LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
Danielė Bagdanavičiūtė
Enzootinės galvijų leukozės paplitimo analizė
Analysis of Enzootic Bovine Leukosis prevalence
Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovė : doc. dr. Marija Stankevičienė
2 DARBAS ATLIKTAS UŽKREČIAMŲJŲ LIGŲ KATEDROJE
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Enzootinės galvijų leukozės paplitimo analizė“.
1. Yra atliktas mano paties (pačios).
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE)
(aprobacijos data) (katedros (klinikos) vedėjo (-os)
vardas, pavardė)
(parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentai 1)
2)
(vardas, pavardė) (parašai)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
3
TURINYS
SANTRUMPOS ... 4 SANTRAUKA ... 5 SUMMARY ... 6 ĮVADAS ... 8 1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 101.1 Leukozę sukeliančio viruso struktūra ... 10
1.2 Patogenezė ... 11
1.3 Klinikiniai požymiai ... 13
1.3.1 Audinių ir organų pažeidimai: ... 14
1.4 Klinikinė ir makroskopinė patologija ... 15
1.5 Epidemiologija ... 16
1.6 Diagnozavimas ... 18
1.7 Gydymas ir likvidavimo priemonės ... 19
1.8 Prevencija ... 20
2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA ... 21
2.1 Imunofermentinės analizės metodas ... 21
2.1.1 Principas ... 21
2.1.2 Metodo atlikimas ... 22
2.1.3 Rezultatų apskaičiavimas ir aiškinimas ... 23
2.2 Imunodifuzijos reakcija agaro gelyje ... 24
2.2.1 Principas ... 24
2.2.2 Metodo atlikimas ... 24
2.2.3 Rezultatų vertinimas ir interpretavimas ... 25
3. TYRIMO REZULTATAI ... 27
3.1 Enzootinės leukozės situacija Lietuvos galvijų populiacijoje ... 27
3.1.1 Enzootinės galvijų leukozės tiriamumas ir paplitimas apskrityse ... 28
3.1.2 Enzootinės galvijų leukozės viruso nešiotojų paplitimas 2008 - 2014 metais ... 29
3.1.3 Enzootinės galvijų leukozės viruso nešiotojų pasiskirstymas pagal amžiaus grupes ... 31
3.1.4 Enzootinės galvijų leukozės viruso nešiotojų pasiskirstymas pagal lytį ... 32
3.1.5 Seroteigiamų galvijų pasiskirstymas pagal veislę ... 33
3.2 Seroteigiamų mėginių patvirtinamasis tyrimas imunodifuzijos reakcija ... 34
4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 35
IŠVADOS ... 38
PADĖKA ... 39
LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 40
4
SANTRUMPOS
Ag – antigenas
EGL – enzootinė galvijų leukozė
Env – genomo dalis, koduojanti paviršinius baltymus
Gag – genomo dalis, koduojanti šerdinius ir struktūrinius baltymus GLV – galvijų leukozės virusas
IDAG – imunodifuzijos reakcija agaro gelyje (angl. AGID (Agar Gel Immunodiffusion Test)) IFA – imunofermentinė analizė (angl. ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay)) NMVRVI – Nacionalinis maisto ir veterinarijos rizikos vertinimo institutas
OT – optinis tankis
PGR – polimerazės grandininė reakcija
Pol – genomo dalis, koduojanti atvirkštinės transkriptazės, proteazės ir integrazės fermentų baltymus Proc. – procentai
RNR – ribonukleino rūgštis TS – teigiamas serumas Tūkst. – tūkstantis
5
SANTRAUKA
Enzootinės galvijų leukozės paplitimo analizė Danielė Bagdanavičiūtė
Magistro baigiamasis darbas
Lietuvoje gyvulininkystė viena iš pagrindinių ūkio šakų. Statistikos departamento duomenimis Lietuvoje 2015 metais buvo laikoma 736 tūkst. galvijų, iš jų pieninių veislių karvių – 313 tūkst. (1). Kad gautume saugią produkciją, labai svarbi užkrečiamųjų ligų prevencija šiame sektoriuje.
Darbo tikslas buvo išanalizuoti leukozės paplitimą galvijų populiacijoje Lietuvos ūkiuose. Darbo uždaviniai buvo suformuluoti norint: išsiaiškinti enzootinės galvijų leukozės tyrimų dažnumą ir paplitimą galvijų tarpe Lietuvos apskrityse, palyginti ligos tiriamumą ir užsikrėtimą pagal metus, bei nustatyti infekcijos nešiotojų paplitimą pagal galvijų amžių, veislę, lytį.
Darbo apimtis 46 puslapiai, pateikta 15 paveikslų, 6 lentelės.
Tyrimas buvo atliktas Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Veterinarijos akademijos Užkrečiamųjų ligų katedroje ir Nacionalinio maisto ir veterinarijos rizikos vertinimo instituto (NMVRVI) Serologinių tyrimų skyriuje. Analizuojami septynerių metų (2008–2014 m.) laikotarpio tyrimų duomenys. Per šį laikotarpį ištirti 169 764 galvijų kraujo serumo mėginiai.
Išanalizavus surinktus duomenis apie atliktus enzootinės galvijų leukozės tyrimus, padaryta išvada, kad 2008–2014 metais iš 169764 ištirtų galvijų, šio viruso nešiotojai buvo 168 (0,1 proc.) individai. Išnagrinėjus tiriamumą ir paplitimą galvijų tarpe apskrityse, nustatyta, kad daugiausia kraujo serumo mėginių ištirta iš Vilniaus apskrities ūkių (28,85 proc.), o virusas labiausiai paplitęs Marijampolės apskrities galvijininkystės ūkiuose (1,34 proc.). Susisteminus duomenis pagal analizuojamus metus, padaryta išvada, jog daugiausia kraujo serumo mėginių ištirta 2011 metais (29,96 proc.), o didžiausias seroteigiamų galvijų skaičius buvo 2008 metais (0,86 proc.). Iš visų tiriamųjų daugiausiai viruso nešiotojų rasta tarp 0 – 5 metų, t.y. jauniausios amžiaus grupės individų (58,33 proc.). Didžiausią dalį infekuotųjų galvijų grupėje sudarė patelės (89,88 proc.). Tarp seroteigiamų gyvulių, daugiausia leukozės viruso nešiotojų Lietuvos juodmargių veislės galvijų tarpe ( 64,88 proc.).
Iš IFA reakcija teigiamai įvertintų 168 kraujo serumo mėginių, 151 mėginys patvirtinimui buvo tiriamas IDAG metodu. Nustatyta, kad tiek IFA metodu, tiek IDAG metodu 151 tirtas mėginys buvo įvertintas teigiamai.
Raktiniai žodžiai: galvijų enzootinė leukozė, galvijas, imunofermentinė analizė, imunodifuzijos reakcija.
6
SUMMARY
Analysis of Enzootic Bovine Leukosis prevalence Danielė Bagdanavičiūtė
Master's Thesis
Livestock farming in Lithuania is one of the main branches of industry. According to the data of the Department of Statistics (Statistics Lithuania), in 2015 in Lithuania it was considered to be kept 736,000 livestock, including 313,000 dairy breeds of cows (1). In order to obtain a safe production, the prevention of communicable diseases in this sector is very important.
The aim of the graduate thesis is to analyze the prevalence of leucosis in cattle population in Lithuanian farms. The tasks of the work have been formulated in order to examine the frequency of testing and prevalence for enzootic bovine leucosis in the counties of Lithuania, compare the study and infection of the disease by the year, and to determine the prevalence of infection carriers by age, breed, and sex.
The thesis is composed of 46 pages. The work also contains 15 Figures and 6 Tables.
The survey was conducted at the Department of Infectious Diseases of Veterinary Academy of Lithuanian University of Health Sciences, and at the Serology Investigation Section of National Food and Veterinary Risk Assessment Institute (NFVRAI). The seven-year (2008-2014) period data of the surveys have been analyzed. During this period 169,764 samples of bovine blood serum have been examined.
After the analysis of the data collected on the tests for enzootic bovine leucosis, it was deduced that 168 (0.1%) individuals out of 169,764 bovine animals examined were infected by the disease during the period from 2008 to 2014. Following an examination of the frequency and prevalence of the disease in the counties, it was found that the majority of the blood serum samples were examined in Vilnius County households (28.85%), while the virus is most prevalent in Marijampolė County cattle holdings (1.34%). After systematizing the data in a year period analysed, it was concluded that the greatest number of blood serum samples were tested in 2011 (29.96%), and the highest number of seropositive cattle was in 2008 (0.86%).
Among all the subjects concerned, the highest infection rate was found among animals aged from 0 to 5, i.e., the youngest age group of individuals (58.33%).
7 The largest group of infected cattle consisted of females (89.88%). Among the seropositive animals, mainly Black Pied breeds (64.88%) of Lithuanian cattle suffered from enzootic bovine leucosis.
Among all the 168 blood serum samples, positively assessed by ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) reaction, 151 samples have been investigated for the approval using AGID (Agar Gel Immunodiffusion Test) method. It was ascertained that 151 samples which had been tested using both the ELISA and AGID methods were rated positively.
Keywords: Enzootic bovine leucosis. Bovine animal. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Immunodiffusion reaction.
8
ĮVADAS
Galvijininkystė – viena iš gyvulininkystės šakų, kuri turi didelę reikšmę Lietuvos žemės ūkiui. Ūkio pajamos iš galvijininkystės, taip pat įskaitant ir skerdimui, bei veislei parduodamus galvijus, sudaro apie 60 proc. visų už gyvulininkystės produkciją gaunamų pajamų, todėl labai svarbi užkrečiamųjų ligų kontrolė šiame sektoriuje. Užkrečiamos, ypatingai virusinės ligos, daro didžiulę žalą galvijininkystės plėtrai (2, 3).
Pirmą kartą enzootinė galvijų leukozė (EGL), kaip suaugusių pieninių galvijų liga, aprašyta 1870 metais (4). Šios ligos sukėlėjui išaiškinti prireikė daugiau kaip 90 metų. 1969 m. amerikiečių mokslininkai leukocitų kultūrose nustatė galvijų leukozės C tipo virusą. Lietuvoje pirmą kartą galvijų enzootinė leukozė užregistruota 1916 m. Klaipėdoje (5).
Enzootinę galvijų leukozę sukelia virusas, kuriuo užsikrėsti gali bet kokio amžiaus gyvuliai, net ir jų embrionai. Tik maždaug 30 proc. infekuotų gyvulių prasideda persistuojanti limfocitozė, o 1–10 proc. susidaro navikai. Praėjus kelioms savaitėms po užsikrėtimo, kraujyje atsiranda antikūnų, kurių kiekis būna nepastovus (6).
Galvijų leukozė yra per kraują plintanti liga, kurios metu pažeidžiama gyvulių imuninė sistema (7), gyvuliai netenka svorio, padidėja daugelis limfinių mazgų, atsiranda raumenų silpnumas, gali būti ir odos pažeidimų (8).
EGL padaro didžiulių ekonominių nuostolių pasaulio galvijininkystei, nes užsikrėtę galvijai brokuojami. Jų prieauglis netinkamas veisti, mėsa ir pieno produktai vartojami ribotai, nemažai skerdienos utilizuojama (9). Ekonominiai nuostoliai pasireiškia sumažėjusia pieno gamyba, sutrumpėjusia laktacijos trukme, suprastėjusiu reprodukciniu efektyvumu, padidėjusiu jautrumu infekcinėms ligoms, išaugusiomis gydymo išlaidomis (10). Užsikrėtę galvijai negali būti parduodami veislei, draudžiamas jų eksportas, jie likviduojami skerdžiant (2).
Daugelyje Europos valstybių EGL yra likviduota, bet kai kuriuose regionuose ligos paplitimas tarp suaugusių pieninių galvijų vis dar svyruoja nuo 23 proc. iki 46 proc. (11).
Darbo tikslas: išanalizuoti enzootinės galvijų leukozės viruso paplitimą galvijų populiacijoje.
Darbo uždaviniai:
1. Surinkti duomenis apie atliktus enzootinės galvijų leukozės tyrimus 2008 – 2014 metais.
2. Išsiaiškinti enzootinės galvijų leukozės tiriamumą ir viruso paplitimą apskričių galvijininkystės ūkiuose.
9 3. Palyginti galvijų tiriamumą ir užsikrėtimą enzootine leukoze nuo 2008 iki 2014 metų.
4. Nustatyti infekcijos nešiotojų paplitimą pagal galvijų amžių, veislę, lytį.
10
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1 Leukozę sukeliančio viruso struktūra
Galvijų leukozė yra užkrečiama, visame pasaulyje paplitusi lėtinė virusinė liga, kurią sukelia galvijų leukozės virusas (GLV). Tai egzogeninis retrovirusas, dažniausiai infekuojantis B limfocitus. Pagal morfologinius, molekulinius ir biocheminius požymius klasifikuojamas, kaip C tipo žinduolių onkornavirusas. Galvijų leukozė aktuali ir socialiniu aspektu, nes GLV priklauso tai pačiai retrovirusų šeimai kaip ir žmonių T leukemijos bei limfomos 1-ojo 2-ir ojo tipo virusai (ŽTLV-I, ŽTLV-II), beždžionių T leukemijos virusas (BTLV), žmonių imunodeficito 1-ojo ir 2-ojo tipo virusai (ŽIV-I, ŽIV-II), beždžionių, kačių ir galvijų imunodeficito virusai (12).
Galvijų leukozę sukeliantis virusas priklauso Retroviridae šeimai, Orthoretrovirinae pošeimiui,
Deltaretrovirus genčiai. Tai dvigubos plius (+) RNR virusas. Jis yra apvalus, gana didelis – diametras
80 – 100 nanometrų. Viruso branduolys sferinis, genomas monocistroninis linijinis, apie ~8,5 kb (1 pav.). GLV, kaip ir kiti retrovirusai, turi atvirkštinės transkriptazės (pol), šerdinių baltymų (gag), bei apvalkalo baltymų (env) genus (13).
GLV susideda iš dviejų vienodų ribonukleino rūgšties molekulių, kurios su keliomis atvirkštinės transkriptazės molekulėmis sudaro viruso neukleoido centrą (4). GLV sudėtyje yra 4 neglikozilinti (p24, p15, p12, p10) ir 2 glikozilinti komponentai (gp51, gp30). Baltymas p24 yra pagrindinis nukleoido vidinis struktūrinis baltymas. Nuo glikoproteino gp30 priklauso infekcijos laipsnis. Be to šis glikoproteinas skatina ląstelių samplaiką (sinsiciją) (1 pav.) (6, 14).
Naujausių filogenetinių tyrimų dėka, tiriant GLV env genus, buvo įrodyta, kad enzootinės galvijų leukozės virusas gali būti klasifikuojamas į 7 padermes (15).
Virusas yra neatsparus aplinkos veiksniams. Jis greitai inaktyvuojamas švitinant ultravioletiniais spinduliais, pasterizuojant. Kaitinamas 56 °C temperatūroje žūva per 30 minučių, tačiau kraujo mėginyje, laikomame 4°C temperatūroje, išlieka gyvybingas 4 savaites (16).
11 1 pav. Galvijų leukozės virusas (17)
1.2 Patogenezė
Daugumai užsikrėtusų GLV liga pasireiškia subkliniškai – neišryškėja klinikiniai ligos požymiai, apie 29 proc. infekuotų galvijų išsivysto limfocitozė, mažiau nei 5 proc. išsivysto limfosarkoma (18).
Persistuojanti limfocitozė – kartais dar vadinama preneoplastiniu sindromu. Limfocitozė laikoma gerybine galvijų leukozės infekcijos būkle. Dėl šios priežasties ji dažnai nepastebima. Tačiau tokie galvijai yra infekcijos rezervuaras. 45 kartus padidėja CD+5 ir 99 kartus padidėja CD-5 B limfocitų kraujyje. Karvės, sergančios šia ligos forma, turi didesnę tikimybę perduoti virusą veršeliui gimdoje. Taip pat tokiems gyvuliams sumažėja pieno gamyba, bei pakinta pieno rodikliai (18).
Limfosarkoma – retai pasireiškia gyvūnams, kurie yra jaunesni, nei 2 metų amžiaus. Ši ligos forma daugiausiai paplitusi tarp galvijų nuo 4 iki 8 metų amžiaus. Limfosarkoma, įskaitant pavienius ir enzootinius atvejus, yra viena iš pagrindinių priežasčių dėl suaugusių pieninių galvijų skerdimo (18).
Sergantys galvijai turi didesnę tikimybę užsikrėsti antrinės kilmės infekcijomis, sumažėja jų produktyvumas ir reprodukcija bei sutrumpėja gyvenimo trukmė (19).
Sergant EGL daugiausia yra infekuojami B limfocitai, tačiau ir kitos imuninės ląstelės, tokios kaip T limfocitai, monocitai, makrofagai gali būti užkrėstos (20). Infekuotų galvijų kraujyje, ypač tų, kurie serga lėtine ligos forma, atsiranda Gumprechto šešėliai, dar kitaip vadinami “suteptomis ląstelėmis (smudge cells)” (2 pav.). Šis pakitimas randamas tik GLV teigiamų galvijų periferiniame kraujyje. Vis dar nėra visiškai aišku, kur įvyksta ši anomalija. Mokslininkai teigia, jog labiausiai tikėtina, jog tai įvyksta B limfocituose – taip pat, kaip ir žmonių organizme (21).
12 2 pav. A- Gumprechto šešėliai GLV teigimo galvijo periferiniame kraujyje
B- Normalus limfocitas neinfekuoto galvijo kraujyje (21)
Viruso reprodukcijos ciklas skirstomas į šiuos etapus: viruso adsorbcijos ląstelės paviršiuje, viruso penetracijos – įsiveržimo į ląstelę, viruso kapsidės ir apvalkalo pašalinimo, makromolekulių sintezės, virionų surinkimo ir viruso pašalinimo iš ląstelės (3 pav.) (22).
3 pav. Gyvūnų retroviruso įsiskverbimo į ląstelę ir dauginimosi schema (22)
Po užsikrėtimo, stimuliuojamas aktyvus imuninis atsakas, kuris trunka visą gyvulio gyvenimą, todėl efektyviai slopinamas viruso replikacijos ciklas, kurio metu mitoziškai dauginasi ląstelės, nešiojančios provirusą. Lėtinėje ligos stadijoje virusas nuolat yra perėjime tarp latentinės ir transkripcinės fazių.Humoralinis antivirusinis atsakas pasireiškia nuo užsikrėtimo pradžios praėjus 1 – 8 savaitėms, kraujyje nustatomi aukšti antikūnų titrai. Kai kurie iš šių antikūnų yra tiesiogiai
13 lizuojantys galvijų leukozės virusą gaminančias ląsteles. Antikūnų sukeltai (humoralinei) citolizinei veiklai didėjant, liga progresuoja link ūmios fazės. Per ankstyvą serologinį laikotarpį citotoksiški T - limfocitai, specifiški Tax proteinui ir env (apvalkalo baltymo) epitopams, atsiranda periferiniame kraujyje. GLV užsikrėtusių gyvūnų organizme, progresuojant ligai, abi (nuo viruso priklausoma ir nepriklausom) CD4 T helperio ląstelės reaguoja, tačiau jų citotoksinė ir kitos helperio funkcijos yra susilpnėjusios. Tai galėtų paaiškinti mažesnį spontaninį (savaiminį) pasveikimą, pvz.: užsikrėtus T.
verrucosum (23).
Struktūriniai genai: tax, pol ir env yra būtini užsikrėtimui in vivo (24).
1.3 Klinikiniai požymiai
Infekcija paprastai sukelia trumpalaikį viremijos periodą, kuris nepasireiškia kliniškai. Galvijų leukozės inkubacinis periodas yra ilgas, įprastai tęsiasi daugiau nei 3 metus (25).
Dažniausiai užsikrėtęs gyvūnas išlieka seroteigiamas ir platina virusą visą gyvenimą (be klinikinių ligos požymių).
30 – 70 proc. infekuotų galvijų pasireiškia persistuojanti limfocitozė, kurios metu kraujyje padidėja B limfocitų.
Tik 0,1 – 10 proc. užsikrėtusiųjų išsivysto limfoma. Maždaug pusei šių gyvūnų iš pradžių pasireiškia persistuojanti limfocitozė prieš pereinant į limfomą. Iš pradžių matomas tik kelių limfinių mazgų padidėjimas, tačiau vėlesnėje ligos stadijoje šis procesas išplinta. Tuomet navikai gali būti randami visuose organuose, kurie turi limfoidinio audinio (kaulų čiulpuose, blužnyje, plaučiuose kepenyse, gimdoje). Tokie gyvūnai praranda apetitą, būna išsekę, pablogėja bendra savijauta. Pažeistų organų skaičius, navikų augimo greitis, dydis ir metastazių išplitimas, bei organų funkcinių sutrikimų laipsnis gali ženkliai paveikti galimus klinikinius požymius ir ligos eigą (25).
Todėl klinikiniai požymiai būna labai įvairūs, nespecifiniai, o daugeliu atvejų netgi klaidinantys diagnozavimą. Gyvulį mirtis ištinka per 1–5 mėnesius po klinikinių ligos požymių pasireiškimo (26). Tai paprastai nutinka dėl kacheksijos, antrinių infekcijų, anemijos bei gyvybiškai svarbių organų išorinių ir funkcinių pažeidimų. Mažai daliai gyvulių ligos eiga ir mirtis būna poūminė arba ūminė, ypač jei plyšta blužnis, sutrinka širdies arba antinksčių veikla (25).
Klinikiniai požymiai taip pat yra susiję su limfosarkomos vystymusi. Jie yra labai įvairūs, nes gali būti pažeidžiami skirtingi organai, kurie ir įtakoja tam tikrus klinikinius požymius. Limfosarkoma dar kitaip vadinama sporadine galvijų leukozės forma. Ji būna trijų rūšių: 1) jauniklių, 2) užkrūčio
14 liaukos, 3) odos. Jauniklių limfosarkoma dažniausiai pasireiškia gyvūnams iki 6 mėnesių amžiaus, o užkrūčio liaukos ir odos limfosarkoma paplitusi tarp 6 – 24 mėnesių amžiaus galvijų (18, 27).
Jauniklių limfosarkomai dažniausiai būdinga staiga prasidėjusi, difuzinė limfoidinio audinio hiperplazija, kurios metu taip pat gali būti pažeidžiami visceraliniai organai. Šios limfosarkomos formos metu pasireiškia svorio netekimas, karščiavimas, tachikardija, dispnėja, išputimas, užpakalinės dalies parezė. Šią ligos formą dažnai lydi ir absoliuti limfocitozė (>50,000/μL), trombocitopenija, anemija. Užkrūčio liaukos limfosarkoma pažeidžia kairiąją (kaklinę) čiobrialiaukės dalį arba dešiniąją (krūtininę), o kartais ir abi iš karto. Klinikiniai požymiai, susiję su šia limfosarkomos forma, labai priklauso nuo navikų lokalizacijos ir dydžio. Užkrūčio liaukos limfosarkomos metu gyvuliams išryškėja dusulys, išputimas, jungo venų išsiplėtimas, karščiavimas, edemos po kaklu, sunkus rijimas bei atrajojimas. Odos limfosarkoma pasireiškia 1 – 5 cm skersmens pilkai baltais odos mazgeliais ant kaklo, nugaros, uodegos, priekinių galūnių bei šlaunų. Gali būti padidėję sritiniai limfiniai mazgai. Oda be plaukų, žaizdota, vidaus organuose randami navikai. Šios limfosarkomos formos metu galima spontaninė remisija, tačiau po to neatmetama ir ligos recidyvo tikimybė (18, 27).
1.3.1 Audinių ir organų pažeidimai:
Gyvūnams, užsikrėtusiems GLV ir išsivysčius limfosarkomai, pakitimų atsiranda centriniuose ir periferiniuose limfmazgiuose. Tie pakitimai siejami su lokaliu ar išplitusiu limfmazgių padidėjimu – limfadenopatija. Šliužo pažeidimų dėka sukeliamas pilvo skausmas, melena, obstrukcija. Dubens galūnių parezė, kuri gali pereiti ir į paralyžių, gali pasireikšti gyvūnams su epiduraliniais stuburo pakitimais. Retrobulbariniai pažeidimai sukelia egzoftalmiją, kuri įtakoja keratitą, bei junginės išsivertimą. Dešiniojo prieširdžio pažeidimai dažnai būna lengvi, todėl juos sunku diagnozuoti. Jie gali sukelti aritmiją, ūžesius, širdies nepakankamumą. Gimdos pakitimai kartais sukelia reprodukcinius sutrikimus ar abortą. Ligos eigoje paprastai pažeidžiami šie vidaus organai: blužnis, kepenys, inkstai, šlapimtakiai. Blužnies pažeidimai dažnai iš pradžių būna besimptomiai, tačiau vėliau gali įtakoti jos plyšimą ir kraujo išsiliejimą į pilvo ertmę. Kepenų limfosarkoma taip pat būna besimptomė, nors gali iššaukti geltą ir kepenų nepakankamumą. Inkstų ir šlapimtakių pažeidimai sukelia pilvo skausmą, hidronefrozę bei atsiranda klinikiniai požymiai, susiję su inkstų nepakankamumu (11, 18).
Limfosarkoma gali atrodyti, kaip gelsvas nudegimas ar difuzinis audinių infiltratas. Organų prašviesėjimai dažnai aiškinami, kaip degeneraciniai procesai, o ne navikiniai dariniai. Histologiškai matomos tankiai išsidėsčiusios monomorfinės limfocitinės ląstelės (18).
15
1.4 Klinikinė ir makroskopinė patologija
Patologiniai anatominiai pokyčiai priklauso nuo to, kokia leukozės forma galvijas sirgo ir kokioje susirgimo stadijoje nugaišo. Anemija (normocitinė ir normochrominė) išsivysto 55 proc. užsikrėtusiųjų. Hemoglobinas nuosekliai mažėja visą ligos laikotarpį. Hematokrito lygis yra lygiagretus hemoglobinui. Kraujo serume gali padidėti šlapimo rūgšties, aspartataminotransferazės (AST) ir laktatdehidrogenazės (LDH). Kiti cheminiai rodikliai taip pat nėra normos ribose arba pasireiškia tik terminalinėje gyvulio būklėje. Preleukeminės stadijos metu pakitimai dažniausiai randami tik kraujyje. Navikinės stadijos metu matomi apibrėžtų ribų arba difuziniai navikinių ląstelių infiltratai limforetikuliniame ir kituose audiniuose. Dažniausiai pažeidžiami limfiniai mazgai, kurių pažeidimų kiekis svyruoja (4 pav.). Iš organų ar audinių, ypač paveikiamas šliužas, žarnos, miokardas, inkstai, kepenys, gimda, smegenys. Mazginiai išvešėjimai gali būti įvairių dydžių ir spalvos: nuo pilkai baltos iki gelsvos ar šviesiai rožinės, vidutinės konsistencijos. Jei jie išplinta, susidaro hemoraginės sritys arba nekrozės zonos. Difuziniai, infiltraciniai išvešėjimai gali sukelti organų pabrinkimą, balkšvumą, konsistencijos minkštumą, tačiau jie nepakeičia organų formos (20, 28).
Stuburo smegenų navikai labiausiai matomi juosmens srityje, kurių diametras svyruoja nuo kelių milimetrų iki tokių dydžių, kurie užima visą stuburo kanalą. Miokardo navikai dažniausiai pasitaiko dešiniajame prieširdyje, ko pasėkoje susidaro centrinės venos kongestija (5 pav.). Šliužo navikai būna kaip difuziniai sustorėjimai gleivinės ir pogleivio sluoksniuose, su opomis ir kraujavimu (28).
16 5 pav. Širdies limfosarkoma (18)
1.5 Epidemiologija
Leukoze serga gyvuliai, paukščiai ir žmonės. Iš gyvūnų dažniausiai serga: galvijai, avys, ožkos, kiaulės, arkliai, kalakutai, vištos, antys ir žąsys. Infekcijos sukėlėjo šaltinis yra sergantys ir persirgę gyvuliai – viruso nešiotojai (29). Nors GLV priklauso tai pačiai retrovirusų šeimai kaip ir žmonių ir turi bendrų antigeninių bruožų, tačiau žmonės nuo gyvūnų neužsikrečia. Taigi EGL nėra zoonozinė liga (30).
Epidemiologiniai tyrimai parodė, jog žalio pieno vartojimas iš užkrėstų karvių taip pat neturi įtakos žmonių leukemijos susirgimo rizikai. Galvijų leukozės virusas, su pienu patekęs į organizmą, nesukelia infekcijos, nesidaugina ir neindukuoja šio susirgimo žmonėms (30, 31).
Įdomu yra tai, kad sergančių gyvulių gali būti nedaug net ir labai užkrėstose bandose. Gyvuliai ne visada suserga, net juos užkrėtus labai didelėmis viruso dozėmis. Tai rodo, kad liga išplinta, esant tam tikroms sąlygoms, tokioms kaip organizmo genetinis polinkis ar imunodeficitas (29).
Galvijų enzootine leukoze ankščiau buvo sergama beveik visose pasaulio valstybėse, taip pat ir Lietuvoje. 2013 m. metiniame Europos komisijos galvijų ir kiaulių ligų pranešime pateikta, jog daugelis Europos valstybių: Austrija, Belgija, Danija, Vokietija, Ispanija, Norvegija, Prancūzija, Didžioji Britanija, Lietuva ir dar 11 šalių yra oficialiai laisvos nuo šios ligos (32). Europos Komisija
17 2012 m. birželio 11 d. priėmė sprendimą, kuriuo Lietuva buvo pripažinta enzootinės galvijų leukozės neapimta šalimi (33).
Tarp geografinių regionų šios ligos paplitimas ir dažnumas skiriasi ir gali svyruoti nuo 1 iki 100 proc. Iš serologinių tyrimų, atliktų Pietų Amerikoje Džersio galvijų bandose, buvo matyti, kad daugiau nei 10 proc. gyvūnų turi antikūnus prieš GLV. Mėsinių galvijų bandose antikūnų rasta daug mažiau. Iš serologinių tyrimų, atliktų 132 pieninių galvijų bandose, iš jų 91 (69 proc.) turėjo antikūnus prieš EGL virusą. Iš viso buvo ištirti 2818 gyvuliai ir 502 (17,8 proc.) iš jų buvo seroteigiami (34).
2005–2012 metais Italijoje buvo atliktas EGL sergamumo tyrimas, kuris vyko visus 8 metus. Per tą laikotarpį užfiksuoti 123 EGL protrūkiai, iš kurių 101 buvo 2-iejuose regionuose, t.y. Sicilijoje ir Kampanijoje. 31 ligos atvejis buvo išaiškintas pasireiškus klinikiniams ligos požymiams, kiti nustatyti serologinių tyrimų pagalba. Šio tyrimo dėka padaryta išvada, jog tik nedaugeliui galvijų, užsikrėtusių GLV, pasireiškia klinikinė ligos išraiška (35).
2000–2004 metais Lietuvoje buvo ištirti 2 827 853 galvijai, iš kurių 12 113 buvo infekuoti EGL virusu. Atlikta išlaidų analizė parodė, kad likviduojant galvijų virusines ligas daugiausia lėšų buvo išleista galvijų enzootinės leukozės likvidacijai. Tyrimo laikotarpiu gyvulių užsikrėtimas EGL virusu sumažėjo nuo 0,85 proc. iki 0,23 proc. (2).
Nors nėra daug informacijos apie galvijų veislės įtaką ligos užsikrėtimui, tačiau 2015 metais atliktame tyrime pateikiama, jog Holšteinų veislės galvijai turi didesnę tikimybę būti paveikti GLV, nei Švicų veislės galvijai. Iš 18 822 ištirtų Holšteinų veislės gyvulių – seroteigiamų buvo 431 (paplitimas 2,28 proc.), o iš 10160 Švicų veislės galvijų – seroteigiamų rasta 29 (paplitimas 0,28 proc.) (36).
Virusas tiesiogiai keičia kraujo ląsteles. Jis paprastai perduodamas sveikam galvijui nuo užsikrėtusio gyvūno su persistuojančia limfocitoze. Sėkmingai transmisijai reikia tik 1 μl (0,001 ml) kraujo (37).
Leukozę sukeliančiu virusu užsikrečiama kraujo perpylimo metu, perpilant užkrėsto galvijo kraują sveikam gyvuliui. Taip pat ragų šalinimo, ženklinimo metu bei kitais atvejais, kai atsiranda galimybė virusui patekti į kraują per pažeistą odą ar gleivinę (25, 7).
Infekcija taip pat gali būti perduota jatrogeniniu būdu (užterštus krauju švirkštus, adatas ir kitus instrumentus), mechaniniu keliu – per kraujasiurbius vabzdžius (pvz.: Tabanusfuscicostatus) bei per pieną ar krekenas. 2007 metais publikuotame Nagy ir kt. (38) mokslininkų straipsnyje pateikiama išvada, jog GLV infekuotos patelės, veršingumo metu, gali užkrėsti savo palikuonis. Tačiau teigiama, kad krekenos iš tų pačių virusu infekuotų karvių ženkliai sumažina infekcijos riziką veršeliams. Remiantis skirtingų autorių išvadomis, galima teigti, kad priešpienis gali padėti sumažinti infekciją
18 veršeliams arba atvirkščiai, jis gali būti vienas iš užsikrėtimo šaltinių. Visgi didžioji dalis tyrimų rodo, kad priešpienyje esančių antikūnų apsauginis poveikis nusveria infekcijos rizikos potencialą (38).
Kitame 2006 metų publikuotame Kohara ir kt. (39) mokslininkų straipsnyje mėginama eksperimentiškai išsiaiškinti, ar virusas galėtų būti perduodamas rektinio tyrimo metu. Panaudojus bendras rektinei palpacijai skirtas pirštines, tiek GLV infekuotiems, tiek neinfekuotiems galvijams, buvo nustatyta, jog gyvūnams neigiamiems leukozės viruso atžvilgiu, antikūnai prieš šį sukėlėją išsivystė praėjus 7 – 10 savaitėms po tiesiosios žarnos tyrimo. Taigi rektinis tyrimas yra potencialus būdas infekcijai plisti užkrėstoje galvijų bandoje (39). Tačiau kiti mokslininkai teigia, kad organizmo išskyros ir skysčiai, tokie kaip seilės ar išmatos, nevaidina svarbaus vaidmens infekcijos perdavimui.
Infekcija gali būti perduodama natūralaus galvijų poravimosi metu. Užsikrėtę buliai perduoda virusą, jei spermoje yra kraujo ar limfocitų (40). Nors kiti mokslininkai teigia, kad galvijų leukozės virusas spermoje aptinkamas itin retai. Užkrėsti spermatozoidai, apvaisinę kiaušialąstę, neturi įtakos susidariusios zigotos infekavimui (41).
1.6 Diagnozavimas
Leukozė diagnozuojama remiantis epizootologinių, klinikinių, hematologinių, virusologinių, patologoanatominių ir serologinių tyrimų duomenimis (29). Infekcija nustatoma identifikuojant virusą, jo sintetinamus baltymus arba netiesioginiu būdu kraujo serume ar piene serologiškai nustačius antikūnus prieš GLV (6).
Anksčiausiai naudojamas testas nustatant GLV, buvo hematologinis testas, pagrįstas įvairiais kriterijais, vadinamais leukozės raktais, kuriais diagnozuojama subklinikinė ligos forma – stebimas limfocitų padidėjimas kraujyje kliniškai sveikose galvijų bandose (24).
Tarptautinėjė prekyboje gyvais galvijais GLV aptikimui pirmenybė teikiama imunodifuzijos reakcijai agaro gelyje (IDAG). Didelio masto GLV antikūnų aptikimo tyrimams IDAG pakeitė imunofermentinė analizė (IFA). IFA yra greitas būdas aptikti gp51 – leukozės viruso antigeno paviršiaus glikoproteiną ir jis užima mažiau laiko nei IDAG metodas. Be to, IFA naudojamas, kaip atrankos metodas, identifikuojant užsikrėtusius galvijus ir vykdant EGL likvidavimo programas (42).
Western Blot – tai dar vienas metodas antikūnams prieš GLV nustayti. Jis jautresnis ir specifiškesnis testas, lyginant su IFA ir IDAG.
19 Polimerazės grandininė reakcija (PGR), tai tiesioginis tyrimo metodas, kurio metu išskiriamos GLV nukleorūgštys. Ligos nustatymui šis metodas yra labai brangus, todėl naudojamas ribotai. Kiti tyrimai tokie kaip: hibridizacija in situ, tėkmės citometrija, imunofluorescenciniai testai, radioimunologiniai ir viruso neutralizacijosmetodai taip pat taikomi retai (24).
Visgi, nustatant enzootinę galvijų leukozę, populiariausias metodas, tai imunofermentinė analizė. Tačiau serologija nėra patikima veršeliams, kurie yra gavę priešpienio iš GLV teigiamų karvių, nes taip įgyjami pasyvūs motininiai antikūnai. Motininiai antikūnai veršeliams nyksta 4 - 6 mėnesių amžiaus (18).
Enzootinės galvijų leukozės tyrimai gali būti atliekami iš pieno (jeigu bandoje yra daugiau kaip 30 proc. melžiamų karvių) arba iš kraujo (43).
1.7 Gydymas ir likvidavimo priemonės
Galvijų enzootinės leukozės gydymo nėra, gyvuliai turi būti skerdžiami (43). Specifinių kovos priemonių (vakcinų, serumų) taip pat nėra. Nepaisant didelės pažangos moksliniuose tyrimuose, komercinė vakcina EGL kontrolei vis dar nesukurta (44). Tik parenterinių kortikosteroidų naudojimas gali laikinai sumažinti klinikinių požymių pasireiškimą.
Buvo sukurtos ligos likvidavimo programos, tačiau jos nebuvo labai sėkmingos, nes programų įdiegimas brangiai kainuoja. Dažniausiai naudojamas likvidavimo priemonių planas:
1) nustatyti užkrėstus gyvūnus, naudojant serologinius tyrimus, 2) iš karto išbrokuoti seroteigiamus galvijus,
3) užkrėstuose ūkiuose, kas 30-60 dienų, pakartotinai tirti gyvulius,
4) naudoti PGR, testuojant jaunus veršelius, ir kaip papildomą testą, patvirtinant rezultatus bandų su mažai išplitusia infekcija,
5) papildomai testuoti bandą ir brokuoti gyvulius tol, kol visi mėginiai bus neigiami.
Tuomet tie galvijai testuojami kas 6 mėnesius. Banda pripažįstama laisva nuo enzootinės galvijų leukozės tada, kai 2 metus iš eilės nerandama nei vieno teigiamo atvejo (18).
Testavimas ir skerdimas yra praktinis metodas bandose su mažai išplitusia infekcija. Tačiau skerdimas ir sveikų nuo sergančių atskyrimas – pergrupavimas nėra geras būdas dideliuose komerciniuose ūkiuose, nes tai yra labai neekonomiška.
Regioninių lygiu, pagrindinis kontrolės būdas yra įvertinti ligos paplitimą, naudojantis nacionalinėmis serologinėmis duomenų bazėmis (24).
20
1.8 Prevencija
Galvijų leukozės prevencijoje labai svarbu, kad užkrėstas kraujas iš sergančių gyvūnų nepatektų sveikiems. Veršeliams propaguojamas priešpienio girdymas iš seroneigiamų karvių, nors epidemiologiniai duomenys rodo, kad priešpienyje esantis antikūnų apsauginis efektas yra didesnis, nei rizika užsikrėsti per jas. Pieno pakeitimas aukštos kokybės pieno pakaitalu, nepasterizuoto priešpienio vengimas, girdant veršelius iš GLV teigiamų karvių, taip pat yra prevencijos priemonė prieš šio viruso plitimą (18, 45).
Nuraginant gyvulius turėtų būti naudojamas termokauteris. Labai svarbu, kad įrankiai ir įvairūs prietaisai, naudojami gyvulių kastracijai, tatuiravimui, žiedų ar įsagų vėrimui, būtų gerai valomi ir dezinfekuojami. Tai reikia daryti tarp kiekvienos atskiro gyvulio procedūros (46).
Transmisiją galima sumažinti keičiant rektinei palpacijai skirtas pirštines po kiekvienos karvės tyrimo (44, 47). Darant dirbtinį apvaisinimą ar embrionų transplantaciją reiktų naudoti tik serologiškai neigiamus recipientus, nes tai taip pat gali apriboti infekcijos plitimą. Galvijų bandose reprodukcijai renkami tik tokie buliai, kurie yra seroneigiami, nors galvijų leukozės viruso išskyrimas iš spermatozoidų ir nebuvo aprašytas. Naudojant tik sveikų bulių spermą, galimybė užkrėsti karves vis tik išlieka, jei traumuojami jų lytiniai takai (18).
Papildomas atsargumo priemones apima visų įrankių, kurie turėjo kontaktą su kūno ar kraujo audiniais, dezinfekcija. Kraujo ėmimui ar intraraumeninėms injekcijoms turi būti naudojamos tik vienkartinio naudojimo adatos. Taip pat tokias adatas vertėtų naudoti ir vakcinuojant, nors EGL viruso perdavimas per poodines injekcijas yra mažai tikėtinas (18, 45).
Norint sumažinti infekcijos perdavimo tikimybę, būtina taikyti kraujasiurbių kontrolę. Kraujo perpylimas yra ypač stiprus veiksnys, kuris gali įtakoti užsikrėtimą leukoze, todėl donorai turi būti itin kruopščiai tikrinami (18,46).
Infekcijos plitimui kelią galima užkirsti ribojant naujagimių veršelių kontaktą su GLV užsikrėtusiais galvijais. Reiktų stengtis atskirti infekuotus gyvulius nuo neinfekuotų, brokuoti galvijus, kuriems jau pasireiškusi limfocitozė (45).
21
2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA
Tiriamasis darbas atliktas Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Veterinarijos akademijoje Užkrečiamųjų ligų katedroje ir Nacionalinio maisto ir veterinarijos rizikos vertinimo instituto Serologinių tyrimų skyriuje.
Per 2008 – 2014 metus buvo ištirti 169 764 galvijų kraujo serumo mėginiai. Mėginiai tirti šiais metodais: imunofermentinės analizės metodu, imunodifuzijos reakcija agaro gelyje.
Diagnozuojant galvijų leukozę būtina:
Vadovautis Lietuvos Respublikos veterinarijos įsakymu (Žin., 1992, Nr.2-15) ir įgyvendinti 1964 m. birželio 26 d. Tarybos direktyvos 64/432/EEB „Dėl gyvūnų sveikatos problemų ir jų poveikio prekybai galvijais ir kiaulėmis bendrijoje nurodymus“.
Vykdyti Valstybinės maisto ir veterinarijos tarnybos (VMVT) ligų stebėsenos planus, bei VMVT Direktoriaus 2004 m. balandžio 20 d. įsakymą Nr.B1-349 „Dėl prekybos galvijais ir kiaulėmis veterinarijos reikalavimų patvirtinimo“.
2.1 Imunofermentinės analizės metodas
Galvijų kraujo serumai buvo tirti naudojant „ELISA Bovine leukosis Serum Screening“ Prancūzijos „Pourquier“ instituto gamybos rinkinį, kuris skirtas nustatyti visus (paviršinius proteinus, kapsulinius ir kt.) antikūnus prieš GLV virusą.
IFA metodo, specifiškumas priklauso nuo antigeno švarumo. Būtent, dėl monokloninių antikūnų prieš GLV antigenus gp51 ir p24, padidėja IFA jautrumas ir specifiškumas. Šiuo metodu galima nustatyti labai mažas antikūnų prieš GLV koncentracijas kraujo serume. Nepaisant didelio IFA metodo jautrumo, priešvirusiniai antikūnai piene nustatomi tada, kai jų kiekis kraujo serume būna gana didelis (48).
2.1.1 Principas
Visos polistirolinės mikroplokštelės duobutės padengtos virusiniu antigenu. Antigenas yra paruoštas iš ląstelių kultūros, t.y. GLV užkrėstų ląstelių linijų. Embrioninis ėriuko inkstas-ląstelės dažniausiai naudojamos komerciniams testams. Nuo 2007 metų naudojama nauja GLV gaminamų ląstelių linija, P0714, kuri yra laisva nuo kitų virusinių linijų (44).
Tiriamieji serumai skiedžiami 1/20 (trumpoji inkubacija) ar 1/50 (ilgoji inkubacija) ir inkubuojami polistirolinių mikroplokštelių duobutėse, kurios yra padengtos antigenu. Serume esantys specifiniai GLV antikūnai sudaro GLV-antikūnų imuninį kompleksą ir lieka duobutėse.
22 Po plovimo, įpilus konjugatą, jame esantys imunoglobulinai prisijungia prie duobutėse esančio imuninio komplekso.
Po sekančio plovimo fermentinis substratas (TMB), sąveikoje su konjugatu, sudaro mėlynos spalvos kompleksą, kuris, sustabdžius reakciją, tampa geltonas. Susidariusios spalvos intensyvumas tiesiogiai priklauso nuo kraujo serume esančių antikūnų kiekio.
Teigiamos reakcijos riba (cut off) nustatoma, naudojant kontrolinį serumą, pateikiamą kartu su rinkiniu (teigiama kontrolė), kuri yra priderinta prie Europos standarto E4, skiesto 1/100 neigiamu galvijų kraujo serumu. Ši teigiama kontrolė turi būti dedama į kiekvieną mikroplokštelę (48).
2.1.2 Metodo atlikimas
1. Prieš tyrimą patikrinti rinkinio galiojimo laiką, įvertinti ar nepasikeitė pradėtų naudoti reagentų spalva, konsistencija ir kt.
2. Rekomenduotina su visais rinkinio komponentais dirbti +21°C (±5°C). Todėl visus reagentus, išskyrus konjugatą ir kontroles, 1 val. palaikyti kambario temperatūroje, kad sušiltų.
3. Serumų išpilstymas ir inkubavimas:
3.1. Serumus galima išpilstyti ir inkubuoti dviem būdais:
Trumpoji inkubacija: 1 val. (±5 min.), + 37°C (±3°C). Serumus (kontroles ir mėginius) skiesti 1/20 antigenu padengtoje mikroplokštelėje:
190 µl „Skiedimo buferio 2“į visasduobutes, 10 µl neskiestos neigiamos kontrolės į A1, 10 µl neskiestos teigiamos kontrolės į B1 ir C1,
10 µl kiekvieno tiriamojo mėginio (serumo ar jungtinio serumo) į likusiasduobutes (vienaduobutė vienam mėginiui).
Ilgoji inkubacija: inkubuojama per naktį, +5°C (±3°C). Serumus (kontroles ir mėginius) atskiesti 1/50 ir pernešti į antigenu padengtą mikroplokštelę:
200 µl neskiestos neigiamos kontrolės į A1, 200 µl neskiestos teigiamos kontrolės į B1 ir C1,
200 µl kiekvieno tiriamojo mėginio (serumo ar jungtinio serumo) į likusias duobutes (viena duobutė vienam mėginiui).
3.2. Homogenizuoti duobučių turinį, t.y. švelniai sukratyti plokštelę.
23 6 pav. Kontrolių ir mėginių išpilstymas mikroplokšelėje (48)
4. Mikroplokštelės plovimas: plokštelių duobutes užpildyti „plovimo tirpalu“ (po 300 µl plovimo tirpalo į kiekvieną mikroplokštelės duobutę) ir vėl išpilti. Jeigu plauname rankiniu būdu, po išpylimo mikroplokštelę gerai „išmušti“ į sugeriamąją servetėlę, kad iš duobučų pasišalintų visas skystis. Šią procedūrą pakartoti dar 2 kartus.
5. Konjugato išpilstymas ir inkubavimas:
5.1. Įpilti po 100 µl atskiesto 1/100 konjugato į kiekvieną mikroplokštelės duobutę.
5.2. Uždengti mikroplokštelę (dangteliu, aliuminio folija ar lipnia juosta) ir inkubuoti 30 min. (± 3min.) +37°C (± 3°C) temperatūroje.
6. Mikroplokštelės plovimas: kartoti punktą nr. 4. 7. Rezultatų išryškinimas:
7.1. Įpilti po 100 µl substrato tirpalą į kiekvieną mikroplokštelės duobutę. 7.2. Inkubuoti 20 min. + 21°C (± 5°C) temperatūroje (saugoti nuo šviesos). 8. Reakcijos sustabdymas:
8.1. Įpilti po 100 µl „Stop“ tirpalo į kiekvieną mikroplokštelės duobutę.
8.2. Švelniai sukratyti plokštelę, kad skystis homogenizuotųsi. Nuvalyti mikroplokštelės dugną. 9. Reakcijos nuskaitymas: spektrofotometro pagalba 450 nm (OT 450) šviesos bangos ilgyje išmatuoti optinį tankį. Prieš tai išmatuoti „tuščią“ vertę, t.y. orą (44, 48).
2.1.3 Rezultatų apskaičiavimas ir aiškinimas
Reikia apskaičiuoti kiekvieno tiriamo mėginio inhibicijos procentą (IP) arba kitaip vadinamą M/T procentą (M/T%).
Formulė M/T% apskaičiavimui: M/T% = 100*[(OT 450 mėginio – OT 450 neigiamos kontrolės)/ (OT 450 teigiamos kontrolės vidurkis – OT 450 neigiamos kontrolės)].
A N 6 B T ... C T D 1 E 2 F 3 G 4 H 5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 N – Neigiama kontrolė T – Teigiama kontrolė 1 – Mėginys Nr.1 2 – Mėginys Nr.2 3 – …………
24 Rezultatų aiškinimas:
Jeigu mėginio M/T % yra lygus arba žemesnis už 85 proc., vertinama, kad galvijas ar banda neturėjo kontakto su GLV virusu – „Neigiamas“.
Jeigu mėginio M/T % yra tarp 85 proc. ir 115 proc., vertinama, kad mėginys yra abejotino teigiamumo – „Abejotinas“.
Jeigu mėginio M/T% yra didesnis už 115 proc., vertinama, kad galvijas ar banda turėjo kontaktą su GLV virusu – „Teigiamas“ (48).
2.2 Imunodifuzijos reakcija agaro gelyje
Imunodifuzijos reakcijai atlikti buvo naudojamas „НАБОР для серологической диагностики лейкоза крупного рогатого скота“Rusijos „БИОК“ firmos gamybos rinkinys. Šis rinkinys skirtas antikūnus prieš GLV virusą nustatymui.
IDAG metodas yra specifiškas, paprastas ir lengvai atliekamas, nepritaikytas tyrimams iš pieno mėginio. Šis metodas yra referentinis metodas, naudojamas kitų tyrimo metodu rezultatams pagrįsti arba tiesiog norint juos patvirtinti (49).
2.2.1 Principas
Šis metodas pagrįstas antikūno-antigeno sąveika agaro gelyje, kai atsiranda ryški precipitacijos linija. Antigene turi dominuoti specifinis galvijų leukozės viruso glikoproteinas gp51, bet gali būti ir p24. Kontrolinis teigiamas serumas paruoštas iš natūraliai ar eksperimentiškai infekuotų galvijų.
Antigenas pilamas į centrinę skylutę, o tiriamieji serumai į periferines skylutes. Antigenas ir tiriamųjų serumų antikūnai (jeigu jie yra) juda agaro gelyje. Jų koncentracija mažėja proporcingai skysčių atstumui. Lygiavertiškumo zona tarp gp51 antigeno ir antikūnų susidaro tarp jų skysčių, t.y. susiformuoja precipitacijos linija – antigeno-antikūno kompleksas, kuris matomas plika akimi. Susiformavusi besitęsianti linija tarp kontrolinio serumo skylutės ir skylutės su tiriamuoju serumu, rodo specifinių antikūnų gp51 buvimą tiriamajame serume (49).
2.2.2 Metodo atlikimas
1. Prieš tyrimą patikrinti rinkinio galiojimo terminą, pradėtų naudoti reagentų spalvą, konsistenciją.
2. Užpildyti specialią tyrimui skirtą formą, kurioje nurodytas tiriamųjų ir kontrolinių mėginių išdėstymas Petri lėkštelėje.
25 2.1. Agaro gelyje spaudo pagalba išpjauti „gėlytės“, iš kurių pašalinti agaro diskelius. Jeigu agaras buvo laikomas šaldytuve, prieš darant skylutes, lėkšteles su agaru palaikyti 1–2 val. kambario temperatūroje, kad sušiltų.
2.2. Antigeną pilti į centrinę „gėlytės“ skylutę. Periferinės skylutes užpildyti kontroliniu ir tiriamaisiais serumais. Galimi keli užpildymo variantai:
pirmasis – kontrolinį serumą pilti į 2 diametraliai paralelines viena priešais kitą esančias skylutes, tiriamuosius serumus į likusias 4 skylutes;
antrasis – kontrolinį serumą pilti į 3 periferines skylutes (kas antrą), tiriamuosius serumus analogiškai. Pastarasis variantas palengvina silpnai teigiamos reakcijos aptikimą, bet padidina antigeno sunaudojimą 25 proc.
1 variantas 2 variantas
2.3. Lėkšteles uždengti ir inkubuoti drėgnoje kameroje kambario temperatūroje (20-26°C). Reakciją vertinti po 24, 48 ar 72 val. (49).
2.2.3 Rezultatų vertinimas ir interpretavimas
Tyrimų rezultatus vertinti peržiūrint lėkšteles išsklaidytoje šviesoje, tamsiame fone. Įvertinti susidariusias precipitacijos linijas tarp antigeno ir kontrolinio precipituojančio serumo. Kontrolinė precipitacijos linija turi būti ilga ir ryški.
Rezultatų interpretavimas: Neigiamas tiriamasis serumas:
– agare nesusidaro linija tarp antigeno ir tiriamojo serumo. Teigiamas tiriamasis serumas:
– agare susidaro precipitacijos linija tarp antigeno ir tiriamojo serumo, kuri jungiasi su kontroline precipitacijos linija.
Ag
TS
1
2
TS
3
4
Ag
TS
1
TS
2
TS
3
26 – kartais tiriamasis serumas suformuoja antrą papildomą liniją, kuri yra arčiau tiriamojo
serumo, kas rodo antikūnų prieš p24 GLV antigeną buvimą.
– nėra precipitacijos linijos tarp antigeno ir tiriamojo serumo, tačiau kontrolinė linija suformuoja užlinkimą ties tiriamuoju serumu, nukreiptą link antigeno. Jeigu negalima įvertinti tokio serumo, kaip „teigiamas“ ar „neigiamas“, reakcija kartojama išpilstant serumus 2 variantu.
Testas nevertinamas jeigu teigiamas kontrolinis serumas nedavė laukto rezultato. Visi tyrimo metu gauti „abejotini“ ar „silpnai teigiami“ serumai yra tiriami pakartotinai (49).
Gauti duomenys buvo apdorojami naudojant „Microsoft Excel 2013“ skaičiuoklę. Šios programos pagalba baigiamojo darbo rezultatuose buvo skaičiuojami patikimumų rodikliai. Rezultatai tarpusavyje lyginami tokiu principu: jeigu p<0,05, tai laikome, kad duomenys patikimi ir yra statistiškai reikšmingi, jeigu p>0,05 – laikome, kad duomenys statistiškai nepatikimi.
27
3. TYRIMO REZULTATAI
3.1 Enzootinės leukozės situacija Lietuvos galvijų populiacijoje
Nacionalinio maisto ir veterinarijos rizikos vertinimo instituto (NMVRVI) Serologinių tyrimų skyriuje per 7 metų laikotarpį (2008–2014 metai) ištirti 169764 kraujo serumo mėginiai. Tirti galvijai rajonuose suskirstyti į apskritis: Alytaus, Kauno, Klaipėdos, Marijampolės, Panevėžio, Šiaulių, Tauragės, Telšių, Utenos, Vilniaus (7 pav.) 2010 m. liepos 1 d. Lietuvos Respublikos Seimas panaikino apskričių administracijas.
7 pav. Lietuvos apskritys (50)
Ištyrus 169764 kraujo mėginius IFA ir IDAG metodais, buvo nustatyti 168 teigiami atvejai. Tai sudarė 0,1 proc. visų tirtų galvijų skaičiaus (1 lentelė).
28 1 lentelė. Enzootinės galvijų leukozės viruso nešiotojų paplitimas apskrityse 2008-2014 metais
Eil.
nr. Apskritis
Tirtų mėginių skaičius
Iš viso 2008 -2014 m. Rasta teigiamų 2008 m. 2009 m. 2010 m. 2011 m. 2012 m. 2013 m. 2014 m. vnt. % (proc.) 1. Alytaus 83 342 5530 13241 11085 5312 6279 41872 14 0,03 2. Kauno 797 3765 435 340 259 351 29 5976 1 0,02 3. Klaipėdos 44 12 286 657 389 2 4 1394 2 0,14 4. Marijampolės 555 164 573 345 53 3 29 1722 23 1,34 5. Panevėžio 528 128 168 514 56 92 0 1486 11 0,74 6. Šiaulių 472 1288 2149 10742 7493 150 1 22295 9 0,04 7. Tauragės 1115 231 1698 3363 1468 728 0 8603 8 0,09 8. Telšių 770 302 46 1650 5596 0 0 8364 10 0,12 9. Utenos 773 1256 5629 6732 8877 3932 1880 29079 7 0,02 10. Vilniaus 1167 2521 5725 12825 12901 7917 5917 48973 83 0,17 Iš viso: 6304 10009 22239 50409 48177 18487 14139 169764 168 0,10
3.1.1 Enzootinės galvijų leukozės tiriamumas ir paplitimas apskrityse
Daugiausia mėginių 2008–2014 metais gauta ir ištirta iš Vilniaus (28,85 proc.), Alytaus (24,66 proc.), Utenos (17,13 proc.) apskričių, o mažiausiai iš Klaipėdos (0,82 proc.), Panevėžio (0,88 proc.), Marijampolės (1,01 proc.) (8 pav.).
Atlikus statistinę duomenų analizę, skirtumas tarp 2008–2014 metais Vilniaus ir Klaipėdos apskričių ištirtų mėginių skaičiaus buvo statistiškai reikšmingas (p<0,001).
8 pav. 2008–2014 metais tirtų mėginių procentinė išraiška 24,66 proc. 3,52 proc. 0,82 proc. 1,01 proc. 0,88 proc. 13,13 proc. 5,07 proc. 4,93 proc. 17,13 proc. 28,85 proc. Alytaus Kauno Klaipėdos Marijampolės Panevėžio Šiaulių Tauragės Telšių Utenos Vilniaus
29 Didžiausią procentinę dalį (1,34 proc.) teigiamų mėginių sudarė kraujo serumo mėginiai iš Marijampolės apskrities ūkių. Mažiausias galvijų užsikrėtimas virusu nustatytas Kauno (0,02 proc.), Utenos (0,02 proc.), Alytaus (0,03 proc.), Šiaulių (0,04 proc.) apskrityse. Procentinė teigiamų atvejų dalis šiose apskrityse neviršijo 0,04 proc. ribos (9 pav.).
Atlikus statistinę duomenų analizę, skirtumas tarp didžiausio ir mažiausio galvijų užsikrėtimo apskrityse buvo statistiškai reikšmingas (p<0,001).
9 pav. Enzootinės galvijų leukozės viruso nešiotojų paplitimas pagal apskritis
3.1.2 Enzootinės galvijų leukozės viruso nešiotojų paplitimas 2008 - 2014 metais
Iš surinktų duomenų, apžvelgus enzootinės galvijų leukozės tyrimų dažnumą, matoma, jog 2011– 2012 metais ištirtų galvijų skaičius buvo didžiausias, siekė net 29,69 proc. Lyginant su kitų metų ištirtų galvijų kraujo serumo mėginių skaičiumi, skirtumas buvo gan didelis. 2009 metais dėl EGL ištirta 5,9 proc. visų 7 metų laikotarpyje tirtų galvijų, o 2008 tik 3,71 proc. (10 pav.).
Atlikus statistinę duomenų analizę, skirtumas tarp 2008 ir 2011 metų visų ištirtų mėginių skaičiaus – statistiškai reikšmingas. Tai reiškia, jog tam tikri metai galėjo turėti įtakos mėginių tiriamumui (p<0,001). 0.03 0.02 0.14 1.34 0.74 0.04 0.09 0.12 0.02 0.17 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 Teig iamų at vejų iš rai šk a proc. Apskritys
30 10 pav. Tirtų mėginių skaičiaus procentinė išraiška
Nacionalinio maisto ir veterinarijos rizikos vertinimo instituto Serologinių tyrimų skyriuje 2008– 2014 metų laikotarpyje nustatyti 168 GLV teigiami kraujo serumo mėginiai. Didžiausias teigiamų EGL atvejų skaičius nustatytas 2008 metais, t.y. 54 teigiami kraujo serumo mėginiai. Mažiausiai antikūnų prieš ligos sukėlėją nustatyta 2009 metais, jų buvo rasta tik 5 (2 lentelė).
2 lentelė. Teigiamų atvejų pasiskirstymas pagal apskritis (nuo 2008 iki 2014 metų)
Apskritis
2008 metai 2009 metai 2010 metai 2011 metai 2012 metai 2013 metai 2014 metai
Ištirta Teig. vnt. Ištirta Teig. vnt. Ištirta Teig. vnt. Ištirta Teig. vnt. Ištirta Teig. vnt. Ištirta Teig. vnt. Ištirta Teig. vnt. Alytaus 83 0 342 0 5530 9 13241 5 11085 0 5312 0 6279 0 Kauno 797 0 3765 0 435 0 340 0 259 0 351 1 29 0 Klaipėdos 44 2 12 0 286 0 657 0 389 0 2 0 4 0 Marijampolės 555 2 164 0 573 1 345 0 53 20 3 0 29 0 Panevėžio 528 11 128 0 168 0 514 0 56 0 92 0 0 0 Šiaulių 472 8 1288 0 2149 0 10742 0 7493 1 150 0 1 0 Tauragės 1115 7 231 0 1698 0 3363 1 1468 0 728 0 0 0 Telšių 770 7 302 1 46 0 1650 0 5596 2 0 0 0 0 Utenos 773 3 1256 0 5629 1 6732 3 8877 0 3932 0 1880 0 Vilniaus 1167 14 2521 4 5725 10 12825 19 12901 14 7917 11 5917 11 Iš viso: 6304 54 10009 5 22239 21 50409 28 48177 37 18487 12 14139 11
Nepaisant kiekvienais metais ištirtų mėginių skaičiaus skirtumo, 2009–2014 m. laikotarpio teigiamų atvejų rodiklis buvo panašus – užsikrėtimas EGL varijavo nuo 0,05 proc. iki 0,08 proc.
3.71 5.90 13.10 29.69 28.38 10.89 8.33 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 2008 m. 2009 m. 2010 m. 2011 m. 2012 m. 2013 m. 2014 m. Procentai M et ai
31 Didžiausias enzootinės galvijų leukozės viruso nešiotojų skaičius buvo 2008 metais – 0,86 proc. Mažiausias 2009 metais – iš 10009 ištirtų galvijų, EGL viruso nešiotojais buvo tik 0,05 proc. (9 pav.). Tokį ženklų infekuotų gyvulių sumažėjimą nuo 2008 iki 2009 metų galėjo nulemti griežtos EGL kontrolės ir likvidavimo priemonės (11 pav.).
Atlikus statistinę duomenų analizę skirtumas tarp 2008 ir 2009 metų teigiamų mėginių skaičiaus buvo statistiškai reikšmingas. Tai reiškia, kad metai turėjo įtakos teigiamai reagavusių mėginių skaičiui (p<0,001).
11 pav. Enzootinės galvijų leukozės viruso nešiotojų dinamika (2008 – 2014 metai)
3.1.3 Enzootinės galvijų leukozės viruso nešiotojų pasiskirstymas pagal amžiaus grupes Analizuojant gautus duomenis, buvo įdomu išsiaiškinti enzootinės galvijų leukozės viruso nešiotojus tarp skirtingo amžiaus grupių gyvulių (0–5 metai, 6–10 metų, 11–15 metų, 16–20 metų). Buvo analizuojami 7 metų laikotarpio EGL teigiamų atvejų duomenys. Iš viso per 2008–2014 metus NMVRVI Serologijos skyriuje dėl EGL ištirti 169764 galvijų kraujo serumo mėginiai, iš kurių 168 turėjo antikūnus prieš EGL. GLV seroteigiamų galvijų skaičiaus dinamika įvairaus amžiaus galvijų grupėse rodo, kad kiekvienais metais didžiausią dalį užsikrėtusiųjų sudarė jauniausios amžiaus grupės, t.y. 0–5 metų individai. Mažiausią dalį infekuotų galvijų sudarė vyriausios amžiaus grupės gyvuliai, t.y. 16–20 metų. Šio amžiaus grupėje nustatyta tik 2013 metais (žr. pried. 1 lentelė). Atskirose amžiaus
0,86 0,05 0,09 0,06 0,08 0,06 0,08 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0.5 0.55 0.6 0.65 0.7 0.75 0.8 0.85 0.9 0.95 1 2008 m. 2009 m. 2010 m. 2011 m. 2012 m. 2013 m. 2014 m. Teigi amų atve jų išr ai šk a proc . Metai
32 grupėse seroteigiamų galvijų procentinė išraiška išsidėstė netolygiai: 0–5 metų amžiaus gyvuliai sudarė 58,33 proc., 6–10 metų - 33,3 proc., 11–15 metų – 7,14 proc., o 16–20 amžiaus grupės individai sudarė tik 1,19 proc. visų seroteigiamų atvejų (12 pav.).
Atlikus statistinę duomenų analizę ir palyginus jauniausią amžiaus grupę su vyriausia, skirtumas tarp jų buvo statistiškai reikšmingas. Taigi galima teigti, kad gyvulių amžius turi įtakos užsikrėtimui GLV (p = 0,00071).
12 pav. Seroteigiamų mėginių procentinė išraiška atskirose amžiaus grupėse
3.1.4 Enzootinės galvijų leukozės viruso nešiotojų pasiskirstymas pagal lytį
Analizuojant gautus duomenis, buvo įdomu sužinoti EGL viruso nešiotojus pagal galvijų lytį (patinai – buliukai, patelės – karvės, telyčaitės) (žr. pried. 2 lentelė). Rezultatai parodė, kad iš 168 seroteigiamų atvejų didžiausią dalį sudarė patelės: karvės – 81,55 proc., telyčaitės – 8,33 proc. Patinai, t.y. buliukai sudarė 10,12 proc. visų infekuotų galvijų (13 pav.).
Tyrimo eigoje nebuvo išsiaiškinta visų dėl EGL tirtų galvijų lytis, tačiau galima teigti, jog didžiausia dalis iš jų yra karvės. Tai galima paaiškinti tuo, kad Lietuvoje beveik 50 proc. visų laikomų galvijų sudaro būtent karvės (51).
Atlikus statistinę duomenų analizę ir palyginus seroteigiamų galvijų skaičių tarp patelių ir patinų, skirtumas tarp jų buvo statistiškai reikšmingas (p<0,001).
58.33 33.33 7.14 1.19 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 60.00
0-5 metų 6-10 metų 11-15 metų 16-20 metų
P
ro
centai
33 13 pav. Seroteigiamų mėginių procentinė išraiška pagal lytį
3.1.5 Seroteigiamų galvijų pasiskirstymas pagal veislę
Analizuojant teigiamų atvejų duomenis, buvo aktualu išsiaiškinti seroteigiamų galvijų veisles. Tarp EGL infekuotų buvo žalųjų veislių galvijai – tai Lietuvos žalieji (LŽ), juodmargių veislių galvijai – Lietuvos juodmargiai (LJ), mišrūnų veislių galvijai – žalieji x mėsinių veislių (ŽM) ir juodmargiai x mėsinių veislių (JM), bei vietinių veislių galvijai – vietiniai baltnugariai (VB) ir vietiniai šėmieji (VŠ) (žr. prieduose 3 lentelė). Tarp šių šešių veislių daugiausia leukoze sirgo Lietuvos juodmargiai – 109 gyvuliai (64,88 proc.) Mažiausią dalį užsikrėtusiųjų sudarė vietiniai šėmieji ir vietiniai baltnugariai. Iš seroteigiamų galvijų grupės, jų rasta tik po 1- ieną gyvulį (0,6 proc.) (14 pav.).
Iš gautų duomenų rezultatų, aiškiai matyti, jog didžiausia procentinė dalis viruso nešiotojų priklausė pieninių galvijų veislėms – Lietuvos juodmargiams ir Lietuvos žaliesiems. Iš viso pieniniai galvijai sudarė 92,26 proc. visų gyvulių, kurie turėjo antikūnus prieš ligos sukėlėją. Tai galima paaiškinti tuo, kad karvės, kurios turi aukštą primilžio ir pieno riebumo genetinį potencialą, dažniausiai yra silpnesnės imuninės sistemos (52). Tai pat tokius rezultatus galėjo įtakoti tai, kad daugiausia Lietuvoje laikoma pieninių veislių galvijų: Lietuvos juodmargių apie 70 proc., Lietuvos žalųjų apie 25 proc. (53).
Atlikus statistinę duomenų analizę ir palyginus seroteigiamų galvijų skaičių tarp veislių, skirtumas tarp jų buvo statistiškai reikšmingas (p=0,0012). Galvijų veislės galėjo turėti įtakos enzootinės galvijų leukozės užsikrėtimui.
34 14 pav. Seroteigiamų galvijųprocentinė išraiška pagal veislę
3.2 Seroteigiamų mėginių patvirtinamasis tyrimas imunodifuzijos reakcija
NMVRVI visi gauti galvijų kraujo serumo mėginiai dėl EGL tiriami IFA metodu. Gavus teigiamą reakciją ir norint ją patvirtinti, ar pagrįstai abejojant dėl tyrimo rezultatų, yra naudojamas IDAG metodas. Taip pat IDAG atliekama ir tada, kai IFA reakcijos nuskaitymo metu, gautas mėginio optinis tankis būna labai artimas „Abejotino“ ribai.2008–2014 metais NMVRVI Serologijos skyriuje ištirti 169764 galvijų kraujo serumo mėginiai, iš kurių 168 turėjo antikūnus prieš ligos sukėlėją. Iš nustatytų seroteigiamų mėginių, 151 (89,88 proc.) buvo tiriamas imunodifuzijos reakcija (3 lentelė).
3 lentelė. Seroteigiamų mėginių tyrimas IDAG metodu
Tyrimo metodas
Seroteigiami mėginiai Iš viso 2008-2014 m.
2008 m. 2009 m. 2010 m. 2011 m. 2012 m. 2013 m. 2014 m. skaičius proc. IFA Teigiami 54 5 21 28 37 12 11 168 100 IDAG Teigiami 47 5 20 26 30 12 11 151 89,88 Netitrti 7 0 1 2 7 0 0 17 10,12
Tik 10,12 proc. GLV teigiamų mėginių nebuvo pakartotinai ištirti IDAG. Nustatyta, kad tiek IFA metodu, tiek IDAG metodu 151 tirtas mėginys buvo įvertintas teigiamai (p<0,001).
64.88 27.38 5.36 1.19 0.60 0.60 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 60.00 65.00 70.00 Proc en ta i Veislė LJ LŽ JM ŽM VŠ VB
35
4. REZULTATŲ APTARIMAS
Šiame 2008–20014 m. laikotarpį apimančiame tyrime, Lietuvos teritorija buvo suskirstyta į buvusias apskritis: Alytaus, Kauno, Klaipėdos, Marijampolės, Panevėžio, Šiaulių, Tauragės, Telšių, Utenos, Vilniaus. Daugiausiai kraujo serumo mėginių į NMVRVI Serologijos skyrių buvo atsiųsta iš Vilniaus – 28,85 proc. ir Alytaus – 24,66 proc. apskričių, mažiausiai iš Klaipėdos – 0,82 proc., bei Panevėžio – 0,88 proc. Didžiausią procentinę dalį (1,34 proc.) teigiamų mėginių sudarė kraujo serumo mėginiai iš Marijampolės apskrities. Mažiausiai antikūnų prieš ligos sukėlėją turėjo galvijai iš Kauno, Utenos apskričių (0,02 proc.). Lyginant su 1988 – 1996 metų duomenimis daugiausia užsikrėtusių galvijų buvo Šiaulių, Panevėžio ir Vilniaus, mažiausiai – Klaipėdos apskričių ūkiuose (5). Enzootinės galvijų leukozės paplitimui apskrityse įtakos gali turėti prevencinių priemonių laikymasis: sterilių instrumentų naudojimas veterinarinio, zootechninio ir ūkinio gyvulių aptarnavimo, ypač atliekant manipuliacijas su gyvūnų krauju.
Kiekvienais metais galvijų skaičius šiek tiek svyruoja. 2008 metų pradžioje Lietuvoje iš viso buvo 787900 galvijų. Iki 2014 metų pradžios jų sumažėjo 9 proc. (54). NMVRVI Serologinių tyrimų skyriuje 2008 – 2014 metais dėl enzootinės galvijų leukozės (EGL) ištirti 169764 gyvuliai. Iš jų 0,1 proc. buvo seroteigiami t.y. turėjo antikūnus prieš GLV. Palyginus gautus duomenis su ankstesniais (1988–1997 m.) Lietuvoje atliktais tyrimais, galvijų enzootinės leukozės viruso nešiotojų iki šių dienų ženkliai sumažėjo. Daugiausia GLV užsikrėtusių galvijų buvo 1988–1992 m. Vėliau nuo 1994 iki 1996 m. leukoze sergančių ir infekuotų galvijų Lietuvos ūkiuose pradėjo mažėti. 1997 m. užsikrėtusiųjų buvo tik 3,6 proc. (5). Analizuojant 2000–2004 metais Lietuvoje atliktą tyrimą, galima buvo pastebėti, kad EGL yra viena iš virusinių ligų, kuriai likviduoti panaudota daugiausia lėšų. Tuo laikotarpiu infekuotų galvijų skaičius sumažėjo nuo 0,85 proc. iki 0,23 proc. (2). Jau 2008 metais galvijų brokavimas dėl leukozės tesudarė 0,03 proc. visų brokuojamų galvijų skaičiaus (9).
Kaimyninės šalies – Latvijos epidemiologinė situacija einant metams kito panašiai, kaip ir Lietuvos. Nuo 1991 iki 2005 metų galvijų užsikrėtimas EGL smarkiai sumažėjo. Šiuo laikotarpiu ligos paplitimas krito nuo 27 proc. iki 0,05 proc. (žr. prieduose 1 pav.) (55).
Europoje daugelis šalių šiuo metu jau yra oficialiai laisvos nuo enzootinės galvijų leukozės. 2013 metais Europos komisija galvijų ir kiaulių metiniame pranešime pateikė informaciją, kad 20 Europos valstybių jau yra oficialiai laisvos nuo šios ligos. Nors Italija, Lenkija, Portugalija, Anglija nėra visiškai nepriklausomos, tačiau daugelis jų regionų jau turi laisvumo statusą. Belgija, kitaip nei daugelis Europos valstybių, vis dar kovoja su šia liga. Joje oficialiai laisvos bandos nuo EGL sudaro 0 procentų (32).
36 Italijoje 2015 metų tyrime buvo nustatyta, kaip kito galvijų sergamumas Kampanijos, Kalabrijos, Apulijos, Sicilijos regionuose nuo 2005 iki 2012 metų. Užfiksuota, kad šiame laikotarpyje viruso paplitimas tarp gyvulių sumažėjo nuo 0,027 proc. iki 0,015 proc. (35).
Europoje 2013 metais vis dar buvo užregistruota ligos protrūkių. Lenkijoje, keturių mėnesių laikotarpyje, pasireiškė 16 ligos protrūkių. Vokietijoje paskutinis ligos protrūkis užregistruotas 2013 m. spalio mėnesį. Jo metu rasta 454 virusu infekuoti galvijai (56).
Amerikoje ligos paplitimas yra opesnė problema, sergamumas gerokai didesnis nei kitose pasaulio valstybėse. Nuo 1996 iki 2007 metų užsikrėtimas EGL beveik nesumažėjo. 1996 metais ligos sukėlėjo paplitimas tarp pieninių galvijų siekė net 89,0 proc., o iki 2007 metų sumažėjo tik 5,1 proc. (57). EGL šaliai sukėlė rimtų problemų pieno prekyboje. Praradus didelius kiekius pieno, dėl seroteigiamų karvių sumažėjusio primilžio, šalis per 2003 metus neteko 525 milijonų JAV dolerių (58).
2013 metais publikuotame straipsnyje pateikiama informacija, kad JAV iš ištirtų 13859 Holšteino ir Džersio veislės karvių, jų užsikrėtimas EGL buvo net 38 proc. (7).
Atlikus leukozės paplitimo analizę pagal amžiaus grupes, rezultatai parodė, kad daugiausia užsikrėtusių galvijų buvo tarp 0–5 metų individų. Iš visų 2008-2014 metais rastų 168 seroteigiamų atvejų, jie sudarė 58,33 proc. Mažiausia infekuotų galvijų dalis buvo tarp vyriausios amžiaus grupės – 16–20 metų gyvulių (1,19 proc.). 2015 m. Turkijoje atliktame tyrime buvo nustatyta, kad galvijų amžius turi įtakos užsikrėtimo galimybei. Atsižvelgiant į amžiaus faktorių, didesnę infekcijos riziką turi galvijai virš 2-iejų metų amžiaus, nei jaunesni individai. Tyrimo rezultatai atskleidė, kad daugiausia seroteigiamų galvijų rasta tarp 3-7 metų gyvulių. EGL viruso paplitimas tarp jų siekė 3 proc., skirtingai nei tarp 1–2 metų amžiaus gyvulių, tarp kurių ligos paplitimas buvo mažesnis nei 0,5 proc. (35).
B. A. Buxton, Hinkle N. C. ir kitų mokslininkų 1985 m. tyrimas, atliktas su Airšyro ir Holšteino veislės galvijais, parodė, jog veislė turi įtakos EGL plitimui. Jie įrodė, kad Holšteino veislės galvijai leukoze serga dažniau (59). Tai patvirtino ir 2015 metais atliktas tyrimas. Ištyrus 10160 Švicų veislės galvijų kraujo serumo mėginius – 0,28 proc. iš jų turėjo antikūnų prieš ligos sukėlėją. Tai 2 proc. mažiau nei Holšteino veislės galvijų tarpe. Iš 18822 ištirtų šios veislės gyvulių, leukoze sirgo 2,28 proc. (35).
Šio tyrimo rezultatai patvirtino veislės įtaką galvijų leukozės viruso užsikrėtimo dažnumui. GLV buvo rastas tarp šešių skirtingos veislės galvijų: Lietuvos žalmargių, Lietuvos juodmargių, juodmargių x mėsinių veislių, žalųjų x mėsinių veislių, vietinių šėmųjų, vietinių baltnugarių. Pagal gautus rezultatus didžiausia procentinė dalis sergančiųjų gyvulių priklausė pieninių galvijų veislėms –
