Espressione eterologa e purificazione della CCD4 di Malus domestica 1 Crescita del ceppo BL21(DE3)pLysS di Escherichia col

Per effettuare l’espressione eterologa del gene della CCD4 di Malus domestica, posta nel vettore di espressione pGEX-4T-1 sotto il controllo del promotore T7 (gentilmente fornito dal prof. F. Huang dell’università di Monaco; Figura 76) si utilizza il ceppo BL21(DE3)pLysS di E. coli. Tale ceppo è infatti stato sviluppato specificamente per l’uso di sistemi di espressione basati sulla RNA polimerasi del batteriofago T7. Mediante l’aggiunta al mezzo di coltura di isopropil-β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG) viene indotta l’espressione di questa polimerasi, che a sua volta determina la trascrizione del gene di interesse. Nonostante ciò, l’espressione

Figura 75. Marcatori di peso

molecolare per l’elettroforesi denaturante su gel di

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della polimerasi T7 a livelli basali potrebbe portare a una instabilità del plasmide, se il gene eterologo codificasse per una proteina tossica: per prevenire ciò il ceppo è dotato del plasmide pLysS (di 4886 bp), che viene mantenuto grazie alla presenza di un gene per la resistenza al cloramfenicolo. Tale plasmide impedisce la trascrizione del gene eterologo in assenza dell’induttore.

Il ceppo batterico viene cresciuto a 37°C su terreno LB, composto da 10 g L-1 NaCl, 10 g L-1 triptone e 5 g L-1 estratto di lievito, a pH 7.5. Per la preparazione del terreno solido viene aggiunto il 12‰ di agar prima della sterilizzazione, che avviene in autoclave a 118°C per 20 min. Dopo la sterilizzazione il terreno viene distribuito in piastre petri di plastica del diametro di 90 mm, nelle quali è già stato posto l’antibiotico. Nel caso del cloramfenicolo, la soluzione stock viene preparata in etanolo puro a una concentrazione di 10 mg mL-1. Esso viene aggiunto al terreno agarizzato a una concentrazione finale di 50 mg L-1, in quello liquido a 25 mg L-1. Il ceppo viene conservato per brevi periodi in piastre madri a 4°C, e rinnovato ogni 2 settimane; per tempi più lunghi, invece, si preparano dei glicerinati risospendendo una coltura a 1.5 - 2.0 A600 in 50% v/v glicerolo sterile; questi sono conservati a -20°C.

2.10.2. Preparazione delle cellule competenti e trasformazione

Con una colonia singola di BL21(DE3)pLysS prelevata da una piastra cresciuta di fresco si avvia un pre-inoculo in 25 mL di LB contenente cloramfenicolo che viene lasciato crescere overnight a 24°C a 100 rpm. La mattina seguente la sospensione ottenuta viene utilizzata per inoculare 30 mL di terreno contenente cloramfenicolo in modo tale da ottenere una assorbanza iniziale A600 < 0.1. I batteri vengono cresciuti a 24°C fino a quando la densità

ottica è pari a 0.2, quando si aggiungono 10 μL mL-1 di una soluzione 2 M MgCl2; si lascia

quindi crescere ulteriormente la coltura fino a ottenere una A600 = 0.45 - 0.55. La coltura

viene a questo punto trasferita in ghiaccio per 30 min. Le cellule batteriche vengono raccolte mediante centrifugazione in una centrifuga Sorvall per 5 min a 10000 g e 4°C. Eliminato il supernatante, si risospende delicatamente il pellet in metà del volume iniziale della soluzione Ca2+/Mn2+ (CH3COONa 40 mM, MnCl2 70 mM, CaCl2 100 mM, portato a pH 5.5 con HCl 1

M e sterilizzato in autoclave a 118°C per 20 min) pre-equilibrata a 0°C, lasciando riposare in ghiaccio per 2 h. Le cellule vengono di nuovo recuperate per centrifugazione e il pellet questa

Figura 76. Rappresentazione

schematica del vettore di espressione pGEX-4-T1

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volta viene risospeso in un decimo del volume precedente di soluzione Ca2+/Mn2+. Dopo ulteriori 60 min a 4°C le cellule possono subire il processo di trasformazione.

A tal fine un’aliquota da 50 µL della sospensione di cellule competenti viene unita a 1 µL della soluzione del plasmide a una concentrazione compresa tra 1 e 10 ng µL-1. Dopo 30 min a 4°C, le cellule sono sottoposte a heat-shock per 45 sec a 42°C senza agitare; immediatamente si diluisce la sospensione con 450 µL di terreno SOC (triptone 10 g L-1, estratto di lievito 5 g L-1, NaCl 5 g L-1, glucosio 10 mM, MgCl2 10 mM e MgSO4 10 mM,

portato pH a 7.5 con NaOH 1 M e sterilizzato in autoclave a 118°C per 20 min). Si pone quindi la sospensione in incubatore per 1 h a 37°C in agitazione. Aliquote da 100, 50 e 10 µL della sospensione sono infine distribuite su piastre selettive contenenti 50 µg mL-1 di cloramfenicolo e ampicillina 100 mg L-1, incubando overnight a 37°C. La mattina seguente si procede al conteggio delle colonie su ogni piastra, risalendo all’efficienza di trasformazione espressa come Unità Formanti Colonia (UFC) µg-1 plasmide.

2.10.3. Induzione della sintesi della proteina eterologa

IL ceppo BL21(DE3)pLysS è dotato dell’operone lac, che viene indotto dall’IPTG, un analogo del galattosio non metabolizzabile, in modo da protrarne nel tempo l’effetto. L’operone lac comprende tre geni, lacZ, lacY e lacA, codificanti per una ß-galattosidasi, una lattosio permeasi e una tiogalattoside transacetilasi che elimina i tiogalattosidi tossici importati dalla lattosio permeasi. La trascrizione dei geni è regolata da due proteine, l’attivatore CAP (Catabolite Activator Protein) e il repressore lac, la cui attività dipende dalle concentrazioni cellulari di glucosio (attivatore) e lattosio (repressore) (Figura 77).

Figura 77. Schema dell’induzione di una proteina eterologa nel ceppo BL21(DE3)pLysS.

Per indurre la produzione della proteina di interesse si avvia un pre-inoculo da una colonia singola in 25 mL di terreno LB contenente cloramfenicolo e ampicillina, incubando overnight a 24°C. Il mattino seguente un’opportuna aliquota del preinoculo viene usata per inoculare 400 mL di LB + antibiotici in una beuta da 2 L, in modo che l’A600 iniziale sia pari

a 0.2. La coltura viene cresciuta a 24°C in agitazione a 100 rpm fino al raggiungimento di una A600 compresa tra 0.6 e 0.8, quando si aggiunge l’IPTG ad una concentrazione finale di 1

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termine le cellule sono raccolte mediante centrifugazione a 4000 g per 10 min. Il materiale cellulare così ottenuto viene conservato a -20°C.

2.10.4. Estrazione di cellule batteriche

Le cellule vengono poste ancora congelate in un mortaio di porcellana del diametro di 7 cm, pre-equilibrato alla temperatura del ghiaccio fondente. La pasta cellulare viene addizionata con 2 g g-1 di ossido di alluminio (Al2O3) e si procede con l’estrazione per 5

minuti con l’aiuto di un pestello. L’omogenato viene risospeso in 20 mL g-1 di tampone PBS (10 mM sodio fosfato, pH 7.4, contenente 150 mM NaCl) e centrifugato a 4°C a 10000 g per 10 min. Il supernatante ottenuto costituisce l’estratto grezzo.

2.10.5. Purificazione mediante cromatografia per affinità su GSH-agarosio

La resina di Glutatione Agarosio (Sigma G-4510) consiste in molecole di glutatione legate covalentemente a una matrice d’agarosio (Figura 78). Il sistema GST (Glutathione S- transferase) Gene Fusion System è basato sulla fusione della proteina ricombinante con l’enzima GST di Schistosoma japonicum. Solitamente il frammento della GST è sempre espresso dal lato N-terminale dell’enzima, in maniera tale che l’attività enzimatica della proteina eterologa non subisca variazioni (Parker et al., 1990; Maru et al., 1996). Il sistema GST è compatibile unicamente con l’espressione in E. coli. La purificazione per affinità avviene mediante l’elevata selettività di legame tra il glutatione e la proteina glutatione S- transferasi (GST) fusa all’enzima: il legame avviene tra il solfuro del tripeptide e l’epossido del polisaccaride. Ciò permette di eliminare le impurità presenti nell’estratto, che non vengono trattenute dalla resina nel corso del processo cromatografico. Successivamente si procede con un’eluizione non denaturante mediante passaggio di tampone contenente 5-10 mM glutatione ridotto, che consente di staccare dalla resina la proteina di interesse preservandone la funzionalità e l’antigenicità.

Figura 78. Struttura del glutatione

immobilizzato su resina Sephadex.

La resina, ha una capacità di legame pari a 5-10 mg GST mL-1 e viene conservata a 4°C in una soluzione di NaCl 2 M. La colonna cromatografica, di 1 mL di volume, viene lavata mediante il passaggio di 10 volumi di acqua, e successivamente equilibrata con altrettanti volumi di tampone PBS. L’intero processo cromatografico viene effettuato in camera fredda a 4°C. All’estratto precedentemente preparato viene aggiunto TritonX-100 alla concentrazione finale dell’1% e si carica immediatamente sulla colonna, in cui il flusso viene fatto procedere per gravità. La resina viene lavata 4 volte con 5 mL di PBS contenente 1% TritonX-100 raccogliendo l’eluato in un’unica frazione. L’enzima di interesse viene successivamente eluito con 5 mL di tampone Tris-HCl 50 mM, pH 9.0, contenente 1-10 mM GSH, raccogliendo frazioni da 1 mL di volume.

La colonna viene quindi rigenerata per lavaggio, in successione, con 5 volumi di tampone sodio borato 0.1 M, pH 8.5, contenente 0.5 M NaCl, 5 volumi di acqua distillata, 5

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volumi di tampone sodio acetato 0.1 M pH 4.5 contenente 0.5 M NaCl, 5 volumi di acqua e 5 volumi di 2 M NaCl contenente 1 mM sodio azide, in cui la resina viene conservata.

2.10.6. Idrolisi della GST e purificazione della MdCCD4 mediante FPLC

L’estratto purificato su colonna di GSH-agarosio viene trattato over night con 4 µL di trombina bovina (Sigma T-4648, 374 U mL-1; 1.5 U in 10 mL). Il dosaggio consigliato è pari a 10 U mg-1 di proteine. Il peso molecolare della trombina bovina è pari a 33 kDa (Mann e Batt, 1969). Al termine dell’incubazione il preparato viene iniettato, con le modalità descritte nel paragrafo 2.3.7, sulla colonna MonoQ 5.5 equilibrata in tampone Tris-HCl 50 mM, pH 9.0. L’eluizione avviene mediante un gradiente lineare da 0 a 500 mM NaCl in 50 mL, raccogliendo frazioni da 2.5 mL, che sono analizzate mediante SDS-PAGE.

2.10.7. FPLC per gel-filtrazione su colonna di Superose 12

Il pool ottenuto nel passaggio cromatografico precedente viene concentrato in un volume di 120 µL tramite l’utilizzo di un filtro Millipore con limite di esclusione di 50 kDa. Il campione così ottenuto viene iniettato mediante un loop calibrato da 100 µL su una colonna Superose 12 (10/300 gl, GE Healthcare, 17-5173-01), che presenta un bed-volume di 25 mL e un limite di esclusione di 1000 kDa. La colonna viene eluita in condizioni isocratiche in tampone Tris-HCl 50 mM, pH 9.0, contenente 150 mM NaCl a un flusso di 0.4 mL min-1, e si raccolgono frazioni da 0.2 mL. La resina mostra un elevato grado di porosità e può essere utilizzata fino ad una pressione limite di 20 bar. Per questo durante il riequilibrio prima dell’iniezione si procede a un flusso più basso, pari a 0.25 mL min-1.

2.11. Saggi in vitro per la determinazione dell'attività enzimatica delle diossigenasi