Due forme di lipossigenasi sono espresse nelle diverse fasi del ciclo di crescita di cellule in sospensione liquida di grano

Per mettere a punto le condizioni per caratterizzare le diverse forme di LOX che in grano duro possono determinare una significativa riduzione del contenuto in carotenoidi si è deciso di utilizzare come sistema sperimentale una coltura cellulare in sospensione liquida della cultivar Ofanto, già disponibile in laboratorio, in quanto essa dovrebbe presentare livelli di attività enzimatica più bassi rispetto ad altri genotipi.

Quando De Simone e collaboratori nel 2010 hanno analizzato l’attività lipossigenasica e l’indice YPC in semi maturi di diverse cultivar italiane antiche e moderne, hanno infatti riscontrato in questo genotipo una bassissima attività, imputata alle proprietà della forma Lpx- B1. In un successivo lavoro (Verlotta et al., 2010) lo stesso gruppo di ricerca ha caratterizzato il sistema genico della Lpx-B1, in cui sono state identificate 3 diverse isoforme (Lpx-B1.1, Lpx-B1.2 e Lpx-B1.3), la prima delle quali è presente con 3 diverse forme alleliche (Lpx-B1.a, Lpx-B1.b e Lpx-B1.c). I vari genotipi contengono solo 2 geni Lpx-B1 e possono quindi essere classificati in aplotipi con differenti caratteristiche di attività lipossigenasica. L’aplotipo III, quello a cui appartiene Ofanto, presenta nei semi maturi elevati livelli di espressione della Lpx-B1.1c, un gene parzialmente deleto e codificante per una proteina non funzionale, e bassa espressione del gene Lpx-B1.2 (Figura 82). Questa combinazione determina un basso livello di attività lipossigenasica, a cui corrisponde un’altrettanto basso bleaching del β-carotene. Ofanto poteva essere quindi un sistema semplificato per la caratterizzazione enzimatica delle lipossigenasi in quanto possiede solamente una isoforma funzionale delle Lpx-1. Inoltre metodi in grado di rilevare adeguatamente i livelli di attività specifica presenti in queste condizioni avrebbero poi dovuto a maggior ragione risultare adeguati se applicati a genotipi con livelli di attività specifica più elevati.

Figura 82. Schema dei geni LOX presenti nella varietà Ofanto di grano duro.

Prove preliminari su estratti di semi maturi hanno però evidenziato valori di attività lipossigenasica quasi indistinguibili dal bianco (ossidazione in assenza dell’enzima), tali da rendere poco plausibile una adeguata caratterizzazione biochimica, soprattutto nel caso in cui l’enzima avesse mostrato una non perfetta stabilità nel tempo. Di qui la scelta della coltura in

Lpx Lpx-B1 Lpx-2 Lpx-3 Lpx-B1.1c (deleta) Lpx-B1.2 (DQ474241) Lpx-A1 (deleta)

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sospensione, in grado di fornire elevate quantità di cellule, con un livello di attività specifica nettamente superiore.

Il frazionamento di estratti grezzi preparati da cellule raccolte in fase esponenziale di crescita per cromatografia a scambio anionico su una colonna di DEAE-Sephacel (Figura 83) ha permesso di separare due picchi di attività enzimatica. Circa il 20% dell’attività lipossigenasica risulta presente nelle frazioni non trattenute dalla resina (isoforma-1), mentre il restante 80% (isoforma-2) viene eluito a una forza ionica corrispondente a circa 60 mM NaCl.

Figura 83. Separazione di due forme di LOX da colture cellulari della varietà Ofanto.

Dal momento che il rapporto quantitativo tra queste due attività mostrava una certa variabilità tra i diversi esperimenti, il protocollo di separazione è stato applicato su cellule raccolte in momenti diversi lungo il ciclo di crescita della coltura. Dal recupero di attività trattenuta o meno dalla resina, rapportato alla quantità di proteine caricate su colonna, si è calcolato il corrispondente valore di attività specifica (Figura 84). Come si può osservare dal grafico, le due putative forme isoenzimatiche sembrano essere espresse in maniera differenziale nelle diverse fasi di crescita: l’isoforma-1 rimane a lungo a livelli basali per poi aumentare in precoce fase stazionaria; l’isoforma-2, al contrario, aumenta con la ripresa della proliferazione cellulare per poi raggiungere un plateau in tarda fase esponenziale, circa 9 giorni dopo il reinoculo.

Poichè tali risultati, pur indicando un diverso pattern di espressione per le due forme di LOX separabili per cromatografia a scambio anionico, non fornivano alcuna indicazione sulla loro identità, parallelamente alla rilevazione del’attività enzimatica è stato effettuato un esperimento per la determinazione semi-quantitativa dei livelli di espressione dei diversi geni Lpx. L’RNA totale è stato pertanto estratto da cellule raccolte subito dopo il reinoculo, in piena fase esponenziale e in precoce fase stazionaria. Dopo retrotrascrizione, il cDNA è stato amplificato utilizzando primers specifici descritti da Verlotta e collaboratori (2010). I risultati ottenuti sono riportati in Figura 85.

117 Figura 84. Livelli di attività specifica di due putative isoforme LOX durante il ciclo di crescita della coltura cellulare di Ofanto. DAI, days after the inoculum.

Figura 85. Analisi mediante RT-PCR semi-quantitativa dell’espressione delle diverse forme

di LOX in cellule in coltura di grano duro, varietà Ofanto. L’amplificazione selettiva è stata ottenuta utilizzando primers specifici per le varie lipossigenasi. Per quanto riguarda i geni Lpx-1.2 e Lpx-2 sono state ottenute bande del peso molecolare atteso; nel caso di Lpx-1.1 sono invece presenti anche prodotti aspecifici: il frammento di dimensioni attese è evidenziato dalla freccia bianca.

Il gene Lpx-3 è risultato del tutto non espresso. Anche se in presenza di prodotti aspecifici, un amplificato delle dimensioni attese è stato ottenuto per Lpx-1.1; esso in Ofanto codifica però per una proteina tronca e non funzionale (Figura 82), per cui ad esso non può corrispondere nessuna delle due forme evidenziate negli estratti cellulari. Prodotti di amplifi- cazione sono stati ottenuti anche per Lpx-B1.2, espressa a bassi livelli immediatamente dopo il reinoculo e poi a livelli sempre maggiori, e per Lpx-2, che ha un massimo di espressione in fase esponenziale di crescita. Il confronto tra questi dati e l’andamento dei livelli di attività

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specifica lungo il ciclo di crescita della coltura ha portato pertanto a identificare l’isoforma-1 con Lpx-B1.2, e l’isoforma-2 con Lpx-2.

3.1.2. Le forme di lipossigenasi espresse nella coltura cellulare di grano duro cv