SALINOMICINO POVEIKIO KRŪTIES VĖŽIO LĄSTELĖMS NORMOKSIJOS IR HIPOKSIJOS SĄLYGOMIS ĮVERTINIMAS

(1)

MEDICINOS AKADEMIJA FARMACIJOS FAKULTETAS VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA

JUSTINA BANELYTĖ

SALINOMICINO POVEIKIO KRŪTIES VĖŽIO LĄSTELĖMS

NORMOKSIJOS IR HIPOKSIJOS SĄLYGOMIS ĮVERTINIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovė Prof. dr. Vilma Petrikaitė

(2)

MEDICINOS AKADEMIJA FARMACIJOS FAKULTETAS VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanė: Ramunė Morkūnienė Data

SALINOMICINO POVEIKIO KRŪTIES VĖŽIO LĄSTELĖMS

NORMOKSIJOS IR HIPOKSIJOS SĄLYGOMIS ĮVERTINIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovė

Prof. dr. Vilma Petrikaitė Data

Recenzentas Darbą atliko Doc. dr. Aušra Mongirdienė Magistrantė Justina Banelytė Data Data

(3)

SANTRAUKA ... 4 SUMMARY ... 5 SANTRUMPOS ... 7 ĮVADAS ... 8 1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10 1.1. Krūties vėžys ... 10

1.2. Hipoksijos svarba gydant vėžį ... 12

1.3. Salinomicinas ir jo priešvėžinis aktyvumas ... 13

1.4. Salinomicino priešvėžinio aktyvumo veikimo mechanizmas ... 17

1.5. Pasirinktų metodų principai ... 19

2. TYRIMO METODIKA IR METODAI ... 22

2.1. Tyrimo objektas ... 22

2.2. Reagentai, priemonės ir aparatūra ... 22

2.3. Tyrimų metodai ... 23

2.3.1. Poveikio ląstelių gyvybingumui nustatymas ... 23

2.3.2. Poveikio ląstelių kamieniškumui nustatymas ... 24

2.3.3. Vėžio ląstelių žūties būdo nustatymas ... 24

2.3.4. Poveikio ląstelių sferoidų augimui nustatymas ... 25

2.3.5. Statistinis duomenų įvertinimas ... 25

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 26

3.1. Salinomicino poveikis vėžio ląstelių gyvybingumui ... 26

3.2. Salinomicino poveikis vėžio ląstelių kamieniškumui ... 27

3.3. Salinomicino sukeliamas vėžio ląstelių žūties būdas ... 29

3.4. Salinomicino poveikis vėžio ląstelių sferoidų augimui ... 32

4. IŠVADOS ... 38

5. LITERATŪRA ... 39

(4)

SANTRAUKA

J. Banelytės magistro baigiamasis darbas „Salinomicino poveikio krūties vėžio ląstelėms normoksijos ir hipoksijos sąlygomis įvertinimas“. Mokslinė vadovė – prof. dr. V. Petrikaitė. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmacijos fakulteto Vaistų chemijos katedra. Kaunas, 2018.

Darbo tikslas: įvertinti salinomicino poveikį krūties vėžio ląstelėms normoksijos ir hipoksijos sąlygomis 2D ir 3D kultūrose in vitro.

Darbo uždaviniai:

1. Nustatyti salinomicino poveikį krūties vėžio ląstelių gyvybingumui. 2. Įvertinti salinomicino poveikį krūties vėžio ląstelių kamieniškumui. 3. Nustatyti salinomicino sukeliamą krūties vėžio ląstelių žūties būdą. 4. Ištirti salinomicino poveikį krūties vėžio ląstelių sferoidų augimui.

Tyrimo metodai. Šiame darbe tirtas salinomicino poveikis žmogaus skirtingų tipų krūties vėžio ląstelių linijų (BT474, MCF-7, MDA-MB-231) 2D ir 3D kultūrose normoksijos ir hipoksijos sąlygomis. Salinomicino poveikis krūties vėžio ląstelių gyvybingumui nustatytas MTT metodu po 72 val. inkubacijos, apskaičiuojant efektyviosios koncentracijos (EC50) vertes. Poveikis krūties vėžio

ląstelių kamieniškumui įvertintas, nustačius jo įtaką ląstelių kolonijų formavimui. Salinomicino sukeltas ląstelių žūties būdas nustatytas dažant jas fluorescenciniais dažais Hoechst 33342 ir propidžio jodidu. Aktyvumas 3D kultūrose įvertintas pagal jo poveikį sferoidų skersmens kitimui. Visuose eksperimentuose kaip palyginamasis junginys naudotas priešvėžinis vaistas paklitakselis.

Rezultatai. Salinomicinas silpniau nei paklitakselis mažino krūties vėžio ląstelių gyvybingumą normoksijos ir hipoksijos sąlygomis. Jis labiausiai slopino MDA-MB231 ląstelių gyvybingumą. Hipoksijoje šis poveikis buvo stipresnis nei normoksijoje (EC50 vertės buvo atitinkamai 0,249 ±

0,050 µM ir 0,536 ± 0,063 µM). Salinomicinas turėjo mažesnį poveikį krūties vėžio ląstelių kolonijų formavimui nei paklitakselis. Jis labiausiai slopino MCF-7 ląstelių kolonijų formavimąsi normoksijoje ir hipoksijoje, tačiau hipoksijoje šis poveikis buvo apie du kartus stipresnis. MDA-MB231 ląstelių kolonijų formavimuisi salinomicinas įtakos beveik neturėjo. Salinomicinas apoptozę labiausiai sukėlė MCF-7 ląstelėms normoksijoje, nekrozę – MDA-MB231 ląstelėms hipoksijoje. Salinomicinas labiau slopino MCF-7 ir MDA-MB231 sferoidų augimą normoksijoje, paklitakselis – hipoksijoje. BT474 sferoidų dydžio salinomicinas nemažino nei normoksijos, nei hipoksijos sąlygomis.

Išvada. Salinomicinas turi mažesnį poveikį nei paklitakselis krūties vėžio ląstelių gyvybingumui ir kamieniškumui, mažiau slopina sferoidų augimą hipoksijoje. Normoksijos sąlygomis salinomicinas pasižymi stipresniu poveikiu MDA-MB231 ir MCF-7 ląstelių kultūrose nei paklitakselis.

(5)

SUMMARY

J. Banelytė Master Thesis „Evaluation of salinomycin activity in breast cancer cell cultures in normoxia and hypoxia“. Scientific supervisor – Prof. Dr. V. Petrikaitė. Department of Drug chemistry, Faculty of Pharmacy, Lithuanian University of Health Sciences. Kaunas, 2018.

The aim of this research was to evaluate the anticancer activity of salinomycin in human breast cancer 2D and 3D cell cultures in vitro in normoxia and hypoxia.

Objectives:

1. To identify the effect of salinomycin on the proliferation of human breast cancer cells. 2. To evaluate the effect of salinomycin on the clonogenicity of human breast cancer cells. 3. To identify the type of human breast cancer cell death induced by salinomycin.

4. To investigate the effect of salinomycin in the human breast cancer cell spheroids.

Methods. In the present study, we investigated the activity of salinomycin in human breast cancer cell (BT474, MCF-7, MDA-MB231) 2D and 3D cultures in normoxia and hypoxia. The effect of salinomycin on cell viability was tested using MTT assay, EC50 values were calculated after 72 hours.

The effect on clonogenicity was tested by evaluating the effect on the colony-forming ability of cancer cells. The type of cell death was identified by cell double staining with Hoechst 33342 and propidium iodide. The activity of salinomycin in 3D breast cancer cell cultures was examined by measuring the size change of spheroids. Paclitaxel was used as a comparison in all the tests.

Results. Salinomycin was less effective on cell viability than paclitaxel in normoxia and hypoxia. Salinomycin had the greatest effect on MDA-MB231 cell viability. In hypoxia this effect was stronger than in normoxia (EC50 values were 0.249 ± 0.05 µM and 0.536 ± 0.063 µM, respectively).

Salinomycin had lower effect on clonogenicity than paclitaxel. The greatest salinomycin effect on colony-formation was in MCF-7 cells in normoxia and hypoxia, but in hypoxia this effect was 2 times greater. On MDA-MB231 colony-formation there was barely no effect. The apoptosis inducing effect of salinomycin was greater on MCF-7 cells in normoxia, the necrosis inducing effect was greater on MDA-MB231 cells in hypoxia. Salinomycin had greater effect in MCF-7 and MDA-MB231 spheroids in normoxia, paclitaxel – in hypoxia. BT474 was not affected by salinomycin in normoxia nor in hypoxia Conclusions. Salinomycin has a lower effect on cell viability, clonogenicity and spheroids growth in hypoxia compared to paclitaxel. In normoxia salinomycin has greater effect than paclitaxel in MDA-MB231 and MCF-7 cells.

(6)

PADĖKA

Dėkoju mokslinei vadovei prof. dr. Vilmai Petrikaitei už suteiktas darbo sąlygas ir visapusišką pagalbą eksperimentų atlikimo bei magistrinio baigiamojo darbo rašymo metu. Taip pat dėkoju prof. Arvydui Ūsui, prof. Arvydui Skeberdžiui ir prof. Vilmantei Borutaitei už suteiktą pagalbą ir galimybę naudotis reikiama įranga. Už pagalbą ir palaikymą dėkoju Miglei Paškevičiūtei bei kolegoms magistrantams.

(7)

SANTRUMPOS

ATCC Amerikos ląstelių kultūrų kolekcija (angl. American Type Culture Collection)

DMEM Dulbecc‘o modifikuota Eagle mitybinė terpė (angl. Dulbecco's Modified Eagle

Medium)

DMSO dimetilsulfoksidas

EC50 koncentracija, sukelianti 50 proc. laukiamo atsako

ER estrogeno receptoriai

FBS fetalinis veršiukų serumas (angl. fetal bovine serum) HER2 žmogaus epidermio receptoriai

HF žmogaus fibroblastai (angl. human fibroblasts)

HIF-1 hipoksiją sukeliantis veiksnys (angl. hypoxia inducing factor 1) MTT 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromidas

PR progesterono receptoriai

(8)

ĮVADAS

Vėžys yra viena dažniausių mirties priežasčių. Remiantis 2016 metų statistika, nuo šios ligos pasaulyje mirė 8,93 milijonai žmonių. Nuo 1990 metų vėžinių susirgimų skaičius išaugo beveik dvigubai, ir manoma, kad sergamumas augs ir toliau [1]. Krūties vėžys – viena iš pagrindinių moterų mirties priežasčių [2]. Vien 2012 metais nustatyta 1,7 mln. naujų krūties vėžio atvejų pasaulyje [3].

Krūties vėžio gydymui naudojami įvairūs metodai: chirurginis gydymas, chemoterapija, radioterapija, hormoninė ir biologinė terapija [4]. Vienas iš pagrindinių chemoterapinių preparatų yra paklitakselis. Taip pat vartojamas doksorubicinas, fluorouracilas, ciklofosfamidas, karboplatina, cisplatina, trastuzumabas, gemcitabinas ir kt., priklausomai nuo krūties vėžio tipo, stadijos ir kitų veiksnių [5].

Nepaisant plataus gydymo būdų ir vaistinių preparatų pasirinkimo, nepavyksta ženkliai sumažinti mirtingumo nuo krūties vėžio, todėl vis ieškoma naujų efektyvesnių junginių. 2009 metais, atlikus išsamius daugybės junginių biologinio aktyvumo tyrimus, nustatytas salinomicino poveikis krūties vėžio ląstelių gyvybingumui [6]. Salinomicinas – tai karbociklinis polieterio jonoforas, gaunamas iš grybelio Streptomyces albus, dažniausiai vartojamas gydyti naminių paukščių kokcidiozę [7]. Atlikta daug salinomicino priešvėžinio aktyvumo tyrimų, naudojant įvairias vėžio ląstelių linijas. Nustatyta, kad salinomicinas slopina ląstelių proliferaciją, sukelia apoptozę, autofagiją įjautrina ląsteles kitiems chemoterapiniams preparatams, slopina metastazes [8–10].

Nors ir atliekama daug tyrimų, siekiant plačiau įvertinti salinomicino priešvėžinį aktyvumą, duomenų apie jo poveikį krūties vėžiui hipoksijos sąlygomis beveik nėra. Šie tyrimai yra svarbūs, nes krūties auglio zonoje dominuoja deguonies trūkumas [11]. Atliekant tyrimus tik normoksijos sąlygomis, sunku prognozuoti junginių poveikį in vivo. Dėl šios priežasties nuspręsta įvertinti salinomicino poveikį trijose skirtingo tipo krūties vėžio ląstelių linijose, nustatant junginio poveikį gyvybingumui, kamieniškumui, atskleisti jo sukeliamą ląstelių žūties būdą bei poveikį 3D kultūroms normoksijos ir hipoksijos sąlygomis.

(9)

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas: įvertinti salinomicino poveikį krūties vėžio ląstelėms normoksijos ir hipoksijos sąlygomis 2D ir 3D kultūrose in vitro.

Darbo uždaviniai:

1. Nustatyti salinomicino poveikį krūties vėžio ląstelių gyvybingumui. 2. Įvertinti salinomicino poveikį krūties vėžio ląstelių kamieniškumui. 3. Nustatyti salinomicino sukeliamą krūties vėžio ląstelių žūties būdą. 4. Ištirti salinomicino poveikį krūties vėžio ląstelių sferoidų augimui.

(10)

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. Krūties vėžys

Pagal vėžio sukeliamą mirtingumą krūties vėžys yra penktoje vietoje, o moterims – vienoje iš pirmųjų. Vien 2015 metais visame pasaulyje užregistruota 571 000 mirties atvejų nuo šios ligos [2,12]. Remiantis 2012 metų duomenimis, Europoje moterys daugiausia serga krūties vėžiu, ir jis yra antroje vietoje pagal mirštamumą tarp kitų vėžio rūšių (1 pav.) [13].

1 pav. Vėžio sergamumas ir mirtingumas moterims Europoje 2012 metais (remiantis [13] šaltiniu).

Krūties vėžys – tai liga, kai mutavusios normalios žmogaus ląstelės pradeda nekontroliuojamai, neribotai daugintis, formuoti piktybinius audinius krūtyje, kurie geba prasiskverbti į gretimus audinius, organus, sutrikdyti jų veiklą ar pakeisti struktūrą. Atitrūkusios ląstelės gali sudaryti metastazes kituose organuose, dažniausiai judėdamos per limfinę sistemą. Veiksniai, lemiantys šių pokyčių atsiradimą, gali būti ankstesnis krūties vėžys, gerybiniai krūties navikai, vėžio atvejai šeimoje, genetika, pakaitinė hormonų terapija, kontraceptinės tabletės, negimdymas, nemaitinimas krūtimi, ankstyvos mėnesinės ir vėlyva menopauzė, gyvenimo būdas, aplinka [4].

Krūties vėžys skirstomas į šiuos tipus: luminalinis A, luminalinis B, HER2 ir trejopai neigiamas [14]. Visi šie tipai skiriasi turimais estrogeno (ER), progesterono (PR) ir žmogaus epidermio (HER2) receptoriais (1 lentelė). 0 100000 200000 300000 400000 500000 A tve jai Sergamumas Mirštamumas

(11)

1 lentelė. Krūties vėžio tipų apibendrinimas (adaptuota pagal [15] šaltinį).

Tipas Receptoriai Ląstelių linijų pavyzdžiai

Luminalinis A ER+, PR+/-, HER2- MCF-7, T47D, SUM185

Luminalinis B ER+, PR+/-, HER2+ BT474, ZR-75

HER2 ER-, PR-, HER2+ MDA-MB453, SKBR3

Trejopai neigiamas ER-, PR-, HER2-

BT549, Hs578T, MDA-MB231, MDA-MB468,

SUM190

Kiekvienam krūties vėžio tipui gydyti parenkami tinkami preparatai. Hormoniniai preparatai yra skiriami luminaliniam A ir luminaliniam B tipams dėl šių tipų ląstelėse esamų ER. Sergantiems vėžiu, turinčiu HER2 receptorius, tinkamas gydymas monokloniniu antikūnu trastuzumabu [15]. Luminalinis B tipas siejamas su prastesne išgyvenamumo prognoze nei luminalinis A tipas, nes jo atveju labiau ekspresuojami su vėžio ląstelių proliferacija susiję genai [16]. Kaip agresyviausias krūties vėžio tipas yra įvardijamas trejopai neigiamas. Svarbiausias šio tipo vėžio išskirtinumas – ląstelės neturi ER, PR ir HER2 receptorių, todėl gydymas minėtais preparatais gali būti neveiksmingas. Nors trejopai neigiamas krūties vėžys gydomas, taikant adjuvantinę chemoterapiją, tačiau dažnai atsinaujina [17]. Šis vėžio tipas dažniausiai nustatomas jaunesnio amžiaus moterims ir vėlyvesnėse stadijose, siejamas su prastu atsaku į gydymą ir mažu išgyvenamumu [14]. Siekiant efektyviau išgydyti krūties vėžį, būtina ieškoti naujų efektyvių preparatų.

Šiame darbe aprašytiems tyrimams atlikti pasirinktos trys krūties vėžio ląstelių linijos – MDA-MB231, MCF-7, BT474, kurios atitinka skirtingus krūties vėžio tipus, bei žmogaus fibroblastai (HF), kaip sveiko audinio ląstelių atstovai. MDA-MB231 ląstelės yra trejopai neigiamos, labai agresyvios, pasižyminčios dideliu invazyvumu. Hormoniniai preparatai šių vėžio ląstelių neveikia, todėl gydymui dažniausiai naudojami neselektyvūs, gana toksiški chemoterapiniai vaistai [18]. MCF-7 ląstelės – krūties vėžio adenokarcinomos ląstelės. Jos priklauso luminaliniam A tipui. Estrogenas, veikdamas į šių ląstelių turimus ER, skatina ląstelių augimą, taip skatindamas vėžio vystymąsi. Dažniausiai šio tipo vėžys gydomas hormoniniais vaistais. Esant rezistentiškumui hormoniniams preparatams, svarbu atrasti kitus veiksmingus preparatus [19]. BT474 ląstelės yra krūties duktalinės karcinomos ląstelės. Jos priklauso luminaliniam B tipui. Kaip ir MCF-7, BT474 turi ER ir, priešingai nei MCF-7, turi HER2 receptorius, dėl kurių auglys laikomas agresyvesniu [15,20].

Tyrimuose svarbu naudoti skirtingas krūties vėžio ląstelių linijas, kurios imituoja skirtingus vėžio tipus, nes junginių poveikis jose gali skirtis. Eksperimentuose panaudoti ir fibroblastai, kad būtų

(12)

galima nustatyti, ar salinomicinas naudojamomis koncentracijomis yra selektyvesnis vėžinėms ląstelėms ir galėtų turėti mažesnį toksinį poveikį sveikiems audiniams.

1.2. Hipoksijos svarba gydant vėžį

Hipoksija – tai mažesnis deguonies kiekis (0,4-2 proc.) nei įprastai (6,5-13,5 proc.). Dažnai ji yra nustatoma piktybiniuose augliuose, tačiau kiekviename skiriasi jos lygis. Dauguma atveju, ligos nepaveiktame organe deguonies kiekis yra didesnis nei organe, kuris paveiktas vėžio. Deguonies kiekis priklauso nuo auglio dydžio ir stadijos, taip pat nuo to, koks yra audinio aprūpinimas deguonimi, nuo deguonies kiekio matavimo metodo ir vietos. Nustatyta, kad sveikose krūtyse vyrauja normoksija, deguonies kiekis 8,5 proc., o krūties vėžio mikroaplinkoje vyrauja hipoksija, deguonies kiekis yra 1,5 proc. Hipoksija siejama su padidėjusiu vėžio ląstelių metastazavimu. Vėžio ląstelės stengiasi ištrūkti iš nepalankios hipoksinės aplinkos į kitus, dar sveikus audinius. Tyrimais su pelėmis nustatyta, kad hipoksija paskatina vėžio ląstelių metastazavimą – pelėms suleistos vėžio ląstelės, augintos hipoksijos sąlygomis, metastazavo į kaulų čiulpus greičiau, nei ląstelės, augintos normoksijos sąlygomis [11].

Hipoksijoje aktyvinami įvairūs genai, kurie dalyvauja angiogenezėje, geležies, gliukozės metabolizme, proliferacijoje. Vienas iš veiksnių, dalyvaujančių šiame procese – hipoksiją sukeliantis veiksnys (HIF-1), kuris sudarytas iš α ir β subvienetų. HIF-1α yra priklausomas nuo deguonies [21] ir normoksijos sąlygomis yra hidroksilinamas prolilheksilazių, kurių veiklai labai svarbus deguonis, dvivalentė geležis ir 2-oksoglutaratas. Hipoksija sukelia genų mutacijas, pakeičiančias fermentų struktūrą, ir taip sutrikdo HIF-1α hidroksilinimą. Hipoksija gali būti sukeliama panaudojus kai kurių metalų druskas, pavyzdžiui, kobalto chloridą, nikelio chloridą, desferioksaminą. Šios medžiagos sutrikdo geležies prisijungimą prie fermento ir sutrikdo jo veiklą. Tuomet, didėja HIF-1α kiekis, skatinamas auglio augimas, angiogenezė [22].

3 lentelė. Hipoksiją sukeliančios medžiagos.

Medžiaga Poveikis Pasekmė

Kobaltas Pakeičia geležį ↑ HIF-1α Nikelis ↓ geležies kiekį ląstelėse ↑ HIF-1α Desferioksaminas Suriša geležį ↑ HIF-1α

HIF-1α kiekio padidėjimas siejamas su prasta ligos prognoze. Ištyrus 206 krūties vėžiu sergančių pacienčių HIF-1α kiekius, nustatytas stiprus ryšys tarp šio veiksnio kiekio ir

(13)

išgyvenamumo/remisijos – kuo didesnis HIF-1α kiekis, tuo prastesnė ligos prognozė [23]. Šis veiksnys aptinkamas piktybiniuose krūties augliuose, gerybiniuose jo nėra. Pirminėse krūties vėžio stadijose HIF-1α rastas žymiai rečiau nei jau metastazavusio krūties vėžio atveju (atitinkamai 29 proc. ir 69 proc.) [24]. Manoma, kad HIF-1α galėtų būti vienas iš taikinių, gydant krūties vėžį.

Hipoksija turi svarbų vaidmenį vystantis krūties vėžiui, ląstelėms įgyjant atsparumą vartojamiems preparatams. Dėl mažesnio deguonies kiekio pakitę įprasti procesai lemia skirtingą junginių poveikį augliui. Siekiant atrasti perspektyvų junginį krūties vėžio gydymui svarbu atlikti tyrimus hipoksijoje.

1.3. Salinomicinas ir jo priešvėžinis aktyvumas

Salinomicinas – tai karbociklinis polieterio jonoforas (2 pav.), gaunamas iš grybelio

Streptomyces albus [25]. Šis junginys pasižymi aktyvumu prieš gramteigiamas bakterijas ir, kaip

dauguma jonoforų, yra efektyvus gydant kokcidijų sukeltas infekcijas naminiams paukščiams, naudojama kaip atrajojančių gyvūnų augimą skatinanti priemonė. Salinomicinas pasižymi antibakteriniu, antigrybeliniu, antiparazitiniu, antimaliariniu, antivirusiniu veikimu, tačiau nevartojamas klinikinėje praktikoje dėl savo parenterinio toksiškumo, pritaikomas tik mažomis dozėmis veterinarijoje [7].

2 pav. Salinomicino struktūrinė formulė.

2009 metais mokslininkas Gupta paskelbė, kad „salinomicinas, vienas iš šiuo metu veterinarinėje medicinoje vartojamų antibiotikų, yra 100 kartų efektyvesnis krūties vėžio kamieninių ląstelių naikintojas negu Taxol (paklitakselis) (3 pav.), dažniau vartojamas krūties vėžio chemoterapinis vaistas“ [6,7].

(14)

3 pav. Paklitakselio struktūrinė formulė.

Paklitakselis yra vienas iš dažniausiai vartojamų preparatų krūties vėžio gydymui. Jis vartojamas prieš arba po chirurginio auglio šalinimo, taip siekiant sumažinti auglio dydį arba sumažinti jo pakartotinio atsiradimo, plitimo į kitus audinius ir organus galimybes [26]. Nustatyta, kad paklitakselis labiausiai išgyvenamumą pagerina pacientėms, sergančioms HER2 tipo krūties vėžiu [27]. Šis junginys dažnai naudojamas tyrimuose kaip palyginamasis junginys, vertinant salinomicino poveikį krūties vėžio ląstelėms, todėl nuspręsta jį naudoti ir šiame tyrime.

2009 metais, ieškant naujų priešvėžinių junginių, nustatyta, kad salinomicinas pasižymi priešvėžinėmis savybėmis. Tirta daugybė junginių – apie 16 000, tačiau tik 4 iš jų turėjo poveikį vėžio ląstelėms. Nustatyta, kad salinomicinas yra aktyviausias, mažina krūties vėžio ląstelių gyvybingumą ir slopina mamosferų formavimąsi labiau nei paklitakselis ar dimetilsulfoksidas [6]. Siekiant detaliau įvertinti galimą salinomicino priešvėžinį aktyvumą, atlikta daug tyrimų tiek in vitro, tiek in vivo. Nustatyta, kad salinomicinas aktyvus daugelio vėžio rūšių ląstelių kultūrose ir gyvūnų modeliuose. Tyrimų rezultatai rodo, kad salinomicinas slopina vėžio ląstelių proliferaciją [28–31], taip pat slopina metastazių formavimąsi, sumažindamas onkogenų ekspresiją, sukeldamas oksidacinį stresą [36].

Nustačius poveikį ląstelių gyvybingumui, tirti ir kiti salinomicino priešvėžinio poveikio aspektai. Salinomicinas aktyvina baltymus kaspazė-3, kaspazė-8 ar kaspazė-9 [32,33], sudarant reaktyviąsias deguonies formas (ROS) [34], slopindamas antiapoptotinius genus BCL-2, BCL-XL, BIRC5 [35]. Brazilijos mokslininkų komanda nustatė, kad salinomicino apoptozę/nekrozę sukeliantis poveikis yra selektyvus krūties vėžio ląstelėms – nevėžinėse ląstelėse šis procesas neaktyvuojamas [28]. Kiaušidžių vėžio ląsteles paveikus salinomicinu, nustatyta priklausomybė tarp apoptotinių ląstelių kiekio ir laiko bei koncentracijos – kuo ilgiau ir kuo didesne koncentracija veikiamos ląstelės, tuo daugiau ląstelių žūsta apoptozės būdu [29]. Kai kurios vėžio ląstelės yra atsparios apoptozę sukeliančioms medžiagoms, todėl tai apsunkina vėžio gydymą. Nustatyta, kad salinomicinas sumažina tokių ląstelių atsparumą ir sukelia jų apoptozę [30].

Salinomicinas taip pat mažina ląstelių gebėjimą formuoti kolonijas (turi poveikį kamieniškumui). Nustatyta, kad MDA-MB231 ląstelės, paveiktos 5 µM salinomicinu, formuoja

(15)

mažesnes kolonijas, o 0,25 µM ir 1 µM koncentracijos stabdo šių ląstelių kolonijų augimą [31,32]. Kitame tyrime nustatyta, kad 0,1-1 µM salinomicinas lėtina HER2 krūties vėžio ląstelių JIMT-1 kolonijų augimą, tuo tarpu trejopai neigiamo krūties vėžio ląstelės HCC1937 ląstelių linija yra atsparesnė salinomicino poveikiui [33]. Manoma, kad toks skirtingas salinomicino aktyvumas yra dėl jo poveikio HER2 receptoriams.

Salinomicino poveikis krūties vėžio ląstelių invaziškumui kol kas yra neištirtas, atlikti tyrimai tik vertinant poveikį migracijai. Siekiant ištirti salinomicino poveikį migracijai, naudotos žmogaus trejopai neigiamo krūties vėžio ląstelių linija MDA-MB436, pelių krūties vėžio ląstelių linija 4T1-luc ir pelių Lewis plaučių karcinomos LLC ląstelių linija. Salinomicinas, labai mažomis koncentracijomis, kurios praktiškai nėra toksiškos ląstelėms (0,05 µM), slopino minėtų ląstelių migraciją [34].

Nustatyta, kad JIMT-1, L929, MCF-7 ląstelių judrumas išlieka panašūs hipoksijos sąlygomis, o paveikus salinomicinu tiek normoksijoje, tiek hipoksijoje judrumas padidėja, migracija pakinta nežymiai. [35]. Kadangi salinomicinas pasižymi migraciją mažinančiu poveikiu, galėtų sumažinti metastazavimą į kitus audinius, taip pagerinti ligos prognozę ir išgyvenamumą.

Taip pat tiriamas poveikis ir 3D kultūrose. Salinomicinas slopina sferoidų augimą, mažina jų dydį ir skaičių. Nustatyta, kad 0,5 µM salinomicinas stipriai slopina krūties vėžio sferoidų (mamosferų) augimą [36], sferoidų dydis labai priklauso nuo salinomicino koncentracijos. Kinijos mokslininkai nustatė, MCF-7 sferoidų dydis yra atvirkščiai proporcingas salinomicino koncentracijai – 0,5 µM salinomicinu veikti sferoidai užauga didžiausi, 1,5 µM – mažiausi [37]. Salinomicino ir paklitakselio kombinacija veikia stipriau nei pavieniai junginiai [38]. Taip pat mažomis koncentracijomis salinomicinas įjautrina ląsteles mikrotubules veikiantiems preparatams – aktyvinama apoptozė, sumažėja ciklino D1, p21, padaugėja H2AX [39].

Tyrimų, kuriais būtų įvertintas salinomicino poveikis krūties vėžio ląstelėms hipoksijos sąlygomis, yra mažai. Švedijos mokslininkai nustatė, kad trejopai neigiamo krūties vėžio JIMT-1 ląstelių ir pelių fibroblastų L929 augimas yra lėtesnis hipoksijos sąlygomis, o veikiant salinomicinu, proliferacija dar labiau sumažėja [35]. Turkijos mokslininkai palygino salinomicino ir kinazių inhibitoriaus everolimo poveikį MCF-7 (luminalinis A) ir MDA-MB231 (trejopai neigiamas) ląstelėms hipoksijoje. Nustatyta, kad salinomicinas pasižymi daug stipresniu poveikiu proliferacijai nei everolimas, ir šis poveikis priklauso nuo koncentracijos. 10 µM koncentracijos salinomicinas labiau sumažina MDA-MB231 ląstelių gyvybingumą. Taip pat nustatyta, kad salinomicinas hipoksijoje labiau sukelia apoptozę krūties vėžio ląstelėse nei everolimas. Apoptotinių ląstelių kiekis priklauso nuo koncentracijos – esant didesnei salinomicino koncentracijai, didėja apoptotinių ląstelių kiekis. MDA-MB231 ląstelėse salinomicinas hipoksijoje labiau aktyvuoja apoptozę nei MCF-7 linijoje [42]. Kadangi vėžio ląstelėse apoptotiniai procesai yra mažiau aktyvus nei nevėžinėse ląstelėse, vėžio gydymui gali

(16)

būti vartojami junginiai, aktyvinantys apoptozę [43]. Tokiu poveikiu ir pasižymi salinomicinas hipoksijoje, todėl svarbu atlikti išsamesnius tyrimus.

Taip pat tiriamas salinomicino poveikis, derinant jį kartu su kitais priešvėžiniais preparatais. Nustatyta, kad kombinacijos su gefitinibu, paklitakseliu, liposominiu doksorubicinu, temozolomidu, 5-fluorouracilu veikia sinergistiškai, o kartu su tamoksifenu – padidina ląstelių jautrumą terapijai (2 lentelė).

2 lentelė. Salinomicino kombinacijos su kitais priešvėžiniais preparatais.

Priešvėžinis

preparatas Vėžio rūšis Poveikis Šaltinis

Gefitinibas Gaubtinės ir tiesiosios žarnų

vėžys Sinergizmas [45]

Tamoksifenas Krūties vėžys ↑ veikimas, ↑ ląstelių jautrumas [46]

Paklitakselis Krūties vėžys Sinergizmas [38]

Liposominis

doksorubicinas Krūties vėžys Sinergizmas [38]

Temozolomidas Glioblastoma Sinergizmas [47]

5-fluorouracilas Hepatoceliulinė karcinoma Sinergizmas [48]

Remiantis ClinicalTrials.gov duomenimis, klinikinių tyrimų su salinomicinu nevykdyta, tačiau atliekami įvairūs in vivo tyrimai su pelėmis. Nustatyta, kad pelėse užaugintų krūties vėžio auglių gydymas yra efektyvesnis, naudojant salinomicino kombinacijas su kitais preparatais [49,50] ar nešiklius, pvz., nanodaleles ar miceles [51,52]. Trejopai neigiamo krūties vėžio 4T1 ir krūties epitelio HMLER ląstelės, paveiktos salinomicinu ar paklitakseliu, pelėse auglį suformuoja 100 kartų lėčiau nei kontrolinėje grupėje. Taip pat abu junginiai panašiai slopina ortotopinio trejopai neigiamo krūties vėžio SUM159 augimą, lyginant su kontrole, mažina metastazių formavimąsi. [6].

Apibendrinant galima teigti, kad salinomicino poveikis krūties vėžio ląstelėms normoksijos sąlygomis yra intensyviai tiriamas. Kadangi krūties vėžio dominuojanti aplinka yra hipoksiška, labai svarbūs tyrimai hipoksijos sąlygomis. Jų kol kas yra labai mažai, todėl šiame darbe nutarta įvertinti salinomicino poveikį hipoksijos sąlygomis.

(17)

1.4. Salinomicino priešvėžinio aktyvumo veikimo mechanizmas

Tikslus salinomicino priešvėžinio aktyvumo mechanizmas kol kas nėra gerai ištirtas, tačiau iškelta daug hipotezių (4 pav.). Manoma, kad salinomicinas skatina ROS susidarymą, taip aktyvuojamas JNK kelias ir sukeliama ląstelės mirtis – autofagija [53]. Autofagija – tai procesas, kurio metu ląstelėje naikinamos medžiagos apsupamos membrana ir susidaro autofagosoma. Tuomet ji keliauja per ląstelės citozolį ir susijungia su lizosoma, turinčia fermentų, susidaro autolizoma ir autofagosomos turinys suskaidomas. Stipri autofagija sukelia ląstelės mirtį [54].

4 pav. Salinomicino galimi veikimo mechanizmai vėžio ląstelėse.

Kitas galimas mechanizmas taip pat susijęs su ROS. Šios formos, susikaupę ląstelėje, sukelia mitochondrijų membranų depoliarizaciją. Tuomet aktyvuojamas apoptozės mediatorius kaspazė-3 ir sukeliamas kaspazės-3 substrato – PARP-1 baltymo, kuris atsakingas už DNR pažeidimų taisymą, skilimas ir sukeliama apoptozė [55]. Vėžio ląstelėse PARP-1 yra vienintelis būdas DNR pažeidimams ištaisyti, tuo tarpu nevėžinės ląstelės turi dar papildomų būdų, todėl priešvėžiniai vaistai, sukeliantys PARP-1 skilimą, nužudo tik vėžio ląsteles, o ne normalias [56].

Salinomicinas taip pat veikia slopindamas Wnt signalinį kelią, kuris lemia vėžio ląstelių augimą ir svarbus jų kamieniškumui [57]. Šis kelias yra slopinamas dvejopai. Vienas iš būdų – sutrikdomas Wnt kelio koreceptoriaus LRP6 fosforilinimas ir sukeliama jo degradacija [58]. Kitas būdas – slopinami signaliniai šio kelio baltymai β-kateninai ir p-GSK-3β [59]. Salinomicinas padidina baltymų p53 (slopina auglį) ir H2AX (atsakingas už DNR pažeidimų taisymą) ekspresiją, sumažina antiapoptotinio

(18)

baltymo p21 ekspresiją, taip įjautrina ląstelę DNR pažeidimus sukeliančioms medžiagoms ir sukelia apoptozę. p38 MAPK kontroliuoja ląstelės proliferaciją, diferenciaciją, išgyvenamumą, migraciją, didėjant jo koncentracijai sukeliama apoptozė. [60].

Krūties vėžio ląstelėse salinomicino galimas veikimo mechanizmas yra šiek tiek kitoks (5 pav.). Autofagija sukeliama tokiu pat būdu, apoptozė sukeliama dalyvaujant ROS, kurios sukelia mitochondrijų membranų depoliarizaciją, tuomet kaspazės-3 aktyvaciją, PARP-1 skilimą ir apoptozę. Kitas apoptozės sukėlimo kelias susijęs su apoptozę skatinančio baltymo Bax padaugėjimu ir apoptozę slopinančio baltymo Bcl-2 sumažėjimu [61]. Taip pat apoptozės mechanizmas susijęs su nuo ciklino priklausomos kinazės inhibitoriumi p27kip1_{ir ciklinu D1. Ciklinas D1 yra atsakingas už ląstelės ciklo}

reguliavimą. Jis dažnai siejamas su prasta prognoze, sergant vėžiu. Veikiant salinomicinui, daugėja p27kip1, todėl mažėja ciklino D1 ir mažėja ląstelių gyvybingumas. Inhibitorius p27kip1 susijęs ir su kitu keliu. Sox2 genas yra transkripcijos faktorius, atsakingas už ląstelės savaiminį atsinaujinimą. Esant salinomicino sukeltai padidėjusiai p27kip1 ekspresijai, daugiau jo sąveikauja su Sox2 geno stiprintuvu SRR2, taip sumažinama Sox2 transkripcija ir sumažėja ląstelių gyvybingumas. Salinomicinas mažina fermento ALDH1 ir receptoriaus CD44 poveikį, slopina ląstelių kitimą, migraciją, vėžio angiogenezę ir kitus procesus. Nanog, Oct4, Sox2 tai transkripcijos faktoriai, dalyvaujantys mamosferų formavime, dažnai siejami su prasta prognoze. Veikiant salinomicinui, sumažėja šių faktorių ir ALDH1, kartu ir baltymų, ir sukeliamas mamosferų formavimosi mažėjimas [36].

(19)

Apibendrinant galima teigti, kad salinomicino veikimo mechanizmas krūties vėžio ir kitos rūšies vėžio ląstelėse yra panašus. Abiem atvejais pagrinde yra aktyvuojami apoptotiniai procesai padidėjus ROS kiekiui ar keičiant apoptozę veikiančių baltymų ekspresiją. Krūties vėžio ląstelių gyvybingumas ir mamosferų formavimas slopinamas dėl mažėjančio kinazių aktyvumo, slopinamų ląstelės veiklai svarbių genų, transkripcijos faktorių.

1.5. Pasirinktų metodų principai

Siekiant ištirti salinomicino priešvėžinį poveikį, pasirinkti keturi skirtingi metodai.

MTT metodas naudojamas įvertinti ląstelių gyvybingumą pagal ląstelės mitochondrijų fermentinį aktyvumą. MTT – tai 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromidas, kuris veikiant fermentui sukcinato dehidrogenazei virsta formazanu. Šie kristalai susidaro ląstelės viduje, praduria membranas. Nupylus mitybinę terpę jie ištirpinami ir spektrofotometriškai matuojamas tirpalo spalvos intensyvumas. Kuo spalva intensyvesnė, tuo daugiau buvo gyvybingų ląstelių [62]. Išmatuotos absorbcijos normalizuojamos nuo 0 iki 1, kur 0 – neigiama, 1 – teigiama kontrolė. Tuomet apskaičiuojamos EC50 koncentracijos, remiantis Hill formule. EC50 – junginių efektyviosios

koncentracijos, 50 proc. mažinančios ląstelių gyvybingumą (6 pav.).

6 pav. EC50 vertės nustatymas.

Svarbu įvertinti ir salinomicino sukeliamą ląstelių žūties būdą. Labiausiai nagrinėjama apoptozė. Nustatyta, kad šis žūties būdas yra kaip apsauginis mechanizmas nuo vėžio vystymosi. Jei apoptozė mažai aktyvi, didėja tikimybė, kad išsivystys auglys, jis didės ar bus neatsparus gydymui [63].

(20)

Tuo tarpu stipri nekrozė gali būti siejama su prasta prognoze. Aktyvavus nekrotinius procesus, sukeliamas uždegiminis procesas, kuris gali paskatinti auglio vystymąsi [64]. Apoptozė ir nekrozė gali būti nustatytos vertinant ląstelės morfologijos pokyčius (laiko intervalų mikroskopija, tėkmės fluorcitometrija, elektronų transmisijos mikroskopija ir kt.), ląstelių paviršiaus žymenis (tėkmės fluorcitometrija ir kt.), viduląstelinius žymenis (tėkmės fluorcitometrija, Western blotingas ir kt.), ekstraląstelinius žymenis (laktato dehidrogenazės, kaspazės analizė Western blotingo, fluorcitometrijos ELISA metodais), tarpląstelinių ryšių vertinimas (tėkmės fluorcitometrija ir kt.) [65]. Šiame darbe pasirinktas ląstelių morfologinių pokyčių vertinimas laiko tarpų mikroskopija. Toks apoptozės ir nekrozės nustatymas paremtas chromatino pakitimo įvertinimu fluorescenciniu būdu. Naudojami skirtingi dažai – Hoechst 33342 ir propidžio jodidas. Paveikus ląsteles Hoechst 33342, jis jungiasi prie kondensuoto chromatino, todėl apoptotinės ląstelės švyti ryškesne mėlyna spalva nei gyvos ląstelės su normaliu chromatinu. Propidžio jodidas prasiskverbia tik į negyvas ląsteles ir švyti raudona spalva (7 pav.) [66].

7 pav. Ląstelių žūtis (A – gyvybingos ląstelės, B – apoptotinės ląstelės, C – nekrotinės ląstelės).

Kamieniškumo tyrimas naudojamas, siekiant įvertinti tiriamojo junginio poveikį ląstelių gebėjimui formuoti kolonijas. Kamieninės ląstelės pasižymi atsinaujinimu, diferenciacija, proliferacija, dažnai yra mažai jautrios junginių poveikiui [67]. Junginiai, kurie slopina ląstelių kolonijų formavimą ir augimą, galimai veiks ir kamienines ląsteles. Kaip ir kamieninės ląstelės, vėžio ląstelės daugybę kartų dalijasi ir taip suformuoja koloniją. Paveikus junginiais, yra tikimybė, kad sumažės ląstelių reprodukcija ir/ar gebėjimas formuoti kolonijas. Kai kontrolėje jų suformuojama pakankamai, kolonijos fiksuojamos ir dažomos. Paveikus ląsteles tiriamu junginiu, jis galimai sumažina kolonijų skaičių ir/arba plotą [68].

Kadangi gyvame organizme augliai sudaryti ne iš ląstelių monosluoksnio, svarbu įvertinti ir salinomicino poveikį 3D kultūrose. Poveikis 3D kultūrose dažniausiai skiriasi nuo poveikio 2D kultūrose. Taip yra dėl skirtingo junginių pasiskirstymo, prasiskverbimo į ląsteles, susijungimo tarp ląstelių ir kita [69]. Tyrimo metu siekiama labiau imituoti natūralias organizmo sąlygas, maišant krūties

(21)

vėžio ląsteles ir nevėžines ląsteles – fibroblastus. Šiuo tyrimo metodu galima tiksliau prognozuoti junginio poveikį gyvame organizme [70,71].

Pasirinkti įvairūs metodai leidžia įvairiapusiškai ištirti salinomicino poveikį krūties vėžio ląstelėms normoksijoje ir hipoksijoje.

(22)

2. TYRIMO METODIKA IR METODAI

2.1. Tyrimo objektas

Tyrimo objektas – salinomicino natrio druska (Abcam, ≥ 97,0 proc.). Palyginimui naudotas paklitakselis (Alfa Aesar, ≥ 99,5 proc.).

2.2. Reagentai, priemonės ir aparatūra

Tyrimuose naudotos ląstelių linijos:

 BT474 – luminalinio B žmogaus krūties vėžio ląstelių linija (Amerikos ląstelių kultūrų kolekcija (ATCC));

 MCF-7 – luminalinio A žmogaus krūties vėžio ląstelių liniją (ATCC);

 MDA-MB231 – trejopai neigiamo žmogaus krūties vėžio ląstelių linija (ATCC);

 žmogaus fibroblastai (HF, įsigyti iš prof. Helder A. Santos, Helsinkio universitetas, Suomija).

Ląstelių kultivavimui ir tyrimams naudotos plastikinės priemonės (centrifuginiai mėgintuvėliai, vienkartinės pipetės, antgaliai pipetėms, lėkštelės ląstelių auginimui, 6, 12, 24, 96 šulinėlių plokštelės, labai mažo prilipimo 96 šulinėlių plokštelės) įsigytos iš kompanijos Corning.

Reagentai:

 1 proc. antibiotikų tirpalas (10 000 VV/ml penicilino ir 10 mg/mg streptomicino (Gibco);  3-(4,5-dimetiltiazol-2-il-)-2,5-difeniltetrazolio bromidas (MTT) (≥ 97 proc.,

Sigma-Aldrich);

 Dimetilsulfoksidas (DMSO) (≥ 99,5 proc., Sigma-Aldrich);

 Dulbecc‘o modifikuota Eagle ląstelių mitybinė terpė Glutamax (DMEM Glutamax) (Gibco);

 Etanolis (96 proc., Vilniaus degtinė);

 Fetalinis veršiukų serumas (FBS), išaktyvuotas karščiu (Gibco);  Fosfatinis druskų tirpalas, pH 7,4 (PBS) (Gibco);

 Hoechst 33342 vandeninis tirpalas (10 mg/ml, Thermo Scientific);  Kobalto chloridas (≥ 98 proc., Sigma-Aldrich);

(23)

 Paraformaldehido vandeninis tirpalas (16 proc., Thermo Scientific);  Propidžio jodido vandeninis tirpalas (1 mg/ml, Thermo Scientific);  Tripsino tirpalas TrypLETM_{Express (Gibco).}

Įranga:

 Centrifuga Eppendorf 5702 R (Eppendorf);  Fluorescencinis mikroskopas IX73 (Olympus);

 G:BOX Chemi XRQ gelių dokumentacijos sistema ląstelių kolonijoms fotografuoti (Syngene International Ltd);

 Inkubatorius HERAcell 150i (Thermo Scientific);

 Mikroplokštelių spektrofotometras Multiskan go (Thermo Scientific).

2.3. Tyrimų metodai

2.3.1. Poveikio ląstelių gyvybingumui nustatymas

Salinomicino poveikis ląstelių gyvybingumui nustatomas MTT metodu. Į 96 šulinėlių plokšteles pilama po 100 μl ląstelių suspensijos taip, kad kiekviename šulinėlyje būtų 5000 ląstelių. Plokštelės inkubuojamos 24 val. 37 °C temperatūroje, 5 proc. anglies dioksido atmosferoje. Tada į šulinėlius pilami po 100 μl skirtingų koncentracijų salinomicino ar paklitakselio tirpalai mitybinėje terpėje. Kaip teigiama kontrolė naudojama mitybinė terpė be ląstelių, kaip neigiama kontrolė naudojamos ląstelės su 0,5 proc. DMSO. Tokia DMSO koncentracija yra visuose šulinėliuose su tiriamaisiais junginiais. Siekiant sukelti hipoksiją, terpė papildyta 100 µM kobalto chlorido. Plokštelė inkubuojama 72 val. 37 °C temperatūroje, 5 proc. anglies dioksido atmosferoje. Po inkubacijos į kiekvieną šulinėlį pilama po 20 μl 5 mg/ml sterilaus MTT tirpalo ir inkubuojama 4 val. 37 °C temperatūroje, 5 proc. anglies dioksido atmosferoje. Tuomet skystis nupilamas ir susiformavę violetinės spalvos formazano kristalai tirpinami 100 μl DMSO. Gyvybingų ląstelių kiekį atitinka susidariusių kristalų koncentracija, kuri nustatoma spektrofotometriškai, matuojant absorbciją 560 nm ir 630 nm bangų ilgiuose.

Išmatuotos absorbcijos normalizuojamos nuo 0 iki 1 (0 – neigiama, 1 – teigiama kontrolė). Gauti duomenys analizuojami Microsoft Office Excel 2016 programa, pagal Hill formulę nustatomos

(24)

2.3.2. Poveikio ląstelių kamieniškumui nustatymas

Salinomicino poveikis ląstelių kamieniškumui tiriamas, įvertinant ląstelių gebėjimą formuoti kolonijas. Į 12 šulinėlių plokšteles pilama po 1 ml paruoštos ląstelių suspensijos taip, kad kiekviename šulinėlyje būtų po 100 ląstelių. Į šulinėlius supilami salinomicino ar paklitakselio tirpalai taip, kad galutinės junginių koncentracijos šulinėliuose atitiktų 90, 50 ir 10 proc. MTT tyrimo metu nustatytų

EC50 verčių. Siekiant sukelti hipoksiją, į kiekvieną šulinėlį pilama 100 µM kobalto chlorido. Visuose

šulinėliuose DMSO koncentracija buvo 0,2 proc. Ląstelės inkubuojamos 37 °C temperatūroje, 5 proc. anglies dioksido atmosferoje tol, kol suformuoja kolonijas (MDA-MB231 ląstelės – 9 dienos.; MCF-7 ląstelės – 14 dienų, BT474 kolonijų nesuformavo). Po to šulinėliai 2 kartus plaunami PBS tirpalu, ląstelės fiksuojamos 4 proc. paraformaldehido tirpalu kambario temperatūroje 15 min. Tuomet praplaunama PBS tirpalu, pilamas 0,1 proc. kristalinio violeto tirpalas ir inkubuojama 15 min. Šulinėliai kelis kartus plaunami dejonizuotu vandeniu ir džiovinami. Plokštelės fotografuojamos G:BOX gelių dokumentacijos sistema, naudojant Genesys programą.

Naudojant GeneTools programą, apskaičiuojamas ląstelių kolonijų skaičius ir procentinis plotas. Kontrolė prilyginta 100 proc., pagal ją procentaliai apskaičiuoti kitų grupių rezultatai.

2.3.3. Vėžio ląstelių žūties būdo nustatymas

Krūties vėžio ląstelių linijos sėjamos į 24 šulinėlių plokšteles po 0,5 ml taip, kad kiekviename šulinėlyje būtų po 15000 ląstelių. Plokštelės inkubuojamos 24 val. 37 °C temperatūroje, 5 proc. anglies dioksido atmosferoje. Tuomet į šulinėlius supilami salinomicino ir paklitakselio tirpalai DMSO taip, kad galutinės junginių koncentracijos būtų 10, 50, 90 proc, MTT tyrimo metu nustatytų EC50 verčių. Siekiant

sukelti hipoksiją, į kiekvieną šulinėlį pilama 100 µM kobalto chlorido. Kiekviename šulinėlyje DMSO koncentracija 0,2 proc. Kiekvienai junginio koncentracijai naudojami trys šulinėliai. Plokštelės inkubuojamos 72 val. 37 °C temperatūroje, 5 proc. anglies dioksido atmosferoje. Po trijų parų iš šulinėlių atsargiai nusiurbiama terpė ir įpilama po 500 µl naujos terpės. Į kiekvieną šulinėlį pilama po 1 µl 1 mg/ml propidžio jodido vandeninio tirpalo ir 2 µl 10 mg/ml Hoechst 33342 vandeninio tirpalo. Po 10 minučių nusiurbiama dalis terpės, ląstelės fotografuojamos fluorescenciniu mikroskopu naudojant 10 didinimo objektyvą. Daroma po penkias nuotraukas kiekvieno šulinėlio skirtingose vietose.

Nuotraukose rankiniu būtu apskaičiuojama procentinė apoptotinių ir nekrotinių ląstelių dalis nuo bendro ląstelių skaičiaus. Gyvybingos ląstelės yra mėlynos spalvos, apoptotinės ląstelės traukiasi ir jų branduoliai švyti žydrai, nekrotinės ląstelės – raudonos spalvos.

(25)

2.3.4. Poveikio ląstelių sferoidų augimui nustatymas

Ląstelių sferoidai formuoti 3D Bioprinting metodu. 6 šulinėlių plokštelės šulinėliuose atskirai sėjamos vėžio ląstelės ir fibroblastai po 240 000 ląstelių kiekviename šulinėlyje. Po 10-12 val. į kiekvieną šulinėlį pilama po 20 µl nanodalelių NanoShuttle, ląstelės inkubuojamos 8-10 val. Ląstelės tripsinizuojamos, ruošiamos suspensijos. Ląstelės sėjamos į mažo prilipimo plokšteles po 50 µl vėžinių ląstelių ir 50 µl fibroblastų taip, kad kiekviename šulinėlyje būtų po 2000 vėžinių ląstelių ir 2000 fibroblastų. Paruošta plokštelė dedama ant magnetinės plokštelės ir inkubuojama 37 °C temperatūroje, 5 proc. anglies dioksido atmosferoje.

Sferoidai susiformavo po 72 val. Tuomet sferoidai fotografuojami kiekviename šulinėlyje su kontrastiniu mikroskopu, naudojant 10 padidinimo objektyvą. Mitybinė terpė pakeičiama nauja terpe su skirtingomis junginių koncentracijomis (50 ir 90 proc. nuo EC50 verčių). Siekiant sukelti hipoksiją, į

kiekvieną šulinėlį pilama 100 µM kobalto chlorido. Kaip neigiama kontrolė naudojama terpė su 0,5 proc. DMSO (tokia DMSO koncentracija visuose šulinėliuose). Sferoidai fotografuojami kas 2 dienas, terpė keičiama kas 4 dienas.

Junginių poveikis 3D kultūroms vertinamas pagal sferoidų skersmens pokytį. Analizė atliekama naudojantis ImageJ programa (Nacionalinis sveikatos institutas, JAV).

2.3.5. Statistinis duomenų įvertinimas

Gauti duomenys apdoroti Microsoft Excel 2016 programa, įvertinant trijų nepriklausomų eksperimentų metu gautus rezultatų vidurkius ir apskaičiuojant santykinius standartinius nuokrypius. Vidurkių palyginimui naudojamas Student‘o t kriterijus, skirtumai statistiškai patikimi, kai reikšmingumo lygmuo p < 0,05.

Koreliacija tarp rezultatų 2D ir 3D kultūrose įvertinta apskaičiuojant Pearson‘o koreliacijos koeficientą r, įvertinus ryšio stiprumą ir koreliacijos koeficiento patikimumą. Koreliacija stipri, kai r yra 0,7 – 1 arba -1 – (-0,7); vidutinė, kai r yra 0,5 - 0,7 arba -0,7 – (-0,5); silpna, kai r yra 0,2 – 0,5 arba -0,5 – (-0,2).

(26)

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1. Salinomicino poveikis vėžio ląstelių gyvybingumui

Salinomicinas pasižymėjo skirtingu poveikiu krūties vėžio ląstelių gyvybingumui normoksijos ir hipoksijos sąlygomis (8 pav.). Normoksijos sąlygomis MCF-7 ir MDA-MB231 ląstelių gyvybingumą salinomicinas mažino panašiomis koncentracijomis (EC50 buvo atitinkamai 0,606 ± 0,034 µM ir

0,536 ± 0,063 µM). Didžiausiomis naudotomis koncentracijomis salinomicinas nemažino BT474 ląstelių ir fibroblastų gyvybingumo – EC50 vertės nenustatytos. Hipoksijos sąlygomis poveikis skyrėsi

nuo poveikio normoksijos sąlygomis: hipoksijoje salinomicinas sumažino BT474 ir fibroblastų gyvybingumą (EC50 buvo atitinkamai 2,065 ± 0,183 µM ir 0,107 ± 0,01 µM), du kartus labiau mažino

MDA-MB231 ląstelių gyvybingumą (EC50 = 0,249 ± 0,05 µM), o poveikis MCF-7 ląstelių

gyvybingumui nustatytas silpnesnis nei normoksijos sąlygomis (1,344 ± 0,09 µM). Nustatytos didesnės

EC50 koncentracijos BT474 ir MCF-7 ląstelėse galėjo būti dėl šių ląstelių turimų ER, dėl kurių jos yra

mažiau jautrios chemoterapiniams preparatams.

8 pav. Salinomicino EC50 verčių palyginimas tarp skirtingų ląstelių linijų po 72 val. normoksijos ir

hipoksijos sąlygomis (normoksijos sąlygomis BT474 ir HF EC50 vertės didesnės nei 2,5 µM); n = 3;

* pažymėti statistiškai reikšmingi skirtumai tarp tiriamųjų ir kontrolinės grupių, p < 0,05.

Paklitakselis normoksijos ir hipoksijos sąlygomis veikė geriau negu salinomicinas, tačiau nustatyti panašūs dėsningumai. Normoksijos sąlygomis EC50 koncentracijos tarp ląstelių linijų

išsidėstytų tokia tvarka: BT474 ir HF > MCF-7 > MDA-MB231. Hipoksijos sąlygomis dėsningumas išlaikomas tarp BT474 ir MCF-7 ląstelių linijų, didesnė salinomicino EC50 koncentracija nustatyta

(27)

Palyginus gautus rezultatus su kitų mokslininkų duomenimis, rezultatai šiek tiek skiriasi. Viena mokslininkų grupė nustatė, kad salinomicino EC50 koncentracijos MDA-MB231 ląstelių linijose yra

0,36 µM, MCF-7 – 0,48 µM, BT474 – 0,92 µM [72]. Skirtumai tarp koncentracijų galimi dėl skirtingų kultivavimo sąlygų ir skirtingos metodikos, taikytos ląstelių gyvybingumui nustatyti. Poveikio normoksijos ir hipoksijos sąlygomis nustatyta panaši tendencija, kaip ir apžvelgtoje literatūroje. Tiek šiame, tiek Turkijos mokslininkų atliktame tyrime, hipoksijoje salinomicinas pasižymėjo didesniu aktyvumu MDA-MB231 nei MCF-7 ląstelių linijoje [42]. Kituose tyrimuose paklitakselio aktyvumas tarp linijų ir tarp sąlygų panašus. MCF-7 ląstelės jautresnės paklitakselio poveikiui negu MDA-MB231 ir paklitakselis hipoksijoje pasižymi silpnesniu poveikiu nei normoksijoje. [40,73]. Fibroblastus normoksijoje ir hipoksijoje salinomicinas veikė silpniau nei paklitakselis.

Galima teigti, kad normoksijoje nevėžinių ląstelių gyvybingumo salinomicinas nemažina. Tai svarbu, nes galima numanyti, kad taikant gydymą salinomicinu in vivo sveikos organizmo ląstelės būtų apsaugomos labiau, sukeliama mažiau pašalinių reiškinių nei gydant paklitakseliu. Taigi, salinomicinas būtų perspektyvus krūties vėžio gydyme.

3.2. Salinomicino poveikis vėžio ląstelių kamieniškumui

Tik dvi iš šiame tyrime naudotų ląstelių linijų – MCF-7 ir MDA-MB231 – formavo kolonijas (9 pav.). BT474 ląstelės kolonijų nesuformavo net po ilgo (20 dienų) inkubacijos laiko. Literatūros duomenimis, kitiems mokslininkams pavyko suformuoti šios linijos kolonijas, tačiau tais atvejais ląstelės buvo sėjamos 20-500 kartų didesniu tankiu ir auginamos iki 3 arba 4 savaičių [74,75].

9 pav. MCF-7 ir MDA-MB231 ląstelių kolonijos su 90 proc. EC50 koncentracijų junginiais

atitinkamai po 9 ir 14 dienų. SAL 90 – 90 proc. salinomicino EC50 koncentracijos vertė, PTX 90 –

90 proc. paklitakselio EC50 koncentracijos vertė

MCF-7 ląstelių linijoje junginių poveikis kolonijų plotui (10 pav. A) ir skaičiui (10 pav. B) buvo panašus. Didesniu aktyvumu beveik visais atvejais pasižymėjo paklitakselis tiek normoksijos, tiek

(28)

hipoksijos sąlygomis. Tik 10 proc. EC50 koncentracijos salinomicinas veikė stipriau nei paklitakselis

normoksijoje. Hipoksijos sąlygomis abu junginiai veikė labiau nei normoksijos sąlygomis, išskyrus 10 proc. EC50 koncentracijos salinomiciną – hipoksijoje kolonijos užaugo didesnės nei normoksijoje.

Taip pat pastebėta priklausomybė nuo koncentracijos – didesnės koncentracijos junginiai pasižymėjo didesniu aktyvumu nei mažesnės koncentracijos junginiai.

10 pav. Salinomicino ir paklitakselio poveikis MCF-7 kolonijų plotui (A) ir skaičiui (B) po 14 dienų inkubacijos su junginiais normoksijos ir hipoksijos sąlygomis; n = 3; * pažymėti statistiškai reikšmingi skirtumai tarp tiriamųjų ir kontrolinės grupių, p < 0,05. PTX 90 – 90 proc. paklitakselio

EC50 koncentracijos vertė, PTX 50 – 50 proc. paklitakselio EC50 koncentracijos vertė, PTX 10 –

10 proc. paklitakselio EC50 koncentracijos vertė, SAL 90 – 90 proc. salinomicino EC50 koncentracijos

vertė, SAL 50 – 50 proc. salinomicino EC50 koncentracijos vertė, SAL 10 – 10 proc. salinomicino EC50

koncentracijos vertė.

MDA-MB231 ląstelėse paklitakselis taip pat buvo aktyvesnis (11 pav.). Po inkubacijos su 50 ir 90 proc. EC50 koncentracijomis normoksijoje ir hipoksijoje kolonijų plotas ir skaičius mažesnis, 10 proc.

EC50 koncentracijos junginys mažino tik kolonijų skaičių hipoksijoje. Salinomicinas poveikiu

MDA-MB231 linijų kolonijoms pasižymėjo tik 90 proc. EC50 koncentracija normoksijos sąlygomis.

Paklitakselis didesniu aktyvumu pasižymėjo hipoksijoje, salinomicinas normoksijoje. Nustatyta, kad paklitakselio aktyvumas priklauso nuo jo koncentracijos.

Mokslininkų atlikti tyrimai patvirtina, kad salinomicinas slopina kolonijų augimą. Dhaheri su kolegomis nustatė, kad salinomicinas 5 µM koncentracija slopina jau suformuotų krūties vėžio MDA-MB231 kolonijų augimą. Salinomicinu paveiktos kolonijos buvo žymiai smulkesnės, lyginant su kontrole, didelių ir vidutinio dydžio kolonijų nustatyta mažiau nei kontrolėje [31]. Šio tyrimo metu salinomicino aktyvumas gana nedidelis – poveikį kolonijų formavimuisi turėjo tik 90 proc. EC50

koncentracijos salinomicinas. Ši koncentracija maždaug 10 kartų mažesnė nei kitų mokslininkų naudota salinomicino koncentracija, todėl ir poveikis nustatytas silpnesnis. Normoksijos sąlygomis atlikta nemažai tyrimų, vertinant salinomicino poveikį krūties vėžio ląstelių kolonijų formavimuisi, nustatytos tendencijos gana panašios į šio tyrimo rezultatus. Remiantis atlikta apžvalga, tyrimų, susijusių su salinomicino kolonijų formavimu hipoksijos sąlygomis, neatlikta.

(29)

11 pav. Salinomicino ir paklitakselio poveikis MDA-MB231 kolonijų plotui (A) ir skaičiui (B) po 9 dienų inkubacijos su junginiais normoksijos ir hipoksijos sąlygomis; n = 3; * pažymėti statistiškai

reikšmingi skirtumai tarp tiriamųjų ir kontrolinės grupių, p < 0,05. PTX 90 – 90 proc. paklitakselio EC50 koncentracijos vertė, PTX 50 – 50 proc. paklitakselio EC50 koncentracijos vertė, PTX 10 –

10 proc. paklitakselio EC50 koncentracijos vertė, SAL 90 – 90 proc. salinomicino EC50 koncentracijos

koncentracijos vertė.

Apibendrinant rezultatus galima teigti, kad salinomicinas efektyviau mažina krūties luminalinio A vėžio ląstelių kolonijų augimą hipoksijos sąlygomis. Normoksijoje ir hipoksijoje poveikis priklausomas nuo koncentracijos. Poveikis krūties trejopai neigiamo vėžio ląstelėms silpnesnis – kolonijų plotas ir skaičius sumažėjo tik normoksijos sąlygomis, inkubuojant su didžiausia naudojama salinomicino koncentracija. Nustatyta panaši tendencija tarp salinomicino ir paklitakselio aktyvumo. Paklitakselis abiejose linijose ir abejomis sąlygomis veikė efektyviau nei atitinkamos koncentracijos salinomicinas, išskyrus mažiausios naudotos koncentracijos poveikį MCF-7 linijai normoksijoje, kai nustatytas didesnis salinomicino aktyvumas nei paklitakselio. Gauti tyrimo rezultatai leidžia daryti prielaidą, kad salinomicinas didesnėmis koncentracijomis gali turėti poveikį kamieninėms ląstelėms trejopai neigiamo ir luminalinio A navikuose, dėl to galėtų būti efektyvesnis šių vėžio rūšių atvejais.

3.3. Salinomicino sukeliamas vėžio ląstelių žūties būdas

Visais atvejais salinomicinu paveiktose ląstelėse nustatyta mažiau tiek apoptotinių, tiek nekrotinių ląstelių, nei paveiktose paklitakseliu.

BT474 ląstelėse labiausiai tiek apoptotinius, tiek nekrotinius procesus aktyvavo 90 proc. EC50

koncentracijos paklitakselis hipoksijos sąlygomis (p < 0,05) (12 pav.). Salinomicinas apoptozę sukėlė 90 proc. EC50 koncentracija hipoksijos sąlygomis, nekrozę – visomis trimis naudotomis

koncentracijomis hipoksijoje (p < 0,05). Abiejų junginių poveikis normoksijos sąlygomis buvo silpnesnis nei hipoksijoje.

(30)

12 pav. BT474 apoptotinių (A) ir nekrotinių (B) ląstelių kiekis po 72 val. inkubacijos su skirtingomis junginių koncentracijomis; n = 3; * pažymėti statistiškai reikšmingi skirtumai tarp tiriamųjų ir kontrolinės grupių, p < 0,05. PTX 10 – 10 proc. paklitakselio EC50 koncentracijos vertė, PTX 50 –

50 proc. paklitakselio EC50 koncentracijos vertė, PTX 90 – 90 proc. paklitakselio EC50 koncentracijos

koncentracijos vertė, SAL 90 – 90 proc. salinomicino EC50 koncentracijos vertė.

MCF-7 linijoje apoptozę sukėlė abu junginiai (p < 0,05), išskyrus 10 proc. ir 50 proc. EC50

koncentracijos salinomiciną hipoksijoje (p > 0,05) (13 pav. A). Nekrozę labiausiai sukėlė 90 proc. EC50

koncentracijos paklitakselis normoksijos sąlygomis (p < 0,05) (13 pav. B). Salinomicinas apoptozę ir nekrozę MCF-7 linijoje sukėlė mažesniam skaičiui ląstelių nei paklitakselis, ir ne visomis naudotomis koncentracijomis.

13 pav. MCF-7 apoptotinių (A) ir nekrotinių (B) ląstelių kiekis po 72 val. inkubacijos su skirtingomis junginių koncentracijomis; n = 3; * pažymėti statistiškai reikšmingi skirtumai tarp tiriamųjų ir kontrolinės grupių, p < 0,05. PTX 10 – 10 proc. paklitakselio EC50 koncentracijos vertė,

PTX 50 – 50 proc. paklitakselio EC50 koncentracijos vertė, PTX 90 – 90 proc. paklitakselio EC50

koncentracijos vertė, SAL 10 – 10 proc. salinomicino EC50 koncentracijos vertė, SAL 50 – 50 proc.

salinomicino EC50 koncentracijos vertė, SAL 90 – 90 proc. salinomicino EC50 koncentracijos vertė.

MDA-MB231 ląstelių linijoje apoptozę labiau sukėlė paklitakselis (p < 0,05). Salinomicinas sukėlė apoptozę mažesniam ląstelių skaičiui ir tik 50 proc. ir 90 proc. EC50 koncentracijomis

(31)

paklitakseliu paveiktos ląstelėse hipoksijoje (p < 0,05) (14 pav. B). Salinomicinas nekrotinius procesus labiau aktyvavo normoksijoje, hipoksijoje nekrozę sukėlė tik 90 proc. EC50 koncentracija paveiktose

ląstelėse.

14 pav. MDA-MB231 apoptotinių (A) ir nekrotinių (B) ląstelių kiekis po 72 val. inkubacijos su skirtingomis junginių koncentracijomis; n = 3; * pažymėti statistiškai reikšmingi skirtumai tarp tiriamųjų ir kontrolinės grupių, p < 0,05. PTX 10 – 10 proc. paklitakselio EC50 koncentracijos vertė,

koncentracijos vertė, SAL 10 – 10 proc. salinomicino EC50 koncentracijos vertė, SAL 50 – 50 proc.

salinomicino EC50 koncentracijos vertė, SAL 90 – 90 proc. salinomicino EC50 koncentracijos vertė.

Mokslininkų atliktų tyrimų duomenimis, salinomicinas sukelia apoptozę ir nekrozę įvairiose vėžio ląstelėse. Daugumos tyrimų atvejais salinomicinas sukelia apoptozę koncentracijomis nuo 0,5 µM iki 10 µM įvairiose vėžio ląstelių linijose. Nustatyta, kad salinomicinas koncentracijomis nuo 0,5 µM iki 10 µM po 24 valandų inkubacijos sukelia apoptozę leukemijos ląstelių linijose, nepriklausomai nuo baltymo p53 ekspresijos, o sveikose ląstelėse apoptozės nesukelia [76]. Lee ir kt. nustatė, kad kiaušidžių vėžio ląstelėse salinomicinas 500 nM koncentracija labiau sukelia apoptozę nei paklitakselis 20 nM koncentracija, ir abu junginiai panašiai aktyvina kaspazę-3, kuri dalyvauja apoptozės procesuose [77]. Šio tyrimo metu nustatyta, kad krūties vėžio ląstelėse apoptozę sukelia ir mažesnės nei 0,5 µM koncentracijos salinomicinas. Mokslininkų Qin ir kt. grupė tyrė salinomicino sukeliamus nekrozės procesus. Salinomicinas koncentracijomis 1-10 µM sukelia mažiau nei 15 proc. gliomos ląstelių apoptozę, 5 µM ir 10 µM koncentracijomis sukelia daugiau nei 35 proc. ląstelių nekrozę. Atlikus tolimesnius tyrimus su įvairiais inhibitoriais, nustatyta, kad salinomicinas aktyvuoja nekrotinius procesus dėl padidėjusios ciklofilino-D ekspresijos, kai dėl ROS sukeliama p53 translokacija mitochondrijose [78]. Šio tyrimo metu tendencija nustatyta priešinga – salinomicinas krūties vėžio ląstelėse labiau aktyvuoja apoptozę negu nekrozę. Poveikis skirtingose vėžio rūšyse skiriasi. Pilevneli ir Eren tyrė salinomicino sukeliamą ląstelių žūties būdą hipoksijos sąlygomis. Nustatyta, kad salinomicinas 2 µM ir 5 µM koncentracijomis MCF-7 ląstelių linijoje sukelia 10 proc. ir 17 proc. ląstelių apoptozę, atitinkamai, MDA-MB231 – 30 proc. ir 35 proc. [42]. Šiuose tyrimuose naudoti kiti metodai ir skirtingas

(32)

inkubacijos laikas. Apoptotinės ir nekrotinės ląstelės nustatytos po 24-48 val. inkubacijos su junginiais, naudojant aneksiną V ir propidžio jodidą, papildoma analizė atlikta tekmės citometrija (angl. flow

cytometry). Kadangi šiame tyrime naudotos mažesnės salinomicino koncentracijos, nustatyti mažesni

apoptotinių ir nekotinių ląstelių kiekiai, MCF-7 linijoje nustatyta daugiau apoptozės ir nekrozės būdu žuvusių ląstelių negu MDA-MB231.

Apibendrinant gautus rezultatus, galima teigti, kad salinomicino sukeliamos ląstelių žūties būdai įvairiose linijose ir sąlygose skiriasi. BT474 linijoje salinomicinas sukelia apoptozę tik hipoksijoje didžiausia naudota koncentracija, nekrozę – hipoksijoje visomis koncentracijomis. MCF-7 linijoje salinomicinas apoptozę efektyviau sukelia normoksijos sąlygomis visomis naudotomis koncentracijomis, nekrozę stipriau sukelia hipoksijos sąlygomis. MDA-MB231 ląstelių linijoje tiek apoptozę, tiek nekrozę labiau sukelia normoksijoje. Paklitakselis visai atvejais labiau aktyvuoja tiek apoptotinius, tiek nekrotinius procesus nei atitinkamos koncentracijos salinomicinas. Pastebėta junginių poveikio priklausomybė nuo koncentracijos. Nustatytas didesnis apoptozę nei nekrozę sukeliantis poveikis siejamas su švelnesniu junginio poveikiu. Lyginant su paklitakseliu, salinomicino poveikis ląstelėms švelnesnis, todėl vartojant salinomiciną terapijoje, galima būtų išvengti stiprių nepageidaujamų reakcijų ir audinių struktūrinių pokyčių.

3.4. Salinomicino poveikis vėžio ląstelių sferoidų augimui

Gyvuose organizmuose naviką sudaro ne tik vėžinės ląstelės. Krūties vėžio mikroaplinkoje yra ir kitų įvairių tipų ląstelių – fibroblastų, makrofagų, imuninės sistemos ląstelių, taip pat citokinų, augimo faktorių, ekstraceliulinio matrikso [71]. Siekiant labiau imituoti in vivo sąlygas, krūties vėžio ląstelės maišytos su fibroblastais santykiu 1:1, sferoidai formuoti 3D Bioprinting metodu. Visų trijų krūties vėžio linijų sferoidai susiformavo per 3 dienas. BT474 suformavo mažiausius sferoidus (normoksijoje skersmuo 299 µm, hipoksijoje – 307 µm) iš visų trijų krūties vėžio linijų, didžiausius – MDA-MB231 (normoksijoje skersmuo 408 µm, hipoksijoje – 425 µm). Abiejų linijų sferoidai buvo apvalūs, lygiais kraštais. MCF-7 sferodai pasižymėjo vidutiniu dydžiu (normoksijoje skersmuo 365 µm, hipoksijoje – 372 µm) ir nelygiais kraštais (15 pav.).

(33)

15 pav. Krūties vėžio sferoidų pokyčiai inkubacijos su junginiais metu. SAL 50 – 50 proc. salinomicino EC50 koncentracijos vertė, SAL 90 – 90 proc. salinomicino EC50 koncentracijos vertė,

koncentracijos vertė.

Salinomicino poveikis 3D kultūrose skyrėsi nuo poveikio 2D kultūrose. BT474 3D modelyje viso tyrimo metu sferoidų skersmuo didėjo tiek normoksijos (16 pav. A), tiek hipoksijos sąlygomis (16 pav. B). Priešingai nei 2D modelyje, normoksijos sąlygomis 90 proc. EC50 koncentracijos

salinomicinas nežymiai sumažino BT474 ląstelių sferoidų skersmenį, tačiau hipoksijos sąlygomis nesukėlė tokio poveikio nei 50 proc., nei 90 proc. EC50 koncentracijos (p > 0,05). Didžiausiu aktyvumu

abiem sąlygomis pasižymėjo 90 proc. EC50 koncentracijos paklitakselis, mažesniu aktyvumu pasižymėjo

50 proc. EC50 koncentracija paklitakselis (p < 0,05).

MCF-7 sferoidai normoksijos (17 pav. A) ir hipoksijos (17 pav. B) sąlygomis palaipsniui didėjo. 2 dieną pastebėtas irimas sferoidų, paveiktų abiejų koncentracijų salinomicinu ir 90 proc. EC50

koncentracijos paklitakseliu. Didžiausiu aktyvumu pasižymėjo 90 proc. EC50 koncentracijos

(34)

16 pav. BT474 sferoidų dydžio kitimas normoksijos (A) ir hipoksijos (B) sąlygomis; n = 8; * pažymėti statistiškai reikšmingi skirtumai tarp tiriamųjų ir kontrolinės grupių, p < 0,05. SAL 50 – 50 proc. salinomicino EC50 koncentracijos vertė, SAL 90 – 90 proc. salinomicino EC50 koncentracijos

vertė, PTX 50 – 50 proc. paklitakselio EC50 koncentracijos vertė, PTX 90 – 90 proc. paklitakselio

EC50 koncentracijos vertė.

Junginių aktyvumas MCF-7 sferoiduose hipoksijos sąlygomis skyrėsi, palyginus su normoksijos sąlygomis (17 pav. B). Didžiausiu aktyvumu pasižymėjo 90 proc. EC50 koncentracijos

paklitakselis – sferoidų skersmuo 14 dieną 2 kartus mažesnis už kontrolinės grupės sferoidus. Kitų junginiais paveikų sferoidų skersmuo taip pat sumažėjo, nustatytas vidutiniškai 1,2 karto mažesnis skersmuo už kontrolę (p < 0,05).

280 300 320 340 360 380 400 0 2 4 6 8 10 12 14 Sf eroid ų s ke rs m u o (µm ) Laikas (dienos)

Kontrolė Sal 50 Sal 90

Ptx 50 Ptx 90

*

280 300 320 340 360 380 400 0 2 4 6 8 10 12 14 Sf ero id ų s kers m u o (µm) Laikas (dienos)

Ptx 50 Ptx 90

*

A.

(35)

17 pav. A. MCF-7 sferoidų dydžio kitimas normoksijos (A) ir hipoksijos (B) sąlygomis; n = 8; * pažymėti statistiškai reikšmingi skirtumai tarp tiriamųjų ir kontrolinės grupių, p < 0,05. SAL 50 – 50 proc. salinomicino EC50 koncentracijos vertė, SAL 90 – 90 proc. salinomicino EC50 koncentracijos

MDA-MB231 sferoidų skersmuo didėjo, 4 dieną pastebėtas yrimas tiek normoksijoje, tiek hipoksijoje (18 pav.). Didžiausiu aktyvumu normoksijoje pasižymėjo 90 proc. EC50 koncentracijos

paklitakselis (p < 0,05). Paskutinę tyrimo dieną 90 proc. EC50 koncentracijos paklitakseliu ir

salinomicinu paveikti sferoidai buvo panašaus skersmens – 455 µm ir 459 µm atitinkamai – tai 1,2 karto mažesni sferoidai nei kontrolinėje grupėje.

Junginių poveikis MDA-MB231 sferoidams hipoksijos sąlygomis nustatytas tarpusavyje panašesnis nei normoksijoje (18 pav. B). Kaip ir normoksijoje, didžiausiu aktyvumu pasižymėjo 90 proc. EC50 koncentracijos paklitakselis (p < 0,05). Abiejų koncentracijų salinomicinas lėtino sferoidų

augimą – vidutinis sferoidų skersmuo 432 µm (1,2 karto mažesni už kontrolę) (p < 0,05). 200 250 300 350 400 450 500 550 0 2 4 6 8 10 12 14 Sf eroid ų s ke rs m u o (µm ) Laikas (dienos)

Ptx 50 Ptx 90

*

200 250 300 350 400 450 500 550 0 2 4 6 8 10 12 14 Sf ero id ų s kers m u o (µm) Laikas (dienos)

Ptx 50 Ptx 90

*

A. B.

(36)

18 pav. MDA-MB231 sferoidų dydžio kitimas normoksijos (A) ir hipoksijos (B) sąlygomis; n = 8; * pažymėti statistiškai reikšmingi skirtumai tarp tiriamųjų ir kontrolinės grupių, p < 0,05. SAL 50 – 50 proc. salinomicino EC50 koncentracijos vertė, SAL 90 – 90 proc. salinomicino EC50 koncentracijos

Panašus salinomicino poveikis 3D kultūroms pastebėtas ir kitų mokslininkų tyrimuose. Vokiečių mokslininkų atliktame tyrime nustatyta, kad salinomicinas 0,5 µM koncentracija sumažina MCF-7 ir MDA-MB231 sferoidų gyvybingumą, tuo tarpu BT474 sferoidams poveikio neturi [49]. Šio tyrimo metu nustatyta panaši tendencija.

Lyginant salinomicino ir paklitakselio poveikį 3D kultūrose, atliktas tyrimas su kiaušidžių vėžio ląstelių linija. Salinomicinas 0,5 µM koncentracija kiaušidžių vėžio sferoidus sumažino 60 proc., paklitakselis – 46,6 proc., o abiejų kombinacija – 86,6 proc. [77] Taigi, salinomicinas buvo efektyvesnis nei paklitakselis. Šio tyrimo metu nustatytas priešingas poveikis – daugeliu atveju paklitakselis buvo aktyvesnis už salinomiciną ir labiau sumažino sferoidus. Toks poveikis galimas dėl skirtingų junginių veikimo mechanizmų skirtingose vėžio linijose.

380 430 480 530 580 630 0 4 6 8 10 12 14 Sf ero id ų s kers m u o (µm) Laikas (dienos)

Ptx 50 Ptx 90

*

380 430 480 530 580 630 0 4 6 8 10 12 14 Sf ero id ų s kers m u o (µm) Laikas (dienos)

Ptx 50 Ptx 90

**

A.

(37)

Palyginus salinomicino aktyvumą tarp skirtingų ląstelių linijų 2D ir 3D kultūrose normoksijoje MCF-7 nustatyta silpnas (r = (-0,12)) koreliacijos ryšys, MDA-MB231 – stiprus (r = (-0,97)). Hipoksijos sąlygomis nustatyta panaši tendencija – atitinkamai r = 0,37 ir r = (-0,74).

Apibendrinant galima teigti, kad salinomicinas slopina luminalinio B ir trejopai neigiamo krūties vėžio ląstelių sferoidų augimą, skatina jų irimą. Normoksijoje didžiausios naudotos koncentracijos poveikis yra šiek tiek stipresnis nei didžiausios naudotos koncentracijos paklitakselio, hipoksijoje atvirkščiai – didesniu aktyvumu pasižymėjo didžiausios naudotos koncentracijos paklitakselis. Hipoksijos sąlygomis pastebėtas panašus aktyvumas tarp abiejų koncentracijų salinomicino – sferoidų skersmenį sumažino panašiai, tarp abiejų koncentracijų paklitakselio skirtumai nustatyti didesni. Palyginus poveikį tarp ląstelių linijų, efektyviausi junginiai labiau paveikė MCF-7 nei MDA-MB231 sferoidus. BT474 sferoidų augimo salinomicinas neveikė, tačiau paklitakselis jų skersmenį sumažino priklausomai nuo koncentracijos.