifikacijų nustatymas būtų naudingas ligai kontroliuoti. Viena tokių tiksliai apibrėžtų modifikacijų yra histonų modifikacijos, stipriai veikiančios chromatino išsi-dėstymą bei genų raišką esant vėžiniams pakitimams [31].

Priešingai nei plokščiųjų ląstelių karcinomos histologinis tipas, SLPV patogenezė nėra visiškai išaiškinta. Vienintelė iškelta hipotezė – tai plaučių neuroendokrininių ląstelių hiperplazija. Todėl tiek mažai žinoma apie SLPV transformuojančius veiksnius ir ribotą informacijos kiekį dėl genetiškai progresuojančio SLPV [21]. Tiksli SLPV ląstelių kilmė kol kas nėra žinoma. Manoma, kad SLPV galėjo kilti iš bronchų gleivinės ląstelių ir turėti epiteli-nės kilmės raišką. Be to, manoma, kad ir bronchų gleiviepiteli-nės ląstelės, ir SLPV galėjo diferencijuotis tiek neuroendokrininiu, tiek ir ne neuroendokrininiu būdu. Tai paaiškina bendrą šių ląstelių epitelinę kilmę [41].

Piktybiniai plaučių neuroendokrininės kilmės navikai yra atskira plaučių neoplazmų klasė. Naujoje PSO plaučių navikų klasifikacijoje šią kategoriją sudarė didelių ląstelių neuroendokrininė karcinoma bei smulkiųjų ląstelių plaučių karcinoma. Kaip pabrėžia PSO klasifikacijos schema, tai mitozės, nekrozės ir polimorfizmas yra būdingi, laipsniškai kintantys bruožai, esantys šiose neoplazmose. Kiekvieno šių navikų tipo ląstelių morfologinė charakte-ristika – ląstelės ir branduolio dydis bei forma, chromatino išsidėstymas, branduolėliai ir citoplazmos kiekis – taip pat gali skirtis [54].

Beverly A. Teicher SLPV pacientus išskiria kaip rūkančiuosius. Morfo-loginiai SLPV ląstelių pokyčiai buvo tirti in vitro jas paveikus nikotino koncentracijomis, atitinkančiomis rastas rūkančiųjų plaučiuose. Ląstelių morfologija sudarė jai nebūdingą neuronų formą. Taip pat padidėjo migracija bei chemorezistentiškumas [40].

Skirtingai nei odos ar gaubtinės žarnos, kvėpavimo takų epitelis retai kada proliferuoja, kol nėra pažeidimo. Autorių duomenimis kamieninių kvėpavimo takų ląstelių aktyvacija baigiasi epitelio regeneracija per 3 dienas kartu su kvėpavimo takuose padidėjusiu kiekiu neuroendokrininių ląstelių, kurios normaliomis fiziologinėmis sąlygomis yra retas ląstelių tipas, dalyvaujantis reguliuojant kvėpavimo takų epitelio augimą ir vystymąsi.

16

Todėl galima daryti išvadą, kad SLPV galimai reprezentuoja piktybinį fenoti-pą, kylantį iš kvėpavimo takų epitelio pirmtakų, kurie plaučių neuroendokri-ninėse ląstelėse išlaiko savo pirmines savybes [55].

Kadangi SLPV biopsijos yra retos, todėl SLPV ląstelės yra pagrindinis įrankis vertinant SLPV ląstelių charakteristiką ir kitus tyrimus, padedančius išsiaiškinti jų patogenezę [40]. Auginant išskirtas ląsteles kultūrose, paste-bimi aiškūs skirtumai tarp smulkiųjų ir nesmulkiųjų plaučių vėžio ląstelių. SLPV ląstelės yra mažos, su šiek tiek citoplazmos aplink branduolį ir turi tendenciją augti kaip plūduriuojantys klasteriai arba sferoidai, kuriuos dažnai sunku išskirti, o NSLPV ląstelės auga formuodamos monosluoksnį, kaip ir dauguma solidinių navikinių ląstelių.

Dėl to sudėtinga dirbti su SLPV in vitro sąlygomis, tačiau jos puikiai tinka tyrimams kaip ksenograftinė medžiaga [40]. Seniai žinomos kai kurios morfologinės ir biocheminės SLPV savybės, pvz., SLPV ląstelių citoplaz-moje būna neurosekrecinių granulių ir tokių neuroendokrininių žymenų kaip L-DOPA dekarboksilazė bei neuronų specifinė enolazė [36, 56, 57]. SLPV ląstelės turi unikalias biologines sąvybes, pasireiškiančias choromosomų pasikeitimais, onkogenų ir antionkogenų disreguliacija, įvairiais signalinimo keliais, augimo veiksniais bei ląstelių žymenimis ir aktyviu vystymusi [40]. Nors konkretaus SLPV navikams specifiško antigeno ir nėra, tačiau yra CD56 [35] ir CD57, kurie atlikus imunohistochemines studijas gali padėti patvirtinti sudėtingus diagnostikos atvejus.

Naudingi gali būti ir kiti neuroendokrininės kilmės žymenys, pvz., chromograninas ir sinaptofizinas bei CD56, kurie yra ypač svarbūs diferenci-juojant SLPV nuo NSLPV [37]. Be to, šie žymenys yra statistiškai reikšmingo didelio jautrumo ir specifiškumo [54]. Mažiau nei 10 proc. SLPV navikų turi neigiamą raišką visiems neuroendokrininiams žymenims. Be to, SLPV pasi-žymi teigiama raiška TTF-1 žymeniui (angl. thyroid transcription factor-1), kuris yra reikšmingas nustatant navikų kilmę, siejamą su plaučiais ir skydliauke [58, 59]. Epitelinės kilmės žymuo citokeratinas yra naudingas diferencijuojant SLPV navikus nuo limfomų ir kitų mažų apvalių navikų [43]. 2.3.1 lentelėje pateikiami įvairūs imuniniai žymenys bei jų diagnostinė vertė SLPV ir kitų plaučių navikų atžvilgiu. Pastebėta, kad CD56 yra specifiš-kiausias imuninis žymuo tarp epitelinių plaučių navikų, ypač diagnozuojant smulkiųjų ląstelių karcinomą. Dabartinės studijos siūlo keletą naujų imuninių žymenų, tarp jų p63 ir didelės molekulinės masės keratiną, skiriant NSLPV nuo SLPV. p63 yra neseniai atrastas p53 branduolių transkripcijos faktorių šeimos narys [54].

17

2.3.1 lentelė. Epitelinių navikų imuninių žymenų diagnostinė vertė plaučių

navikuose (Žemaitis M. ir kt., 2013) C K (pl at aus spe kt ro ) TTF -1 EM A C K 7 C K 5 C K 20 C H R -A SIN A PT C EA -P C AL RT C D5 6 Plaučių adenokarcinoma 88 77 100 97 13 9 4 17 87 14 4 Didelių ląstelių plaučių karcinoma*

Plokščiųjų ląstelių karcinoma 95 7 29 94 0 5 8 44 33 11 Smulkiųjų ląstelių karcinoma 84 88 89 13 27 3 40 52 70 47 97 Mezotelioma, epitelioidinė 94 0 78 84 92 4 13 9 4 89 12 Metastatinė adenokarcinoma 99 0 81 100 įvairi** 0 67 11 0 Nesmulkiųjų ląstelių plaučių

karcinoma 89 57 99 86 47 9 4 13 82 21 8

Didelių ląstelių karcinomos skirstomos į grupes: neuroendokrininės ir ne neuroendokrininės kilmės navikai, kurių imunohistocheminės charakteristikos nevienodos. Neuroendokrininės kilmės didelių ląstelių plaučių karcinoma aiškiai teigiamai reaguoja bent su vienu neuroendokrininiu žymeniu, apie 50 proc. atvejų būna teigiama reakcija su TTF-1. Ne neuroendokrininės kilmės didelių ląstelių karcinomos specifiško imunoprofilio neturi. ** priklauso nuo pirminio naviko.

CALRT – kalretininas, mezotelio ir iš jo kilusių navikų imunohistocheminis žymuo; CD56 – neuroendokrininės kilmės bei kai kurių limfominių navikų imunohistocheminis žymuo; CEA-P – karcinoembrioninis antigenas, polikloninis; CHR-A – chromograninas A, neoroen-dokrininių navikų imunohistocheminis žymuo; CK – citokeratinas, epitelinių navikų imuno-histocheminis žymuo; EMA – epitelinis membranos antigenas, imunoimuno-histocheminis žymuo; HMB-45 – melanocitinės kilmės navikų imunohistocheminis žymuo; PSA – prostatos specifinis antigenas, imunohistocheminis žymuo; SINAPT – sinaptofizinas, neuroendo-krininės kilmės navikų imunohistocheminis žymuo; TTF-1 – skydliaukės transkripcijos fak-torius, imunohistocheminis žymuo, būdingas pirminiams skydliaukės ir plaučių navikams.

Skirtingos tyrėjų grupės pateikia skirtingus duomenis apie p53 raišką esant plaučių vėžiui. Berns A. ir kt. aprašė SLPV remdamiesi pelių modeliu, kai 90 proc. žmogaus SLPV ląstelių turėjo mutantinę p53 ir (retinoblastomos) Rb genų supresorių raišką [60]. Kiti atlikti tyrimai pažymi, kad SLPV metastazės koreliuoja su Rb/p53 genų delecija [61–63] ir TP53 bei RB1 abiejų alelių pakitimai yra pagrindiniai veiksniai SLPV patogenezėje [63]. Be to, buvo nustatyta, kad ASCL1, pagrindinis spiralės-kilpos-spiralės (angl.

18

helix-loop-helix) transkripcijos faktorius, kuris yra lemiamas veiksnys neuro-endokrininėje diferenciacijoje ir SLPV bei neuroendokrininių ląstelių raiškoje, gali sąveikauti su RB ir p53 baltymo netekimu SLPV atveju [63, 64]. Teigiama koreliacija taip pat buvo pastebėta tarp p53 ir PLBA raiškos pirminėse plaučių karcinomose, nors CNS neoplazmose ir krūties karcinomo-se šis ryšys buvo neigiamas. Tokie rezultatai leidžia manyti, kad mutantinis p53 gali tiesiogiai aktyvuoti PLBA skatintojus [65]. Yra tyrimų, įrodančių, kad nors ir nedidelė dalis, apie 3,7 proc., plaučių navikų turi neigiamą PLBA raišką, bet teigiamą p53 [66]. Kiti autoriai teigia, kad PLBA yra svarbus plaučių adenokarcinomos ląstelių proliferacijai [67]. Kartais tokie kontrover-siški duomenys verčia manyti, kad ryšys tarp branduolio baltymų p53 ir PLBA tikrai yra. Nemažai duomenų yra aprašant dar vieną navikinį žymenį – zeste homologo 2 enhancerį (EZH2). Vis daugėja tyrimų ieškant potencialių terapinių intervencijų SLPV gydymui, susijusių būtent su šiuo baltymu.

Įrodyta, kad EZH2 yra funkciškai aktyvus SLPV navikuose ir pasireiškia protumorigeniškai in vitro. Tai asocijuojama su PRC2 genų taikinių nenor-maliu DNR metilinimu, kurie, manoma, pasižymi SLPV navikų hipermetili-nimu bei panašumu į kamienines ląsteles [27, 68]. Hubaux R. ir kt. tyrinėdami SLPV, atrado keletą svarbių EZH2 inhibicijos savybių, pvz., padidėjusį apop-totinį aktyvumą veikiant proapoptotinius faktorius Puma ir Bad2, sumažė-jusią ląstelių dalį, esančią S ir G2/M ląstelės ciklo fazėse bei padidėsumažė-jusią p21 baltymo raišką, nurodančią ląstelių ciklo kontrolę, susijusią su EZH2 [69].

2.4. Glioblastomos biologinės ypatybės ir imuninių žymenų mutantinio p53, EZH2 ir PLBA vaidmuo diagnostikai

Viena priežasčių, kodėl GBM yra atsparios chemoterapiniams vaistams, yra naviko kompleksiškumas, kuris pasižymi nekroze ir hemoragija. Pavadinimas – multiforminė glioblastoma būtent tai ir apibrėžia. Multifor-minė ji yra ir mikroskopiškai su pseudopalisadinės nekrozės židiniais, pleomorfiniais ląstelių branduoliais ir pačiomis ląstelėmis bei mikrokrau-jagyslių proliferacija [70]. Tokios gliomos migruoja per nepažeistą paren-chimą, apsupa neuronus ir kraujagysles ir migruoja per baltąją medžiagą. Toks invazyvus individualių navikinių ląstelių judėjimas gali atitikti pirmykštį migracijos mechanizmą CNS vystymosi periodu [70]. Yra nemažai studijų, įrodančių kamieninių navikinių ląstelių buvimą GBM navikuose bei jų svarbą GBM patogenezei [9, 71–74].

Kamieninės navikinės ląstelės yra apibūdinamos kaip atsinaujinančios, multipotentinės, turinčios kamieninių ląstelių žymenų raišką (CD133, nestino ir kt.) ir pasižyminčios in vivo augimu navike net ir esant sudėtingoms

19

sąlygoms, pvz., serijiniams ląstelių transplantams [75]. Nors morfologiškai ir panašūs, tačiau skirtingi GBM navikai pasireiškia skirtingais klinikiniais požymiais. Tą galima paaiškinti remiantis molekuliniais pakitimais, randa-mais skirtinguose GBM navikuose. Dažniausi pakitę signalinimo keliai yra receptoriaus tirozino kinazės signalinimo kelias (RTK-RAS-MAPK-PI3KA) bei p53 ir RB baltymai [75].

17 chromosomos petyje aptinkamas p53 genas koduoja branduolio bal-tymą, dalyvaujantį reguliuojant ląstelės ciklą bei ląstelės proliferacijos proce-se [76]. Vėlesnių tyrimų metu buvo nustatyta, kad 17p choromosoma yra atsakinga už heterozigotiškumo praradimą per mitozines rekombinacijas astrocitomose. Remiantis tokia informacija, buvo nustatyta, kad pakitęs p53 genas yra randamas apie 30 proc. gerybinių anaplastinių astrocitomų bei glioblastomų. Nustatyta, kad nepakitęs p53 genas, koduojantis p53 kDa ląstelės branduolio fosfoproteiną („laukinio tipo“ p53 baltymą, angl. wild type p53), normalių ląstelių branduoliuose randamas labai mažais kiekiais [77]. Tačiau mutacijos p53 gene lemia koduojančio baltymo pokyčius, todėl šis „mutantinis p53“ jau yra metaboliškai aktyvus ir ląstelių branduoliuose labai išryškėjęs [78]. Įdomu, jog pirminiuose navikuose neaptikus p53 mutacijų, de novo p53 mutantiniai aleliai pasireiškė to naviko atsinaujinusiose vietose. Be to, pacientai pirminiame navike tik viename iš alelių turėję p53 mutaciją, o kitame ne, po naviko atsinaujinimo jau ir antrame alelyje turėjo nepriklauso-mą p53 mutaciją.

Norint nustatyti, ar p53 alelinis statusas koreliuoja su geba suformuoti navikus pelėms po oda, 5×106 _{ir 5×10}7 _{glioblastomos ląstelių buvo suleista}

imunodeficitinėms pelėms. Po 3 mėnesių pelėms susiformavo navikai, o tai reiškia, kad p53 mutacijos nėra būtinas tumorigeninis veiksnys U-87 ląste-lėms, nes ,,laukinio tipo“ p53 pasižymi kancerogeninėmis savybėmis. Tuo tarpu kita glioblastomos ląstelių linija T98G turi mutantinio p53 raišką, kuris šiose ląstelėse pasirodė nesąs tumorigeninis. Atsižvelgiant į atliktus tyrimus, galima kelti hipotezę, kad egzistuoja du glioblastomas inicijuojantys keliai: vienas apibūdinamas kaip ,,laukinio tipo“ p53 inaktyvacija per alelius ir jų mutacijas, antras yra nepriklausomas nuo p53 geno inaktyvacijos [79]. Ankstesnės bei pastaruoju metu atliktos studijos vis dažniau orientuojamos į kitą navikinį žymenį – EZH2 [80-84]. „Polycomb“ grupės (angl. Polycomb Group (PcG)) baltymai yra svarbūs epigenetiniai reguliatoriai, kurie yra sugrupuoti į „Polycomb“ slopinimo kompleksus. Pastarieji savo ruožtu yra skirstomi į PRC1 ir PRC2. PCR2 grupei priklausantis EZH2 yra kataliziškai aktyvus ir sukelia histono H3 lizino 27 metilinimą [85]. Remiantis in silico raiškos analize ir EZH2 raiškos koreliacija, vienos studijos metu buvo nusta-tyta, kad padidėjusi EZH2 raiška sukelia gliomos proliferaciją, migraciją/in-vaziją ir neoangiogenezę, kuri ypač svarbi gliomos progresavimui [83].

20

Nors EZH2 nuslopinimas yra embrioniškai letalus pelėms, tačiau vėži-nėse ląstelėse jis sumažino jų augimą, taip pat susilpnino naviko augimą ir metastazes in vivo [83]. Neseniai atlikta studija pateikė rezultatus, kur padidėjusi EZH raiška koreliuoja su gliomos piktybiškumo laipsniu. Paste-bėta, kad EZH2 mRNA žymiai padidėjo didesnio laipsnio gliomose nei ma-žesnio. Be to, EZH2 tarp kitų pagrindinių PCR2 priklausančių komponentų (SUZ12 ir EDD) buvo labiausiai statistiškai reikšmingai siejamas su gliomos laipsniu [84]. Kitas onkologijoje plačiai naudojamas žymuo yra PLBA – proliferuojančių ląstelių branduolių antigenas (angl. proliferating cell nuclear antigen (PCNA)). Pirmiausiai buvo įrodyta, kad PLBA, kurio molekulinis svoris siekia 36-kd [86], veikia kaip DNR polimerazės δ aktyvatorius, kuris yra reikalingas DNR sintezei replikacijos metu [19, 87].

Be DNR replikacijos, PLBA funkcijos yra siejamos su tokiais gyvybi-niais procesais ląstelėje kaip chromatino remodeliavimas, DNR pažaidos atstatymas, sisterinių chromatidžių kohezija ir ląstelių ciklo kontrolė [88], todėl PLBA dar vadinamas baltymu ciklinu. PLBA taip pat siejamas su sveikų ir neoplastinių ląstelių proliferacija. PLBA yra ryškiausias G1 ir S ląstelės

ciklo fazių metu. Tokiuose tyrimuose buvo nustatyta, kad žiurkės gliomos ląstelių proliferaciją paveikus iš glijos ląstelių išgautu neurotrofiniu faktoriu-mi, PLBA raiška buvo ypač stipri [19]. Be to, yra keletas studijų, kurios sieja PLBA raišką su naviko piktybiškumo laipsniu [89, 90]. Chaloob M. K. ir kt. nustatė didelę reikšmingą koreliaciją tarp histopatologinio astrocitomų laipsnio ir PLBA raiškos (p<0,001) [86].

2.5. NCI-H146 ir U-87 ląstelių charakteristika 2.5.1. NCI-H146 ląstelių charakteristika

Pirmą kartą NCI-H146 ląstelės buvo išgautos A. F. Gazdar 1979 metais iš smulkiųjų ląstelių plaučių vėžiu sirgusio paciento pleuros skysčio. NCI-H146 yra viena iš 50 SLPV ląstelių linijų, kurios pasižymi raiška tokiems žymenims kaip L-dopa dekarboksilazė, bombezinas, neuronų specifinė enolazė ir kreatinkinazės smegenų izofermentas ir yra skirstoma į dvi klases: 1) klasikinės SLPV ląstelių linijos (35 ląstelių linijų), kurios turi padidėjusią raišką visiems 4 žymenims; 2) variacinės SLPV ląstelių linijos (15 ląstelių linijų), kurios turi neaptinkamus kiekius L-dopa dekarboksilazės ir bombe-sino, tačiau išreiškia neuronų specifinės enolazės ir kreatinkinazės smegenų izofermentą. Pastarieji du žymenys padeda diferencijuoti šį variacinį SLPV tipą nuo NSLPV ląstelių linijų [91].

Be minėtų navikinių žymenų, ląstelės pasižymi teigiama raiška vimen-tinui ir keravimen-tinui, tačiau yra neigiamos neurofilamentų tripleto baltymui.

21

Disertacijoje be mezenchiminio žymens vimentino, kokybiškai NCI-H146 navikuose bus vertinama E- ir N-kadherinai, kurių padidėjusi raiška atitin-kamai sietina su navikų invazijos bei metastazavimo slopinimu arba aktyvinimu [92, 93].

Svarbios yra subpopuliacijos ląstelės, esančios SLPV navikuose ir pasi-žyminčios Hoechst dažų išmetimu sveikuose audiniuose ir malignizuotuose. Ryšys tarp subpopuliacijos ląstelių, atsparumo chemoterapiniams prepara-tams ir vėžinių kamieninių ląstelių, yra mažai ištirtas. Ypač agresyvus SLPV tipas verčia manyti, kad ši liga gali turėti didelę kamieninių vėžinių ląstelių frakciją. Subpopuliacijos ląstelės geba proliferuoti in vitro ir pasižymi sumažėjusia diferenciacijos žymenų CD56 ir CD90 raiška. SLPV subpopu-liacijos ląstelėms būdinga bendra, su vėžinėmis kamieninėmis ląstelėmis susijusia genų raiška: CD133, ABCG2, FGF1, IGF1, MYC, SOX1/2, WNT1. Jos pasižymi Notch ir Hedgehog signalinimo kelių aktyvacija [40]. NCI-H146 ląstelės turi triploidinį chromosomų rinkinį (modalinis chromosomų skaičius – 68).

2.5.2. U-87 ląstelių charakteristika

U-87 ląstelės buvo išgautos iš žmogaus smegenų naviko (glioblastomos astrocitomos). Ląstelės yra epitelinės kilmės ir kultivuojant pasižymi adhe-rentinėmis savybėmis. Priešingai nei NCI-H146 ląstelių linija, ląstelės prikimba prie flakono dugno. Apytiksliai 48 proc. ląstelių turėjo mažesnį ne-gu įprasta chromosomų skaičių (44 chromosomas). Didesnio choromosomų skaičiaus dažnis yra 5,9 proc. Glioblastoma yra visuma navikų, kylančių iš glijos bei jos pirmtakų ląstelių. Viena gliomos atsparumo gydymui priežasčių yra jų heterogeniškumas, tai yra gliomos, turinčios ypač kompleksinę charakteristiką. Kaip ir smulkialąstelinio plaučių vėžio NCI-H146 ląstelės, gliomos yra retai operuojamos dėl topografiškai difuziškos sklaidos po audinius, nes tai dar labiau sumažina optimalias gydymo galimybes [70].

Vis daugėja tyrimų, atsižvelgiančių į navikinių kamieninių ląstelių reikšmę. Ne išimtis yra ir glioblastomos. Jų ląsteliniai mechanizmai kyla iš gliomos kamieninių ląstelių, kurios atsakingos už naviko formavimąsi, jo funkcijų palaikymą, progresavimą bei atsinaujinimą [94].

2.5.3. NCI-H146 ir U-87 ląstelių embriologinės kilmės sąsajos

Seniai žinoma, kad neuruliacijos metu nervinės skiauterės ląstelės migruoja į daugelį organizmo vietų tam, kad susiformuotų įvairūs ląstelių tipai, būdingi skirtingiems organams [95]. Augimo faktoriai, esantys ląstelės paviršiuje, yra vieni svarbiausių veiksnių, kurie apsprendžia ir reguliuoja ląstelių funkcijas – proliferaciją ir diferenciaciją – ir aktyvina prie DNR

22

prisijungiančius baltymus [95]. A. Pietras ir kitų atlikti tyrimai parodė, kad gliomos ląstelės, panašios į kamienines ląsteles, iniciavo neoangiogenezės procesą per stiprią raišką turintį kraujagyslių endotelio augimo faktorių (angl. vascular endothelial growth factor (VEGF)). Atkreipiamas dėmesys į tai, kad HIF-2α (angl. hypoxia inducing factor) yra vienas pagrindinių faktorių, aktyvuojančių VEGF esant hipoksinėms ir nehipoksinėms sąlygoms. Atsi-žvelgiant į šiuos duomenis, tyrėjai atskleidžia didelę HIF-2α ir VEGF raišką perivaskuliniuose neuroblastomos ląstelių poaibiuose, kurie pasižymėjo nervinės skiauterės ląstelėms būdingu fenotipu. Šie duomenys rodo, kad HIF-2α atlieka svarbų vaidmenį neuroblastomos neoangiogenezėje, taip pat kaip ir gliomos [96].

Žinoma, kad neuroblastomos yra kilusios iš simpatinės nervų sistemos pirmtakų, o šie – iš nervinės skiauterės ląstelių. Manoma, kad neuroblastomos kamieninės ląstelės gali labai išryškinti nervinės skiauterės ląstelių žymenis, pvz., Notch-1, HES-1 ir c-Kit, kaip ir ankstyvos SNS raišką turintys balty-mai – vimentinas ir dHAND [96]. Pastebėta, jog ir nervinės kamieninės ląstelės, ir gliomos pasižymi teigiama raiška tiems patiems žymenims: nestino, epidermio augimo faktoriaus (angl. epidermal growth factor (EGF)) receptorių, PTEN, Shh (angl. Sonic hedgehog), Wnt bei telomerazės signali-nimo kelių aktyvacija [97], kurie būdingi nustatant SLPV ankstyvą kilmę. Šie duomenys leidžia manyti, kad glioblastomas, kaip ir neuroblastomas, sieja bendra kilmė su nervinės skiauterės ląstelėmis.

Yra tyrimų, kurie aprašo CNS navikų kilmę. 93 proc. tirtų pacientų gliomos pasireiškė subventrikulinėje zonoje, iš kurios, manoma, yra kilę dauguma smegenų navikų [98]. Prieš atrandant suaugusio žmogaus nervines kamienines ląsteles, ilgą laiką buvo manoma, kad astrocitai yra vienintelės besidalijančios ląstelės suaugusio individo smegenyse [99]. Astrocitai, gauti iš pelių naujagimių ir auginti terpėje su EGF, greitai pakeitė fenotipą ir po 10 dienų pradėjo formuoti neurosferas, kurios turėjo raišką nervinių kamieninių ląstelių žymeniui nestinui ir A2B5 [100]. Nestino raišką taip pat turėjo nervinės kamieninės ląstelės, rastos subventrikulinėje zonoje, kuri sietina su gliomų lokalizacija. Yra hipotezių, teigiančių oligodendrocitų prekursorių ląstelių gebą transformuotis į gliomas sukeliančias ląsteles dėl Ras aktyva-cijos ir p53 išeikvojimo. Pastarosios geba indukuoti antrinius navikus [101]. Be to, būdingi oligodendrocitų prekursoriams žymenys – NG2 ir PDGFR – nustatomi oligodendrogliomose, pilocitinėse astrocitomose ir glioblastomose [102].

Įdomūs tyrėjų duomenys apie smulkialąstelinio plaučių vėžio embriolo-ginės kilmės pradžią, kurie leidžia daryti išvadą apie bendrą SLPV ir GBM kilmę. Iš nervinės skiauterės kyla endokrininių funkcijų turinčios ląstelės [95]. Nustatyta, kad SLPV ir GBM turi raišką tam pačiam vėžinių kamieninių

23

ląstelių žymeniui CD133. SLPV klasikinis ląstelių tipas yra kilęs iš labiau subrendusių ląstelių, kuriame vyrauja nervinis fenotipas [36]. Neseniai Z. Zhang ir kiti išsamiai aprašė procesus ir navikinius žymenis, kurie turi bendrų sąsajų su SLPV ir nervinės skiauterės ląstelėmis. SLPV ląstelių linija NCI-H446 turėjo raišką nervinės skiauterės kamieninių ląstelių žymeniui nestinui, NCAM ir S100β bei mezenchimos kamieninių ląstelių žymeniui vimentinui, CD44 ir CD105. SLPV pasižymi ne tik kamieninėms ląstelėms būdinga genų raiška, tačiau šiam naviko tipui, kaip ir glioblastomoms, būdingi jau minėti Notch ir Shh signalinimo keliai [39, 103].

Nustatyta, kad NCI-H446 ląstelės sugebėjo diferencijuotis į neurogeninį fenotipą turinčias ląsteles, kai buvo paveiktos histonų deacetilazių inhibito-riumi (HDACI), ir įgijo neuronus primenančių ląstelių fenotipą su tarpusavyje besijungiančiais neuritais bei buvo stipriai imunofluorescentiškai teigiamos neuronų žymeniui BM88 [104]. Iš aprašytų žymenų matyti, kad SLPV ląstelės turi teigiamą raišką žymenims, būdingiems neuroektodermai ir mezenchimai, kurios yra ektomezenchimos liekanos. Pastaroji, manoma, yra kilusi iš nervinės skiauterės kamieninių ląstelių, kurios geba diferencijuotis į kaulų, kremzlės, kitų jungiamųjų audinių bei nervines ląsteles [105, 106]. Embrioninio vystymosi metu vyksta procesas, vadinamas epitelio-mezenchi-mos tranzicija (EMT). Tuo metu ląstelės migruoja mezenchima į įvairias embriono kūno vietas inicijuodamos organų užuomazgų susidarymą. Dalis nervinės skiauterės ląstelių migruoja išilgai mezenteriumo į pirmykštę žarną, ten diferencijuojasi į nervinių mazgų neuronus, gliocitus, ir epitelio neuro-endokrinines ląsteles. Iš pirmykštės žarnos endodermos yra kilęs ir kvėpa-vimo takus išklojantis epitelis, ir jame esančios neuroendokrininės ląstelės [104].

Iš literatūros šaltinių matyti, kad ir SLPV, ir glioblastomas vienija bendri žymenys nestinas ir vimentinas bei signalinimo keliai, kurie įrodo bendrą ląstelių embriologinę kilmę.

2.6. Viščiuko embriono CAM formavimasis ir struktūra

Viščiuko embriono vystymasis trunka 21 dieną prieš jam išsiritant. Viš-čiuko embrioną supa keturios ekstraembrioninės membranos: trynio maišas, amnionas, seroza ir alantojis. Kartais seroza vadinama chorionu; tačiau terminas chorionas yra dažniau taikomas apibūdinti susijungusiems alantojui ir serozai. Alantojis viščiuko embrione atsiranda apie trečią inkubacijos parą iš ventralios endodermos sienelės. 4–10 inkubacijos parą alantojo pūslelės staiga padidėja. Tuo metu alantojo mezodermos sluoksnis susilieja su chorio-no mezodermos sluoksniu formuodami chorioalantojinę membraną CAM.

24

Šiame dvigubame sluoksnyje formuojasi kraujagyslių tinklas, kuris yra susijungęs su embriono arterijomis ir venomis. Nesubrendusios kraujagyslės, kurios neturi pakankamai susiformavusios pamatinės membranos ir lygiųjų raumenų ląstelių, auga sparčiai iki 8-tos vystymosi paros ir duoda pradžią kapiliarų tinklui. Šis kapiliarų tinklas glaudžiai kontaktuoja su choriono epitelio ląstelėmis ir dalyvauja dujų apykaitoje su išorine aplinka [107]. CAM yra prisiglaudusi prie poromis iškloto kiaušinio lukšto, kuris atiduoda kalcį ir per kurį gaunamas deguonis. Todėl šis unikalus kvėpavimą reguliuojantis audinys embrioniniu laikotarpiu yra traktuojamas kaip plaučiai [108].

Be to, šis ypač vaskuliarizuotas embriono apvalkalas yra labai svarbus embriono vystymuisi ne tik dėl kalcio bei deguonies apykaitos rato, bet ir rūgščių–šarmų balanso, vandens bei elektrolitų reabsorbcijos iš alantojo ertmės, kurioje vyksta šalinimo produktų išskyrimas [109]. Patrycja Nowak-Sliwinska (2014) pažymi, kad CAM prisiglaudžia prie kiaušinio lukšto apie 4–5-tą parą po apvaisinimo, todėl ypač svarbu atliekant tyrimus su CAM, langelius lukšte atidaryti 3-čią inkubacijos parą prieš CAM prisiglaudžiant prie kiaušinio lukšto, antraip langelių atidarymas būtų lygus CAM suardymui [110]. Ruslan Hlushchuk (2007) ir kitų autorių duomenimis, kai tik susiformuoja kapiliarų tinklelis, prasideda remodeliavimo ir angioadaptacijos procesai, kurie apibūdinami kaip endotelinių ląstelių pirmtakų – lygiųjų raumenų, fibroblastų bei pericitų – kaupimas. Endotelinėms ir hematopoeti-nėms ląstelėms priklauso bendras pirmtakas – hemangioblastai, kurie trynio maiše formuoja agregatus, o šie iš vidinių ląstelių vystosi į hematopoetines ląsteles, o iš išorinio sluoksnio ląstelių populiacijos vystosi endoteliocitai. Toks naujų kraujagyslių besiformavimas yra vadinamas in situ diferenciacija arba vaskulogenezė. T. y. kai iš nediferencijuotų pirmtakų ląstelių (heman-gioblastų) pradeda formuotis endotelinės ląstelės, kurios susiformuoja kraujagyslių tinkle [111].

Be vaskulogenezės, kai ląstelės vystosi de novo, t. y. nuo pat pradžių, yra aprašomi dar du pagrindiniai kraujagyslių formavimosi mechanizmai, kurie bendrai žinomi kaip angiogenezė – t. y. naujų kraujagyslių formavimasis iš jau esamų kraujagyslių. Šie mechanizmai įvardijami kaip ataugų formavimas (angl. sprouting) ir invaginacija (angl. intussusception). Formuojant ataugas, angiogeniniai faktoriai prisijungia prie specifinių receptorių, esančių kapiliarų endotelio ląstelėse, kurios yra skatinamos dalijimuisi ir augimui, ir taip formuoja ataugas už kraujagyslės spindžio (angl. abluminal), kol šios susijungia su šalia esančiais kapiliarais. Priešingai šiam ataugų formavimo mechanizmui veikia invaginacija. Jos metu angiogenezė vyksta per kapiliarų skilimą jų viduje (angl. intraluminal splitting).

Tam tikri iki galo neištirti veiksniai priverčia endotelio ląsteles formuoti ataugas kapiliaro spindyje. Tokio formavimosi metu susidaro dvi atskiros

25

mažos kraujagyslės. Invaginacijos būdu per kelias valandas gali susiformuoti labai didelis kiekis naujų kapiliarų [112, 113]. Būtent toks naujų kraujagyslių atsiradimo būdas yra daugelyje audinių, tarp jų viščiuko embriono CAM bei besiformuojančiuose žiurkės plaučiuose ir širdyje [112].

Verta paminėti dar vieną kraujagyslių formavimosi ypatumą, susijusį su navikinių ląstelių ar audinių transplantavimu, kada pakitusios ląstelės pradeda formuoti kraujagyslių sienelę, tačiau be endotelinių ląstelių (angl. vascular mimicry). Toks fenomenas yra sėkmingai studijuojamas pasitelkiant CAM. Pirmas tą pastebėjo Ribatti ir kt., transplantavę melanomos ląsteles (B16-F10) ant CAM [114].

Tačiau neoangiogenezės terminu (dažnai vadinamu neovaskuliarizacija) apibūdinamas tiktai navikams būdingas naujų kraujagyslių formavimasis, kai jau yra endotelinės ląstelės, aprūpinančios navikus deguonimi ir maisto medžiagomis ir taip užtikrinančios jų augimą. Tai yra priešingas procesas angiogenezei, kuri atsakinga už naujų kraujagyslių formavimąsi ne naviki-niuose darinaviki-niuose [115].

Histologiškai CAM yra sudaryta iš trijų sluoksnių: ektodermos, prisi-glaudusios prie lukšto membranos, mezodermos, kurioje yra išsidėstę krau-jagyslės bei stromos komponentai, ir endodermos, kuri liečiasi su alantojaus ertme. CAM yra labai plona struktūra, dažniausiai nedidesnė nei 100 µm skersmens visuose trijuose sluoksniuose, kurie aiškiai matomi hematoksilinu-eozinu dažytuose preparatuose. Ektodermą sudaro vienas arba du sluoksniai epitelinių ląstelių, kurių dalis yra labai suplokštėjusios, nes per jas vyksta dujų mainai. Mezoderma sudaryta iš stromos ląstelių – kolageno skaidulų ir skirtingo skersmens kraujagyslių bei galinių kapiliarų dalių, nusidriekusių iki ektodermos sluoksnio, ir iš vieno ląstelių sluoksnio sudaryta plokščios formos endoderma.

Kadangi CAM puikiai palaiko transplantuotus audinius dėl greitos neo-angiogenezės, todėl CAM tinka kaip spontaniškai sukeltų ar transplantuotų navikinių ląstelių „saugykla“ [108]. Svarbi ir limfinė viščiuko embriono sistema. Patrycjos Nowak-Sliwinskos ir bendraautorių teigimu CAM turi visiškai išvystytą imuninę sistemą, kuri daugeliu aspektų atspindi žinduolių imuninę sistemą [110]. Tiesa, jauni embrionai nėra pakankamai imunizuoti. Embrionai yra apsaugoti dvigubos imuninės sistemos, kuriai priklauso T ir B limfocitai, kurie atitinkamai reguliuoja antikūnų ir ląstelinį imunitetą. T limfocitai aptinkami 11-tą embrioninio vystymosi parą, o B limfocitai – tik apie 12-tą embrioninio vystymosi parą. 12-tą embrioninio vystymosi parą monocitai ir makrofagai yra aptinkami trynio maiše, blužnyje, Fabricijaus maišelyje, žarnyne, čiobrialiaukėje ir kepenyse. Po 15-tos embrioninio vystymosi paros B limfocitai pradeda plėstis ir 18-tą parą viščiuko embrionai turi visiškai išvystytą imuninę sistemą [26]. Atsižvelgiant į tai, kad viščiuko

26

embrionai iki tam tikros vystymosi paros pasižymi natūraliu imunodeficitu, įvairių navikinių audinių ar ląstelių transplantacijos gali būti atliekamos nesitikint jokios atmetimo reakcijos [116].

Yra du pagrindiniai ląstelių tipai, dalyvaujantys uždegiminiuose proce-suose – heterofilai ir monocitai. Heterofilai atspindi žinduolių neutrofilus ir yra pagrindinis matrikso metaloproteinazių-9 (MMP-9) šaltinis viščiuko embrione. Tuo tarpu monocitų/makrofagų sistema pasižymi matrikso metalo-proteinazių-13 (MMP-13) prezentacija. Tiek MMP-9, tiek MMP-13 viščiuko embrione gali būti identifikuojami naudojant atitinkamus imunohistoche-minius žymenis [108, 116].

2.6.1 pav. Viščiuko embriono 12 vystymosi para

(Modifikuota pagal Vargas ir kt. 2007)

Viščiuko padėtis kiaušinyje ir jį juosianti CAM (a). CAM skersinis pjūvis (b) kuriame matomos jos pagrindinės sudedamosios dalys: 1 – chorioninis epitelis (ChE), esantis prie pat vidinės lukšto membranos, 2 – viščiuko kraujagyslės mezodermoje, 3 – alantojo epitelis, esantis arčiausiai embriono.

2.7. Viščiuko embriono CAM panaudojimas navikinių ląstelių transplantavimo bei angiogenezės tyrimo modeliams

Viščiuko embriono CAM dėl jo imuninės sistemos savybių ilgą laiką buvo naudojama navikinių ląstelių ir audinių tyrinėjimams, o atmetimo reakcijų nebuvo nustatyta. Pirmą kartą Rous ir Murphy (1911 m.) bandy-muose su CAM transplantavo Rous sarkomos virusą. Po kelerių metų Murphy įrodė, kad navikiniai audiniai iš žiurkės nesivysto suaugusiuose viščiukuose, tačiau vystosi viščiuko embriono CAM iki 18-tos embrioninio vystymosi paros [116]. Pastebėta, kad į kraujagyslę suleidus leukemijos ląstelių, jos viščiuko embrione metastazavo į smegenis. Tai atspindi analogišką žmonėms mechanizmą, todėl leidžia analizuoti navikines ląsteles bei jų vėlesnį augimą,

27

kai jos pasiekia antrinius metastazavimo organus [108, 116, 117]. Patrycja Nowak-Sliwinska aprašo dar vieną navikinių ląstelių ypatybę invazyvavus į CAM. Tuo metu navikinės ląstelės dėstosi išilgai/šalia kraujagyslių, o ne padrikai visame CAM mezodermos sluoksnyje. Tokį fenomeną sukėlė žmo-gaus HT-1080 fibrosarkomos ląstelės, žmožmo-gaus A2780 kiaušidžių karcinoma ir žmogaus melanoma [110]. Todėl šį modelį verta tirti toliau siekiant išsiaiškinti onkologinius mechanizmus.

Dauguma navikų ir audinių tarp 2-ros ir 5-tos paros po implantacijos CAM yra matomi ir pasižymi gausia CAM kilmės vaskuliarizacija, tuo metu prasideda staigi kraujagyslių augimo fazė. Todėl implantai, transplantuoti tarp 8-tos ir 10-tos embrioninio vystymosi paros, dėl kraujagyslių formavimo veiksnių sukelia stiprią neoangiogenezę. 8–10-ta viščiuko embriono inkuba-cijos para tinka tiriant ir anti-angiogeninius faktorius. Kitokiu poveikiu pasižymi transplantai, įterpti 11-tą ir 12-tą parą. Taip yra dėl to, kad CAM endotelis yra mitoziškai aktyvus iki 10-tos inkubacijos paros, nes vėliau žymiai sumažėja mitozinis indeksas [108, 116, 118].

CAM angiogeninio stimulo atsakas yra gana greitas ir daugeliu atvejų neprireikia daugiau nei 3–5 parų. Siekiant išanalizuoti normalių ir patologinių mechanizmų angiogenezę, pasitelkiama nemažai in vivo sistemų. Pavyzdžiui, laboratorinių gyvūnų: žinduolių (pelės, žiurkės, žiurkėnai, triušiai), paukščių (viščiukai, putpelės) ir žuvų (angl. zebra fish). Ląstelių ar audinių transplanta-vimas dažniausiai vyksta per kiaušinio lukšte padarytą mažą langelį, esantį tiesiai virš CAM. Angiogeninį atsaką sukeliančios medžiagos dažniausiai yra inkorporuotos diskeliuose arba mažame kiekyje polimerizuotų substancijų, pvz., želatininių kempinėlių arba biologiškai inertiškų sintetinių polimerų, turinčių arba angiogeninių medžiagų, arba impregnuotų navikinių ląstelių.

Tranplantacijos būdai, kai CAM su ant jos užsėtomis medžiagomis vystosi kiaušinyje, yra vadinami in ovo. Kitas būdas, kai embrionai yra auginami ne kiaušinyje (in ovo), o pavyzdžiui, specializuotoje Petri lėkštelėje, vadinamas ex ovo. Tokiu būdu yra lengviau kontroliuoti ir stebėti CAM vykstančius pokyčius [25, 108]. Pagrindinis veiksnys, ribojantis mokslinius tyrimus CAM, yra nespecifinės uždegiminės reakcijos, kurios transportuojant įvairias medžiagas gali sukelti antrinį kraujagyslių proliferacijos atsaką ir trukdyti kiekybiškai nustatyti pirminį atsaką į tam tikrą substanciją. Jakob ir bendraautoriai 1978 metais atliko seriją eksperimentų ir tikrino įvairias medžiagų transportavimo sistemas (Milipore filtrus, stiklo pluošto diskelius, filtrinio popieriaus diskelius, agarozę ir poliakrilamidinius gelius) bei natūra-lius kiaušinio komponentus (kiaušinio lukšto membraną, koaguliuotą albumi-ną ir koaguliuotą trynį), kurie CAM sukėlė uždegimines reakcijas. Dėl palankių viščiuko embriono imuninės sistemos sąlygų nespecifinis uždegimi-nis atsakas yra kur kas retesuždegimi-nis, jei tiriamoji medžiaga yra tranplantuojama

28

kuo greičiau – vos tik CAM pradėjus vystytis ir dar nesusiformavus imunite-tui [24, 107]. Tiriama daugybė pro- ir anti-angiogeninių medžiagų siekiant morfologiškai nustatyti kiekybinį CAM kraujagyslių atsaką.

Tokių derinių veiksmingumas yra nustatomas atliekant kokybinius ir kiekybinius CAM kraujagyslių vertinimo metodus. Kokybiniams vertinimo metodams priklauso kraujagyslių apimties matavimas skale nuo 0 iki 4. Kitu atveju gali būti pasitelkti kiekybiniai vertinimo metodai, pvz., kraujagyslių skaičius, kai kraujagyslės invazyvuoja bekraujagyslį matriksą su jame ištirpu-siomis proangiogeninėmis medžiagomis. Taip pat gali būti pasitelkiamas kraujagyslių tankumas, ilgis ar išsišakojimo taškai/mm2_{. Kad būtų}

paleng-vintas šis metodas ir pagerinta kraujagyslių vizualizacija, siūloma injekuoti fluoresceiną ar jo junginius į viščiuko embriono kraujagyslę [107, 110]. Andries Ziljstra ir bendraautoriai naujų kraujagyslių kiekybinei analizei nau-dojo plastikines tinklelio formos groteles, kuriose skaičiavo naujai įaugusias kraujagysles [119]. Elena Deryugina (2008 m.) aprašo populiarius metodus, dažniausiai naudojamus kiekybiškai vertinant angiogenezę ant viščiuko embriono CAM. Tai yra filtriniai diskeliai, prisotinti pro angiogeninių arba antiangiogeninių medžiagų, įvairios stingstančios medžiagos (matrigeliai, metilceliuliozės diskeliai, natrio alginatas), inkorporuojamos ant nailoninių ar plastikinių tinkelių [119]. Tačiau tokie tinkleliai turi ir trūkumų, nes nėra tęstinio stebėjimo galimybės [120]. D. Ribatti ir kitų autorių yra atlikta nema-žai tyrimų, kur tiriamosios medžiagos buvo transplantuojamos naudojant silikono žiedą, o ląstelės buvo sulašinamos į patį jo vidurį ir taip apribojamos norint suformuoti naviką arba sukelti angiogenezę [114, 121–123].

Kitas D. Ribatti pasiūlytas populiarus būdas – naudoti želatinines arba absorbuojančias kempinėles. Jos gerai prikimba prie CAM, rečiau sukelia nespecifines uždegimines reakcijas, o svarbiausia – naujos kraujagyslės auga vertikaliai besiskverbdamos į kempinėlę. Toks kraujagyslių išsidėstymas leidžia ne tik atskirti naujas kraujagysles nuo jau egzistuojančių, bet ir tiksliau morfometriškai įvertinti CAM [118]. Tikru perversmu tapo kolageno implan-tų naudojimas, turintis privalumų lyginant su minėtais modeliais. Kaip ir naudojant želatininę kempinėlę, taip ir į kolageną kraujagyslės įauga vertika-liai. Pirmas šį metodą panaudojo Nguyen ir kt. Jie kolageną iš galvijo dermos uždėjo ant nailoninio tinklelio [124]. Vienas iš esminių skirtumų yra tas, kad kolagenas yra natūralus jungiamojo audinio komponentas, kuriame ir vyksta angiogenezė. Tokie implanto modeliai yra taikomi daugeliui analizių – histo-loginių, imunohistocheminių ar biocheminių. Kolageno implante inkorpo-ruotos navikinės ląstelės pasižymi angiogenezę skatinančiu veikimu. Jeigu navikinės ląstelės kolageno implante ant CAM yra paliekamos 6–7 paroms, jos suformuoja mažus, apibrėžtus ir gerai vaskuliarizuotus navikus [108]. Remdamiesi literatūra, sudarėme lentelę (2.7.1 lentelė), apžvelgiančią CAM

29

kempinėlės/kolageno implanto metodo privalumus ir trūkumus. Kaip matyti, šiame modelyje yra daugiau privalumų nei trūkumų. Verta paminėti, kad CAM, kaip ir ragenos mikrokišenėlėje atliekamuose angiogenezės tyrimuose, kraujagyslės yra arti audinio-oro sąlyčio taško, kuris lemia aukštą O2

koncent-raciją [24]. Dėl patirties dirbant su CAM, mūsų atliekamiems tyrimams trumpas eksperimento laikas yra privalumas, o taikant naują metodiką, implantas sukelia minimalią CAM reakciją.

2.7.1 lentelė. CAM – kempinėlės/kolageno implanto metodo trūkumai ir

privalumai

Protokolas Privalumai Trūkumai

CAM • Paprasta ir nebrangu

• Tinkamas dideliems kiekiams • Nėra šalinimo funkcijos, kurios

metu pasišalintų tiriamosios medžiagos

• Tinkama žinduolių transplantams • Minimaliai invazyvu

• Sunku atskirti senas kraujagysles nuo naujų • Trumpas eksperimento laikas • Nespecifiniai endogeniniai faktoriai sąlygoja angiogenezę Kempinėlės/kolageno

implantas • Angiogenezė vertinama nepaaukojus gyvūno

• Tinkamas vertinant angiogenezę ir navikų invaziją

• Paprastas atlikimas

• Galimybė dinamiškai stebėti kraujotaką

• Didelis kiekis duomenų • Visapusiškas ir efektyvusa

• Implantai sukelia reakcijas priklausomai nuo dydžio ir jo tipo • Nespecifinės imuninės

reakcijos

• Trumpas eksperimento laikas

2.8. Natrio valproato naudojimas eksperimentiniams CAM modeliams

Gausiai vaskuliarizuota viščiuko embriono CAM yra puikus modelis studijuojant NaVP poveikį kraujagyslių formavimuisi ir invazijai. Šis modelis turi keletą privalumų lyginant su žinduolių eksperimentiniais modeliais. Pirmiausia reikia pažymėti, kad CAM yra sudaryta iš plono, plokščio kraujagyslių tinklo, kuris puikiai tinka mikroskopiniams stebėjimams. Be to, CAM kraujagyslės yra tiesiog „patiekiamos“ ant permatomo paviršiaus ir tai suteikia galimybę stebėti neoangiogenezės procesus veikiant NaVP viso eksperimento metu [125].

Natrio valproato panaudojimas viščiuko embriono CAM yra mažai ištir-tas. Martin Michaelis yra atlikęs keletą tyrimų su NaVP naudodamas viščiuko