LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
Mantas Trimantas
Natrio valproato poveikis čiobrialiaukei ir plaučių
navikų progresavimui
Sodium valproate effect on thymus gland and cancer
of lungs progress
Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovas: Prof. Dr. Paulius Matusevičius
2
DARBAS ATLIKTAS GYVŪNŲ VEISIMO IR MITYBOS KATEDROJE PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Natrio valproato poveikis čiobrialiaukei ir plaučių navikų progresavimui“.
1. Yra atliktas mano paties/pačios;
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje;
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą panaudotos literatūros sąrašą.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADOS DĖL DARBO GYNIMO
(data) (darbo vadovo vardas,
pavardė)
(parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE/KLINIKOJE
(aprobacijos data) (katedros/klinikos vedėjo/jos
vardas, pavardė)
(parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentas
(vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
(data) (gynimo komisijos sekretorės (–riaus) vardas,
pavardė)
(parašas)
Magistro baigiamasis darbas yra įdėtas į ETD IS
3 TURINYS SUMMARY ... 5 SANTRAUKA ... 6 SANTRUMPOS ... 7 1. ĮVADAS ... 8 2. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10
2.1 NaVP – HDAC inhibitorius ... 10
2.2 NaVP poveikis įvairioms navikinių ląstelių kultūroms... 11
2.2.1 NaVP poveikis gliomos ląstelėms ... 11
2.2.2 NaVP poveikis neuroblastomos ląstelėms ... 11
2.2.3 NaVP poveikis krūties vėžio ląstelėms ... 12
2.2.4 NaVP poveikis gaubtinės žarnos navikinėms ląstelėms ... 12
2.2.5 NaVP poveikis prostatos navikinėms ląstelėms ... 13
2.2.6 NaVP poveikis gimdos kaklelio navikinėms ląstelėms ... 13
2.2.7 NaVP poveikis gimdos gleivinės (endometriumo) navikinėms ląstelėms ... 13
2.2.8 NaVP poveikis neuroektodermos navikinėms ląstelėms ... 14
2.2.9 NaVP poveikis melanomos ląstelėms ... 14
2.2.10 NaVP poveikis kiaušidžių navikinėms ląstelėms ... 14
2.2.11 NaVP poveikis teratokarcinomos ląstelėms... 15
2.2.12 NaVP poveikis meduloblastomos ląstelėms ... 15
2.2.13 NaVP poveikis krūtinės ląstoje esantiems augliams (plaučių, stemplės) ... 15
2.2.14 NaVP poveikis šlapimo pūslės navikinėms ląstelėms ... 15
2.2.15 NaVP poveikis karcinoidiniams dariniams ... 16
4
2.3 NaVP įtaka K+ ir Cl- jonų apytakai ... 16
2.4 Šalutiniai NaVP poveikiai ... 17
3. MEDŽIAGOS IR METODAI ... 21
3.1 Plaučių navikų progresavimo tyrimas ... 22
3.2 Čiobrialiaukės tyrimas... 23
3.3 Pelių ir žiurkių orchiektomijos atlikimo technika ... 24
3.4 Žiurkių ir pelių ovariohisterektomijos atlikimo technika ... 24
3.5 Duomenų statistinė analizė... 25
4. REZULTATAI ... 26
4.1 NaVP poveikio abiejų lyčių Wistar žiurkių čiobrialiaukei analizė ... 26
4.2 NaVP poveikio BALB/c linijos pelių navikų progresavimui analizė ... 29
5. REZULTATŲ APTARIMAS... 33
6. IŠVADOS ... 35
5
SUMMARY
The main goal of this research was to analyze NaVP effect on thymus gland and on cancer of lungs.
Research methodology. The study of lungs tumors progression was performed for 6 months
with 48 BALB /c mice. 24 mice were castrated (12 male) and sterilized (12 females). In this research NaVP and urethane were used. Thymus gland studies were carried out using NaVP with 24 rats of Wistar population, analogically both genders of the rats were selected: males which were castrated, and non–pregnant females which did not have offspring’s.
Results and conclusions of research. Our study has shown that the weight of thymus gland
decreased in control of both Wistar rats genders when affected with NaVP (0,07 g in females and 0,09 g in males (p > 0,05)). A statistically significant decrease of thymus gland was observed in castrated male rats which were affected with NaVP (decreased by 0,38 g ( p < 0,05), but in sterilized female rats statistically increase of thymus gland weight was observed (increase by 0,02 g ( p > 0,05)). Also, in this research was analyzed that NaVP with urethane sinergeticaly determines differences in development of lung tumors of BALB/c mice which are related to gender, castration and sterilization. NaVP promotes growth and progress of lung tumors in mice which were affected with urethane. The number of tumors increased by 2,12 times in non– castrated male rats and in castrated male rats by 1,75 times. For sterilized and non–sterilized female rats the number of tumors increased by 1,08 and 2,15 times. However, these differences are not statistically reliable (p > 0,05).
6
SANTRAUKA
Šio tyrimo tikslas buvo išanalizuoti NaVP poveikį čiobrialiaukei ir plaučių navikų progresavimui.
Tyrimo metodika. Plaučių navikų progresavimo tyrimas buvo vykdomas 6 mėnesius su 48
BALB/c linijos pelėmis. 24 pelės buvo kastruojamos (12 patinėlių) ir sterilizuojamos (12 patelių). Tyrime buvo naudojamas NaVP bei uretanas. Čiobrialiaukės tyrimai buvo atliekami naudojant NaVP su 24 Wistar populiacijos žiurkėmis, analogų principu atrenkant abiejų lyčių žiurkes: patinėliai ir neturėjusios palikuonių bei neapvaisintos patelės, taip pat, analogiškai – kastruotos ir sterelizuotos žiurkės.
Tyrimo rezultatai ir išvados. Mūsų atlikti tyrimai parodė, kad intaktinių, abiejų lyčių, Wistar
veislės žiurkes paveikiant NaVP, abiejų lyčių žiurkių čiobrialiaukės masė tendencingai sumažėjo patelėms 0,07 g ir atitinkamai patinėliams – 0,09 g (p > 0,05). Kastruotų žiurkių patinėlių, kurie buvo paveikti NaVP, čiobrialiaukės masė statistiškai patikimai sumažėjo 0,38 g (p < 0,05), o sterilizuotų patelių tendencingai padidėjo 0,02 g (p > 0,05). Taip pat, tyrime buvo išanalizuota, kad NaVP kartu su uretanu sinergistiškai lemia su lytimi, kastracija ir sterilizacija susijusius skirtumus BALB/c pelių plaučių navikų raidai. NaVP skatina pelių, paveiktų uretanu, plaučių navikų atsiradimą ir progresavimą: padidėjęs navikų skaičius nustatytas nekastruotiems patinams 2,12 karto, kastruotiems 1,75 – karto, o sterilizuotoms ir nesterilizuotoms patelėms – atitinkamai 1,08 ir 2,15 karto išaugęs navikų skaičius. Tačiau šie skirtumai yra statistiškai nepatikimi (p > 0,05).
7
SANTRUMPOS
Akt – proteinkinazė B
APC –storųjų žarnų adenomatozinė polipozė CP – ciklofosfamidas
DNR – dezoksiribonukleino rūgštis GABA – gama amino sviesto rūgštis HDAC – histonų deacetilazė
HER2 – žmonių epidermio navikinių ląstelių augimo faktorius IFN–alfa – interferonas alfa
NaVP – natrio valproatas
8
1. ĮVADAS
Biomedicininiuose tyrimuose, tokiuose kaip eksperimentinė onkologija, moduliacinio poveikio kancerogenezei tirti yra naudojmi laboratoriniai gyvūnai – dažniausiai įvairių veislių pelės bei žiurkės. Tokie tyrimo modeliai yra labai naudingi ir padeda per palyginti trumpą laiką išaiškinti, kokią įtaką daro tiriamosios medžiagos gyvam organizmui. Taip pat bandymai su laboratoriniais gyvūnais padeda lengviau tirti įvairius navikų atsiradimo mechanizmus, nes tyrimo metu naudojant peles ir žiurkes galima ilgiau išlaikyti piktybinį naviką, taip pat, perkelti navikines ląsteles iš vieno gyvūno kitam. Eksperimentiniai tyrimai svarbūs teoriškai ir praktiškai, nes gali nušviesti kai kuriuos kancerogenezės mechanizmo aspektus.
Pastaraisiais 4–iais dešimtmečiais NaVP plačiai vartojamas epilepsijos, migrenos, bipolinio sutrikimo, lėtinės neuralgijos gydymui (Johannessen C., Johannessen S., 2003). Tyrinėjant NaVP poveikį ląstelių proliferacijai, nustatyta, kad NaVP priklauso HDAC inhibitoriams. Farmakologinis HDAC slopinimas sukelia vėžinių ląstelių diferenciacijos, proliferacijos slopinimą ir apoptozę. HDAC inhibitoriai gali slopinti ne tik kancerogenezę, bet ir uždegiminius–imuninius sutrikimus, kurie lydi vėžio procesą, ar daryti įtaką jų ląstelinių procesų aktyvumui (Konstantinopoulos et al. 2007). Negalima paneigti, kad minėti mechanizmai yra susiję su NaVP poveikiu ar jonų transportu per ląstelių membraną, kuris svarbus tiriant NaVP antivėžinį poveikį.
Čiobrialiaukė vienas iš pagrindinių imuninės sistemos organų, kuriame bręsta ir proliferuoja limfocitai. Literatūroje yra mažai informacijos apie NaVP poveikį čiobrialiaukei. NaVP poveikio čiobriauliaukei išaiškinimas yra labai svarbus tiriant kancerogenezės mechanizmą, bei nustatant imuniteto pokyčius, kurie gali būti susiję su organizmo apsisaugojimu nuo neoplastinių ląstelių.
Literatūros duomenimis NaVP žiurkėms padidina Cl
-, Na+ išsiskyrimą su šlapimu, o šio poveikio skirtumai yra susiję su lytimi (Grikinienė et al. 2005; Jakutienė et al. 2007). NaVP lemdamas natrio ir chloro jonų išsiskyrimą per ląstelės membraną gali sąlygoti ląstelių tūrio sumažėjimą, kas gali lemti jų proliferacijos sulėtėjimą. Tai gali būti susiję taip pat ir su antineoplastiniu bei antiangiogeneziniu poveikiu. NaVP priešnavikinio veikimo mechanizmai tyrinėjami in vitro. Preliminarūs ikiklinikinių tyrimų rezultatai rodo, kad NaVP gali būti naudingas gydant piktybinius navikus. Tyrimai atlikti naudojant neuroektodermalinių navikų ląstelių, leukemijos, limfomos ląstelių linijas. Kita vertus, atlikti ilgalaikiai tyrimai su žiurkėmis
9 parodė, kad NaVP padidino poodinių fibrosarkomų formavimąsi tik žiurkių patinams, o tyrimuose su pelėmis padažnino gerybinių plaučių adenomų atsiradimą tik pelių patinams (McEvoy, 1991). Šių rezultatų svarba žmogui iki šiol nėra žinoma. Norėdami toliau tirti NaVP daromą poveikį koncerogenezei, mes iškėlėme darbo tikslus ir uždavinius.
Darbo tikslas: Išanalizuoti NaVP poveikį čiobrialiaukei ir plaučių navikų progresavimui. Darbo uždaviniai:
1. Ištirti NaVP poveikį Wistar veislės žiurkių čiobrialiaukės masei, bei nustatyti skirtumus susijusius su lytimi bei kastracija ir sterilizacija.
2. Ištirti NaVP poveikį BALB/c linijos pelių uretanu sukeltų plaučių navikų atsiradimui ir progresavimui, bei nustatyti skirtumus susijusius su lytimi bei kastracija ir sterilizacija.
10
2. LITERATŪROS APŽVALGA 2.1 NaVP – HDAC inhibitorius
Nuo 1970–ųjų metų NaVP pagrindinis panaudojimas medicinoje buvo skirtas epilepsijos gydymui. Taip pat NaVP parodė keletą papildomų biologinių veikimų, tokių kaip pagrindinį – teigiamą poveikį migrenos gydyme ir kaip šalutinį – neigiamą poveikį – vaisiaus apsigimimą bei kepenų pažeidimus, kurių pasekoje atsiranda nauji, skirtingi veikimo mechanizmai (Rettie et al., 1987; Loscher, 1999). Praktikoje atliktais tyrimais buvo nustatyta, kad vaisiaus apsigimimo mechanizmas visiškai skiriasi nuo antiepilepsinio veikimo, nes egzistuojantys NaVP junginiai gali pasižymėti teratogeniniu poveikiu (vaisiaus apsigimimas), kurį sukelia S–4–yn–NaVP arba antiepilepsiniu poveikiu, kurį sukelia valproamidas (Loscher, Nau, 1985; Nau et al., 1991; Radatz et al., 1998). Martin Gottlicher ir kt. (1992) atliktas tyrimas parodė, kad NaVP koncentracija 0,3 – 1,0 µmol naudojama 20 – 30 mg/kg dienos dozė epilepsijos gydyme, veikia kaip stiprus HDAC inhibitorius. Kol kas visi atlikti tyrimai su NaVP junginiais parodė, kad teratogeninis poveikis gali būti arba tiesioginiai (kaip ištirta šiame tyrime), arba netiesiogiai (PPARδ slopinamojo poveikio numalšinimas) susijęs su HDAC inhibitoriumi (Lampen et al., 1999). Tai patvirtina teiginį, kad normalus embrioninis vystimasis suardomas dėl NaVP, bet antiepilepsinis veikimas nėra priklausomas nuo HDAC inhibicijos. Nepaisant gerai aprašyto NaVP teratogeninio poveikio žmonėms, šis šalutinis poveikis gali veikti ir kai kurias pelių rūšis, ir, taip pat, priklauso nuo genetinių veiksnių (Nau et al., 1991; Faiella et al., 2000).
Seniai yra pripažinta, kad neoplastinės ląstelės atsiranda dėl pasikeitusių genų išraiškos, todėl buvo imtasi veiksmų siekiant ištaisyti šiuos genetinius pakitimus naudojant farmakologines manipuliacijas nukreiptas į epigenomą. Taip pat buvo dėta daug pastangų siekiant išvystyti HDAC inhibitorius. HDAC buvo identifikuotas kaip natūralus produktas (pvz.: trapoksinas), kuris lėmė vėžinių ląstelių diferenciaciją ir buvo naudojamas kaip priemonė išgauti HDAC1 iš ląstelių lizato. (Taunton et al., 1996) Vėliau ikiklinikiniai tyrimai parodė, kad HDAC gali turėti stiprų priešvėžinį poveikį ir demonstravo perspektyvų gydymo potencialą. (Bolden et al., 2006; Carey et al., 2006; Marchion et al., 2007). Nemažai mokslinių tyrimų atskleidė NaVP antinavikinį poveikį įvairių rūšių navikams.
11
2.2 NaVP poveikis įvairioms navikinių ląstelių kultūroms 2.2.1 NaVP poveikis gliomos ląstelėms
Iki 1985 metų, NaVP buvo naudojamas kaip vaistas slopinantis mitozės indeksą žiurkių gliomos G6 ląstelių linijose esant 0,5 µmol koncentracijai, kadangi ir toliau naudojama 1 µmol koncentacija parodė padidėjusį ląstelių skaičių ir adheziją (Regan, 1985). Svyruojant NaVP koncentracijai nuo 0,1 µmol iki 1 µmol yra sustabdoma proliferacija ir pelių C6 gliomos ląstelės, priklausomai nuo dozės dydžio. Įdomu tai, kad po 7 dienas trukusio inkubacinio periodo, kurio metu buvo naudojama 1 µmol NaVP dozė, gydomasis poveikis ląstelėse padidėja. Tačiau, kai toks pats gydymas yra pritaikomas žmonėms – gydomasis poveikis sumažėja visose ląstelių linijose (Knupfer et al., 1998). Esant 1 µmol NaVP dozei žymiai padidėja augimą slopinantis aktyvumas D54 gliomos ląstelės linijoje (Chavez–Blanco et al., 2006). Kitos gliomos ląstelių linijos taip pat yra slopinamos naudojant NaVP atskirai, arba kombinacijoje su citotoksinais, pavyzdžiui – etopozidu. Naudojant abiejų vaistų kombinaciją žymiai sustiprėjo etopozido citotoksiškumas visose ląstelių linijose. Galiausiai buvo pastebėtas reikšmingas kaspazės–3 aktyvumas. Taip pat, naudojant NaVP ir etopozidą kartu, buvo pastebėta apoptozė, kai naudojant vaistus po vieną atskirai, ne kombinuotame gydyme, šio poveikio nebuvo (Das et al., 2007).
2.2.2 NaVP poveikis neuroblastomos ląstelėms
NaVP slopina augimą ir skatina žmogaus neuroblastomos ląstelių diferenciaciją in
vitro esant koncentracijai, kuri buvo pritaikyta žmonėms be didesnių neigiamų pasėkmių. UKF
– NB – 2 ir UKF – NB – 3 NB ląstelių linijų gydymas su NaVP esant koncentracijai nuo 0,5 iki 2 µmol sąlygoja neuronų morfologinę diferenciaciją, kuri yra būdinga ląstelinių procesų pratęsimui be reikšmingo poveikio ląstelės gyvybingumui. NaVP gydytų ląstelių ultrastruktūriniai bruožai buvo suderinti su neuronų tipo diferenciacija ir yra susiję su N–myc onkoproteino poveikio sumažėjimu bei su padidėjusiu nervų ląstelių molekulės adhezijos poveikiu membranoje. Be to NaVP 0,5 µmol koncentracija padidina ląstelių jautrumą limfokinui, kuris sąlygoja visišką ląstelės suardymą (Cinatl et al., 1996). Šiose ląstelių linijose gydymas NaVP kooperuoja su IFN– alfa ir tai veda prie masyvaus ląstelių kaupimosi G0/G1 fazėje. NaVP ir IFN–alfa sąveika slopino UKF – NB – 3 ksenograftinių auglių augimą pelėse ir visiškai išgydė du iš šešių gyvūnus, kol pavienis gydymas NaVP vos slopino auglio augimą (Michaelis et al., 2004).
12
2.2.3 NaVP poveikis krūties vėžio ląstelėms
NaVP stipriai sumažina MCF – 7 krūties vėžio ląstelių augimo liniją, kurios koncentracija yra 0,23 µmol. Šis poveikis yra nepriklausomas nuo estrogenų receptorių (Olsen et al., 2004). NaVP kartu su retino rugštimis ir DNR metiltransferazės inhibitoriaus kombinacija veda prie tyliojo navikų slopinimo geno žmonių krūties vėžio ląstelėse bei slopina teigiamų ir neigiamų MCF–7 receptorių proliferaciją. Taip pat slopina MDA–231 ląsteles atskirai arba kartu su retino rūgštimi ir DNR metiltransferasės inhibitoriumi.(Mongan et al., 2005) NaVP stiprina tamoksifeno, raloksifeno, fulverstano ir letrolio poveikį krūties vėžio ląstelių linijose MCF–7, T47–D, ir ZR–75–1, išreikšdami estrogenų receptorių alfa. Be to, NaVP padidina antinavikinį tamoksifeno poveikį MCF–7 ląstelėse, kurios yra transfekuotos su HER2. Dėl kombinuoto gydymo NaVP ir tamoksifeno junginiu adenokarcinomos ląstelės yra labai slopinamos proliferacijos metu. Tačiau šis procesas priešingai veikia E2 ląsteles – kaip tamoksifeno agonistų veikla adenokarcenomos ląstelėse (Hodges–Gallagher et al., 2006).
2.2.4 NaVP poveikis gaubtinės žarnos navikinėms ląstelėms
NaVP buvo išbandytas gaubtinės žarnos navikinių ląsteliu linijoje HCA – 7, kurios turi laukinio tipo β–kateniną ir APC baltymus. Toks pats tyrimas buvo atliktas ir su SW620 ląstelėmis ir HT – 29 ląstelių linija, kurios yra APC mutantas. Nors NaVP skatina svarbų apoptozės lygį HCA – 7 ląstelėse, SW620 ir HT – 29 ląstelės, gydomos tokiomis pačiomis dozėmis, yra atsparios. Dirbtinė APC HT – 29 ląstelių išraiška įgija jautrumą dėl NaVP sukeltos apoptozės (Huang et al., 2006). Nepaisant to, po vėlesnės tų pačių ląstelių linijų gydymo NaVP ataskaitos buvo pastebėtas didelis slopinamojo poveikio augimas, esant koncentracijai tarp 1 ir 10 µmol. Toks poveikis yra dėl mitomicino C. Be to, NaVP sukelia inhibicijos augimą pirminėse, šviežiai išskirtose, gaubtinės žarnos ląstelėse ir sukelia mitomicino C poveikį keturioms iš jų (Friedmann et al., 2006). NaVP taip pat slopina ir kitas gaubtinės žarnos navikinių ląstelių linijas, tokias kaip SW80 ( Chavez–Blanco et al., 2006). NaVP malšina angiogeninius veiksnius VEGF ir FGF Caco–2 tipo ląstelėse, abiejuose, proteino ir transportinės DNR, lygiuose (Zgouras et al., 2004).
13
2.2.5 NaVP poveikis prostatos navikinėms ląstelėms
Prostatos navikinių ląstelių linijų LNCaP gydymas NaVP sukelia apoptozę, kuri yra susijusi pro–apoptotiniu faktoriumi kaspaze–3, taip pat su audinio inhibicija metaloproteinaze–3 ir į insuliną panašiu faktoriumi, kuris suriša baltymo augimą (Thelen et al., 2004). NaVP poveikio tyrimai parodė, kad po trijų dienų gydymo NaVP 1,2 – 5 µmol dozėmis, sumažina ląstelių išlikimo galimybę, mažina proliferaciją ir didina apoptozę. Tačiau nutraukus gydymą, išlikusios gyvybingos vėžinės ląstelės toliau auga. Priešingai, lėtinis gydymas (10 – 14 dienų) sukelia reikšmingą poveikį ląstelių proliferacijai ir kaspazės indukcijai. Šis navikinių ląstelių slopinimas taip pat stebimas ir ksenograftinėse nu/nu veislės vyriškos giminės pelėse, kurioms yra pašalinta čiobrialiaukė, bandymo metu naudojant nuo androgenų priklausomą ir nuo androgenų nepriklausomą prostatos vėžinių ląstelių liniją. Gyvūnus gydant NaVP buvo nustatytas statistiškai reikšmingas auglio apimties sumažėjimas lyginant su kontroline gyvūnų grupe. Rezultatai buvo akivaizdūs: 40proc., 60proc. ir 70proc. auglio apimties sumažėjimas skirtinguose ląstelių linijose. Atlikus pilnus kraujo tyrimus, papildomai tiriant alanino aminotransferazę ir aspartato aminotransferazę, buvo nustatyta, kad jokių skirtumų nėra tarp gydytų ir kontrolinės grupės pelių. (Xia et al., 2006).
2.2.6 NaVP poveikis gimdos kaklelio navikinėms ląstelėms
NaVP antivėžinis poveikis buvo išbandytas ir gimdos kaklelio vėžinių ląstelių linijose. Tyrimai parodė, kad NaVP (1 µmol koncentracijoje) ląstelėse padeda sumažinti navikus. Taip pat buvo nustatyta, kad NaVP padidina cisplastino, adriamicino arba gemcitabino toksiškumą, tai įrodo kintantis ląstelių gyvybingumo sumažėjimas HeLa tipo ląstelėse, kuris svyruoja nuo 0 proc. iki 37 proc. (Chavez–Blanco et al., 2006). Kiti HeLa tipo ląstelių tyrimai patvirtino, kad 24 valandų gydymas NaVP skatina vėžinių ląstelių žūtį. Šis NaVP modelis trukdo Akt deaktyvavimui ir apoptozinių ląstelių žūčiai per nuo kaspazės priklausomą būdą (Chen et al., 2006).
2.2.7 NaVP poveikis gimdos gleivinės (endometriumo) navikinėms ląstelėms
Biologinis ir gydomasis NaVP poveikis buvo tiriamas gimdos gleivinės (endometriumo) vėžinėse ląstelių linijose. Priklausomai nuo dozės NaVP slopina klonų proliferaciją visose gimdos gelivinės vėžinėse ląstelių linijose. Be to, NaVP dozei svyruojant nuo
14 1 iki 5 µmol padidėja apoptozė. Naviko slopinimas in vitro naudojant NaVP taip pat buvo pastebėtas ir atliekant lėtinius (5 savaičių trukmės) tyrimus in vivo. Šis lėtinis tyrimas parodė žymų slopinamąjį naviko apimties augimo poveikį ir slopinamąjį histologiškai būdingą nekrozės, fibrozės ir apoptozės poveikį (Takai et al., 2004). Lyginant su negydytomis ląstelėmis, NaVP gydytos ląstelės įgavo verpstės formos morfologiją ir parodė daugiau citoplazmos plėtinių (Hrzenjak et al., 2006).
2.2.8 NaVP poveikis neuroektodermos navikinėms ląstelėms
NaVP, atlikus tyrimus, parodė augantį slopinamą aktyvumą primitivioms neuroektodermos auglių ląstelėms. NaVP skatina šių auglių ląstelių augimo slopinimą, ląstelės ciklo sustabdymą, apoptozę, ląstelių senėjimą, diferenciaciją, slopina šių ląstelių kolonijų sudarymą. Rezultatai gauti atlikus tyrimus in vitro, panaudojus NaVP dozę nuo 0,6 iki 1 µmol (Li et al., 2005).
2.2.9 NaVP poveikis melanomos ląstelėms
Mokslininkų atliktų tyrimų duomenimis, NaVP sukėlė melanomos ląstelių apoptozę bei ląstelės ciklo sustabdymą. Panaudojus NaVP dozę 2,9 µmol pasiektas melonomos ląstelių auginimo sustojimas siekė 75 proc., tuo tarpu apoptozė buvo sukelta net 50 proc. melonomos ląstelių, kai NaVP buvo panaudotas vienas arba kombinuoto gydymo metu su kitais antinavikiniais vaistais (Valentini et al., 2007).
2.2.10 NaVP poveikis kiaušidžių navikinėms ląstelėms
NaVP demonstruoja taip pat augantį slopinamą aktyvumą kiaušidžių navikinėms ląstelėms. Panaudojus NaVP dozę 0,93 – 2,4 µmol stebimas 50 proc. ląstelių ciklo sustabdymas. Padidinus dozę iki 5 µmol, ląstelių apoptozė padidėjo nuo 26 proc. iki 49 proc. Tada tyrimai buvo pradėti su pelėmis, su ksenograftiniu naviko modeliu, naudojant NaVP. Tyrimas parodė teigiamus rezultatus – NaVP ženkliai sumažino naviko augimą. Navikų masė sumažėjo net 80 proc. Beveik 50 – 60 proc. navikinių ląstelių, jas veikiant NaVP, nekrozavo, o histologiniai tyrimai parodė navikinių ląstelių apoptozę (Takai et al., 2004).
15
2.2.11 NaVP poveikis teratokarcinomos ląstelėms
Tiriant NaVP teratogeninį poveikį ląstelių kultūroms, buvo pastebėtas NaVP slopinamasis poveikis teratokarcinomos ląstelių augimui ir ląstelėms sukeliamas citotoksinis efektas (Skladchikova et al., 1998).
2.2.12 NaVP poveikis meduloblastomos ląstelėms
NaVP poveikis taip pat stebimas ir meduloblastomos ląstelėms atliekant tyrimus in
vitro. Panaudojus NaVP dozę 0,6 – 1 µmol stebimas meduloblastomos ląstelių augimo
slopinimas, ląstelės ciklo sustabdymas, apoptozė, ląstelių senėjimas bei sumažėjęs auglio formavimasis. Įvertinimui buvo atliki tyrimai su imunodeficitinėmis pelėmis, kurioms buvo perkeltos meduloblastomos ląstelės. Pelėms į pilvo ertmę, 28 dienas iš eilės, buvo leidžiama NaVP (dozė 400 mg/kg). Bandymo metu buvo nustatytas ypatingai reikšmingas antinavikinis NaVP poveikis (Li et al., 2005).
2.2.13 NaVP poveikis krūtinės ląstoje esantiems augliams (plaučių, stemplės)
Panaudojant NaVP dozę nuo 3,2 – 5 µmol buvo pastebėtas, kad NaVP sukelia plaučių navikų kultūrinėms ląstelėms (H460 ir H433 tipui) augimo sustabdymą bei apoptozę. Taip pat, toks NaVP poveikis buvo pastebėtas ir stemplės navikinėms ląstelėms (T2 ir T12 tipui), piktybinėms pleuros mezoteliomos ląstelėms (H211 ir H513 tipui). Remiantis autorių atliktų bandymų rezultatais, NaVP (3,2 – 5 µmol) panaudojant kaip vieną medžiagą gydymui sukelia tik 20 proc. ląstelių apoptozę, tuo tarpu NaVP naudojant kombinuotame gydyme su kitais vaistais, apotozė sukeliama net 90 proc. ląstelių. Šis apoptotinis efektas yra susijęs su esminę 8, 9 ir 3 kaspazių aktyvaciją, kuri gali būti nuslopinta Bcl2 baltymų šeimos arba gydymo metu panaudojant kaspazės 9 inhibitorių (Ziauddin et al., 2006).
2.2.14 NaVP poveikis šlapimo pūslės navikinėms ląstelėms
Atliekant NaVP bandymus su šlapimo pūslės navikinėms ląstelėms, mokslininkai pastebėjo, kad panaudojus aktyvų gydymą (72h) NaVP, priklausomai nuo dozės, sukelia šlapimo pūslės navikinių ląstelių T24, TCCSUP, HT1376 augimo slopinimą. Lėtinio gydymo metu (34 paros), NaVP ženkliai sumažina T24 ksenograftinių navikinių ląstelių augimą (Chen et al., 2006).
16
2.2.15 NaVP poveikis karcinoidiniams dariniams
Karcinoidiniai dariniai yra neoplazmos navikai, kurie atsiranda iš neuroendokrininių virškinamojo trakto, plaučių ir kitų organų ląstelių. Mokslininkų tyrimai parodė, kad NaVP sustabdo karcinoidinių ląstelių augimą, sustabdydamą jų ląstelių augimo ciklą G1 fazėje. Be to, šis NaVP sukeltas ląstelių augimo sustabdymas buvo patvirtintas atliekant bandymus su pelėmis. Bandymo metu buvo panaudotas ksenograftinis modelis su karcinoidinių auglių ląstelėmis (Greenblatt et al., 2007).
2.2.16 NaVP poveikis fibrosarkomos ląstelėms
Sarkomos ksenograftiniame modelyje nu/nu pelėms taikomame gydyme, į kurį įėjo gydymas naudojant NaVP ir hidralazino kombinacija, DNR inhibitorius bei pridėtas adriamicinas, buvo pastebėtas poveikio skirtumas. Gyvūnams, kurie buvo gydyti adriamicinu su ar be NaVP ir hidralazinu, navikai išnyko po 21 dienos. Tačiau, gyvūnams kurie buvo gydyti tik adriamicinu, navikai iš karto atsinaujino, o gydymas NaVP ir hidralazino kombinacija sustabdė navikų atsinaujinimą. Šie rezultatai parodo, kad derinant šių vaistų kombinaciją, antinavikinis veiksmingumas buvo didesnis. Iš esmės, šis gydymas gali būti labai naudingas pacientams kurie buvo gydyti chiruginiu būdu, chemoterapija ir/arba radioterapija ir ligos likutinis kiekis yra labai mažas (Chavez–Blanco et al., 2006).
2.3 NaVP įtaka K+ ir Cl- jonų apytakai
Mokslininkai atliko bandymą, kurio tikslas buvo įvertinti kokį poveikį sukelia NaVP šlapime išskirtam K+ ir Cl
kiekiui. Bandymai buvo atlikti su Wistar veislės pelėmis. Buvo nustatyta, kad NaVP žiurkėms padidina Cl-, K+ išsiskyrimą su šlapimu, o šio poveikio skirtumai yra susiję su lytimi (Grikinienė et al., 2005).
GABA tipo A receptorius yra jonotropinis receptorius. Jo padaliniai sudaro funkcinį Cl- kanalą (Bureu et al., 1997; Fritschy et al., 1995). GABA (A) receptorių padaliniai pasireiškia Wistar pelių veislės inkstų proksimaliniuose ir tiesiuose kanalėliuose (Sarang et al., 2001). NaVP padeda greitai aktyvuoti GABA (A) receptorius smegenyse (Armijo et al., 2000). Cl- kanalai vaidina lemiamą vaidmenį nervų sistemos funkcionavime, keisdami ląstelėse tarpmembraninį potencialą (Yogeeswari et al., 2004). Cl
transportavimas per ląstelių membranas ir Cl -transportavimo stambiuose pelių raumenų ląstelėse, jautrumas vazopresinui yra su lytimi susiję
17 skirtumai (Stakišaitis et al., 1996). Viduląstelinis Cl- lygis ir Cl- transportavimo skirtumai gali būti svarbūs ląstelinių procesų reguliavimui ir gali padėti išreikšti tam tikrus funkcinius, skirtingų ląstelių skirtumus (Stakišaitis et al., 1996; Stakišaitis et al., 1998). Cl
yra svarbus viduląstelinio pH faktorius kuris yra susijęs su daugumos ląstelių funkcijų reguliavimu. Tyrimai parodė, kad K+
- Cl- bendra sąveika yra susijusi su ląstelių audinių tipais skirtingose gyvūnų rūšyse (Adragna et al., 2004). Weinsteinas, (1992) tirdamas Cl- jono transportavimą pelių proksimaliniuose kanalėliuose atrado, kad Cl- jono išskyrimas labiausiai susijęs su K+
– Cl- bendros sąveikos mechanizmu. Viduląstelinis Cl-
kiekis priklauso nuo K+ – Cl- bedros sąveikos mechanizmo ir nustato kaip neuronai atsako GABA receptoriams – ar depoliarizacijos, ar hiperpolirizacijos metu. Tačiau, K+
– Cl- bendros sąveikos priklausomumas chlorido homeostazei reguliuojant spontanišką neuronų veiklą per GABA receptorius iki galo nėra ištirtas. Tyrimų rezultatai rodo, kad K+ – Cl- bendra sąveika yra labiausiai susijusi su GABA(A) receptoriumi (Xu et al., 2006). Praktikoje nėra tyrimų duomenų apie K+
– Cl- bendrą sąveiką su GABA receptoriais, K+ homeostaze ar NAVP įtaka K+ ir Cl- transportavimui inkstuose.
2.4 Šalutiniai NaVP poveikiai
Praktikoje buvo atlikti keli klinikiniai tyrimai, kurie padėjo įvertinti antinavikinį poveikį įvairioms navikinių ląstelių grupėms naudojant HDAC inhibitorius su tradicinėmis antinavikinėmis medžiagomis(Duenas–Gonzalez et al., 2008; Rocca et al., 2009). Tačiau, vykdant šiuos tyrimus iškilo keletas klausimų, susijusių su nespecifine terapija: tiksli mechanizmo in vivo veikla ar atsparumas, mechanizmo toksiškumas ir minimali efektinė dozė (LeBaron et al., 2010; Moggs et al., 2004). Ciklofosfamidas yra imunosupresinis vaistas, kuris mažina uždegimą ir slopina imuninę sistemą. Jis veikia ląstelių dauginimasį, sutrikdant DNR gamybą. Ypatingai veikia kraujo, plaukų, virškinamojo trakto gleivinės ląsteles, kurios aktyviai dauginasi. Šio preparato pagrindinis panaudojimas yra skirtas vėžio gydymui. (Tripathi et al., 2008; Ahmed et al.,1984).
Atliekant tyrimus buvo pastebėta, kad NaVP galėtų veikti kaip HDAC inhibitorius ir gali padidinti histono pėdsakų acetilinimą. Padidėjęs histono acetilinimas daro įtaką chromatino dekondensacijai kuri priklauso nuo elektrostatinio krūvio sąveikos tarp histonų ir DNR slopinimo (Atmaca et al.,2007; Chateauvieux et al., 2010). NaVP sukelta chromatino dekondensacija gali sukelti padidėjusį DNR jautrumą nukleazei ir padidėjusį DNR ir
18 interkaliacinių medžiagų ryšį, taip didinant makromolekulių ir ksenobiotikų prieigą prie DNR ( Marchion et al., 2000). Taip pat, buvo pastebėta, kad NaVP sukeltas chromatino struktūrinių medžiagų moduliavimas yra nuo dozės ir laiko priklausomas reiškinys (Marchion et al., 2005). HDAC inhibitorius sukelia biologinių efektų masyvą vėžinėms ląstelėms, taip pat kaip ir įprastoms ląstelėms, ir palaiko ląstelių ciklo sustabdymą, ir sukeliamą apoptozę (Sawan et al., 2008). Be to, HDAC inhibitorius sukelia apoptozę per abu išorinius (mirties receptorius) ir vidinius (mitochondrinius) kelius (Carew et al.,2008). HDAC inhibitorius kartu su NaVP gali paveikti epigenomą ir pakeisti kartotinius ląstelių impulsų kelius, o tai rodo, kad HDAC inhibitorius su NaVP paveikia ksenobiotikų likimą ne tik gydymo metu, bet ir tolesniame gyvenime (Kostrouchova et al., 2007). Tai turi įtakos vaistų poveikiui ir toksiniam ksenobiotikų ir/arba vaistų efektui, nes ląstelėms būdingas epigenetinis kitimas gali sukelti skiriamąsias farmakodinamines, farmakokinetines ir toksines reakcijas įvairiuose audiniuose (Szyf, 2007). Naujausi duomenys rodo, kad epigenetinių modifikacijų subrendusioje spermoje pateiktas sąrašas gali atlikti svarbų vaidmenį embriono kitime, o epigeninio profilio pakitimai yra siejamis su žmonių nevaisingumu (Carrell, Hammoud, 2010; Godmann et al., 2009).
Turėdami tai omenyje, mokslininkai iškėlė hipotezę, kad naudojant šių vaistų kombinaciją jie gali pakeisti CP savybes, nesutrikdant DNR vientisumą ir epigenetinį mechanizmą. Todėl, kai HDAC inhibitorius bus naudojamas su citotoksiniais vaistais, toksinis poveikis gali būti perkeltas į audinius ir ląsteles specifiniu būdu. Taip pat, mokslininkai pamėgino įvertinti CP toksiškumą, kai jį veikia NaVP (HDAC inhibitorius). Šie tyrimai buvo atlikti siekant ištirti galimą NaVP poveikį prieš ir po gydymo, dėl CP sukeltų embrioninių ląstelių toksiškumo ir DNR pažeidimų (Khan, Jena, 2013).
Šiame tyrime mokslininkai ištyrė, kad gydymui naudojant CP ir NaVP 200 mg/kg ir 500 mg/kg dozėmis, šių vaistų kombinacija lemia statistiškai reikšmingą svorio kitimą, kurio nebuvo pastebėta gydant tik su CP. Šių vaistų kombinacija lėmė reikšmingą sėklidžių ir antsėklidžio svorio sumažėjimą, lyginant su sąntykiniu sėklidžių svoriu, kai gydymui buvo naudojamas tik CP. Svorio pakitimas galėjo būti sąlygojamas dėl citotoksinio medikamentų efekto. Taip pat, tolimesnis svorio kitimas pasireiškė dėl gydymo NaVP, kaip HDAC inhibitoriaus poveikio, kuris tolimesniame gydyme sustiprino citotoksinį CP vaisto poveikį. Taip pat buvo ištirta, kad sėklidžių ir antsėklidžio svorio sumažėjimas gali kisti dėl degeneracijos ir spermatogeninių ląstelių proliferacijos slopinimo. Histologinio tyrimo metu buvo nustatytas toks
19 pats, tiesioginis, citotoksinio medikamento poveikis lytinių ląstelių proliferacijai. Sėklidžių histologiniame pjūvyje padidejo vakuolizacija, sumažėjo spermatogonijų, spermatocidų ir spermatodidų skaičius kuris parodė, kad prieš gydymą naudotas NaVP turi daugiau toksinio efekto palyginus su po gydymo naudotu CP, kuris akivaizdžiai matomas, iš histologinių pjūvių struktūrinių pokyčių. Beveik visuose sėkliniuose kanalėliuose buvo atimtos spermatogenininės ląstelės ir ląstelių struktūros, kai prieš ir po gydymo buvo naudojamas CP ir NaVP, tačiau šis poveikis labai ryškus naudojant tik NaVP, lyginant su poveikiu naudojant tik CP (Khan, Jena, 2013).
Be to, prieš ir po gydymo naudojant CP ir NaVP yra sukeliama žymi lytinių ląstėlių degeneracija dėl kurios atsiranda spermos galvos morfologijos anomalijų bei mažėja spermatozoidų skaičius. Tačiau prieš gydymą naudotas NaVP skatina žymų spermatozoidų skaičiaus mažėjimą ir padidina anomalinius spemos galvos dažnius, lyginant su po gydymo naudotu NaVP ir CP poveikiu. Šie rezultatai gali būti patvirtinti matant kokios yra spermatogonojų ir spermatocitų patirtos žalos, taip pat sumažėja ir spermatogonezė, kuri veda prie žymiai sumažėjusio spermatozoidų skaičiaus ir padidėjusių spermatozoidų galvutės anomalijų. Šių mokslininkų ankstesni tyrimai taip pat rodo, kad NaVP, naudojamas didelėmis dozėmis, lėtiniame gydyme, savaime yra toksiškas reprodukcijai (Khan, Jena, 2013).
Tačiau ši galimybė gali būti atmesta dėl riboto NaVP naudojimo (tik šešios dozės kas antrą dieną) (Khan et al., 2011). Spermatozoidų galvutės morfologija leidžia apytiksliai įvertinti spermatozoidų funkcinį pajėgumą ir DNR kokybę (Sun et al., 2006). Tačiau spermos kometos testas pamatuoja spermoje esančią DNR žalą ir prideda informaciją apie spermos kokybę. Taip pat buvo pranešta, kad yra stipri koreliacija tarp spermatozoido kometos testo ir spermatozoidų galvutės morfologijos (Trivedi et al., 2010). Šių mokslininkų tyrime buvo ištirta, kad spermos kometos tyrimas astkleidžia CP ir NaVP potencialios žalos DNR. Spermos DNR padidėję pažeidimai dėl NaVP naudojimo prieš gydymą palyginus su po gydymui naudotu CP, gali būti sukelta dėl HDAC inhibitoriaus veiklos, kuri gali sukelti histonų hiperacetilinimą, kuris sukelia chromatino dekondensaciją ir padidėjusį DNR prieinamumą prie CP ir makromolekulių, kurie sustiprina CP veiklą DNR pažeidimui (Khan, Jena, 2013).
Dauguma praktikoje atliktų tyrimų duomenimis buvo pastebėta, kad HDAC inhibitorius sukelia ląstelių apoptozę auglių navikinėse ląstelėse (Takai et al., 2004; Das et al., 2007; Huang et al., 2006). Be to, spermatogenezės metu yra nustatyta keletas epigeninių
20 pakitimų – acetilinimas, metilinimas ir histono pakeitimas protaminu, kurie yra esminiai veiksniai sąlygojantys spermos savybes (Carrell, Hammoud, 2010; Barratt et al., 2010; Trasler,2009). Viena iš labiausiai tikėtinų priežasčių, toliau didėjančio CP toksiško poveikio lytinėms ląstelėms ir DNR pažeidimų, kai kombinuotame gydyme naudojamas NaVP, gali būti susijęs HDAC slopinimu, kuris sukelia histonų acetilinimą. Taip pat, tai gali sukelti genų ekspresiją ir chromatino dekondensaciją, kuri palengvina DNR pažeidimus sukeliamus CP (Marchion et al., 2005). Tikėtina, kad NaVP gali veikti toksiškai lytines ląsteles ir sukelti DNR pažeidimus dėl CP veiklos, kurios metu yra trukdoma įvairių baltymų acetilinimui, kurie dalyvauja histonų keitime protaminu. Šie veiksniai sąlygoja spermos savybes. HDAC inhibitoriaus naudojimas kartu su kitais antivėžiniais vaistais teikia daug vilčių navikų gydymo perspektyvoje ( Atmaca et al., 2007; Rocca et al., 2009).
21
3. MEDŽIAGOS IR METODAI
Tyrimai buvo atlikti Lietuvos sveikatos mokslų universitete su Wistar populiacijos žiurkėmis ir BALB/c linijos pelėmis. Žiurkės bei pelės buvo atvestos per vieną reprodukcijos ciklą, laikomos metabolinėse kamerose, šeriamos specialiu granuliuotu pašaru gyvūnams ad
libitum, girdytos vandentiekio vandeniu ad libitum, patalpos temperatūra palaikyta 22±1OC, drėgmė 60 proc., šviesos režimas 12/12 val.
Tyrimai buvo atliekami vykdant Lietuvos mokslo tarybos projektą „Valproato poveikis limfocitų chlorido koncentracijai, pH proliferacijai, navikų progresavimui“( Nr. MIP–12224, Projekto trukmė: 2012–01–01 iki 2014–12–31). Moksliniai tyrimai buvo atliekami laikantis Lietuvos Respublikos gyvūnų globos, laikymo ir naudojimo įstatymu (Žin., 1997, Nr. 108–2728), Europos konvencija dėl eksperimentiniais ir kitais mokslo tikslais naudojamų stuburinių gyvūnų apsaugos
(OL 2004 m. specialusis leidimas, 15 skyrius, 4 tomas, p. 325), 1986 m. lapkričio 24 d. Tarybos
direktyva 86/609/EEB dėl valstybių narių įstatymų ir kitų teisės aktų, susijusių su eksperimentiniais ir kitais mokslo tikslais naudojamų gyvūnų apsauga, suderinimo (OL 2004 m.
specialusis leidimas, 15 skyrius, 1 tomas, p. 292) su paskutiniais pakeitimais, padarytais 2003 m.
liepos 22 d. Europos Parlamento ir Tarybos direktyva 2003/65/EB (OL 2004 m. specialusis
leidimas, 15 skyrius, 7 tomas, p. 609), 2007 m. birželio 18 d. Komisijos rekomendacija
2007/526/EB dėl eksperimentiniais ir kitais mokslo tikslais naudojamų gyvūnų laikymo ir priežiūros gairių (OL 2007 L 197, p. 1), Europos Komisijos rekomendacijų dėl eksperimentinių gyvūnų eutanazijos 1 ir 2 dalimis, Valstybinės maisto ir veterinarijos tarnybos 2008 m. gruodžio 18 d. įsakymu Nr. B1–639 „Dėl Gyvūnų, skirtų eksperimentiniams ir kitiems mokslo tikslams, laikymo, priežiūros ir naudojimo reikalavimų patvirtinimo“, Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministro 1999 m. balandžio 12 d. įsakymu Nr.155 „Dėl Geros laboratorinės praktikos (GLP) taisyklių neklinikinių (eksperimentinių) laboratorijų tyrimams“ (Žin., 1999, Nr. 35–1053). Eksperimentinių gyvūnų lavonai buvo laikomi šaldiklyje. Vėliau jie buvo vežami tolimesniam utilizavimui į LSMU VA Patologijos centrą, o iš ten pagal paslaugų teikimo sutartį Nr. 163 į UAB „Rietavo veterinarinė sanitarija“.
22
3.1 Plaučių navikų progresavimo tyrimas
Vienu iš tinkamiausių modelių, tyrinėjant potencialius moduliacinius veiksnius, yra A linijos ir BALB/c pelių plaučių navikų eksperimentinis modelis. Šio modelio privalumas yra tas, kad daugybinius plaučių navikus lengva sukelti karbamatais (uretanu) ir kitais kancerogenais. Dažnai užtenka vienkartinės arba kelių dozių, o navikai išsivysto po trumpo laiko. Tai nėra brangus eksperimentinis modelis ir leidžia tyrinėti galimą moduliacinių veiksnių poveikį ir iniciacijos, ir promocijos metu, kas svarbu navikinio proceso raidai.
Tyrimas buvo vykdomas 6 mėnesius su 48 BALB/c linijos pelėmis. 24 pelės buvo kastruojamos (12 patinėlių) ir sterilizuojamos (12 patelių). Pelės buvo suskirstytos į grupes (1 lentelė).
Patinėlių kontrolinė grupė (n=3) Kastruotų patinėlių kontrolinė grupė (n=3) Patelių kontrolinė grupė (n=3) Sterilizuotų patelių kontrolinė grupė (n=3) Patinėlių grupė paveikta uretanu (n=3) Kastruotų patinėlių grupė paveikta uretanu
(n=3)
Patelių grupė paveikta uretanu (n=3) Sterilizuotų patelių grupė paveikta uretanu (n=3)
Patinėlių grupė paveikta uretanu ir NaVP (n=3) Kastruotų patinėlių grupė paveikta uretanu ir NaVP (n=3)
Patelių grupė paveikta uretanu ir NaVP (n=3) Sterilizuotų patelių grupė paveikta uretanu ir NaVP (n=3)
Patinėlių grupė paveikta NaVP (n=3) Kastruotų patinėlių grupė paveikta NaVP (n=3)
Patelių grupė paveikta NaVP (n=3) Sterilizuotų patelių grupė paveikta NaVP (n=3)
23 Viso eksperimento metu NaVP buvo skiriamas girdant 0,4 proc. vandeniniu NaVP tirpalu iki soties per os (jį pradedant skirti 2 savaites iki skiriant uretaną). Uretanas leidžiamas 10 mg/pelei intraperitonealiai, 2 kartus savaitėje (viso 5 kartai). Bandymo pabaigoje (po 6 mėn.) pelėms buvo atliekama stuburo slankstelių dislokacija. Tyrimo metu buvo atveriama pelių krūtinės ląsta, išpreparuojami plaučiai, stengiantis jų nepažeisti. Plaučiai buvo fiksuojami 10 proc. formalino tirpale 14 dienų. Po to atlikta tyrimo analizė. Pelių plaučiai įvertinti makroskopiškai: suskaičiuoti balkšvi mazgeliai, esantys plaučių paviršiuje.
3.2 Čiobrialiaukės tyrimas
Tyrimai buvo atliekami su 24 Wistar populiacijos žiurkėmis, analogų principu atrenkant abiejų lyčių žiurkes: patinėliai ir neturėjusios palikuonių bei neapvaisintos patelės. Tyrimo metu lygiagrečiai buvo tirtos kontrolinės ir tiriamųjų grupių abiejų lyčių žiurkės (intaktinės ir kastruotos bei sterilizuotos), kad būtų gauti kontroliniai duomenys žiurkėms, kurioms buvo skirtas NaVP. NaVP buvo skriamas nuo 3 savaitės po 300 mg/kg parai (10:00 val. ± 1 val., koncentracija 300 mg/ml distiliuoto vandens tirpalas) per zondą į skrandį 4 savaites. NaVP 300 mg/kg parai dozę pasirinkome remdamiesi kitų tyrėjų eksperimentiniais ikiklinikiniais tyrimais, kuriuose buvo tiriama žiurkių valproatų farmakodinamika ir efektyvumas.
Kontrolinių kastruotų patelių grupė (n=3) Patinėlių kontrolinė grupė (n=3) Kontrolinių kastruotų patinėlių grupė (n=3) Patelių kontrolinė grupė (n=3) Kontrolinė kastruotų patelių, paveiktų NaVP,
grupė (n=3)
Patinėlių paveiktų NaVP grupė (n=3)
Kontrolinė kastruotų patinėlių, paveiktų NaVP, grupė (n=3)
Patelių paveiktų NaVP grupė (n=3)
2 lentelė. Čiobrialiaukės tyrimo shema
Parinktas minimalus eksperimentinių gyvūnų kiekis, kuris leidžia optimaliai ir statistiškai įvertinti rezultatus, ir užtikrinti eksperimento patikimumą
24 Tyrimo pabaigoje žiurkės buvo pasvertos analitinėmis svarstyklėmis, paskui joms buvo atlikta eutanazija, naudojant izoliuotą kamerą, dujos CO2 70 proc. Čiobriauliaukė buvo išpreparuota, stengiantis jos nepažeisti ir maksimaliai pašalinti ją supantį jungiamąjį audinį. Vėliau buvo nustatoma čiobrialiaukės masė ją pasveriant analitinėmis svarstyklėmis.
3.3 Pelių ir žiurkių orchiektomijos atlikimo technika
Anestezuotas gyvūnas paguldomas ant nugaros. Paruošiamas operacijos laukas, nuskutant plaukus nuo pilvo, operacijos plotas dezinfekuojamas su 2 proc. jodo spiritiniu tirpalu, po to – 70 proc. spiritiniu tirpalu. Pelių orchiektomijos atveju atliekama kaudalinė laparotomija. Atliekamas 0,4–0,5 cm pjūvis odoje 0,5 cm kranialiau nuo išorinių lytinių organų, pasluoksniui perpjaunamas poodinis purusis jungiamasis audinys. Pilvo siena atveriama atliekant pjūvį per baltąją liniją (linea alba). Surandamos sėklidės, jos iškeliamos į žaizdos paviršių, abiems sėklidėms monofilamentiniu tirpiu 6–0 siūlu ligatūruojamas sėklinis virželis su kraujagyslėmis, uždedamas hemostatinis pincetas nuo ligatūros į sėklidės pusę ir atliekamas pjūvis tarp hemostatinio pinceto ir ligatūros. Pilvo siena užsiuvama mazginėmis siūlėmis naudojant monofilamentinį tirpų 6–0 (žiurkėms – 4–0) siūlą. Poodinis audinys siuvamas ištisine matracine siūle. Oda suklijuojama odos klijais. Po operacijos suleidžiama: NaCl 0,9 proc. injekcinis tirpalas po oda – 1 ml, antibiotikas Enrofloksacinas – 10 mg/kg po oda, skausmą malšinantis vaistas nuo uždegimo ketofenas 1 proc. – 5 mg/kg po oda (Olson M.E., Bruce J., 1986).
3.4 Žiurkių ir pelių ovariohisterektomijos atlikimo technika
Anestezuotas gyvūnas paguldomas ant nugaros. Paruošiamas operacijos laukas, nuskutant plaukus nuo pilvo, operacijos plotas dezinfekuojamas su 2 proc. jodo spiritiniu tirpalu, po to – 70 proc. spiritiniu tirpalu. Žiurkių ovariohisterektomijos atveju atliekama kranialinė laparotomija. Atliekamas 1,5 cm pjūvis odoje 1 cm kaudaliau nuo krūtinkaulio, pasluoksniui perpjaunamas poodinis purusis jungiamasis audinys. Pilvo siena atveriama atliekant pjūvį per baltąją liniją (linea alba). Surandami gimdos ragai ir kiaušidės. Kranialiau nuo kiaušidžių ligatūruojamos abiejų kiaušidžių kraujagyslės ir raiščiai, uždedamas hemostatinis pincetas tarp kiaušidės ir uždėtos ligatūros. Atliekamas pjūvis tarp uždėto hemostatinio pinceto ir ligatūros. Ligatūruojama gimda per gimdos kaklelį naudojant monofilamentinį tirpų 4–0 siūlą. Ant gimdos kūno uždedamas hemostatinis pincetas kranialiau nuo ligatūros. Tarp hemostatinio pinceto ir
25 ligatūros atliekamas pjūvis. Pilvo siena užsiuvama mazginėmis siūlėmis naudojant monofilametinį tirpų 4–0 siūlą. Poodinis audinys siuvama ištisine matracine siūle. Oda suklijuojama odos klijais. Po operacijos suleidžiama: NaCl 0,9 proc. injekcinis tirpalas po oda – 3–5 ml; antibiotikas Enrofloksacinas – 10 mg/kg po oda; skausmą malšinantis vaistas nuo uždegimo ketofenas 1 proc. – 5 mg/kg po oda (Olson M.E., Bruce J., 1986).
3.5 Duomenų statistinė analizė
Statistinė analizė atlikta SPSS statistinio paketo Nr. 15 versija (SPSS for Windows 9.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA, 1989–1995). Analizuojant duomenis, buvo atliekamas jų aprašymas naudojantis aprašomąja statistika. Duomenų statistinė analizė atlikta naudojant stjudento t – testą. Duomenys buvo laikomi statistiškai patikimi, kai p < 0,05.
26
4. REZULTATAI
4.1 NaVP poveikio abiejų lyčių Wistar žiurkių čiobrialiaukei analizė
Po sterilizacijos bei kastracijos praktikoje yra stebima kūno masės didėjimo tendencija. Didėjant kūno masei galimai gali didėti ir atskirų organų, tokių kaip čiobrialiaukė, masė. Mūsų darbe gyvūnai buvo sterilizuojami ir kastruojami, siekiant sustabdyti lytinių hormonų poveikį. Ši procedūra buvo atliekama gyvūnams pasiekus 20 ± 2 amžiaus dieną (prieš lytinį brendimą). Atlikti tyrimai parodė, kad patelių ir patinėlių čiobrialiaukės masės kontrolinėse grupėse buvo vienodos po 0,52 g, tačiau tai statistiškai nepatikima (p ˃ 0,05) (2 pav.). Po kastracijos patinėlių čiobrialiaukės masė buvo didesnė 0,22 g lyginant su sterilizuotomis patelėmis. Rodiklis taip pat buvo statistiškai nepatikimas (p > 0,05) (1 pav.). Kastruotų patinėlių čiobrialiaukės masė buvo didesnė 0,22 g lyginant su kontrolinės grupės patinėliais (1 ir 2 pav.) Skirtumas buvo statistiškai patikimas (p < 0,05). Skirtumo tarp čiobrialiaukės masių nepastebėta lyginant sterilizuotų patelių čiobrialiaukės mases su kontrolinės grupės patelių čiobrialiaukės masėmis. Abiejų grupių čiobrialiaukės masės buvo atitinkamai po 0,52 g (p > 0,05) (1 ir 2 pav.).
1 pav. Čiobrialiaukės ir žiurkių masės kastruotų/sterilizuotų žiurkių grupėse kitimo
dinamika 0,36 0,74 0,54 0,52 135,1 150,6 171,6 139 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 ♂ kastracija + NaVP ♂ kastracija ♀ sterilizacija + NaVP ♀ sterilizacija Ž iu rk ės m asė , g Čiob rial iau k ės m asė , g
27 NaVP dažniausiai yra naudojamas onkologijos srityje. Jo veikimas yra susijęs su imuninės sistemos funkcijų reguliavimu. Taip pat yra keliamos prielaidos, kad NaVP gali turėti įtakos ir čiobrialiaukės masei. Mūsų atlikti tyrimai parodė, kad paveiktų NaVP žiurkių patinėlių čiobrialiaukės masė buvo mažesnė 0,09 g nei kontrolinės grupės patinėlių, bet skirtumas buvo nepatikimas (p > 0,05) (2 pav.). Paveiktų NaVP patelių čiobrialiaukės masė buvo mažesnė 0,07 g palyginus su kontrolinės grupės patelėmis, bet šis skirtumas buvo nepatikimas (p > 0,05) (2 pav.). Lyginant kastruotų žiurkių patinėlių ir kastruotų bei paveiktų NaVP patinėlių čiobrialiaukės masę, pastebėtas žymus, statistiškai patikimas čiobrialiaukės masės sumažėjimas 0,38 g (p < 0,05) kastruotų bei paveiktų NaVP patinėlių grupėje (1 pav.). Sterilizuotų ir paveiktų NaVP patelių čiobrialiaukės masė buvo didesnė 0,02 g lyginant su sterilizuotų patelių grupe, bet šis masės skirtumas buvo statistiškai nepatikimas (p > 0,05) (1 pav.). Lyginant kastruotų ir paveiktų NaVP patinėlių bei sterilizuotų ir paveiktų NaVP patelių čiobrialiaukių mases, nustatyta, kad kastruotų ir paveiktų NaVP patinėlių čiobrialiaukės masė yra mažesnė 0,18 g (p > 0,05) (1 pav.).
2 pav. Čiobrialiaukės ir žiurkių masės kontrolinėse žiurkių grupėse kitimo dinamika 0,43 0,52 0,45 0,52 182,3 166,1 160,5 149,9 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 ♂ kontrolė + NaVP ♂ kontrolė ♀ kontrolė + NaVP ♀ kontrolė Ž iu rk ės m asė , g Čiob rial iau k ės m asė , g
28 NaVP darydamas poveikį gyvūno imuninėms funkcijoms, galimai gali daryti įtaką ir gyvūno masei. Kontrolinės grupės patinėlių masė buvo didesnė 15,5 g nei kastruotų patinėlių grupės, šis skirtumas buvo statistiškai nepatikimas (p > 0,05) (1 ir 2 pav.). Lyginant patinėlių kontrolinės grupės masę su paveiktų NaVP patinėlių mase, nustatyta 16,2 g didesnė patinėlių paveiktų NaVP masė (p < 0,05) (2 pav.). Lyginant kastruotų patinėlių masę su kastruotų ir paveiktų NaVP patinėlių mase, nustatyta, kad kastruotų patinėlių masė yra 15,5 g didesnė nei kastruotų ir paveiktų NaVP masė (p > 0,05) (1 pav.). Kontrolinės grupės patelių ir sterilizuotų patelių kūno masė atitinkamai buvo 149,9 g ir 139 g ir buvo nustatytas statistiškai nepatikimas masės sumažėjimas sterilizuotų patelių grupėje (p > 0,05) (1 ir 2 pav.). Lyginant patelių kontrolinės grupės masę su paveiktų NaVP patelių mase, nustatytas kūno masės padidėjimas 10,6 g NaVP paveiktų patelių grupėje (p > 0,05) (2 pav.). Lyginant sterilizuotų patelių masę su sterilizuotų ir paveiktų NaVP patelių mase, nustatytas aiškus skirtumas 32,6 g – sterilizuotų ir paveiktų NaVP patelių masė buvo didesnė (p < 0,05) (1 pav.).
Tiriant santykį tarp čiobrialiaukės ir žiurkės masių buvo pastebėtas statistinis ryšys tarp kintamųjų dydžių. Ištyrus koreliaciją tarp čiobrialiaukės masės ir žiurkės masės atskirose grupėse, nustatyta labai stipri, statistiškai patikima koreliacija tik sterilizuotų ir paveiktų NaVP patelių grupėje (p < 0,05). Kastruotų ir paveiktų NaVP patinėlių grupėje ši koreliacija buvo stipri, tačiau statistiškai nepatikima (p > 0,05). Taip pat stipri koreliacija pastebėta kontrolinėje patelių grupėje (p > 0,05) bei NaVP paveiktų patelių grupėje (p > 0,05). Sterilizuotų patelių grupėje nustatyta vidutinė koreliacija (p > 0,05). Kitose tirtose grupėse nustatytas silpnas arba labai silpnas statistiškai nepatikimas koreliacinis ryšys (p > 0,05) (3 pav.).
29 3 pav. Koreliacija tarp čiobrialiaukės masės ir žiurkės masės (Pastaba: * p < 0,05)
4.2 NaVP poveikio BALB/c linijos pelių navikų progresavimui analizė
Kadangi uretanas yra kancerogeninė medžiaga, plaučių navikai stebėti visų grupių gyvūnams (nepriklausomai nuo lyties), kurie buvo paveikti uretanu (5 pav.). Bet kastruotų patinų, paveiktų uretanu grupėje navikai buvo nustatyti tik 66,67 proc. pelių (5 pav.) Tyrimo metu nenustatyta plaučių navikų pelių grupėse, kuriose nebuvo naudotas uretanas (4 pav.). Palyginus navikų skaičių tenkančių patinams, kuriems buvo panaudotas tik uretanas, bei uretanas ir NaVP – navikų skaičius buvo rastas didesnis patinams, kuriems buvo panaudotas uretanas ir NaVP, atitinkamai 2,67 ir 5,67 navikai pelei (p > 0,05) (4 pav). Taip pat palyginus navikų skaičių tenkančių patelėms, kurioms buvo panaudotas tik uretanas, bei uretanas ir NaVP – navikų skaičius buvo rastas didesnis patelėms, kurioms buvo panaudotas uretanas ir NaVP, atitinkamai 2,33 ir 5 navikai pelei (p > 0,05) (4 pav). Lyginant kastruotus patinus paveiktus uretanu (1,33 navikai pelei) su kastruotais patinais paveiktais uretanu kartu su NaVP (2,33 navikai pelei) grupėse, nustatytas didesnis navikų skaičius kastruotų patinų grupėje, paveiktoje
-0,10 0,98 -0,38 0,94 0,60 0,49 1,00 * -0,71 -1,00 -0,50 0,00 0,50 1,00 ♂ kontrolė ♀ kontrolė ♂ NaVP ♀ NaVP ♀ sterilizuoti ♂ kastruoti ♀ sterilizuoti + NaVP ♂ kastruoti + NaVP Koreliacijos koeficientas
30 uretanu bei NaVP (p > 0,05) (4 pav.). Tačiau analogiškose patelių grupėse buvo nustatytas mažesnis navikų skaičius sterilizuotų patelių paveiktų uretanu bei NaVP grupėje nei sterilizuotų patelių paveiktų tik uretanu – atitinkamai 4 ir 4,33 navikai pelei (p > 0,05).
4 pav. Navikų skaičius, vnt/pelė
Lyginant kastruotų patinų, paveiktų uretanu bei NaVP, grupę su nekastruotų patinų atitinkamos grupės duomenimis, plaučių navikų skaičius buvo didesnis nekastruotų patinų grupėje, kuri buvo paveikta uretanu bei NaVP – atitinkamai 2,33 navikai pelei ir 5,67 navikai pelei (p > 0,05) (4 pav). Tačiau palyginus sterilizuotų patelių, paveiktų uretanu bei NaVP, grupę su nesterilizuotų patelių atitinkamos grupės duomenimis, plaučių navikų skaičius buvo nežymiai didesnis nesterilizuotų patelių grupėje, kuri buvo paveikta uretanu bei NaVP – atitinkamai 4 navikai pelei ir 5 navikai pelei (p > 0,05) (4 pav).
0 0 2,67 2,33 5,67 5 0 0 0 0 1,33 4,33 2,33 4 0 0 0 1 2 3 4 5 6 Navik ų sk aičiu s, vn t/p elė
31 5 pav. Pelių skaičius, vnt bei plaučių navikų pasireiškimas grupėse, proc.
Daugiausiai navikų buvo nustatyta patinėlių, paveiktų uretanu bei NaVP grupėje – net 20 proc. visų nustatytų navikų. Mažiausiai navikų buvo nustatyta kastruotų patinėlių, paveiktų uretanu grupėje – 5 proc. Abiejų lyčių kontrolinėse grupėse – navikų nebuvo nustatyta. Sterilizuotų patelių bei kastruotų patinėlių kontrolinėse grupėse, taip pat sterilizuotų patelių bei kastruotų patinėlių, paveiktų NaVP grupėse, bei abiejų lyčių kontrolinėse grupėse, paveiktose NaVP navikų nebuvo nustatyta. Sterilizuotų patelių, paveiktų uretanu, navikų skaičius buvo didesnis 2 proc. nei tokių pat patelių grupėje, paveiktoje uretanu kartu su NaVP. Tačiau
3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 0 0 100 100 100 100 0 0 0 0 66,67 100 100 100 0 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 P el ės su p lau čių n avik u , % P eli ų sk aičiu s gr u p ėje , vn t
32 kastruotų patinų, paveiktų uretanu, navikų skaičius buvo mažesnis 3 proc. nei kastruotų patinėlių, paveiktų uretanu bei NaVP grupėje. Nustatytas didelis, 10 proc. navikų skaičiaus skirtumas tarp nesterilizuotų patelių, paveiktų uretanu grupės ir nesterilizuotų patelių paveiktų uretanu bei NaVP grupės (6 pav.)
6 pav. Navikų skaičiaus pasiskirstymas grupėse, proc. ♂ kontrolė 0% ♀ kontrolė 0% ♂ uretanas 10% ♀ uretanas 8% ♂ uretanas + NaVP 20% ♀ uretanas + NaVP 18% ♂ NaVP 0% ♀ NaVP 0% ♂ kastr. kontrolė 0% ♀ steril. kontrolė 0% ♂ kastr. + uretanas 5% ♀ steril. + uretanas 16% ♂ kastr. + uretanas + NaVP 8% ♀ steril. + uretanas + NaVP 14% ♂ kastr. + NaVP 0% ♀ steril. + NaVP 0%
33
5. REZULTATŲ APTARIMAS
Daugelis autorių literatūroje yra aprašę lytinių hormonų poveikį čiobriauliaukei (Kato et al., 2011). M. Perišic ir kt. (2013) tyrė čiobrialiaukės masės padidėjimo sąsajas ir priklausomybę nuo lytinių hormonų ir nustatė, kad sterilizuotoms žiurkių patelėms čiobrialiaukės masė didėja lyginant su nesterilizuotomis patelėmis. Mūsų tyrimo duomenimis, čiobriauliaukės masė padidėjo tik kastruotiems patinėliams, lyginant su intaktine patinėlių grupe, o patelių čiobrialiaukės masė nepakito. Žiurkių patinėliams čiobrialiaukės masės padidėjimas buvo statistiškai patikimas. Nustatytas su lytimi susijęs čiobrialiaukės masės kitimas, lyginant kastruotų ir sterilizuotų žiurkių čiobrialiaukės masę su kastruotų bei sterilizuotų ir paveiktų NaVP gyvūnų čiobrialiaukės mase. Patinėlių čiobriauliaukės masė statistiškai patikimai sumažėjo grupėje, kuri buvo veikiama NaVP, o patelių priešingai – čiobrialiaukės masė padidėjo. Literatūroje yra duomenų apie NaVP imunomoduliacinį poveikį. T. Schneider ir kt. (2008) duomenimis, veikiant NaVP, sumažėja žiurkių naujagimių patinėlių čiobriauliaukės masė. Mūsų gauti duomenys parodė, kad NaVP skirtingai veikia čiobriauliaukę, priklausomai nuo lyties bei kastracijos ir sterilizacijos. Lyginant kontrolinių ir paveiktų NaVP žiurkių čiobrialiaukės mases, buvo stebima čiobriauliaukės masės sumažėjimo tendencija tiek vyriškos, tiek moteriškos lyties gyvūnams, tačiau statistiškai patikimo skirtumo nenustatyta. Tyrimų rezultatai atskleidė skirtingą NaVP poveikį kastruotų patinėlių bei sterilizuotų patelių čiobrialiaukės masei. Labai stiprus, statistiškai patikimas, koreliacinis ryšys tarp čiobrialiaukės masės bei žiurkės masės buvo nustatytas sterilizuotų ir paveiktų NaVP patelių grupėje. Koreliacija gali būti paaiškinama tuo, kad sustabdžius lytinių hormonų funkciją, čiobrialiaukė, augant gyvūnui, toliau proliferuoja, bet patelių čiobrialiaukės masės sumažėjimo NaVP nesukelia. Dauguma tyrimų apie imunomoduliacinį NaVP poveikį atlikta su cirkuliuojančiais kraujyje T limfocitais arba naudojant ląstelių kultūras. Mūsų tyrimai atlikti su žiurkėmis siekiant nustatyti NaVP poveikį čiobriauliaukei. Čiobrialiaukėje T limfocitų pirmtakai proliferuoja, subrendę T limfocitai per kraujagysles ir limfagysles patenka į periferinius imuninės sistemos organus (Kato, 1997). Čiobrialiaukės masės sumažėjimas gali būti siejamas su limfocitų skaičiaus sumažėjimu čiobrialiaukėje. Tuo galima paaiškinti kitų mokslininkų paskelbtus duomenis apie čiobrialiaukės masės sumažėjimą po NaVP poveikio (Dowdell, 2009).
34 Uretanas (kancerogenas) yra tabako dūmų komponentas, naudojamas plaučių navikų tyrimams (Pfeifer et al., 2002). Uretanas yra metabolizuojamas į vinilo karbamato epoksidą, to pasekoje pažeidžia plaučių ląsteles, vėliau atsiranda navikai (Forkert, 2010). F. Ninomiya ir kt. (2013) nustatė daugiau uretano sukeltų navikų A/J veislės patelių plaučiuose nei patinų. Mūsų tyrimo tikslas buvo įvertinti NaVP poveikį navikų atsiradimui ir progresavimui, ištirti skirtumus atsirandančius dėl lyties, kastracijos ir sterilizacijos. BALB/c veislės pelėms uretano poveikio metu išsivysto plaučių navikai, kuriuos galima naudoti tolimesniems tyrimams (Uleckienė et al., 2005, Piegari et al., 2011). Mūsų tyrimuose analizuoti navikai, kurie išsivystė nuo pirmos uretano injekcijos praėjus 24 savaičių trukmės laikotarpiui. Kitų autorių duomenimis, po 12 savaičių nuo pirmos kancerogeno injekcijos buvo nustatyti plaučių navikai (Regala et al., 2011). Autoriai tyrė uretano sukeltų navikų atsiradimo dinamiką A/J rūšies pelėms ir nustatė, kad testosteronas slopina kancerogenezę (Ninomiya et al., 2013). Tačiau mūsų tyrimų rezultatais nustatyta, kad vyriškos lyties BALB/c linijos kastruotiems patinėliams, paveiktiems uretanu, išsivystė mažiau plaučių navikų negu nekastruotiems patinėliams, paveiktiems uretanu. Sterilizuotoms patelėms, paveiktoms uretanu, nustatytas didesnis navikų skaičius nei nesterilizuotoms patelėms. Remiantis mūsų tyrimo rezultatais stebima tendencija, kad patelių lytiniai hormonai slopina kancerogenezę. Mokslinių tyrimų duomenimis, kancerogenezės mechanizmas yra skirtingas žiurkėms (Nakano et al., 2014) ir pelėms (Kreisel et al., 2012). Navikų skaičius BALB/c pelių plaučiuose rodo, kad naudotas NaVP ir uretanas veikia sinergistiškai ir sustiprina uretano poveikį navikų progresavimui.
35
6. IŠVADOS
1. Intaktinių, abiejų lyčių, Wistar veislės žiurkes paveikiant NaVP, abiejų lyčių žiurkių čiobrialiaukės masė tendencingai sumažėjo patelėms 0,07 g ir atitinkamai patinėliams – 0,09 g (p > 0,05). Kastruotų žiurkių patinėlių, kurie buvo paveikti NaVP, čiobrialiaukės masė statistiškai patikimai sumažėjo 0,38 g (p < 0,05), o sterilizuotų patelių tendencingai padidėjo 0,02 g (p > 0,05).
2. NaVP kartu su uretanu sinergistiškai lemia su lytimi, kastracija ir sterilizacija susijusius skirtumus BALB/c pelių plaučių navikų raidai. NaVP skatina pelių, paveiktų uretanu, plaučių navikų atsiradimą ir progresavimą: padidėjęs navikų skaičius nustatytas nekastruotiems patinams 2,12 karto, kastruotiems – 1,75 karto, o sterilizuotoms ir nesterilizuotoms patelėms – atitinkamai 1,08 ir 2,15 karto išaugęs navikų skaičius. Tačiau šie skirtumai yra statistiškai nepatikimi (p > 0,05).
36
LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Adragna NC., Fulvio MD., Lauf PK. Regulation of K–Cl cotransport: from function to genes. 2004. J Membr. Biol. 201. P. 109–137.
2. Ahmed AR., Hombal SM. Cyclophosphamide (Cytoxan): A review on relevant pharmacology and clinical uses. 1984. J Am. Acad. Dermatol. 11:1115. P. 26.
3. Armijo JA., de las Cuevas I., Adin J. Ion channels and epilepsy. 2000. Rev. Neurol. 30(Suppl 1) P. 25–41.
4. Atmaca A., Al–Batran SE., Maurer A., Neumann A., Heinzel T., Hentsch B., et al. Valproic acid (VPA) in patients with refractory advanced cancer: A dose escalating phase I clinical trial. 2007. Br. J Cancer 97:177. P.82.
5. Barratt CL., Aitken RJ., Björndahl L., Carrell DT., de Boer P., Kvist U., et al. Sperm DNA: Organization, protection and vulnerability: from basic science to clinical applications–a position report. 2010. Hum. Reprod. 25:824. P. 38.
6. Bolden JE., Peart MJ., Johnstone RW. Anticancer activities of histone deacetylase inhibitors. 2006. Nat. Rev. Drug Discov. 5:769. P. 84.
7. Bureu M., Laschet J., Minier F., Chauvel P. Intervention of GABAergic neurotransmission in partial epilepsies. 1997. Rev. Neurol. 153. P. 46–54.
8. Carey N., La Thangue NB. Histone deacetylase inhibitors: gathering pace. 2006. Curr Opin Pharmacol. 6:369. P. 75.
9. Carew JS., Giles FJ., Nawrocki ST. Histone deacetylase inhibitors: Mechanisms of cell death and promise in combination cancer therapy. 2008. Cancer Lett. 269. P. 7–17. 10. Carrell DT., Hammoud SS. The human sperm epigenome and its potential role in
embryonic development. 2010. Mol. Hum. Reprod. 16. P. 37–47.
11. Chateauvieux S., Morceau F., Dicato M., Diederich M. Molecular and therapeutic potential and toxicity of valproic acid. 2010. J Biomed. Biotechnol. P. 1–18.
12. Chavez–Blanco A., Perez–Plasencia C., Perez–Cardenas E., et al. Antineoplastic effects of the DNA methylation inhibitor hydralazine and the histone deacetylase inhibitor valproic acid in cancer cell lines. 2006. Cancer Cell Int. 6:2.
13. Chavez–Blanco A., Perez–Plasencia C., Perez–Cardenas E., et al. Antineoplastic effects of the DNA methylation inhibitor hydralazine and the histone deacetylase inhibitor valproic acid in cancer cell lines. 2006 Cancer Cell Int. 6. P. 2.
37 14. Chen CL., Sung J., Cohen M., et al. Valproic acid inhibits invasiveness in bladder cancer
but not in prostate cancer cells. 2006. J Pharmacol. Exp. Ther. 319:533. P. 42.
15. Chen J., Ghazawi FM., Bakkar W., et al. Valproic acid and butyrate induce apoptosis in human cancer cells through inhibition of gene expression of Akt/protein kinase B. 2006. Mol. Cancer 5. P. 71.
16. Cinatl J., Cinatl J., Scholz M., et al. Antitumor activity of sodium valproate in cultures of human neuroblastoma cells. 1996. Anticancer Drugs 7:766. P. 73.
17. Das CM., Aguilera D., Vasquez H., et al. Valproic acid induces and topoisomerase–II (alpha/beta) expression and synergistically enhances etoposide cytotoxicity in human glioblastoma cell lines. 2007. J Neurooncol. 30(May). P. 21.
18. Duenas–Gonzalez A., Candelaria M., Perez–Plascencia C., Perez–Cardenas E., de la Cruz–Hernandez E., Herrera LA. Valproic acid as epigenetic cancer drug: Preclinical, clinical and transcriptional effects on solid tumors. 2008. Cancer Treat. Rev. 34. P. 206– 22.
19. Faiella A., Wernig M., Consalez G.G., Hostick U., Hofmann C., Hustert E., Boncinelli E., Balling R., Nadeau J.H. A mouse model for valproate teratogenicity: parental effects, homeotic transformations and altered HOX expression. 2000. Hum. Mol. Genet., 9. P. 227–236.
20. Forkert P. Mechanisms of lung tumorigenesis by ethyl carbamate and vinylcarbamate. 2010. Drug Metab Rev. 42(2):355. P. 78.
21. Friedmann I., Atmaca A., Chow KU., et al. Synergistic effects of valproic acid and mitomycin C in adenocarcinoma cell lines and fresh tumor cells of patients with colon cancer. 2006. J Chemother. 18:415. P. 20.
22. Fritschy JM., Mohler H. GABAA–receptor heterogeneity in the adult rat brain: differential regional and cellular distribution of seven major subunits. 1995. Comp. Neurol. 359. P. 154–194.
23. Godmann M., Lambrot R., Kimmins S. The dynamic epigenetic program in male germ cells: Its role in spermatogenesis, testis cancer, and its response to the environment. 2009. Microsc. Res. Tech. 72:603. P.19.
