Attività di bleaching del β-carotene in tuberi di patata

Lo sviluppo di un metodo di saggio che possa fornire dati sui livelli degli enzimi coinvolti nel catabolismo dei carotenoidi presenta un indubbio interesse per i programmi di selezione di cultivar di specie agrarie con un accresciuto contenuto di questi fitonutrienti. Su richiesta dei coordinatori del progetto ALISAL, l’analisi del bleaching del β-carotene è stata

pertanto applicata anche ai cromoplasti ottenuti da tuberi di patata di genotipi con diversa colorazione. I materiali sono stati forniti dal dott. Giuseppe Mandolino (Centro di Ricerca per le Colture industriali di Bologna) e sono stati congelati in azoto liquido e conservati a -20°C fino all’utilizzo. Sono stati analizzati materiali di 9 differenti genotipi, caratterizzati da pasta bianca (Chacoense, Daifla), gialla (Yema de Huevo, Papapura, ISCI-105) e arancio (Mayan Gold, 7M6, 2R4, ISCI-503).

Come per il riso in Estremo Oriente, anche per la patata la presenza di livelli molto bassi di β-carotene determina in Sudamerica problemi di avitaminosi e conseguenti disturbi della vista. Per questo diversi gruppi hanno tentato di ingegnerizzare questa specie per ottenere cultivar con un più elevato accumulo di carotenoidi. Piante trasformate con il gene CrtB del batterio Erwinia uredovora, codificante per una fitoene sintasi, hanno mostrato un aumento dell’accumulo dei carotenoidi totali di 7 volte in un genotipo a polpa bianca (Desiree) e di circa 3 volte in uno a polpa arancio (Mayan Gold), raggiungendo una concentrazione pari a 78 µg g-1 di peso secco (Ducreux et al., 2005). Con l’inserimento di una breve via metabolica costituita da tre geni (CrtB, fitoene desaturasi CrtI e CrtY) della via

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biosintetica dei carotenoidi di Erwinia sotto il controllo del promotore tubero-specifico PAT si sono ottenuti tuberi a pasta gialla intensa, denominata "golden potato", che mostra un contenuto di carotenoidi totali 20 volte maggiore rispetto al wild type (114 µg g-1) e un contenuto di β-carotene di 47 µg g-1, 3600 volte più alto rispetto al controllo non trasformato (Diretto et al., 2007a). Visto che l’utilizzo di piante geneticamente modificate trova però delle forti resistenze nell’opinione pubblica, la caratterizzazione delle basi della variabilità naturale esistente a questo proposito nel germoplasma di patata potrebbe permettere di ottenere risultati simili attraverso metodi tradizionali di breeding.

I risultati ottenuti applicando il protocollo messo a punto e caratterizzato in pesco ai diversi genotipi di patata sono riassunti in Figura 122. Nei genotipi a pasta bianca (Cachoense e Daifla) l’attività di bleaching risulta essere più elevata rispetto a quelli a polpa gialla e arancio (P < 0.01). Tutti i genotipi a polpa colorata presentano infatti livelli di attività almeno dimezzata rispetto a Daifla e sei volte inferiori rispetto a Chacoense. Questo dato sembrerebbe indicare un possibile ruolo della CCD4 nell’accumulo dei carotenoidi anche nel tubero di patata. Tra i genotipi colorati l’unica eccezione è data dal genotipo Mayan Gold, che è quello maggiormente ricco in carotenoidi; esso presenta infatti valori di attività enzimatica rilevanti: questo dato sembra indicare che anche in alcune cultivars colorate, dove la via di sintesi di tali composti è incrementata, il catabolismo è ancora attivo.

Figura 122. Livelli medi di attività di bleaching del β-carotene in cromoplasti isolati

dalla polpa del tubero di alcune cultivars rappresentative di patata. I genotipi sono posizionati nel grafico in base al contenuto di carotenoidi nel tubero maturo, dalla più bianca (Chacoense)

a quella a maggior concentrazione di tali pigmenti (Mayan Gold).

Bisogna sottolineare che questi risultati sono del tutto preliminari, poichè relativi a una singola determinazione -pur se replicata- su materiali non omogenei. Non è infatti disponibile alcuna informazione sulle possibili variazioni dei livelli di attività in funzione dell’età dei tuberi, elemento che in patata può essere estremamente rilevante visto che essi vengono

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spesso conservati a bassa temperatura per lungo tempo prima di essere consumati. Inoltre, contrariamente a quanto era stato possibile in pesco, in questo caso non si trattava di analizzare sistemi isogenici che differissero solo per il carattere di interesse, ma di esaminare materiali geneticamente del tutto diversi, addirittura appartenenti a 3 specie diverse (Solanum tuberosum, S. pureja e S. chacoense). In simili condizioni, dunque, è più che plausibile che più di un meccanismo possa agire in genotipi diversi per determinare lo stesso genotipo.

A maggior ragione, però, l’aver evidenziato una buona correlazione tra l’attività di bleaching e il contenuto di carotenoidi nei diversi materiali sembra suggerire che l’attività catabolica giochi un ruolo fondamentale anche in patata ai fini della determinazione dei livelli di questi composti nella pasta del tubero. Se questo fosse confermato, un processo di breeding mirato alla selezione di bassi livelli della CCD4, o il suo silenziamento mediante tecniche di ingegneria genetica, potrebbe fornire le basi per l’ottenimento di patate ricche di questi metaboliti secondari. Fino ad oggi, al contrario, tale obiettivo è stato perseguito quasi esclusivamente mediante la stimolazione della via di sintesi (Diretto et al., 2007a).

A sostegno della potenzialità di tale approccio, un incremento dei livelli di carotenoidi nei tuberi è stato in effetti ottenuto mediante l’espressione del gene Or di cavolfiore, che codifica per una proteina che sembra stimolare la differenziazione dei plastidi in cromoplasti; questa tecnica ha permesso di aumentare fino a 10 volte il loro accumulo rispetto al controllo (Lopez et al., 2008). In un altro lavoro, realizzato da Campbell e collaboratori (2010), è stato studiato il livello di espressione della CCD4 in due cultivars a polpa bianca e in altrettante a polpa gialla, rilevando livelli di espressione più elevati nei genotipi a basso contenuto di carotenoidi. Abbassando questi livelli attraverso la tecnica dell’RNAi si sono ottenuti tuberi con un contenuto di carotenoidi a 5.6 volte maggiore rispetto al wild type. Tale effetto è stato osservato solamente nei tuberi e nei petali, mentre in altri organi, come foglie e radici, la repressione della CCD4, pur evidente, non ha determinato nessuna variazione. Questo potrebbe dipendere dal modo in cui i carotenoidi vengono accumulati nei tessuti verdi (nei cloroplasti) rispetto ai tuberi e ai petali, dove i cloroplasti differenziano in cromoplasti. Oltre alla variazione nel contenuto di carotenoidi, nelle piante transgeniche si è osservato un fenotipo molto simile a quello che si verifica in tuberi conservati al freddo intervallati da periodi a alte temperature: una forma allungata nei tuberi, spesso concatenati tra loro. Questo dato potrebbe indicare un ruolo dei prodotti derivanti dall’attività della CCD4 in risposta a particolari tipi di stress, come ad esempio l’esposizione ad alte temperature.

In conclusione, quindi, sembra che si possa affermare che la CCD4 rappresenti un ottimo target per l’incremento dell’accumulo di carotenoidi anche nei tuberi di patata.