Purificazione delle lipossigenasi di Triticum durum 1 Passaggio desalante su resina Bio-Gel P6DG

In un estratto le proteine possono essere separate dalle piccole molecole quali sali, aminoacidi e zuccheri grazie a un passaggio cromatografico per gel filtrazione. Si utilizza a questo scopo una resina poliacrilamidica (Bio-Gel P6DG, Pharmacia), caratterizzata da un diametro delle particelle idratate pari a 90-180 µm e un intervallo di frazionamento di 1000- 6000 Da. La cromatografia ad esclusione si basa sulle proprietà di setaccio molecolare proprie di numerosi materiali porosi, permettendo la separazione delle molecole del campione in base alla forma e al peso molecolare. I materiali più comunemente utilizzati a questo scopo sono polimeri presenti sotto forma di reticolo tridimensionale poroso che conferiscono proprietà di gel (gel permeation chromatography). Il limite di esclusione della resina Bio-Gel P6DG favorisce il rallentamento delle componenti più piccole, che non entrano nelle sferule della fase stazionaria: l’eluizione dei sali e delle piccole molecole viene ritardata, e possono così essere eliminate in modo inversamente proporzionale alla loro dimensione. Tramite l’ausilio di tale processo cromatografico è possibile separare agevolmente i sali dalle proteine, a patto che il campione caricato presenti un volume inferiore al 20% di quello della colonna utilizzata. Questo passaggio permette quindi la purificazione delle proteine dai sali presenti, inclusi i residui di solfato di ammonio derivanti da un processo del salting-out, che potrebbero avere un’azione inibente sull’attività enzimatica.

Per la preparazione di una colonna da 10 mL di bed-volume vengono pesati 1.5 g di resina che viene idratata in tampone 25 mM Tris-HCl pH 7.5; trascorsi 30 min di riequilibrio alla temperatura di 4°C, la sospensione viene degasata per 3 min mediante l’ausilio di un apparato sotto vuoto. La resina viene quindi impaccata in una colonna di 1.5 cm di diametro e

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equilibrata con almeno 2 volumi di tampone di eluizione, utilizzando la pressione esercitata da un sifone in entrata. La taratura viene effettuata utilizzando una soluzione da 2 mL contenente azocaseina 0.1% e cianocobalamina 0.01% e la presenza dei due marcatori viene rilevata spettrofotometricamente nelle frazioni di eluizione rispettivamente a 440 e 360 nm. Tutto il processo viene effettuato in camera fredda a 4°C e sulla base dei risultati ottenuti si può identificare il profilo di eluizione delle proteine (> 6000 Da) e quello delle piccole molecole (<1355 Da), e decidere quali frazioni conservare per ottenere un recupero maggiore possibile delle proteine contenute nell’estratto eliminando nel contempo gran parte dei sali e dei metaboliti presenti nella cellula. La stessa procedura viene seguita per la preparazione e la taratura di una serie di colonne in maniera da poter essere utilizzate in base ai volumi di estratto da desalare: su una colonna da 100 mL di bed-volume, a esempio, possono essere caricati 20 mL di estratto.

2.3.2. Separazione per cromatografia a scambio anionico

Le proteine presenti in un estratto possono essere separate sulla base della loro carica grazie alla cromatografia a scambio ionico. La resina DEAE Sephacel è costituita da una matrice di particelle di cellulosa a cui sono legati covalentemente dei gruppi dietilammino- etilici (pK  8.5), che comportano un debole scambio anionico. Tali gruppi presentano infatti una carica positiva permanente nell’intervallo di pH 2-9, capace di attrarre molecole con carica netta negativa, comprese le proteine, che vengono così trattenute della fase stazionaria. La resina è di tipo macro-poroso, e presenta un limite d’esclusione di circa 1000 kDa per le proteine globulari.

Si utilizza una colonna di DEAE Sephacel di 1.5 cm di diametro e 30 mL di volume, precedentemente riequilibrata per passaggio di 50 mL di tampone 25 mM Tris-HCl, pH 7.5, contenente 1 M NaCl, in modo che qualsiasi anione presente sia sostituito da ioni cloruro, seguiti da almeno 10 volumi del medesimo tampone privo di sale, fino a che il pH del liquido in uscita dalla colonna sia uguale a quello in entrata. Il tutto viene effettuato a 4°C in camera fredda. Il flusso di eluizione viene mantenuto costante a 1 mL min-1 da una pompa peristaltica in uscita. L’estratto viene caricato su colonna, e le proteine trattenute dalla resina vengono quindi eluite mediante un gradiente lineare da 0 a 100 mM NaCl in 200 mL di tampone. L’eluato viene suddiviso in frazioni (generalmente da 5 mL) mediante l’utilizzo di un collettore automatico.

2.3.3. Salting out mediante aggiunta di (NH4)2SO4

La tendenza di una proteina ad aggregare, che è funzione della composizione amminoacidica di superficie, può essere favorita da diversi metodi, trai i quali l’aggiunta di elevate concentrazioni di sali. L’ammonio solfato è un sale estremamente solubile, ottenibile a un elevato grado di purezza e a costi ridotti, utilizzato comunemente per effettuare la tecnica del salting-out. Questa metodologia consiste nell’aggiungere a un estratto concentrazioni crescenti di sale; l’innalzamento della forza ionica che ne consegue causa la precipitazione selettiva e progressiva delle proteine, a partire da quelle più idofobiche per finire con quelle idrofiliche (Duong-Ly e Gabelli, 2014). L’utilizzo di una quantità di sale pari al 70% della soluzione satura determina l’uscita di soluzione di virtualmente tutte le proteine, che possono così essere sia concentrate che separate dalle piccole molecole, come ioni e amminoacidi, che rimangono in soluzione. Alcune proteine precipitano a basse concentrazioni di sale, altre richiedono concentrazioni vicine a quelle saturanti: l’utilizzo di concentrazioni opportune ammonio solfato può quindi consentire l’eliminazione di buona parte delle proteine presenti nell’estratto e il recupero quasi integrale di quella di interesse.

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Prove preliminari hanno mostrato che in estratti cellulari di Ofanto l’aggiunta di 226 mg (NH4)2SO4 mL-1, pari al 40% di saturazione a 4°C, determina la quasi totale precipitazione

delle LOX e un allontanamento delle proteine ancora solubili, con un arricchimento dell’attività specifica. Il pool ottenuto mediante cromatografia a scambio anionico viene quindi trattato con questa quantità di sale, mescolando ripetutamente e mantenendo in ghiaccio per 5-10 min fino a ottenere la sua completa dissoluzione. In condizioni ottimali le proteine precipitate sono sedimentate per centrifugazione per 10 minuti a 10000 g a 4°C come descritto. Eliminato il superrnatante, il sedimento viene sospeso in un opportuno volume di tampone.

Spesso però, probabilmente per la densità del campione, le proteine precipitate non sedimentano, ma formano un menisco flottante sulla fase liquida. Per recuperare tale materiale si procede a saturare con 15 mL di una soluzione 10 mg mL-1 di BSA un filtro di cellulosa da 0.22 μm (Millipore), posto in un apparato filtrante collegato a una pompa a vuoto. Dopo aver allontanato l’eccesso di BSA tramite lavaggi con acqua distillata, viene effettuato il passaggio del campione sul filtro di cellulosa, che trattiene il precipitato. Il filtro viene quindi trasferito in un tubo Greiner da 50 mL e immerso in un piccolo volume di tampone 25 mM Tris-HCl, pH 7.5, contenente 250 mM NaCl, rimescolando per 15 min così da facilitare la risospensione delle proteine.

2.3.4. Separazione per cromatografia a gel filtrazione

Il campione ottenuto, in un volume di 5 mL, viene caricato su una colonna per gel filtrazione di Sephacryl S200 (Pharmacia), con un diametro di 2.5 cm e un bed-volume di 200 mL, riequilibrata nello stesso tampone a un flusso di 0.5 mL min-1. La presenza di sale nel tampone consente di evitare l’aggregazione delle proteine. Questa resina ha la proprietà di rallentare le proteine con peso molecolare inferiore a 250 kDa, e un’aggregazione proteica potrebbe portare alla formazione di complessi con peso molecolare superiore al limite di esclusione. La colonna viene eluita con 350 mL di tampone, raccogliendo frazioni da 2.5 mL.

2.3.5. Cromatografia negativa su colonna di Reactive-Blue sepharose

Una colonna di Reactive-Blue sepharose di bed-volume pari a 5 mL viene riequilibrata tramite il passaggio di 10 mL di tampone 25 mM Tris-HCl, pH 7.5, contenente1 M NaCl, e di 10 volumi di tampone senza sale, mantenendo il flusso a 1 mL min-1 mediante una pompa peristaltica connessa in entrata per evitare la formazione di bolle.

Il pool ottenuto dal passaggio precedente viene portato a 20 mL e desalato su una colonna da 100 mL di bed-volume di BioGel P6DG, ottenendo un preparato di 35 mL. Tale campione viene caricato in colonna, raccogliendo il flow through in un’unica frazione. La colonna viene poi lavata con 10 mL di tampone, raccogliendo l’eluato che viene unito al precedente, ottenendo 45 mL di volume totale.

2.3.6. Cromatografia per adsorbimento su colonna di idrossiapatite

Una colonna di idrossiapatite viene preparata idratando 1.80 g di tale resina in 40 mL di tampone potassio fosfato 10 mM, pH 7.5. Si elimina quindi il liquido in eccesso, che contiene particelle piccole che potrebbero dare problemi aumentando considerevolmente la resistenza della colonna. Si effettua un secondo lavaggio con ulteriori 40 mL di tampone, e poi la resina viene impaccata in colonna. Si ottiene così una colonna di 7 mL di volume che viene riequilibrata tramite il passaggio di 15 mL di tampone potassio fosfato 10 mM, pH 7.5. Il flusso della colonna viene mantenuto a 40 mL ora-1. Al campione ottenuto dalla colonna di Blue-sepharose viene aggiunta una opportuna aliquota di tampone 0.5 M potassio fosfato, pH

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7.5, così da avere una concentrazione finale pari a 10 mM. Dopo il caricamento dell’estratto su colonna si applica un lavaggio con 10 mL di tampone, e le proteine vengono eluite mediante un gradiente da 10 a 200 mM fosfato in 200 mL di volume, raccogliendo frazioni da 2.5 mL. Anche in questo caso l’intero procedimento viene effettuato in camera fredda a 4°C.

2.3.7. Cromatografia liquida ad alta prestazione (FPLC)

Il pool ottenuto dal passaggio cromatografico su colonna di idrossiapatite viene concentrato per centrifugazione in un filtro con cut-off di 30 kDa (Millipore) ottenendo un preparato di 0.5 mL. Tale campione viene diluito a un volume di 10 mL con tampone 25 mM Tris-HCl, pH 7.5, permettendo di diluire la concentrazione di fosfato di 20 volte (2 mM rispetto ai 40 mM iniziali). Il preparato così ottenuto viene iniettato per mezzo di un superLoop (Pharmacia) su una colonna monoQ (Pharmacia) da 1 mL di bed-volume riequilibrata per passaggio di 10 mL di tampone 25 mM Tris-HCl, pH 7.5, contenente 500 mM NaCl e 20 mL di tampone senza sale a un flusso di 0.5 mL min-1. Si lava quindi con 2 mL di tampone e si eluisce mediante un gradiente da 0 a 50 mM NaCl in 3 mL e un secondo gradiente 50 a 200 mM NaCl in 25 mL, leggendo l’eluato a 280 nm. Durante il gradiente vengono raccolte frazioni da 0.5 mL di volume, che vengono poste immediatamente a 4°C.