Regolazione della biosintesi dei carotenoid

Il contenuto di carotenoidi è estremamente variabile tra specie diverse, ma anche tra i diversi organi di una stessa pianta (Tanaka et al., 2008). La loro biosintesi è regolata sia in

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relazione a stimoli endogeni di tipo fisiologico, come ad esempio l’evoluzione del cloroplasto a cromoplasto, che di tipo ambientale, come l’esposizione ad una forte irradiazione che induce la carotenogenesi. Ecco allora che la sintesi di questi composti è regolata durante tutto il ciclo di vita della pianta, con variazioni sostanziali durante germinazione, fotomorfogenesi, fotosintesi, maturazione di fiori e frutti e anche in risposta a svariati tipi di stress.

La quantità di carotenoidi che si possono trovare in una pianta è data dalla sommatoria tra la loro biosintesi e la loro degradazione: in molti casi è proprio quest’ultima che risulta prevalente nel determinarne il contenuto finale; alcuni tessuti vegetali, infatti, contengono solo tracce di carotenoidi nonostante esprimano la via biosintetica. La regolazione sembra avvenire prevalentemente a livello trascrizionale, ma può verificarsi in misura minore anche a livello post-trascrizionale, con feedback da prodotto e con meccanismi di controllo epigenetico (Sandmann et al., 2006).

Il primo punto di regolazione della sintesi dei carotenoidi è a carico della DXS, ancor prima della sintesi del MEP. L’espressione di questo enzima risulta infatti essere organo- specifica e la sua trascrizione aumenta sostanzialmente durante la maturazione della bacca di pomodoro: consequenzialmente all’aumento di DXS si osserva un incremento della trascrizione di PSY e dell’accumulo di carotenoidi (Lois et al., 2000). La sovraespressione di DXS e DXR in A. thaliana provoca un innalzamento del contenuto di carotenoidi del 13% nei semi, mentre esperimenti di RNA-silencing di DXS lo riducono del 12% (Carretero-Paulet et al., 2006). Un secondo punto di regolazione è a carico della HDR, enzima che catalizza la produzione di IPP e DMAPP; l’incremento della trascrizione del gene corrispondente, correlata all’aumento del contenuto di carotenoidi, è stata osservata in frutti di pomodoro in maturazione e in semi di A. thaliana. Un gruppo di ricerca spagnolo ha effettuato un esperimento in cui la sovraespressione della HDR di Solanum lycopersicum in A. thaliana ha aumentato l’accumulo di β-carotene e luteina nei cloroplasti, ma non negli ezioplasti (Botella- Pavia et al., 2004). La disponibilità dei precursori rappresenta quindi un fondamentale elemento di regolazione e la produzione di unità isopreniche è a sua volta legata a fattori biotici e abiotici (come la luce), che possono alterare l’espressione dei geni della via del MEP (Cazzonelli e Pogson, 2010).

Il più importante punto di regolazione nella biosintesi dei carotenoidi è comunque ritenuto essere l’enzima PSY: studi di sovraespressione ne hanno infatti evidenziato il ruolo chiave nell’indirizzare il flusso dei precursori verso il pathway di questi composti (Fray et al., 1995;_{Rodr guez-Villalón et al., 2009). La trascrizione dei geni PSY subisce un incremento in} risposta a elevata illuminazione, temperatura, fotoperiodo, stress salino e siccità, e al trattamento con ABA (Cazzonelli e Pogson, 2010). Mentre in A. thaliana vi è un solo gene codificante per la PSY, sono state identificati due o più omologhi in pomodoro, riso, mais e grano tenero. Anche se l’attività della varie PSY sembra essere ridondante, la loro espressione è tessuto specifica: la PSY3 di mais e il suo ortologo in riso, ad esempio, sono sovraespressi nella radici in condizioni di stress salino o siccità (Li et al., 2008a). La rapida scomparsa dei trascritti di PSY2 e PSY3 nella fasi successive alla reidratazione dimostra invece uno stretto controllo della stabilità dei messaggeri. Non sempre però l’abbondanza del messaggero della PSY è correlato all’accumulo finale dei carotenoidi: nelle foglie di mais, ad esempio, è stato evidenziato che una diminuzione del trascritto della PSY1 dovuto alle elevate temperature ha come effetto un aumento del contenuto finale di tali metaboliti (Li et al., 2008b). Sembra infine che i differenti profili di espressione delle varie isoforme di PSY in mais siano correlati alla presenza di promotori regolati dalla luce nel caso di PSY1 e PSY2 e dall’ABA per PSY3. Il trascritto di PSY2 di mais è up-regolato durante la fotomorfogenesi attraverso il pathway del fitocromo: la luce sia rossa che rossa lontana ne aumentano infatti la trascrizione (Welsh et al., 2008).

Ci sono evidenze anche a favore di una regolazione da feed-back indotta dall’accumulo di MEP, carotenoidi e ABA. L’accumulo di acido abscissico in riso porta alla up-regolazione

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di PSY3 che gioca quindi un ruolo importante nelle risposta a stress abiotici. Uno studio condotto su semi eziolati di A. thaliana ha dimostrato come in una pianta transgenica sovraesprimente una PSY vi sia un incremento nell’accumulo degli mRNA della DXS, evidenziando un feedback positivo che stimola la produzione dei substrati della via del MEP. La sola iper-espressione della DXS non è sufficiente però ad innalzare il contenuto finale dei carotenoidi nei semi, dato che conferma l’importanza della PSY come primo vero punto di regolazione della via metabolica.

La carotenogenesi luce-dipendente è stata osservata in numerosi studi, mentre si nota un decremento o addirittura un blocco della sintesi in caso di buio prolungato (Simkin et al., 2003). La regolazione in questo caso è prevalentemente trascrizionale: nelle foglie adattate al buio si ritrovano infatti piccole tracce degli mRNA dei geni PSY, PDS e CRTISO, mentre nelle foglie illuminate i livelli di questi messaggeri sono molto più elevati. Mutanti di A. thaliana che presentano una PDS non in grado di funzionare accumulano fitoene, che agisce da feedback negativo sui geni a monte. Tra gli enzimi che catabolizzano il licopene, ovvero PDS, Z-ISO, ZDS e CRTISO, un importante punto di regolazione risulta essere a carico di quest’ultimo, che promuove l’isomerizzazione dei legami cis in trans, portando alla produzione di all-trans-licopene, che a sua volte funge da substrato per gli enzimi LCYB e LCYE (DellaPenna e Pogson, 2006). Un mutante di pomodoro avente una CRTISO non funzionale (tangerine) accumula cis-carotenoidi nei cromoplasti delle bacche (Figura 21), ma non nei tessuti fotosinteticamente attivi; in questi ultimi, infatti, la reazione di isomerizza- zione effettuata dall’enzima avviene tramite fotoisomerizzazione (Isaacson et al., 2002). Se mutanti tangerine vengono fatti crescere in condizioni di buio, in assenza di fotoisomerizza- zione, si ha accumulo di pro-licopene anche nei tessuti fotosintetici, e la via che porta alla sintesi del licopene viene bloccata.

Figura 21. Pomodori

wild type, che accumulano licopene

nella polpa, e pomodori transgenici

tangerine, a ridotta attività della CRTISO,

che accumulano pro- licopene (Isaacson et

al., 2002).

Questa isomerasi viene regolata anche in modo epigenetico tramite l’enzima metil- transferasico Set Domain Group 8 (SDG8), che interviene metilando l’istone dove è presente il gene CRTISO. L’assenza della SDG8 altera la metilazione della cromatina associata al gene, riducendone la trascrizione e portando alla riduzione della sintesi di luteina e all’incremento della ramificazione dei germogli (Cazzonelli et al., 2009).

Il pathway dei carotenoidi subisce una biforcazione dopo la sintesi del licopene il quale viene utilizzato come substrato dalla LCYB e dalla LCYE per generare rispettivamente β e ε- carotenoidi (Figura 22). In condizioni di scarsa luminosità la pianta ha la necessità di assorbire maggiormente la luce per poter sostenere la fotosintesi; in queste condizioni il ciclo

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foto-protettivo delle xantofille non è di vitale importanza, quindi si assiste ad un incremento della sintesi dei ε-carotenoidi, come la luteina. Nella situazione opposta, in condizioni di luce intensa, la pianta ha necessità di dissipare l’energia in eccesso e il ciclo delle xantofille diventa essenziale: ecco allora che viene intensificata questa volta la via dei β-carotenoidi.

Figura 22. Pathway dei carotenoidi. I tubi cromati simboleggiano i carotenoidi più

abbondanti nei tessuti fotosintetici e i punti di regolazione della via di sintesi. La via è regolata da fattori ambientali (luce), epigenetici e da meccanismi di feedback. Gli imbuti

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In A. thaliana ad esempio non viene osservata alcuna variazione del contenuto di luteina in condizione di scarsa luminosità, mentre si osserva un aumento delle xantofille (e un calo di luteina) dopo un’ora di esposizione a elevata irradianza. L’ottenimento di mutanti privi di una LCYE funzionale con un bassissimo contenuto di luteina ha dimostrato che l’enzima è un punto di controllo per la sintesi di tale metabolita (Cuttriss et al., 2007). L’espressione del trascritto di LCYE è a sua volta soggetto a feedback negativo da parte del tetra-cis-licopene, che si accumula in assenza dell’attività della CRTISO: mutanti deficitari di CRTISO e SDG8 hanno infatti mostrato bassi livelli di mRNA dell’enzima ad attività ciclasica, con una marcata riduzione della produzione di luteina (Cazzonelli et al., 2009).