BETA ADRENOBLOKATORIŲ PRIEŠVĖŽINIO AKTYVUMO PLAUČIŲ VĖŽIO LĄSTELIŲ KULTŪROSE ĮVERTINIMAS

MEDICINOS AKADEMIJA FARMACIJOS FAKULTETAS VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA

MARINA SIDOROVA

BETA ADRENOBLOKATORIŲ PRIEŠVĖŽINIO AKTYVUMO

PLAUČIŲ VĖŽIO LĄSTELIŲ KULTŪROSE ĮVERTINIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovė

Prof. dr. Vilma Petrikaitė

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanė: Ramunė Morkūnienė Data

BETA ADRENOBLOKATORIŲ PRIEŠVĖŽINIO AKTYVUMO

PLAUČIŲ VĖŽIO LĄSTELIŲ KULTŪROSE ĮVERTINIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovė

Prof. dr. Vilma Petrikaitė Data

Recenzentas Darbą atliko

Lekt. Dalė Baranauskienė Magistrantė

Marina Sidorova

Data Data

TURINYS

1.1. Plaučių vėžio gydymo problematika ... 9

1.2. Beta adrenoblokatorių savybės ... 10

1.3. Beta adrenoblokatorių veikimo mechanizmas ... 12

1.4. Beta adrenoblokatorių priešvėžinio aktyvumo tyrimai ... 13

1.5. Pasirinktų metodų ypatybės ... 18

1.6. Pasirinktų ląstelių linijų ypatybės ... 19

2. TYRIMO METODIKA IR METODAI ... 21

2.1. Tyrimo objektas ... 21

2.2. Reagentai, priemonės, aparatūra ... 22

2.3. Tyrimo metodikos ... 22

2.3.1. Ląstelių kultivavimas ... 22

2.3.2. Poveikio ląstelių gyvybingumui nustatymas ... 23

2.3.3. Poveikio ląstelių kamieniškumui nustatymas ... 24

2.3.4. Poveikio ląstelių sferoidams nustatymas ... 24

2.3.5 Vėžio ląstelių žūties būdo nustatymas ... 25

2.3.6 Statistinis duomenų įvertinimas ... 25

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 26

3.1. Beta adrenoblokatorių poveikis plaučių vėžio ląstelių gyvybingumui ... 26

3.2. Beta adrenoblokatorių poveikis plaučių vėžio ląstelių kamieniškumui ... 28

3.3. Beta adrenoblokatorių sukeliamas ląstelių žūties būdas ... 30

3.4. Beta adrenoblokatorių poveikis ląstelių sferoidams ... 32

4. IŠVADOS ... 35

5. LITERATŪRA ... 36

SANTRAUKA

M. Sidorovos magistro baigiamasis darbas „Beta adrenoblokatorių priešvėžinio aktyvumo plaučių vėžio ląstelių kultūrose įvertinimas“. Mokslinio darbo vadovė – prof. Dr. V. Petrikaitė. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmacijos fakulteto Vaistų chemijos katedra. Kaunas, 2018.

Darbo tikslas – įvertinti beta adrenoblokatorių priešvėžinį aktyvumą plaučių vėžio ląstelių 2D ir 3D kultūrose.

Darbo uždaviniai:

1. Nustatyti beta adrenoblokatorių poveikį plaučių vėžio ląstelių gyvybingumui 2D kultūrose. 2. Išanalizuoti beta adrenoblokatorių poveikį plaučių vėžio ląstelių kamieniškumui.

3. Nustatyti beta adrenoblokatorių sukeliamą plaučių vėžio ląstelių žūties būdą.

4. Įvertinti beta adrenoblokatorių aktyvumą plaučių vėžio ląstelių sferoiduose (3D kultūrose). 5. Įvertinti beta adrenoblokatorių priešvėžinio poveikio priklausomybę nuo jų selektyvumo beta

adrenoreceptoriams.

Tyrimo metodai. Šiame darbe buvo tiriamas septynių beta adrenoblokatorių (selektyvių: atenololio, betaksololio, esmololio, metoprololio; bei neselektyvių: pindololio, propranololio, timololio) poveikis žmogaus nesmulkialąstelinio plaučių vėžio linijų (A549 ir H1299) 2D ir 3D kultūrose. Beta adrenoblokatorių poveikis žmogaus plaučių vėžio ląstelių gyvybingumui nustatytas MTT metodu po 72 val. inkubacijos, apskaičiuojant koncentracijos, slopinančios 50 proc. ląstelių gyvybingumą (EC50)

vertes. Beta adrenoblokatorių poveikis ląstelių kamieniškumui nustatytas įvertinant jų poveikį ląstelių kolonijų formavimui ir augimui. Ląstelių žūties būdas nustatytas jas dažant fluorescentiniais dažais Hoechst 33342 ir propidžio jodidu. Beta adrenoblokatorių aktyvumas plaučių vėžio 3D ląstelių kultūrose nustatytas įvertinant jų poveikį sferoidų dydžio kitimui.

Rezultatai. Propranololis ir betaksololis slopino plaučių vėžio ląstelių gyvybingumą. Didžiausiu aktyvumu pasižymėjo propranololis. Nustatytos jo EC50 vertės A549 ir H1299 ląstelių linijose buvo

atitinkamai 119,3 ± 12,7 µM ir 98,8 ± 10,3 µM. Propranololis stipriau slopino H1299 ląstelių gyvybingumą, tuo tarpu betaksololis vienodai slopino abiejų ląstelių linijų gyvybingumą. Kiti junginiai slopino ląstelių gyvybingumą didesnėmis nei 500 µM koncentracijomis. Ląstelių kolonijų formavimąsi 90 proc. nuo EC50 koncentracijomis pilnai slopino betaksololis ir propranolis. Dauguma beta

adrenoblokatorių sukėlė plaučių vėžio A549 ir H1299 ląstelių apoptozę ir nekrozę. Daugiau A549 ląstelių žuvo apoptozės būdu nei nekrozės, tuo tarpu H1299 ląstelėse šie junginiai sukėlė ląstelių žūtį abiem būdais. Beta adrenoblokatoriai neslopino H1299 ląstelių sferoidų augimo.

Išvados. Beta adrenoblokatorių priešvėžinis aktyvumas nesmulkialąstelinio plaučių vėžio ląstelių H1299 ir A549 kultūrose nėra susijęs su jų selektyvumu beta adrenoreceptoriams. Didžiausiu priešvėžiniu aktyvumu ląstelių 2D kultūrose pasižymi propranololis ir betaksololis.

SUMMARY

M. Sidorova Master Thesis „Evaluation of anticancer activity of beta adrenoreceptor antagonists in lung cancer cell cultures“. Scientific supervisor – V. Petrikaitė. Department of drug chemistry, Faculty of Pharmacy, Lithuanian University of Health Sciences. Kaunas, 2018.

The aim of the research was to evaluate the anticancer activity of statins in human non-small cellular lung cancer cell lines.

Objectives:

1. To investigate the effects of beta adrenoreceptors antagonists on cancer cell viability. 2. To investigate the effects of beta adrenoreceptors antagonists on cancer cell migration.

3. To identify the type of human non-small cellular lung cancer cell death induced by beta adrenoreceptor antagonists.

4. To evaluate the effect of beta adrenoreceptors antagonists on human non-small cellular lung cancer cell 3D cultures (spheroids).

5. To evaluate the anticancer activity of beta adrenoreceptors depending on the drug selectivity. Methods. In the present study the anticancer activity of seven beta adrenoblockers (selective: atenolol, betaxolol, esmolol, metoprolol and non-selective: pindolol, propranolol and timolol) was investigated in non-small cellular lung cancer cell lines A549 and H1299. The effect of beta adrenoblockers on cell viability was evaluated using MTT assay, EC50 values were obtained after 72 hours of incubation. The

activity of beta adrenoblockers on clonogenicity of lung cancer cells was tested by evaluating the effect on the colony-forming ability and growth of cancer cells. The type of cell death was evaluated by cell staining with Hoechst 33342 and propidium iodide. The activity of beta adrenoblockers in 3D non-small lung cellular cancer cell cultures was evaluated by measuring the size of spheroids.

Results. Propranolol and betaxolol inhibited cell viability. Among tested compounds propranolol had the greatest effect on cell viability (EC50 values after 72 h on A549 and H1299 cell lines were

119,3 ± 12,7 µM and 98,8 ± 10,3 µM, respectively). Propranolol had stronger effect on H1299 cell lines viability while betaxolol activity was the same in both cell lines. The rest of the compounds inhibited cell viability at concentrations greater than 500 µM. 90 perc. of calculated EC50 concentrations of

propranolol and betaxolol completely suppressed colony formation. The majority of tested compounds induced cell death through apoptosis and necrosis. In A549 cell lines apoptosis was mainly induced while in H1299 cell line compounds induced both apoptosis and necrosis. None of tested beta adrenoblockers showed the effect on tumor spheroid growth.

Conclusions. Anticancer activity of beta adrenoblockers is not related to selectivity of the compounds. The most active compounds in lung cancer cell 2D cultures are propranolol and betaxolol.

SANTRUMPOS

A549 nesmulkialąstelinio plaučių vėžio ląstelių linija, plaučių adenokarcinoma ATP adenozino trifosfatas

cAMF ciklinis adenozino monofosfatas COX-2 ciklooksigenazė-2

DMEM Dulbecc‘o modifikuota Eagle mitybinė terpė (angl. Dulbecc‘o Modified Eagle Medium) DMSO dimetilsulfoksidas

EC50 koncentracija, sukelianti 50 proc. laukiamo atsako FBS fetalinis veršiukų serumas (angl. fetal bovine serum)

H1299 nesmulkialąstelinio plaučių vėžio ląstelių linija, plaučių karcinoma LogD pasiskirstymo koeficientas (angl. distribution coefficient)

MSA membranas stabilizuojantis aktyvumas

MTT 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromidas NNK nitrozamino 4-(metilnitrozamino)-1-(3-piridil)-1-butanonas PBS buferinis fosfatinis druskų tirpalas

PFA paraformaldehidas

PSO Pasaulio sveikatos organizacija

VEGF kraujagyslių endotelio augimo veiksnys (angl. vascular endothelial growth factor) VSA vidinis simpatomimetinis aktyvumas

ĮVADAS

Sergamumas plaučių vėžiu yra antroje vietoje tarp visų vėžio rūšių. Mirtingumas nuo šio vėžio yra pirmoje vietoje pasaulyje, ir tai yra viena iš pagrindinių vyrų mirties priežasčių [1].

Nepaisant pažangos diagnostikos ir gydymo srityse, šios plaučių vėžio rūšies gydymas išlieka problematiškas. Atsparumas vaistams mažina gydymo efektyvumą [2] ir 5 metų išgyvenamumo laikotarpis pasiekiamas mažiau nei 18 proc. ligos atvejų [3].

Katecholaminai norepinefrinas ir epinefrinas, kitaip vadinami noradrenalinu ir adrenalinu, yra beta adrenoreceptorių neuromediatoriai, išskiriami iš antinksčių šerdies kaip atsakas į fizinį ir psichologinį stresą. Jie reguliuoja organų ir ląstelių veiklą, susijusią su simpatinės nervų sistemos stimuliacija. Mokslininkų teigimu, šių neuromediatorių koncentracijos padidėjimas organizme skatina plaučių adenokarcinomos mikrometastazių augimą [4,5]. Priešingai, beta adrenerginiai antagonistai (beta adrenoblokatoriai), blokuodami beta adrenoreceptorius, neleidžia prie jų prisijungti norepinefrinui ir epinefrinui.

Pirmą kartą beta adrenoreceptorių vaidmuo vystantis plaučių vėžiui buvo paminėtas 1989 metais [4]. Nustatyta, kad beta adrenoreceptorių stimuliavimo sukeliamas katecholaminų išskyrimas didina egzogeninio ciklinio adenozino monofosfato (cAMF) koncentraciją, dėl to skatinama vėžinių ląstelių proliferacija [6]. Ikiklinikiniuose tyrimuose nustatyta, kad beta adrenoblokatoriai mažina vėžinių ląstelių proliferaciją, migraciją, invaziškumą, angiogenezę ir auglio imuninį atsaką [7–9].Tikslus šios vaistų klasės priešvėžinio aktyvumo veikimo mechanizmas iki šiol nėra aiškus, todėl svarbu atlikti detalesnius tyrimus vėžio ląstelių kultūrose.

Klinikinių tyrimų rezultatais patvirtintas beta adrenoblokatorių teigiamas poveikis pacientų, sergančių krūties, prostatos, kiaušidžių, storosios žarnos, odos ir plaučių vėžių, išgyvenamumui. Prieš keletą metų paskelbto retrospektyvinio klinikinio tyrimo duomenimis, pacientų, vartojusių beta adrenoblokatorius kartu su radioterapija, išgyvenamumas padidėjo 22 proc., lyginant su kontroline grupe [10]. Nepaisant nustatyto teigiamo poveikio pacientų išgyvenamumui, yra ir duomenų, jog beta adrenoblokatorių ir kitų noradrenalino apykaitą organizme veikiančių vaistų vartojimas gali didinti vėžio atsiradimo tikimybę bei neigiamai veikti pacientų išgyvenamumą [11,12].

Nors galimas beta adrenoblokatorių priešvėžinis aktyvumas pastebėtas jau prieš beveik du dešimtmečius, jų priešvėžinis aktyvumas plaučių vėžio ląstelių kultūrose iki šiol nėra pakankamai įvertintas. Atsižvelgiant į plaučių vėžio gydymo problematiką ir paplitimą, nuspręsta ištirti beta adrenoblokatorių priešvėžinį poveikį nesmulkialąstelinio plaučių vėžio linijų A549 ir H1299 vėžio 2D ir 3D kultūrose. Šiame darbe buvo tiriamas jų poveikis ląstelių gyvybingumui ir kamieniškumui bei vertinamas sukeliamas ląstelių žūties būdas, nustatomas aktyvumas vėžio sferoiduose. Taip pat buvo siekiama įvertinti, ar priešvėžinis aktyvumas yra susijęs su selektyvumu beta adrenoreceptoriams.

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Tikslas: įvertinti beta adrenoblokatorių priešvėžinį aktyvumą plaučių vėžio ląstelių 2D ir 3D kultūrose. Uždaviniai:

1. Nustatyti beta adrenoblokatorių poveikį plaučių vėžio ląstelių gyvybingumui 2D kultūrose. 2. Išanalizuoti beta adrenoblokatorių poveikį plaučių vėžio ląstelių kamieniškumui.

3. Nustatyti beta adrenoblokatorių sukeliamą plaučių vėžio ląstelių žūties būdą.

4. Įvertinti beta adrenoblokatorių aktyvumą plaučių vėžio ląstelių sferoiduose (3D kultūrose). 5. Įvertinti beta adrenoblokatorių priešvėžinio poveikio priklausomybę nuo jų selektyvumo beta

1.

LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. Plaučių vėžio gydymo problematika

Atsižvelgiant į navikinių ląstelių morfologiją, plaučių vėžys skirstomas į nesmulkialąstelinį, diagnozuojamą 80-85 proc., ir smulkialąstelinį, diagnozuojamą 15-20 proc. pacientų [13]. Histologiškai nesmulkialąstelinis plaučių vėžys skirstomas į adenokarcinomą (sudaro 25 proc. susirgimo atvejų), putliųjų ląstelių karcinomą ir didelių ląstelių karcinomą [14]. Plaučių adenokarcinomai būdingas metastazavimas į tolimesnes kūno dalis bei lėtas naviko augimas. Metastazės pirmiausia atsiranda arčiausiai esančiuose tarpuplaučio limfmazgiuose, vėliau jų aptinkama inkstuose, kauluose, smegenyse ir kepenyse. Vėžys, atsiradęs kituose organuose, taip pat gali pažeisti plaučius. Tokia savybė būdinga krūties, kasos, inkstų ir odos vėžiui. Tuomet chirurginiu būdu pašalinamas pirminis pažeistas organas.

Karcinomos tipai tarpusavyje panašūs jautrumu vaistams ir sukeliamu poveikiu pacientų išgyvenamumui [3]. Sergančiųjų nesmulkialąsteliniu plaučių vėžio išgyvenamumas priklauso nuo ligos stadijos; pacientų išgyvenamumas siekia 60 proc., nustačius I ligos stadiją, tačiau siekia tik 1 proc., nustačius IV stadijos onkologinį susirgimą [14]. Smulkialąstelinis plaučių vėžys pasižymi geresniu atsaku į chemoterapiją ir radiaciją nei kitos plaučių vėžio rūšys, tačiau dažniausiai pacientams nustatomos tolimos metastazės [15]. Nepaisant pažangos gydymo ir diagnostikos srityje, apie 70 proc. pacientų diagnozuojama vėlyva vėžio stadija, todėl išgyvenamumas 5 metų laikotarpiu pasiekiamas tik 8-9 proc. atvejų, diagnozavus smulkialąstelinį [16] ir 18 proc. – nesmulkialąstelinį plaučių vėžį [17]. Kasmet nuo plaučių vėžio miršta daugiau žmonių nei nuo storosios žarnos, krūties ir prostatos vėžio kartu sudėjus [18]. Remiantis Pasaulio sveikatos organizacijos (PSO) duomenimis, artimiausio dešimtmečio bėgyje plaučių vėžys taps šešta dažniausia mirties priežastimi ir išliks šioje pozicijoje artimiausius dvejus dešimtmečius [19].

Kadangi nustatyti galimi nesmulkialąstelinio plaučių vėžio vystymosi mechanizmai bei specifinių genų, nulemiančių navikų atsparumą vaistams, mutacijos gydymui taikoma chemoterapija tikslinio pobūdžio vaistais [20]. Vėžinių ląstelių proliferacijai svarbus naujų kraujagyslių susidarymas, kurį skatina kraujagyslių endotelio augimo veiksnys (VEFG) [21]. Angiogenezės slopikliai yra plačiai vartojami plaučių vėžio gydymui [22,23]. Siekiant išspręsti atsirandančio navikinių ląstelių atsparumo vaistams problemą ir užtikrinti chemoterapijos veiksmingumą, kuriami nauji preparatai. Atsižvelgiant į tai, jog naujų vaistinių preparatų vystymas yra ilgalaikis ir didelių kaštų reikalaujantis procesas, tiriamas jau rinkoje esančių vaistų priešvėžinis aktyvumas. Nepaisant to, kad beta adrenoblokatoriai yra dažniausiai vartojami širdies ir kraujagyslių ligų, migrenos ir glaukomos gydymui, yra duomenų, jog šios vaistų klasės vartojimas turi teigiamą įtaką pacientų, sergančių vėžiu, išgyvenamumui [10,24–26].

1.2. Beta adrenoblokatorių savybės

Beta adrenoblokatoriai slopina simpatinės nervų sistemos veiklą, todėl šios klasės junginiai taip pat yra vadinami simpatolitikais. Šių junginių struktūrai būdingi simpatinės nervų sistemos neuromediatorių epinefrino ir norepinefrino molekulių fragmentai. Pagal struktūrą jie yra skirstomi į ariletanolaminus ir ariloksipropranolaminus (1 pav.) [27].

Selektyvumą receptoriams lemia pakaitai aromatiniame žiede: para padėties pakaitai būdingi junginiams, selektyviems beta1 adrenoreceptoriams, tuo tarpu orto padėties pakaitai yra neselektyvių

junginių struktūroje. Fenolinės hidroksigrupės būtinos vidiniam simpatomimetiniam aktyvumui (VSA). Jų pašalinimas ar pakeitimas kitomis liekanomis nulemia šios savybės praradimą, tačiau junginio aktyvumas išlieka [27]. Esterinės grupės įvedimas į beta adrenoblokatorių struktūrą mažina junginio atsparumą fermentams (esterazėms), tai nulemia trumpą gyvavimo pusperiodį (pvz., esmololio gyvavimo pusperiodis yra apytiksliai 9 min) [28].

1 pav. Beta adrenoblokatorių bendrosios struktūrinės formulės

Beta adrenoblokatoriai tarpusavyje skiriasi selektyvumu receptoriams, VSA, membranas stabilizuojančiu aktyvumu (MSA) ir lipofiliškumu. Pirmos kartos beta adrenoblokatoriai yra neselektyvūs (vienodai veikia beta1 ir beta2 adrenoreceptorius), antros kartos – sąlyginai

kardioselektyvūs (labiau veikia beta1 adrenoceptorius), naujausi junginiai pasižymi dideliu selektyvumu

beta1 adrenoreceptoriams. Vaistų selektyvumas receptoriams yra priklausomas nuo dozės (didinant

dozę – mažėja) (1 lentelė) [29]. Beta adrenoblokatoriai, pasižymintys daliniu agonistiniu aktyvumu, kitaip vadinamu VSA, slopina katecholaminų poveikį, tačiau silpnai stimuliuoja beta1 ir beta2

adrenoreceptorius [29]. Dalinis agonistinis poveikis beta adrenoreceptoriams priklauso nuo endogeninės katecholaminų koncentracijos: esant didelei endogeninei katecholaminų koncentracijai junginiai beta adrenoreceptorius veikia antagonistiškai, tuo tarpu esant katecholaminų trūkumui organizme ar stipriam simpatinės nervų sistemos veiklos slopinimui, junginiai veikia agonistiškai [30]. VSA gali pasireikšti dviem būdais: blokuojant ar dalinai agonistiškai veikiant beta1 adrenoreceptorius ir agonistiškai veikiant

adrenoreceptorius (būdinga karvediloliui, labetaloliui) [29]. Teoriškai stipriai išreikštas junginio VSA padeda išvengti bradikardijos arba stipraus nepageidaujamo inotropinio poveikio, tačiau klinikinėje praktikoje nėra nustatyta šios savybės nauda. Kai kurių mokslininkų teigimu, VSA gali komplikuoti miokardo infarkto prevencijos eigą [28].

Kai kurie beta adrenoblokatoriai, vartojami didesnėmis nei terapinėmis dozėmis, gali pasižymėti MSA [29]. Slopinant natrio jonų patekimą į ląsteles per įtampos valdomus natrio jonų kanalus, ilgėja membranos depoliarizacijos trukmė (0 fazė). Šia savybe pasižymi ir vietiniai anestetikai (pvz., lidokainas) bei I klasės antiaritminiai vaistai. Nėra nustatyta, kad MSA sukelia tiesioginį neigiamą inotropinį poveikį, be to, MSA pasireiškia tik vartojant didesnę nei terapinę vaisto dozę [30].

Naujesnės kartos beta adrenoblokatoriai, veikdami kitų receptorių potipius, plečia periferines kraujagysles. Karvedilolis ir labetalolis papildomai blokuoja α1 adrenoreceptorius. Taip pat nustatytas

karvedilolio antioksidacinis, priešuždegiminis, antiproliferacinis ir antiariminis poveikis. Nebivololis plečia kraujagysles, didindamas azoto oksido biopasisavinimą, ir tai svarbu klinikinėje praktikoje, kadangi azoto oksidas veikia endotelio funkciją [28,29]. Beta blokatoriai, vartojami glaukomos gydymui (betaksololis, karteololis, levobunololis ir timololis), plečia kraujagysles blokuodami įtampos valdomus kalcio kanalus [29].

1 lentelė. Farmakologinės beta adrenoblokatorių savybės; sudaryta pagal [31,32]

Junginys β1 blokados stiprumas

(propranololis = 1) VSA* MSA* LogD** pKa Selektyvūs junginiai: Atenololis 1,0 0 0 -1,85 9,6 Betaksololis 1,0 0 + 0,43 9,4 Esmololis 0,02 0 0 -0,18 9,5 Metoprololis 1,0 0 ++ -0,26 9,7 Neselektyvūs junginiai: Pindololis 6,0 ++ ++ -0,10 9,7 Propranololis 1,0 0 ++ 1,07 9,4 Timololis 6,0 0 0 -0,52 8,8

+ vidutiniškai išreikšta junginio savybė, ++ stipriai išreikšta junginio savybė, 0 – nepasižymi nurodyta savybe. ** log D reikšmė, kai pH = 7,4.

Lipofiliški junginiai yra greičiau metabolizuojami kepenyse, stipriau sąveikauja su kitais paciento vartojamais vaistais, geriau ir greičiau patenka į galvos smegenis, sukeldami tokius šalutinius poveikius kaip galvos skausmas, nemiga ar nerimas. Taip pat jiems būdingas trumpas gyvavimo pusperiodis (apytiksliai 4 val.). Slopindami kepenų kraujotaką lipofiliški junginiai mažina kitų vaistų

metabolizmą bei biopasisavinimą. Vartojant lipofiliškus beta adrenoblokatorius ilgą laiką vaisto gyvavimo pusperiodis pailgėja maždaug 3 kartus. Hidrofiliški beta adrenoblokatoriai išsiskiria pro inkstus nepakitę ir nesikaupia organizmo terpėse. Esant fiziologiniam pH (apie 7,4), 95 proc. bazių jonizuojasi [32]. Jonizuoti aminai, įgiję teigiamą krūvį, jungiasi prie neigiamą krūvį turinčios membranos fosfolipidų hidrofilinės dalies ir taip patenka į ląstelės vidų [32].

Atsižvelgiant į farmakologines junginių savybes, tyrimams buvo pasirinkti septyni beta adrenoblokatoriai. Siekiant įvertinti selektyvumo receptoriams ryšį su priešvėžiniu aktyvumu, eksperimentuose buvo naudojami keturi selektyvūs (atenololis, betaksololis, esmololis ir metoprololis) ir trys neselektyvūs (pindololis, propranololis ir timololis) beta adrenoreceptoriams junginiai.

1.3. Beta adrenoblokatorių veikimo mechanizmas

1948 m. Ahlquist nustatė, jog egzistuoja kelių tipų adrenoreceptoriai [33]. Remiantis tolimesnių tyrimų rezultatais, beta adrenoreceptoriai buvo priskirti prie su G-baltymu susijusių receptorių [29]. Su G-baltymu susiję receptoriai, prisijungdami ligandą, įgauna tam tikra aktyvią konformaciją [34]. Katecholaminų agonistinis poveikis beta adrenoreceptoriams sukelia baltymo konformacijos pokyčius, dėl to aktyvuojama adenilciklazė ir skatinamas cAMF susidarymas iš adenozintrifosfato (ATF) [29]. Priešingai, beta adrenerginių receptorių antagonistai stabdo norepinefrino ir epinefrino prisijungimą prie receptorių, tačiau nekeičia receptorių konformacijos ir jautrumo [29]. Manoma, kad endogeninės katecholaminų koncentracijos padidėjimas turi neigiamą poveikį vėžiu sergančių pacientų išgyvenamumui [35].

In vitro tyrimuose nustatyta, jog beta adrenerginių receptorių stimuliavimas skatina vėžinių

ląstelių proliferaciją ir migraciją bei VEGF gamybą. Priešingai, antagonistinis poveikis, sukeliamas beta adrenoblokatorių, slopina vėžinių ląstelių invaziškumą ir metastazavimą in vivo [8,9]. Be to, receptorių stimuliavimas inicijuoja PKA, Src, EPAC/MAPK/ERK1/2 ir arachidono rūgšties signalinimo kaskadas ir aktyvuoja matrikso metalo proteinazes 2 ir 9, skatinančias vėžinių ląstelių invaziškumą [36–38] (2 pav.).

2 pav. Beta adrenoblokatorių priešvėžinio poveikio mechanizmas

Beta adrenerginių receptorių stimuliavimas skatina cAMF gamybą. In vitro tyrimuose nustatyta, jog cAMF keikio padidėjimas slopina plaučių vėžio ląstelių apoptozę [39]. In vivo tyrimuose nustatyta, jog blokuojant beta1 adrenoreceptorius slopinami cAMF ir PKA keliai bei matrikso metalo

proteinazės, kurie yra svarbūs veiksniai vėžinių ląstelių invaziškumui, augimui ir diferenciacijai [37,38]. Tiriant propranololio ir karvedilolio farmakologinį poveikį, nustatyta, jog abu junginiai ne tik slopina adenilciklazę, bet ir reguliuoja ekstraląstelinių kinazių veiklą [29].

1.4. Beta adrenoblokatorių priešvėžinio aktyvumo tyrimai

Siekiant įvertinti beta adrenoblokatorių priešvėžinį aktyvumą, atlikta daug tyrimų in vivo ir in

vitro sąlygomis. Jų metu nustatyta, jog šie junginiai slopina vėžinių ląstelių gyvybingumą, proliferaciją,

2 lentelė. Beta adrenoblokatorių priešvėžinis aktyvumas skirtingose vėžio rūšyse

Vėžio tipas Vaistas Sukeliamas poveikis Šaltinis

Kasos Butoksaminas, metoprololis, propranololis Invaziškumas, migracija, proliferacija, apoptozė [38,40–42]

Krūties Atenololis, karvedilolis, propranololis

Invaziškumas, proliferacija, migracija

[8] Kolorektalinis Atenololis, karvedilolis,

propranololis

Invaziškumas, proliferacija, migracija, apoptozė

[8,38]

Stemplės Atenololis Proliferacija [43]

Skrandžio Atenololis, propranololis Proliferacija, apoptozė [44,45]

Plaučių Propranololis Proliferacija [46]

Melanoma Karvedilolis Proliferacija, angiogenezė [47]

Leukemija Karvedilolis, propranololis

Proliferacija, auglio augimas, metastazavimas

[48,49]

Hemangioma Propranololis Proliferacija [50]

Angiosarkoma Propranololis Proliferacija [51]

Kiaušidžių Propranololis Proliferacija, migracija, invaziškumas, auglio augimas,

apoptozė

[12,52]

Prostatos Propranololis Migracija,metastazavimas,apoptozė [44,53,54] Neuroblastoma Atenololis, karvedilolis,

metoprololis, nebivololis, prorpanololis

Proliferacija, apoptozė [48]

Pirmą kartą beta adrenoreceptorių vaidmuo plaučių vėžio vystymuisi buvo paminėtas 1989 metais [4]. Manoma, kad beta adrenoreceptorių stimuliavimo sukeliamas katecholaminų išskyrimas didina egzogeninio cAMF koncentraciją, dėl to skatinama vėžinių ląstelių proliferacija [6]. Mokslininkai įrodė, kad šių neuromediatorių koncentracijos padidėjimas organizme skatina plaučių adenokarcinomos mikrometastazių augimą [4,5]. Katecholaminai taip pat kontroliuoja imuninės sistemos veiklą. Mažindami limfocitų kiekį ir aktyvumą, jie slopina ląstelių žudikių veiklą, dėl to padidėja vėžinių ląstelių atsparumas ir skatinamas naviko vystymasis [55,56]. Gyvūnų modeliuose neselektyvių beta adrenoblokatorių sukeliamas antagonistinis poveikis beta2 adrenoreceptoriams atstatė limfocitų

funkciją, tačiau tai neturėjo įtakos išgyvenamumui [7]. Tuo tarpu beta adrenoblokatorių derinių su ciklooksigenazės-2 (COX-2) slopikliais vartojimas pailgino gyvūnų gyvenimo trukmę [26]. Literatūros duomenimis, beta adrenoreceptorių stimuliavimas aktyvina COX-2 veikimą ir per arachidono rūgšties kaskadą skatinamas vėžinių ląstelių augimas ir invazyvumas [57,58].

Dažniausia plaučių adenokarcinomos atsiradimo priežastis yra rūkymas. Cigaretėse esantis nitrozamino 4-(metilnitrozamino)-1-(3-piridil)-1-butanonas (NNK), prisijungdamas prie beta adrenoreceptorių, veikdamas kvėpavimo takų epitelio ląsteles per nuo cAMF priklausomą signalinimo kaskadą skatina plaučių adenokarcinomos vystymąsi, vėžinių ląstelių proliferaciją ir invazyvumą [59,60]. Beta2 adrenerginiai receptoriai tiesiogiai dalyvauja vystantis plaučių vėžiui ir angiogenezės

procesuose [61]. Remiantis Schuller eksperimentų rezultatais galima teigti, jog beta adrenoreceptorių agonistai, tokie kaip adrenalinas, teofilinas ir izoproterenolis, sukeldami cAMF koncentracijos padidėjimą ląstelėse, ženkliai didina NNK plaučių adenokarcinomos vystymąsi skatinantį poveikį [4]. Priešingai, beta adrenoreceptorių antagonistai, tokie kaip propranololis, slopina NNK poveikį ir plaučių adenokarcinomos vystymąsi [42,62]. Mokslininkas Wang nustatė, jog vien beta2 adrenerginių receptorių

aktyvinimas gali skatinti vėžio vystymąsi ir NNK sukeliamas mutageninis poveikis neturi įtakos vėžio atsiradimui [63]. Vis dėlto, įrodyta, jog nikotinas skatina plaučių vėžio vystymąsi ne tik agonistiniu poveikiu į beta adrenoreceptorius, bet ir tiesiogiai slopindamas vėžinių ląstelių apoptozę [64,65]. Be to, nikotinas skatina katecholaminų koncentracijos organizme padidėjimą [66].

Klinikinių retrospektyvinių tyrimų rezultatai rodo, kad beta adrenoblokatoriai, ypač propranololis, mažina auglių dydį ir jų atsinaujinimo tikimybę bei didina pacientų išgyvenamumą [5,67– 69]. Toks priešvėžinis junginių aktyvumas buvo nustatytas pacientų, sergančių krūties vėžiu ir vartojančių šios klasės vaistus 30 dienų prieš ir po naviko pašalinimo, populiacijoje [25,70]. Vis dėlto, beta adrenoblokatorių vartojimas 60 dienų prieš nesmulkialąstelinio plaučių vėžio pašalinimą neturėjo įtakos pacientų išgyvenamumui ir nedidino remisijos tikimybės [59]. Taip pat pastebėta, kad laikotarpiu prieš chirurginį naviko pašalinimą organizme didėja katecholaminų koncentracija, dėl to skatinamas mikrometastazių augimas ir didėja vėžio atsinaujinimo tikimybė [12]. Kadangi beta adrenoblokatoriai antagonistiškai veikdami beta adrenoreceptorius slopina katecholaminų poveikį, buvo tiriamas beta adrenerginių antagonistų vartojimo derinimo su radioterapija poveikis pacientų, sergančių nesmulkialąsteliniu plaučių vėžiu, būklei [10]. Papildomas vaistų vartojimas 33 proc. pacientų sumažino tolimų metastazių atsiradimo riziką, 26 proc. mažino ligos atsiradimo riziką ir 22 proc. mažino mirties riziką, lyginant su kontroline grupe.

Nepaisant moksliniuose tyrimuose nustatyto teigiamo beta adrenoblokatorių poveikio pacientų išgyvenamumui, yra duomenų, jog beta adrenoblokatorių ir kitų noradrenalino apykaitą organizme veikiančių vaistų vartojimas gali didinti vėžio atsiradimo tikimybę bei neigiamai veikti pacientų išgyvenamumą [11,12]. Vis dėlto, vartojant šios klasės vaistus 7,5 ir daugiau metų vėžio riziką didinantis poveikis nenustatytas [52]. Remiantis šių tyrimų rezultatais galima daryti išvadą, kad beta adrenoblokatoriai pasižymi priešvėžiniu poveikiu, mažindami vėžinių ląstelių proliferaciją ar metastazavimą in vivo ir gali būti vartojami vėžinių susirgimų profilaktikai, tačiau neslopina jau esančių metastazių augimo ir turi statistiškai reikšmingą poveikį pacientų gyvenimo trukmei tik derinant vaistų vartojimą su kitais vėžio gydymo būdais ar atsižvelgiant į receptorių, dominuojančių vėžio tipe, ekspresiją ir į preparatų selektyvumą receptoriams. Be to, skirtingus tyrimų rezultatus galima paaiškinti tuo, kad tyrimuose dalyvaujantys pacientai turi žalingų įpročių ar serga gretutinėmis ligomis, turinčiomis įtakos išgyvenamumui.

2017 m. atliktose epidemiologinėse analizėse, kuriose buvo siekiama išsiaiškinti beta adrenoblokatorių įtaką vėžiu sergančių pacientų išgyvenamumui, buvo atsižvelgta į gretutines ligas. Navikinių ląstelių augimui svarbus naujų kraujagyslių susidarymas, kurį skatina VEGF. VEGF koncentracijos padidėjimą organizme sukelia hipertenzija [71]. Siekiant ištirti hipertenzijos ir beta blokatorių vartojimo įtaką pacientų išgyvenamumui, buvo išanalizuoti 606 pacientų, kuriems buvo nustatytas III stadijos nesmulkialąstelinis plaučių vėžys, duomenys [72]. Kraujospūdžio sutrikimai neturėjo įtakos pacientų išgyvenamumui, tačiau beta adrenoblokatorių vartojimas 22 proc. didino pacientų gyvenimo trukmę. Kadangi yra duomenų apie beta adrenoblokatorių savybę mažinti VEGF koncentraciją organizme ir tokiu būdu pagerinti pacientų išgyvenamumą, buvo išanalizuoti 239 pacientų, sergančiujų II ir III nesmulkialąsteliniu plaučių vėžiu ir gydomų chemoterapija, duomenys [21]. Nustatyta, kad VEGF turi įtakos ligos vystymosi eigai, tačiau beta adrenoblokatoriai nemažino VEGF koncentracijos organizme bei negerino pacientų išgyvenamumo. 2015 m. atliktuose tyrimuose buvo vertinamas hipertenzijos ir beta adrenoblokatorių poveikis pacientų, sergančių metastazavusiu smegenų vėžiu, ligos vystymosi eigai ir išgyvenamumui [47]. Dauguma atveju pirminis vėžio židinys buvo plaučiai. Nustatyta, kad hipertenzija neturėjo įtakos pacientų gyvenimo trukmei. Papildomas beta adrenoblokatorių vartojimas 23 proc. mažino auglio augimą, 3 kartus mažino vėžio progresavimo tikimybę ir 11 mėnesių ilgino pacientų išgyvenamumą, lyginant su kontroline grupe [47]. Beta adrenoblokatoriai skiriami hipertenzijos kontrolei, tačiau jų savybė mažinti VEGF kiekį neįrodyta in

vivo. Prieštaringos mokslininkų išvados galimai nulemtos skirtingų tyrimų sąlygų: pacientų vartojami

vaistai skiriasi selektyvumu receptoriams, neretai nurodoma tik vartojamų vaistų klasė, tačiau nenurodomi konkretūs preparatų pavadinimai. Be to, širdies ir kraujagyslių ligų gydymui dažnai skiriami vaistų deriniai, o ne pavieniai beta adrenoblokatorių atstovai. Kaip kontrolinė grupė pasirenkami pacientai, nevartojantys beta adrenoblokatorių, tačiau vartojantys kitoms indikacijoms gydyti paskirtus vaistus, kurie gali sąveikauti tarpusavyje ir daryti įtaką vėžio vystymosi eigai. Taip pat skiriasi dalyvių individualios savybės, tokios kaip amžius, žalingų įpročių buvimas ir sergamumas gretutinėmis ligomis. Individualios pacientų fiziologinės savybės nulemia farmakokinetinių ir farmakodinaminių rodiklių pokyčius ir skirtumą. Pastebėta, jog koronarinė širdies liga, bet ne hipertenziją, turi didesnę įtaką pacientų išgyvenamumui ir atsakui į chemoterapiją ir radioterapiją [73]. Be to, laikotarpiu prieš chirurginį naviko pašalinimą galimas VEGF koncentracijos padidėjimas [12]. Svarbu atsižvelgti į tai, jog analizei pasirinktas skirtingų stadijų plaučių vėžys, kuris tarpusavyje skiriasi ne tik morfologija, bet ir etiologija. Tam, kad pateikti vienareikšmišką išvadą apie beta adrenoblokatorių įtaką pacientų išgyvenamumui reikėtų suvienodinti tyrimų sąlygas.

Per pastaruosius dešimtmečius buvo atliekami ir klinikiniai tyrimai, vertinantys beta adrenoblokatorių priešvėžinį aktyvumą (3 pav.). Pirmieji klinikiniai tyrimai su beta adrenoblokatoriais buvo pradėti 2008 m.[74]. Daugiausia klinikinių tyrimų, vertinančių beta adrenoblokatorių priešvėžinį

aktyvumą, buvo pradėti 2013 m. (6), tačiau jų populiarumas iki 2016 metų sumažėjo. 2017 m. pradėti penki klinikiniai tyrimai, skirti įvertinti atenololio ir propranololio pritaikymą hemangiomos ir melanomos gydymui ir profilaktikai.

3 pav. Priešvėžinio beta adrenoblokatorių aktyvumo tyrimai pagal vėžio rūšis

(parengta pagal ClinicalTrials.gov duomenis)

Net vienuolikoje klinikinių tyrimų buvo naudojamas propranololis. Vieno klinikinio tyrimo metu buvo nustatyta, kad propranololis 87 proc. pacientų pilnai panaikino hemangiomos požymius, todėl jis patvirtintas kaip pirmo pasirinkimo vaistas gydant kūdikių hemangiomą [74]. 2011 propranololis taip pat tapo pirmo pasirinkimo vaistu gydant galvos ir kaklo hemangiomą [75]. ClinicalTrials.gov duomenų bazėje neužregistruotas nei vienas klinikinis tyrimas, kuriame būtų naudojamas pindololis ar betaksololis. Be to, nėra atliktų ar naujai užregistruotų klinikinių tyrimų su plaučiu vėžiu.

Remiantis literatūros duomenimis, galima teigti, kad beta adrenoblokatoriai pasižymi priešvėžiniu aktyvumu ir jų poveikis yra plačiai tiriamas įvairių vėžio rūšių modeliuose in vivo ir in vitro sąlygomis. Vis dėlto, pavienių beta adrenoblokatorių poveikis vėžinėms ląstelėms iki šiol nėra nustatytas. Be to, su nesmulkialąstelinių plaučių vėžiu yra atlikta ženkliai mažiau tyrimų, palyginus su kitomis vėžio rūšimis, todėl tyrimams buvo pasirinktos būtent šios rūšies vėžio ląstelių linijos.

15 4 3 3 2 1 1 1 1 0 3 6 9 12 15 Atilkt ų k linik in ių ty rim ų ska iči u s

1.5. Pasirinktų metodų ypatybės

Siekiant įvertinti beta adrenoblokatorių priešvėžinį aktyvumą, pasirinkti tyrimų metodai, kuriais galima nustatyti junginių poveikį tam tikriems vėžinėse ląstelėse vykstantiems procesams. Visų pirma, atliekami junginių poveikio ląstelių gyvybingumui tyrimai. Tokiu būdu nustatoma junginių EC50,

kuri yra naudojama tolimesniuose eksperimentuose.

Vėžinės ląstelės geba proliferuoti ir formuoti kolonijas. Ši ląstelių savybė yra siejama su kamieniškumu. Plaučių vėžiui yra būdingos kamieninės ląstelės, nulemiančios navikų atsinaujinimą ir atsparumą priešvėžiniams vaistams [76]. Junginiai, pasižymintys priešvėžiniu aktyvumu, slopina ląstelių gyvybingumą ir tuo pačiu kamieniškumą. Tokiu būdu galima nustatyti koncentracijas, mažinančias kolonijų kiekį ir procentaliai užimamą kolonijų plotą, tai padeda nuspėti junginio efektyvumą gydant onkologines ligas.

Programuota ląstelių žūtimi iš organizmo pašalinamos pasenusios, nereikalingos ląstelės. Apoptozė apsaugo organizmą nuo patologinių procesų vystymosi [77]. Sutrikus balansui ląstelių apoptotiniuose procesuose, keičiasi santykis tarp ląstelių proliferacijos ir žūties, dėl to skatinamas vėžio vystymasis ir augimas [78]. Daugelyje vėžinių ląstelių receptoriai, atsakingi už apoptozę, yra mutavę, todėl vėžinėms ląstelėms būdinga greita proliferacija, invaziškumas ir didesnis atsparumas citotoksiniams vaistams, palyginus su sveikomis ląstelėmis. Apoptotinis procesas yra siejamas su kaspazių aktyvumu ir gali būti skatinamas ląstelių paviršiuje esančių receptorių stimuliavimu arba citochromo c išskyrimo iš mitochondrijų [79]. Vis dėlto, nekrotiniuose procesuose kaspazės nedalyvauja. Šio ląstelių žūties būdu ląstelės miršta esant patologijai arba tam tikriems struktūriniams pažeidimams [80].

Junginių priešvėžinis aktyvumas dažniausiai nustatomas ląstelių monosluoksnyje, tačiau sąlygų atkartojimui in vivo labiau tinkamas 3D ląstelių sferoidų formavimas in vitro. Nustatyta, kad ląstelių sferoidai pasižymi didesniu invaziškumu ir atsparumu citotoksiniams vaistams bei radioterapijai, palyginus su ląstelėmis, augančiomis 2D monosluoksniu [81]. Sferoidų, kurių diametras ne mažesnis nei 200 um, paviršiuje esančios ląstelės proliferuoja [82]. Dėl sutrikusios deguonies ir medžiagų pernašos vidiniuose sferoido sluoksniuose esančių ląstelių augimas sustabdomas ir jos miršta apoptotiniu ar nekrotiniu būdu [83,84]. Didesnio dydžio ląstelių sferoidų centre nustatomos nekrotinės ląstelės ir atkartojamos hipoksijos sąlygos, būdingos navikams in vivo. Mokslininkų įrodyta, jog hipoksija yra viena pagrindinių vėžinių ląstelių atsparumo vaistams priežasčių [85,86]. Kadangi sferoiduose tarp ląstelių susidaro glaudžioji jungtis, tai labiau atkartoja galimas naviko struktūrines savybes in vivo bei medžiagų transporto sąlygas [87]. Dėl hipoksijos sukelto oksidacinio streso, padidėja reaktyviųjų deguonies formų koncentracija, stabilizuojamas hipoksiją sukeliantis veiksnys 1α (HIF-1a). HIF-1α navikinėse ląstelėse kontroliuoja genų, atsakingų už gliukozės metabolizmą, veiklą [88]. Įrodyta, jog

gliukozės transporto pokyčiai gali aktyvuoti VEGF, skatinantį vėžinių ląstelių proliferaciją ir angiogenezę [89]. Kadangi ląstelių sferoidų gliukozės sąnaudos ir laktato gamyba yra ženkliai didesnės, palyginus su 2D ląstelių kultūromis, šiomis sąlygomis galima tiksliau nustatyti galimą junginio priešvėžinį aktyvumą [90,91]. Dėl gliukozės koncentracijos pokyčių ląstelėse didėja ATF kiekis, kuris, tuo tarpu, nulemia ląstelių žūties būdą: esant aukštai ATF koncentracijai ląstelės miršta apoptotiniu būdu, tuo tarpu esant ATF trūkumui skatinama ląstelių nekrozė [92].

1.6. Pasirinktų ląstelių linijų ypatybės

Eksperimentams buvo pasirinktos dvi laukinio tipo nesmulkialąstelinio plaučių vėžio ląstelių linijos: A549 (plaučių adenokarcinoma) ir H1299 (plaučių karcinoma) (4 pav.) [14]. Abiejose ląstelių linijose nustatyta p53 baltymo mutacija. p53 baltymas nulemia ląstelių proliferacijos greitį ir ląstelių žūties būdą, tiesiogiai sukeldamas nekrotinius procesus [93]. Kadangi vėžinėse ląstelėse p53 baltymas yra mutavęs, šios ląstelės pasižymi didesniu atsparumu priešvėžiniams vaistams [49].

4 pav. Tyrimuose naudotos nesmulkialąstelinio plaučių vėžio ląstelių linijos. A – A549 ląstelių linija, B – H1299 ląstelių linija.

A549 ląstelėse yra nustatytas K-Ras onkogenas. Tai yra G-baltymas, reguliuojantis VEGF veikimą, kuris skatina VEGF signalinimo kaskadą, svarbią vėžinių ląstelių proliferacijai ir diferencijacijai [94,95]. K-Ras geno mutacijos yra būdingos 20-40 proc. plaučių adenokarcinomų [96]. Mokslininkų nustatyta, kad pacientų, sergančių nesmulkialąsteliniu plaučių vėžiu, kuriam būdinga K-Ras geno mutacija, išgyvenamumas yra prastesnis [96]. H1299 ląstelėse yra N-Ras geno mutacija, kuri yra aptinkama tik 1 proc. nesmulkialąstelinio plaučių vėžio navikų ir yra būdinga rūkymo sukeltam plaučių vėžiui [97]. Be to, N-Ras geno mutacijos dažniausiai pasireiškia kartu su K-Ras ir VEGF mutacijomis [62]. VEGF mutacijos dažniau pasireiškia adenokarcinomos ląstelėse ir taip pat mažina jautrumą vaistams bei turi neigiamą poveikį pacientų išgyvenamumui [95,99,100].

A

_B

Ląstelių linijos tarpusavyje skiriasi ne tik fenotipu ir genotipu, bet ir jautrumu priešvėžiniams vaistams. Įrodyta, kad H1299 ląstelių linija yra atsparesnė alkilinančių vaistų grupei priskiriamai cisplatinai, nei A549 [101], tačiau A549 ląstelės yra du kartus atsparesnės celastroliui [102]. Atsižvelgiant į abiejų ląstelių linijų ypatumus ir jautrumą priešvėžiniams vaistams, nuspręsta šias ląstelių linijas naudoti pasirinktų beta adrenoblokatorių tyrimuose.

2.

TYRIMO METODIKA IR METODAI

2.1. Tyrimo objektas

Tyrimams naudojami septyni beta adrenoblokatoriai: beta1 selektyvūs atenololis (99 proc.,

Abcam), metoprololis (98 proc., Alfa Aesar), esmololis (98 proc., Abcam), betaksololis (96 proc., Abcam) ir neselektyvūs: propranololis (99 proc., Acros Organics), timololis (99 proc., Abcam) ir pindololis (99 proc., Abcam) (5 pav.).

2.2. Reagentai, priemonės, aparatūra

Ląstelių linijos

Tyrimuose naudotos žmogaus nesmulkialąstelinio plaučių vėžio ląstelių linijos A549 ir H1299 gautos iš prof. Esteller Manel, IDIBELL tyrimų instituto (Barselona, Ispanija).

Reagentai:

• 1 proc. antibiotikų tirpalas (10000 VV/ml penicilino ir 10 mg/ml streptomicino) (Gibco) • 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromidas (MTT) (≥ 97 proc., Sigma-Aldrich) • Buferinis fosfatinis druskų tirpalas, pH 7,4 (PBS, Gibco)

• Dimetilsulfoksidas (DMSO, ≥ 99,5 proc., Sigma-Aldrich Co.)

• Dulbecc‘o modifikuota Eagle ląstelių mitybinė terpė (DMEM GlutaMAX, Gibco) • Etanolis 96 proc. (Stumbras)

• Fetalinis veršiukų serumas (FBS, Gibco)

• Kristalinis violetinis (≥ 90 proc., Sigma-Aldrich)

• Paraformadehido 16 proc. vandeninis tirpalas (Thermo Scientific)

• Tripsino tirpalas TrypLE Express (Gibco)

Aparatūra

• Centrifūga Eppendorf Centrifuge 5702 R (Eppendorf)

• G:Box Chemi XRQ gelių vaizdavimo sistema (Syngene International Ltd) • Inkubatorius HERAcell 150i (Thermo Scientific)

• Invertuotas fluorescencinis mikroskopas Olympus IX73 (Olympus) • Mikroplokštelių spektrofotometras Multiskan go (Thermo Scientific) • Neubauer kamera Blaubrand (Sigma–Aldrich)

2.3. Tyrimo metodikos

2.3.1. Ląstelių kultivavimas

Ląstelių atšildymas. Ląstelės yra atšildomos kambario temperatūroje, maišant suspensiją su ląstelių mitybine terpe DMEM GlutaMAX, papildyta 1 proc. antibiotikų mišinio ir 10 proc. FBS. Suspensija pilama į 10 cm skersmens lėkštelę. Atšildytos ląstelės kultivuojamos inkubatoriuje, 37 °C

temperatūroje, 5 proc. CO2 atmosferoje. Po paros mitybinė terpė yra pakeičiama. Ląstelės auginamos ne

daugiau kaip iki dvidešimto persėjimo.

Ląstelių persėjimas. Ląstelės auginamos tol, kol padengia apie 70 proc. lėkštelės dugno paviršiaus. Tada nuo ląstelių nusiurbama mitybinė terpė, lėkštelė praplaunama PBS. Įpilamas 1 ml tripsino tirpalo, ląstelės laikomos inkubatoriuje, esant 37 °C temperatūrai ir 5 proc. CO2 atmosferai apie

5-8 minutes, kad atkibtų nuo lėkštelės dugno. Tuomet tripsinas neutralizuojamas 7 ml mitybinės terpės ir gauta ląstelių suspensija perkeliama į 15 ml centrifuginį mėgintuvėlį. Centrifuguojama 22°C temperatūroje 4 minutes, 1000 aps./min. greičiu. Supernatantas nupilamas, ląstelės suspenduojamos 2-3 ml mitybinės terpės. Esant poreikiui, jų kiekis skaičiuojamas naudojant Neubauer kamerą. 0,5-1 ml suspensijos perkeliama į 10 cm skersmens lėkštelę, įpilami 8 ml mitybinės terpės, auginama esant 37 °C temperatūrai ir 5 proc. CO2 atmosferai.

2.3.2. Poveikio ląstelių gyvybingumui nustatymas

Beta adrenoblokatorių poveikis žmogaus plaučių vėžio A549 ir H1299 ląstelių linijų gyvybingumui buvo nustatomas MTT metodu. Paruošta ląstelių suspensija praskiedžiama taip, kad 100

μl suspensijos būtų 3000 ląstelių. Tuomet į 96 šulinėlių plokštelės kiekvieną šulinėlį įpilama po 100 μl

suspensijos. Plokštelė 24 val. laikoma inkubatoriuje 37 °C temperatūroje, 5 proc. CO2 atmosferoje. Tada į

šulinėlius su ląstelėmis įpilami skirtingos koncentracijos tiriamųjų junginių tirpalai. Kiekvienos koncentracijos tirpalas pilamas į tris šulinėlius. Kaip teigiama kontrolė naudojama terpė be ląstelių, kaip neigiama – terpė su 0,5 proc. DMSO. Tokia pati DMSO koncentracija yra visuose šulinėliuose su tiriamaisiais tirpalais. Plokštelė laikoma inkubatoriuje 37 °C temperatūroje, 5 proc. CO2 atmosferoje.

Po 72 val. į kiekvieną šulinėlį įpilama 20 μl MTT reagento (5 mg/ml koncentracijos) ir inkubuojama 3 val. Vėliau skystis iš plokštelės nupilamas ir formazano kristalai yra tirpinami 100 μl DMSO. Gyvybingų ląstelių kiekis vertinamas naudojant spektrofotometrą, matuojant absorbciją 570 nm ir 630 nm bangos ilgiuose.

Išmatuotos absorbcijos vertės normalizuojamos nuo 0 iki 1, kur 0 atitinka neigiamą, 1 – teigiamą kontrolę. Gauti duomenys analizuojami Microsoft Office Excel 2007 programa, ir pagal Hill formulę nustatomos junginių efektyviosios koncentracijos, mažinančios 50 proc. ląstelių gyvybingumą (EC50).

2.3.3.

Poveikio ląstelių kamieniškumui nustatymas

Beta adrenoblokatorių poveikis ląstelių kamieniškumui nustatomas vertinant ląstelių gebėjimą sudaryti kolonijas. Plaučių vėžio A549 ir H1299 ląstelių linijų suspensijos paruošiamos taip, kad 1 ml mitybinės terpės būtų 100 ląstelių. Pagaminta suspensija išpilstoma po 1 ml į kiekvieną 12 šulinėlių plokštelės šulinėlį. Naudojamos jų koncentracijos, atitinkančios 10 ir 90 proc. MTT metodu nustatytos

EC50 vertės (betaksololio ir propranololio atveju) arba 10 ir 90 proc. nuo 500 µM koncentracijos (kitų beta adrenoblokatorių, kuriems nebuvo nustatytos EC50 vertės, atveju). Tyrimų metu DMSO

koncentracija visuose šulinėliuose yra 0,5 proc. Tuomet plokštelės su junginiais paveiktomis ląstelėmis inkubuojamos 37 °C temperatūroje, 5 proc. CO2 atmosferoje.

Po inkubacijos terpė su ląstelėmis nusiurbiama, praplaunama PBS du kartus. Ląstelės fiksuojamos 4 proc. paraformaldehido (PFA) tirpalu kambario temperatūroje 10-15 min ir du kartus plaplaunamos PBS. Kolonijos dažomos 0,1 proc. kristalinio violetinio vandeniniu tirpalu, 2 kartus praplaunamos dejonizuotu vandeniu ir džiovinamos.

Nudažytos kolonijos fotografuojamos G:Box (Syngene International Ltd) įranga, naudojant

Genesys programą. Junginių poveikis ląstelių kamieniškumui įvertinamas analizuojant kiekviename

šulinėlyje esančių kolonijų skaičių ir plotą procentinemis dalimis GeneTools programa. Šulinėliuose susidariusios kolonijos lyginamos su kontrole, kuri prilyginama 100 proc., atitinkamai apskaičiuojami tyrimų rezultatai.

2.3.4. Poveikio ląstelių sferoidams nustatymas

Sferoidų formavimui iš A549 ir H1299 ląstelių linijų buvo taikomas 3D Bioprinting metodas. 6 šulinėlių plokštelės šulinėlyje inkubuojamos nesmulkialąstelinio plaučių vėžio ląstelės (apie 250 000 ląstelių viename šulinėlyje). Praėjus parai po inkubacijos pradžios į kiekvieną šulinėlį įpilama po 30 μl nanodalelių NanoShuttle ir inkubuojama dar 8 val.

Ląstelės praplaunamos PBS, tripsinizuojamos ir gaminamos suspensijos mitybinėje terpėje DMEM GlutaMAX. Suspensijos paruošiamos ir išpilstomos į 96 šulinėlių labai mažo prilipimo plokšteles po 100 μl taip, kad kiekviename šulinėlyje būtų po 1000 nesmulkialąstelinio plaučių vėžio ląstelių. Plokštelė dedama ant magnetinės plokštelės ir inkubuojama 37 °C temperatūroje, 5 proc. CO2

atmosferoje.

Sferoidai iš H1299 ląstelių linijos susiformavo per 72 val. Tuomet sferoidai kiekviename šulinėlyje fotografuojami fazių konstrastiniu mikroskopu, naudojant 10× didinimo objektyvą. Mitybinė terpė kas ketvirtą dieną pakeičiama nauja terpe su skirtingomis beta adrenoblokatorių koncentracijomis.

Kaip neigiama kontrolė naudojama terpė su 0,5 proc. DMSO koncentracija, tokia pati DMSO koncentracijos buvo visuose šulinėliuose.

Beta adrenoblokatorių poveikis 3D kultūroms vertinamas pagal sferoidų skersmens pokytį, analizė atliekama naudojant ImageJ programą (Nacionalinis sveikatos institutas, JAV).

2.3.5 Vėžio ląstelių žūties būdo nustatymas

Nesmulkialąstelinio plaučių vėžio A549 ir H1299 ląstelių linijos sėjamos į 24 šulinėlių plokšteles taip, kad kiekviename šulinėlyje būtų 15000 ląstelių ir inkubuojama 37°C temperatūroje, 5 proc. CO2 atmosferoje 24 val.

Į šulinėlius su ląstelėmis pilami tiriamųjų junginių tirpalai. Naudojamos jų koncentracijos, atitinkančios 10 ir 90 proc. MTT metodu nustatytos EC50 vertės (betaksololio ir propranololio atveju)

arba 10 ir 90 proc. nuo 500 µM koncentracijos (kitų beta adrenoblokatorių, kuriems nebuvo nustatytos

EC50 vertės, atveju). Kiekvienos koncentracijos junginio tirpalas įpilamas į 3 lėkštelės šulinėlius.

Plokštelės su junginių tirpalais inkubuojamos 37 °C temperatūroje, 5 proc. CO2 atmosferoje 72 val.

Po 72 val. iš šulinėlių nusiurbiama terpė, ląstelės plaunamos PBS ir pilama po 500 μl šviežios terpės. Į kiekvieną šulinėlį įpilama po 3 μl 10 mg/ml Hoechst 33342 vandeninio tirpalo ir 1 μl 1 mg/ml koncentracijos propidžio jodido vandeninio tirpalo. Po 10 minučių ląstelės fotografuojamos fluorescentiniu mikroskopu, naudojant 10× didinimo objektyvą. Padaroma po penkias nuotraukos kiekvieno šulinėlio skirtingose vietose.

Rankiniu būdu nuotraukose apskaičiuojama procentinė apoptotinių ir nekrotinių ląstelių dalis nuo bendro ląstelių skaičiaus. Gyvybingos ląstelės yra mėlynos, nekrotinės ląstelės nusidažo raudonai, o apoptotinės ląstelės yra susitraukiusios ir jų branduolys švyti melsvai.

2.3.6 Statistinis duomenų įvertinimas

Duomenys apdoroti naudojant paketą “MS Excel 2010”, įvertinant mažiausiai trijų matavimų vidurkius ir santykinius standartinius nuokrypius. Vidurkių palyginimui buvo taikomas Student’o t kriterijus. Skirtumai laikomi statistiškai reikšmingais, kai reikšmingumo lygmuo p < 0,05.

3.

REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1. Beta adrenoblokatorių poveikis plaučių vėžio ląstelių gyvybingumui

Iš tirtų septynių beta adrenoblokatorių, aktyviausi buvo propranololis ir betaksololis. Didžiausiu antiproliferaciniu aktyvumu pasižymėjo propranololis (6 pav.). Nustatytos jo EC50 vertės

buvo atitinkamai 119,3 ± 12,7 µM ir 98,8 ± 10,3 µM A549 ir H1299 ląstelių linijose. Betaksololis slopino ląstelių gyvybingumą didesnėmis koncentracijomis (EC50 vertės A549 ir H1299 ląstelių linijose

buvo atitinkamai 251,3 ± 14,6 µM ir 252,2 ± 7,6 µM). Palyginus junginių poveikį tarp ląstelių linijų, nustatyta, jog propranololis stipriau slopino H1299 ląstelių gyvybingumą (p < 0,05), tuo tarpu betaksololis vienodai veikė abiejose ląstelių linijose (p > 0,05). Literatūros duomenimis, nesmulkialąstelinio plaučių vėžio ląstelių linijos, kurioms yra būdingos K-Ras geno mutacijos, pasižymi silpnesniu atsaku į neselektyvių beta adrenoblokatorių poveikį [41]. Tai paaiškina, kodėl neselektyvus propranololis stipriau slopino H1299 ląstelių gyvybingumą nei betaksololis. Abu junginiai pasižymi vienodu selektyvumu beta1 adrenoreceptoriams, taip pat jiems būdingas MSA. Stiprų poveikį ląstelių

gyvybingumui galima paaiškinti ir tuo, kad propranololis ir betaksololis yra lipofiliškiausi iš tyrimuose naudotų junginių.

6 pav. Propranololio ir betaksololio nustatytos EC50 vertės A549 ir H1299 ląstelių linijose; *pažymėti

statistiškai reikšmingi skirtumai tarp junginių poveikio ląstelių linijoms, p < 0,05, n = 3.

Kiti junginiai slopino ląstelių gyvybingumą tik 500 µM koncentracijomis (7 pav.). Stipriausiai A549 ląstelių gyvybingumą 500 µM koncentracija slopino selektyvus beta adrenoblokatorius esmololis, silpniausiai blokuojantis beta1 adrenoreceptorius iš visų tyrimuose naudotų junginių. Tuo tarpu

mažiausią poveikį A549 ląstelių gyvybingumui turėjo neselektyvus beta adrenoblokatorius pindololis, stipriausiai blokuojantis beta1 adrenoreceptorius ir pasižymintis VSA.

0 50 100 150 200 250 300 Propranololis Betaksololis EC 50 (µ M) A549 H1299

*

7 pav. Beta adrenoblokatorių poveikis A549 ir H1299 ląstelių gyvybingumui po 72 val. inkubacijos su 500 µM koncentracijos tirpalais; *pažymėti statistiškai reikšmingi skirtumai tarp tiriamųjų ir

kontrolinės grupių, p < 0,05, n = 3

Labiausiai H1299 ląstelių gyvybingumą slopino selektyvūs junginiai esmololis ir atenololis, taip pat neselektyvus junginys pindololis (p < 0,05).

Beta adrenoblokatorių poveikis vėžio ląstelių gyvybingumui taip pat buvo tiriamas kitų mokslininkų. Nustatyta propranololio EC50 vertė po 72 val. inkubacijos melanomos ląstelių linijose

A375 ir P8, buvo atitinkamai 77,30 ir 60,30 μM [103]. Tokius skirtumus tarp EC50 verčių galėjo nulemti

tai, jog melanomos ir plaučių vėžio ląstelėms yra būdinga skirtinga beta adrenoreceptorių ekspresija. Kiti mokslininkai nustatė, kad propranololio poveikis mielomos ląstelių U266 gyvybingumui yra priklausomas nuo laiko ir koncentracijos, jų nustatytos EC50 vertės panašios, kaip ir šiame tyrime [104].

Be to, manoma, jog neselektyvūs, beta1 ir beta2 adrenerginius receptorius veikiantys beta

adrenoblokatoriai pasižymi stipresniu poveikiu vėžio ląstelių gyvybingumui, lyginant su selektyviais junginiais [105]. Tokia tendencija nustatyta, atliekant selektyvių ir neselektyvių beta adrenoblokatorių tyrimą krūties MCF-7, gaubtinės žarnos HT-29 ir kepenų HepG2 ląstelių kultūrose. Minėtame tyrime atenololis buvo nuo 7 iki 50 kartų mažiau aktyvus nei propranololis. Šiame tyrime plaučių vėžio ląstelėse nustatyta panaši tendencija abiejų junginių atveju, tačiau ji nepasitvirtino, įvertinus kitų junginių poveikį gyvybingumui. Vienas iš aktyviausių junginių – betaksololis – yra selektyvus beta adrenoblokatorius, tuo tarpu propranololiui nėra būdingas selektyvumas beta adrenoreceptoriams.

Apibendrinant gautus rezultatus galima teigti, kad beta adrenoblokatorių poveikis nesmulkialąstelinio plaučių vėžio ląstelių H1299 ir A549 gyvybingumui nėra susijęs su jų selektyvumu beta adrenoreceptoriams. Labiausiai vėžinių ląstelių gyvybingumą slopina propranololis ir betaksololis.

0 20 40 60 80 100

Timololis Metoprololis Pindololis Esmololis Atenololis

Lą steli ų gy vy b in gu m as (p ro c.) A549 H1299

*

*

_{* *}

*

*

*

*

*

*

3.2. Beta adrenoblokatorių poveikis plaučių vėžio ląstelių kamieniškumui

Siekiant įvertinti beta adrenoblokatorių poveikį vėžinių ląstelių kamieniškumui, buvo atliktas ląstelių kolonijų formavimo tyrimas, kurio metu buvo nustatyta, ar tam tikromis koncentracijomis junginiai slopina besiformuojančių kolonijų kiekį bei plotą.

Kaip ir poveikio ląstelių gyvybingumui tyrimuose, abiejose ląstelių linijose propranololis ir selektyvus betaksololis pasižymėjo didžiausiu aktyvumu (8 pav.).

8 pav. A549 ir H1299 ląstelių kolonijos po inkubacijos su 90 proc. nuo EC50 koncentracijos

junginių tirpalais

Abu junginiai 90 proc. nuo EC50 vertės koncentracijomis pilnai slopino kolonijų formavimąsi

(p < 0,05) (9 pav.).

9 pav. Beta adrenoblokatorių 90 proc. nuo EC50 koncentracijos poveikis A549 ir H1299 ląstelių

kamieniškumui. A – ląstelių kolonijų skaičius B – ląstelių kolonijų plotas; *pažymėti statistiškai reikšmingi skirtumai tarp tiriamųjų ir kontrolinės grupių, p < 0,05, n = 3.

0 20 40 60 80 100 Kolo n ijų ska iči u s (p ro c.) A549 H1299 0 20 40 60 80 100 Kolo n ijų p lot as (p ro c.) A549 H1299

A

B

Šiek tiek silpniau nei propranololis ir betaksololis, A549 ląstelių kolonijų skaičių ir plotą mažino 90 proc. nuo EC50 vertės koncentracijos metoprololis. Dar mažesniu, bet tarpusavyje panašiu

aktyvumu, pasižymėjo neselektyvūs beta adrenoblokatoriai timololis ir pindololis bei selektyvus – esmololis. Mažiausiai A549 ląstelių kolonijų formavimąsi slopino 90 proc. nuo EC50 vertės

koncentracijos selektyvus beta adrenoblokatorius atenololis (p > 0,05).

Panašios tendencijos nustatytos ir tiriant beta adrenoblokatorių poveikį H1299 ląstelių kamieniškumui. Visi junginiai, išskyrus atenololį, statistiškai reikšmingai mažino šių ląstelių kolonijų kiekį ir užimamą plotą (p < 0,05). Aktyviausi buvo esmololis ir metoprololis (p < 0,05).

Veikiant ląstelių linijas mažesnės koncentracijos (10 proc. nuo EC50 vertės) junginių tirpalais,

statistiškai reikšmingai A549 ląstelių kolonijų skaičių mažino tik betaksololis (10 pav. A), o pindololiu ir propranololiu paveiktos kolonijos buvo smulkesnės lyginant su kontrole (p < 0,05) (10 pav. B).

10 pav. Beta adrenoblokatorių 10 proc. nuo EC50 koncentracijos poveikis A549 ir H1299 ląstelių

kamieniškumui. A – ląstelių kolonijų skaičius B – ląstelių kolonijų plotas; *pažymėti statistiškai reikšmingi skirtumai tarp tiriamųjų ir kontrolinės grupių, p < 0,05, n = 3.

Nei vienas tirtas junginys 10 proc. nuo EC50 vertės koncentracija statistiškai reikšmingu

poveikiu H1299 ląstelių kolonijų formavimui nepasižymėjo: nemažino nei kolonijų skaičiaus, nei jų ploto (p > 0,05).

Beta adrenoblokatorių poveikis nesmulkialąstelinio plaučių vėžio kolonijų formavimui iki šiol buvo mažai tirtas. Min su kitais mokslininkais atskleidė, kad 10 μM koncentracijos propranololis ir atenololis slopina plaučių vėžio A549 ir H0CC-15 ląstelių, prieš tai paveiktų NNK, gebėjimą formuoti kolonijas [107]. Mūsų atliktuose tyrimuose propranololis panašia koncentracija (12 µM) taip pat turėjo įtakos suformuotų A549 kolonijų dydžiui, tačiau atenololis net 450 µM koncentracija nepasižymėjo statistiškai reikšmingu poveikiu kolonijų formavimui. Tą būtų galima paaiškinti tuo, kad skyrėsi kitų

0 20 40 60 80 100 Kolo n ijų ska iči u s (p ro c.) A549 H1299 0 20 40 60 80 100 Kolo n ijų p lot as (p ro c.) A549 H1299

A

B

mokslininkų naudojama metodika (jie kolonijas augino ant minkštojo agaro), bei ląstelių linijų skirtumais tarp skirtingų laboratorijų. Taip pat literatūroje yra duomenų, įrodančių, kad propranololis turi įtakos ir kitų vėžio rūšių ląstelių linijų kamieniškumui: kartu su radioterapija ar kinazių slopikliu sumatinibu mažina skrandžio vėžio ir melanomos ląstelių gebėjimą formuoti kolonijas [103,106].

Apibendrinant gautus duomenis, galima teigti, jog beta adrenoblokatorių poveikis nesmulkialąstelinio plaučių vėžio A549 ir H1299 ląstelių kamieniškumui yra priklausomas nuo koncentracijos. Abiejų ląstelių linijų kolonijų formavimąsi pilnai slopina 90 proc. nuo EC50 vertės

koncentracijos propranololis ir betaksololis. Tirtų beta adrenoblokatorių poveikis ląstelių kamieniškumui nepriklauso nuo jų selektyvumo adrenoreceptoriams.

3.3. Beta adrenoblokatorių sukeliamas ląstelių žūties būdas

Veikiant nesmulkialąstelinio plaučių vėžio A549 ir H1299 ląstelių linijas 10 ir 90 proc. nuo nustatytos EC50 vertės koncentracijos beta adrenoblokatorių tirpalais, įvertinta, kokiu būdu jie sukelia

šių ląstelių žūtį.

Visi tirti junginiai sukėlė A549 ląstelių apoptozę net ir mažesne naudota koncentracija (p < 0,05) (11 pav. A). Statistiškai reikšmingų skirtumų tarp 10 ir 90 proc. nuo nustatytos EC50 vertės

koncentracijų poveikio ląstelių apoptozei nenustatyta (p >0,05).

10 pav. Apoptotinių ląstelių kiekis po 72 val. inkubacijos su skirtingais beta adrenoblokatoriais. A – A549 ląstelių linijoje, B – H1299 ląstelių linijoje; *pažymėti statistiškai reikšmingi skirtumai tarp

tiriamųjų ir kontrolinės grupių, p < 0,05 0,0 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0 Ap o p to tin ių ląs teli ų s ka iči u s (p ro c.)

10 proc. EC50 90 proc. EC50

0 0,4 0,8 1,2 1,6 2 Ap o p to tin ių ląs teli ų s ka iči u s (p ro c.)

10 proc. EC50 90 proc. EC50

H1299 ląstelių apoptozės iš tirtų junginių nesukėlė tik atenololis abiem naudotomis koncentracijomis ir betaksololis mažesne koncentracija, lyginant su kontroline grupe (p > 0,05) (11 pav. B). Statistiškai reikšmingų skirtumų tarp beta adrenoblokatorių sukeliamos ląstelių žūties apoptozės būdu tarpusavyje nenustatyta nei vienoje ląstelių linijoje.

Beta adrenoblokatoriai labiau sukėlė H1299 nei A549 ląstelių nekrozę (12 pav.). Visi junginiai, išskyrus timololį, didesne naudota koncentracija statistiškai reikšmingai paskatino H2199 ląstelių žūtį nekrozės būdu, lyginant su kontrole (p < 0,05). Metoprololis, pindololis ir propranololis praktiškai nesukėlė A549 ląstelių nekrozės, taip pat šie junginiai mažesne naudota koncentracija neskatino ir H1299 ląstelių nekrozės (p > 0,05).

12 pav. Nekrotinių ląstelių kiekis po 72 val. inkubacijos su skirtingais beta adrenoblokatoriais. A - A549 ląstelių linijoje, B – H1299 ląstelių linijoje; *pažymėti statistiškai reikšmingi skirtumai tarp

tiriamųjų ir kontrolinės grupių, p < 0,05

Kiti mokslininkai taip pat nustatė, kad beta adrenoblokatoriai pasižymi apoptotiniu aktyvumu įvairiose vėžio ląstelių linijose. Labiausiai ištirti yra propranolis ir metoprololis, duomenų apie kitų šiame darbe aprašytų beta adrenoblokatorių sukeliamą žūties būdą nepavyko rasti. Taip pat nėra duomenų apie tirtų junginių nekrotinį aktyvumą.

Zhang ir kiti mokslininkai nustatė, kad 100 μM koncentracijos metoprololis nepasižymi apoptotiniu aktyvumu kasos vėžio ląstelių kultūrose [41]. Šiame tyrime metoprololis net 50 µM koncentracija skatino plaučių A549 ir H1299 ląstelių apoptozę. Tai galėtų būti paaiškinta skirtumais tarp ląstelių linijų, pvz. kitokia beta adrenoreceptorių ekspresija skirtingose linijose ar veikimo mechanizmu per kitus metabolinius kelius.

Kitų mokslininkų tyrime nustatyta, kad 50 μM koncentracijos propranololis nesukelia apoptozės skrandžio adenokarcinomos BGC-823 ir SGC-7901 ląstelių linijose, tačiau derinyje su

0 0,4 0,8 1,2 1,6 2 N ekr o tin ių lą steli ų s ka iči u s (p ro c.)

10 proc. EC50 90 proc. EC50

0 0,4 0,8 1,2 1,6 2 N ekr o tin ių lą steli ų s ka iči u s (p ro c.)

10 proc. EC50 90 proc. EC50

radioterapija ženkliai paskatina apoptozę po 48 val. inkubacijos [106]. Šiame tyrime abiejų plaučių vėžio ląstelių linijų apoptozę skatino net ir 12 µM koncentracijos propranololis, tačiau šios ląstelės buvo inkubuojamos su tiriamaisiais junginiais 72 val., ir gali būti, kad apototinis poveikis pasireiškė po ilgesnio laiko.

Siekiant įvertinti beta2 adrenerginių receptorių vaidmenį ląstelių žūties būdui, buvo lyginamas

beta2 selektyvaus adrenoblokatoriaus butoksamino, neselektyvaus propranololio ir selektyvaus beta1

receptoriams metoprololio poveikis kasos vėžio ląstelėms [67]. Mažiausiai apoptozę sukėlė selektyvus junginys metoprololis, labiausiai – butoksaminas. Remiantis šio tyrimo rezultatais, būtų galima manyti, kad apoptotiniam beta adrenoblokatorių aktyvumui svarbus antagonistinis poveikis į beta2

adrenoreceptorius. Verta pastebėti, kad Zhang ir kitų mokslininkų eksperimentuose buvo naudota tik po vieną junginį, kuriam būdingas skirtingas selektyvumas. Mūsų tyrime, plaučių vėžio ląstelėse buvo tiriama daugiau ir skirtingo selektyvumo junginių, tačiau statistiškai reikšmingi skirtumai tarp jų grupių nebuvo nustatyti. Tačiau abiems nesmulkialąstelinio plaučių vėžio ląstelių linijoms, naudotoms šiame tyrime, yra būdingos K-Ras geno mutacijos, nulemiančios silpnesnį atsaką į neselektyvius beta adrenoblokatorius [41]. Be to, buvo naudojamos skirtingos junginių koncentracijos. Todėl daryti vienareikšmiškos išvados negalima. Gali būti, kad junginių selektyvumas gali būti svarbus nebūtinai visoms, bet tik tam tikroms ląstelių linijoms.

Apibendrinant galima teigti, kad dauguma beta adrenoblokatorių sukelia plaučių vėžio A549 ir H1299 ląstelių apoptozę ir nekrozę. Daugiau A549 ląstelių žūsta apoptozės būdu nei nekrozės, tuo tarpu H1299 ląstelėse šie junginiai sukelia ląstelių žūtį abiem būdais.

3.4. Beta adrenoblokatorių poveikis ląstelių sferoidams

3D ląstelių kultūros labiau atkartoja naviko savybes in vivo nei monosluoksniu auginamos ląstelės, todėl buvo nuspręsta nustatyti beta adrenoblokatorių priešvėžinį aktyvumą sferoiduose.

A549 ląstelių sferoidų suformuoti nepavyko. Galimai tai nulėmė ilgas ląstelių kultivavimo laikas [109]. H1299 ląstelės sferoidus suformavo po 3 dienų (13 pav.). Gautų sferoidų skersmuo buvo 165 ± 44 µm.

13 pav. H1299 ląstelių sferoidai eksperimento pradžioje ir po inkubacijos su 90 proc. nuo EC50

koncentracijos junginių tirpalais

Sferoidų augimą mažino tik 90 proc. nuo EC50 koncentracijos betaksololis, esmololis ir

propranololis, tačiau statistiškai reikšmingi skirtumai nenustatyti, lyginant su kontroline grupe (p > 0,05) (14 pav.). Verta pastebėti, kad betaksololis ir propranololis taip pat labiausiai slopino ir H1299 ląstelių gyvybingumą.

14 pav. 90 proc. nuo EC50 koncentracijos beta adrenoblokatorių poveikis H1299 ląstelių sferoidų

augimui; n = 8 40 60 80 100 120 140 160 180 0 2 4 6 8 10 Sf ero id ų ske rsm u o (pr o c.) Laikas (dienos) Kontrolė Atenololis Betaksololis Esmololis Metoprololis Pindololis Propranololis Timololis

Nei vienas tirtas beta adrenoblokatorius 10 proc. nuo EC50 koncentracija neslopino sferoidų

augimo, lyginant su kontrole (15 pav.).

15 pav. 10 proc. nuo EC50 koncentracijos beta adrenoblokatorių sukeltas poveikis H1299 ląstelių

sferoidams

Galimai tokių junginių poveikį nulėmė tam tikri struktūriniai skirtumai tarp 2D ir 3D ląstelių kultūrų. Monosluoksniu auginamos ląstelės ir sferoidai tarpusavyje skiriasi receptorių ekspresija. H1299 ir A549 ląstelių sferoiduose yra nustatytas ženkliai mažesnis VEGF receptorių tankis, tačiau stipresnis jų fosforilinimas, lyginant su monosluoksniu auginamomis ląstelėmis [110]. Manoma, kad priešvėžiniu aktyvumu pasižymintys vaistai stipriau slopina 2D kultūrų proliferaciją [111,112]. Kadangi 3D kultūrose ląstelės yra sukibusios, tarpusavyje sudarančios ląstelės-ląstelės ryšį, labiau atkartojama junginio skvarba in vivo sąlygomis, susidaro koncentracijos gradientas. Tuo tarpu junginių poveikis monosluoksniu augančioms ląstelėms yra tolygus.

Apibendrinant gautus rezultatus, galima teigti, kad beta adrenoblokatoriai 90 proc. nuo jų EC50

koncentracijos neslopina plaučių vėžio H1299 sferoidų augimo. Gauti rezultatai rodo, kad junginių priešvėžiniam aktyvumui 3D kultūrose pasiekti reikia naudoti didesnės koncentracijos nei ląstelių gyvybingumo 2D kultūrose tyrimuose.

40 60 80 100 120 140 160 180 0 2 4 6 8 10 Sf ero id ų s kers m u o (p ro c. ) Laikas (dienos) Kontrolė Atenololis Betaksololis Esmololis Metoprololis Pindololis Propranololis Timololis