Il presente lavoro si inserisce nel più ampio quadro del progetto ALISAL (Miglioramento
delle proprietà igienico-sanitarie, salutistiche e funzionali di commodity per l’alimentazione dell’uomo e/o degli animali), finanziato dal Ministero delle Politiche Agricole e Forestali. Il compito della Unità Operativa (UO) di Ferrara è quello di contribuire in sinergia con le altre UO coinvolte alla caratterizzazione delle vie biosintetiche e degradative dei carotenoidi e dei polifenoli in frumento duro e pesco, in genotipi divergenti per il contenuto di questi fitonutrienti nelle parti edibili, così da individuare gli enzimi-chiave alla base della loro omeostasi. L’UO perseguirà in particolare la messa a punto dei saggi di attività in vitro degli enzimi di interesse e, se necessario, di protocolli di risoluzione cromatografica di diverse forme isoenzimatiche. Procederà poi alla misurazione dei livelli di attività specifica nei genotipi selezionati, su materiale prelevato negli stadi fenologici di formazione della cariosside di frumento e di maturazione del frutto del pesco, fornito dalle altre Unità. Tali
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attività costituiranno le basi per una successiva purificazione e caratterizzazione di forme alleliche che abbiano mostrato una forte correlazione con il contenuto finale di carotenoidi o polifenoli, così da delucidare le proprietà potenzialmente in grado di determinare un ulteriore incremento del valore nutrizionale di questi alimenti.
Nel piano complessivo delle attività del progetto, l’UO è impegnata in 3 linee di ricerca che si prefiggono lo studio delle vie metaboliche dei fenoli e dei carotenoidi in frumento e pesco, secondo il seguente schema:
Relativamente a queste linee di ricerca, gli obiettivi a priori sono i seguenti:
1.7.1. Pathway dei carotenoidi in frumento duro
Messa a punto in un sistema modello del saggio in vitro degli enzimi responsabili della parziale distruzione dei carotenoidi nella granella di frumento, appartenenti alla famiglia delle lipossigenasi. Verrà utilizzata a questo fine una coltura in sospensione liquida di frumento duro (cv. Ofanto), verificando in stretta collaborazione con l’Unità CRA-CER l’effettiva espressione di tali geni. Dal momento che è noto che in frumento sono presenti 3 forme isoenzimatiche, si provvederà a individuare un protocollo di separazione cromatografica in grado di risolvere tra di loro le diverse isoforme, così da quantificare l’apporto di ognuna all’attività complessiva.
I protocolli ottimizzati saranno applicati al fine di purificare e caratterizzare le tre forme di lipoossigenasi, direttamente da materiale vegetale o mediante espressione dei corrispondenti geni in sistemi eterologhi. Il clonaggio dei geni e il loro inserimento in opportuni plasmidi di espressione è previsto a opera della UO CRA-CER. Con i costrutti da essa forniti si cercherà di ottenere cloni ricombinanti di E. coli o di lievito, in cui l’espressione del transgene verrà indotta e la proteina purificata mediante uno o più passaggi per cromatografia liquida o FPLC.
1.7.1.1. Risultati attesi
Messa a punto e ottimizzazione delle condizioni di saggio e delucidazione preliminare delle proprietà di enzimi sin qui non adeguatamente caratterizzati in frumento. Identificazione e caratterizzazione di varianti geniche/alleliche con diversa efficienza catalitica. Valutazione
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dell’importanza relativa della attività delle lipoossigenasi nel determinare il contenuto finale di carotenoidi nella granella di frumento.
I risultati consentiranno: una verifica di alcune conoscenze sul metabolismo dei carotenoidi, fin qui principalmente acquisite su specie modello, in una specie di grande interesse agrario; la caratterizzazione del ruolo degli enzimi ossidativi che riconoscono i carotenoidi come substrati nel determinare i livelli finali nella granella di questi fitonutrienti, elemento che potrà rivelarsi utile per una successiva fase di breeding tesa a incrementarne la concentrazione in cultivar commerciali.
1.7.2. Pathway dei carotenoidi in pesco
Messa a punto in un sistema modello del saggio in vitro degli enzimi (diossigenasi) responsabili della ossidazione di quantità rilevanti di carotenoidi nella polpa del frutto di pesco. Verrà utilizzato a questo fine materiale di due genotipi contrastanti (Redhaven e il suo mutante bianco) caratterizzati da una forte differenza nella pigmentazione del frutto. Il materiale sarà fornito dalla UO CRA-FRF, che dispone già di dati preliminari sulla espressione dei relativi geni, su cui sarà possibile basarsi per la scelta della fase fenologica in cui raccogliere i campioni. Dal momento che è noto che in pesco sono presenti diverse forme di diossigenasi, si provvederà inoltre a ottimizzare un protocollo di separazione cromatografica, cercando di risolvere tra di loro gli enzimi presenti negli estratti grezzi, così da quantificare l’apporto di ognuno all’attività complessiva.
I protocolli ottimizzati saranno applicati al fine di purificare almeno parzialmente le diverse diossigenasi, e di caratterizzarle soprattutto per quanto riguarda la loro selettività di substrato. Si procederà inoltre a misurare i livelli di attività specifica a tempi crescenti nel corso della maturazione del frutto in 2-4 genotipi contrastanti di pesco. Tali materiali saranno definiti in concerto con le altre UO sulla base dei risultati dello screening su un numero più elevato di genotipi caratterizzati da colore della polpa differenziato, nella gamma dal bianco al giallo arancio, condotto dall’Unità CRA-RPS.
1.7.2.1. Risultati attesi
Messa a punto e ottimizzazione delle condizioni di saggio e delucidazione delle proprietà di enzimi sin qui non adeguatamente caratterizzati in pesco. Valutazione del ruolo della via catabolica nel determinare il contenuto finale di carotenoidi nella polpa del frutto. Caratterizzazione preliminare di varianti alleliche con diversa efficienza catalitica.
I risultati consentiranno: una verifica delle conoscenze sul metabolismo dei carotenoidi, fin qui principalmente acquisite su specie modello, in una specie arborea di grande interesse economico in Italia; l’individuazione del ruolo delle diossigenasi nel determinare i livelli di questi fitonutrienti nei frutti maturi, elemento da utilizzare per una successiva fase di breeding tesa a incrementarne la concentrazione nel prodotto commerciale.
1.7.3. Pathway dei composti fenolici in frumento duro
Messa a punto in un sistema modello (cellule in coltura di frumento duro, cv. Ofanto) dei saggi in vitro degli enzimi che controllano il flusso carbonioso nella via che porta alla biosintesi di antociani e proantocianidine, e precisamente:
- DAHP sintasi, primo enzima del pathway dei composti aromatici - PAL, che incanala la fenilalanina verso la sintesi dei fenilpropanoidi
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- antocianidina sintasi (ANS), che catalizza la conversione dei flavan-3.4-dioli in antocianidine
- antocianidina reduttasi (ANR), che avvia queste ultime alla condensazione in proantocianidine.
Non essendo noti metodi spettrofotometrici di rilevazione diretta della formazione dei prodotti, la cui concentrazione/identificazione dovrà essere ottenuta a termine del saggio mediante analisi chimica o risoluzione mediante HPLC.
I protocolli che sarà stato possibile ottimizzare saranno applicati al materiale fornito dalla UO CRA-GPG al fine di determinare i livelli di attività enzimatica in genotipi di frumento contrastanti, caratterizzati dalla presenza o assenza di polifenoli nel seme. In particolare, sulla base dei dati ottenuti dall’altra Unità nel corso del primo anno di attività e relativi all’analisi metabolomica di un numero elevato (≈75) di genotipi colorati, si sceglierà un gruppo ristretto di varietà caratterizzate dalla presenza di antociani nel tegumento (color porpora) proantocianidine nel tegumento (color rosso) e antociani nell’aleurone (color azzurro), a confronto di un genotipo in cui la presenza di fenoli nel seme sia trascurabile. In queste linee saranno valutati i livelli di attività specifica degli enzimi di interesse. I risultati dovrebbero consentire l’individuazione dell’enzima-chiave, i cui maggiori livelli correlino con un maggiore contenuto finale di fitonutrienti.
1.7.3.1. Risultati attesi
Ottimizzazione delle condizioni di saggio e delucidazione delle proprietà di enzimi sin qui non adeguatamente caratterizzati in frumento. Identificazione dei punti di regolazione del metabolismo fenolico in genotipi a diverso contenuto di polifenoli.
I risultati consentiranno: una verifica delle conoscenze sul metabolismo dei fenoli, fin qui acquisite su specie modello, in una specie di grande interesse agrario; l’individuazione dei punti-chiave nella regolazione del flusso carbonioso nella via di sintesi di questi fitonutrienti, che potrà rivelarsi utile per una successiva fase di breeding tesa a incrementarne la concentrazione in cultivar commerciali.
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