Livelli di attività di bleaching del β-carotene in frutti di diversi genotipi di pesco

Il protocollo sperimentale in tal modo messo a punto è stato applicato ai materiali forniti dal CRA di Forlì, costituiti da frutti a diversi stadi di maturazione di due coppie isogeniche in cui a seguito di una singola mutazione nel gene della CCD4 si è determinata la variazione del colore della pasta, da gialla a bianca (RedHaven e RedHaven bianca) o viceversa (Caldesi e Cristina 2000) (Adami et al., 2013). I frutti ai diversi stadi di sviluppo sono stati raccolti nel corso della primavera-estate 2012 e immediatamente congelati.

3.2.3.1. Il sistema isogenico RedHaven - RedHaven Bianca

Inizialmente è stata effettuata l’analisi della coppia di genotipi RH, a polpa gialla, e RHB, a polpa bianca, per la quale era già disponibile una caratterizzazione chimica e molecolare nei vari stadi di maturazione del frutto: S1 (circa 35 giorni dopo l’impollinazione [dap]), S2 (circa 50 dap), S3 (circa 90 dap) e S4 (122 dap; Figura 41) (Brandi et al., 2011).

Nonostante l’elevata identità a livello nucleotidico la sequenza amminoacidica predetta per la CCD4 di pesco risulta molto più breve rispetto all’ortologo di melo (427 residui contro 591). Questa differenza è dovuta alla presenza di un microsatellite (CT)8 a monte del codone

di inizio, non presente nella sequenza della MdCCD4, che produce uno slittamento della trascrizione, impedendo la corretta traduzione della proteina. Successive analisi hanno evidenziato la presenza nel germoplasma di pesco di due alleli che presentano un polimorfismo in questo microsatellite: il primo [(CT)8], corrispondente alla sequenza presente

nel database del genoma di pesco, con un microsatellite di 201 bp, e un secondo [(CT)7] più

corto di 2 bp. La sequenza amminoacidica predetta utilizzando il microsatellite (CT)7, che

ripristina il corretto frame shift, risulta essere di 597 aa, molto simile a quella di melo. Una ricerca effettuata con marcatori specifici per i suddetti microsatelliti ha permesso di verificare che entrambe queste linee isogeniche sono eterozigoti e possiedono entrambi gli alleli (CT)7 e

(CT)8. Vi è però una differenza sostanziale: il genotipo a polpa gialla presenta una inserzione

di 6263 bp all’interno dell’introne, con una sequenza molto simile a un retrotrasposone LTR (Gipsy-like), che è assente invece in RHB. Visto che il fenotipo a polpa bianca risulta essere dominante su quello giallo, i due alleli sono stati associati al colore del mesocarpo e denominati y1 (per l’allele (CT)8) e y2 (per l’allele (CT)7 contenente l’inserzione). L’allele y1

è presente in entrambi i genotipi, mentre nel fenotipo bianco y2 è retro-mutato in W1, che manca del retrotrasposone: la sua riattivazione determinerebbe la produzione di una forma (più) attiva di CCD4, determinando il bleaching dei carotenoidi.

I risultati ottenuti mediante l’analisi dei cromoplasti isolati dalla polpa dei frutti ai quattro diversi stadi di sviluppo, riassunti in Figura 117, hanno evidenziato un diverso pattern di attività specifica nel corso del processo di sviluppo del frutto delle due varietà. Nel genotipo giallo l’attività di bleaching del β-carotene rimane relativamente costante per tutto il processo di maturazione, per crescere nello stadio finale, mentre in quello bianco si notano livelli elevati di attività enzimatica nella fase iniziale, che calano poi gradualmente, fino a scomparire quasi completamente nel frutto maturo.

Comparando i dati ottenuti con quelli relativi al contenuto di carotenoidi nella polpa (Brandi et al., 2011) si può notare una certa correlazione tra il livello di attività specifica e la presenza dei substrati (Figura 118): nel genotipo a polpa gialla il livello di bleaching rimane costante per crescere nello stadio S4, dove la concentrazione di substrato è maggiore.

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Figura 122. Livelli di attività di bleaching dei carotenoidi nei cromoplasti isolati da frutti di

RH e RHB raccolti in diverse fasi di maturazione. I risultati sono sia espressi in rapporto alle proteine totali, sia normalizzati rispetto alla biomassa del frutto. Tutti i dati riportati rappre- sentano la media ± SE ottenuta dall’analisi di 5 repliche indipendenti; dph, days post harvest.

Figura 118. Confronto tra i livelli di attività di bleaching del β-carotene nei cromoplasti di RH e RHB in relazione al suo contenuto nei frutti ai vari stadi di maturazione.

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Viceversa, in RHB gli alti livelli di attività nelle fasi iniziali dello sviluppo del frutto, quando il β-carotene è presente in concentrazioni elevate, diminuiscono in modo drastico nelle fasi tardive, dove la presenza dei substrati scompare. Il quadro generale ottenuto da questo primo esperimento sembrerebbe indicare una induzione dell’attività enzimatica proporzionale alla concentrazione di β-carotene nel frutto, tenendo presente però che i livelli di attività rapportati ai grammi di peso fresco sono decisamente maggiori (P < 0.05) nel genotipo a polpa bianca dove allo stadio S1 raggiungono circa i 15 pKat g-1. L’ipotesi che i livelli di attività della CCD4 siano più alti in tessuti dove sono presenti elevati livelli di carotenoidi è coerente con i risultati ottenuti in alcuni lavori su altre specie, come a esempio in C. sativus (Rubio et al., 2008) e in petali e tuberi di patata (Campbell et al., 2010), dove si è dimostrato che il livello di espressione è finemente correlato alla disponibilità di substrato.

3.2.3.1.1. Induzione di anticorpi policlonali contro la PpCCD4 e analisi immunologica dei cromoplasti isolati dai frutti di pesco

I dati ottenuti non erano però in accordo con quanto descritto in precedenza sullo stesso sistema, cioè che i livelli di RNA messaggero per la CCD4 erano più elevati nel genotipo RHB che in RH proprio nelle fasi terminali del processo di sviluppo (Brandi et al., 2011). Tale discrepanza potrebbe essere dovuta a una diversa stabilità dell’enzima, una volta prodotto. In alternativa, però, la stessa differenza avrebbe potuto dipendere dalla presenza nei cromoplasti di altri enzimi in grado di catalizzare il bleaching del β-carotene. Il saggio utilizzato, infatti, non consente di attribuire con certezza alla CCD4 l’attività misurata. Per ottenere maggiori indicazioni relativamente al fatto che i risultati ottenuti nel sistema RH- RHB potessero essere riferiti effettivamente alla PpCCD4, si è tentato di rilevare fisicamente la presenza della proteina. A tal fine, si sono indotti anticorpi policlonali specifici per tale enzima. Non disponendo della proteina purificata, sulla base della sequenza dedotta da quella genica sono stati disegnati due diversi peptidi immunogenici, che sono stati sintetizzati da un service esterno (Proteogenix, Schiltigheim, France):

 PEPTIDE1: cys-GLDPSKVPRIGVIPR [MW 1707.08]  PEPTIDE2: cys-IRNGPNPQYLPRGPY [MW 1845.12]

Entrambi i peptidi presentano una lunghezza pari a 15 amminoacidi, più una cisteina iniziale, e hanno un grado di purezza superiore al 95%. Essi sono stati inoltre coniugati con la Keyhole limpet hemocyanin (KLH), una proteina capace di incrementarne l’immunogenicità. Con questi preparati sono stati immunizzati quattro topi (2 esemplari per ciascun peptide), gentilmente messi a disposizione dal Prof. Ottorino Belluzzi (Università di Ferrara). Dopo 3 iniezioni, da ogni animale sono stati ottenuti circa 2 mL di antisiero, che è stato utilizzato per effettuare dei Western blot sugli estratti di cromoplasti di pesco. Malgrado diversi tentativi, utilizzando anche diverse metodologie di estrazione della frazione proteica, non si è riusciti a ottenere una banda singola quantificabile del peso molecolare atteso in quanto la proteina non permeava nel gel di poliacrilammide, ma rimaneva intrappolata nello stacking gel. Gli estratti sono stati allora sottoposti ad analisi immunologica in condizioni non denaturanti mediante dot-blot, adsorbendo direttamente i preparati goccia a goccia sulla nitrocellulosa non idratata. L’intensità delle bande è stata misurata tramite l’ausilio del software "ImageJ", e i risultati ottenuti sono stati confrontati con quelli relativi all’attività di bleaching del β-carotene analizzata sugli stessi preparati (Figura 119).

Una correlazione statisticamente significativa è stata riscontrata tra l’attività enzimatica misurata con il saggio in vitro e il segnale ottenuto con l’analisi immunologica. Tali risultati sembrerebbero dunque confermare che l’attività evidenziata con il saggio di bleaching del β- carotene sia effettivamente attribuibile alla diossigenasi.

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Figura 119. Gli anticorpi

policlonali ottenuti in topo contro peptidi sintetici disegnati

sulla base della sequenza aminoacidica dedotta della PpCCD4 sono stati utilizzati per

l’analisi degli estratti di cromoplasti isolati dai frutti a

vari stadi dello sviluppo. I risultati ottenuti sono stati espressi in funzione di quelli ottenuti sui medesimi campioni

con il saggio del bleaching del β-carotene.

3.2.3.2. Il sistema isogenico Cristina - Caldesi 2000

Visti i riscontri positivi a favore della capacità del protocollo impiegato di fornire informazioni quantitative sull’attività della CCD4, le analisi sono state estese ad altri due genotipi di pesche, Cristina e Caldesi. Anche questi costituiscono un sistema isogenico composto da una cultivar a polpa bianca (Caldesi 2000) e dal suo mutante a polpa gialla (Cristina). Nessuno dei due genotipi possiede l’inserzione LTR: Caldesi 2000 è eterozigote per la lunghezza dei microsatelliti (y1, W1), mentre Cristina è omozigote per l’allele y1. L’allele W1 codifica per una proteina di 597 amminoacidi putativamente funzionale, mentre in Cristina una mutazione consistente di un’addizione di una unità ripetuta causa la mutazione di W1 in y1. Il conseguente frame shift causa la trascrizione di un mRNA troncato (Adami et al., 2013).

In Caldesi 2000 sono stati riscontrati livelli di attività specifica molto bassi (Figura 120), con un trend che li vede ulteriormente calare in modo progressivo nel corso del proces- so di maturazione. Al contrario nel genotipo a polpa bianca i livelli di attività enzimatica risultano essere molto più elevati, con un picco massimo di oltre 60 pKat mg-1 di proteine allo stadio S4 (P < 0.01). I dati ottenuti sembrano dunque in accordo con quelli genetici, anche se nel genotipo Cristina non dovrebbe essere riscontrabile neppure una bassa attività dal momento che esso non dovrebbe possedere alcun allele funzionale codificante la diossigenasi.

3.2.3.3. Il genotipo ancestrale Yumyeong

Per ottenere ulteriori informazioni, si è deciso infine di analizzare i livelli di attività enzimatica presenti nel genotipo ancestrale Yumyeong. Tale genotipo possiede due alleli funzionali W1, codificanti per la proteina completa di 597 aa. Per esso non è stato però possibile ottenere una quantità di materiale sufficiente a permettere una adeguata replicazione delle misure. Sono state quindi effettuate solo 1 o 2 prove per ogni stadio di sviluppo, e i risultati -non presentati- sono stati considerati solo come una indicazione di massima. In accordo con le attese, comunque, nei frutti di questa cultivar sono stati riscontrati valori di bleaching del β-carotene molto elevati, superiori a quelli di tutti gli altri genotipi analizzati.

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Figura 120. Livelli di attività di bleaching dei carotenoidi nei cromoplasti isolati da frutti di

Cristina e Caldesi 2000 raccolti in diverse fasi di maturazione. I risultati sono stati normalizzati sulla base della biomassa estratta. Tutti i dati rappresentano la media ± SE

ottenuta dall’analisi di 5 repliche indipendenti.

Solo successivamente alla esecuzione della maggior parte delle analisi descritte, il sistema allelico della CCD4 in pesco è stato definito in dettaglio (Falchi et al., 2013; Adami et al., 2013). Il quadro generale che è stato delineato è che in passato il pesco avesse frutti a polpa bianca per la presenza di due alleli funzionali e, quindi, di elevati livelli di attività di bleaching dei carotenoidi. Una serie sequenziale di mutazioni avrebbe in seguito portato all’origine di genotipi intermedi (Caldesi 2000) e a polpa gialla (RH e Cristina), dove la proteina non viene prodotta, o viene trascritta in maniera non ottimale. Infine, eventi di retromutazione in alcuni genotipi moderni, come RHB, avrebbe ripristinato trascrizione di almeno un allele funzionale, generando nuovamente delle cultivars con frutti a polpa bianca. Per verificare se i dati ottenuti con il saggio in vitro di bleaching del β-carotene fossero compatibili con questo quadro complessivo, la media dei valori di attività specifica ottenuti per ciascun genotipo è stata confrontata con il numero e la qualità degli alleli funzionali presenti (Figura 121).

Il genotipo ancestrale Yumyeong presenta i livelli di attività specifica più alti, con valori che si avvicinano a 50 pkat mg-1 di proteine. Caldesi 2000, derivante da un genotipo ancentrale ma con un solo allele W1 funzionale, ha un’attività media pressochè dimezzata, che si attesta intorno ai 25 pkat mg-1. Il genotipo ad alto contenuto di carotenoidi nel frutto, Cristina, che possiede due alleli non funzionali y1, è quello che evidenzia i valori di attività di bleaching più bassi, quasi ai limiti della rilevabilità. Per quanto riguarda il sistema Red Haven-Red Haven Bianca, il genotipo giallo presenta livelli leggermente inferiori rispetto a quello a polpa bianca, ma l’attività riscontrata è superiore a quella osservata in Cristina. Complessivamente, dunque, i dati enzimatici sembrano compatibili con quelli genetici. È vero che in Red Haven non dovrebbero essere presenti livelli rilevabili di mRNA della PpCCD4. Questa incongruenza potrebbe però indicare che l’inserzione del retrotrasposone non blocchi completamente la trascrizione del gene e la successiva traduzione corretta della proteina. In alternativa, pur avendo l’analisi immunologica evidenziato una buona correlazione tra la presenza della CCD4 e i valori di attività di bleaching nei preparati, la rilevazione di un livello basale di attività anche in un genotipo in cui la CCD4 non dovrebbe essere presente potrebbe indicare che altri enzimi, non ancora identificati, possano contribuire al metabolismo dei carotenoidi all’interno dei cromoplasti.

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Figura 121. Livelli medi di attività di bleaching del β-carotene in cromoplasti di alcune

cultivars rappresentative di pesco (istogramma) in relazione al modello genetico degli alleli della CCD4 descritto in questa specie (Falchi et al., 2013; Adami et al., 2013).